專利名稱：外周給藥的紅細(xì)胞生成素對應(yīng)激組織功能的調(diào)制的制作方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用外周給藥的紅細(xì)胞生成素和其他紅細(xì)胞生成素受體活性調(diào)制劑或EPO-活化受體調(diào)制劑來正向影響應(yīng)激組織的功能。這包括保護(hù)應(yīng)激組織諸如神經(jīng)元和心臟組織免受神經(jīng)毒素、氧不足和其他不利刺激的傷害，以及增強(qiáng)應(yīng)激組織的功能，諸如用于幫助學(xué)習(xí)和記憶。本發(fā)明還涉及通過與紅細(xì)胞生成素分子、紅細(xì)胞生成素受體活性調(diào)制劑或其他EPO-活化受體調(diào)制劑締合將物質(zhì)轉(zhuǎn)運通過內(nèi)皮細(xì)胞屏障的方法。
2.發(fā)明背景許多種急性和慢性病況和疾病來源于外部和內(nèi)部刺激引起的應(yīng)激組織損害和機(jī)能障礙。這類刺激包括缺乏足夠的氧合作用或葡萄糖、神經(jīng)毒素、衰老的結(jié)果、感染性試劑、和外傷。例如，應(yīng)激組織受到損害可能是癲癇發(fā)作和慢性癲癇發(fā)作、驚厥、癲癇、中風(fēng)、早老性癡呆、帕金森氏病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、低氧癥、大腦性麻痹、腦或脊髓創(chuàng)傷、AIDS癡呆和其他形式的癡呆、與年齡有關(guān)的認(rèn)知功能喪失、記憶力喪失、肌萎縮性側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、低血壓、心搏停止、神經(jīng)元損失、煙霧吸入和一氧化碳中毒等的結(jié)果。
眾所周知腦可獲得的能量供給諸如葡萄糖或氧的減少會導(dǎo)致對腦功能的深度損傷，包括認(rèn)知力損傷。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的許多(但不是全部)神經(jīng)元在例如氧不足、低血糖、緊張狀態(tài)和/或長時間的強(qiáng)烈興奮等代謝有限條件下工作時極易受損。在這些情況下，這些細(xì)胞的電化學(xué)梯度常常崩潰，導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)元損傷和細(xì)胞死亡?，F(xiàn)行的觀點認(rèn)為這種一般機(jī)理是大量常見且致虛弱的神經(jīng)病學(xué)變性疾病包括中風(fēng)、癲癇和早老性癡呆的共同最終途徑。
盡管有限的能量底物對腦功能影響的后果是眾所周知的，但對于提高在否則就是正常的腦中的能量釋放的作用只進(jìn)行了很少的研究。目前的資料有力地提示在動物模型和正常的人受治療者中，無論是葡萄糖還是氧的釋放提高都顯著改善了復(fù)雜認(rèn)知功能(Kopf等，1994，《行為與神經(jīng)生物學(xué)》62237-243；Li等，1998，《神經(jīng)科學(xué)》85785-794；Moss等，1996，《精神藥理學(xué)》124255-260)。此外，已證明在腦中產(chǎn)生的越來越多的神經(jīng)肽類直接提供了對正常腦認(rèn)知功能的改善。這些增強(qiáng)作用的生理學(xué)基礎(chǔ)最終都取決于通過突觸變化的神經(jīng)元互連的重塑。
腦組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示出極大的可塑性并經(jīng)歷連續(xù)不斷的重塑。由許多營養(yǎng)分子介導(dǎo)的這些過程不僅發(fā)生在損害后，而且在學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能中起著突出的作用。盡管原型神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是神經(jīng)生長因子(NGF)，但數(shù)量逐漸增加的細(xì)胞因子已公認(rèn)在腦中發(fā)揮營養(yǎng)功能(Hefti等，1997，《藥理學(xué)與毒理學(xué)年評》37239-67)。
近來，許多獨立的研究者都認(rèn)識到神經(jīng)組織表達(dá)高濃度的EPO及其受體(EPO-R；Digicaylioglu等，1998，《美國國家科學(xué)院院報》923717-20；Juul等，《兒科研究》4340-9；Marti等，1997，《國際腎臟學(xué)》51416-8；Morishita等，1997，《神經(jīng)科學(xué)》76105-16)。盡管似乎EPO及其受體蛋白各自是單基因的產(chǎn)物，但CNS變型明顯更小。這種觀察結(jié)果的生理學(xué)含義尚不清楚，但質(zhì)量差異似乎確實改變了生物活性。例如，在對病人的研究中，研究者已得出結(jié)論，認(rèn)為EPO沒有被從外周轉(zhuǎn)運到腦中(Marti等，1997，同上)。但是，迄今為止，尚未利用任何直接研究對EPO的這種可能性加以評估。盡管腦EPO比腎EPO少約15％(應(yīng)歸于唾液?；饔玫牟煌?，但腦EPO在低配體濃度下的紅細(xì)胞集落刺激中更具活性(Masuda等，1994，《生物化學(xué)雜志》26919488-93)。另一方面，CNS受體顯示出比外周受體低得多的對去糖基化EPO的親和力，外周受體的這種親和力要高出30％(Konishi等，1993，《腦研究》60929-35；Masuda等，1993，《生物化學(xué)雜志》26811208-16)。
在腦中，已在星形細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)EPO的表達(dá)，且EPO表達(dá)和釋放的增加可由氧不足和其他代謝緊張性刺激誘導(dǎo)(Marti等，1996，《歐洲神經(jīng)科學(xué)雜志》8666-76；Masuda等，1993，《生物化學(xué)雜志》26811208-16；Masuda等，1994，《生物化學(xué)雜志》26919488-93)，或者甚至由其他受體諸如胰島素樣生長因子家族的占據(jù)誘導(dǎo)(Masuda等，1997，《腦研究》74663-70)。神經(jīng)元是這種分泌EPO的一個目標(biāo)，因為它們以高度細(xì)胞類型特異性方式表達(dá)EPO-R(Morishita等，1997，《神經(jīng)科學(xué)》76105-16)。與EPO本身形成對照，EPO-R密度似乎在代謝應(yīng)激反應(yīng)過程中未被調(diào)制(Digicaylioglu等，1995，《美國國家科學(xué)院院報》923717-20)。
最近的研究證明，EPO令人印象深刻地在體外以及在體內(nèi)當(dāng)直接注射到腦室中時可保護(hù)對抗低氧性神經(jīng)元損傷(Morishita等，1997，《神經(jīng)科學(xué)》76105-16；Sadamoto等，1998，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊》25326-32；Sakanaka等，1998，《美國國家科學(xué)院院報》954635-40)。Konishi等(1993，《腦研究》60929-35)已證明EPO當(dāng)直接注射到成年大鼠腦室中時促進(jìn)了膽堿能神經(jīng)元在體內(nèi)的存活。中樞給藥到腦室中的EPO還成功地防止了大鼠的與局部缺血損傷有關(guān)的空間學(xué)習(xí)障礙(Sadamoto等，1998，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊》25326-32)。一份近期的出版物提出只有EPO的17-氨基酸部分是培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中這些神經(jīng)營養(yǎng)作用所需要的(Campana等，1998，《國際分子醫(yī)學(xué)雜志》1235-41)。
許多年來，紅細(xì)胞生成素(EPO)的唯一清楚的生理學(xué)作用是其控制紅細(xì)胞的產(chǎn)生。近來，有一些證據(jù)表明，EPO作為細(xì)胞因子超家族的成員發(fā)揮著其他重要的生理學(xué)功能，這些功能是通過與紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)的相互作用介導(dǎo)的。這些作用包括致有絲分裂、調(diào)制流入到平滑肌和神經(jīng)細(xì)胞中的鈣、以及對中間代謝的作用。據(jù)信EPO提供了可改善低氧性細(xì)胞微環(huán)境的補償性應(yīng)答。盡管研究已確定EPO顱內(nèi)注射可保護(hù)神經(jīng)元對抗低氧性神經(jīng)元損傷，但顱內(nèi)給藥對于醫(yī)療應(yīng)用來說是一種不切實際且難以接受的給藥途徑，特別是對于正常的個體。另外，早先對給藥EPO的貧血病人的研究已得出結(jié)論外周給藥的EPO沒有被轉(zhuǎn)運到腦中(Marti等，1997，同上)。
在此處引用或討論的參考文獻(xiàn)將不理解為是本發(fā)明的在先技術(shù)。
3.本發(fā)明的簡要概述本發(fā)明涉及用于調(diào)制哺乳動物應(yīng)激組織功能的組合物和方法，以及用于將藥物釋放到應(yīng)激組織的方法和組合物。本發(fā)明部分是基于申請人的發(fā)現(xiàn)全身性并以高劑量給藥的紅細(xì)胞生成素(EPO)被腦特定吸收。特別是，申請人發(fā)現(xiàn)以高劑量釋放的EPO可以穿過血腦屏障，此時它能增強(qiáng)認(rèn)知功能，并保護(hù)神經(jīng)組織免受應(yīng)激性狀態(tài)諸如氧不足的損害。
紅細(xì)胞生成素和EPO(在本文中可互換使用)、EPO受體活性調(diào)制劑、和EPO-活化受體調(diào)制劑指的是當(dāng)全身性給藥(在血腦屏障外部)時能激活電應(yīng)激組織的EPO-活化受體來增強(qiáng)和/或保護(hù)使免受損傷和死亡的化合物。因此，EPO可以指能調(diào)制應(yīng)激組織的任何形式的紅細(xì)胞生成素，以及EPO類似物、其片段和模擬物。在優(yōu)選的實施方案中，對于在本發(fā)明方法中的使用，紅細(xì)胞生成素表現(xiàn)出對腦EPO受體的增加的特異性。在另一個實施方案中，紅細(xì)胞生成素是非紅細(xì)胞生成性的。在又一個實施方案中，紅細(xì)胞生成素以比最大地刺激紅細(xì)胞生成所必需的劑量更大的劑量給藥。
本發(fā)明提供了適于調(diào)制應(yīng)激組織、增強(qiáng)認(rèn)知功能或運送化合物穿過內(nèi)皮緊密接點的劑量單位形式的藥物組合物，每劑量單位包含有效無毒量的約50,000至500,000單位范圍內(nèi)的EPO、EPO受體活性調(diào)制劑、EPO-活化受體調(diào)制劑、或其聯(lián)合形式，以及藥學(xué)上可接受的載體。在一個實施方案中，在所述藥物組合物中的有效無毒量的EPO包含50,000至500,000單位的EPO。在另一個實施方案中，所述藥物制劑的EPO的有效無毒量是能有效地達(dá)到大于10,000mU/ml血清的EPO循環(huán)濃度的劑量。在另一個實施方案中，EPO的循環(huán)濃度在EPO給藥后約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時達(dá)到。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物試劑盒，它包括分裝在一個或多個容器中的用于調(diào)制應(yīng)激組織、增強(qiáng)認(rèn)知功能或運送化合物穿過內(nèi)皮緊密接點的有效量的EPO。
本發(fā)明提供了調(diào)制哺乳動物應(yīng)激組織功能的方法，包括對所述哺乳動物外周給藥有效量的紅細(xì)胞生成素。應(yīng)激組織可以是正常組織或異常的患病組織。在一個實施方案中，應(yīng)激組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元組織。在其他實施方案中，應(yīng)激組織選自外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元組織和心臟組織。
在一個實施方案中，提供了通過外周給藥有效量的EPO或EPO受體活性調(diào)制劑來增強(qiáng)哺乳動物應(yīng)激組織、特別是正常和異常應(yīng)激組織功能的方法。應(yīng)激組織功能的增強(qiáng)使得例如學(xué)習(xí)、聯(lián)想學(xué)習(xí)或記憶增強(qiáng)。可用本發(fā)明的這個方面治療的病況或疾病的非限制性實例包括心境障礙、焦慮癥、抑郁、孤獨癖、注意渙散多動癥、早老性癡呆、衰老和認(rèn)知機(jī)能障礙。
在另一個實施方案中，對應(yīng)激組織的調(diào)制提供了使免受由對應(yīng)激組織例如對中樞神經(jīng)細(xì)胞、外周神經(jīng)細(xì)胞或心臟組織的神經(jīng)元的損傷產(chǎn)生的病變的保護(hù)作用?？僧a(chǎn)生這種病變的損傷包括但不限于低氧癥、癲癇發(fā)作、神經(jīng)變性疾病、神經(jīng)毒素中毒、多發(fā)性硬化、低血壓、心搏停止、放射或低血糖。在一個實施方案中，病變是低氧癥的結(jié)果，并且可能是產(chǎn)前或產(chǎn)后缺氧、窒息、壅塞、幾乎淹溺、手術(shù)后認(rèn)知機(jī)能障礙、一氧化碳中毒、煙霧吸入、慢性阻塞性肺疾病、肺氣腫、成人呼吸窘迫綜合征、低血壓休克、膿毒性休克、胰島素休克、過敏性休克、鐮狀細(xì)胞危象、心搏停止、節(jié)律障礙或氮麻醉。在其中病變?yōu)榘d癇發(fā)作的情況下，它的非限制性實例可以是癲癇、驚厥或慢性癲癇發(fā)作。在其中病變?yōu)樯窠?jīng)變性疾病的情況下，它可以是例如中風(fēng)、早老性癡呆、帕金森氏病、大腦性麻痹、腦或脊髓創(chuàng)傷、AIDS癡呆、與年齡有關(guān)的認(rèn)知功能喪失、記憶喪失、肌萎縮性側(cè)索硬化、癲癇發(fā)作、醇中毒、視網(wǎng)膜局部缺血、衰老、青光眼或神經(jīng)元損失。在另一個實施方案中，給藥EPO可以用于在手術(shù)操作諸如象腫瘤切除或動脈瘤修復(fù)過程中預(yù)防損傷或組織損害。
在又一個實施方案中，提供了通過給藥與紅細(xì)胞生成素結(jié)合的分子的組合物來促進(jìn)分子穿過哺乳動物內(nèi)皮細(xì)胞屏障的轉(zhuǎn)胞吞作用的方法。要轉(zhuǎn)運的分子和EPO之間的結(jié)合可以是例如與分子結(jié)合位點的不穩(wěn)定共價鍵、穩(wěn)定共價鍵或者非共價結(jié)合。在一個實施方案中，內(nèi)皮細(xì)胞屏障可以是血腦屏障、血眼屏障、血睪丸屏障、血卵巢屏障或血胎盤屏障。
本發(fā)明還提供了用于經(jīng)由轉(zhuǎn)胞吞作用轉(zhuǎn)運分子穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障的組合物，它包含與EPO、EPO受體活性調(diào)制劑或EPO-活化受體調(diào)制劑結(jié)合的所述分子。在一個實施方案中，EPO是紅細(xì)胞生成素、紅細(xì)胞生成素類似物、紅細(xì)胞生成素模擬物、紅細(xì)胞生成素片段、雜合紅細(xì)胞生成素分子、紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合分子、紅細(xì)胞生成素激動劑、腎紅細(xì)胞生成素、腦紅細(xì)胞生成素、其寡聚體、其多聚體、其突變蛋白質(zhì)、其同類物、其天然存在形式、其合成形式、其重組形式、或其聯(lián)合形式。在另一個實施方案中，所述組合物的分子是激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗微生物劑、放射藥物、反義化合物、抗體、免疫抑制劑、毒素或抗癌劑。用于利用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)運的合適的分子包括但不限于激素，諸如生長激素，抗生素，抗癌劑，和毒素。
參照以下附圖和詳細(xì)說明將更好地領(lǐng)會本發(fā)明的這些以及其他方面。
4.附圖的簡要描述

圖1A-B.Morris水迷路試驗。A、用每天接受外周給藥的EPO或鹽水(SHAM)的小鼠進(jìn)行的Morris水迷路試驗的結(jié)果。B、接受EPO的受驗者的表現(xiàn)顯著優(yōu)于用SHAM治療的受驗者。回歸線(R2＝0.88)顯示顯著不同于斜率1的斜率(0.68)，明顯有利于EPO組。
圖2A-C.條件性味覺移轉(zhuǎn)試驗。A、比較外周假物和EPO治療對正經(jīng)歷條件性味覺移轉(zhuǎn)試驗的小鼠的水消耗量的影響。水消耗量表示為沒有用氯化鋰導(dǎo)致生病的對照小鼠消耗的體積百分?jǐn)?shù)。B和C說明EPO-增強(qiáng)的學(xué)習(xí)是健康的，因為在避開含有與疾病相聯(lián)的線索的水繼續(xù)花更多的時間尋找水這方面，EPO受驗者可比對照忍受大得多的渴感。
圖3A-B.A、證明了外周給藥的EPO預(yù)處理降低了癲癇發(fā)作的嚴(yán)重性并保護(hù)小鼠免受紅藻氨酸神經(jīng)毒素引起的驚厥和死亡的實驗結(jié)果。每個條柱下面在圓括號中的數(shù)字指示接受每種紅藻氨酸鹽劑量的動物數(shù)。B顯示了外周給藥的EPO的保護(hù)作用隨著EPO的每日給藥而增加。C說明了EPO作用的開始被延遲，特征在于基因表達(dá)程序的誘導(dǎo)。
圖4A-B描述了rhEPO對抗缺血性腦損傷(局灶性中風(fēng))的保護(hù)作用。A、在誘導(dǎo)腦局部缺血后的不同時間全身性給藥EPO減小了梗塞的尺寸。B、以這種模型比較兩種形式的EPO在保護(hù)腦免受損傷方面的作用重組人EPO(rhEPO)和17氨基酸EPO衍生物(17聚體)，結(jié)果說明有些EPO類似物對神經(jīng)保護(hù)是無效的。
圖5描述了rhEPO對抗遞送到大腦皮質(zhì)中的鈍器外傷的保護(hù)作用。
圖6A-B描述了EPO對缺血性心臟損傷的保護(hù)作用。A、肌酸激酶(CK)活性，心肌細(xì)胞損害的指示劑。B、髓過氧化物酶(MPO)活性，炎癥的量度。
圖7顯示小鼠用EPO治療延遲并減少了由實驗性變應(yīng)性腦炎產(chǎn)生的神經(jīng)病學(xué)癥狀，這是多發(fā)性硬化的一種模型。
圖8A-B.A、在大鼠局灶性中風(fēng)模型中提供神經(jīng)保護(hù)的EPO的最小有效劑量。B、對雌性Balb/c小鼠腹膜內(nèi)給藥5000U rhEPO后不同時間點的EPO血清濃度。
圖9A-C.A、EPO-R在毛細(xì)血管上及其周圍的免疫定位。B、對小鼠IP給藥的生物素化EPO在5小時的時候發(fā)現(xiàn)于離腦極近的周圍毛細(xì)血管中。C、17小時后，可以在特異性神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)生物素標(biāo)記。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于使用紅細(xì)胞生成素(EPO)來調(diào)制應(yīng)激組織功能、諸如象增強(qiáng)認(rèn)知功能和保護(hù)應(yīng)激細(xì)胞免受毒性刺激的組合物和方法。特別是，本發(fā)明提供了包含EPO的組合物，以及將它們用于預(yù)防和治療性處理包括藥物釋放的方法。本文中所用的應(yīng)激組織包括但不限于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元組織以及心臟組織。
此處描述的發(fā)明提供了通過外周給藥EPO、或EPO受體活化分子或顯示EPO-活化受體活性的分子、以及利用通過其他非經(jīng)典EPO受體起作用來摹擬EPO活性的任何分子來調(diào)制應(yīng)激組織功能的方法。不受任何特定作用機(jī)理的束縛，這樣的分子可以經(jīng)由EPO受體發(fā)信號，例如，引發(fā)最終激活導(dǎo)致對應(yīng)激組織功能的保護(hù)或增強(qiáng)的基因表達(dá)程序的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)。能與EPO受體相互作用并調(diào)制受體活性的分子，在本文中稱作EPO或EPO受體活性調(diào)制劑，可在本發(fā)明范圍內(nèi)用于保護(hù)或增強(qiáng)應(yīng)激組織功能。這些分子可以是例如天然存在的、合成的、或重組形式的EPO分子，如上所述，或是除了調(diào)制EPO受體活性以外不必然以任何方式類似于EPO的其他分子，如本文中所述。這些分子可以聯(lián)合用于本文中描述的各種目的。
本文中描述的組合物和方法可以用于治療和/或保護(hù)正常組織或異常組織，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、或心臟組織。特別是，在下面的5.1部分中，描述了用于實施本發(fā)明的EPO組合物。在5.2.1部分中，描述了使用這類EPO組合物來增強(qiáng)應(yīng)激組織的功能諸如學(xué)習(xí)、記憶和其他方面的認(rèn)知功能的方法，而在5.2.2部分中，描述了保護(hù)應(yīng)激組織免受損害和損傷的方法。在下面的5.2.3部分中還描述了EPO的意外的可通過毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密接點的能力，這一發(fā)現(xiàn)提供了運送化合物穿過這類屏障的方法。最后，在5.3部分中描述了可以使用本發(fā)明的方法定向的疾病，而在5.4部分中描述了這類EPO組合物的給藥方法和有效劑量。
5.1包含紅細(xì)胞生成素的組合物適合用于本發(fā)明的EPO組合物包括當(dāng)外周給藥時能激活EPO-活化受體來調(diào)制、即增強(qiáng)應(yīng)激組織的功能、保護(hù)應(yīng)激組織免受損害或損傷、或運送化合物到應(yīng)激組織的任何紅細(xì)胞生成素化合物。紅細(xì)胞生成素是一種糖蛋白激素，它在人體內(nèi)的分子量為34至38kD。成熟蛋白質(zhì)包含166個氨基酸，而糖基殘基占該分子重量的約40％。用于實施本發(fā)明的EPO形式包括天然存在的、合成和重組形式的下列分子紅細(xì)胞生成素、紅細(xì)胞生成素類似物、紅細(xì)胞生成素模擬物、紅細(xì)胞生成素片段、雜合紅細(xì)胞生成素分子、紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合分子、紅細(xì)胞生成素激動劑、腎紅細(xì)胞生成素、腦紅細(xì)胞生成素、其寡聚體和多聚體、其突變蛋白質(zhì)、以及其同類物。術(shù)語“紅細(xì)胞生成素”和“EPO”可以互換或結(jié)合使用。
本文中提供了合成和重組分子，諸如腦EPO和腎EPO，EPO的重組哺乳動物形式，以及其天然存在的、來自于腫瘤的、和重組同種型，諸如重組表達(dá)的分子和通過同源重組制備的那些分子。此外，本發(fā)明包括包含結(jié)合EPO受體的肽的分子，以及重組構(gòu)建物或具有EPO的部分或全部結(jié)構(gòu)和/或生物學(xué)特性的其他分子，包括EPO的片段和多聚體或其片段。本文中EPO包含具有改變的EPO受體結(jié)合活性的分子，優(yōu)選具有增加的受體親和力，特別是當(dāng)用于增強(qiáng)穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障的轉(zhuǎn)運時。本文中還包括包含具有另外或減少數(shù)目的糖基化位點的分子的突變蛋白質(zhì)。如上所述，術(shù)語“紅細(xì)胞生成素”、“EPO”和“模擬物”以及其他術(shù)語在本文中可互換使用來指與EPO有關(guān)的應(yīng)激組織保護(hù)和增強(qiáng)分子以及能夠穿過內(nèi)皮緊密接點并如此用作其他分子的釋放方式的分子。另外，本文中也包括利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的分子。應(yīng)當(dāng)注意包括在本文中的EPO分子除了與EPO受體相互作用或調(diào)制EPO受體活性或激活EPO-活化信號級聯(lián)放大等能力外，并不必然在結(jié)構(gòu)上或以任何其他方式與EPO相似，如上所述。
作為非限制性的實例，用于實施本發(fā)明的EPO的形式包括EPO突變蛋白質(zhì)，諸如美國專利5,457,089和美國專利4,835,260中所述的在羧基端帶有改變的氨基酸的那些；每個分子中帶有不同數(shù)量的唾液酸殘基的EPO同種型，諸如美國專利5,856,292中所述的；美國專利4,703,008中所述的多肽；美國專利5,767,078中所述的激動劑；如美國專利5,773,569和5,830,851中所述的結(jié)合EPO受體的肽；如美國專利5,835,382中所述的激活EPO受體的小分子模擬物；以及WO 9505465、WO 9718318和WO 9818926中所述的EPO類似物。上述所有引用文獻(xiàn)都結(jié)合在此，就好象這類公開文獻(xiàn)提到的是用于制備這類形式的本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素的各種交替形式或方法。
EPO可以從商業(yè)上獲得(以商標(biāo)PROCRIT從Ortho Biotech購得，和以商標(biāo)EPOGEN從Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA購得)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，包含在本文中的EPO分子包括雜合EPO分子，可以制備成包含EPO受體調(diào)制活性以及另一種活性，例如生長激素的活性。具有多結(jié)構(gòu)域的這類雜合分子因此具有與EPO受體相互作用的能力-也具有另一種分子諸如激素的活性。有兩個結(jié)構(gòu)域的這類分子的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。正如將在下面的5.2.3部分更詳細(xì)地描述的那樣，這類分子的一個特性是由EPO受體活性調(diào)制結(jié)構(gòu)域提供的穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障的轉(zhuǎn)運，和靶位點上另一種分子的活性。
可以使用本文中所述的測定法來檢驗上述任何一種化合物，以確定能夠調(diào)制應(yīng)激組織，即增強(qiáng)其功能、保護(hù)其免受損害或損傷、或運送化合物至其中的EPO化合物。例如，可以使用5.2.1部分中描述的方法來檢驗EPO化合物增強(qiáng)應(yīng)激組織功能、諸如學(xué)習(xí)、記憶和其他方面的認(rèn)知功能的能力。有關(guān)認(rèn)知功能的體內(nèi)測定法的實例包括Morris水迷路試驗，第6部分中描述了其的一個例子，和條件性味覺移轉(zhuǎn)試驗，第7部分中詳細(xì)描述了其的一個例子。此外，可以使用5.2.2部分中描述的測定法來檢驗上述EPO化合物，以鑒別能保護(hù)應(yīng)激組織免受損害和損傷的EPO化合物。在第8、9、10、11和12部分中描述的例子提供了這些測定法的具體實例。還可以使用諸如在下文中的5.2.3和第9部分中描述的那些測定法來鑒定EPO化合物運送化合物穿過內(nèi)皮緊密接點諸如血腦屏障的能力。因此，適合用于本發(fā)明的EPO組合物包括當(dāng)外周給藥時能夠通過EPO-活化受體發(fā)信號來調(diào)制應(yīng)激組織、即增強(qiáng)其功能、保護(hù)其免受損害或損傷、或運送化合物至其中的任一和所有化合物。
5.2 本發(fā)明的預(yù)防和治療性應(yīng)用的方法在本發(fā)明的各種實施方案中，EPO組合物可以用于保護(hù)應(yīng)激組織免受損傷或低氧壓力，增強(qiáng)應(yīng)激組織的功能，或用于運送化合物穿過應(yīng)激組織的內(nèi)皮緊密接點。如上所述，本發(fā)明部分是基于這樣的發(fā)現(xiàn)EPO分子可以被從腔表面轉(zhuǎn)運到有內(nèi)皮細(xì)胞緊密接點的器官包括例如腦、視網(wǎng)膜和睪丸的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基膜表面上。不希望受到任何特定理論的束縛，EPO轉(zhuǎn)胞吞后，EPO可以與應(yīng)激組織諸如象中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、外周神經(jīng)系統(tǒng)、或心臟組織上的EPO受體相互作用，而受體的結(jié)合可以引發(fā)導(dǎo)致應(yīng)激組織中的基因表達(dá)程度激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，產(chǎn)生對細(xì)胞的保護(hù)作用，使其免受諸如神經(jīng)毒素、低氧癥等的損害。因此，下文中詳細(xì)描述了保護(hù)應(yīng)激組織免受損傷或低氧壓力、增強(qiáng)應(yīng)激組織功能、和運送化合物穿過應(yīng)激組織的緊密接點的方法。
5.2.1增強(qiáng)應(yīng)激組織功能的方法在一個方面，本發(fā)明涉及通過給藥能夠激活增強(qiáng)應(yīng)激組織功能的基因表達(dá)程序的EPO分子來增強(qiáng)應(yīng)激組織功能的方法。應(yīng)激組織功能的增強(qiáng)增進(jìn)了學(xué)習(xí)、聯(lián)想學(xué)習(xí)和記憶能力。許多疾病和病況可以使用這種方法進(jìn)行治療，并且，該方法可在沒有任何病況或疾病的情況下用于增強(qiáng)認(rèn)知功能。本發(fā)明的這些應(yīng)用在下文中作了更詳細(xì)的描述，包括增強(qiáng)人和非人哺乳動物的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練。
可以用本發(fā)明這個方面的方法進(jìn)行治療的病況和疾病包括能從神經(jīng)元功能的增強(qiáng)中獲益的任何病況或疾病。這類病患的實例包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)病患，包括但不限于心境障礙、焦慮癥、抑郁、孤獨癖、注意渙散多動癥和認(rèn)知機(jī)能障礙?？梢杂帽景l(fā)明的方法增強(qiáng)的認(rèn)知功能的其他非限制性實例記載在第5.3部分中。
在一個實施方案中，例如，EPO分子可以對患有導(dǎo)致認(rèn)知功能喪失的病癥諸如象早老性癡呆的受驗者或病人給藥。
EPO增強(qiáng)認(rèn)知功能的能力可以用實驗動物使用本文中所述的任何一種方法或其他任何一種本領(lǐng)域公認(rèn)的學(xué)習(xí)或認(rèn)知功能模型進(jìn)行檢驗。如第6和7部分中記載的實施例中所述，用正常實驗動物通過數(shù)種充分確定的學(xué)習(xí)模型證明了外周給藥的紅細(xì)胞生成素增強(qiáng)了學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能。這類學(xué)習(xí)模型的例子是在第6部分中給出實例的Morris水迷路試驗和在第7部分中給出實例的條件性味覺移轉(zhuǎn)(CTA)實驗。在一個實施方案中，例如，使用非常靈敏的、眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)試驗-條件性味覺移轉(zhuǎn)(CTA)試驗來檢驗動物給藥EPO后的認(rèn)知功能。用CTA來檢驗動物學(xué)習(xí)將疾病與一種新穎刺激諸如味覺聯(lián)系起來，使得動物在后來再次接受該新穎刺激時避開這種新穎味覺的能力。CTA在各種皮質(zhì)和皮質(zhì)下水平上累及腦。將產(chǎn)生厭惡行為的遞增和遞減的信息聯(lián)合在一起的聯(lián)想可以通過影響任何一種互連單元的改變來減弱或加強(qiáng)。作為聯(lián)想學(xué)習(xí)的形式，CTA的強(qiáng)度決定于多種變量，包括口頭刺激的新奇性(例如，非新穎刺激不能加以厭惡調(diào)節(jié))，產(chǎn)生的“疾病”的程度(毒性)，重復(fù)次數(shù)(訓(xùn)練)，相反的動力(諸如渴感)等，這只是幾個例子。盡管有許多化學(xué)和物理試劑可以劑量依賴方式產(chǎn)生CTA，但氯化鋰能可靠地產(chǎn)生不適和厭食。象一種自然發(fā)生的疾病，鋰通過刺激上述途徑，包括細(xì)胞因子釋放，來產(chǎn)生CTA。
應(yīng)激細(xì)胞功能例如認(rèn)知功能的增強(qiáng)為教育和工作環(huán)境中的個體提供了許多益處，并能提高訓(xùn)練和教育非人哺乳動物的能力。
5.2.2保護(hù)應(yīng)激組織免受損傷的方法在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及保護(hù)哺乳動物使之免受應(yīng)激組織損傷產(chǎn)生的病變的方法。保護(hù)作用是通過利用外周給藥途徑對哺乳動物給藥適量的能有效地保護(hù)應(yīng)激組織免受損傷的紅細(xì)胞生成素實現(xiàn)的。正如在下面的第8部分的實施例中詳細(xì)顯示的那樣，在紅藻氨酸毒素之前給藥的EPO對小鼠是顯著的神經(jīng)保護(hù)劑，提高了癲癇發(fā)作閾值并防止了死亡。EPO的神經(jīng)保護(hù)作用強(qiáng)而持久。值得注意的是在本文中見到的積極作用出現(xiàn)于相對給藥EPO使達(dá)到血細(xì)胞比容增加來說太短的時間內(nèi)，這是EPO的紅細(xì)胞生成活性的結(jié)果。另外，如上面已經(jīng)看到的那樣，本發(fā)明的實施方案包括缺乏增加血細(xì)胞比容能力的EPO。
在一個實施方案中，本發(fā)明可以有利地用于如上所述的神經(jīng)病學(xué)病患的急性和慢性預(yù)防和治療，和用于增強(qiáng)正?；蚧疾〉哪X的認(rèn)知功能。上面已經(jīng)看到，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的損害和死亡是嚴(yán)重的，常常導(dǎo)致死亡，使人群的發(fā)病率和死亡率都很高。急性神經(jīng)病學(xué)損害可能發(fā)生在癲癇發(fā)作、驚厥、癲癇、中風(fēng)、出血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、低氧癥、低血糖、低血壓和腦或脊髓外傷過程中或者這些疾病的結(jié)果。本發(fā)明提供了用于治療急性事件的急性給藥方案。
在一個實施方案中，例如，本發(fā)明的方法可以用于保護(hù)哺乳動物免受由腦的輻射損害導(dǎo)致的損傷。
在另一個實施方案中，可以按照本發(fā)明治療或預(yù)防的嚴(yán)重病況是預(yù)防和治療產(chǎn)前低氧狀況下的子宮，在出生后進(jìn)行治療以保護(hù)腦免受生產(chǎn)過程中持續(xù)的低氧損傷，以及預(yù)防和治療窒息、淹溺和其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在因缺氧或接受其他神經(jīng)毒性刺激而產(chǎn)生神經(jīng)毒性損害危險的其他病況。眾所周知，在分娩過程中遭受氧不足的個體，或者作為非致命的低氧事故或事件的結(jié)果，可能導(dǎo)致終身的神經(jīng)病學(xué)缺陷。外傷后或在手術(shù)操作過程中可能出現(xiàn)的低氧癥和/或大腦血流中斷也帶來引起終身神經(jīng)病學(xué)缺陷的危險。
手術(shù)后認(rèn)知機(jī)能障礙，包括使用心-肺機(jī)后的短缺，也可以用本文中提供的方法進(jìn)行治療。另外，本發(fā)明方法可以用于治療一氧化碳中毒或吸入煙霧引起的低氧癥。
在另一個實施方案中，用EPO來保護(hù)心臟組織使其免受局部缺血、梗塞形成、炎癥或外傷過程中持續(xù)的損傷。
這些是可以按照本發(fā)明進(jìn)行治療的應(yīng)激組織損害的非限制性實例。對這些病患的及時和早期治療可以由可移動醫(yī)療緊急健康護(hù)理專業(yè)人員進(jìn)行，以便一旦在對神經(jīng)病學(xué)損害的可能性確定后就盡快開始治療。由分娩誘導(dǎo)的神經(jīng)病學(xué)損害的危險可以通過在分娩前或分娩過程中對胎兒進(jìn)行預(yù)防性治療而得以減少。這些以及其他功用和情況將由技術(shù)人員識別。
5.2.3化合物的運送方法本發(fā)明還涉及通過給藥包含與紅細(xì)胞生成素聯(lián)合的特定分子的組合物來幫助將分子轉(zhuǎn)運穿過哺乳動物體內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞屏障的方法。上面已經(jīng)看到，發(fā)明人在此處發(fā)現(xiàn)了迄今未料想到的且令人驚訝的外周給藥的EPO對應(yīng)激組織、諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、或心臟組織中的神經(jīng)元組織的活性，確定EPO是能夠穿過這類應(yīng)激組織的緊密接點諸如血腦屏障的分子。這樣，EPO就可用作運送其他分子穿過血腦屏障和其他類似屏障的載體。
在一個實施方案中，包含與EPO分子綴合的分子的EPO受體結(jié)合分子可以用于轉(zhuǎn)運那些分子穿過血腦屏障。這類分子可由此攜帶在用于穿過BBB釋放的EPO上。在另一個實施方案中，抗體或分子的其他結(jié)合配偶體可以與EPO聯(lián)合，或與EPO受體活性調(diào)制劑聯(lián)合，由此通過非共價結(jié)合將要轉(zhuǎn)運的分子與結(jié)合配偶體結(jié)合起來，其再進(jìn)一步與可轉(zhuǎn)運的EPO分子結(jié)合。在另一個實施方案中，包含EPO受體的抗體的EPO受體結(jié)合分子可用于此處描述的方法。這類抗體提供了可以攜載其他分子的轉(zhuǎn)運載體，大多以相同的方式一直以來都使用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體來獲得穿過血腦屏障的能力(Pardridge等，1991，“抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體在體內(nèi)通過血腦屏障的選擇性轉(zhuǎn)運”，《藥理學(xué)與實驗治療學(xué)雜志》2766)。
技術(shù)人員會知道將分子與EPO和上述其他試劑通過共價、非共價和其他方式結(jié)合起來的各種方式；另外，對組合物效能的評估可以容易地用實驗系統(tǒng)確定。分子與EPO和類似物的結(jié)合可以周許多方式實現(xiàn)，包括不穩(wěn)定的共價結(jié)合、交聯(lián)等等。在一個實施方案中，例如，要轉(zhuǎn)運穿過屏障的分子與紅細(xì)胞生成素之間的結(jié)合可以是不穩(wěn)定的共價鍵，在這種情況下，分子穿過屏障后從與EPO的結(jié)合物中釋放。在一個實施方案中，可以使用生物素/抗生物素蛋白相互作用。在另一個實施方案中，如上文中提到的，可以通過重組或合成方式制備雜合分子，例如，它包括分子的具有所需藥理學(xué)活性的結(jié)構(gòu)域和能引起EPO受體活性調(diào)制的結(jié)構(gòu)域。
分子可以通過多功能分子、即多功能交聯(lián)劑與EPO或EPO受體活性調(diào)制劑綴合。本文中所用的術(shù)語“多功能分子”包括具有一個能不止一次連續(xù)反應(yīng)的官能團(tuán)的分子，諸如甲醛，以及具有一個以上活性基的分子。本文中所用的術(shù)語“活性基”指的是交聯(lián)劑上的與分子(例如要運送穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障的肽、蛋白質(zhì)、糖類、核酸、特定激素、抗生素、或抗癌劑)上的官能團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)，以便在交聯(lián)劑和該分子之間形成共價鍵。術(shù)語“官能團(tuán)”保持其在有機(jī)化學(xué)中的標(biāo)準(zhǔn)含義。可以使用的多功能分子優(yōu)選生物相容性接頭，即它們在體內(nèi)是非致癌的、非毒性的、和基本上非致免疫的。多功能交聯(lián)劑諸如本領(lǐng)域中已知的那些和本文中描述的那些可以容易地用動物模型加以檢驗以確定它們的生物相容性。多功能分子優(yōu)選為雙功能分子。本文中所用的術(shù)語“雙功能分子”指的是具有兩個活性基的分子。雙功能分子可以是異雙功能分子或同雙功能分子。異雙功能交聯(lián)劑允許向量綴合。對于多功能分子來說特別優(yōu)選的是能充分溶于水，使交聯(lián)反應(yīng)在水溶液中發(fā)生，諸如在pH6-8的緩沖水溶液中，并使所得綴合物保持水溶性以更有效地生物分布。一般說來，多功能分子與氨基或巰基官能團(tuán)共價鍵合。不過，本發(fā)明中也包括帶有其他官能團(tuán)、諸如羧酸或羥基的活性多功能分子。
同雙功能分子有至少兩個活性官能團(tuán)，它們是相同的。同雙功能分子上的活性官能團(tuán)包括例如醛基和活性酯基。具有醛基的同雙功能分子包括例如戊二醛和辛二醛。Poznansky等在《科學(xué)》223，1304-1306(1984)中公開了將戊二醛用作交聯(lián)劑。具有至少兩個活性酯單元的同雙功能分子包括二羧酸和N-羥基琥珀酰亞胺的酯。這類N-琥珀酰亞胺基酯的一些實例包括辛二酸二琥珀酰亞胺基酯和二硫-雙-(丙酸琥珀酰亞胺基酯)，以及它們的可溶性雙磺酸和雙磺酸酯鹽，諸如它們的鈉鹽和鉀鹽。這些同雙功能試劑可以從Pierce，Rockford，Illinois購得。
異雙功能分子具有至少兩個不同的活性基?；钚曰c例如存在于EPO和分子上的不同官能團(tuán)反應(yīng)。與異雙功能交聯(lián)劑上的活性基反應(yīng)的兩個不同官能團(tuán)通常是氨基，例如賴氨酸的ε氨基；巰基，例如半胱氨酸的巰基；羧酸，例如天門冬氨酸上的羧酸酯；或羥基，例如絲氨酸上的羥基。
當(dāng)異雙功能分子的活性基與氨基形成共價鍵時，該共價鍵通常將是酰氨基或亞氨基鍵。與氨基形成共價鍵的活性基可以是，例如活化羧酸酯基、鹵代羰基或酯基。優(yōu)選的鹵代羰基是氯羰基。酯基優(yōu)選活性酯基，諸如象N-羥基-琥珀酰亞胺酯基。
其他官能團(tuán)一般是巰基、能夠轉(zhuǎn)化為巰基的基團(tuán)、或者是與硫基形成共價鍵的基團(tuán)。該共價鍵通常將是硫醚鍵或二硫鍵。與巰基形成共價鍵的活性基可以是例如與巰基或活化二硫鍵反應(yīng)的雙鍵。含有能夠與巰基反應(yīng)的雙鍵的活性基是馬來酰亞胺基，不過也有可能是其他的，諸如丙烯腈?；钚远蚧锘梢允牵?-吡啶基二硫基或5，5′-二硫-雙-(2-硝基苯甲酸)基。含有活性二硫鍵的異雙功能試劑的一些實例包括N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基-二硫基)丙酸酯(Carlsson等，1978，《生物化學(xué)雜志》173723-737)，5-4-琥珀酰亞胺氧基羰基-α-甲基芐基硫代硫酸鈉，和4-琥珀酰亞胺氧基羰基-α-甲基(2-吡啶基二硫基)甲苯。優(yōu)選N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯。包含具有與巰基反應(yīng)的雙鍵的活性基的異雙功能試劑的一些實例包括琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯和琥珀酰亞胺基間馬來酰亞胺基苯甲酸酯。
其他異雙功能分子包括琥珀酰亞胺基3-(馬來酰亞胺基)丙酸酯，磺基琥珀酰亞胺基4-(對馬來酰亞胺基-苯基)丁酸酯，磺基琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基-環(huán)己烷)-1-羧酸酯，馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基-琥珀酰亞胺酯。優(yōu)選琥珀酰亞胺基間馬來酰亞胺基苯甲酸酯的磺酸鈉鹽。上述異雙功能試劑和它們的磺酸鹽中許多可以從Pierce購得。
技術(shù)人員可以容易地確定對上述將是可逆或不穩(wěn)定的綴合的需要?？梢栽隗w外檢驗綴合物的EPO受體活性調(diào)制活性，以及期望的藥理學(xué)活性。如果綴合物保留了這兩種性能，就可接著檢驗其在體內(nèi)的適應(yīng)性。如果綴合分子需要與EPO分離的活性，將優(yōu)選與EPO不穩(wěn)定鍵合或可逆結(jié)合。不穩(wěn)定性特征也可以在進(jìn)行體內(nèi)測試前使用標(biāo)準(zhǔn)體外操作加以檢驗。
有關(guān)如何制備和使用這些以及其他多功能試劑的其他信息可以從下列出版物或本領(lǐng)域中可獲得的其他途徑得到Carlsson等，1978，《生物化學(xué)雜志》173723-737；Cumber等，1985，《酶學(xué)方法學(xué)》112207-224；Jue等，1978，《生物化學(xué)》175399-5405；Sun等，1974，《生物化學(xué)》132334-2340；Blattler等，1985，《生物化學(xué)》241517-152；Liu等，1979，《生物化學(xué)》18690-697；Youle和Neville，1980，《美國國家科學(xué)院院報》775483-5486；Lerner等，1981，《美國國家科學(xué)院院報》783403-3407；Jung和Moroi，1983，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報》761162；Caulfield等，1984，《生物化學(xué)》817772-7776；Staros，J.V.，1982，《生物化學(xué)》213950-3955；Yoshitake等，1979，《歐洲生物化學(xué)雜志》101395-399；Yoshitake等，1982，《生物化學(xué)雜志》921413-1424；Pilch和Czech，1979，《生物化學(xué)雜志》2543375-3381；Novick等，1987，《生物化學(xué)雜志》2628483-8487；Lomant和Fairbanks，1976，《分子生物學(xué)雜志》104243-261；Hamada和Tsuruo，1987，《分析生物化學(xué)》160483-488；和Hashida，1984，《應(yīng)用生物化學(xué)雜志》656-63。另外，Means和Feeney，1990，《生物綴合物化學(xué)》12-12中回顧了交聯(lián)的方法。利用本發(fā)明的上述方法和組合物穿過的屏障包括但不限于血腦屏障、血眼屏障、血睪丸屏障、血卵巢屏障和血胎盤屏障。
用于轉(zhuǎn)運穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障的候選分子包括，例如激素諸如生長激素，神經(jīng)營養(yǎng)因子，抗生素或抗真菌劑諸如通常受到腦和其他屏障器官排斥的那些，肽類放射藥物，反義藥物，生物學(xué)活性試劑的抗體，藥物，和抗癌劑。這類分子的非限制性實例包括生長激素，神經(jīng)生長因子(NGF)，腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BNF)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CTF.)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)，轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGFβ2)，轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGFβ3)，白介素1，白介素2，白介素3和白介素6，AZT，針對腫瘤壞死因子的抗體，和免疫抑制劑諸如環(huán)孢菌素。
在另一個實施方案中，包含EPO的重組嵌合毒素分子可以用于毒素的治療性釋放，以治療病毒性疾病或增殖性疾病，諸如癌癥?？梢耘cEPO稠合來構(gòu)建適于此實施方案的嵌合毒素的化合物包括但不限于毒性物質(zhì)，諸如假單胞菌外毒素、白喉毒素、和蓖麻毒蛋白，等等。
5.3目標(biāo)病況如上所述，本文中提供的EPO組合物和它們的使用方法可以用于治療和預(yù)防由低氧狀況引起的疾病，這些疾病會不利地影響應(yīng)激組織，諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、外周神經(jīng)系統(tǒng)組織或心臟組織中的應(yīng)激組織，諸如象腦、心臟或視網(wǎng)膜。因此，本發(fā)明可以用于治療或預(yù)防在各種各樣的病況和事件中由低氧狀況引起的對應(yīng)激組織的損害。下文中提供了這類病況和事件的非限制性實例。
在可按照本發(fā)明進(jìn)行治療的神經(jīng)元組織病變的保護(hù)的實例中，這類病變包括由神經(jīng)元組織的氧合作用減少而產(chǎn)生的那些。會減少神經(jīng)元組織對氧的利用性、導(dǎo)致壓力、損害和最終神經(jīng)元細(xì)胞死亡的任何病況都可用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。統(tǒng)稱為低氧癥和/或局部缺血的這些病況來自于或者包括但不限于中風(fēng)、血管閉塞、產(chǎn)前或產(chǎn)后缺氧、窒息、壅塞、幾乎淹溺、一氧化碳中毒、吸入煙霧、外傷、包括手術(shù)和放射治療、無脈、癲癇、低血糖、慢性阻塞性肺疾病、肺氣腫、成人呼吸窘迫綜合征、低血壓休克、膿毒性休克、過敏性休克、胰島素休克、鐮狀細(xì)胞危象、心搏停止、節(jié)律障礙、和氮麻醉。
在一個實施方案中，例如，可以給藥EPO來預(yù)防由在手術(shù)操作諸如象腫瘤切除或動脈瘤修復(fù)過程中的損傷或組織損害危險引起的損傷或組織損害。
可以用本文中描述的方法治療的由低血糖引起或產(chǎn)生的其他病變包括胰島素配藥過量，也稱作醫(yī)原性高胰島素血，胰島瘤，生長激素缺乏，腎上腺皮質(zhì)機(jī)能減退，藥物配藥過量，和某些腫瘤。
由應(yīng)激神經(jīng)元組織損害產(chǎn)生的其他病變包括癲癇發(fā)作，諸如癲癇、驚厥或慢性癲癇發(fā)作。其他可治療的病況和疾病包括這類疾病諸如中風(fēng)、多發(fā)性硬化、低血壓、心搏停止、早老性癡呆、帕金森氏病、大腦性麻痹、腦或脊索外傷、AIDS癡呆、與年齡有關(guān)的認(rèn)知功能喪失、記憶喪失、肌萎縮性側(cè)索硬化、癲癇發(fā)作、醇中毒、視網(wǎng)膜局部缺血、青光眼產(chǎn)生的視神經(jīng)損害、和神經(jīng)元損失。
本發(fā)明的方法可以用于治療視網(wǎng)膜組織的疾病和對其的損害。這類病患包括但不限于黃斑變性、視網(wǎng)膜脫離、色素性視網(wǎng)膜炎、動脈硬化性視網(wǎng)膜病、高血壓性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜動脈阻塞、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、低血壓、和糖尿病性視網(wǎng)膜病。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法可以用于保護(hù)或治療由對應(yīng)激組織的放射損害產(chǎn)生的損傷。
本發(fā)明方法的其他功用是治療神經(jīng)毒素中毒，諸如軟骨藻酸牡蠣中毒、神經(jīng)山黧豆中毒和關(guān)島病，肌萎縮性側(cè)索硬化，和帕金森氏病。
如上文中提到的，本發(fā)明還涉及通過外周給藥紅細(xì)胞生成素來增強(qiáng)哺乳動物應(yīng)激組織功能的方法。許多疾病和病況可以使用該方法進(jìn)行治療，并且，該方法可在沒有任何病況或疾病的情況下用于增強(qiáng)認(rèn)知功能。本發(fā)明的這些應(yīng)用在下文中作了更詳細(xì)的描述，包括增強(qiáng)人和非人哺乳動物的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練。
可以用本發(fā)明這個方面的方法治療的涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病況和疾病包括但不限于心境障礙、焦慮癥、抑郁、孤獨癖、注意渙散多動癥和認(rèn)知機(jī)能障礙。這些病況可從神經(jīng)元功能的增強(qiáng)中獲益。
可按照本發(fā)明的教導(dǎo)進(jìn)行治療的其他病患包括睡眠分裂，例如睡眠呼吸暫停和與履行有關(guān)的病患；蛛網(wǎng)膜下和動脈瘤出血，低血壓休克，震蕩性損傷，膿毒性休克，過敏性休克，和各種腦炎和腦膜炎的后遺癥，例如與結(jié)締組織疾病有關(guān)的大腦炎諸如狼瘡。其他用途包括預(yù)防或保護(hù)使免受神經(jīng)毒素中毒，諸如軟骨藻酸牡蠣中毒、神經(jīng)山黧豆中毒和關(guān)島病，肌萎縮性側(cè)索硬化，帕金森氏??；對栓塞或缺血性損傷的手術(shù)后治療；全腦照射；鐮狀細(xì)胞危象；和驚厥。
另一組可用本發(fā)明方法治療的病況包括遺傳或獲得性的線粒體機(jī)能障礙，它們是多種以神經(jīng)元損傷和死亡為象征的神經(jīng)病學(xué)疾病的原因。例如，利氏病(亞急性壞死性腦脊髓病)的特征在于進(jìn)行性視覺喪失和腦脊髓病，是由神經(jīng)元掉離和肌病導(dǎo)致的。在這些情況下，有缺陷的線粒體代謝不能提供足夠的高能量底物來供給應(yīng)激細(xì)胞代謝的燃料。EPO受體活性調(diào)制劑優(yōu)化了各種線粒體疾病中失敗的功能。
如上文中提到的，低氧狀況會不利地影響應(yīng)激組織。應(yīng)激組織包括但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、外周神經(jīng)系統(tǒng)組織和心臟組織。除了上述病況以外，本發(fā)明的方法還可用于治療吸入性中毒諸如吸入一氧化碳和煙霧，嚴(yán)重哮喘，成人呼吸窘迫綜合征，以及壅塞和幾乎淹溺。會造成低氧狀況或通過其他方式誘導(dǎo)應(yīng)激組織損害的其他病況包括可能在不適當(dāng)給藥胰島素中出現(xiàn)的低血糖，或帶有產(chǎn)生胰島素的贅生物(胰島瘤)的低血糖。
據(jù)信來源于應(yīng)激組織損害的各種神經(jīng)心理學(xué)病患可以用本方法進(jìn)行治療。其中可能涉及神經(jīng)元損害并可用本發(fā)明治療的慢性病患包括涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或外周神經(jīng)系統(tǒng)的病患包括與年齡有關(guān)的認(rèn)知功能喪失和老年性癡呆，慢性癲癇發(fā)作，早老性癡呆，帕金森氏病，癡呆，記憶喪失，肌萎縮性側(cè)索硬化，多發(fā)性硬化，結(jié)節(jié)性硬化，肝豆?fàn)詈俗冃?，大腦和進(jìn)行性核上性麻痹，關(guān)島病，雷維小體性癡呆，朊病毒性疾病，諸如海綿狀腦脊髓病，例如克羅伊茨費爾特-雅各布疾病，杭廷頓氏舞蹈病，肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良，F(xiàn)reidrich共濟(jì)失調(diào)和其他共濟(jì)失調(diào)，以及圖雷特綜合征，癲癇發(fā)作疾病諸如癲癇和慢性癲癇發(fā)作，中風(fēng)，腦或脊髓外傷，AIDS癡呆，醇中毒，孤獨癖，視網(wǎng)膜局部缺陷，青光眼，自主功能疾病諸如高血壓和睡眠疾病，以及神經(jīng)精神病學(xué)病患，包括但不限于精神分裂癥，分裂情感性精神障礙，注意力渙散癥，精神抑郁癥，重性抑郁癥，躁狂，著迷-強(qiáng)迫性精神障礙，應(yīng)用精神作用物質(zhì)所致精神障礙，焦慮，驚恐性障礙，以及單相性和雙相性精神障礙。其他神經(jīng)精神病學(xué)和神經(jīng)變性疾病包括，例如在美國精神病學(xué)協(xié)會的精神病診斷和統(tǒng)計手冊(DSM)中列出的那些，其最流行的版本整個結(jié)合在此作為參考。
在另一個實施方案中，包含EPO的重組嵌合毒素分子可以用于毒素的治療性釋放來治療增殖性病患，諸如癌癥，或病毒性病患，諸如亞急性硬化性全腦炎。
5.4藥物制劑和給藥按照本發(fā)明，EPO、其類似物、模擬物、紅細(xì)胞生成素片段、雜合紅細(xì)胞生成素分子、紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合分子、紅細(xì)胞生成素激動劑、腎紅細(xì)胞生成素、腦紅細(xì)胞生成素、其突變蛋白質(zhì)、以及其同類物可以胃腸外給藥，經(jīng)粘膜給藥，例如口服、經(jīng)鼻、直腸、陰道內(nèi)、舌下、粘膜下層或經(jīng)皮給藥。優(yōu)選胃腸外給藥，例如通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，并且還包括但不限于動脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)和皮下給藥。小分子EPO模擬物的優(yōu)選給藥途徑是利用口服途徑。
以外周給藥EPO為有效治療方案的受治療者優(yōu)選人，但也可以是任何動物，優(yōu)選哺乳動物。因此，正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可輕易領(lǐng)會到的那樣，本發(fā)明的方法和藥物組合物特別適于對任何動物、特別是哺乳動物給藥，包括但決不限于家養(yǎng)動物，諸如貓科或犬科動物受治療者，農(nóng)場動物，諸如但不限于牛、馬、山羊、綿羊和豬受治療者，野生動物(無論是在野外還是在動物園中的)，研究動物，諸如小鼠、大鼠、兔子、山羊、綿羊、豬、狗、貓等等。如上面已經(jīng)看到的那樣，馴養(yǎng)的動物，包括寵物和勞作的動物，既是本發(fā)明的神經(jīng)保護(hù)益處的候選者，也是認(rèn)知功能增強(qiáng)的候選者。由低氧癥以及急性和慢性病患包括癲癇引起的神經(jīng)病學(xué)損害在這類動物中是常見的，因此是治療的候選者。在上文中還看到，非人動物的認(rèn)知增強(qiáng)是本發(fā)明的一個益處，于是學(xué)習(xí)、訓(xùn)練和學(xué)會行為的保持可以使用本發(fā)明的教導(dǎo)得以增強(qiáng)、補充和維持。這樣，寵物擁有者的開支和心理壓力就減少了。例如，訓(xùn)練狗和其他家庭動物所需的時間減少了。此外，一般很難訓(xùn)練的野生動物也可以更好地利用本發(fā)明的方法進(jìn)行訓(xùn)練。
5.4.1制劑和有效劑量本發(fā)明還提供了藥物組合物。包含EPO和EPO受體活性調(diào)制劑的藥物組合物可以治療有效劑量對患者給藥來保護(hù)應(yīng)激組織免受損害、增強(qiáng)應(yīng)激組織的功能、或?qū)⒒衔镞\送至應(yīng)激組織。申請人發(fā)現(xiàn)抬高劑量的EPO對調(diào)制應(yīng)激組織和保護(hù)其免受損傷來說是優(yōu)選的。
優(yōu)選有效劑量的選擇將由技術(shù)人員在考慮了若干因素的基礎(chǔ)上確定，這些因素將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。這些因素包括紅細(xì)胞生成素的特定形式及其藥動學(xué)參數(shù)諸如生物利用度、代謝、半衰期等，它們將是在一般用于獲得對藥物化合物的管理批準(zhǔn)時通常的研制過程中就已確定的。就劑量來說要考慮的其他因素包括要治療的病況或疾病或要在正常個體中實現(xiàn)的好處、患者的身體狀況、給藥途徑、給藥是急性的還是慢性的、并行的藥物治療、以及眾所周知的影響所給藥劑功效的其他因素。因此精確的劑量應(yīng)當(dāng)根據(jù)醫(yī)師的判斷和每位患者的具體情況來定，例如根據(jù)按照標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定的患者個體的病情和免疫狀態(tài)。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了適于調(diào)制應(yīng)激組織、增強(qiáng)認(rèn)知功能或運送化合物穿過內(nèi)皮緊密接點的劑量單位形式的藥物組合物，每劑量單位包含有效無毒量的約50,000至500,000單位、60,000至500,000單位、70,000至500,000單位、80,000至500,000單位、90,000至500,000單位、100,000至500,000單位、150,000至500,000單位、200,000至500,000單位、250,000至500,000單位、300,000至500,000單位、350,000至500,000單位、400,000至500,000單位或450,000至500,000單位范圍內(nèi)的EPO、EPO受體活性調(diào)制劑、或EPO-活化受體調(diào)制劑和藥學(xué)上可接受的載體。在優(yōu)選的實施方案中，EPO的有效無毒量在約50,000至500,000單位范圍內(nèi)。
在一個實施方案中，EPO的這種藥物組合物可以全身性給藥來保護(hù)應(yīng)激組織免受損害、增強(qiáng)應(yīng)激組織的功能、或運送化合物至應(yīng)激組織。這種給藥可以是胃腸外的，經(jīng)粘膜的，例如口服、經(jīng)鼻、直腸、陰道內(nèi)、舌下、粘膜下層或經(jīng)皮給藥、優(yōu)選胃腸外給藥，例如通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，并且還包括但不限于動脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)和皮下給藥。
在一個優(yōu)選的實施方案中，EPO可以每次給藥2000-10000單位/kg體重、優(yōu)選約2000-5000單位/kg體重、首選5000單位/kg體重的劑量全身性給藥。這種有效劑量應(yīng)當(dāng)在EPO給藥后足以使EPO的血清濃度大于約10,000、15,000或20,000mU/ml血清。這種血清濃度可以在給藥后約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時達(dá)到。根據(jù)需要可以反復(fù)給予這些劑量。例如，只要臨床上需要，可以每天重復(fù)給藥，或者在適當(dāng)?shù)拈g隔后給藥，例如每1到12周給藥一次，優(yōu)選每3到8周給藥一次。在一個實施方案中，有效量的EPO和藥學(xué)上可接受的載體可以包裝在單劑小瓶或其他容器中。在一個實施方案中，EPO是非紅細(xì)胞生成性的，即它能產(chǎn)生本文中描述的活性但不會引起血紅蛋白濃度或血細(xì)胞比容的增加。在另一個實施方案中，EPO以比最大地刺激紅細(xì)胞生成所需的劑量更大的劑量給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可以包含治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。在一個具體實施方案中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指被聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或者列在美國藥典或其他普遍承認(rèn)的藥典中用于動物、更特別是用于人的。術(shù)語“載體”指的是與治療劑一起給藥的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。這類藥物載體可以是無菌液體，諸如鹽水的水和油溶液，包括石油、動物、植物或合成來源的那些油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。當(dāng)藥物組合物靜脈給藥時，鹽水溶液是優(yōu)選的載體。鹽水溶液和含水葡萄糖以及甘油溶液也可用作液體載體，特別是用于注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、一硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，組合物還可含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以采用溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末劑、緩釋制劑等形式。組合物可以配制成栓劑，帶有傳統(tǒng)的粘合劑和載體諸如甘油三酯。本發(fā)明化合物可以配制成中性或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括與游離氨基形成的那些，諸如從鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等得到的那些，和與游離羧基形成的那些，諸如從氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等得到的那些。合適的藥物載體的實例是在E.W.Martin的“Remington藥物科學(xué)”中記載的。這類組合物將含有治療有效量的化合物，優(yōu)選為純化形式，再加上適宜量的載體，以便為患者提供合適的給藥形式。制劑應(yīng)當(dāng)與給藥方式相適應(yīng)。
適于口服給藥的藥物組合物可以制成膠囊或片劑；制成粉末或顆粒；制成溶液、糖漿或懸浮液(在含水或非含水液體中)；制成可食用泡沫或打散泡沫劑(whips)；或者制成乳劑。片劑或硬明膠膠囊劑可以包含乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂、硬脂酸或其鹽。軟明膠膠囊劑可以包含植物油、蠟、脂肪、半固體或液體多元醇等。溶液和糖漿劑可以包含水、多元醇和糖。
打算口服給藥的活性藥劑可以用能延遲活性藥劑在胃腸道中的崩解和/或吸收的物質(zhì)包衣或與之混合(例如可以使用一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)。因此，活性藥劑的持續(xù)釋放可以經(jīng)過數(shù)小時達(dá)到，并且如果需要，可以保護(hù)活性藥劑使其不在胃中被降解。用于口服給藥的藥物組合物可以進(jìn)行配制后用于幫助將活性藥劑根據(jù)特定pH或酶條件釋放在特定胃腸部位。
適于經(jīng)皮給藥的藥物組合物可以制成打算與接受者的表皮保持長時間緊密接觸的離散貼敷片劑。適于局部給藥的藥物組合物可以制成軟膏劑、膏霜劑、懸浮液、洗液、粉末劑、溶液劑、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油劑。至于對皮膚、口腔、眼睛或其他外部組織的局部給藥，優(yōu)選使用局部軟膏劑或膏霜劑。當(dāng)配制成軟膏劑時，活性成分可以與石蠟或水混溶性軟膏基質(zhì)一起使用。另一方面，活性成分可以與水包油型基質(zhì)或油包水型基質(zhì)一起配制成膏霜劑。適于對眼睛局部給藥的藥物組合物包括滴眼劑。在這些組合物中，活性成分可以溶解或懸浮于合適的載體例如含水溶劑中。適于在口腔中局部給藥的藥物組合物包括錠劑、軟錠劑和漱口劑。
適于鼻部給藥的藥物組合物可包含固體載體諸如粉末(優(yōu)選粒徑在20至500微米范圍內(nèi))。粉末劑可以用鼻吸藥的方式給藥，即從放在鼻子近處的粉末容器中通過鼻子迅速吸入給藥。另一方面，適于鼻部給藥的組合物可以包含液體載體，例如鼻噴霧劑或滴鼻劑。這些組合物可以包含活性成分的水或油溶液。用于通過吸入給藥的組合物可以裝在專門配套的設(shè)備中，包括但不限于加壓氣溶膠、噴霧器或吹入器，它們可以裝配成能提供預(yù)定劑量的活性成分。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物經(jīng)由鼻腔給藥到肺部。
適于直腸給藥的藥物組合物可以配制成栓劑或灌腸劑。適于陰道給藥的藥物組合物可以配制成陰道栓、陰道塞、膏霜、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧制劑。
適于胃腸外給藥的藥物組合物包括含水和不含水的無菌注射溶液或懸浮液，它們可以含有抗氧劑、緩沖劑、制菌劑和使得組合物基本上與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)。這類組合物中可以存在的其他成分包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。適于胃腸外給藥的組合物可以裝在單劑或多劑容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并可以冷凍干燥(凍干)狀態(tài)儲存，只需要在即刻使用前加入無菌液體載體例如注射用無菌鹽水溶液即可。當(dāng)時配制用的注射溶液和懸浮液可以用無菌粉末、顆粒和片劑制備。
在優(yōu)選實施方案中，組合物按照常規(guī)操作配制成適于對人類靜脈內(nèi)給藥的藥物組合物。一般說來，用于靜脈內(nèi)給藥的組合物是在無菌等滲含水緩沖液中的溶液。需要時，該組合物還可包括增溶劑和局麻劑諸如利多卡因以減輕注射部位的疼痛。通常，各成分分離或混合在一起地制成單位劑型，例如制成干燥的凍干粉末或無水濃縮物裝在密封容器諸如指示出活性藥劑量的安瓿或藥囊中。當(dāng)組合物打算通過輸液給藥時，它可以用含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶調(diào)劑。當(dāng)組合物通過注射給藥時，可以提供一安瓿的無菌注射用水或鹽水，以便各成分可以在給藥前混合。
栓劑通常含有0.5％至10重量％范圍內(nèi)的活性成分；口服制劑通常含有10％至95％的活性成分。
本發(fā)明還提供了包含填充了一種或多種本發(fā)明藥物組合物各成分的一個或多個容器的藥包或試劑盒。這些容器可選地伴隨有為由調(diào)控藥物或生物制品的制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定形式的說明書，該說明書反映了管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)其出于對人給藥的目的制造、使用或銷售。
5.4.2給藥方法本發(fā)明提供了外周給藥EPO來增強(qiáng)功能或保護(hù)應(yīng)激組織和運送化合物至這類組織的組合物和方法。如上面所看到的那樣，本發(fā)明部分地基于這樣的發(fā)現(xiàn)外周給藥的EPO在應(yīng)激組織、諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、外周神經(jīng)系統(tǒng)組織或心臟組織中具有直接的神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)增強(qiáng)性能。本文中所用的“應(yīng)激組織”包括但不限于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元組織以及心臟組織。本部分描述了這類化合物以及它們的給藥方法。
本發(fā)明提供了利用不同于直接給藥到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的給藥途徑來給藥EPO和EPO受體活性調(diào)制劑的方法，這些不同途徑統(tǒng)一用術(shù)語“外周”和“全身”途徑表示。外周給藥包括口服或胃腸外給藥，諸如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸、粘膜下層或真皮內(nèi)給藥。也可使用其他途徑給藥本文中所述的藥劑。本文中提供了急性和慢性給藥。
在一個實施方案中，例如，EPO可以用控釋系統(tǒng)釋放。例如，多肽可以使用靜脈內(nèi)輸液、可植入滲透泵、經(jīng)皮貼敷片、脂質(zhì)體或其他給藥方式給藥。在一個實施方案中，可以使用泵(參見Langer，同上；Sefton，1987，《CRC Crit.Ref.Biomed.Eng》14201；Buchwald等，1980，《外科學(xué)》88507；Saudek等，1989，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》321574)。在另一個實施方案中，化合物可以用載體、特別是脂質(zhì)體釋放(參見Langer，《科學(xué)》2491527-1533(1990)；Treat等，載于《傳染病和癌癥治療中的脂質(zhì)體》，Lopez-Berestein和Fidler(編輯)，Liss，New York，353-365頁(1989)；WO 91/04014；美國專利No.4,704,355；Lopez-Berestein，出處同上，317-327頁；普遍地參見上述文獻(xiàn))。在另一個實施方案中，可以使用聚合物材料[參見《控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用》，Langer和Wise(編輯)，CRC PressBoca Raton，F(xiàn)lorida，1974；《可控的藥物生物利用度藥品的設(shè)計和表現(xiàn)》，Smolen和Ball(編輯)，WileyNewYork(1984)；Ranger和Peppas，《大分子科學(xué)評論與大分子化學(xué)雜志》2361，1953；還參見Levy等，1985，《科學(xué)》228190；During等，1989，《神經(jīng)病學(xué)紀(jì)事》25351；Howard等，1989，《神經(jīng)外科學(xué)雜志》71105)。
在又一個實施方案中，可以將控釋系統(tǒng)置于治療目標(biāo)、即腦附近，因此只需要一小部分全身劑量(參見，例如Goodson，115-138頁，載于《控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用》，第2卷，同上，1984)。在Langer(1990，《科學(xué)》2491527-1533)的回顧中討論了其他控釋系統(tǒng)。
在另一個實施方案中，經(jīng)過適當(dāng)制劑的EPO可以通過鼻、口腔、直腸、陰道或舌下途徑給藥。
在一個具體的實施方案中，可以預(yù)期將本發(fā)明的EPO組合物局部給藥到需要治療的區(qū)域；這可以通過這樣一些方式實現(xiàn)例如但不限于手術(shù)過程中局部輸注，局部應(yīng)用，例如與手術(shù)后的傷口敷料結(jié)合，通過注射，借助導(dǎo)管，借助栓劑，或借助植入物，所述植入物是多孔、非多孔或凝膠狀物質(zhì)，包括膜，諸如硅橡膠膜，或纖維。
參照以下非限制性實施例可以更好地理解本發(fā)明，這些實施例只是作為本發(fā)明的示范。給出以下實施例是為了更全面地說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。但是，它們決不應(yīng)當(dāng)理解為是對本發(fā)明寬范圍的限制。
正如下文中描述的那樣，在此處發(fā)明人進(jìn)行的研究都是在能預(yù)示預(yù)防和治療益處的動物模型上進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)的、全世界公認(rèn)的試驗。
6.實施例1外周給藥的EPO增強(qiáng)了認(rèn)知功能在該實施例中，一種稱作Morris水迷路試驗的空間定位實驗顯示了EPO誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知功能的增強(qiáng)。在該試驗中，將一個小的透明平臺置于四分之一的帶有不透明水的游泳池中。放到該游泳池中的小鼠必須游泳，直到它們到達(dá)表面下的休息平臺上，該平臺是游泳的小鼠看不到的。試驗包括測量動物到達(dá)平臺所用的時間(即它們游泳所花費的時間長度)。在連續(xù)試驗中，每只小鼠到達(dá)平臺所用的時間將作為學(xué)習(xí)其定位的它們的函數(shù)減少。這種學(xué)習(xí)實驗類型涉及海馬，因為海馬損害在該試驗中妨礙學(xué)習(xí)。
實驗在一個直徑為150cm的圓形黑池子中進(jìn)行。任意指派四個點為北、南、東和西。每四分之一部分賦予一些可視的區(qū)別線索例如，閃光、四方形布置的明亮的帶子等等，以確定小鼠在池中的方向。平臺任意放置在一個四分之一圓中。試驗包括將動物頭向前地放到池子的一個四分之一圓中并松開它。試驗長度總共為90秒。如果動物沒能到達(dá)平臺，就將它置于平臺上再呆15秒。讓受驗動物休息1小時，然后放到另一個四分之一圓中進(jìn)行測試。在1天的試驗中所有4個四分之一圓都要使用，且動物連續(xù)試驗12天(即，總共48次試驗)。
實驗本身包括在12天試驗的每一天中，在開始當(dāng)天的試驗之前4小時給每只小鼠腹膜內(nèi)注射5000U/kg的重組人EPO(Ortho-Biotech公司以商品名PROCRIT出售的)。對照動物用鹽水假注射。
通過測量每只小鼠在平臺上的時間長度來估量學(xué)習(xí)情況。如圖1A中所示，根據(jù)EPO治療組和假物組在平臺上的時間將結(jié)果繪圖。結(jié)果顯示，在連續(xù)的每個試驗日子里，這兩組動物都花了更多的時間在平臺上，即它們學(xué)會了更快地到達(dá)平臺，但EPO治療動物確實比假物組更快地做到這一點。因此EPO治療動物具有比假物組更快的“學(xué)習(xí)曲線”。當(dāng)結(jié)果表示為EPO治療組與假物治療組之間的差異，并對EPO和假物治療組的結(jié)果進(jìn)行對比時，回歸線(R2＝0.88)顯示顯著不同于斜率1的斜率(0.68)，明顯有利于EPO組(圖1B)。
7.實施例2外周給藥的EPO加強(qiáng)了學(xué)會的條件性味覺移轉(zhuǎn)本實施例中進(jìn)行的條件性味覺移轉(zhuǎn)(CTA)試驗證明EPO顯著地影響了小鼠記憶并學(xué)會避開討厭的味覺感受的能力，討厭的味覺感受在本實驗的情況下是導(dǎo)致疾病的物質(zhì)。在本實施例中，用氯化鋰來產(chǎn)生CTA，因為氯化鋰能以劑量依賴方式可靠地產(chǎn)生不適和厭食。象一種自然發(fā)生的疾病，鋰通過刺激上文中所述的途徑，包括細(xì)胞因子釋放，來產(chǎn)生CTA。
訓(xùn)練雌性Balb/c小鼠，將它們每天的總攝水量限制到一天飲用一次5分鐘，并學(xué)會在此期間飲夠足量的水來保持平衡。將動物分成幾組并給藥假物對照(鹽水)或EPO(5000U/kg)，腹膜內(nèi)注射(IP)，在給予新奇的糖精-香草液體之前4小時給藥。飲用完甜的液體后，動物立即接受鹽水或致病劑量的鋰(20mg/kg，0.15M LiCl，IP注射)。之后，動物分成三組進(jìn)行處理。第一組(對照)飲水后不注射鋰。第二組注射鋰和EPO。第三組(假物)注射鹽水(沒有EPO)和鋰。
通過測量在其后接著接觸致病溶液-新奇的糖精-香草液體的飲水的減少來估量條件性味覺移轉(zhuǎn)。從鋰或假物治療中恢復(fù)5天后，對缺水的動物再次給予相同的新奇的糖精-香草液體。圖2A中顯示了與組1(對照)相對比的組2和組3結(jié)果的繪圖。第2天代表動物習(xí)慣試驗籠后水消耗的基線。在第3天，動物腹膜內(nèi)注射鹽水或EPO(5000U/kg)，4小時后給予新奇的糖精-香草液體，接著用鋰或假物鹽水處理(箭頭)。在第3天時，這種處理導(dǎo)致所有組中的液體消耗少量減少，這是注射和新奇的液體先前已證明過的副作用。對于對照組，恢復(fù)后，用于確定CTA的第一次試驗顯示水消耗沒有減少。但是，接受了鋰的動物顯示事實上完全厭惡該液體，盡管它缺水(第4天)。連續(xù)缺水最終使CTA消失(第5-9天)，但特征是接受了EPO的動物恢復(fù)得顯著更遲，如圖2A中的實心圓所示。
通過考慮每個試驗日子里的缺水程度可更好地領(lǐng)會此處確立的CTA的穩(wěn)健性，因為忍受缺水的EPO治療動物大約是假物注射受驗動物的兩倍(圖2B)。盡管EPO組顯示了明顯強(qiáng)烈的CTA，但該組中的動物與假物組相比更迅速地接近飲水管，如圖2C中所示。CTA的強(qiáng)度通過重復(fù)注射單獨的鋰(沒有EPO)來顯示，這產(chǎn)生了減弱的CTA，在EPO組中減弱得更多(圖2A，第10天)。這些數(shù)據(jù)顯示EPO預(yù)處理與用鋰產(chǎn)生的CTA的顯著加強(qiáng)有關(guān)。
8.實施例3外周給藥的EPO保護(hù)腦免受興奮毒素的傷害本實施例證明EPO穿過了血腦屏障并對用紅藻氨酸神經(jīng)毒素處理的小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用。大自然中存在許多對神經(jīng)元顯示特異性毒性的化合物。這些分子一般與氨基酸遞質(zhì)谷氨酸鹽的內(nèi)源性受體相互作用，隨后引起過度刺激和神經(jīng)元損傷。這些中的一點廣泛用于研究因興奮毒性導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的物質(zhì)紅藻氨酸鹽，是一種谷氨酸鹽類似物。紅藻氨酸鹽是特異性破壞神經(jīng)元的一種強(qiáng)神經(jīng)毒素，特別是位于有高密度紅藻氨酸鹽受體的區(qū)域諸如海馬中的那些，它誘導(dǎo)癲癇發(fā)作、腦損傷和死亡。
以下神經(jīng)毒性研究使用紅藻氨酸鹽用小鼠進(jìn)行。這種模型用于評定治療對疾病諸如精神運動性癲癇的保護(hù)益處。對實驗動物諸如大鼠和小鼠進(jìn)行胃腸外注射，以劑量依賴方式引起部分(緣)癲癇發(fā)作，然后其可能擴(kuò)散并引起死亡。進(jìn)行該部分中記載的實驗來測試外周給藥的EPO是否穿過血腦屏障，如果是，EPO對神經(jīng)元能量平衡是否有作用，特別是它是否具有對抗紅藻氨酸鹽的神經(jīng)保護(hù)作用。
為此，對雌性Balb/c小鼠(平均重15-20gm)進(jìn)行預(yù)測，在接受紅藻氨酸鹽(Sigma Chemical)之前、之時或之后的特定時間點腹膜內(nèi)注射5000U/kg的重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO；由Ortho-Biotech公司以商標(biāo)PROCRIT出售的)或鹽水(假物)，還以特定濃度IP注射(物質(zhì)/kg體重)。然后對受驗動物進(jìn)行監(jiān)測并對接受紅藻氨酸鹽后20分鐘時的癲癇發(fā)作活性的發(fā)展加以評分。每次試驗在紅藻氨酸鹽給藥后60分鐘終止。如圖3A中所示，EPO預(yù)處理顯著降低了用紅藻氨酸鹽處理的小鼠的癲癇發(fā)作的嚴(yán)重性并延遲了癲癇發(fā)作狀態(tài)的開始。EPO-和假物-治療動物之間的比較顯示接受劑量為20-30mg/kg范圍內(nèi)的紅藻氨酸鹽的動物的死亡率顯著降低，表明了用EPO預(yù)處理所產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用。每個條柱下圓括號中的數(shù)字指示接受每種紅藻氨酸鹽劑量的動物數(shù)。
圖3B中顯示了EPO在提供抗紅藻氨酸鹽的神經(jīng)保護(hù)作用中的劑量依賴性。對小鼠給藥EPO(5000U/kg；每天IP注射，最多5天)。通過測定紅藻氨酸鹽給藥(20mg/kg)后的存活來評定每劑EPO的神經(jīng)保護(hù)作用，對于對照動物(未給EPO；參見圖3A)，給藥紅藻氨酸鹽產(chǎn)生了大約50％的死亡率。條柱指示了與假物注射動物相比EPO治療動物存活率的提高。如圖3B中所示，隨著另一劑5000U/kg的EPO，神經(jīng)保護(hù)作用增加了。
EPO所提供的神經(jīng)保護(hù)的特征在于發(fā)病延遲，特點是基因表達(dá)程序的激活。圖3C顯示了在紅藻氨酸鹽給藥(20mg/kg)時給予的單劑EPO對于由癲癇發(fā)作引起的死亡的與EPO有關(guān)的延遲(以分鐘計)沒有提供任何立即的保護(hù)作用，而在紅藻氨酸鹽之前24小時給予的EPO改善了癲癇發(fā)作的潛伏期和嚴(yán)重性以及死亡的時間。這種作用持續(xù)最多7天。
9.實施例4外周給藥的EPO保護(hù)腦免受因局部缺血導(dǎo)致的損害先前使用沙土鼠球形再灌注模型進(jìn)行的體內(nèi)研究已表明阻塞流向腦部的血流導(dǎo)致腦中細(xì)胞死亡，且直接注射到大腦皮質(zhì)中的EPO保護(hù)腦使其免受了這種細(xì)胞死亡(Sakanaka等，1998，《美國國家科學(xué)院院報》954635)。在本實施例中記載的實驗第一次顯示了在局部缺血的動物模型中外周釋放的EPO防衛(wèi)了體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的死亡。
以下實驗使用大腦中動脈閉塞模型進(jìn)行，這是一種本領(lǐng)域公認(rèn)的缺血性局灶性中風(fēng)模型。在實驗方案中，雄性大鼠(體重250gm)用苯巴比妥麻醉并維持在37℃。目測檢驗頸動脈，并將同側(cè)頸動脈永久性閉合。目測檢驗同側(cè)大腦中動脈(MCA)并在其起點處進(jìn)行燒灼。對側(cè)動脈用鉗子夾住使閉合1小時。24小時后將動物處死，取出腦并切成1mm系列切片。通過原位三苯基四唑鎓還原使活組織從壞死區(qū)域中顯現(xiàn)來目測檢驗?zāi)芑畹慕M織。局部缺血的中心和周圍的邊緣部分都產(chǎn)生了細(xì)胞死亡。
使用這種MCA模型，EPO在損傷之前的不同時間和損傷后立即通過外周注射給藥，損傷的體積利用計算機(jī)輔助圖像分析加以定量。圖4A中顯示的該分析的結(jié)果表明了在中風(fēng)后的以下時間用EPO治療的效果中風(fēng)前24小時、在中風(fēng)時、以及在中風(fēng)后第3、6和9小時。如圖4A中所示，EPO當(dāng)在中風(fēng)后最多6小時給藥時保護(hù)組織免受了壞死損傷。
有趣而形成對照的是，先前已報道有向神經(jīng)活性、在體外促進(jìn)軸突的生長和來自體內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞髓鞘形成的從EPO衍生的17聚體(Campana等，1998，《國際分子醫(yī)學(xué)雜志》1235-41；1997年12月23日公布的美國專利5,700,909)在該系統(tǒng)中沒有保護(hù)對抗損傷的作用(圖4B，“17聚體”)。因此，這種模型，以及本發(fā)明提供的用于測定EPO對應(yīng)激組織功能的影響的其他方法可以用于鑒別能用于調(diào)制應(yīng)激組織功能、諸如保護(hù)其免受損害或增強(qiáng)學(xué)習(xí)和認(rèn)知的EPO和EPO受體活性調(diào)制劑。
10.實施例5外周給藥的EPO保護(hù)腦免受鈍性外傷在一種機(jī)械外傷模型-皮質(zhì)撞擊模型中，通過全身性給藥EPO的預(yù)治療保護(hù)小鼠腦部免受了鈍傷。為了產(chǎn)生外傷，采用能精確地釋放打擊到頭顱的直徑3mm的充氣驅(qū)動的活塞(Clippard Valves)。將每只小鼠麻醉并安全地置于立體定位設(shè)備中以防止頭移動。切開頭皮以確定前囟的位置，這是最初用活塞打擊位置的參考點。然后通過將活塞移動至距前囟尾側(cè)2mm和前側(cè)2mm來調(diào)節(jié)活塞的位置并通過使用精確的氮氣脈沖進(jìn)行撞擊。這種設(shè)備允許精確地選擇活塞速度(4m/s)和撞擊移位(2mm)。
小鼠在損傷24小時前、損傷時和損傷3、6或9小時后用EPO(5000U/kg)治療并繼續(xù)每天給藥。10天后將小鼠處死，隨后對腦進(jìn)行檢驗并確定腦壞死的體積。在假物治療小鼠中，觀察到大面積的壞死(圖5)，且有大量的單核細(xì)胞浸潤。與此相對照，當(dāng)動物用EPO預(yù)治療或在損傷后不超過3小時給藥EPO時，動物被保護(hù)而沒有受到這種損害，并且在損傷面積中只檢測到很少的單核細(xì)胞。
11.實施例6外周給藥的EPO保護(hù)心肌免受局部缺血損傷本實施例示范了EPO在保護(hù)心臟組織對抗低氧損傷中的作用。為此，大鼠在按照Latini等(1999，《心血管藥理學(xué)雜志》31601-8)進(jìn)行操作前24小時用EPO(5000U/kg)進(jìn)行預(yù)測。隨后，將受驗動物麻醉，置于輔助通氣上并進(jìn)行胸廓切開術(shù)。確定心臟及其內(nèi)部循環(huán)，將可除去的縫線置于左前下行冠狀動脈最鄰近部分周圍，然后結(jié)扎。然后給藥另一劑EPO(5000U/kg)，并使閉塞保持30分鐘。此時，松開結(jié)扎線，使動物再維持深度麻醉6小時，隨后處死。死亡后立即取出心臟并取出受影響區(qū)域部分(AAR)以及未受影響區(qū)域部分(小隔)并制備用于生物化學(xué)分析。評定兩個參數(shù)作為心肌存活量度的肌酸激酶(CK)(CK越低，組織活力越小)和髓過氧化物酶，這是單核細(xì)胞浸潤的產(chǎn)物。結(jié)果顯示在圖6A和圖6B中。如這些圖中所示，用EPO治療產(chǎn)生了維持的CK活性，這與組織活力增加一致，和相對于對照的降低的MPO活性，無論是在梗死面積(AAR)還是在灌注的左心室(LV)自由內(nèi)壁中，表明被炎性細(xì)胞的浸潤顯著減少。
12.實施例7外周給藥的EPO減少了實驗性變應(yīng)性腦炎大鼠的實驗性變應(yīng)性(或自身免疫性)腦脊髓炎(EAE)是本領(lǐng)域公認(rèn)的多發(fā)性硬化(MS)的動物模型。已開發(fā)了用于免疫學(xué)、病毒學(xué)、毒性和外傷參數(shù)的多種EAE動物模型，以便了解MS的特征。
為了測試EPO是否能保護(hù)對抗EAE的癥狀，進(jìn)行以下實驗。6-8周齡的雌性Lewis大鼠(Charles River，Calco，Italy)在醚淺麻醉下通過向兩個后足墊中注射50μg豚鼠髓磷脂堿性蛋白(MBP；Sigma，St.Louis，MO)的水溶液進(jìn)行免疫，所述蛋白用等體積的帶有加入到H37Ra(Difco，Detroit，MI)中的7mg/ml熱殺死的結(jié)核分支桿菌的完全弗氏佐劑(CFA，Sigma)乳化，終體積為100μl。
治療后，每天評定大鼠的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的征兆并如下計分0，沒有疾??；1，尾巴無力；2，共濟(jì)失調(diào)；3，后肢完全麻痹且尿失禁。同時還監(jiān)測體重。大鼠在免疫后第3天開始給藥EPO(5000U/kg，IP，每天一次)，持續(xù)到第18天。對照大鼠只接受單獨的載體。如圖7所示，用EPO治療的大鼠顯示出得分改善(即得分較低)和疾病持續(xù)時間的改善。另外，在用EPO治療的大鼠中注意到了癥狀開始的顯著延遲。
13.實施例8保護(hù)應(yīng)激組織所需的EPO的最小有效劑量和藥動學(xué)使用上述局灶性缺血性中風(fēng)動物模型評定EPO的最佳和有效劑量。如圖8A所示，小于450單位/kg體重的EPO劑量在保護(hù)應(yīng)激組織免受壞死損傷中的有效性是不可靠的。如圖8B所示，在動物研究中，對四只雌性受驗小鼠IP注射給藥的大約為5000單位/kg體重的劑量在給藥后5小時內(nèi)產(chǎn)生了大于20,000mU/ml血清的EPO循環(huán)濃度，在給藥后10小時產(chǎn)生了大于10,000mU的循環(huán)濃度，但給藥24小時后濃度小于5單位/ml。
14.實施例9紅細(xì)胞生成素介導(dǎo)的CNS釋放下文中記載的實驗顯示與EPO綴合的分子成功地轉(zhuǎn)運穿過了血腦屏障以及其在基膜內(nèi)的定位。如圖9A所示，腦切片用EPO受體(EPO-R)的抗體染色，其顯示腦毛細(xì)血管表達(dá)高水平的EPO-R。為了研究EPO是否能被轉(zhuǎn)運穿過血腦屏障，EPO如下所述用生物素標(biāo)記。含有rhEPO的物質(zhì)使用Centricon-10濾器(Millipore)濃縮并通過讀取280nm波長下的吸光度讀數(shù)測量回收率。接著，將0.2mg長臂生物素(Vector Labs)溶于100μl DMSO，將其加入到濃縮rhEPO溶液中并立即渦旋攪拌。該混合物然后在室溫下溫育4小時，同時輕微攪拌并避光。通過使用Centricon-10層析柱從溶液中除去未結(jié)合的生物素。然后生物素化EPO對動物IP給藥，5小時后，將動物處死。腦切片用與過氧化物酶偶合的抗生物素蛋白標(biāo)記，加入二氨基聯(lián)苯胺直到生成可用于利用光顯微鏡檢查進(jìn)行觀測的足夠反應(yīng)產(chǎn)物。在對EPO-R陽性染色的相同毛細(xì)血管中同時并存EPO(圖9B)。在以后的時間點，生物素標(biāo)記看來在特定神經(jīng)元中定位(例如17小時的時候，圖9C)。與此對照，如果將冷的EPO以100倍過量加入到標(biāo)記過的EPO中，所有特異性染色就都消除了。結(jié)果證明全身性給藥的綴合EPO化合物成功地被運送穿過了血腦屏障。
全身給藥的EPO-生物素綴合物成功地穿過血腦屏障運送到腦中證明其他治療化合物可以用類似的方式通過將EPO與所需化合物復(fù)合而運送穿過血腦屏障。作為一個例子，腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BNF)可以使用標(biāo)準(zhǔn)操作通過碳二亞胺偶聯(lián)共價偶合到EPO上。純化后，該綴合物可以經(jīng)腹膜內(nèi)注射對動物給藥。BNF對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的積極作用可以相對對照動物加以測量，以估量與EPO結(jié)合的該分子的成功轉(zhuǎn)運，而非綴合BNF沒有中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性。
本發(fā)明不限于所述具體實施方案描述的范圍，這些具體實施方案只是對本發(fā)明各個方面的個別說明，功能上等價的方法和組分也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。的確除了本文中所顯示和描述的之外，對本發(fā)明的各種改進(jìn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將從前面的說明和附圖變得顯而易見。這些改進(jìn)也有意落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
本文中提及的所有參考文獻(xiàn)都全文引用在此作為參考。
權(quán)利要求
1.一種適于調(diào)制應(yīng)激組織、增強(qiáng)認(rèn)知功能或運送化合物穿過內(nèi)皮緊密接點的劑量單位形式的藥物組合物，每劑量單位包含有效無毒量的約50,000至500,000單位范圍內(nèi)的EPO、EPO受體活性調(diào)制劑、EPO-活化受體調(diào)制劑、或其聯(lián)合形式，以及藥學(xué)上可接受的載體。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中有效無毒量的EPO包含50,000至500,000單位的EPO。
3.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中EPO的有效無毒量是能有效地達(dá)到大于10,000mU/ml血清的EPO循環(huán)濃度的劑量。
4.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中EPO的循環(huán)濃度在EPO給藥約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時后測量。
5.一種藥物試劑盒，它帶有包含權(quán)利要求2所述藥物組合物的一個或多個容器。
6.一種保護(hù)哺乳動物免受由應(yīng)激組織損傷產(chǎn)生的病變的方法，包括對所述哺乳動物外周給藥有效量的EPO、EPO受體活性調(diào)制劑或EPO-活化受體調(diào)制劑來保護(hù)應(yīng)激組織。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述損傷是以下疾病的結(jié)果癲癇發(fā)作、多發(fā)性硬化、中風(fēng)、低血壓、心搏停止、局部缺血、心肌梗死、炎癥、與年齡有關(guān)的認(rèn)知功能喪失、放射損害、大腦性麻痹、神經(jīng)變性疾病、早老性癡呆、帕金森氏病、利氏病、AIDS癡呆、記憶喪失、肌萎縮性側(cè)索硬化、醇中毒、心境障礙、焦慮癥、注意力渙散癥、孤獨癖、克羅伊茨費爾特-雅各布疾病、腦或脊索外傷、心-肺旁路、青光眼、視網(wǎng)膜局部缺血或視網(wǎng)膜外傷。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述損傷是低氧癥的結(jié)果。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述低氧癥是產(chǎn)前或產(chǎn)后缺氧、窒息、壅塞、幾乎淹溺、手術(shù)后認(rèn)知機(jī)能障礙、一氧化碳中毒、煙霧吸入、慢性阻塞性肺疾病、肺氣腫、成人呼吸窘迫綜合征、低血壓休克、膿毒性休克、過敏性休克、胰島素休克、鐮狀細(xì)胞危象、心搏停止、節(jié)律障礙、氮麻醉或局部組織低氧癥。
10.一種增強(qiáng)哺乳動物正常或異常應(yīng)激組織功能的方法，包括對所述哺乳動物外周給藥外周有效應(yīng)激組織增強(qiáng)量的EPO、EPO受體活性調(diào)制劑、EPO-活化受體調(diào)制劑或其聯(lián)合形式。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述增強(qiáng)應(yīng)激組織的功能增強(qiáng)了聯(lián)想學(xué)習(xí)或記憶。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述增強(qiáng)應(yīng)激組織的功能可用于治療心境障礙、焦慮癥、抑郁、孤獨癖、注意渙散多動癥、早老性癡呆、衰老或認(rèn)知機(jī)能障礙。
13.權(quán)利要求6或10的方法，其中所述應(yīng)激組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織、外周神經(jīng)系統(tǒng)組織或心臟組織。
14.權(quán)利要求6或10的方法，其中所述給藥包括口服、局部、管腔內(nèi)給藥或通過吸入或胃腸外給藥。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述胃腸外給藥是靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、粘膜下層或真皮內(nèi)給藥。
16.權(quán)利要求6或10的方法，其中所述給藥是急性或慢性的。
17.權(quán)利要求6或10的方法，其中所述EPO是非紅細(xì)胞生成性的。
18.權(quán)利要求6或10的方法，其中所述EPO以比最大地刺激紅細(xì)胞生成所需劑量更大的劑量給藥。
19.一種促進(jìn)哺乳動物體內(nèi)分子轉(zhuǎn)胞吞穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障的方法，包括對所述哺乳動物給藥包含與EPO、EPO受體活性調(diào)制劑、EPO-活化受體調(diào)制劑或其聯(lián)合形式結(jié)合的所述分子的組合物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述結(jié)合是不穩(wěn)定共價鍵、穩(wěn)定共價鍵、或與所述分子的結(jié)合位點非共價結(jié)合。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞屏障是血腦屏障、血眼屏障、血睪丸屏障、血卵巢屏障或血胎盤屏障。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述分子是受體激動劑或拮抗劑激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗微生物劑、放射藥物、反義化合物、抗體、免疫抑制劑、毒素或抗癌劑。
23.權(quán)利要求6、10或19的方法，其中所述EPO是紅細(xì)胞生成素、紅細(xì)胞生成素類似物、紅細(xì)胞生成素模擬物、紅細(xì)胞生成素片段、雜合紅細(xì)胞生成素分子、紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合分子、紅細(xì)胞生成素激動劑、腎紅細(xì)胞生成素、腦紅細(xì)胞生成素、其寡聚體、其多聚體、其突變蛋白質(zhì)、其同類物、其天然存在形式、其合成形式、其重組形式、或其聯(lián)合形式。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述EPO受體結(jié)合分子是紅細(xì)胞生成素受體的抗體。
25.一種用于經(jīng)由轉(zhuǎn)胞吞作用轉(zhuǎn)運分子穿過內(nèi)皮細(xì)胞屏障的組合物，它包含與EPO、EPO受體活性調(diào)制劑或EPO-活化受體調(diào)制劑結(jié)合的所述分子。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述EPO是紅細(xì)胞生成素、紅細(xì)胞生成素類似物、紅細(xì)胞生成素模擬物、紅細(xì)胞生成素片段、雜合紅細(xì)胞生成素分子、紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合分子、紅細(xì)胞生成素激動劑、腎紅細(xì)胞生成素、腦紅細(xì)胞生成素、其寡聚體、其多聚體、其突變蛋白質(zhì)、其同類物、其天然存在形式、其合成形式、其重組形式、或其聯(lián)合形式。
27.權(quán)利要求25的組合物，其中所述分子是受體激動劑或拮抗劑激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗微生物劑、放射藥物、反義化合物、抗體、免疫抑制劑、毒素或抗癌劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過全身性給藥紅細(xì)胞生成素受體活性調(diào)制劑，諸如經(jīng)由EPO－活化受體發(fā)出信號來調(diào)制應(yīng)激組織功能的紅細(xì)胞生成素，來保護(hù)或增強(qiáng)哺乳動物的應(yīng)激組織功能的方法和組合物。應(yīng)激組織包括中樞神經(jīng)元組織，諸如腦，外周神經(jīng)元組織，視網(wǎng)膜，和心臟組織。保護(hù)應(yīng)激組織可治療低氧癥、癲癇發(fā)作、神經(jīng)變性疾病、低血糖和神經(jīng)毒素中毒。功能的增強(qiáng)在學(xué)習(xí)和記憶中是有用的。本發(fā)明還涉及用于通過將分子與紅細(xì)胞生成素受體活性調(diào)制劑諸如紅細(xì)胞生成素結(jié)合來促進(jìn)分子轉(zhuǎn)運穿過內(nèi)皮細(xì)胞緊密接點屏障諸如血腦屏障的組合物和方法。
文檔編號A61P25/28GK1607957SQ00808746
公開日2005年4月20日 申請日期2000年4月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月13日
發(fā)明者M·布里尼斯, A·塞拉米, C·塞拉米 申請人:肯尼思·S·沃倫協(xié)會有限公司