專利名稱：角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子－2制劑的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)的液體和凍干制劑及其衍生物。本發(fā)明還涉及KGF-2的制劑，尤其是可用于需要軟組織生長(zhǎng)和再生之適應(yīng)征的治療用途的局部和可注射的制劑。
相關(guān)領(lǐng)域成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族曾以參與軟組織生長(zhǎng)和再生的一個(gè)大家族的生長(zhǎng)因子出現(xiàn)。它目前包括在蛋白質(zhì)水平上享有不同同源性的幾個(gè)成員，和除了一個(gè)例外之外，似乎具有類似廣泛的促有絲分裂譜，即，促進(jìn)多種多樣的中胚層和神經(jīng)外胚層起源的細(xì)胞增生和/或促進(jìn)血管形成。
通過序列同源性或因子純化和克隆，KGF原先被鑒定為FGF的一個(gè)家族成員。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)從培養(yǎng)的老鼠角質(zhì)細(xì)胞系中作為一種分裂素分離出來(Rubin，J.S.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)86802-806(1989))。不像其它的FGF家族成員，它對(duì)間質(zhì)來源的細(xì)胞很少有活性，但刺激上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過來源于皮膚和胎兒肺臟的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生(Rubin等，(1989))。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA被發(fā)現(xiàn)在成年人的腎，結(jié)腸和腸骨中表達(dá)，但不在大腦或者肺臟中表達(dá)(Finch，P.W.等，科學(xué)245752-755/(1989))。KGF顯示出FGF蛋白質(zhì)家族內(nèi)的保守區(qū)。KGF以高親和性與FGF-2受體結(jié)合。
消弱的創(chuàng)傷愈合是一個(gè)重大的病態(tài)源，可以導(dǎo)致一些并發(fā)癥，如開裂，吻合崩潰和非治愈的創(chuàng)傷。在正常的個(gè)體中，創(chuàng)傷愈合完成簡(jiǎn)單。相反，削弱的愈合與幾個(gè)疾病狀況相聯(lián)系，如糖尿病，感染，免疫抑制，肥胖癥，以及營(yíng)養(yǎng)不良(Cruse，P.J.和Foord，R.，Arch.Surg.107206(1973)；Schrock，T.R.等，Ann.Surg.177513(1973)；Poole，G.U.，Jr.，外科97631(1985)；Irvin，G.L.等，Am.Surg.51418(1985))。
創(chuàng)傷修復(fù)是復(fù)雜的相互作用和生物學(xué)病變過程的結(jié)果。在正常的創(chuàng)傷愈合中描述了三個(gè)階段急性炎癥期，胞外基質(zhì)和膠原合成，以及模型重建(Peacock，E.E.，Jr.，創(chuàng)傷修復(fù)，第二版，WB Saunders，費(fèi)城(1984))。該過程牽涉到角質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞在創(chuàng)傷位點(diǎn)的相互作用。
理想的是研制能夠促進(jìn)和增加軟組織生長(zhǎng)和再生的藥物組合物的多肽制劑，該藥物組合物(1)在延長(zhǎng)的保存期間是穩(wěn)定的，(2)增加藥用的活性或多肽的效能或者(3)使得在治療范圍內(nèi)容易使用或者施用多肽。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及KGF-2的液體和凍干制劑，以及它們的缺失突變體或點(diǎn)突變體或取代突變體(本文稱為KGF-2多肽)。本發(fā)明還涉及這些KGF-2多肽制劑促進(jìn)或者加速軟組織生長(zhǎng)或者再生的用途，例如在創(chuàng)傷愈合，或者在治療mucocytis或炎癥性的腸疾病方面的用途。本發(fā)明的優(yōu)選制劑使用新型的KGF-2突變體形式，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，使用一個(gè)本文稱為KGF2-Δ33的缺失突變體。本制劑中使用的輔助組分(1)提供KGF-2多肽保存的穩(wěn)定性，(2)進(jìn)一步提高治療組合物的軟組織治愈活性，和/或(3)當(dāng)為特定的治療目的使得容易使用和施用時(shí)，以一種活性形式提供KGF-2多肽。
本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種包含KGF-2多肽和具有介于約pH5.0和約pH8.0之間緩沖能力的緩沖劑的制劑。有用的緩沖液包括磷酸鹽，醋酸鹽，順烏頭酸鹽，琥珀酸鹽，蘋果酸鹽，碳酸鹽以及檸檬酸鹽緩沖液，優(yōu)選的為檸檬酸鹽。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及一種包含KGF-2多肽，冷凍干燥成塊劑和具有介于約pH5.0和約pH8.0之間緩沖能力的緩沖劑制劑。有用的緩沖液包括磷酸鹽，醋酸鹽，順烏頭酸鹽，琥珀酸鹽，蘋果酸鹽，碳酸鹽以及檸檬酸鹽緩沖液，優(yōu)選的為檸檬酸鹽。
本發(fā)明的第三方面涉及一種包含KGF-2多肽和含巰基的混合物、優(yōu)選地為能夠穩(wěn)定KGF-2多肽的單巰基甘油制劑。該制劑優(yōu)選地包含具有介于約pH5.0和約pH8.0之間緩沖能力的緩沖劑。該制劑還可包含一種或多種抗氧劑或一種或多種金屬螯合劑。
本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及一種包含KGF-2多肽，緩沖液，和使該制劑在某個(gè)預(yù)定溫度形成凝膠的高分子量化合物的制劑。一種優(yōu)選的的高分子量化合物是Pluronic或者Poloxamer的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯的嵌段共聚物。含巰基的混合物，如單巰基甘油，也可包含在本制劑中以提供多肽附加的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及一種包含KGF-2多肽，緩沖劑和增稠劑的制劑。增稠劑用來增加該制劑的粘度。優(yōu)選的增稠劑為羧甲基纖維素(CMC)，羥乙基纖維素(HEC)，羥丙基甲基纖維素(HPMC)，Natrosol，以及Carbomers。
此外，本發(fā)明的制劑也可以包含金屬螯合劑，抗氧劑或者含巰基混合物如抗壞血酸酯，單巰基甘油，半胱氨酸，生育粉，丁化羥基苯甲醚，硫酸鈉，亞硫酸氫鈉，以及偏亞硫酸鈉，以及防腐劑如m-甲苯酚，苯酚，氯丁烷，氯丁醇，苯甲醇，甲基對(duì)羥基苯甲酸酯和丙基對(duì)羥基苯甲酸酯?？刮⑸锓栏瘎┛梢詼p少KGF-2制劑的穩(wěn)定性，令人驚奇的是，甲基對(duì)羥基苯甲酸酯和丙基對(duì)羥基苯甲酸酯的結(jié)合被發(fā)現(xiàn)適于在KGF-2制劑中使用。本發(fā)明的制劑在藥瓶的頭部空間也可以有一層氮?dú)飧采w物。此外，本發(fā)明的制劑可以包含用氦氣，氬氣，或者氮?dú)馇逑粗苿┚彌_液。
附圖簡(jiǎn)要描述圖形1A-1C說明了KGF-2的cDNA與相應(yīng)的所推導(dǎo)的氨基酸序列。初始的35個(gè)或者36個(gè)氨基酸殘基代表可能的引導(dǎo)序列(下畫線的)。對(duì)氨基酸使用一個(gè)字母的縮寫標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)試圖確定多核苷酸序列時(shí)，序列測(cè)定的不準(zhǔn)確性是一個(gè)普遍的問題。利用373自動(dòng)DNA序列分析儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行序列分析。預(yù)計(jì)序列分析的準(zhǔn)確性大于97％的準(zhǔn)確率。(SEQ ID NO1和2)
圖2(A)-2(C)描述了通過本發(fā)明的KGF-2多肽刺激正常的原初上皮角質(zhì)細(xì)胞的增生作用。圖(2A)顯示KGF-2對(duì)正常的原初上皮角質(zhì)細(xì)胞增生的刺激作用。圖(2B)顯示KGF-2Δ33對(duì)正常的原初上皮角質(zhì)細(xì)胞增生的刺激作用。圖(2C)顯示KGF-2Δ28對(duì)正常的原初上皮角質(zhì)細(xì)胞增生的刺激作用。
圖3顯示了KGF-2Δ33的液體制劑10個(gè)月穩(wěn)定性的生物活性結(jié)果。
圖4顯示了KGF-2Δ33的凍干制劑9個(gè)月穩(wěn)定性的生物活性結(jié)果。
圖5顯示了單巰基甘油對(duì)KGF-2生物活性的影響。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述KGF-2刺激上皮角質(zhì)細(xì)胞，但不是間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞的增生。這樣，“具有KGF-2蛋白質(zhì)樣活性的多肽”包括在下面陳述的角質(zhì)細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)中顯示KGF-2活性和結(jié)合FGF受體異構(gòu)形式1-iiib和2-iiib的多肽。
本發(fā)明涉及KGF-2多肽的藥物和獸藥制劑。通過參考附

圖1的多肽(SEQID NO2)和由保藏的cDNA編碼的多肽，以及包括附圖1多肽(SEQ ID NO2)的片段，衍生物和類似物，或者由保藏的cDNA編碼的本質(zhì)上保持與親代多肽相同的生物學(xué)功能的多肽定義本文的KGF-2多肽。本發(fā)明中使用的多肽可以是重組多肽，天然多肽或者是合成的多肽，優(yōu)選地為重組多肽。
在pH為4.5或小于4.5，或大于8.0pH時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KGF-2多肽表現(xiàn)出較差的活性和穩(wěn)定性。本發(fā)明者曾發(fā)現(xiàn)KGF-2多肽的氧化和沉淀。當(dāng)試圖把其配制為用于治療目的的制劑時(shí)，這些多肽呈現(xiàn)出一定的困難。為了保持理化性質(zhì)和生物活性，KGF-2多肽可用抗氧劑(如氧清除混合物)，和/或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑(如含巰基混合物)，和/或金屬-螯合劑(如EDTA)進(jìn)行配制。本文所使用的穩(wěn)定作用是指在指定的時(shí)間段內(nèi)維持KGF-2多肽的理化性質(zhì)和實(shí)質(zhì)上的生物學(xué)活性。
根據(jù)本發(fā)明的制劑包含凝膠，增稠劑，溶液和凍干形式。這些制劑本文也稱為“藥物組合物”或者“組合物”。可注射的制劑液體制劑本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及KGF-2多肽的液體制劑，包含一種KGF-2多肽和一種具有介于約pH5.0和約pH8.0之間、更優(yōu)選地為pH5.5至pH6.5之間、最優(yōu)選地為pH6.2的緩沖能力的緩沖液。有用的緩沖液包括來源于磷酸，醋酸，烏頭酸，檸檬酸，戊二酸，蘋果酸，琥珀酸和碳酸的緩沖液。典型地所使用的是上述一種酸的堿金屬或堿土金屬鹽。更優(yōu)選的緩沖液將是醋酸鹽或者為檸檬酸鹽，最優(yōu)選地為檸檬酸鹽。例如，制劑可以包含通過在水中把一種緩沖量的檸檬酸或其藥學(xué)上可接受的鹽與KGF-2Δ33相混合所形成的組合物。或者，制劑也可包括通過在水中把一種緩沖量的醋酸或其藥學(xué)上可接受的鹽與KGF-2Δ33相混合所形成的組合物。優(yōu)選的緩沖液濃度從約5mM到約50mM。最優(yōu)選的醋酸鹽緩沖液將具有約20mM的濃度，以及檸檬酸鹽緩沖液將具有約10mM到約20mM的濃度。制劑也可包含NaCl，甘氨酸，蔗糖或者甘露醇，或者其組合作為一種補(bǔ)劑，濃度約從0mM至150mM，優(yōu)選地為10至約150mM，最優(yōu)選地為約125mM，以及金屬螯合劑，如EDTA，濃度約從0mM至10mM，最優(yōu)選地為約1mM。另外，本發(fā)明的液體制劑也可包含一種或多種(a)一種穩(wěn)定量的抗氧劑，如抗壞血酸和或(b)一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)量的巰基化合物，例如單巰基甘油(MTG)。不希望被理論所束縛，人們相信巰基混合物如MTG用作保護(hù)KGF-多肽中存在的游離硫羥基基團(tuán)。用于液體制劑的保存條件典型地在約2℃至約8℃?；蛘?，保存條件在-20℃或低于-20℃。最優(yōu)選地，保存條件在約-20℃。在冷凍狀態(tài)下保存KGF-2液體制劑限制了對(duì)多肽的氧化量，轉(zhuǎn)過來導(dǎo)致形成穩(wěn)定的多肽制劑。
優(yōu)選地，液體制劑包含(1)一種治療有效量的KGF-2多肽；(2)一種有效量的具有介于約pH5.0和約pH8.0之間緩沖能力的緩沖液；和(3)一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑；和(4)可有可無的下列一種或多種(a)NaCl，甘氨酸，蔗糖或甘露醇或者其組合體，作為一種補(bǔ)劑(b)一種螯合劑，(c)一種穩(wěn)定量的抗氧劑，和
(d)一種穩(wěn)定量的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。KGF-2多肽優(yōu)選地保存于溶液中。
本發(fā)明的組合物通過一起混合上述所列出的組分進(jìn)行加工，優(yōu)選地以本文表示的濃度和比例進(jìn)行加工。
可用于液體制劑的抗氧劑包括硫酸氫鈉，半胱氨酸，亞硫酸鈉，抗壞血酸，生育粉，以及丁化羥基苯甲醚。此外，可用于液體制劑的穩(wěn)定劑還包括巰基類如半胱氨酸，甲硫氨酸和巰基甘油。可使用的金屬螯合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)，或二乙三胺五乙酸(DPTA)，以EDTA為優(yōu)選。
本發(fā)明包含抗氧化劑或巰基類的制劑可以增加KGF-2多肽的穩(wěn)定性。這使具有較長(zhǎng)的貨架壽命的藥物產(chǎn)品成為可能。
此外，本發(fā)明的制劑還可包含一種或多種防腐劑，如苯甲醇，優(yōu)選地濃度為約0.5％至約1.5％，最優(yōu)選地濃度為0.9％；氯丁醇，優(yōu)選地濃度為約0.01％至約1％，最優(yōu)選地濃度為0.5％；甲基對(duì)羥基苯甲酸酯，優(yōu)選地濃度為約0.1％至約0.2％，最優(yōu)選地濃度為0.18％；丙基對(duì)羥基苯甲酸酯，優(yōu)選地濃度為約0.01％至約0.05％，最優(yōu)選地濃度為0.02％；間-甲酚，優(yōu)選地濃度為約0.1％至約1％，最優(yōu)選地濃度為0.3％；和/或苯酚，優(yōu)選地濃度為約0.1％至約1％，最優(yōu)選地濃度為0.5％。特別優(yōu)選地是甲基對(duì)羥基苯甲酸酯和丙基對(duì)羥基苯甲酸酯一起使用，甲基對(duì)羥基苯甲酸酯的濃度為約0.1％至約0.2％，丙基對(duì)羥基苯甲酸酯的濃度為約0.10％至約0.05％。最優(yōu)選地是甲基對(duì)羥基苯甲酸酯和丙基對(duì)羥基苯甲酸酯的組合，甲基對(duì)羥基苯甲酸酯的濃度為0.18％，丙基對(duì)羥基苯甲酸酯的濃度為0.02％。
更優(yōu)選的液體制劑包含(1)濃度范圍為約0.02至約40mg/ml(w/v)的KGF-多肽，更優(yōu)選地為約0.05至約30mg/ml(w/v)，甚至更優(yōu)選地為約0.1至約2mg/ml(w/v)，還有更優(yōu)選地為約10mg/ml(w/v)；并且最優(yōu)選地為約0.2至4mg/ml(w/v)；(2)濃度范圍在約5mM至50mM，優(yōu)選地約5mM至30mM的具有介于約pH5.0和約pH8.0之間緩沖能力的緩沖液；和(3)一種藥物學(xué)上可接受的稀釋劑，優(yōu)選地為水，使組合物稀釋至指定的體積。
用于本發(fā)明制劑的有用的緩沖液包括來源于醋酸，烏頭酸，檸檬酸，戊二酸，蘋果酸，琥珀酸，磷酸鹽和碳酸的緩沖液。典型地所使用的是上述酸的堿金屬或堿土金屬鹽。優(yōu)選的為醋酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液，如醋酸或者其藥學(xué)上可接受的鹽，或者檸檬酸或者其藥學(xué)上可接受的鹽。該溶液制劑更優(yōu)選的pH范圍從約pH5.0至約pH8.0，更優(yōu)選地為pH5.5至pH6.5，以及最優(yōu)選地為約pH6.2。醋酸鈉或者檸檬酸鈉是優(yōu)選的的緩沖劑，尤以檸檬酸鈉鹽為最優(yōu)選。
優(yōu)選地向上述溶液中加入的還有(4)一種螯合劑，如濃度范圍在約0.1mM至約10mM，更優(yōu)選地在約1mM的EDTA；(5)一種補(bǔ)劑，如濃度范圍在約0.01mM至約150mM，更優(yōu)選地為約125mM的NaCl，甘氨酸，蔗糖或者甘露醇，或者它們的組合體。
可選擇地，一種液體制劑也可以包含一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)的量的選自下組的混合物(a)約0.5％至約2％w/v的甘油，(b)約0.1％至約1％w/v的甲硫氨酸，或者(c)約0.1％至約2％w/v的單巰基甘油。
本發(fā)明該方面的優(yōu)選實(shí)施方案包括通過混合下列物質(zhì)所形成的組合物(1)濃度為約0.02至約40mg/ml(w/v)，更優(yōu)選的濃度約0.1至約20mg/ml，最優(yōu)選的為約0.2至4mg/ml的KGF-2多肽。
(2)10mM的檸檬酸鈉或者20mM醋酸鈉；(3)125mM NaCl；(4)1mM EDTA；和(5)作為稀釋劑的水。
更優(yōu)選地，該溶液制劑包含通過混合以下物質(zhì)所形成的組合物(1)約0.2至4mg/ml的KGF-2多肽；(2)20mM的醋酸鈉；
(3)125mM的NaCl；(4)1mM的EDTA；和(5)作為稀釋劑的水，其中溶液在約pH6.2，并且在約-20℃保存。
最優(yōu)選地，該溶液制劑包含通過混合以下物質(zhì)所形成的組合物(1)約1.0mg/ml的KGF-2多肽；(2)20mM的檸檬酸鹽，pH5-5.5；和(3)0.01％的多山梨酸酯80。
該溶液優(yōu)選地還包含約7％蔗糖或者2％甘氨酸與0.5％蔗糖的組合體。
或者，該溶液制劑包含通過混合以下物質(zhì)所形成的組合物(1)約1.0mg/ml的一個(gè)KGF-2多肽；(2)20mM的檸檬酸鹽，pH5-5.5；(3)1mM的EDTA；和(4)0.01％的多山梨酸酯80。
該溶液優(yōu)選地還包含約7％蔗糖或者2％甘氨酸與0.5％蔗糖的組合體。
本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KGF-2多肽容易氧化，凝聚和在溶液中沉淀。雖然KGF-2的氧化作用不破壞生物活性，限制該產(chǎn)品的氧化程度導(dǎo)致一種更穩(wěn)定的產(chǎn)品。本發(fā)明者觀察到，如果液體制劑pH太低，KGF-2多肽將失去生物活性。此外，隨著溶液的pH接近KGF-2的pI，蛋白質(zhì)將從溶液中沉淀下來。因此，本發(fā)明者曾測(cè)定液體制劑應(yīng)該保持在約pH6.0至約pH7.0的范圍內(nèi)，并且約6.2的pH對(duì)穩(wěn)定KGF-2多肽來說是最合適的。而且，發(fā)明者令人驚奇地測(cè)定到檸檬酸鹽緩沖液特別能穩(wěn)定KGF-2多肽。
雖然，使用約pH6.0-6.2的檸檬酸鹽緩沖液提供一種可減少KGF-2多肽的凝聚，并且增加穩(wěn)定性的液體制劑，但液體多肽制劑中KGF-2多肽仍然易受氧化和沉淀。因此，發(fā)明者開發(fā)了一種下面陳述的凍干制劑。凍干制劑本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及KGF-2多肽的凍干制劑，包含一種KGF-2多肽和一種具有介于約pH5.0和約pH8.0之間、更優(yōu)選地為pH5.5至pH6.5、最優(yōu)選地為pH6.2的緩沖能力的緩沖液。有用的緩沖液包括來源于磷酸，醋酸，烏頭酸，檸檬酸，戊二酸，蘋果酸，琥珀酸和碳酸的緩沖液。典型地所使用的是上述酸的堿金屬或堿土金屬鹽。更優(yōu)選的緩沖液將是磷酸鹽或者檸檬酸鹽，最優(yōu)選地為檸檬酸鹽。例如，制劑可以包含通過在水中把一種緩沖量的檸檬酸或其藥學(xué)上可接受的鹽與KGF-2Δ33相混合所形成的組合物。優(yōu)選的緩沖液濃度從約5mM到約50mM。更優(yōu)選的緩沖液濃度約為10mM。最優(yōu)選地，以約10mM的濃度加入檸檬酸緩沖液。在該制劑中優(yōu)選地還包含作為補(bǔ)劑的氯化鈉，濃度為約0mM至150mM，最優(yōu)選地為約20mM，以及金屬螯合劑，如EDTA，濃度為約0mM至10mM，最優(yōu)選地為約1mM。此外，成塊劑/低溫防凍劑如蔗糖，甘氨酸，甘露醇，海藻糖或者其它的藥物學(xué)上可接受的成塊劑也包括在該制劑中。使用的成塊劑的量將使溶液是等滲的，范圍在約2％至10％w/v。優(yōu)選的濃度如下5％甘露醇，7％蔗糖，8％海藻糖，或者2％甘氨酸加0.5％蔗糖。更優(yōu)選地，使用蔗糖或者蔗糖/甘氨酸的混合物。此外，本發(fā)明的凍干制劑也可包含一種或多種的(a)穩(wěn)定量的抗氧劑，如抗壞血酸或者(b)穩(wěn)定量的巰基類化合物，例如單巰基甘油。凍干制劑的保存條件典型地是約2℃至約25℃。更優(yōu)選的保存條件在約2℃至約8℃或者約2℃至約8℃之下。
在初始溶液中濃度為約0.02mg/ml至約10mg/ml的蛋白質(zhì)被冷凍干燥為KGF-2多肽。
初始的凍干溶液優(yōu)選地包含(除KGF-2多肽之外)(1)有效量的檸檬酸或者其藥物學(xué)上可接受的鹽，優(yōu)選地為檸檬酸鈉，濃度范圍在約5mM至約20mM；(2)濃度范圍為約0mM至約125mM的NaCl，(3)濃度范圍為約0mM至約10mM的EDTA，(4)一種或多種濃度范圍為約2％w/v至15％w/v的蔗糖，甘露醇，甘氨酸或海藻糖，或者它們的混合物；和(5)水。
冷凍干燥緩沖液優(yōu)選的pH范圍為約5.5至約8.0，優(yōu)選地為約pH6.2。
更優(yōu)選地，冷凍干燥緩沖液包含10mM的檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM的pH6.2的EDTA和7％蔗糖。
凍干的KGF-2多肽制劑在無菌水中重構(gòu)，以保持約290mOsm的等滲狀態(tài)。KGF-2多肽可在無菌水中重構(gòu)，可以也可以不含有穩(wěn)定量的抗氧化劑，包含a)約0.01％至約2％w/v的單巰基甘油，b)約0.01％至約2％w/v的抗壞血酸，c)約0.01％至約2％w/v的甲硫氨酸或者，d)它們的組合體。
本發(fā)明包括產(chǎn)生穩(wěn)定的KGF-多肽制劑的冷凍干燥循環(huán)。冷凍干燥循環(huán)被設(shè)計(jì)來在初級(jí)的干燥階段把KGF-2多肽產(chǎn)品保持在它的折迭溫度之下。此外，含水量?jī)?yōu)選地定為不到5％，更優(yōu)選地不到2％％。對(duì)任何特定的蛋白質(zhì)必須在個(gè)體基礎(chǔ)上測(cè)定這種凍干流程。根據(jù)本發(fā)明的對(duì)含有凍干制劑的KGF-2蔗糖的一個(gè)示范凍干循環(huán)周期測(cè)定如下
根據(jù)本發(fā)明的對(duì)KGF-2凍干制劑的另一個(gè)示范凍干循環(huán)周期測(cè)定如下
本發(fā)明的冷凍干燥制劑提供了意外地增加的穩(wěn)定性的產(chǎn)品。的確，本發(fā)明的凍干KGF-2制劑在溫度高達(dá)45℃至少9個(gè)月生物學(xué)性質(zhì)還是穩(wěn)定的(圖4)。逆相高效液相色譜顯示本發(fā)明的凍干KGF-2制劑在45℃或低于45℃的溫度和75％的相對(duì)濕度下保持其理化性質(zhì)多達(dá)8個(gè)月。在這樣的高溫下，保持如此之長(zhǎng)的時(shí)間穩(wěn)定性對(duì)蛋白質(zhì)是十分不尋常的。增稠的和凝膠制劑本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及KGF-2多肽增稠的或者凝膠制劑。
1)增稠劑增稠劑可以添加到上述所描述的液體制劑中，以增加產(chǎn)生制劑的粘度。具有增加的粘度的一種制劑對(duì)局部用藥是有益的，這些局部用藥的地方在控制藥物釋放，粘附到創(chuàng)傷外面或者避免流失掉可能是重要的。這些增稠的制劑被用于局部的用途，如創(chuàng)傷愈合，治療皮膚病或任何其它的通過局部施用KGF-2的藥物組合物能夠治療的用途。
增稠劑應(yīng)該提高粘度到約50至約10,000厘泊(cps)，更優(yōu)選地為約50至約1,000cps，最優(yōu)選地約200至約300cps。利用一個(gè)旋轉(zhuǎn)紡錘粘度計(jì)測(cè)定粘度。最優(yōu)選的增稠劑濃度為0至5％(w/w)。增稠的溶液總將保持液體狀態(tài)。
合適的增稠劑的例子包括，但不限于水溶性的乙醚化的纖維素和carbomer(高分子量的丙烯酸與烯丙基蔗糖或戊赤鮮糖的烯丙基醚交聯(lián)的聚合物)。乙醚化的纖維素的例子是本領(lǐng)域中熟知的(在USP中列出)，包括烷基化纖維素，羥基烷基化的纖維素和烷基化的羥基烷基化纖維素，例如，甲基纖維素，羥基乙基纖維素，羥基丙基纖維素，羥基丙基甲基化的纖維素等等。在另一實(shí)施方案中，局部的或切開的凝膠可包含約0至20％重量的具有50,000至約700,000的分子量的纖維素衍生物。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，纖維素衍生物以約2％至8％的重量存在，具有約80,000至約240,000的分子量范圍。優(yōu)選的纖維素衍生物為羥基丙基甲基化的纖維素，甲基纖維素，羧甲基纖維素，羥基乙基纖維素。
當(dāng)增稠劑加入到注射制劑中時(shí)，為其最佳的穩(wěn)定性可以加入或者從制劑中去除上面詳述的鹽和緩沖劑。例如，可以增加檸檬酸鹽濃度。例如，優(yōu)選濃度為約10mM至約500mM的檸檬酸鹽，更優(yōu)選地為約10mM至約50mM的檸檬酸鹽，最優(yōu)選地為約10mM至20mM的檸檬酸鹽。此外，在凍干制劑中可減少蔗糖的量到約0至約5％蔗糖的范圍。
增稠劑可直接加入到根據(jù)本發(fā)明的液體凍干制劑中，然后凍干。或者，根據(jù)本發(fā)明的凍干制劑可通過加入合適的稀釋劑，最優(yōu)選地為加入含有溶解在其中的增稠劑的水重構(gòu)。通過噴霧施用這些增稠的制劑。
根據(jù)本發(fā)明，一種優(yōu)選的增稠KGF-2多肽溶液的例子包括通過混合下列物質(zhì)所形成的產(chǎn)品(1)一種局部有效量的KGF多肽，優(yōu)選地為KGF-2A33；(2)約10mM至約500mM的檸檬酸鈉鹽緩沖液；(3)約0.01至約150mM的NaCl；(4)約0.75至約1.27mM，優(yōu)選地為約1ml的EDTA；(5)約0.1％至約7％的蔗糖，或約2.0％甘氨酸和約0.5％蔗糖的組合體；(6)約0.75至約1.5％(w/w)的羧甲基纖維素，或約0.5至約1.5％的羥基丙基甲基纖維素，或者約0.25至約0.75％的羥基乙基纖維素，或者約0至1％的carbomer，或者任何它們的組合體。
這樣一種制劑的pH最優(yōu)選地為pH6.2。
2)凝膠劑本發(fā)明的另一方面涉及KGF-2多肽的凝膠制劑。凝膠劑可以添加至本發(fā)明的可注射制劑中以提供一種在室溫下保持液體的制劑，并且當(dāng)施用到皮膚的表面時(shí)(在約37℃)可以凝固。這些制劑對(duì)局部用藥是有用的，這些局部用藥的地方在控制藥物釋放，粘附到創(chuàng)傷外面或者避免流失掉可能是重要的。這些凝膠的制劑被用于局部用途，如創(chuàng)傷愈合，治療皮膚病或任何其它的通過局部施用一種KGF-2的藥物組合物能夠治療的用途。
根據(jù)本發(fā)明的KGF-2多肽凝膠制劑包含
(1)一種局部有效量的KGF多肽；(2)一種緩沖液；(3)一種藥物學(xué)上可接受的稀釋劑，優(yōu)選地為水；和(4)一種形成凝膠的高分子量化合物。
本發(fā)明的凝膠制劑的粘度在室溫下為約1至約10,000cps的范圍，最優(yōu)選地為室溫下約20至約100cps。利用一個(gè)旋轉(zhuǎn)紡錘粘度計(jì)測(cè)定粘度。
本發(fā)明中使用的形成凝膠的高分子量化合物典型地是水溶性的能夠形成粘性水溶液的聚合物，或者非水溶性的，遇水膨脹的也能形成粘性溶液和一旦與皮膚接觸即形成凝膠的聚合物(例如膠原蛋白)。
有用的形成凝膠的高分子量化合物可選自乙烯基聚合物，聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物，多糖，蛋白，聚(乙烯氧化物)，丙烯酰胺聚合物及其衍生物，和/或它們的鹽。在美國(guó)專利5,427,778中可以發(fā)現(xiàn)能夠用來制造藥物凝膠制劑、用于治愈創(chuàng)傷的其它化合物，本文充分予以一并參考。
有用的乙烯聚合物(或者替代聚乙烯)包括多丙烯酸，多甲基丙烯酸，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯乙醇。有用的多糖包括纖維素衍生物，粘多糖，瓊脂，果膠，褐藻酸，葡聚糖，α-直鏈淀粉，支鏈淀粉，殼聚糖。有用的粘多糖包括透明質(zhì)酸，軟骨素，4-硫酸軟骨素，硫酸乙酰肝素，肝素。粘多糖與任何其它凝膠形成聚合物，例如，膠原蛋白，明膠，纖連蛋白一起結(jié)合可用來提高創(chuàng)傷愈合。丙烯酰胺聚合物可以是聚丙烯酰胺或者聚甲基丙烯酰胺。
優(yōu)選的高分子量凝膠形成混合物是聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物，尤其是那些在貿(mào)易上指定為PLURONICS(BASF)或者POLAXAMERS(BASF)的嵌段共聚物。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的凝膠按重量比可以包含約10至約60％的具有平均分子量為約500至50,000的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物。在一更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的凝膠按重量比可以包含約14至約18％的具有分子量范圍為1,000至15,000的嵌段共聚物。本發(fā)明的優(yōu)選嵌段共聚物是Pluronic F108和Pluronic F127。
聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物(Pluronic或者Poloxamer)在局部藥物傳送系統(tǒng)的應(yīng)用中具有很大的潛力，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出可逆的熱凝膠化行為，具有很好的藥物釋放特征以及較低的毒性。當(dāng)溶液加熱即形成凝膠。因此，凝膠在室溫下是一種低粘性的水溶液，但當(dāng)它接觸哺乳動(dòng)物身體時(shí)，被體溫溫暖，粘度隨著溶液形成凝膠而增加。例如，Pluronic凝膠可用于KGF-2多肽控制傳輸?shù)絼?chuàng)傷以及其它需要局部傳輸藥物的位點(diǎn)。KGF-2多肽可與Pluronic以液態(tài)方式結(jié)合，并施用到創(chuàng)傷處。凝膠化作用發(fā)生并有效地減少多肽釋放至創(chuàng)傷的速率，進(jìn)而以延長(zhǎng)多肽和創(chuàng)傷位點(diǎn)之間的接觸。利用這樣的凝膠制劑的益處包括保持創(chuàng)傷濕潤(rùn)，持有在形狀上合適于創(chuàng)傷或其它可施用化合物的位點(diǎn)的藥物化合物。
根據(jù)本發(fā)明的KGF-2多肽的優(yōu)選凝膠制劑包含檸檬酸鹽緩沖液和Pluronic。該制劑可以包括一定量的檸檬酸酸或者其藥物學(xué)上可接受的鹽。
根據(jù)本發(fā)明的凝膠制劑也可包括螯合劑，穩(wěn)定量的抗氧劑或者巰基類。凝膠制劑包含以一定量形成凝膠的高分子量化合物，如Pluronic，或者水溶性乙醚化的纖維素，等等。在根據(jù)本發(fā)明的凝膠制劑中，KGF-2多肽優(yōu)選地為約0.01mg/ml至約10mg/ml的濃度。
優(yōu)選地，凝膠制劑的形成通過混合(1)一種KGF-2多肽，優(yōu)選地為KGF-2Δ33，以最終計(jì)算的0.01mg/ml至約10mg/ml的濃度；(2)一種有效量的緩沖劑；(3)約10％至約60％，或者更優(yōu)選地為約14％至約18％的重量的平均分子量為約500至50,000的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物；和(4)一種藥物學(xué)上可接受的稀釋劑，優(yōu)選地為水。
另一個(gè)優(yōu)選的凝膠制劑包含(1)一種藥物學(xué)上具活性量的KGF-2多肽；(2)約10mM至約500mM檸檬酸鈉鹽；(3)約0.01mM至約150mMNaCl；(4)約1mM EDTA；
(5)約0.1％至約7％蔗糖或者約2.0％甘氨酸和約0.5％蔗糖；(6)約14％至約18％Pluronic F127；和(7)水，其中制劑的pH約為pH6.2。
最優(yōu)選地，凝膠制劑包含(1)一種KGF-2多肽，優(yōu)選地KGF-2Δ33，在約為0.01mg/ml至約10mg/ml(w/v)的濃度范圍，更優(yōu)選地約0.1mg/ml至約3mg/ml的濃度范圍，最優(yōu)選地為約0.2mg/ml的濃度；(2)濃度范圍約5mM至20mM的檸檬酸鈉；(3)約10％至約25％(w/v)，優(yōu)選地為約15至約25，最優(yōu)選地為約16％的Pluronic127或者Poloxaxner407；(4)約6.7％至約7.3％的蔗糖，優(yōu)選地為約7％蔗糖或者約2.0％甘氨酸和約0.5％蔗糖；和(5)加水至體積。
凝膠制劑還可以包含下列的一種或多種(6)濃度范圍約0.1mM至約10mM的EDTA。
(7)濃度范圍約0.01mM至約125mM的NaCl。凝膠制劑的優(yōu)選pH范圍從約pH5.0至約pH8.0，優(yōu)選地為pH6.2，產(chǎn)生的凝膠制劑應(yīng)該是等滲的。
3)附加的穩(wěn)定劑本發(fā)明的所有前述的制劑可從抗氧化劑，金屬螯合劑，含巰基類混合物和其它通用的穩(wěn)定劑中受益。這樣的穩(wěn)定劑的例子包括，但不限于(a)約0.5％至約2％w/v的甘油，(b)約0.1％至約1％w/v的甲硫氨酸，(c)約0.1％至約2％w/v的單巰基甘油，(d)約1mM至約10mM的EDTA，(e)約0.01％至約2％w/v的抗壞血酸，(f)0.003％至約0.02％w/v的多山梨酸酯80，(g)0.001％至約0.05％w/v的多山梨酸酯20，
(h)精氨酸，優(yōu)選的濃度在約0.5％至約2.5％，最優(yōu)選地在約1.7％，(i)肝素或者肝素類似物(帶負(fù)電荷的)，(j)葡聚糖硫酸鹽，濃度優(yōu)選地在約0.05％和0.5％，(k)環(huán)化糊精或者硫酸鹽環(huán)化糊精，(1)陰離子或者多陰離子種類[肝素類似物]，(m)賴氨酸，優(yōu)選地為10％的濃度，(n)羥基丙基-σ-環(huán)化糊精，優(yōu)選地在約2至10％的濃度，(o)硫酸鹽-σ-環(huán)化糊精，優(yōu)選地在約0.1％和10％的濃度，最優(yōu)選地在約1％，或者(p)它們的組合體。KGF-2多肽的施用本發(fā)明的KGF-2多肽制劑可以使用熟知的在藥物組合物中有用的合適的藥物稀釋劑。這樣的稀釋劑包括但不限于鹽水，緩沖液鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，以及它們的組合。該制劑應(yīng)該適宜于施藥的模式。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明上述指定的方法調(diào)制藥物組合物。水是優(yōu)選的稀釋劑。
具有KGF-2活性的多肽以藥物組合物的方式與一種或多種藥物學(xué)上可接受的賦形劑施用。不言而喻的是當(dāng)施藥給一個(gè)患者時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物的每日總使用劑量將由出診醫(yī)生在其正確的判斷范圍內(nèi)作出決定。對(duì)任一特定病人的特定療效劑量水平將取決于多種因素，包括欲達(dá)成的反應(yīng)類型和程度；特定的組合物，包括是否使用另一種藥劑(如果有的話)；年齡，體重，一般健康，性別和病人的飲食；施藥的時(shí)間，施藥的途徑，和組合物分泌的速率；治療持續(xù)的時(shí)間；與特定的組合物一起使用或同時(shí)使用的藥物(如一種化療劑)；以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的同類因素。在Remington的藥物科學(xué)中(最近的版本，Mack出版公司，Easton，PA)可以發(fā)現(xiàn)本領(lǐng)域熟知的合適的制劑。因此，通過這樣的考慮確定用于本文目的的“有效量”的KGF-2。
本發(fā)明的藥物組合物可以以一種方便的形式進(jìn)行施藥，如通過口服，直腸給藥，局部給藥，靜脈注射，腹膜內(nèi)注射，肌內(nèi)注射，皮下注射，關(guān)節(jié)內(nèi)施藥，鼻內(nèi)施藥，吸入，眼內(nèi)施藥，以及皮內(nèi)途徑施藥。腸胃外的和局部施藥是優(yōu)選的用藥途徑。如本文所使用的“腸胃外的”指包括靜脈注射，肌內(nèi)注射，腹膜內(nèi)注射，胸骨內(nèi)注射，皮下注射以及關(guān)節(jié)內(nèi)注射和灌輸?shù)挠盟幏绞健?br> 藥物組合物以一定量的、有效治療和/預(yù)防特定指征的方式施藥。在大多數(shù)情況下，考慮到用藥途徑，癥狀等，KGF-2劑量從每日約1μg/kg至約30mg/kg體重。然而，劑量可以低至0.001g/kg。例如，在特定的局部施藥的情況下，優(yōu)選施藥劑量從每平方厘米約0.01g至9mg。在鼻內(nèi)和眼內(nèi)用藥的情況下，優(yōu)選的用藥劑量從約0.001μg/kg至約10mg/ml，更優(yōu)選地從約0.05mg/ml至約4mg/ml。
作為一個(gè)一般性建議，腸胃外施用的KGF-2多肽總的藥物有效量的范圍在病人體重的1μg/kg/天至10mg/kg/天，雖然，如上面提到的，這將取決于療效而定。如果連續(xù)不斷地施藥，KGF-2多肽典型地以一個(gè)約1μg/kg/小時(shí)至約50μg/kg/小時(shí)的計(jì)量速率施藥，例如，使用一個(gè)微型泵，通過每天1-4次注射或者通過皮下灌輸。也可使用一種靜脈注射的袋裝溶液或瓶裝溶液。
如果連續(xù)施藥不長(zhǎng)于一定的最低天數(shù)，KGF-2多肽影響纖維蛋白系統(tǒng)的一個(gè)療程似乎是最佳的，對(duì)小鼠來說為7天。需要觀察治療后產(chǎn)生反應(yīng)的變化和間隔，治療的時(shí)間隨著需要的效果而定。
對(duì)于腸胃外施藥，在一實(shí)施方案中，一般通過把所需純度的KGF-多肽、以一個(gè)單位劑量的可注射形式(溶液，懸浮液，或乳化液)與一個(gè)藥物學(xué)上可接受的載體(即使用的劑量和濃度對(duì)受體為無毒的，并且與制劑中的其它成分具相容性的載體)相混合配制KGF-2多肽制劑。例如，制劑優(yōu)選地不包括氧化劑和其它已知對(duì)多肽有害的化合物。
一般地，通過把KGF-2多肽與液體載體或細(xì)小的分開的固體載體或兩者均一地和密切地相互接觸調(diào)制制劑。如果必要的話，產(chǎn)品可制成所需的制劑。優(yōu)選地，載體為腸胃外的一種載體，更優(yōu)選地為一種與受體血液等滲的溶液。這些載體工具的例子包括水，鹽水，林格溶液和葡萄糖溶液。非水溶性的載體工具如固定油，乙基油酸以及脂質(zhì)體也是有用的。在Remington的藥物科學(xué)中(最近的版本，Mack出版公司，Easton，PA)可以發(fā)現(xiàn)本領(lǐng)域熟知的合適的制劑。
KGF-2多肽也可以液體，滴劑，或增稠的液體，凝膠施用到眼中治療動(dòng)物和人體的淚腺損傷，失調(diào)和病變。
KGF-2多肽也可以液體滴劑或噴霧的形式通過在鼻內(nèi)施藥到鼻腔粘膜上治療動(dòng)物和人體的鼻腔粘膜和鼻竇上皮的失調(diào)，損傷和病變。
一般地，通過把KGF-2多肽與液體載體或細(xì)小的分開的固體載體或兩者均一地和密切地相互接觸調(diào)制制劑。如果必要的話，產(chǎn)品可制成所需的制劑。優(yōu)選地，載體為腸胃外的一種載體，更優(yōu)選地為一種與受體血液等滲的溶液。這些載體工具的例子包括水，鹽水，林格溶液和葡萄糖溶液。非水溶性的載體工具如固定油，乙基油酸以及脂質(zhì)體也是有用的。在Remington的藥物科學(xué)中(最近的版本，Mack出版公司，Easton，PA)可以發(fā)現(xiàn)本領(lǐng)域熟知的合適的制劑。
載體也可以包含少量的合適的添加劑，如提高等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性物質(zhì)。這樣的物質(zhì)所使用的劑量和濃度對(duì)受體是無毒的，包括緩沖液如磷酸，檸檬酸，琥珀酸，醋酸，以及其它的有機(jī)酸或者它們的鹽；抗氧劑如抗壞血酸；低分子量的多肽(不到10個(gè)殘基)，即多精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，明膠，或者免疫球蛋白；親水性的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或精氨酸；單糖，雙糖，和其它的碳水化合物，包括纖維素及其衍生物，葡萄糖，甘露糖，或者糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或者山梨醇；平衡離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如多山梨酸酯，poloxamers，或者PEG。
KGF-2典型地以這種載體制成的制劑在濃度約為0.01μg/ml至50mg/ml，優(yōu)選地為0.01μg/ml至10mg/ml，pH為約5至8，優(yōu)選地約6至約7，最優(yōu)選地約pH6.2。不言而喻的是使用某種前述的賦形劑，載體，或穩(wěn)定劑將導(dǎo)致KGF-2鹽的形成。
用于治療用藥的KGF-2可以是無菌的。通過無菌過濾膜(例如，0.2微米的膜)以過濾的方式容易完成無菌處理。治療的KGF-2組合物可置于一個(gè)具有無菌出口的容器中，例如，一個(gè)靜脈注射的溶液袋或通過皮下注射針頭可刺穿的塞子的藥水瓶。
KGF-2平常地保存于單位或多劑量的容器中，例如，密封的安瓿或藥瓶，作為一種水溶液或一個(gè)供重新恢復(fù)其水分的凍干制劑。作為一個(gè)凍干制劑的例子，3ml的藥水瓶注入1ml的過濾滅菌1％(w/v)的KGF-2水溶液，產(chǎn)生的混合物再冷凍干燥。通過利用注射用水(可選擇性包括一種或多種抗氧化劑)重構(gòu)凍干的KGF-2制備灌輸溶液。
用藥劑量也可以以患者特定的方式進(jìn)行安排，以便在血液中提供KGF-2活性的一種所預(yù)定的、例如，如同通過RIA技術(shù)所測(cè)定的濃度。因此，可以調(diào)整病人的用藥劑量以便達(dá)到有規(guī)律的、正在通過血液的濃度，如RIA所測(cè)定的、從50ng至1000ng/ml，優(yōu)選地為150至500ng/ml的濃度級(jí)別進(jìn)行劑量用藥。
KGF-2也可適當(dāng)?shù)亟柚诔掷m(xù)釋放系統(tǒng)用藥。持續(xù)釋放的組合物的合適的例子包括半滲透的已成型的物件形式的聚合物基質(zhì)，例如，薄膜，或微膠囊。持續(xù)釋放的基質(zhì)包括多聚乳酸(美國(guó)專利3,773,919，EP58,481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(U.Sidman等，生物聚合物22547-556(1983))，多聚(2-羥基乙基異丁烯酸)(R.Langer等.J.Biomed.Mater.Res.15167-277(1981)，R.Langer.Chem.Tech.1298-105(1982))，和乙烯乙烯基醋酸(R.Langer，出處同上)或多聚-D-羥基丁酸(EP133,988)。持久釋放的KGF-2組合物也包括脂質(zhì)體包載的KGF-2。包含KGF-2的脂質(zhì)體用本質(zhì)上已知的方法制備DE3,218,121；Epstein，等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)823688-3692(1985)；Hwang等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)774030-4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本專利申請(qǐng)83-118008；美國(guó)專利4,485,045和4,544,545；以及EP102,324。
一般地，脂質(zhì)體為小的(約200-800埃)單層脂質(zhì)體類型，其中脂的含量大于約30mol百分比的膽固醇，所選擇的比例調(diào)整為最理想的KGF-2療法。
本發(fā)明也提供了包含一個(gè)或多個(gè)裝有一種或多種本發(fā)明藥物組合物組分的容器的藥物包或試劑盒。與這些容器相關(guān)聯(lián)的是政府機(jī)構(gòu)以表格形式規(guī)定的布告，控制藥物或生物產(chǎn)品的制造，使用和銷售，該布告反應(yīng)生產(chǎn)機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，以及供人類施藥的用途和銷售。另外，本發(fā)明的多肽，拮抗劑和拮抗物可與其它治療化合物連同使用。
當(dāng)本發(fā)明者檢查按本發(fā)明制劑制備的KGF-2多肽的生物活性和穩(wěn)定性時(shí)，驚奇地發(fā)現(xiàn)單巰基甘油的使用可以穩(wěn)定KGF-2多肽，并且在創(chuàng)傷治愈中作為KGF-2多肽的一種增效劑。用于單巰基甘油增效的最適濃度范圍為0.1％至2％w/v。KGF-2多肽KGF-2刺激上皮細(xì)胞和表皮角質(zhì)細(xì)胞，但不是間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞的增生。這樣，“具有KGF-2蛋白樣活性的多肽”包括在下面和美國(guó)申請(qǐng)08/910,875陳述的在角質(zhì)細(xì)胞增生試驗(yàn)中表現(xiàn)KGF-2活性，并且能與FGF受體異構(gòu)體1-iiib和2-iiib結(jié)合的多肽。雖然活性程度不必與KGF-2蛋白質(zhì)的活性相同，優(yōu)選地，與KGF-2蛋白質(zhì)相比，“具有KGF-2蛋白樣活性的多肽”表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)上相似的活性(即，相對(duì)于參照KGF-2蛋白質(zhì)而言，候選多肽表現(xiàn)出更大的活性，或不超過十倍的活性，優(yōu)選地，不大于約兩倍的活性)。
本發(fā)明的制劑中使用的KGF-2多肽可以有，也可以沒有N-末端的甲硫氨酸，優(yōu)選地，多肽將缺乏N-末端的甲硫氨酸。
KGF-2 cDNA克隆于1994年十二月年十六日，以ATCC保藏號(hào)75977保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，專利保藏處(10801 University，Manassas，VA 20110-2209)。此外，插入到表達(dá)載體pHE4-5、編碼KGF-2Δ33的cDNA于1998年一月九日，以ATCC保藏號(hào)209575保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
當(dāng)涉及圖1的多肽(SEQ ID NO2)或保藏的cDNA編碼的多肽時(shí)，術(shù)語“片段”，“衍生物”和“類似物”是指本質(zhì)上保留與這種多肽一樣的生物學(xué)功能或活性的多肽。因此，類似物包括通過切割前蛋白部分以產(chǎn)生有活性的、成熟的多肽方式被激活的前蛋白。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或者合成多肽，優(yōu)選地為重組多肽。
圖1(SEQ ID NO2)的多肽片段，衍生物或者類似物，或者由保藏的cDNA所編碼的多肽可以是(i)一種多肽，在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選地為保守的氨基酸殘基)所替代，這種替代的氨基酸殘基可以是也不一定是遺傳密碼所編碼的，或(ii)一種多肽，在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括取代基，或(iii)一種多肽，在其中成熟的多肽與另一種混合物相融合，如一種增加多肽的半保留期的混合物(例如，聚乙二醇)，或(iv)一種多肽，在其中附加的氨基酸與成熟多肽相融合，如一個(gè)引導(dǎo)或分泌序列、或者一個(gè)用于純化成熟多肽的序列、或者一個(gè)前蛋白序列。這樣的片段，衍生物或者類似物被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的范圍之內(nèi)。
術(shù)語“肽”和“寡肽”被認(rèn)為是同意的(如同一般所公認(rèn)的)，每個(gè)術(shù)語可按上下文的需要相互交換使用，表示一條通過肽鍵偶聯(lián)的至少兩個(gè)氨基酸的鏈。本文的單詞“多肽”用于含有十個(gè)氨基酸以上的鏈。本文所有的寡肽或多肽公式或序列都以從左到右和由氨基端到羧基端的方向書寫。
本領(lǐng)域所公認(rèn)的是KGF-2多肽的某些氨基酸序列的變化對(duì)該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或者功能沒有顯著的影響。如果注視序列中的這些變化，應(yīng)該牢記的是在蛋白質(zhì)上將有決定其活性的關(guān)鍵區(qū)域。一般來說，如果使用執(zhí)行相似功能的殘基，取代形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基是可能的。在其它實(shí)例中，如果氨基酸殘基的改變發(fā)生在蛋白質(zhì)的非關(guān)鍵區(qū)域，這種殘基的類型可能是完全不重要的。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選地是一種分離的形式。分離的“多肽”是指從其天然環(huán)境中分離的多肽。因此，產(chǎn)生的多肽或包含于一個(gè)重組宿主細(xì)胞內(nèi)的多肽被認(rèn)為是為本發(fā)明的目的而分離的。部分地或?qū)嵸|(zhì)上從一個(gè)重組宿主細(xì)胞或一個(gè)天然來源中純化的多肽也是指這種含義。
本發(fā)明的藥物制劑包含SEQ ID NO2的KGF-2多肽(尤其是成熟多肽)及其缺失突變體，以及一些與SEQ ID NO2多肽具有至少90％，95％，96％，97％，98％，99％相似性(更優(yōu)選地至少90％，95％，96％，97％，98％，99％同源性)的多肽和它們的缺失突變體，還包括具有這樣的多肽部分它們一般地包含至少30個(gè)氨基酸和更優(yōu)選地至少50個(gè)氨基酸這樣的多肽部分(如下面描述的缺失突變體)。
如本領(lǐng)域所熟知的，通過把一種多肽的氨基酸序列和其保守的氨基酸取代序列與第二種多肽氨基酸序列相比較確定兩種多肽之間的“相似性”。
兩種多肽的“％相似性”是指使用Bestfit程序(威斯康星序列分析軟件包，Unix第8版本，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組，大學(xué)研究公園，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711)，通過比較兩種多肽的氨基酸序列和比較用于測(cè)定相似性的欠缺背景所產(chǎn)生的相似性分值。Bestfit程序利用Smith和Waterman的局部同源性算法(應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展2482-489，1981)尋找兩種序列之間的最佳同源片段。
例如，具有與KGF-2多肽的參照氨基酸序列至少95％“同源性”的氨基酸序列的一種多肽是指除多肽序列可以包括多達(dá)5個(gè)氨基酸的改變(KGF-2多肽參照氨基酸的每100個(gè)氨基酸)之外，多肽的氨基酸序列與參照序列是相同的。換句話說，為了獲得氨基酸序列與一個(gè)參照氨基酸序列具有至少95％的同源性的多肽，參照序列中的多達(dá)5％的氨基酸殘基可以被缺失或用另外的氨基酸取代，或者參照序列中多達(dá)5％的總氨基酸殘基數(shù)量的氨基酸可以插入到參照序列中。參照序列的這些改變可以發(fā)生在參照氨基酸序列的氨基端或羧基端位置上，或者介于這些末端位置的其它任何地方，要么單獨(dú)地散布于參照序列的殘基中或者分布在參照序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)相鄰基團(tuán)上。
作為一個(gè)實(shí)用的物質(zhì)，任何特定的多肽是否與圖1[SEQ ID NO2]中表示的氨基酸序列，或與保藏的cDNA克隆編碼的氨基酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％或者99％的同源性可用已知的計(jì)算機(jī)程序如Bestfit程序(威斯康星序列分析軟件包，Unix第8版本，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組，大學(xué)研究公園，575 Science Drive，Madison，WI 53711)進(jìn)行常規(guī)測(cè)定。當(dāng)使用Bestfit或者任何其它序列對(duì)比程序來確定一種特定的序列與根據(jù)本發(fā)明的參照序列是否具有同源性，例如95％的同源性時(shí)，當(dāng)然要設(shè)置參數(shù)，在參照氨基酸序列的整個(gè)長(zhǎng)度范圍上計(jì)算同源性的百分率，并允許參照序列中氨基酸殘基總數(shù)有多達(dá)5％的同源性缺口。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是天然存在的，重組產(chǎn)生的，或者使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)化學(xué)合成的(例如，參見Creighton，1983，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原則，W.H.Freeman和Co.，N.Y.，以及Hunkapiller.M.等，自然310105-111(1984))。例如，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的KGF-2多肽的一個(gè)片段的多肽可通過使用多肽合成儀合成。而且，如果需要的話，還可向KGF-2多肽序列中引入非傳統(tǒng)的氨基酸或化學(xué)氨基酸類似物作為取代或添加。非傳統(tǒng)的氨基酸包括，但不限于，普通氨基酸的D-型同分異構(gòu)體，2，4-二氨基丁酸，α-氨基異丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，γ-Abu，ε-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基異丁酸，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，磺基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，環(huán)己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟基-氨基酸，設(shè)計(jì)的氨基酸如β-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，一般的氨基酸類似物。而且，氨基酸可以是D(右旋的)或者L(左旋的)。
非天然存在的變異體可使用本領(lǐng)域已知的突變技術(shù)產(chǎn)生，這些突變技術(shù)包括，但不限于，寡核苷酸介導(dǎo)的突變，丙氨酸掃描，PCR突變，點(diǎn)指導(dǎo)的突變(參見，例如，Carter等，核酸研究134331(1986)；和Zoller等，核酸研究106487(1982))，盒式突變(參見，例如，Well等，基因34315(1985))，限制性選擇突變(參見，例如，Well等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317415(1986))。
另外，本發(fā)明包括在翻譯期間或之后差異修飾的KGF-2多肽，例如，通過糖基化，乙?；?，磷酸化，酰胺化，通過已知的保護(hù)/封阻基團(tuán)衍生化，蛋白質(zhì)的水解切割，與一個(gè)抗體分子或其它細(xì)胞配體形成鍵合，等等。通過已知的技術(shù)可以進(jìn)行任何的化學(xué)修飾，這些技術(shù)包括，但不限于，通過溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4的化學(xué)切割，乙酰化作用，甲基化作用，氧化作用，還原作用，以及在衣霉素存在時(shí)的代謝合成，等等。
本發(fā)明包括的附加的翻譯后修飾包括，例如N-連接的或O-連接的碳水化合物鏈，N-末端或C-末端的加工，化學(xué)部分與氨基酸主鍵的附著，以及由于原核宿主細(xì)胞表達(dá)而產(chǎn)生的N-末端甲硫氨酸殘基的添加或缺失。多肽也可用一個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記修飾，如酶的，熒光的，同位素的或親和標(biāo)記以便于蛋白質(zhì)的檢測(cè)和分離。
本發(fā)明還提供了化學(xué)修飾的KGF-2的衍生物，這些衍生物可提供一些另外的優(yōu)點(diǎn)，如增加的可溶性，穩(wěn)定性和多肽的循環(huán)時(shí)間，或者減少免疫原性(參見美國(guó)專利4,179,337)。供衍生化的化學(xué)部分可選自水溶性的聚合物，如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚合物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇等等。多肽可在分子內(nèi)的隨機(jī)位置或分子內(nèi)的預(yù)定位置修飾，并且一種，兩種，三種或多種連接的化學(xué)部分。
聚合物可以具有任何分子量，可以是分支的或不分支的。對(duì)聚乙二醇，優(yōu)選的的分子量在約1kDa和約100kDa之間(術(shù)語“約”指在聚乙二醇的制備物中，某些分子比規(guī)定的分子量將更重一些，某些分子比規(guī)定的分子量將更輕一些)以便于處理和制造。也可以使用其它分子量大小的聚乙二醇，取決于所需的治療外觀(例如所需的持續(xù)釋放的時(shí)間，影響效果，如果對(duì)生物活性有任何影響的話，處理的便利，抗原性的程度或者缺乏以及聚乙二醇對(duì)用于治療的蛋白質(zhì)或者類似物的其它已知的影響)。例如，聚乙二醇的平均分子量約為200，500，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10,000，10,500，11,000，11,500，12,000，12,500，13,000，13,500，14,000，14,500，15,000，15,500，16,000，16,500，17,000，17,500，18,000，18,500，19,000，19,500，20,000，25,000，30,000，35,000，40,000，50,000，55,000，60,000，65,000，70,000，75,000，80,000，85,000，90,000，95,000，或者100,000kDa。
如同上面所指出的，聚乙二醇可以有一個(gè)分支結(jié)構(gòu)。分支的聚乙二醇曾有過描述，例如，在美國(guó)專利5,643,575；Morpurgo等，應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù)5659-72(1996)；Vorobjev等，核酸182745-2750(1999)；以及Caliceti等，Bioconjug.Chem.10638-646(1999)，各自公開的內(nèi)容在此一并參考。
考慮到對(duì)蛋白質(zhì)的功能或抗原結(jié)構(gòu)域的影響，聚乙二醇分子(或其它的化學(xué)部分)應(yīng)該附著在蛋白質(zhì)上。有一些對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員于可供使用的附著方法，例如，EP 0401 384，本文一并參考(PEG偶聯(lián)到G-CSF上)，也參見Malik等，Exp.Hematol.201028-1035(1992)(利用tresyl氯化物報(bào)告GM-CSF的錨定作用)。聚乙二醇經(jīng)反應(yīng)基團(tuán)，如一個(gè)游離的氨基或羧基，通過氨基酸殘基可以共價(jià)地結(jié)合。反應(yīng)基團(tuán)是活化的聚乙二醇分子可以結(jié)合的那些基團(tuán)。具有一個(gè)游離的氨基基團(tuán)的氨基酸殘基包括賴氨酸殘基和N-末端的氨基酸殘基；具有一個(gè)游離的羧基基團(tuán)的氨基酸殘基包括天冬氨酸殘基，谷氨酸殘基和C-末端的氨基酸殘基。巰基基團(tuán)也可用作附著聚乙二醇分子的一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)。優(yōu)選地用于治療用途的是附著在氨基基團(tuán)上，如附著在N-末端上或賴氨酸基團(tuán)上。
如上面所建議的，聚乙二醇通過鍵合到任何一些氨基酸殘基上可附著在蛋白質(zhì)上。例如，聚乙二醇通過共價(jià)鍵結(jié)合到賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或半胱氨酸殘基上可連接到蛋白質(zhì)上?？墒褂靡环N或多種化學(xué)反應(yīng)把聚乙二醇附著在蛋白質(zhì)特定的氨基酸殘基上(例如，賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或半胱氨酸)或者附著到蛋白質(zhì)的不止一種類型的氨基酸殘基上(如，賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸和它們的組合體)。
人們可以期望尤其在N-末端被化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)。利用聚乙二醇作為本發(fā)明組合物的說明，人們可以從各種各樣聚乙二醇分子(按分子量，分支，等等)中，從反應(yīng)混合物中的聚乙二醇分子與蛋白質(zhì)(或多肽)的比例，從所使用的錨定反應(yīng)的類型，以及從獲得選擇的N-末端被錨定的蛋白質(zhì)的方法中選擇。獲得N-末端被錨定的制劑(即，如果必要的話，從其它單錨定的部分中分離該部分)的方法可通過從錨定的蛋白質(zhì)分子群體中提純N-末端錨定的物質(zhì)。通過還原烷基化作用可獲得在N-末端修飾位置上的經(jīng)化學(xué)修飾的選擇性蛋白質(zhì)，該還原烷基化作用利用在一特定的蛋白質(zhì)中不同類型的可供衍生化的一級(jí)氨基酸基團(tuán)(賴氨酸對(duì)N-末端)的差別反應(yīng)性。在合適的反應(yīng)條件下，在蛋白質(zhì)的N-末端用一個(gè)含羧基的聚合物可完成實(shí)質(zhì)上選擇性的衍生化。
如同上面所表明的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的錨定可通過任何一些方式完成。例如，聚乙二醇可直接地或通過一個(gè)介入的接頭附著在蛋白質(zhì)上。對(duì)聚乙二醇附著在蛋白質(zhì)上的無接頭系統(tǒng)在以下參考文獻(xiàn)中有過描述Delgado等，Crit.V.Thera.Drug Carrier Sys.9249-304(1992)；Francis等，國(guó)際血液學(xué)雜志.681-18(1998)；美國(guó)專利4,002,531；美國(guó)專利5,349,052；WO 95/06058；和WO 98/32466，每篇文獻(xiàn)的公開的內(nèi)容在此一并參考。
無須介入的接頭把聚乙二醇直接地附著在蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的一個(gè)系統(tǒng)使用三氟乙磺酸化(tresylated)MPEG(使用三氟乙磺酰氯(ClSO2CH2CF3)，通過單甲氧基聚乙二醇(MPEG)的修飾而產(chǎn)生的)。蛋白質(zhì)與三氟乙磺酸化MPEG反應(yīng)，聚乙二醇直接地附著在蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的胺基團(tuán)上。因此，本發(fā)明包括通過本發(fā)明的蛋白質(zhì)與具有2，2，2-三氟乙磺酰基團(tuán)的一個(gè)聚乙二醇反應(yīng)而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)-聚乙二醇綴合物。
用一些不同的介入接頭，聚乙二醇也可附著在蛋白質(zhì)上。例如，美國(guó)專利5,612,460，其整個(gè)說明書本文一并參考，公開了用于連接聚乙二醇和蛋白質(zhì)的氨基甲酸乙酯接頭。蛋白質(zhì)-聚乙二醇綴合物(其中聚乙二醇通過一個(gè)接頭附著在蛋白質(zhì)上)也可以通過蛋白質(zhì)與化合物(如MEPG-琥珀酸琥珀酰亞氨基酯，用1，1’羰基二咪唑活化的MPEG，MPEG-2，4，5-三氯penyl碳酸鹽，MPEG-p-氮苯基碳酸鹽，和各種各樣的MPEG-琥珀酸酯衍生物)反應(yīng)產(chǎn)生。一些另外的聚乙二醇衍生物和把聚乙二醇附著在蛋白質(zhì)上的反應(yīng)化學(xué)在WO 98/32466中描述過，其整個(gè)說明書本文一并參考。用本文陳述的反應(yīng)化學(xué)所產(chǎn)生的錨定的蛋白質(zhì)產(chǎn)物包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
附著在本發(fā)明的每種蛋白質(zhì)上的聚乙二醇部分的數(shù)量(即，取代的程度)也是可以變化的。例如，本發(fā)明的錨定蛋白質(zhì)可連接到平均1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20，或更多的聚乙二醇分子上。類似地，在這些范圍內(nèi)如每個(gè)蛋白分子上有1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19，或18-20聚乙二醇部分的平均取代程度。測(cè)定取代程度的方法，例如在Delgado等，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sye.9249-304(1992)中有過描述。KGF-2缺失突變體天然的KGF-2在含水的狀態(tài)下是相對(duì)不穩(wěn)定的，并且在加工和保存期間經(jīng)歷化學(xué)和物理降解，導(dǎo)致生物活性的喪失。天然的KGF-2在含水的溶液中在溫度提高時(shí)也傾向于聚集，并且在酸性條件下被滅活。
特別優(yōu)選的KGF-2多肽是如下所顯示的缺失突變體(數(shù)字起始于蛋白質(zhì)的第一個(gè)氨基酸(Met)Thr(殘基36)--Ser(殘基208) Gly(41)--Ser(208)Cys(37)--Ser(208) GIn(42)--Ser(208)Gln(38)--Ser(208) Asp(43)--Ser(208)Ala(39)--Ser(208) Met(44)--Ser(208)Leu(40)--Ser(208) Val(45)--Ser(208)Ser(46)--Ser(208)Pro(47)--Ser(208)Glu(48)--Ser(208)Ala(49)--(Ser208)Thr(50)--Ser(208)Asn(51)--Ser(208)Ser(52)--Ser(208)Ser(53)--Ser(208)Ser(54)--Ser(208)Ser(55)--Ser(208)Ser(56)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--His(200)Phe(57)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Ala(199)Ser(59)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Ser(198)Ser(62)--Ser(208)Met(I)，Thr(36)，或Cys(37)--Thr(197)Ala(63)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Asn(196)Gly(64)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Lys(195)Arg(65)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(194)Val(67)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(193)Ser(69)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Thr(192)Val(77)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Lys(191)Arg(80)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(188)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--His(207)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(187)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Val(206)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Lys(183)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Val(205)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Met(204)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Pro(203)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Leu(202)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Phe(201)優(yōu)選的實(shí)施方案包括N-末端缺失Ala(63)--Ser(208)(KGF-2Δ28)和Ser(69)--Ser(208)(KGF-2Δ33)。其它優(yōu)選的的N-末端與C-末端缺失突變體包括Ala(39)--Ser(208)；Pro(47)--Ser(208)；Val(77)--Ser(208)；Glu(93)--Ser(208)；Glu(104)--Ser(208)；Val(123)--Ser(208)；和Gly(138)--Ser(208)。其它優(yōu)選的C-末端缺失突變體包括Met(1)，Thr(36)，或者Cys(37)--Lys(153)。
本發(fā)明還包括從N-末端和C-末端兩者都缺失的氨基酸的缺失突變體。這樣的突變體包括所有以上描述的N-末端缺失突變體與C-末端缺失突變體的組合，例如，Ala(39)--His(200)，Met(44)--Arg(193)，Ala(63)--Lys(153)，Ser(69)--Lys(153)，等等。利用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的重組技術(shù)可以產(chǎn)生這些組合。
因此，供本發(fā)明的藥物制劑使用的優(yōu)選KGF多肽包括N-末端缺失突變體，包括那些含有圖1(Seq ID NO2)中顯示的氨基酸序列，但除了至少第一個(gè)38個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失之外(即，圖1(Seq ID NO2)中的至少M(fèi)et(1)-Gln(38)但不超過其第一個(gè)147個(gè)N-末端的氨基酸殘基的缺失)?；蛘?，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)38個(gè)N-末端氨基酸殘基(即至少M(fèi)et(1)-Gln(38)的缺失)但不超過其第一個(gè)147個(gè)N-末端的氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)46個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)137個(gè)N-末端的氨基酸殘基)的突變體?；蛘?，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)62個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)137個(gè)N-末端的氨基酸殘基)的突變體?；蛘?，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq IDNO2)中的至少第一個(gè)68個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)137個(gè)N-末端的氨基酸殘基)的突變體?；蛘?，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)76個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)137個(gè)N-末端的氨基酸殘基)的突變體?；蛘?，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)92個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)137個(gè)N-末端的氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含具有一種缺失(該缺失將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)103個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)137個(gè)N-末端的氨基酸殘基)的突變體?；蛘撸撝苿┌哂幸环N缺失(該缺失將包括圖1(Seq IDNO2)中的至少第一個(gè)122個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)137個(gè)N-末端的氨基酸殘基)的突變體。
除含有以上描述的N-末端缺失突變體范圍的KGF-2突變體的制劑之外，本發(fā)明還針對(duì)具有所有上述描述范圍的制劑，即圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)62個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)68個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)62個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)76個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)62個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)92個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)62個(gè)氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)103個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)68個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)76個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)68個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)92個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)68個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)103個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)46個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)62個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)46個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)68個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)46個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過其第一個(gè)76個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失；等等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含C-末端缺失突變體的制劑。優(yōu)選地，所說的C-末端缺失突變體的N-末端氨基酸殘基是圖1(Seq ID NO2)中的第1個(gè)氨基酸殘基(Met)，第36個(gè)氨基酸殘基(Thr)，或者第37個(gè)氨基酸殘基(Cys)。除了不包含至少最后的C-末端氨基酸殘基(Ser(208)但不超過最后的55個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失(即圖1(Seq ID NO2)中的氨基酸殘基Glu(154)-Ser(208)的缺失)之外，包含突變體的這些制劑包含那些包含圖1(Seq ID NO2)中所顯示的氨基酸序列?；蛘撸撝苿┌环N具有突變(該突變將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸殘基但不超過最后的65個(gè)C-末端氨基酸殘基)的突變體?；蛘?，該制劑包含一種具有突變(該突變將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少最后10個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個(gè)C-末端氨基酸殘基)的突變體?；蛘撸撝苿┌环N具有突變(該突變將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少最后30個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個(gè)C-末端氨基酸殘基)的突變體。或者，該制劑包含一種具有突變(該突變將包括圖1(Seq ID NO2)中的至少最后40個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個(gè)C-末端氨基酸殘基)的突變體?；蛘?，該制劑包含一種具有突變(該突變將包括圖1(Seq IDNO2)中的至少最后50個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個(gè)C-末端氨基酸殘基)的突變體。
除包含以上描述的C-末端缺失突變體范圍的KGF-2突變體的制劑，本發(fā)明還針對(duì)具有所有上述描述范圍的制劑，即圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的10個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的20個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的30個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的40個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq IDNO2)中的至少最后的10個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的20個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的10個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的30個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的10個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的40個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的20個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失，但不超過其最后的30個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失；等等。
在另一實(shí)施方案中，KGF-2多肽可以是一個(gè)具有從N-末端和C-末端兩者都缺失的氨基酸的缺失突變體。這樣的突變體包括所有以上描述的N-末端缺失突變體與C-末端缺失突變體的組合。除圖1(Seq ID NO2)中的至少第一個(gè)46個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過第一個(gè)137個(gè)N-末端氨基酸殘基的缺失和至少最后的C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失之外，這種突變體包括那些含有圖1(Seq ID NO2)中表示的氨基酸序列。或者，一種缺失可包括圖1(Seq ID NO2)中的第一個(gè)62個(gè)，68個(gè)，76個(gè)，92個(gè)，103個(gè)或122個(gè)N-末端氨基酸殘基但不超過第一個(gè)137個(gè)N-末端氨基酸殘基以及圖1(Seq ID NO2)中的至少最后的10個(gè)，20個(gè)，30個(gè)，40個(gè)或50個(gè)C-末端氨基酸殘基但不超過最后的55個(gè)C-末端氨基酸殘基的缺失。還包括所有上述所描述的范圍的組合。KGF-2取代突變體有用的KGF-2多肽包括那些具有氨基酸取代的多肽。天然的成熟KGF-2包含44個(gè)帶電殘基，其中32個(gè)帶有正電荷。取決于這些殘基在蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)中的位置，用帶負(fù)電荷或中性電荷的氨基酸取代一個(gè)或多個(gè)這些成簇的殘基可以改變相鄰氨基酸的靜電相互作用，并且對(duì)增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和減少其凝聚作用可能是有用的。蛋白質(zhì)的凝聚作用不僅僅導(dǎo)致其活性的喪失，當(dāng)配制藥物制劑時(shí)也成問題，因?yàn)樗鼈兛梢跃哂忻庖咴?Pinckard等，Clin.Exp.ImmuNOl.2331-340(1967)，Robbins等，糖尿病36838-845(1987)，Cleland等，Grit.Rev.Therapeutic DrugCarrier System 10307-377(1993))。任何修飾應(yīng)該考慮到在蛋白質(zhì)分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)中最大限度地減少電荷排斥。因此，具有特別興趣的是用另一種電荷和用中性的或帶負(fù)電荷的氨基酸取代帶電的氨基酸。后者(指用中性的或帶負(fù)電荷的氨基酸取代)導(dǎo)致具有減少的正電荷的蛋白質(zhì)，以改進(jìn)KGF-2的特性。與天然多肽相比，這種改進(jìn)包括增加類似物的穩(wěn)定性和減少其凝聚作用。
氨基酸的取代也可改變結(jié)合到細(xì)胞表面受體的選擇性。Ostade等，自然361266-268(1993)描述了某種TNFα突變導(dǎo)致TNFα選擇性地只結(jié)合于其中一種兩種已知的TNF受體。
KGF-2分子可以包含一種或多種來源于自然突變或人類操縱的氨基酸取代，缺失或添加。某些優(yōu)選的突變例子是Ala(49)Gln，Asn(51)Ala，Ser(54)Val，Ala(63)Pro，Gly(64)Glu，Val(67)Thr，Trp(79)Val，Arg(80)Lys，Lys(87)Arg，Tyr(88)Trp，Phe(89)Tyr，Lys(91)Arg，Ser(99)Lys，Lys(102)Gln，Lys103(Glu)，Glu(104)Met，Asn(105)Lys，Pro(107)Asn，Ser(109)Asn，Leu(111)Met，Thr(114)Arg，Glu(117)Ala，Val(120)Ile，Val(123)Ile，Ala(125)Gly，Ile(126)Val，Asn(127)Glu，Asn(127)GIn，Tyr(130)Phe，Met(134)Thr，Lys(136)Glu，Lys(137)Glu，Gly(142)Ala，Ser(143)Lys，Phe(146)Ser，Asn(148)Glu，Lys(151)Asn，Leu(152)Phe，Glu(154)Gly，Glu(154)Asp，Arg(155)Leu，Glu(157)Leu，Gly(160)His，Phe(167)Ala，Asn(168)Lys，GIn(170)Thr，Arg(174)Gly，Tyr(177)Phe，Gly(182)Gln，Ala(185)Val，Ala(185)Leu，Ala(185)Ile，Arg(187)GIn(190)Lys，Lys(195)Glu，Thr(197)Lys，Ser(198)Thr，Arg(194)Glu，Arg(194)Gln，Lys(191)Glu，Lys(191)Gln，Arg(188)Glu，Arg(188)Gln，Lys(183)Glu。
例如，通過設(shè)計(jì)，Ala(49)Gln是指圖1(Seq ID NO2)中的第49個(gè)位置的Ala被Gln所取代。
這些變化的氨基酸優(yōu)選地具有次要的性質(zhì)，如不顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊或者活性的保守氨基酸取代。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的保守氨基酸取代的例子陳述如下芳香族的 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸疏水性的 亮氨酸異亮氨酸纈氨酸極性的谷氨酰胺天冬酰胺堿性的精氨酸賴氨酸組氨酸酸性的谷氨酸天冬氨酸較小的丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸甘氨酸當(dāng)然，技術(shù)人員想取代的氨基酸的數(shù)量依賴于許多因素，包括以上描述的那些因素。一般地說，對(duì)任何給定的KGF-2多肽的取代的氨基酸數(shù)量將不超過50，40，30，20，10，5，或者3個(gè)(取決于特定的目的)。例如，在KGF-2的C-末端可作一些取代以改進(jìn)穩(wěn)定性。
通過本領(lǐng)域熟知的方法，可以鑒定KGF-2中對(duì)功能必需的氨基酸，如定點(diǎn)突變或丙氨酸掃描突變(Cunningham和Well，科學(xué)2441081-1085(1989))。后一種方法的步驟在氨基酸分子的每個(gè)殘基引入單個(gè)丙氨酸突變。然后對(duì)產(chǎn)生的突變體分子測(cè)定其生物學(xué)活性，如受體結(jié)合或活體外或活體內(nèi)的增生活性(參見，例如，實(shí)施例1)。也可通過結(jié)構(gòu)分析如晶體化，核磁共振或光親和標(biāo)記測(cè)定配體-受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。(例如，參見Smith等。分子生物學(xué)雜志224899-904(1992)；和de Vos等。科學(xué)255306-312(1992))。
其它有用的KGF多肽包括在氨基酸位置37，106和150以絲氨酸取代半胱氨酸的多肽。不均衡數(shù)量的半胱氨酸意味著至少一個(gè)半胱氨酸殘基可用于使蛋白質(zhì)呈現(xiàn)不需要的三級(jí)結(jié)構(gòu)的分子間的交互連接或形成鍵合。一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸被絲氨酸或丙氨酸取代的新型的KGF-蛋白一般地能以較高產(chǎn)量的可溶性的、正確折疊的蛋白質(zhì)形式提純。雖然不希望束縛于理論，人們相信第106個(gè)位置上的半胱氨酸殘基對(duì)功能是重要的。該半胱氨酸殘基在所有其它的FGF家族成員中都是高度保守的。
另外的KGF-2多肽在以下專利申請(qǐng)中都有過描述PCT/US95/01790，于1995年2月14日申請(qǐng)，美國(guó)專利申請(qǐng)08/461,195，于1995年6月5日申請(qǐng)，08/696,135，于1996年8月13日申請(qǐng)，60/023,852，于1996年8月13日申請(qǐng)，60/039,045，于1997年2月28日申請(qǐng)，08/862,432，于1997年5月23日申請(qǐng)，60/055,561，于1997年8月13日申請(qǐng)，08/910,875，于1997年8月13日申請(qǐng)，09/023,082，于1998年2月13日申請(qǐng)，09/345,373，于1999年7月1日申請(qǐng)，60/142,343，于1999年7月2日申請(qǐng)，60/143,648，于1999年7月14日申請(qǐng)，60/144,024，于1999年7月15日申請(qǐng)，60/148,628，于1999年8月12日申請(qǐng)，60/149,935，于1999年9月24日申請(qǐng)，60/163,375，于1999年11月3日申請(qǐng)，60/171,677，于1999年12月22日申請(qǐng)，和60/198,322，于2000年4月19日申請(qǐng)，所有公開內(nèi)容本文一并參考。KGF-2多肽組合物的治療用途本發(fā)明的多肽可以刺激角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)散。因此，本發(fā)明的組合物可用于刺激上皮細(xì)胞增生和用于創(chuàng)傷治愈為目的的基部角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，并且刺激毛囊產(chǎn)生，和治愈皮膚創(chuàng)傷。這些創(chuàng)傷可以具有表面的性質(zhì)或者是很深的創(chuàng)傷，并且包括皮膚的真皮和表皮損害。
KGF-2對(duì)治療一些疾病是有用的。例如，KGF-2在體外和體內(nèi)的各種的創(chuàng)傷治愈模型中是有活性的。參見，美國(guó)專利申請(qǐng)08/910,875，申請(qǐng)于1997年8月813日和09/023,082，申請(qǐng)于1998年2月13日。
被KGF-2施藥的個(gè)體以一種正常的速率可以治愈創(chuàng)傷，或者其治愈被削弱。當(dāng)施藥給其治愈不被削弱的個(gè)體時(shí)，施用KGF-2加速正常的治愈過程。當(dāng)施藥給其治愈被削弱的個(gè)體時(shí)，施用KGF-2有利于以其它方式慢慢地治愈或者根本不能治愈的創(chuàng)傷的治愈。一些疾病和癥狀可以導(dǎo)致治愈被削弱。這些疾病和癥狀包括糖尿病(例如，II型糖尿病)，用類固醇和非類固醇藥物因子的治療，局部缺血障礙或傷害。
一些生長(zhǎng)因子顯示了在治愈削弱的個(gè)體中可促進(jìn)創(chuàng)傷治愈。這些生長(zhǎng)因子包括生長(zhǎng)激素釋放因子，血小板來源的生長(zhǎng)因子，和基本的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。因此，本發(fā)明還包括與一種或多種生長(zhǎng)因子或其它的促進(jìn)創(chuàng)傷治愈的因子連同施用的KGF-2組合物。
本發(fā)明的組合物也促進(jìn)在個(gè)體中由外科手術(shù)過程造成的吻合和其它傷口(兩種傷口都以正常速率愈合創(chuàng)傷，并且治愈也受削弱)的治愈。
也可以使用本發(fā)明的組合物刺激細(xì)胞，例如，肌肉細(xì)胞，構(gòu)成神經(jīng)組織的細(xì)胞，前列腺細(xì)胞和肺部細(xì)胞的分化。
本發(fā)明的組合物在臨床上對(duì)刺激創(chuàng)傷的傷口治愈是有用的，這些創(chuàng)傷包括外科傷口，切除傷口，牽涉損害真皮和表皮的深度創(chuàng)傷，眼組織創(chuàng)傷，牙組織創(chuàng)傷，口腔創(chuàng)傷，糖尿病引起的潰瘍，真皮潰瘍，肘潰瘍，動(dòng)脈潰瘍，靜脈郁積潰瘍，在正常的個(gè)體和那些誘導(dǎo)反常的創(chuàng)傷治愈狀況(如尿毒癥，營(yíng)養(yǎng)不良，維生素缺乏癥，肥胖癥，感染，免役抑制和與用類固醇、輻射治療和用抗腫瘤藥物以及抗代謝物治療相關(guān)的并發(fā)癥)的個(gè)體暴露于熱或冷的極端溫度、或暴露于化學(xué)藥品引起的灼傷。組合物對(duì)促進(jìn)與局部缺血和局部缺血傷害(例如，通過靜脈循環(huán)系統(tǒng)返回和/或不足的削弱所造成的慢性靜脈腿潰瘍)相關(guān)聯(lián)的創(chuàng)傷治愈；對(duì)皮層損失之后的皮層重建；對(duì)增加表皮的抗拉強(qiáng)度和表皮厚度；對(duì)增加皮膚移植到傷口層的粘附和刺激傷口層的上皮重新形成都是有用的。
KGF-2多肽的其它治療用途包括，但不限于，例如，刺激上皮細(xì)胞增生和基部的角質(zhì)細(xì)胞，其目的在于治療灼傷和皮膚缺陷如牛皮癬和表皮水皰癥。KGF-2也可用來減少由于輻射，化療治療或者病毒感染引起的消化道毒性的副作用。KGF-2可以用來治療肝臟，肺臟，腎，胸部，胰腺，胃部，小腸，以及大腸的疾病和癥狀。KGF-2可用來治療腸炎疾病，糖尿病，血小板減少，血纖維蛋白原過少，血清蛋白減少，球蛋白過少，出血膀胱炎，口腔干燥，角膜結(jié)膜炎干燥。KGF-2可以用來刺激唾腺，淚腺的上皮細(xì)胞，刺激鼻竇的上皮再形成和鼻部粘膜的生長(zhǎng)。
一些其它的可通過本發(fā)明的組合物治療的疾病癥兆在美國(guó)專利申請(qǐng)08/910,875，和09/023,082中有過描述，本文一并參考。
本發(fā)明涉及KGF-2的新型液體和凍干制劑以及它們的缺失突變體。本發(fā)明還涉及治療用途的KGF-2制劑。該制劑給有活性的KGF-2多肽提供優(yōu)越的穩(wěn)定性，在一些實(shí)例中，加強(qiáng)和顯著地增加該多肽的創(chuàng)傷治愈活性。
如本文所使用的，“個(gè)體”是指動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物(如類人猿，奶牛，馬，豬，公野豬，綿羊，嚙齒動(dòng)物，山羊，狗，貓，小雞，猴子，野兔，雪貂，鯨魚，以及海豚)，更優(yōu)選地為人類。
本發(fā)明的制劑中所使用的KGF-2Δ33多肽可以有也可以不必有N-末端甲硫氨酸，優(yōu)選地多肽將缺乏N-末端甲硫氨酸。本發(fā)明的KGF-2多肽制劑的穩(wěn)定性可由以下描述的增生試驗(yàn)測(cè)定。
KGF-2其它的治療用途在美國(guó)專利申請(qǐng)60/074,585(申請(qǐng)于1998年2月13日)，60/114,484(申請(qǐng)于1998年12月30日)，以及09/248,998(申請(qǐng)于1999年2月12日)中都有過描述，所有的專利申請(qǐng)說明書本文一并參考。角質(zhì)細(xì)胞增生試驗(yàn)皮膚角質(zhì)細(xì)胞是皮膚表皮中的細(xì)胞。在創(chuàng)傷治愈中，皮膚中角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散是一個(gè)重要過程。因此，角質(zhì)細(xì)胞的增生實(shí)驗(yàn)在刺激角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和創(chuàng)傷治愈中是蛋白質(zhì)活性的一個(gè)有價(jià)值的指示物。
然而，角質(zhì)細(xì)胞難于在體外生長(zhǎng)。極少的角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系可以存活。這些細(xì)胞系具有不同的細(xì)胞和遺傳缺陷。為了避免由于這種細(xì)胞缺陷(如主要的生長(zhǎng)因子的喪失和主要的生長(zhǎng)因子對(duì)生長(zhǎng)的依賴性)造成的該試驗(yàn)的復(fù)雜性，選擇原初皮膚角質(zhì)細(xì)胞用于該試驗(yàn)。這些皮膚角質(zhì)細(xì)胞是從Clonetics公司(San Diego，CA)獲得的。
KGF-2多肽的生物活性是使用經(jīng)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2iiib受體(FGFR2iiib)轉(zhuǎn)染的鼠的Baf3 2b細(xì)胞通過細(xì)胞增生試驗(yàn)測(cè)定的。在細(xì)胞暴露于以下描述的蛋白質(zhì)之后，通過滲入[甲基-3H]-胸苷測(cè)定這些細(xì)胞的增生。該試驗(yàn)在96孔組織培養(yǎng)平板中進(jìn)行的，每個(gè)孔中用約22,000個(gè)Baf32b細(xì)胞。這些細(xì)胞暴露于不同濃度的KGF-2多肽中，設(shè)三個(gè)重復(fù)，于37℃下在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約48小時(shí)。然后向每個(gè)孔中加入近似量的含標(biāo)記的胸苷的細(xì)胞培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。然后用細(xì)胞收獲器，在一個(gè)96孔格式的玻璃纖維過濾墊上收獲細(xì)胞。干燥過濾墊，用平底的液體閃爍器記數(shù)滲入到每種樣品的放射活性。在這些測(cè)定條件下，與用適當(dāng)稀釋的空白對(duì)照緩沖液或簡(jiǎn)單地用磷酸鹽緩沖液處理的細(xì)胞相比，暴露于KGF-2的細(xì)胞表現(xiàn)出增加的放射活性滲入。
另一個(gè)有用的角質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)散試驗(yàn)是用Alamar藍(lán)。當(dāng)加入到培養(yǎng)基中時(shí)，Alamar藍(lán)是一種通過線粒體代謝能存活的藍(lán)色染色。該染料在組織培養(yǎng)的上清液中變?yōu)榧t色。紅色染料的量可直接地通過介于570nm至600nm之間的光密度的讀數(shù)差異定量測(cè)定。該讀書反應(yīng)細(xì)胞活性和細(xì)胞數(shù)量。
正常的皮膚角質(zhì)細(xì)胞(CC-0255，NHEK-新的混合)是從Clonetics公司(San Diego，CA)購(gòu)買的。這些細(xì)胞是第2代。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)于完全的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(CC-3001，KGM；Clonetics公司)，直到它們達(dá)到80％的融合性。這些細(xì)胞根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行胰蛋白酶消化。簡(jiǎn)單地，細(xì)胞用Hank的平衡鹽溶液洗滌兩次。加入胰蛋白酶中和溶液。細(xì)胞在室溫下以600xg離心5分鐘，再用預(yù)熱的培養(yǎng)基以每平方厘米3000個(gè)細(xì)胞涂板于一個(gè)新的燒瓶中。對(duì)于增生試驗(yàn)，用完全培養(yǎng)基在Corning平底96孔平板中的每個(gè)孔中涂板1000至2000個(gè)角質(zhì)細(xì)胞，最外面一排除外。這有助于使孔的溫度和濕度波動(dòng)保持到最低。用5％的CO2在37℃下過夜培養(yǎng)細(xì)胞。用角質(zhì)細(xì)胞基本培養(yǎng)基(CC-3101，KBM，Clonetics公司)洗滌細(xì)胞兩次，并向每個(gè)孔中加入100μl的KBM。溫育24小時(shí)。用KBM以系列緩沖液稀釋生長(zhǎng)因子，并向每個(gè)孔中加入100μl。用KGM作為正對(duì)照，KBM作為負(fù)對(duì)照。每個(gè)濃度點(diǎn)使用6個(gè)孔。培養(yǎng)2至3天。在培養(yǎng)的最后，用KBM洗滌細(xì)胞一次，與10％的v/v的預(yù)先混合于培養(yǎng)基中的Alamar藍(lán)一起加入100μl的KBM。培養(yǎng)6至16小時(shí)，直到KGM陽性對(duì)照中的培養(yǎng)基顏色開始變?yōu)榧t色為止。通過直接地把平板置于平板讀數(shù)計(jì)中測(cè)定570nm的光密度減去600nm的光密度。KGF-2缺失突變體的構(gòu)建通過下列流程構(gòu)建用于本發(fā)明組合物的有用的缺失突變體。
利用一優(yōu)化的KGF-2構(gòu)建體為模板，從KGF-2基因的5’端和3’端構(gòu)建缺失突變體。缺失是根據(jù)可能消極地影響在大腸桿菌中的表達(dá)的基因區(qū)選擇的。對(duì)5’端的缺失，使用下面列出的引物作為5’端引物。這些引物含有指定的限制位點(diǎn)和編碼起始甲硫氨酸的ATG。KGF-2(FGF-12)208氨基酸的3’HindIII引物用作3’引物。用標(biāo)準(zhǔn)的條件完成25輪PCR擴(kuò)增。KGF-236aa/208aa的缺失突變體產(chǎn)物進(jìn)行5’端位置的BspHI消化和3’端位置的HindIII消化，并克隆至用BspHI和HindIII消化的pQE60中。所有其它產(chǎn)物用NcoI作5’端的限制酶消化和用HindIII作3’端的限制酶消化，并克隆至用NcoI和HindIII消化的pQE60中。對(duì)KGF-2(FGF-12)，36aa/153aa與128aa3’端的HindIII用作3’端引物，F(xiàn)GF-12 36aa/208aa用作5’端引物。對(duì)于FGF-12 62aa/153aa，128aa3’端的HindIII用作3’端引物，F(xiàn)GF-1262aa/208aa用作5’端引物。產(chǎn)生的這些克隆的命名是指由缺失產(chǎn)生的多肽的第一個(gè)和最后一個(gè)氨基酸。例如，KGF-2 36aa/153aa是指缺失突變體的第一個(gè)氨基酸為KGF-2的第36個(gè)氨基酸，最后一個(gè)氨基酸為KGF-2的第153個(gè)氨基酸。這些KGF-2缺失突變體的構(gòu)建在美國(guó)專利申請(qǐng)08/910,875，和09/023,082，中有過描述，本文一并參考。此外，如以下所指出的，每個(gè)突變體都向其N-末端加入了甲硫氨酸。然而，根據(jù)本發(fā)明在制劑所使用的KGF-2缺失多肽可以具有或者也不必有N-末端的甲硫氨酸，優(yōu)選地多肽將缺乏N-末端的甲硫氨酸。缺失引物序列FGF12 36aa/208aa5’Bsphl GGACCCTCATGACCTGCCAGGCTCTGGGTCAGGAC(SEQ ID NO3)FGF12 63aa/208aa5’NcoI GGACAGCCATGGCTGGTCGTCACGTTCG(SEQ ID NO4)FGF12 77aa1208aa5’NcoI GGACAGCCATGGTTCGTTGGCGTAAACTG(SEQ ID NO5)FGF12 93aa/208aa5’NcoI GGACAGCCATGGAAAAAAACGGTAAAGTTTC(SEQ ID NO6)FGF12 TO4aa/208aa5’NcoI GGACCCCCATGGAGAACTGCCCGTAGAGC(SEQ ID NO7)FGF12 123aa/208aa5’NcoI GGACCCCCATGGTCAAAGCCATTAACAGCAAC(SEQ ID NO8)FGF12 138aa/208aa5’NcoI GGACCCCCATGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAG(SEQ ID NO9)FGF12 3’HindIII(用于所有以上的缺失克隆)CTGCCCAAGCTfl7ATTATGAGTGTACCACCATfGGAAG(SEQ ID NO10)FGF12 36aa/153aa
5’Bsphl(同上)3’HindIIICTGCCCAAGCTTATTACTFUCAGCTTACAGTCATTGT(SEQ ID NO11)FGF12 63aa/153aa5’NcoI和3’HindIII，同上N-末端缺失突變體KGF-2Δ33的構(gòu)建在pQE6中構(gòu)建KGF-2Δ33為了使得可以進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)指導(dǎo)的擴(kuò)增和KGF-2Δ33亞克隆至大腸桿菌蛋白表達(dá)載體pQE6中，用下列堿基序列合成對(duì)應(yīng)于所需的KGF2區(qū)域的兩個(gè)寡引物(5952和19138)。引物59525’GCGGCACATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTG 3’(SEQ ID NO12)引物191385’GGGCCCAAGCTTATGAGTGTACCACCAT 3’(SEQ ID NO13)對(duì)N-末端引物(5952)，引入一個(gè)AflIII限制性位點(diǎn)，而對(duì)C-末端引物(19138)，引入一個(gè)HindIII限制性位點(diǎn)。引物5952在KGF2編碼區(qū)附近和框架內(nèi)也包含一個(gè)ATG序列，使克隆片段在大腸桿菌內(nèi)翻譯，而引物19138在KGF2編碼區(qū)附近和框架內(nèi)包含保證在大腸桿菌內(nèi)正確翻譯終止的兩個(gè)終止密碼子(優(yōu)選地在大腸桿菌中使用)。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件和成熟的KGF-2(aa36-208)的核苷酸引物作為模板完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。產(chǎn)生的擴(kuò)增子用AflIII和HindIII限制性消化并亞克隆至NcoI/HindIII消化的pQE6蛋白質(zhì)表達(dá)載體中。
在pHE1中構(gòu)建KGF-2Δ33為了使得可以進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)指導(dǎo)的擴(kuò)增和KGF-2Δ33亞克隆至大腸桿菌蛋白表達(dá)載體pHE1中，用下列堿基序列合成對(duì)應(yīng)于所需的KGF2區(qū)域的兩個(gè)寡引物(6153和6150)。引物61535’CCGGCGGATCCCATATGTCTTACAACCACCTGCAGG3’(SEQ ID NO14)引物61505’CCGGCGGTACCTTATTATGAGTGTACCACCATTGG3’(SEQ ID NO15)對(duì)N-末端引物(6153)，引入一個(gè)NdeI限制性位點(diǎn)，而對(duì)C-末端引物(6150)，引入一個(gè)Asp718限制性位點(diǎn)。引物6153在KGF2編碼區(qū)附近和框架內(nèi)也包含一個(gè)ATG序列，使克隆片段在大腸桿菌內(nèi)翻譯，而引物6150在KGF2編碼區(qū)附近和框架內(nèi)包含保證在大腸桿菌內(nèi)正確翻譯終止的兩個(gè)終止密碼子(優(yōu)選地在大腸桿菌中使用)。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件和成熟的KGF-2(aa36-208)的核苷酸引物作為模板完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。產(chǎn)生的擴(kuò)增子用NdeI和Asp718限制性消化并亞克隆至NdeI/Asp718消化的pQE6蛋白質(zhì)表達(dá)載體中。
KGF-2Δ33的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCTTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGGACCAAGAAGGAGAACTGCCCGTACAGCATCCTGGAGATAACATCAGTAGAAATCGGAGTTGTTGCCGTCAAAGCCATTAACAGCAACTATTACTTAGCCATGAACAAGAAGGGGAAACTCTATGGCTCAAAAGAATTTAACAATGACTGTAAGCTGAAGGAGAGGATAGAGGAAAATGGATACAATACCTATGCATCATTTAACTGGCAGCATAATGGGAGGCAAATGTATGTGGCATTGAATGGAAAAGGAGCTCCAAGGAGAGGACAGAAAACACGAAGGAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTTCCAATGGTGGTACACTCATAA(SEQ ID NO16)KGF-2Δ33的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO17)B.優(yōu)化的KGF-2Δ33多核苷酸序列的構(gòu)建為了增加KGF2Δ33在大腸桿菌中的表達(dá)水平，對(duì)完整基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化、以便與用于大腸桿菌中的那些密碼子最高度地匹配。由于用來產(chǎn)生KGF2Δ33的模板在N-末端區(qū)內(nèi)為密碼子最優(yōu)化的，C-末端氨基酸(84-208)需要最優(yōu)化。
首先，氨基酸172-208是密碼子優(yōu)化而產(chǎn)生KGF2Δ33(s172-208)。這可通過一個(gè)重復(fù)的PCR策略完成。寡核苷酸PM07和PM08(對(duì)應(yīng)于氨基酸172-208)相結(jié)合，并通過把它們加熱到70℃一起退火，冷卻至37℃。然后用退火的寡核苷酸作為模板用于標(biāo)準(zhǔn)的由引物PM07和PM08指導(dǎo)的PCR反應(yīng)。在一個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)中，用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)條件和用KGF2Δ33作為模板，寡聚核苷酸PM05(它與KGF2的編碼區(qū)內(nèi)的PstI位點(diǎn)重疊)和PM11用于擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于氨基酸84-172的KGF2的區(qū)域。在第三個(gè)PCR反應(yīng)中，第一個(gè)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物(對(duì)應(yīng)于密碼子優(yōu)化的氨基酸172-208)與第二個(gè)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物(對(duì)應(yīng)于密碼子非優(yōu)化的氨基酸84-172)相結(jié)合，并用作引物PM05和PM10指導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)的模板。產(chǎn)生的擴(kuò)增子用Pst1/HindIII消化并亞克隆至用Pst1/HindIII消化的pQE6KGF2Δ33，有效地取代了相應(yīng)的非密碼子優(yōu)化區(qū)，并創(chuàng)建pQE6KGF2Δ33(s172-208)。
為了完成對(duì)KGF2的密碼子優(yōu)化，用重疊的寡聚核苷酸產(chǎn)生一個(gè)為對(duì)應(yīng)于氨基酸84-172的KGF2區(qū)域所優(yōu)化的合成的基因密碼子。四個(gè)寡核苷酸(PM31，PM32，PM33，PM34)相結(jié)合，完成7個(gè)循環(huán)的以下PCR94℃，30秒；46.5℃，30秒；72℃，30秒。
用標(biāo)準(zhǔn)的程序，使用1μ的第一個(gè)PCR反應(yīng)為模板，完成PM35和PM36指導(dǎo)的第二個(gè)PCR反應(yīng)。產(chǎn)生的密碼子優(yōu)化的基因片段用Pst1/Sal1消化，并亞克隆到Pst1/Sal1消化的pQE6KGF2Δ33(s172-208)中，以創(chuàng)建一個(gè)充分優(yōu)化的KGF2編碼基因，pQE6KGF2Δ33s。
為了創(chuàng)造一個(gè)可供選擇的大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)載體，把KGF2Δ33s用引物PM102和PM130在pQE6KGF2Δ33s上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)生的擴(kuò)增子用NdeI和EcoRV消化，并亞克隆到用NdeI和Asp718(平端的)消化的pHE1表達(dá)載體上以創(chuàng)建pHElΔ33s。
用于構(gòu)建密碼子優(yōu)化的KGF2Δ33s的寡核苷酸序列PM05CAACCACCTGCAGGGTGACG(SEQ ID NO18)PM07AACGGTCGACAAATGTATGT GGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGTGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACC(SEQ ID N019)PM08 GGGCCCAAGCTTAAGAGTGTACCACCATTGGCAGAAAGTGAGCAGAGGTGTTITTACGACGGGTTTTCTGACCACG(SEQ ID NO20)PM09GCCACATACATTTGTCGACCGTT(SEQ ID NO21)PM10GGGCCCAAGCTTAAGAGTG(SEQ ID NO22)PM11GCCACATACATTTGTCGACCGTT(SEQ ID NO23)PM31 CTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTFCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTG GTACCA AG(SEQ ID NO24)PM32 AGCTTTAACAGCAACAACACCGATTTCAACGGAGGTGATTTCCAGGATGGAGTACGGGCAGTTTTCTUCTTGGTACCAGAAAC TTTACC(SEQ ID NO25)PM33 GGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTTCCAAAGAATTTAACAAC(SEQ ID NO26)PM34 GTCGACCGTTGTGCTGCCAGTTGAAGGAAGCGTAGGTGTTGTAACCGTTTTCTTCGATACGTTCTTTCAGTTTACAGTCGTTGTTAAATTCTTTGGAACC(SEQ ID NO27)PM35GCGGCGTCGACCGTTGTGCTGCCAG(SEQ ID NO28)PM36GCGGCCTGCAGGGTGACGTTCGTTGG(SEQ ID NO29)PM102CCGGCGGATCCCATATGTCTFACAACCACCTGCAGG(SEQ ID NO30)PM130CGCGCGATATCTTATTAAGAGTGTACCACCATTG(SEQ ID NO31)KGF2Δ33(s172-208)的核苷酸序列ATGTCTTACAACCACCTGCAGGGTGACGTTCGTTGGCGTAAACTGTTCTCCTTCACCAAATACTTCCTGAAAATCGAAAAAAACGGTAAAGTTTCTGGTACCAAGAAAGAAAACTGCCCGTACTCCATCCTGAAATCACCTCCGTTGAAATCGGTGTTGTTGCTGTTAAAGCTATCAACTCCAACTACTACCTGGCTATGAACAAGAAAGGTAAACTGTACGGTCCAAAGAATTTAACAACGACTGTAAACTGAAAGAACGTATCGAAGAAAACGGTTACAACACCTACGCTTCCTTCAACTGGCAGCACAACGGTCGACAAATGTATGTGGCACTGAACGGTAAAGGTGCTCCACGTCGGTCAGAAAACCCGTCGTAAAAACACCTCTGCTCACTTTCTGCCAATGGTGGTACACTCTTAA(SEQ ID NO32)KGF2Δ33(s172-208)的氨基酸序列MSYNHLQGDVRWRKLFSFTKYFLKIEKNGKVSGTKKENCPYSILEITSVEIGVVAVKAINSNYYLAMNKKGKLYGSKEFNNDCKLKERIEENGYNTYASFNWQHNGRQMYVALNGKGAPRRGQKTRRKNTSAHFLPMVVHS(SEQ ID NO33)實(shí)施例實(shí)施例1KGF-2的液體制劑混合下列組分以產(chǎn)生一種液體KGF2Δ33制劑，該制劑保存于-20℃。
2mg/ml的KGF-2Δ33多肽，20Mm醋酸鈉，125mM氯化鈉，1mM EDTA，水，pH6.2。
在2-8℃或2-8℃以下的保存條件下，該制劑保持其體外生物活性多達(dá)10個(gè)月。在第10個(gè)月的生物活性于圖3所示。該制劑在2-8℃或2-8℃以下的保存條件下保持其所有的理化活性多達(dá)11個(gè)月。
用如下的細(xì)胞增生試驗(yàn)測(cè)定生物學(xué)活性。BaF3細(xì)胞，在常規(guī)下生長(zhǎng)并保存在含有10％的NBCS，10％的WEHI細(xì)胞條件培養(yǎng)基，2mM的谷氨酰胺，600μg/ml的GENETICIN，1μl的β-巰基乙醇/每500ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基，50個(gè)單位的青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中(Ornitz，D.，M.等(1996)生物化學(xué)雜志。27115292-15297)。對(duì)于細(xì)胞增生試驗(yàn)，通過離心收獲BaF3細(xì)胞，用基本培養(yǎng)基洗滌(這種培養(yǎng)基具有與生長(zhǎng)培養(yǎng)基相同的成分，但是不包含WEHI細(xì)胞條件培養(yǎng)基，并且補(bǔ)充有1μg/ml的肝素)。經(jīng)過這些操作之后，細(xì)胞重新懸浮于基本培養(yǎng)基中，在96孔的細(xì)胞培養(yǎng)簇皿中，每個(gè)孔中涂布22,000個(gè)細(xì)胞/180μl。在另一個(gè)96孔的平板中配制合適的KGF2稀釋液(高于10倍的所需的終濃度)，并加入到細(xì)胞中至終體積200μl。涂布有細(xì)胞的平板在37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-40小時(shí)，并向每個(gè)孔中加入50μl的含0.5μCi的甲基-3H胸苷的基本培養(yǎng)基。平板在培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)5小時(shí)，并用Tomtec收獲器96在玻璃纖維過濾器上通過過濾收獲細(xì)胞。滲入的胸苷在一個(gè)Wallacβ平板閃爍計(jì)數(shù)器上記數(shù)。
實(shí)施例2KGF-2的凍干制劑混合下列組分以產(chǎn)生KGF-2Δ33的凍干制劑。
10mg/ml的KGF-2Δ33，10mM檸檬酸鈉，20mM的氯化鈉，1mM EDTA，7％w/v蔗糖，水(冷凍干燥后去除)pH6.2。
在45℃或以下的保存條件0下，這種制劑保持其體外生物學(xué)活性多達(dá)9個(gè)月。在第9個(gè)月的生物學(xué)活性表示于圖4。生物學(xué)活性用實(shí)施例1中詳述的細(xì)胞增生試驗(yàn)測(cè)定。反向HPLC證明該制劑在45℃或之下和75％的相對(duì)濕度下保持其理化活性多達(dá)8個(gè)月。
實(shí)施例3KGF-2的增稠制劑混合下列組分以產(chǎn)生KGF-2Δ33的增稠制劑。
2mg/ml KGF-2Δ33，10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA，7％w/v蔗糖，1.25％羧甲基纖維素，水，pH6.2。
該制劑通過向羧甲基纖維素溶液中加入KGF-2Δ33多肽制備而成。產(chǎn)生的制劑粘度用旋轉(zhuǎn)的紡錘粘度計(jì)測(cè)定為約250cps。在羧甲基纖維素存在時(shí)，KGF-2多肽保持生物學(xué)活性。該制劑的生物學(xué)活性用實(shí)施例1中詳述的細(xì)胞增生試驗(yàn)測(cè)定。
實(shí)施例4KGF-2的凝膠制劑混合下列組分以產(chǎn)生KGF-2Δ33凝膠制劑。
2mg/ml KGF-2Δ33，10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA，16％的Pluronic F127，水，pH6.2。
在約2℃至8℃下加入KGF-2Δ33至Pluronic溶液。產(chǎn)生的制劑粘度是20℃下約為50cps，并于37℃下凝固。如同實(shí)施例1中詳述的細(xì)胞增生試驗(yàn)所測(cè)定的，KGF-2在Pluronic F127存在時(shí)保持生物學(xué)活性。
實(shí)施例5KGF2被單巰基甘油激活KGF-2Δ33的蛋白質(zhì)儲(chǔ)備制劑(0.1至2.0mg/ml)用或者不用單巰基甘油(MTG)制備。
蛋白質(zhì)制劑用pH7.2的1倍的磷酸緩沖鹽(PBS)稀釋，以獲得供細(xì)胞增生試驗(yàn)使用的所需濃度。細(xì)胞培養(yǎng)BaF32b細(xì)胞，在常規(guī)下生長(zhǎng)并保存在含有10％的NBCS，10％的WEHI細(xì)胞條件培養(yǎng)基，2mM的谷氨酰胺，600μg/ml的GENETICIN，1μl的β-巰基乙醇/每500ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基，50個(gè)單位的青霉素和50μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中(Ornitz，D.，M.等(1996)生物化學(xué)雜志。27115292-15297)。細(xì)胞增生試驗(yàn)對(duì)于細(xì)胞增生試驗(yàn)，通過離心收獲BaF3細(xì)胞，用基本培養(yǎng)基洗滌(這種培養(yǎng)基具有與生長(zhǎng)培養(yǎng)基相同的成分，但是不包含WEHI細(xì)胞條件培養(yǎng)基，并且補(bǔ)充有1μg/ml的肝素)。經(jīng)過這些操作之后，細(xì)胞重新懸浮于基本培養(yǎng)基中，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個(gè)孔中涂布22,000個(gè)細(xì)胞/180μl。在另一個(gè)96孔的平板中配制合適的KGF2稀釋液(高于10倍的所需的終濃度)，并加入到細(xì)胞中至終體積200μl。涂布有細(xì)胞的平板在37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-40小時(shí)，并向每個(gè)孔中加入50μl的含0.5μCi的甲基-3H胸苷的基本培養(yǎng)基。平板在培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)5小時(shí)，并用Tomtec收獲器96在玻璃纖維過濾器上通過過濾收獲細(xì)胞。滲入的胸苷在一個(gè)Wallacβ平板閃爍計(jì)數(shù)器上記數(shù)。結(jié)果A.MTG濃度對(duì)KGF-2活性的影響把KGF-2暴露于不同濃度的單巰基甘油(MTG)進(jìn)行細(xì)胞增生試驗(yàn)。對(duì)照樣品不含賦形劑。使用MTG，觀察到的其各種濃度的MTG對(duì)KGF-2活性的刺激作用表示于圖5中。活性的增加介于對(duì)照的10-150％，取決于所使用的MTG的濃度。用該生長(zhǎng)因子家族的其它成員沒有觀察到這種增加的細(xì)胞增生活性。從這些觀察得出的結(jié)論是，MTG對(duì)KGF-2活性的刺激作用是十分獨(dú)特的。結(jié)論單巰基甘油似乎特異性地刺激KGF-2的體外細(xì)胞增生活性。
實(shí)施例6含有檸檬酸鹽的KGF-2凝膠制劑混合下列組分以產(chǎn)生在室溫下為液體的KGF-2制劑，施用到皮膚上后形成凝膠。
20mM檸檬酸鈉鹽，125mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉，17％的Pluronic127，pH6.0，
水。
實(shí)施例7含有醋酸鹽的KGF-2凝膠制劑混合下列組分以便產(chǎn)生一旦施用后可形成凝膠的KGF-2制劑。
20mM醋酸鈉，125mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉，17％的Pluronic 127，pH6.0，水。
實(shí)施例81.液體KGF-2制劑以4種單獨(dú)的制劑和在3個(gè)單獨(dú)的pHpH5.0，pH5.5和pH6.0下，評(píng)估檸檬酸鈉作為緩沖液保持KGF-2Δ33的適宜性。
制劑A.1或者2mg/ml的KGF-2Δ3320mM的檸檬酸鈉，125mM氯化鈉，1mMEDTA二鈉，水。
B.如同以上的“A”，還包括1％的甘油。
C.如同以上的“A”，還包括0.05％的甲硫氨酸。
D.如同以上的“A”，還包括1％的單巰基甘油。
在所有上述制劑中KGF-2Δ33的濃度為1和2mg/ml。
2.凍干制劑在3種成塊劑(甘露醇，蔗糖和海藻糖)中的一種存在時(shí)，冷凍干燥KGF-2Δ33。
制劑
A.10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉以及4％甘露醇，pH6.0B.10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉以及7％蔗糖，pH6.0C.10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉以及8％海藻糖，pH6.0KGF-2Δ33多肽的濃度為3mg/ml和8mg/ml。評(píng)價(jià)參數(shù)(在重構(gòu)之前和之后)為RP-HPLC，SDS-PAGE，外觀。
3.10mg/ml的KGF-2冷凍干燥評(píng)估制劑是否使得可以將10mg/ml的蛋白質(zhì)冷凍干燥以及評(píng)估重構(gòu)之后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
制劑10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA二鈉以及4％甘露醇，pH6.0。
凍干產(chǎn)品用水或含有1％的單巰基甘油的水重構(gòu)。
實(shí)施例9增稠劑的穩(wěn)定性根據(jù)前面的實(shí)施例的方法配制下列制劑。劑型1和2是單獨(dú)凍干的KGF-2；劑型3和4包含增稠劑作為凍干塊狀物的部分；和劑型5-8包含增稠劑為液體稀釋劑的部分。
實(shí)施例10KGF-2在治療慢性創(chuàng)傷中的用途預(yù)計(jì)涉及多次的，局部施藥。由于不存在任何的防腐劑，凍干的劑型需要一個(gè)單獨(dú)的藥物產(chǎn)品藥瓶以便每次使用時(shí)重構(gòu)。每次給藥時(shí)，將導(dǎo)致大量的藥物浪費(fèi)以及在制備產(chǎn)品中需要更加密集型的勞動(dòng)。理想地，KGF-2的商業(yè)劑型包括一個(gè)單一的可供多次使用的盛有KGF-2的藥瓶。為了研究該劑型的可行性，檢查了KGF-2與防腐劑的相容性。
防腐劑選自一系列FDA批準(zhǔn)的化合物。所選擇的五種候選防腐劑基于在醫(yī)生書桌參考書(PDR)中流行以及以前所出版的生物藥品著作。因?yàn)樯形醋罱K決定劑型和劑量形式，最初并沒有著重強(qiáng)調(diào)在pH6.2時(shí)與彈性閉合物的相容性或者穩(wěn)定性。根據(jù)文獻(xiàn)的一些數(shù)值以及FDA/USP和BP的指南選擇濃度。下表陳列出本研究中考查的五種候選防腐劑。
1“對(duì)羥基苯甲酸酯類”在本實(shí)施例中定義為0.18％的甲基對(duì)羥基苯甲酸酯和0.02％的丙基對(duì)羥基苯甲酸酯。
為了使用防腐劑，必須滿足兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。首先，必須確定藥物產(chǎn)品的相容性和穩(wěn)定性。第二，必須確定對(duì)微生物的影響(每USP<51>)。本研究的目的在于檢查KGF-2與這些防腐劑的短期相容性。材料和方法制劑所有的化學(xué)藥品從Spectrum購(gòu)買，并且是USP/NF級(jí)別或相當(dāng)于該級(jí)別。KGF-2滲濾到一種含有下列之一的基礎(chǔ)制劑緩沖液中0.9％的苯甲醇，0.5％的氯丁醇，0.5％的苯酚，0.3％的甲酚，或者0.18％甲基對(duì)羥基苯甲酸酯+0.02％的丙基對(duì)羥基苯甲酸酯(對(duì)羥基苯甲酸酯類)。用一個(gè)Biomax10kD的膜在Amicon攪拌槽中完成滲濾。所有的處理在2-8℃下進(jìn)行。對(duì)每次滲濾，總共完成5次緩沖液交換，滲濾過程中的恢復(fù)率大于90％。KGF-2稀釋成為1.0mg/mL，并且注入1.0mL到2mL的Schott Purform藥瓶中，并用Diakyo D-777血清瓶塞和鋁卷曲封印密封。藥水瓶保存在-80℃，2-8℃，和25℃/60％的相對(duì)濕度下。含有沉淀的制劑在進(jìn)一步分析前用0.2μl的濾膜過濾。外觀利用正常放大率的向前照明熒光燈在黑白背景下進(jìn)行視覺檢查。SDS-PAGE在非還原的條件下用16％的Tris-甘氨酸NOvex凝膠完成SDS-PAGE。每個(gè)泳道中上樣共2μg的KGF-2。凝膠在恒壓(125V)下電泳約2小時(shí)。按照制造商的使用說明書用Daiichi銀染料進(jìn)行染色。生物活性利用經(jīng)成纖維生長(zhǎng)因子2iiib受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的老鼠的淋巴細(xì)胞系，Baf32b，測(cè)定KGF-2的生物活性?；钚允窃诩?xì)胞增生的基礎(chǔ)上、在細(xì)胞暴露于KGF-2之后通過滲入的[甲基-3H]胸苷所測(cè)定的。差式掃描熱量測(cè)定法(DSC)在一個(gè)熱量測(cè)定科學(xué)NaNO DSC儀(型號(hào)5100)上獲得每個(gè)制劑的DSC溫度圖譜。掃描從5℃到80℃以每分鐘1℃的速率沿加熱和冷卻兩個(gè)方向進(jìn)行。熔點(diǎn)(Tm)以熱轉(zhuǎn)變的頂點(diǎn)測(cè)量。在任何樣品中在冷卻方向沒有觀察到信號(hào)，表明解折疊是不可逆轉(zhuǎn)的。RP-HPLC(濃度，純度，氧化百分率)在一個(gè)裝備Waters 960光電二極管矩陣檢測(cè)器的2690聯(lián)合系統(tǒng)上完成RP-HPLC。用一個(gè)線形梯度的溶劑A(0.1％的TFA溶于水中)至溶劑B(0.07％的TFA溶于乙腈)用Watersδ-Pak C18柱子(2.1×150毫米，5μm，300埃)分離。利用已知濃度的內(nèi)標(biāo)，通過把一個(gè)未知濃度的總的峰面積與一條標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)聯(lián)測(cè)定濃度。標(biāo)準(zhǔn)參照物的典型層析譜表示如下。兩個(gè)主要的峰被分離開，且在以前被鑒定為完整的KGF-2峰和一個(gè)氧化形式的KGF-2峰。氧化百分率被報(bào)道為占總面積的面積百分比。純度百分率是歸因于完整的和氧化形式總和的面積百分率。結(jié)果氯丁醇和對(duì)羥基苯甲酸酯類在2-8℃下表現(xiàn)出與KGF-2有希望的相容性。當(dāng)保存于2-8℃下時(shí)，苯甲基醇，甲酚和苯酚造成KGF-2的迅速凝聚。當(dāng)保存于25℃時(shí)，一個(gè)星期之后所有的制劑均具有較差的外觀。在甲酚和苯酚存在的情況下，當(dāng)置于凍/融條件下時(shí)，KGF-2從溶液中沉淀出來。
試驗(yàn)過的所有防腐劑對(duì)KGF-2的熱穩(wěn)定性均有一種輕微的不穩(wěn)定的影響。在所有的防腐劑存在時(shí)，DSC測(cè)定的熔點(diǎn)溫度顯示出約5℃的下降。在試驗(yàn)過的防腐劑中，對(duì)羥基苯甲酸酯類的影響最小。
KGF-2的比活性不受任何試驗(yàn)過的防腐劑存在的影響。雖然保存于25℃的制劑總活性在保存6個(gè)星期之后因KGF-2的沉淀的確有下降，在氯丁醇，對(duì)羥基苯甲酸酯類和苯甲醇制劑中的可溶性蛋白仍保持其比活性。
在2-8℃的保存條件下，如同RP-HPLC所測(cè)定的，所有制劑保持其10％的起始濃度范圍之內(nèi)。當(dāng)保存于25℃時(shí)，包含甲酚和苯酚的制劑表現(xiàn)出最快速度的沉淀。在試驗(yàn)過的制劑中，包含氯丁醇和對(duì)羥基苯甲酸酯類的那些制劑在短期的穩(wěn)定性期間在溶液中保持最多的KGF-2。
苯甲醇造成KGF-2的迅速氧化，其后為氧化形式的降解。這可由高的初始水平的氧化作用(在滲濾期間形成的)，緊接著為緩慢地過渡至進(jìn)一步氧化形式表現(xiàn)出來。當(dāng)保存于2-8℃時(shí)，剩余的制劑具有每月約4％的可比較的氧化速率。當(dāng)保存于25℃時(shí)，氧化速率增加至每月30-40％。在試驗(yàn)過的制劑中，包含對(duì)羥基苯甲酸酯類的制劑具有最緩慢的平均氧化速率。
作為一個(gè)總的層析面積的百分率，以KGF-2的主要和氧化形式的總和測(cè)定純度。包含苯甲醇和苯酚的制劑最初表現(xiàn)出低的純度，其后為純度的提高，然后為純度逐漸降低。這與在零時(shí)間的層析峰的急劇增加(該層析峰似乎與可溶性的集合物相對(duì)應(yīng))相符合。隨著沉淀的繼續(xù)形成，這種峰隨即消失，任何其它的峰面積爾后也沒有增加。當(dāng)保存于25℃時(shí)，包含對(duì)羥基苯甲酸酯類的制劑保持最高的純度。
SDS-PAGE顯示在零時(shí)間以及在保存6個(gè)星期時(shí)包含苯甲醇的二聚體帶的輕微的增加，在保存于25℃的制劑中觀察到模糊的泳道條紋和二聚體濃度的增加。結(jié)論在被檢查的條件下，KGF-2與苯甲醇，甲酚和苯酚是不相容的。在這些制劑中，聚合其后的沉淀是降解的主要途徑。在試驗(yàn)過的防腐劑中，甲基/丙基對(duì)羥基苯甲酸酯對(duì)KGF-2的短期穩(wěn)定性的影響最小。
實(shí)施例11KGF-2的凍干制劑混合下列組分以便產(chǎn)生KGF-2Δ33的預(yù)混合制劑。
3.3mg/ml KGF-2Δ33，10mM檸檬酸鈉，20mM氯化物鈉，1mM EDTA，2％的w/v的甘氨酸0.5％的w/v的蔗糖，水(凍干即被去除)，pH6.2。
接下來按照以上描述的第二個(gè)凍干循環(huán)凍干該制劑。
在25℃或低于25℃的保存條件下，這種制劑保持其體外生物活性多達(dá)12個(gè)月。
實(shí)施例12KGF-2局部制劑混合下列組分以便產(chǎn)生局部應(yīng)用的KGF-2制劑。
1.0mg/ml的KGF-2Δ33，0.46％羥乙基纖維素(HFC)7％蔗糖，20mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈉，1mM EDTA，pH6.2。
清晰明了的是，本發(fā)明可以以前面描述的和實(shí)施例中特別描述的以外的方式實(shí)施。
按照上述教導(dǎo)，本發(fā)明的許多修改和變化是可能的，因此，這些修改和變化也在附加權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
本文引用的所有出版物(包括專利，專利申請(qǐng)，期刊文章，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，書籍，或者其它的文件)的全部公開內(nèi)容在此一并參考。
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Chopra，ArvindKaushal，ParveenSpitznagel，ThomasUnsworth，EdwardKhan，F(xiàn)azal<120>角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子2-2制劑<130>1488.103PC05<140>待定<141>與此一道<150>US 60/137,448<151>1999-06-02<150>US 60/160,913<151>1999-10-22<160>33<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>627<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(1)..(624)<400>1atg tgg aaa tgg ata ctg aca cat tgt gcc tca gcc ttt ccc cac ctg 48Met Trp Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu1 5 10 15ccc ggc tgc tgc tgc tgc tgc ttt ttg ttg ctg ttc ttg gtg tct tcc 96Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser20 25 30gtc cct gtc acc tgc caa gcc ctt ggt cag gac atg gtg tca cca gag144Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu35 40 45gcc acc aac tct tct tcc tcc tcc ttc tcc tct cct tcc agc gcg gga192Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly50 55 60agg cat gtg cgg agc tac aat cac ctt caa gga gat gtc cgc tgg aga 240Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg65 70 75 80aag cta ttc tct ttc acc aag tac ttt ctc aag att gag aag aac ggg 288Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly85 90 95aag gtc agc ggg acc aag aag gag aac tgc ccg tac agc atc ctg gag 336Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu100 105 110ata aca tca gta gaa atc gga gtt gtt gcc gtc aaa gcc att aac agc 384Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser115 120 125aac tat tac tta gcc atg aac aag aag ggg aaa ctc tat ggc tca aaa 432Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys130 135 140gaa ttt aac aat gac tgt aag ctg aag gag agg ata gag gaa aat gga 480Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly145 150 155 160tac aat acc tat gca tca ttt aac tgg cag cat aat ggg agg caa atg 528Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met165 170 175tat gtg gca ttg aat gga aaa gga gct cca agg aga gga cag aaa aca 576Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr180 185 190cga agg aaa aac acc tct gct cac ttt ctt cca atg gtg gta cac tca 624Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser195 200 205tag 627<210>2<211>208<212>PRT<213>人類<400>2Met Trp Lys Trp Ile Leu Thr His Cys Ala Ser Ala Phe Pro His Leu1 5 10 15Pro Gly Cys Cys Cys Cys Cys Phe Leu Leu Leu Phe Leu Val Ser Ser20 25 30Val Pro Val Thr Cys Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu
35 40 45Ala Thr Asn Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly50 55 60Arg His Val Arg Ser Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg65 70 75 80Lys Leu Phe Ser Phe Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly85 90 95Lys Val Ser Gly Thr Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu100 105 110Ile Thr Ser Val Glu Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser115 120 125Asn Tyr Tyr Leu Ala Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys130 135 140Glu Phe Asn Asn Asp Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly145 150 155 160Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met165 170 175Tyr Val Ala Leu Asn Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr180 185 190Arg Arg Lys Asn Thr Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser195 200 205<210>3<211>35<212>DNA<213>人類<400>3ggaccctcat gacctgccag gctctgggtc aggac 35<210>4<211>28<212>DNA<213>人類<400>4ggacagccat ggctggtcgt cacgttcg 28<210>5<211>29<212>DNA<213>人類<400>5ggacagccat ggttcgttgg cgtaaactg 29<210>6<211>31<212>DNA<213>人類<400>6ggacagccat 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權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其包含(a)一種約0.02到約40mg/ml(w/v)濃度范圍的KGF-2多肽；(b)一種在約5mM到約50mM濃度范圍，具有約pH5.0到約pH8.0的緩沖能力的緩沖液；和(c)一種使組合物稀釋到指定體積的藥學(xué)上可接受的稀釋劑；和(d)一種選自下組的防腐劑間-甲酚，氯丁醇，和甲基對(duì)羥基苯甲酸酯與丙基對(duì)羥基苯甲酸酯的混合物；或它們的反應(yīng)產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其還包含一種或多種(a)約0mM到約10mM濃度范圍的螯合劑；和(b)約0mM到約150mM濃度范圍的補(bǔ)劑。
3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所說的補(bǔ)劑選自下組NaCl，甘氨酸，蔗糖，甘露醇，和它們的混合物。
4.權(quán)利要求1的藥物組合物，其還包含以下之一1.約0.5％至約2％w/v的甘油，2.約0.1％至約1％w/v的甲硫氨酸，或者3.約0.1％至約2％w/v的單巰基甘油。
5.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽以約0.05至約30mg/ml(w/v)濃度范圍存在。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽以約0.1至約20mg/ml(w/v)濃度范圍存在。
7.權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽以約0.2至4mg/ml濃度范圍存在。
8.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽是KGF-2-Δ33。
9.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的稀釋劑是水。
10.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所說的螯合劑是約1mM濃度的EDTA，并且所說的補(bǔ)劑以約125mM的濃度存在。
11.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的pH從約pH5.5至約pH6.5。
12.權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所說的pH約為pH6.0。
13.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的緩沖液選自下組磷酸，醋酸，烏頭酸，檸檬酸，戊二酸，蘋果酸，琥珀碳酸，以及它們的堿金屬或堿土金屬鹽。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所說的緩沖液是磷酸鹽，醋酸鹽，或檸檬酸鹽。
15.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所說的緩沖液是檸檬酸鹽。
16.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的緩沖液以約5mM至約30mM的濃度范圍存在。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中所說的緩沖液是以約10mM至約20mM濃度存在的檸檬酸鹽。
18.權(quán)利要求1的藥物組合物，還包含穩(wěn)定量的一種或更多的(a)抗氧化劑或者(b)巰基化合物。
19.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的組合物保存在-20℃或-20℃以下的溫度下。
20.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的KGF-2Δ33多肽選自下組具有N-末端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，缺少N-末端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，以及它們的混合物。
21.權(quán)利要求1的藥物組合物，還包含一種成塊劑。
22.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所說的成塊劑選自下組蔗糖，甘氨酸，甘露醇，海藻糖，以及它們的混合物。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所說的成塊劑是蔗糖或蔗糖和甘氨酸的混合物。
24.權(quán)利要求2的藥物組合物，其還包含一種成塊劑。
25.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所說的成塊劑以約2％至約10％w/v的濃度存在。
26.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中所說的成塊劑是5％的甘露醇，7％的蔗糖，8％的海藻糖，或2％的甘氨酸加0.5％的蔗糖。
27.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所說的pH為約6.2。
28.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所說的稀釋劑是水。
29.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所說的緩沖液選自下組磷酸，醋酸，烏頭酸，檸檬酸，戊二酸，蘋果酸，琥珀碳酸，以及它們的堿金屬或堿土金屬鹽。
30.權(quán)利要求29的藥物組合物，其中所說的緩沖液是一種磷酸鹽或者檸檬酸鹽。
31.權(quán)利要求30的藥物組合物，其中所說的緩沖液是一種檸檬酸鹽。
32.權(quán)利要求28的藥物組合物，其中超過90％的水被凍干除去。
33.權(quán)利要求32的藥物組合物，該組合物由一定量的無菌水重構(gòu)，無菌/水的量能有效保持約290mOsm的等滲狀態(tài)。
34.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽是KGF-2-Δ33。
35.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中所說的KGF-2Δ33多肽選自下組具有N-末端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，缺少N-末端甲硫氨酸的KGF-2Δ33多肽，以及它們的混合物。
36.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所說的緩沖液以約5mM至約50mM的濃度加入。
37.權(quán)利要求36的藥物組合物，其中所說的緩沖液是約10mM濃度的檸檬酸鹽。
38.權(quán)利要求21的藥物組合物，其還包含一種穩(wěn)定量的一種或多種(g)抗氧化劑或(h)巰基化合物。
39.權(quán)利要求21的藥物組合物，其中所說的組合物由含有穩(wěn)定量的抗氧化劑的無菌水重構(gòu)，該抗氧化劑包括a)約0.01％至約2％w/v單巰基甘油，b)約0.01％至約2％w/v抗壞血酸，c)約0.01％到約2％w/v甲硫氨酸或者d)它們的組合。
40.權(quán)利要求1的藥物組合物，其還包含一種有效量的把粘度提高到約50至約10,000cps的增稠劑。
41.權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所說的增稠劑以提高粘度到約50至約1,000cps的有效量存在。
42.權(quán)利要求41的藥物組合物，其中所說的增稠劑以提高粘度到約200至約300cps的有效量存在。
43.權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所說的增稠劑以0至5％(w/w)的濃度存在。
44.權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所說的增稠劑是一種水溶性的乙醚化的纖維素或一種高分子量的丙烯酸與烯丙基蔗糖或戊赤鮮糖的烯丙基醚交聯(lián)的聚合物。
45.權(quán)利要求44的藥物組合物，其中所說的乙醚化的纖維素是烷基化的纖維素，羥基烷基化纖維素，羧基纖維素或者烷基羥基烷基化的纖維素。
46.權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所說的乙醚化的纖維素是甲基纖維素，羥基乙基纖維素，羥基丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素。
47.權(quán)利要求46的藥物組合物，其中所說的乙醚化的纖維素衍生物具有約50,000至約700,000的分子量，并且以約0至約20％的濃度(按重量)存在。
48.權(quán)利要求47的藥物組合物，其中所說的乙醚化的纖維素衍生物具有約80,000至約240,000的分子量，并且以約2％至約8％的濃度(按重量)存在。
49.權(quán)利要求42的藥物組合物，其中所說的緩沖液是約10mM到約50mM濃度的檸檬酸鹽。
50.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所說的緩沖液是約10mM到約2mM濃度的檸檬酸鹽。
51.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所說的成塊劑是約0.01％到約5％濃度的蔗糖。
52.權(quán)利要求51的藥物組合物，其中所說的增稠劑直接地加到液體制劑中，然后凍干。
53.權(quán)利要求51的藥物組合物，通過加入一種合適的含有溶解在其中的增稠劑的稀釋劑來重構(gòu)制劑，把其中所說的增稠劑加入到凍干制劑中。
54.權(quán)利要求21的藥物組合物，還包含一種有效量的把粘度提高到約50至約10,000cps增稠劑。
55.權(quán)利要求1的組合物，其還包含有效量的在室溫下把粘度提高到約0.1至約10,000cps的凝膠劑。
56.權(quán)利要求1的組合物，其還包含有效量的在室溫下把粘度提高到約0.1至約10,000cps的凝膠劑。
57.權(quán)利要求55的組合物，其中所說的凝膠形成劑是一種能夠形成膠粘水溶液的水溶性聚合物，或者是一種能夠形成膠粘溶液的非水溶性的，遇水可膨脹的聚合物。
58.權(quán)利要求57的組合物，其中所說的凝膠形成劑是一種選自下組的高分子量聚合物乙烯聚合物，聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物，多糖，蛋白質(zhì)，聚環(huán)氧乙烷，丙烯酰胺聚合物或它們的鹽。
59.權(quán)利要求58的組合物，其中所說的凝膠形成劑是(1)選自下組的乙烯聚合物聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯酒精，和它們的鹽或酯；或(2)選自下組的多糖纖維素衍生物，粘多糖，瓊脂，果膠，褐藻酸，葡聚糖，α-直鏈淀粉，支鏈淀粉，殼聚糖，和它們的鹽和酯。
60.權(quán)利要求58的組合物，其中所說的凝膠形成劑是一種選自下組的粘多糖透明質(zhì)酸，軟骨素，4-硫酸軟骨素，硫酸乙酰肝素，肝素以及它們的鹽和酯。
61.權(quán)利要求60的組合物，其中所說的粘多糖與膠原蛋白，明膠，或纖連蛋白以結(jié)合形式存在。
62.權(quán)利要求58的組合物，其中所說的凝膠形成劑是一種選自下組的丙烯酰胺聚合物聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺。
63.權(quán)利要求58的組合物，其中所說的凝膠形成劑是聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物。
64.權(quán)利要求63的組合物，其它包含約10％至約60％重量的具有平均分子量約500至50,000的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物。
65.權(quán)利要求64的組合物，其它包含約14％至約18％重量的具有1,000至15,000分子量范圍的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物。
66.權(quán)利要求1的組合物，其中所說的KGF-2多肽以約0.01mg/ml至約10mg/ml濃度存在。
67.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽是選自下組的N-末端缺失體Ala(63)--Ser(208)(KGF-2Δ28)和Ser(69)--Ser(208)(KGF-2Δ33)。
68.權(quán)利要求67的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽具有N末端甲硫氨酸，缺乏N末端甲硫氨酸，或者是它們的混合物。
69.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽是選自下組的N-末端或C-末端缺失突變體Ala(39)--Ser(208)；Pro(47)--Ser(208)；Val(77)--Ser(208)；Glu(93)--Ser(208)；Glu(104)--Ser(208)；Val(123)--Ser(208)；Gly(138)--Ser(208)；Met(1)，Thr(36)；和Cys(37)--Lys(153)。
70.權(quán)利要求69的藥物組合物，其中所說的KGF-2多肽具有N末端甲硫氨酸，缺乏N末端甲硫氨酸，或者是它們的混合物。
71.權(quán)利要求1的藥物組合物，其還包含以下之一(a)賴氨酸；(b)羥丙基-β-環(huán)狀糊精；或(c)硫酸鹽-β-環(huán)狀糊精；或者它們的組合體。
72.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說的防腐劑是甲基對(duì)羥基苯甲酸酯與丙基對(duì)羥基苯甲酸酯的混合物。
73.權(quán)利要求72的藥物組合物，其中所說的組合物包含0.18％甲基對(duì)羥基苯甲酸酯和0.02％丙基對(duì)羥基苯甲酸酯。
74.一種藥物組合物，其包含(a)約1.0mg/ml的KGF-2；(b)20mM檸檬酸鹽，pH5-5.5；和(c)0.01％的聚山梨酸酯80。
75.權(quán)利要求74的藥物組合物，其還包含1mMEDTA。
76.一種藥物組合物，包含(A)約3.3mg/ml的KGF-2；(B)10mM檸檬酸鈉(C)20mM氯化鈉；(D)1mM的EDTA(E)2％w/v的甘氨酸；(F)0.5％w/v的蔗糖；(G)水；和(H)pH約6.2；或者它們的反應(yīng)產(chǎn)物。
77.權(quán)利要求77的藥物組合物，其中超過90％的水由凍干去除。
78.一種藥物組合物，其包含(a)約1.0mg/ml的KGF-2；(b)0.46％羥乙基纖維素；(c)7％蔗糖；(d)20mM檸檬酸鈉；(e)20mM氯化鈉；(f)1mM的EDTA；和(g)pH約6.2；或者它們的反應(yīng)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及液體和凍干形式的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子－2(KGF－2)及其衍生物。本發(fā)明還涉及具有治療用途,例如,促進(jìn)或者加速創(chuàng)傷愈合的KGF－2制劑。
文檔編號(hào)A61K47/26GK1359299SQ00809802
公開日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2000年6月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月2日
發(fā)明者R·L·詹茨, A·卓普拉, P·考沙爾, T·斯皮茨納吉爾, E·昂斯沃斯, F·肯 申請(qǐng)人:人類基因組科學(xué)公司