專利名稱：：具有preptin功能的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物活性肽。尤其是，本發(fā)明涉及一種由胰腺胰島β-細胞分泌的刺激胰島素分泌的肽。
背景技術(shù)：
：胰腺胰島β-細胞，主要是通過其胰島素的分泌，在生理學(xué)中扮演著一個重要的調(diào)節(jié)角色，而胰島素是一種對中間代謝施加深刻效應(yīng)的肽激素(Draznin等人，(1994))。第二種β-細胞激素，即糊精，通過其對胰島素分泌以及組織胰島素敏感性的作用，也有助于β-細胞的調(diào)節(jié)功能(Cooper，C(1994)；Hettiarachchi等人，(1997))。在胰島β-細胞中，激素被包裝在分泌性顆粒中，通過對信號諸如燃料(例如，葡萄糖、氨基酸類)或神經(jīng)激素性刺激的響應(yīng)，這些激素經(jīng)歷了調(diào)節(jié)性釋放。這些顆粒含有富含胰島素和Zn的致密核，而在顆?；|(zhì)中存在有較少量的胰島素C-肽、糊精、胰島素原、嗜鉻粒蛋白衍生的肽類、蛋白酶類和其它蛋白質(zhì)類(Hutton，J(1989))。本發(fā)明申請人當(dāng)前已確定的是胰腺胰島β-細胞還分泌一種調(diào)節(jié)性肽。本發(fā)明申請人已進一步地確定，這種肽增強葡萄糖介導(dǎo)的胰島素分泌。針對這種肽，本發(fā)明申請人稱其為preptin，本發(fā)明廣泛地涉及其多個方面。發(fā)明概述因此，在第一方面本發(fā)明提供了preptin肽或其類似物。對于“preptin”，本發(fā)明申請人是指一種34個氨基酸的肽，其序列如下AspValSerThrR1R2R3ValLeuProAspR4PheProArgTyrProValGlyLysPhePheR5R6AspThrTrpR7GlnSerR8R9ArgLeu其中R1為Ser或Pro；R2為Gln或Pro；R3為Ala或Thr；R4為Asp或AsnR5為Gln或Lys；R6為Tyr或Phe；R7為Arg或Lys；R8為Ala或Thr；和R9為Gly或Gln，或者其類似物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了人的preptin，其氨基酸序列為AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLysGlnSerThrGlnArgLeu.在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了大鼠的preptin，其氨基酸序列為AspValSerThrSerGlnAlaValLeuProAspAspPheProArgTyrProValGlyLysPhePheLysPheAspThrTrpArgGlnSerAlaGlyArgLeu.在又一個實施方案中，本發(fā)明提供了小鼠的preptin，其氨基酸序列為AspValSerThrSerGlnAlaValLeuProAspAspPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpArgGlnSerAlaGlyArgLeu.這些氨基酸序列相當(dāng)于每種哺乳動物中的proIGF-IIE-肽的Asp69-Leu102。在另一方面，本發(fā)明提供了編碼preptin或其類似物的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了包含有編碼preptin或其類似物的多核苷酸并且具有表達preptin或所述類似物能力的載體或細胞系。本發(fā)明也提供了preptin的鹽類，其優(yōu)選地為生理可接受的preptin鹽類。在另一方面，本發(fā)明進一步提供了包含preptin或其類似物或preptin鹽類的藥物組合物。在再一方面，本發(fā)明提供了以治療或預(yù)防為目的的刺激胰島素分泌的方法，它包括對需要這種治療或預(yù)防的患者施用有效量的preptin或其類似物這一步驟。在又一方面，本發(fā)明提供了preptin或其類似物或其鹽在制備藥物尤其是用于刺激胰島素分泌的藥物中的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了調(diào)制葡萄糖介導(dǎo)的胰島素分泌的方法，它包括對患者施用有效量的preptin、preptin類似物、preptin激動劑或preptin拮抗劑這一步驟。在另一些實施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合preptin或其類似物的抗體、使用了這些抗體的測定方法和含有這些抗體的測定試劑盒。上面的概述并沒有包括本發(fā)明的全部內(nèi)容。從下面的描述以及從所附的權(quán)利要求書，將顯而易見本發(fā)明的其它方面。圖1是preptin的純化與表征圖。a)對標(biāo)志蛋白質(zhì)的測定表明，來自βTC6-F7細胞的細胞器被定位于OptiPrep的連續(xù)梯度內(nèi)顆粒核(胰島素)，顆?；|(zhì)(糊精)，溶酶體(芳香基硫酸酯酶)，線粒體(檸檬酸合酶)。b)RP-HPLC純化顆粒蛋白質(zhì)收集所指示的峰(加影線)并進一步純化。c)采用MALDI-TOFMS來確定來自加影線峰的主要肽的純度和質(zhì)量(M+H+)。d)從加影線峰純化的肽，用Lys-C消化后經(jīng)RP-HPLC純化的圖譜1為NH2-末端片段，2為COOH-末端片段，3為未消化的肽。e)通過對(d)中Lys-C衍生的肽進行測序，而確定出的小鼠preptin的結(jié)構(gòu)NH2-末端片段為正體，COOH-末端片段為斜黑體，并且preptin被定位于所顯示的鼠proIGF-IIE肽的一個片段中。圖中對proIGF-II的結(jié)構(gòu)域(B、C、A、D、E)均予以顯示。位于Arg68的已識別切點用黑體表示，而推定的雙堿性基序(motif)用間隔線顯不。圖2是preptin的細胞分泌圖。a)preptin的RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線。b)24小時的βTC6-F7條件培養(yǎng)液和來自圖1b的顆粒內(nèi)部分，在這二者的RP-HPLC分部收集部分中，preptin樣免疫反應(yīng)性物質(zhì)(PLIM)的RIA表征。c)從βTC6-F7細胞分泌的含有主要的PLIM的分級部分之MALDI-TOFMS，峰對應(yīng)于鼠preptin(M+H+)，誤差率為0.07％。圖3是preptin對胰島素分泌的效應(yīng)圖。a)preptin介導(dǎo)的從βTC6-F7細胞分泌胰島素。曲線表明胰島素的濃度增加超過了基礎(chǔ)水平(沒有加入preptin時)。b)preptin介導(dǎo)的從分離的被灌注的大鼠胰腺分泌胰島素。每個點為平均值±sem(復(fù)式分析，對于每根曲線n＝4個胰腺)。曲線下面積(胰島素的第二期分泌；P＝0.03，不配對的雙尾部t-試驗)。圖4是鼠胰腺的免疫組織化圖。對從成年FVB/n小鼠中收集的胰腺進行切片，用蘇木精和多克隆兔抗血清染色，并使用了免疫過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗。分圖中a.抗胰島素抗血清(1∶40)；b.抗preptin抗血清(1∶40)；c.和d.用合成的大鼠preptin在c.1mg/ml、d.5mg/ml，Bar＝100μm下預(yù)溫育30分鐘的抗preptin抗血清(1∶40)。圖5是在大鼠胰島或βTC6-F7顆粒部分的RP-HPLC分部收集部分中，對preptin樣免疫反應(yīng)性物質(zhì)(PLIM)的RIA表征(標(biāo)準(zhǔn)圖1b)。圖6表示從βTC6-F7細胞和分離的大鼠胰島共分泌的preptin和胰島素。a和b為葡萄糖介導(dǎo)的來自a.βTC6-F7細胞和b.分離的大鼠胰島的preptin和胰島素共分泌。圖7是preptin對胰島素分泌的效應(yīng)圖。a和b表示純化的a.兔抗大鼠preptin的γ-球蛋白和b.未免疫的兔γ-球蛋白的純度與質(zhì)量。1輕鏈IgG，M+H+；2完整的IgG，M+4H+；3重鏈IgG，M+H+；4完整的IgG，M+2H+；完整的IgG，M+H+。c是用抗preptin的γ-球蛋白在35μg/ml、37℃、pH7.4的條件下模擬抗體灌注實驗的接觸時間、稀釋度、溫度和pH進行灌注后，在1分鐘內(nèi)結(jié)合preptin的能力。d是注入抗preptin的γ-球蛋白或?qū)φ?未免疫的兔γ-球蛋白)，對葡萄糖刺激(20mM，方形波)的分離的被灌注大鼠胰腺的胰島素分泌之效應(yīng)圖。每個點均為平均值±s.e.m.(復(fù)式分析，對于每根曲線n＝5個胰腺)。曲線下面積(胰島素的第二期分泌；P＝0.03，不配對的單尾部t-試驗)?？傊ㄟ^使用一步密度梯度離心法純化來自培養(yǎng)的鼠βTC6-F7細胞的分泌顆粒以及對標(biāo)志蛋白質(zhì)進行分析以確定其純度(圖1a)，從而鑒定出了preptin。胰島素被用來跟蹤顆粒核的純化，而通過測定存在于顆?；|(zhì)(Johnson，K(1988))中的糊精可以證實顆粒膜的完整性(圖1a)。接著，使用反相HPLC(A214圖1b)，對可溶性的顆粒組分進行分離。通過質(zhì)譜和NH2-末端氨基酸測序，對肽的同一性進行了確定。主要峰含有鼠胰島素-I和-II以及C-肽-I和-II(圖1a)。沒有檢測到任何非β-細胞肽，并且糊精對胰島素(1∶23)以及小鼠胰島素I對小鼠胰島素II(1∶3)的摩爾比值與生理性β-細胞的比值相同(Cooper(1994)；Linde(1989))。在緊鄰胰島素-I之前的一個主要洗脫峰中，發(fā)現(xiàn)含有一種以前未知的肽(圖1b)。將這種肽純化至均一性后，其分子量為3950Da(圖1c)。用賴氨酸專一性的蛋白酶對該分子消化，接著將得到的肽用RP-HPLC分離(圖1d)，然后進行完整NH2-末端蛋白質(zhì)測序。完整序列證實該分子含有34個氨基酸，它相當(dāng)于鼠proIGF-IIE-肽的Asp69-Leu102(圖1c)。這種肽就是小鼠的preptin。在preptin的NH2-末端側(cè)翼是一個已識別的Arg切點，在其COOH-末端側(cè)翼是一個推定的雙堿性(Arg-Arg)切割基序(Bell等人，(1985))(圖1e)。這些殘基在不同物種之間高度保守，并且很可能是翻譯后的加工信號。雖然另一些研究者已表明在細胞培養(yǎng)液以及多種哺乳動物的生物液中，有不同的proIGF-IIE-肽衍生肽存在(Hylka等人，(1985)；Daughaday等人，(1992)；Liu等人，(1993))，但是他們都沒有鑒定出一種與preptin相當(dāng)?shù)碾?。小鼠preptin的氨基酸序列如下AspValSerThrSerGlnAlaValLeuProAspAspPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpArgGlnSerAlaGlyArgLeu人和大鼠的preptin的等同氨基酸序列分別為AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLysGlnSerThrGlnArgLeu；AspValSerThrSerGlnAlaValLeuProAspAspPheProArgTyrProValGlyLysPhePheLysPheAspThrTrpArgGlnSerAlaG1yArgLeu.編碼preptin的多核苷酸的核苷酸序列如下gacgtgtcgacccctccgaccgtgcttccggacaacttccccagataccccgtgggcaagttcttccaatatgacacctggaagcagtccacccagcgcctg(人)gacgtgtctacctctcaggccgtacttccggacgacttccccagataccccgtgggcaagttcttcaaattcgacacctggagacagtccgcgggacgcctg(大鼠)gacgtgtctacctctcaggccgtacttccggacgacttccccagataccccgtgggcaagttcttccaatatgacacctggagacagtccgcgggacgcctg(小鼠)preptin可通過合成或重組方法生成。例如，在用合成方法制備時，可以使用任何可商業(yè)獲得的固相技術(shù)諸如Merryfield固相合成方法，在這種方法中氨基酸被順序地加入到一個正在延伸的氨基酸鏈上，從而合成preptin(見Merryfield，J.Am.Soc.852146-2149(1963))。自動合成肽的設(shè)備也可從供應(yīng)商諸如PerkinElmer/應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems，Inc)處商業(yè)獲得，并且可以根據(jù)制造商的說明書來操作。preptin也可以通過將編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸(通常為DNA)序列插入到表達載體中并在合適宿主中將其表達，從而用重組方法生成。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種表達載體中的任何一種都可以拿來使用。在用含有編碼重組肽之DNA分子的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染任何合適的宿主細胞后，就可以在這種細胞中實現(xiàn)表達。合適的宿主細胞包括原核細胞、酵母和高等真核細胞。用于產(chǎn)生重組的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在例如Maniatis等人的分子克隆實驗室手冊(MolecularCloning-ALaboratoryMannual，ColdSpringHarbourLaboratories，ColdSpringHarbour，NewYork(1989))中予以了描述。表達preptin的載體和/或細胞系，各有各的作用，并且它們也成為本發(fā)明的一部分。preptin的類似物以及它的編碼多核苷酸也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這樣的類似物包括preptin和上述多核苷酸的功能性等同物。對于preptin本身，其功能性等同物包括在免疫學(xué)上可與preptin發(fā)生交叉反應(yīng)并且具有與preptin基本相同功能的所有蛋白質(zhì)。這樣的功能性等同物可以是，例如，含有6至33個氨基酸(通常是以C-末端被截短的形式出現(xiàn))并包含preptin的一個或多個活性位點的的preptin的片段，preptin的替代、添加或缺失突變體，或者帶有其它氨基酸的preptin或片段或突變體的融合體。形成最小片段的六個氨基酸，只要它們在preptin序列中是連續(xù)的并且滿足功能要求，就可以來自序列的任何部分。當(dāng)然，生物活性肽也可能(并已明確地構(gòu)思了)包括那些六肽中的任何一種，或者確實是或者包括來自preptin序列的任何七肽、八肽、九肽或十肽。尤其優(yōu)選這樣的肽類，它們是或者包括來自人preptin的六肽、七肽、八肽、九肽或十肽。肽中殘基的改變是可能的，而且對此進行了構(gòu)思。例如，采用常規(guī)技術(shù)用等同的氨基酸替換序列中的氨基酸是可能的。通常所知的等同的氨基酸組為(a)AlaSerThrProGly；(b)AsnAspGluGln；(c)HisArgLys；(d)MetGluIleVal；和(e)PheTyrTrp.只要所得到的肽可與preptin發(fā)生免疫交叉反應(yīng)并且具有與preptin基本相同的功能，也可以進行氨基酸的添加和/或缺失。等同的多核苷酸包括編碼與如上所述的preptin等同的蛋白質(zhì)之核酸序列。等同的多核苷酸也包括這樣的核酸序列，由于核酸密碼的簡并性，它們與天然的多核苷酸有不同之處，但是這些不同之處并沒有影響相應(yīng)的氨基酸序列?？梢愿鶕?jù)同源性來預(yù)測某一特定的多核苷酸或多肽是否與上面所給出的那些多核苷酸或多肽相當(dāng)。通過利用可公開獲得的計算機算法，可以將多核苷酸或多肽的序列進行比對(align)，從而確定某一特定區(qū)域相對于另一序列的核苷酸同一性百分比。用于比對和鑒定多核苷酸序列相似性的兩個示范性算法是BLASTN和FASTA算法。多肽序列的相似性可以使用BLASTP算法來檢驗。BLASTN和BLASTP軟件均可以在NCBI匿名的FTP服務(wù)器(ftp//ncbi.nlm.nih.gov.)上，在/blast/executables/下獲得。在確定根據(jù)本發(fā)明的變異體時，優(yōu)選使用按文件中所述的缺省參數(shù)進行設(shè)置并與算法一起發(fā)放的2.0.4版本〖1998年2月24日〗的BLASTN算法。包括BLASTN和BLASTP在內(nèi)的BLAST算法家族的用途，在位于URL的http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.html的NCBI之web站點(website)有描述，并且在Altschul和StephenF等人(1997)“有空位的BLAST和PSI-BLAST新一代的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索程序(GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms)”、核酸研究(NucleicAcidsRes.)253389-3402這些出版物中也有描述。計算機算法FASTA可以在互聯(lián)網(wǎng)(Internet)上的ftp站點ftp//ftp.virginia.edu.pub/fasta/上獲得。在確定根據(jù)本發(fā)明的變異體時，優(yōu)選使用按文件中所述的缺省參數(shù)進行設(shè)置并與算法一起發(fā)放的2.0.4版本，1996年2月。FASTA算法的用途，在WRPearson和D.J.Lipman，“生物序列分析員使用的改進工具(ImprovedToolsforBiologicalAnalysts)”，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，852444-2448(1988)以及W.R.Pearson，“用FASTP和FASTA進行快速和靈敏的序列比較(RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA)”，酶學(xué)方法(MethodsinEnzymology)，18363-98(1990)中予以了描述。本發(fā)明的類似物也包括來自除人、大鼠或小鼠以外的物種的preptin同源物。這樣的同源物通過使用，例如，基于編碼人、大鼠和小鼠的preptin多核苷酸之保守區(qū)的核酸探針，能夠很容易地予以鑒定。preptin或其類似物也可以以多種程度的純度形式存在。優(yōu)選地preptin/類似物組分構(gòu)成制備物重量的至少50％，更優(yōu)選地至少80％，更優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％以及仍更優(yōu)選地至少99％。然而，preptin或類似物在應(yīng)用于藥物中時，一般優(yōu)選其處于純的或基本純的形式。在對患者施用preptin或preptin類似物時，有可能使用其這樣的純或基本純的化合物。然而，preptin或preptin類似物也可以以藥物組合物的形式存在。這樣的組合物可包含preptin或preptin類似物，并再加入一種或多種藥學(xué)可接受的載體以及如果希望的話，任選地其它治療性成分。載體的可接受性，是指其必須與preptin或preptin類似物相容，并且對受治療的患者無害。所希望的組合物還不應(yīng)該包含有與已知肽類不相容的物質(zhì)?？梢詫⒔M合物還可以單位劑量的形式方便地存在，并且可以采用藥學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法制備。所有的方法均包括使活性成分與載體相結(jié)合這一步驟，而其中的載體由一種或多種輔助成分構(gòu)成。組合物所采用的具體形式，在很大程度上將取決于所選擇的施用途徑。例如，可以將preptin或preptin類似物以非腸道途徑注射，例如，通過靜脈內(nèi)注射進入受治療患者的血流中。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員歡迎將施用途徑多樣化，它們可以是靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腸道、經(jīng)皮、跨粘膜、持續(xù)釋放聚合物組合物(如，交酯聚合物或共聚物微?；蛑踩塍w)、灌注、肺(例如，吸入)、鼻、口等等。目前，優(yōu)選適于非腸道途徑、尤其是靜脈內(nèi)施用的組合物。這樣的組合物方便地含有preptin或preptin類似物的無菌水性溶液。優(yōu)選地，溶液與受治療患者的血液等滲。將preptin或類似物溶于水中以生成水性溶液，接著無菌化這種溶液，就可以方便地制備出這樣的組合物。這時就可以以單位或多劑量的包裝物形式，例如密封的安瓿或小瓶，傳遞組合物。一種尤其優(yōu)選的組合物是preptin處于適于注射的生理緩沖液中。適于非腸道施用的持續(xù)釋放性組合物(例如，可生物降解聚合物的配制物)，也為本領(lǐng)域公知。見，例如，美國專利3773919和4767628以及PCT出版物WO94/15587。將preptin轉(zhuǎn)化為鹽的形式也很方便。這樣的鹽一般是生理可接受的鹽，并且可以通過利用任何方便的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)方法來生成。尤其優(yōu)選通過preptin與有機酸類的陰離子結(jié)合而生成的preptin鹽類。這樣的鹽類包括但不限于蘋果酸、乙酸、丙酸、丁酸、草酸、檸檬酸、異檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸和三氟乙酸的鹽類。也可以將這樣形成的鹽類配制于藥物組合物中，當(dāng)需要的時候用于治療性施用。以下，通過參考下面的非限制性實驗部分，對本發(fā)明的若干方面進行描述。實驗第一部分方法和材料細胞培養(yǎng)將βTC6-F7鼠胰腺胰島β-細胞，傳代數(shù)49-60，在三聯(lián)瓶中于37℃培養(yǎng)，其中，O2對CO2的比例為95∶5(體積/體積)，瓶中裝有用15％加熱滅活的馬血清和2.5％胎牛血清補充的nDMEM(Gibco)，并且通過采用PBS洗、隨后是胰蛋白酶(2.5％胰蛋白酶-EDTA)處理，每5天進行一次次代培養(yǎng)。在生長至70％匯合時，每個瓶可得到大約2.0×108個細胞。顆粒純化將來自8-12個三聯(lián)瓶中、處于傳代數(shù)為55-60的β-細胞在用胰蛋白酶處理后收獲，平均得到2.5-4.0ml純凈細胞(1.6-2.4×109個)，將其濃縮(1700×g，5分鐘)，然后用PBS洗兩次，接著用均質(zhì)化介質(zhì)(0.3M蔗糖/10mMMESK(σ)/1mMK2EGTA/1mMMgSO4/pH6.5)洗一次，然后在冰上于相同介質(zhì)(按1∶5體積/體積)中進行均質(zhì)化處理。將細胞懸浮液通過球磨(ball-bearing)勻漿器(7.87×10-5cm間隙)20遍進行均質(zhì)化處理，然后通過離心(400×g，10分鐘)進行澄清，將沉淀物再進行一次均質(zhì)化處理和離心，然后將兩次上清液合并(終體積＝20ml)。通過用均質(zhì)化介質(zhì)稀釋來制備13％和31％的OptiprepTM(Nycomed)溶液(體積/體積)，然后將6×10ml的連續(xù)梯度(31％-13％Optiprep)傾入(AutoDensi-flowII，Haakebuchler)超凈離心管(Beckmam)中。將沉淀物平鋪于上層或底層，然后進行超離心(SW40T1/160000×g/16h/4℃)。將RI為1.363-1.368的分級部分，其中含有最高純度的分泌顆粒，收集起來，而線粒體和溶酶體則被分離到RI大于1.371的分級部分中。通過使用放射性免疫測定胰島素(結(jié)晶的顆粒核)、糊精(顆?；|(zhì))，檢測所制備顆粒的完整性；通過芳香基硫酸酯酶(溶酶體)和檸檬酸合酶(線粒體)的功能測定，檢測純度；并采用Bicinchoninicacid(Pierce)測定總蛋白質(zhì)含量。RP-HPLC順序進行兩次RP-HPLC(A0.08％TFA體積/體積；B80％乙腈+20％A；AppliedBiosystems140B/785A/112A系統(tǒng)JupiterC18RP柱，250×2.0毫米(Phenomonex)250-300微升/分鐘；A214)，純化顆粒蛋白質(zhì)。在上柱前，首先將分泌性顆粒物離心(16000×g，20分鐘)。開始的15分鐘采用等度洗脫，并在注射后19分鐘時開始順序收集，每30秒一個分部收集部分。為了純化蛋白質(zhì)，順序使用了略微不同的梯度第一次RP-HPLC得到的是半純化的顆粒蛋白質(zhì)，而第二次RP-HPLC使用了更加平緩的梯度，以提高分辨率和純度。肽序列分析采用N-末端序列測定(自動化的Edman法；ABIProciseTM)并結(jié)合MALDI-TOFMS精確測定質(zhì)量，對純化的肽進行鑒定。為了驗證全序列，使用Lys-C(BoehringerMannheim)對純化的小鼠preptin分離物進行切割，然后將所得到的肽片段用RP-HPLC再純化。MALDI-TOFMS質(zhì)譜采用裝備有500兆赫數(shù)字示波器(G2030AA，LeCroy)的MALDI-TOFMS(惠普公司(Hewlett-Packard)G2025A337納米氮激光發(fā)射光/最大輸出150微焦耳/脈沖寬度9納秒/90千伏離子加速電壓)，采用加入了重組人胰島素(NovoNordisk；M+H+，5808.66Da；M+2H+，2904.83)以及生長抑素(Bachem，M+H+，1638.91；M+Na+，1660.90)的一種α-CHC基質(zhì)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，以確定肽的分子量。在高真空度(小于1.0微托)下進行MS，并且采用外質(zhì)量標(biāo)定法以“單次發(fā)射”方式進行數(shù)據(jù)采集(ChemStation0-20PS方法，陽極性(positivepolarity)在0-20kDa范圍內(nèi))。通過采用外質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)插法，確證純化的肽的精確分子量。大鼠preptin的化學(xué)合成通過與已知的推定IGF-II序列進行比較，對大鼠和人的preptin的序列進行了確定。根據(jù)推定的序列，采用Fmoc化學(xué)、在肽合成儀器(AdvancedChemTech396RoboticsPeptideSynthesiser)上、用FmocLeu-Wang樹脂起始，化學(xué)合成大鼠的preptin(AuspepPty，Australia(澳大利亞))。將肽脫保護并采用92.5％TFA2.5％水2.5％三異丙基硅烷2.5％二硫蘇糖醇的溶液，處理3小時從而將肽從樹脂上切下。通過加入二異丙醚將肽從TFA溶液中沉淀出來，接著將沉淀溶解于30％乙腈水中，凍干并用RP-HPLC純化。用分析型RP-HPLC測定(大鼠preptin在47％B時被洗脫下來)證實純度為大于99％，與此同時，MALDI-TOFMS確證的質(zhì)量為3932.4Da±0.026％。preptin的放射性免疫測定采用戊二醛一步法于pH7.0，將合成的大鼠preptin與載體卵清蛋白偶聯(lián)，接著用它在NZW兔中產(chǎn)生多克隆抗血清。采用氯胺T法將preptin進行125I-放射性標(biāo)記，然后用SephadexG-10層析(50mM磷酸緩沖液，pH7.5)純化[125I]preptin(362微居/微克)。接著，開發(fā)了用于preptin的最優(yōu)化RIA，其中通過采用PEG輔助的第二抗體將B/F分開(山羊-抗-兔法)。該法采用了終稀釋度為1∶10000的抗血清(測定時的終稀釋度為1∶30000)，R/T值為0∶30；示蹤器的讀數(shù)為每管8000計數(shù)/分鐘(cpm)；溫育時間為24小時+72小時；EC20值為344pMpreptinEC50為39pM；最低檢測濃度為11.2±9.8pM；與嚙齒類(大鼠/小鼠)胰島素和糊精無交叉反應(yīng)。preptin的細胞分泌在βTC6-F7細胞(傳代數(shù)#52)中對preptin的分泌進行了研究，βTC6-F7細胞是在24孔板中以4×105個細胞/孔進行培養(yǎng)的，其它培養(yǎng)條件同上。對preptin的刺激是在生長3天后達到80％匯合時實施的。在進行分泌研究開始之前，將細胞在用HEPES緩沖的KRB中洗兩次，接著在1毫升/孔的溫育緩沖液(0mM葡萄糖；0.1％溶于HEPES-KRB中的FractionVBSA(Sigma)重量/重量)中預(yù)溫育1小時，之后從每孔中移出500μl，并補充以等體積的含有多種濃度葡萄糖的新鮮溫育緩沖液，。在溫育(37℃)2小時后，將溫育介質(zhì)移出，用PBS洗細胞三次，然后用裂解緩沖液裂解。接著，采用已描述的RIA，對溫育上清液和細胞裂解物進行胰島素和preptin含量測定。在分開的實驗中，對激素分泌的時間依賴性也進行了測定。分泌的preptin樣免疫反應(yīng)性物質(zhì)(PLIM)的表征既然preptin是IGF-II之E-肽的一種切割產(chǎn)物，并且過去已從血清中分離出源自一個更小區(qū)域的其它切割產(chǎn)物(Hylka(1985)；Daughaday(1992)；Liu(1993))，所以采用preptinRIA定量并不能充分地表征該被分泌和循環(huán)肽的特性。因此，開發(fā)了RP-HPLC/preptinRIA相結(jié)合的方法，以進一步表征PLIM。將2ml來自一個人供體的分離血漿分裝物和2mlβTC6-F7條件培養(yǎng)液，分別用0.1ml4M乙酸酸化，然后加載到已用10ml100％甲醇和20ml4％(體積/體積)乙酸預(yù)平衡的C-18SepPak(Waters，1ml體積)上。先用20ml4％乙酸洗SepPak，然后用2ml于70％甲醇中的0.1M乙酸洗脫結(jié)合組分，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將洗脫液的最終體積減小至150μl。接著，對洗脫液按上面所述進行RP-HPLC，合并多次層析操作的相應(yīng)的分部收集部分。將很可能含有preptin和胰島素的分部收集部分進行MALDI-TOFMS。接著，用preptin測定緩沖液將所有分部收集部分的體積補至350μl，然后采用RIA對preptin和胰島素進行分析。為了比較這些分泌產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性圖譜與顆粒內(nèi)物質(zhì)的圖譜(圖1b)，將10μl來自初始的RP-HPLC顆粒分部收集部分用preptinRIA緩沖液稀釋至終體積610μl，也進行胰島素和preptin測定。在分離的大鼠骨骼肌中糖類代謝的速率在外周組織包括骨骼肌中，β-細胞激素糊精和胰島素調(diào)制糖類的利用。在對比目魚肌進行分離、溫育和剝離后，將其用作模型組織，對preptin改變葡萄糖吸收及摻入到肌肉糖原中的能力進行了研究。所實施的所有動物方法，均已得到了動物道德委員會組織(InstitutionalAnimalEthicsCommittee)的恰當(dāng)許可。將雄性Wistar大鼠(200±20g)飼養(yǎng)于條件受控的房間(20℃，12小時光/暗循環(huán))內(nèi)，并給予標(biāo)準(zhǔn)的大鼠食物(Diet86.NRMTegel，Auckland)和隨意飲水。將禁食18小時的大鼠麻醉(戊巴比妥鈉45mg/kg)，并采用頸脫位法將其處死，隨后在生碳氧-KHB(O2與CO2的比例為95∶5體積/體積)下解剖比目魚肌，接著將其溫育在補充了多種濃度的胰島素和preptin的nDMEM中。將肌肉沿縱向挑開為3個等條，每條的最終半徑為大約1.5mm。將[(U)14C]D(+)-葡萄糖(1毫居/毫升，Amersham)按1∶20(體積/體積)稀釋于70％乙醇中，所得終濃度為0.5微居/10微升。將Actrapid重組的人胰島素(100單位/毫升，NovoNordisk)按1∶1000稀釋于10毫升nDMEM中。將60μg大鼠preptin溶解于1526μlnDMEM中，至濃度為10μM，然后在nDMEM中進一步稀釋，以獲得1μM、100nM、10nM、100pM和1pM的儲存液。采用兩個不同的實驗范例，以確定preptin是(i)刺激葡萄糖摻入糖原中的速率，還是(ii)作為胰島素引起的葡萄糖摻入糖原中的拮抗劑。preptin拮抗劑的溫育方法將四個肌肉條轉(zhuǎn)至一個瓶中，共轉(zhuǎn)入9個瓶，每瓶含有生碳氧(carboxygenated)nDMEM、0(對照)或最有效胰島素(23.7nM)和多種濃度的preptin(10fM，100fM，1pM，0，10pM，100pM，1nM或10nM)，共10ml。接著，將瓶子在搖動水浴(30℃，20分鐘)中平衡，在此之后，按精確的1.5分鐘間隔，加入10μl(0.5微居)D-[(U)14C]葡萄糖。接著，在卡波金(carbogen)下，將肌肉條在30℃溫育120分鐘。溫育后，按1.5分鐘間隔，將肌肉條從每個瓶子中移出，吸干水分。將這些肌肉條在液氮中急速冷凍，隨后在預(yù)稱重的管中進行24小時凍干，接著確定肌肉條的干重。然后，將肌肉條在250μl60％KOH中進行溶解，在70℃溫育45分鐘，冷卻后用冰冷的乙醇在-20℃沉淀過夜。接著，通過離心(9000×g，15分鐘，0℃)制備糖原沉淀物，然后將沉淀物再懸浮，再沉淀兩次，最后吸出上清液并將糖原沉淀物在70℃放置2小時進行徹底干燥。這時，通過閃爍計數(shù)可以確定出14C的摻入量。preptin激動劑方法除了在對肌肉條進行溫育時，其中不含胰島素(但陽性對照除外，其中含有23.7nM胰島素)以及preptin的終濃度為0，0.1，1，10和100nM外，其余所有方法按如上描述。preptin對胰島素分泌的效應(yīng)已知胰島素和糊精通過推測的自分泌機制，調(diào)制β-細胞的胰島素分泌。因此，采用β-細胞促分泌素方法，對preptin對胰島素分泌的效應(yīng)進行了測定。將βTC6-F7細胞在傳代數(shù)#52時，次代培養(yǎng)于24孔板中，4×105個細胞/孔。將它們在nDMEM中培養(yǎng)3天，生長至80％匯合，接著用KRB-HEPES洗兩次。將preptin儲存液系列稀釋于含有10mMD(+)-葡萄糖的溫育培養(yǎng)液中，所得溶液的preptin終濃度分別為150，75，25，5，1和0.1nM。然后洗細胞，并將含有10mM和多種終濃度的preptin的溫育培養(yǎng)液，按1毫升/孔加入到每孔中。將細胞在37℃溫育2小時，然后移出培養(yǎng)液。用PBS洗細胞三次，然后用500μl裂解緩沖液進行裂解。將溫育培養(yǎng)液離心(16000×g，3分鐘)，并將上清液與沉淀的碎片分開。接著，對溫育培養(yǎng)液和裂解物按上面所述進行胰島素、preptin和蛋白質(zhì)分析。結(jié)果上述實驗的結(jié)果見圖1、2和3。討論小鼠的preptin是一個34個氨基酸的肽，它相當(dāng)于鼠proIGF-IIE-肽的Asp69-Leu102。通過對RP-HPLC的峰面積進行積分，測定出preptin在顆粒中存在的含量是胰島素的八分之一，但卻是糊精含量的兩倍(摩爾/摩爾)。在preptin的NH2-末端側(cè)翼是一個已識別的Arg切點，在preptin的COOH-末端側(cè)翼是一個推定的雙堿性(Arg-Arg)切割基序(Bell(1984))(圖le)。這些殘基在不同物種之間高度保守，并且很可能是翻譯后的加工信號。許多激素原的前體是多于一種激素的結(jié)合體，其中帶有不同的并常常是組織特異性的蛋白分解加工機制(Martinez(1989))。上面的結(jié)果表明，proIGF-II是一種含有多于一種肽激素產(chǎn)物的激素原。IGF-II是胰島素家族的一員，它調(diào)節(jié)著細胞的生長、分化和代謝(DeChiara等人(1990))。IGF-II是一條單多肽鏈，源自proIGF-II的BCA和B結(jié)構(gòu)域(見圖1e)，并且在胎兒和成年組織中有廣泛的合成。而胰島素的表達，卻幾乎完全限制于β-細胞。在哺乳動物的基因組中，IGF-II基因與胰島素基因鄰近(Bell(1985))，而且最近在對人的研究中，在INS和IGF-II基因的上游已鑒定出一種VNTR多態(tài)性，這也許有助于這兩種基因的差異性調(diào)節(jié)(Ong(1999))。對preptin的放射性免疫測定(RIA)(圖2a)以及用preptinRIA對圖1a顆粒純化圖譜的再分析，發(fā)現(xiàn)preptin與胰島素和糊精被共純化，從而證實它確實是一種顆粒成分。通過對純化的顆粒以及βTC6-F7細胞條件培養(yǎng)液進行RP-HPLC/RIA，對preptin樣免疫反應(yīng)性物質(zhì)(PLIM)進行了表征。顆粒內(nèi)和細胞外的PLIM的主要形式，在RP-HPLC上均被共洗脫(圖2b)。對相當(dāng)于來自βTC6-F7細胞之PLIM峰的HPLC純化物質(zhì)所作的質(zhì)譜表明只有一種物質(zhì)存在，其分子量與鼠preptin的分子量完全相同(圖2c)。RP-HPLC還證明，人和大鼠血漿的PLIM的主要形式與顆粒內(nèi)的鼠preptin共洗脫。preptin與胰島素一起從βTC6-F7細胞中共分泌，以應(yīng)答葡萄糖刺激(圖2d)，在1mM或更高濃度葡萄糖時達到了最高水平。這些結(jié)果證實，preptin在胰島β-細胞中合成，并被包裝于分泌性顆粒中。此外，它與胰島素一起以葡萄糖依賴方式共分泌。有證據(jù)表明胰島素的分泌可被包括胰島素(Kulkarni(1999)；Elahi(1982)；Argoud(1987))、糊精(Waggoner等人(1993)；Silvestre(1996)；Degano等人(1993))和胰抑制素(Tatemoto(1986))在內(nèi)的胰島β-細胞激素調(diào)制。一般認(rèn)為它們是通過自分泌性的負反饋回路起作用，并通過與特異的細胞表面受體結(jié)合被介導(dǎo)。因而，對preptin對胰島素分泌的效應(yīng)進行了研究。所獲得的結(jié)果表明合成的大鼠preptin，以一種既是濃度依賴性的又有飽和性的方式，增強葡萄糖(10mM)刺激胰島素從培養(yǎng)的βTC6-F7細胞分泌(圖3a)。在濃度為0.1nM和更高時，與對照(沒有加preptin)相比，檢測到preptin的顯著效應(yīng)，并在75nM時達到了最大效應(yīng)。也正是在該濃度下，糊精引起胰島素分泌的抑制(Degano等人(1993))。這些preptin濃度與βTC6-F7細胞分泌的濃度相似(圖2d)，因而它們非?？赡茉谏硇砸葝u中于原位發(fā)生于β-細胞細胞膜的附近。對preptin刺激胰島素分泌的濃度依賴性和飽和性的證實，提示preptin是通過與細胞表面受體結(jié)合從而引起這些效應(yīng)。對分離的被灌注的大鼠胰臟采用最有效的preptin濃度(75nM)，注入合成的大鼠preptin，測定了它在其中對葡萄糖(20mM)刺激的胰島素分泌的效應(yīng)(圖3b)。與對照(沒有加preptin)值相比，preptin顯著地增強(增強30％；p＝0.03，曲線下面積的雙尾部t-試驗)胰島素的第二期分泌(圖3b)。這些發(fā)現(xiàn)與從βTC6-F7細胞得到的那些結(jié)果(圖3a)是一致的。它們提示preptin是胰島素分泌的一種生理調(diào)節(jié)子，它以一種新認(rèn)識到的前反饋自分泌性回路方式，增強葡萄糖刺激的胰島素分泌，而且也許在抗衡其它β-細胞激素對胰島素分泌的抑制效應(yīng)中發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明申請人的觀點是preptin以一種局部方式，在恢復(fù)、引發(fā)和協(xié)調(diào)β-細胞對葡萄糖的應(yīng)答活性中起作用，將葡萄糖引發(fā)的信號放大給β-細胞器官。這種作用與前反饋機制相似，凝血酶所引發(fā)的血栓烷A2的釋放在血小板中就產(chǎn)生出這種機制(Barritt(1992))。一種以前未意料到的機制的存在，通過這種機制一種新的胰島β-細胞激素將葡萄糖介導(dǎo)的胰島素分泌放大，提示preptin的生物學(xué)將在II型糖尿病中很重要，II型糖尿病的特征在于一種復(fù)雜的胰島素分泌損害(DeFronzo等人(1992))。在preptin的合成、分泌或作用方面的缺陷，會促成這種情況下葡萄糖介導(dǎo)的胰島素分泌的缺陷，施用preptin也許對治療II型糖尿病或者其它與β-細胞減少胰島素分泌相關(guān)的疾病有幫助。要指出的是，在人類中，位于相鄰的胰島素(INS)和IGF-II基因之上游的串聯(lián)重復(fù)數(shù)目變化(VNTR)的多態(tài)性，調(diào)節(jié)著這兩個基因的表達，并且與II型糖尿病和多囊性卵巢綜合癥這兩種疾病的增加趨勢相關(guān)。第二部分preptin與胰島素共包裝于胰島組織中為了研究preptin的生理學(xué)，通過采用對preptin特異的抗血清，對正常的鼠胰臟進行了免疫組化研究。將按上面所述(AuspepPtyLtd)制備的合成大鼠preptin，采用戊二醛一步法于pH7.0與卵清蛋白偶聯(lián)(Harlow和Lane)。采用新西蘭白兔，用于產(chǎn)生針對大鼠preptin偶聯(lián)物的多克隆抗血清。采用蘇木精及專一性地抗preptin或抗胰島素的抗血清和采用山羊-抗-兔免疫過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體，并對所有染色劑進行40倍終稀釋(體積/體積)，對來自正常的成年小鼠(FVB/n)胰臟的系列切片進行染色。先將preptin(1或5mg/ml)與抗-preptin抗血清預(yù)溫育30分鐘，然后再將其加入切片，以證實preptin免疫染色的特異性。preptin樣免疫反應(yīng)性物質(zhì)(PLIM)和胰島素樣免疫反應(yīng)性物質(zhì)已被共定位于胰島β-細胞中(圖4a，b)。競爭性研究表明將preptin抗血清與合成的preptin預(yù)溫育，會以濃度依賴方式抑制PLIM染色(圖4b-d)。這些研究提示preptin存在于生理性的胰腺胰島β-細胞中。PLIM存在于正常的胰島組織中為了證實正常胰島組織中的PLIM，我們對來自分離的大鼠胰島的酸性乙醇提取物進行了RP-HPLC/RIA。胰腺胰島是分離自正常的成年雄性Wistar大鼠，并根據(jù)已發(fā)表方法(Wollheim和Sharp(1981)；Romanus(1988))的修改本，對內(nèi)含物用酸性乙醇抽提。結(jié)果見圖5。盡管preptin的水平比在βTC6-F7細胞中低許多，但是PLIM的主峰與顆粒內(nèi)的preptin被共洗脫下來，這表明在正常的胰島中preptin是PLIM的占主導(dǎo)地位的生理成分(圖5)。這些數(shù)據(jù)證實從βTC6-F7細胞純化的preptin并不只是一種在純化過程中由蛋白裂解產(chǎn)生的人工產(chǎn)物，而是preptin就以這種形式存在并從βTC6-F7細胞以及正常的大鼠胰島分泌出來。在對葡萄糖刺激的應(yīng)答中preptin與胰島素共分泌由于已知preptin與胰島素共定位于β-細胞分泌性顆粒中，所以進行實驗以確定preptin和胰島素是否以受調(diào)節(jié)的方式共分泌。根據(jù)已發(fā)表的方法，采用βTC6-F7細胞(Efrat等人(1993)；Knaack等人(1994))以及分離的大鼠胰島(Gotoh等人(1987))，對葡萄糖刺激的肽分泌進行了研究，并且通過使用特異性的RIA對preptin和胰島素的濃度進行了測定。結(jié)果見圖6。這些結(jié)果表明當(dāng)βTC6-F7細胞對亞生理濃度的葡萄糖(小于5mM)應(yīng)答(SEfrat，私人通訊)的同時，從βTC6-F7細胞(圖6a)以及正常的大鼠胰島(圖6b)觀察到清晰的胰島素/preptin共分泌型式。從胰島組織(preptin與胰島素的比例為1∶500)分泌的preptin的量比從βTC6-F7細胞(preptin與胰島素的比例為1∶8)分泌的水平低許多。該觀察結(jié)果支持了HPLC/RIA結(jié)果，它表明在生理性組織中preptin的水平比培養(yǎng)的β-細胞中的preptin水平低許多。盡管preptin的水平在生理性組織中低許多，但是這兩個模型都明確地表明為了應(yīng)答葡萄糖刺激，preptin與胰島素一起從生理性胰島β-細胞共分泌。去除內(nèi)源性preptin顯著地減少了胰島素從分離的被灌注的大鼠胰臟分泌為了確定內(nèi)源性的胰臟preptin在胰島素的分泌中可能扮演的角色，通過注入抗-preptin抗體到分離的被灌注的胰臟模型中，將內(nèi)源性的preptin作用去除，做法如下用補充了4％葡聚糖、0.5％BSA、3mM精氨酸、5.5mM葡萄糖(最終濃度)的KHB對胰臟進行灌注。用95％O2/5％CO2混合物對灌注液充氣，并采用蠕動泵將其以2.7ml/min的速度無再循環(huán)注入。在每次70分鐘的灌注之前，先對胰臟進行灌注及平衡20分鐘。在進入實驗10分鐘時，將抗-preptin的γ-球蛋白或未免疫的兔γ-球蛋白，通過側(cè)臂注入(在灌注液中γ-球蛋白的終濃度為35μg/ml于載體緩沖液(0.1％BSA于0.9％NaCl中)中)。此外，在25分鐘時，用20分鐘時間將葡萄糖注入(在灌注液中測定的終濃度為20mM)。于冰上收集1-分鐘連續(xù)分部收集部分，然后對其測定胰島素(RIA)。采用ProteinA親和層析(PharmaciaBiotech，Hi-TrapProteinATechRep.Wikstroms，瑞典(1999))，對兔抗-大鼠preptin的γ-球蛋白或?qū)φ?未免疫的兔)γ-球蛋白進行純化，以減小來自其它血清組分的潛在影響。采用MALDI-TOFMS，對這兩種不同的γ-球蛋白分級部分的組成進行了確定(圖7a，b)，并且在模擬如上所述的抗體灌注實驗的條件下，對這兩種不同的γ-球蛋白分級部分的結(jié)合能力進行了測定。在被灌注的胰臟實驗條件下，由抗-preptin的γ-球蛋白完全結(jié)合的preptin的最大量為20ng/min(圖7c)。對分離的被灌注的胰臟注入抗-preptin或?qū)φ盏摩?球蛋白，并用20mM葡萄糖對其進行方波刺激(圖7d)。抗-preptin的γ-球蛋白使胰島素的第一以及第二期分泌均顯著地降低(第一期與對照相比平均抑制29％，P＝0.02，單尾部t-試驗；第期與對照相比平均抑制26％，P＝0.03，曲線下面積的單尾部t-試驗)。在這個實驗中，我們已經(jīng)表明除去內(nèi)源性的循環(huán)的preptin，會引起葡萄糖介導(dǎo)的胰島素分泌的顯著減少。如果已估計出preptin在生理性胰島中存在的濃度相當(dāng)?shù)?大約比胰島素低500倍)，并且仍然能夠?qū)σ葝u素分泌施加顯著效應(yīng)，那么這個結(jié)果將是非常非常有趣的。這些實驗結(jié)果與這樣的前提是一致的，即胰腺的preptin生理濃度扮演著一個自分泌性角色，以提高葡萄糖介導(dǎo)的胰島素分泌。這種作用也許與由凝血酶引發(fā)的血栓烷A2的釋放而在血小板中引起的前反饋機制相似(Barrit(1992))。總結(jié)論總之，preptin是一種以前未知的胰腺胰島β-細胞激素。它由pro-IGF-II的E-肽產(chǎn)生，在胰島β-細胞顆粒中以顯著量存在，以一種受調(diào)節(jié)方式與胰島素共分泌，增強葡萄糖刺激的胰島素分泌，并且很可能通過與β-細胞表面受體結(jié)合而在前反饋自分泌性回路中可能起作用。工業(yè)應(yīng)用正如上面所描述，本發(fā)明提供了preptin(包括其人、大鼠和小鼠形式)以及preptin的類似物。preptin和它的類似物在刺激由葡萄糖引起的胰島素分泌中，扮演著一個生理性角色。因而本發(fā)明也提供了這樣一些方法，采用這些方法可以對葡萄糖引起的胰島素分泌進行調(diào)制。這樣的調(diào)制將通常包括按如上所述施用preptin及其類似物。但是，使用preptin的激動劑和拮抗劑也可以實現(xiàn)調(diào)制。preptin激動劑就是能夠促進或加強preptin對胰島素分泌的效應(yīng)的化合物。與此相反，preptin拮抗劑就是能夠與preptin競爭或者反而能夠與preptin反應(yīng)，從而封阻或減小preptin對胰島素分泌的效應(yīng)的化合物。在存在和不存在試驗化合物的情況下，通過對那些能夠測量preptin對胰島素分泌效應(yīng)的系統(tǒng)進行測定，就可以對preptin激動劑和preptin拮抗劑進行鑒定。例如，可以使用在本文的實驗部分中描述的測定系統(tǒng)。在調(diào)制胰島素分泌中，當(dāng)需要使用preptin激動劑或preptin拮抗劑時，可以將激動劑/拮抗劑以純的化合物施用，或者配制為如上所述的preptin的藥物組合物。本專利也提供了結(jié)合preptin的免疫試劑。這樣的免疫試劑(它們可以是多克隆抗體)可通過使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來產(chǎn)生，其中包括在實驗部分中描述的那些技術(shù)。也可以提供單克隆抗體。這樣的抗體一般是通過標(biāo)準(zhǔn)程序，正如在例如Harlow和Lane1988中所描述的，來進行制造。概括地講就是選擇合適的動物并按所希望的免疫程序進行。經(jīng)過一段合適的時間后，將這樣的動物的脾臟摘除，然后將單個脾臟細胞一般地與永生化的骨髓瘤細胞，選擇合適的條件進行融合。此后，將細胞克隆性地分開，并對每個克隆的上清液所產(chǎn)生的對免疫原之所希望部分特異的合適抗體進行測試。用于制備抗體的其它合適的技術(shù)包括將淋巴細胞在體外暴露給抗原，或者替代性地，也可以篩選位于噬菌體或類似載體中的抗體文庫，例如，參見Huse等人1989。另外，通過采用本領(lǐng)域已知的方法，可以產(chǎn)生重組抗體。見例如，美國專利4816567。可以使用帶或不帶修飾的抗體。經(jīng)常通過共價或非共價方式將抗體與一種提供檢測信號的物質(zhì)連接，從而對抗體進行標(biāo)記。已知有多種不同的標(biāo)記物和偶聯(lián)技術(shù)，并在文獻中對它們有廣泛的報道。因而，可以將針對preptin的如上抗體用于監(jiān)測患者或者在preptin定量測定中preptin的存在。在這樣的測定中，可以采用任何方便的免疫學(xué)方法。這樣的方法包括免疫組化測定法、RIA、IRMA和ELISA測定法。這些測定法可用于有關(guān)肯定或應(yīng)該含有preptin的任何生物液。這樣的液體包括血液、血清、血漿、尿液和腦脊液。也可以將抗體包含在測定試劑盒中。這樣的試劑盒可以另外含有若干任選的但卻帶來方便的成分，選擇這些試劑盒對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來講屬常規(guī)工作。但是，試劑盒中的那些另加組分將一般包括一個preptin參考標(biāo)準(zhǔn)，它可以是preptin本身，或是一種類似物(諸如一個片段)。這種情況將是令人滿意的諸如上面所述的抗體在某些情況下，通過與preptin結(jié)合，也能作為preptin的拮抗劑發(fā)揮作用，從而部分或完全地干擾preptin的活性。正如前面所暗示，本發(fā)明申請人在preptin方面的發(fā)現(xiàn)，也具有診斷含義。例如，為了引發(fā)胰島素分泌至合適的水平，就需要一定量的preptin，那些所產(chǎn)生的preptin比所需要的要少或者所產(chǎn)生的preptin處于活性較低或無活性(突變體)狀態(tài)的個體，就需要治療性干預(yù)。因而，診斷或預(yù)后方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在一個特定的實施方案中，診斷或預(yù)后方法將包括對編碼preptin的基因和/或preptin分泌機制進行突變檢測。對于檢測，可以采用本領(lǐng)域的若干標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)中的任何一種，包括單鏈確定分析(SingleStrandedConfirmationAnalysis)(Orita等人(1989))或在歐洲專利申請出版物第0332435號中公開的抗擴增性突變系統(tǒng)(AmplificationRefractoryMutationSystem)(ARMS)。如果檢測到了突變，那么就有可能給出校正方案來。校正方案包括但不限于基因治療。此外，還將使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。本發(fā)明申請人對preptin鑒定的其它含義和應(yīng)用，對本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員而言將是顯而易見的，這些人將會理解上面的描述只是通過舉例方式提供的，而且本發(fā)明并不局限于上面的描述。參考文獻Draznin，B.和LeRoith，D.(編著).II型糖尿病的分子生物學(xué).胰島素對基因表達與調(diào)節(jié)以及對葡萄糖轉(zhuǎn)運的作用和效應(yīng)(HumanaPressInc.，NewJersey(1994)).Cooper，G.Endocr.Reu.15，163-201(1994).Waggoner，P.，Chen，C.，Worley，J.，Dukes，1.和Oxford，G.美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natn.Acad.Sci.，USA)，90，9145-9149(1993).Hettiarachchi，M.，等人.美國生理學(xué)雜志(AmJ.Physiol.)，273，E859-E867(1997).Hutton，糖尿病學(xué)雜志(J.Diabetologia)，12，271-281(1989).Efrat，S.等人.糖尿病(Diabetes)，42，901-907(1993).Knaack，D.等人.糖尿病，43，1413-1417(1994).Linde，S.等人色譜學(xué)雜志(J.Chromatgr.).4642，243-254(1989)Johnson.K.，等人.美國病理學(xué)雜志(AmJ.Pathol)，130，1-8(1998).Bell，G，I.，等人.自然(Nature)，310，775-777(1984).Martinez，J.(編著).肽激素前激素加工，生物學(xué)活性，藥學(xué)(Peptidehormonesprohormonesprocessing，biologicalactivity，pharmacology)(EllisHorwoodLtd，Chichester，1989).DeChiara，T.，Efstradiadis，A.andRobertson，E.自然，345，78-79(1990).Kulkarni，R.等人.細胞(Cell)，96，329-339(1999).Elahi，D.等人.新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(N.Eng.J.Med.)，306，1196-1202(1982).Argoud，G.，Schade，D.和Eaton，R.糖尿病，36，959-962(1987).Silvestre，R.等人.不列顛藥學(xué)雜志(Br.J.Pharmacol.)，117，347-350(1995).Degano，P.，Silvestre，R.，Salas，M.和Peiro，E.Regul.Pep.43，91-96(1993).Tatemoto，K.等人.自然，324.476-478(1986).Barritt，G.動物細胞內(nèi)通訊(Communicationwithinanimalcells)，(OxfordUniversityPress，Oxford，1992).DeFronzo，R.，Bonadonna，R.和Ferrannini，E.DiabetesCare15，318-368(1992).Hutton，J.，Penn，E.和Peshavaria，M.糖尿病學(xué)(Diabetologia)2，365-373(1982).Grodsky，G.和Fanska，R.酶學(xué)方法(MethodsEnzymol.)，39，364-372(1975).Stempien，M.，F(xiàn)ong，N.，Rall，L.和Bell，G.DNA，5，357-361(1986).Dull，T.，Gray，A.Hayflick，J.和Ullrich，A.自然，310，777-780(1984).Harlow和Lane(1988).抗體實驗室手冊(AntibodiesALaboratoryManual).(ColdSpringHarbourLaboratory，ColdSpringHarbour，NewYork).Huse等人.(1989).科學(xué)(Science)，2461275-1281.Orita等人.(1989).美國國家科學(xué)院院刊，86276-277.Hylka，V.，Teplow，D.，Kent，S.和Strauss，D.生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)，260，14417-14420(1985).Daughaday，W.和Trivedi，B.臨床內(nèi)分泌學(xué)雜志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)，75，641-645(1992).Liu，F(xiàn).，Baker，B.，Powell，D.和Hintz，R.臨床內(nèi)分泌學(xué)雜志，76，1095-1100(1993).Bell，G.，Gerhard，D.，F(xiàn)ong，N.，Sanchez-Pescador，R.和Rall，L.美國國家科學(xué)院院刊，82，6450-6454(1985).Ong，K.等人.Nat.Genet.21，262-263(1999)序列表<110>G·J·S·庫珀C·M·布坎南<120>肽<130>26010MRB<140><141><150>NZ336359<151>1999-06-18<160>10<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>34<212>PRT<213>未知組織<220><223>未知組織的描述序列具有變體<220><221>VARIANT<222>(5)<223>SerorProorananalogthereof<220><221>VARIANT<222>(6)<223>GlnorProorananalogthereof<220><221>VARIANT<222>(7)<223>AlaorThrorananalogthereof<220><221>VARIANT<222>(12)<223>AsporAsnorananalogthereof<220><221>VARIANT<222>(23)<223>GlnorLysorananalogthereof<220><221>VARIANT<222>(24)<223>TyrorPheorananalogthereof<220><221>VARIANT<222>(28)<223>ArgorLysorananalogthereof<220><221>VARIANT<222>(31)<223>AlaorThrorananalogthereof<220><221>VARIANT<222>(32)<223>GlyorGlnorananalogthereof<400>1AspValSerThrXaaXaaXaaValLeuProAspXaaPheProArgTyr151015ProValGlyLysPhePheXaaXaaAspThrTrpXaaGlnSerXaaXaa202530ArgLeu<210>2<211>102<212>DNA<213>智人<220><221>CDS<222>(1)..(102)<400>2gacgtgtcgacccctccgaccgtgcttccggacaacttccccagatac48AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyr151015cccgtgggcaagttctcccaatatgacacctggaagcagtccacccag96ProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLysGlnSerThrGln202530cgcctg102ArgLeu<210>3<211>34<212>PRT<213>智人<400>3AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyr251015ProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLysGlnSerThrGln202530ArgLeu<210>4<211>102<212>DNA<213>家鼠屬(Rattussp.)<220><221>CDS<222>(1)..(102)<400>4gacgtgtctacctctcaggccgtacttccggacgacttccccagatac48AspValSerThrSerGlnAlaValLeuProAspAspPheProArgTyr151015cccgtgggcaagttcttcaaattcgacacctggagacagtccgcggga96ProValGlyLysPhePheLysPheAspThrTrpArgGlnSerAlaGly202530cgcctg102ArgLeu<210>5<211>34<212>PRT<213>家鼠屬(Rattussp.)<400>5AspValSerThrSerGlnAlaValLeuProAspAspPheProArgTyr151015ProValGlyLysPhePheLysPheAspThrTrpArgGlnSerAlaGly202530ArgLeu<210>6<211>102<212>DNA<213>鼠屬(Mussp.)<220><221>CDS<222>(1)..(102)<400>6gacgtgtctacctctcaggccgtacttccggacgacttccccagatac48AspValSerThrSerGlnAlaValLeuProAspAspPheProArgTyr151015cccgtgggcaagttcttccaatatgacacctggagacagtccgcggga96ProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpArgGlnSerAlaGly202530cgcctg102ArgLeu<210>7<211>34<212>PRT<213>鼠屬(Mussp.)<400>7AspValSerThrSerGlnAlaValLeuProAspAspPheProArgTyr151015ProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpArgGlnSerAlaGly202530ArgLeu<210>8<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述作為實例提供<400>8AlaSerThrProGly15<210>9<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述作為實例提供<400>9AsnAspGluGln1<210>10<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述作為實例提供<400>10MetGluIleVal權(quán)利要求1.一種具有preptin功能的分離的生物活性肽。2.一種生物活性肽，其氨基酸序列如下AspValSerThrR1R2R3ValLeuProAspR4PheProArgTyrProValGlyLysPhePheR5R6AspThrTrpR7GlnSerR8R9ArgLeu其中R1為Ser或Pro；R2為Gln或Pro；R3為Ala或Thr；R4為Asp或Asn；R5為Gln或LysR6為Tyr或Phe；R7為Arg或Lys；R8為Ala或Thr；和R9為Gly或Gln；或者其類似物。3.具有如下氨基酸序列的人preptinAspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLysGlnSerThrGlnArgLeu或者其類似物。4.具有如下氨基酸序列的大鼠preptinAspValSerThrSerGlnAlaValLeuProAspAspPheProArgTyrProValGlyLysPhePheLysPheAspThrTrpArgGlnSerAlaGlyArgLeu或者其類似物。5.具有如下氨基酸序列的小鼠preptinAspValSerThrSerGlnAlaValLeuProAspAspPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpArgGlnSerAlaGlyArgLeu或者其類似物。6.權(quán)利要求3-5中的任意一項所述的人、大鼠或小鼠之preptin的哺乳動物同源物。7.一種preptin類似物，它包含來自權(quán)利要求2-5中任意一項所述序列中的6至33個氨基酸，并且它保留了preptin的功能。8.一種preptin類似物，它是，或者包括，源自權(quán)利要求3中所述的人preptin的六肽、七肽、八肽、九肽或十肽。9.一種選自人preptin的肽，具有如下氨基酸序列AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLysGlnSerThrGlnArgLeu或者其類似物，其中所說的類似物選自(i)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLysGlnSerThrGlnArg；(ii)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLysGlnSerThrGln；(iii)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLysGlnSerThr；(iv)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLysGlnSer；(v)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLysGln；(vi)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrpLys；(vii)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspThrTrp；(viii)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAspTyr；(ix)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyrAsp；(x)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGlnTyr；(xi)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePheGln；(xii)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhePhe；(xiii)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLysPhe；(xiv)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGlyLys；(xv)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProValGly；(xvi)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrProVal；(xvii)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyrPro；(xviii)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArgTyr；(xix)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPheProArg；(xx)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPhePro；(xxi)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsnPhe；(xxii)AspValSerThrProProThrValLeuProAspAsn；(xxiii)AspValSerThrProProThrValLeuProAsp；(xxiv)AspValSerThrProProThrValLeuPro；(xxv)AspValSerThrProProThrValLeu；(xxvi)AspValSerThrProProThrVal；(xxvii)AspValSerThrProProThr；and(xxviii)AspValSerThrProPro.10.一種分離的多核苷酸，它編碼如權(quán)利要求1-9中任一項所述的preptin或其類似物。11.一種分離的多核苷酸，它編碼人的preptin，并且它包含下面的核苷酸序列g(shù)acgtgtcgacccctccgaccgtgcttccggacaacttccccagataccccgtgggcaagttcttccaatatgacacctggaagcagtccacccagcgcctg.12.一種分離的多核苷酸，它編碼大鼠的preptin，并且它包含下面的核苷酸序列g(shù)acgtgtctacctctcaggccgtacttccggacgacttccccagataccccgtgggcaagttcttcaaattcgacacctggagacagtccgcgggacgcctg.13.一種分離的多核苷酸，它編碼小鼠的preptin，并且它包含下面的核苷酸序列g(shù)acgtgtctacctctcaggccgtacttccggacgacttccccagatacccegtgggcaagttcttccaatatgacacctggagacagtccgcgggacgcctg.14.一種載體或細胞系，它包含具有權(quán)利要求11-13中任意一項核苷酸序列的多核苷酸，并且它能夠表達具有preptin功能的肽。15.如權(quán)利要求14所述的載體或細胞系，它包含權(quán)利要求11的核苷酸序列。16.一種藥物組合物，它包含如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的preptin或其類似物。17.一種劑量形式，它含有如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的哺乳動物preptin或其類似物，以及適于施用于人的生理緩沖液。18.如權(quán)利要求17所述的劑量形式，其用于注射給藥。19.如權(quán)利要求17或18所述的劑量形式，其中所說的preptin是如權(quán)利要求3、8和9中任意一項所述的人preptin或其類似物。20.如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的哺乳動物preptin或類似物的制劑，其中所說的preptin或類似物的存在量為至少50％重量。21.如權(quán)利要求20所述的制劑，其中所說的preptin或類似物為所說制劑的至少80％重量。22.如權(quán)利要求20所述的制劑，其中所說的preptin或類似物為所說制劑的至少90％重量。23.如權(quán)利要求20所述的制劑，其中所說的preptin或類似物為所說制劑的至少95％重量。24.如權(quán)利要求20所述的制劑，其中所說的preptin或類似物為所說制劑的至少99％重量。25.如權(quán)利要求20所述的制劑，其中所說的preptin或類似物基本上是純的。26.如權(quán)利要求20所述的制劑，其中所說的preptin或類似物是純的。27.如權(quán)利要求20中所述的制劑，其中所說的preptin或類似物是人preptin或其類似物。28.權(quán)利要求1-9中任意一項所述的哺乳動物preptin或類似物的鹽。29.如權(quán)利要求28所述的鹽，其是一種生理可接受的鹽。30.如權(quán)利要求29所述的鹽，其中所說的preptin或類似物是通過與有機酸的陰離子結(jié)合而形成的。31.如權(quán)利要求30所述的鹽，其中所說的鹽選自蘋果酸、乙酸、丙酸、丁酸、草酸、檸檬酸、異檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸和三氟乙酸的鹽類。32.一種包含如權(quán)利要求29-31中任意一項所述的鹽的藥物組合物。33.一種治療性或預(yù)防性地醫(yī)治患者的方法，它包括對所說的患者施用有效量的如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的preptin或其類似物，或者如權(quán)利要求29-31中任意一項所述鹽的步驟。34.一種用于治療或預(yù)防目的的刺激胰島素分泌的方法，它包括對需要如此治療或預(yù)防的患者施用有效量的如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的preptin或其類似物，或者如權(quán)利要求29-31中任意一項所述鹽的步驟。35.一種治療II型糖尿病的方法，它包括對患者施用有效量的如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的preptin或其類似物，或者如權(quán)利要求29-31中任意一項所述鹽的步驟。36.一種治療疾病的方法，這種疾病導(dǎo)致或涉及缺陷的胰島素合成、分泌或作用，該方法包括對患者施用有效量的如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的preptin或其類似物，或者如權(quán)利要求29-31中任意一項所述的鹽的步驟。37.權(quán)利要求1-9中任意一項所述的preptin或其類似物在制備藥物中的用途。38.權(quán)利要求1-9中任意一項所述的preptin或其類似物在制備用于刺激胰島素分泌的藥物中的用途。39.權(quán)利要求29-31中任意一項所述的鹽在制備藥物中的用途。40.權(quán)利要求29-31中任意一項所述的鹽在制備用于刺激胰島素分泌的藥物中的用途。41.與如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的preptin或其類似物結(jié)合的抗體。42.與如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的preptin或其類似物結(jié)合的單克隆抗體。43.與如權(quán)利要求3、8和9中任意一項所述的人preptin或其類似物結(jié)合的單克隆抗體。44.一種使用如權(quán)利要求41-43中任意一項所述的抗體的免疫學(xué)測定法。45.如權(quán)利要求44中所述的測定法，其中對preptin在生物液中的存在進行定量測定。46.如權(quán)利要求45中所述的測定法，其中所述生物液是血液、血清、血漿、尿液或腦脊液(CSF)。47.一種免疫學(xué)測定法，它使用如權(quán)利要求41-43中任意一項所述的抗體，并且它是RIA、IRMA或ELISA。48.一種測定試劑盒，它包含如權(quán)利要求41-43中任意一項所述的抗體。49.如權(quán)利要求48所述的測定試劑盒，它包含如權(quán)利要求41-43中任意一項所述的抗體以及preptin參考標(biāo)準(zhǔn)。50.如權(quán)利要求49所述的測定試劑盒，其中所說的參考標(biāo)準(zhǔn)是如權(quán)利要求1-9中任意一項所述的preptin或其類似物。51.一種鑒定preptin激動劑的方法，它包括步驟在存在及不存在候選物激動劑的情況下，對由預(yù)定濃度的如權(quán)利要求1中所述的preptin所誘導(dǎo)的胰島素分泌程度進行測定；以及對具有提高preptin介導(dǎo)的胰島素分泌效應(yīng)的任何化合物，作為激動劑，予以鑒定。52.一種鑒定preptin拮抗劑的方法，它包括步驟在存在及不存在候選物拮抗劑的情況下，對由預(yù)定濃度的如權(quán)利要求1中所述的preptin所誘導(dǎo)的胰島素分泌程度進行測定；以及對具有減小preptin介導(dǎo)的胰島素分泌效應(yīng)的任何化合物，作為拮抗劑，予以鑒定。53.一種調(diào)制葡萄糖介導(dǎo)的胰島素分泌的方法，它包括對患者施用有效量的preptin激動劑或者preptin拮抗劑的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及一種哺乳動物的生物活性肽。尤其是,本發(fā)明涉及一種由胰腺胰島β－細胞分泌的刺激胰島素分泌的肽,稱為preptin。本發(fā)明還尤其提供了preptin的類似物、含有preptin或其類似物的藥物組合物以及它們作為藥物的用途。文檔編號A61P5/50GK1355813SQ00808785公開日2002年6月26日申請日期2000年6月19日優(yōu)先權(quán)日1999年6月18日發(fā)明者G·J·S·庫珀,C·M·布坎南申請人:普羅特米克斯公司