專(zhuān)利名稱(chēng)：促紅細(xì)胞生成素與聚乙二醇的偶聯(lián)物的制作方法
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素在補(bǔ)償細(xì)胞破壞時(shí)產(chǎn)生紅細(xì)胞。促紅細(xì)胞生成素是使正常組織氧化作用獲得足夠的紅細(xì)胞的受控生理機(jī)理。天然存在的人促紅細(xì)胞生成素(hEPO)是在腎臟中產(chǎn)生的含有165個(gè)氨基酸的糖蛋白，并且是刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生的體液血漿因子(Carnot，P和Deflandre，C(1906)C.R.Acad.Sci.143432；Eralev，AJ(1953)血液(Blood)8349；Reissmann，KR(1950)血液(Blood)5372；Jacobson，LO，Goldwasser，E，F(xiàn)reid，W和Plzak，LF(1957)自然(Nature)1799331-4)。人EPO刺激定向類(lèi)紅細(xì)胞先祖在骨髓中分裂和分化。人EPO通過(guò)與類(lèi)紅細(xì)胞先祖上的受體結(jié)合而表現(xiàn)出其生物學(xué)活性(Krantz，BS(1991)血液(Blood)77419)。天然存在的人促紅細(xì)胞生成素是在血漿中以低濃度存在以刺激隨著老化而消失的紅細(xì)胞的替代的酸性糖蛋白。
應(yīng)用重組DNA技術(shù)已經(jīng)生物合成出促紅細(xì)胞生成素(Egrie，JC，Strickland，TW，Lane，J等(1986)免疫生物學(xué)(Immunobiol)72213-224)，其是插入到中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢組織細(xì)胞(CHO細(xì)胞)中并且表達(dá)的克隆的人EPO基因的產(chǎn)物。天然存在的人EPO首先翻譯成含有166個(gè)氨基酸并且166位是精氨酸的多肽鏈。在翻譯后修飾中用羧肽酶裂解掉166位精氨酸。

圖1詳細(xì)說(shuō)明了人EPO的一級(jí)結(jié)構(gòu)(165aa)。圖2詳細(xì)說(shuō)明了人EPO的一級(jí)結(jié)構(gòu)(166aa)。Cys7-Cys161和Cys29-Cys33之間有兩個(gè)二硫橋。沒(méi)有糖基的人EPO的多肽鏈的分子量是18236Da。在完整的EPO分子中，糖基占分子量的大約40％(Sasaki，H，Bothner，Dell，A和Fukuda，M(1987)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26212059)。
因?yàn)榇偌t細(xì)胞生成素在紅細(xì)胞形成中是必需的，所以激素在治療特征在于紅細(xì)胞產(chǎn)量低或者缺乏的血液病中是有用的。臨床上，在例如慢性腎衰竭(CRF)患者貧血癥的治療中使用EPO(Eschbach，JW，Egri，JC，Downing，MR等(1987)NEJM 31673-78；Eschbach，JW，Abdulhadi，MH，Browne，JK等(1989)國(guó)際藥物學(xué)年度報(bào)告(Ann.Intern.Med)111992；Egri，JC，Eschbach，JW，McGuire，T，Adamson，JW(1988)Kidney Intl.33262；Lim，VS，Degowin，RL，Zavala，D等(1989)國(guó)際藥物學(xué)年度報(bào)告(Ann.Intern.Med.)111108-114)，和在艾滋病和接受化療的癌癥患者貧血癥的治療中使用EPO(Danna，RP，Rudnick，SA，Abels，RI，于MB，Garnick編著，臨床應(yīng)用中的促紅細(xì)胞生成素-國(guó)際展望(Erythropoietin in ClinicalApplications-An International Perspective)紐約，NYMarcel Dekker；1990p301-324)。但是當(dāng)前可獲得的蛋白質(zhì)治療劑例如EPO的生物利用率受到它們的短的血漿半壽期和容易遭受蛋白酶降解的限制。這些缺陷阻止它們獲得最大臨床效力。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明是一類(lèi)新的EPO的PEG衍生物。本發(fā)明的生理學(xué)活性PEG-EPO偶聯(lián)物(conjugate)包括具有至少一個(gè)自由氨基的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白，并且它具有能引起骨髓細(xì)胞提高網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的產(chǎn)量的體內(nèi)生物學(xué)活性，所述促紅細(xì)胞生成素糖蛋白選自人促紅細(xì)胞生成素和具有通過(guò)加入1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素的一級(jí)結(jié)構(gòu)的其類(lèi)似物；所述糖蛋白共價(jià)連接到1至3個(gè)低級(jí)烷氧基聚(乙二醇)基團(tuán)上，每個(gè)聚(乙二醇)基團(tuán)通過(guò)式-C(O)-X-S-Y-的連接基團(tuán)與糖蛋白共價(jià)連接，該連接基團(tuán)的C(O)與所述氨基中的一個(gè)形成酰胺鍵，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1至10，Y是 每個(gè)聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約20千道爾頓至大約40千道爾頓，偶聯(lián)物的分子量是大約51千道爾頓至大約175千道爾頓。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有本文所述偶聯(lián)物的組合物，其中組合物中n是1的偶聯(lián)物的百分比至少是90％。
與未修飾的EPO(即沒(méi)有連接PEG的EPO)和常規(guī)PEG-EPO偶聯(lián)物相比，本發(fā)明偶聯(lián)物具有提高的循環(huán)半壽期和血漿滯留時(shí)間，降低的清除率和提高的體內(nèi)臨床活性。本發(fā)明的偶聯(lián)物具有和EPO一樣的用途。特別地，本發(fā)明的偶聯(lián)物以EPO被用來(lái)治療患者的相同方式通過(guò)刺激定向類(lèi)紅細(xì)胞先祖在骨髓中分裂和分化而用于治療患者。
本發(fā)明還包括治療人貧血的方法。本發(fā)明還包括制備促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物的方法，包括使促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸的ε-氨基與雙功能試劑共價(jià)反應(yīng)，形成具有酰胺鍵的中間體。雙功能試劑包含一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)和一個(gè)保護(hù)的巰基。然后酰胺鍵鍵連的中間體與一種活化的聚乙二醇衍生物共價(jià)反應(yīng)，生成本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物。
附圖的簡(jiǎn)要描述圖1人EPO的一級(jí)結(jié)構(gòu)(165個(gè)氨基酸)。
圖2人EPO的一級(jí)結(jié)構(gòu)(165個(gè)氨基酸)。
圖3通過(guò)正常血紅細(xì)胞(normocythaemic)小鼠測(cè)試測(cè)定的聚乙二醇基化EPO的體內(nèi)活性。
發(fā)明的詳細(xì)描述下面的術(shù)語(yǔ)具有下面給出的定義術(shù)語(yǔ)“促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)”，“促紅細(xì)胞生成素”，“EPO”，或“促紅細(xì)胞生成素糖蛋白”指具有圖1(SEQ ID NO1)或2(SEQ ID NO2)所示序列的糖蛋白或者與其基本上同源的生物學(xué)活性與刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生和刺激定向類(lèi)紅細(xì)胞先祖在骨髓中分裂和分化相關(guān)的蛋白質(zhì)或多肽。如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)EPO蛋白質(zhì)包括例如通過(guò)定點(diǎn)誘變或隨機(jī)突變而精密修飾的這樣的蛋白質(zhì)。這些術(shù)語(yǔ)還包括具有1-6個(gè)附加的糖基化位點(diǎn)的類(lèi)似物，蛋白質(zhì)的羧基末端具有至少一個(gè)附加的氨基酸的類(lèi)似物(其中附加的氨基酸包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn))，具有包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排的氨基酸序列的類(lèi)似物，例如歐洲專(zhuān)利公開(kāi)No.640619中公開(kāi)的類(lèi)似物。這些術(shù)語(yǔ)包括天然的和重組產(chǎn)生的人促紅細(xì)胞生成素。
術(shù)語(yǔ)“基本上同源的”指通過(guò)一處或多處取代，缺失或添加從參考序列變化產(chǎn)生的特定主觀序列，例如突變序列，其凈作用不導(dǎo)致參考和主觀序列之間的不利的功能不相似性。為了本發(fā)明的目的，具有大于95％同源性，等價(jià)生物學(xué)性質(zhì)和等價(jià)表達(dá)特征的序列被認(rèn)為是基本上同源的。為了測(cè)定同源性的目的，成熟序列的平截應(yīng)該忽略不計(jì)。具有較低程度的同源性，可比較生物活性和等價(jià)表達(dá)特征的序列被認(rèn)為是基本等價(jià)物。
術(shù)語(yǔ)EPO蛋白質(zhì)的“片段”指具有EPO蛋白質(zhì)的部分或片段的氨基酸序列并且具有EPO的生物學(xué)活性的任何蛋白質(zhì)或多肽。片段包括EPO蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生的或者通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法通過(guò)化學(xué)合成的蛋白質(zhì)或多肽。當(dāng)對(duì)人施用蛋白質(zhì)或片段導(dǎo)致刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生和刺激定向類(lèi)紅細(xì)胞先祖在骨髓中分裂和分化，則該EPO蛋白質(zhì)或者其片段是有生物活性的。通過(guò)用于這樣的目的的對(duì)一種或多種哺乳動(dòng)物物種的常規(guī)的公知的試驗(yàn)，可以進(jìn)行EPO蛋白質(zhì)的生物活性測(cè)定。本文描述了能夠用來(lái)證實(shí)這樣的生物活性的合適的試驗(yàn)。
術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是引起骨髓細(xì)胞提高網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的產(chǎn)量的體內(nèi)生物活性所必需的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物的量。促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物的精確量是對(duì)象要治療的癥狀的準(zhǔn)確類(lèi)型，要治療的患者的狀況，以及組合物中其它成分這樣的因素的優(yōu)選主題。以通過(guò)各種方法對(duì)患有特征在于紅細(xì)胞產(chǎn)量低或缺乏的血液病人患者施用強(qiáng)有效量可以配制含有促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物的藥物組合物。促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物的平均治療有效量可以是不同的，并且特別應(yīng)該以有資格的醫(yī)生的建議和藥方為基礎(chǔ)。
本發(fā)明涉及式1代表的具有引起骨髓細(xì)胞提高網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的產(chǎn)量的體內(nèi)生物活性的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n1其中X和Y如上定義，m是450-900，n是1-3，R是低級(jí)烷基，P是缺少能與X形成酰胺鍵的一個(gè)或多個(gè)氨基的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白。如下所述，EPO的制備和純化是本領(lǐng)域公知的。EPO指天然或重組蛋白質(zhì)，優(yōu)選人源的，從任何常規(guī)來(lái)源例如組織，蛋白質(zhì)合成，用天然或重組細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物可獲得。包括具有EPO活性的所有的蛋白質(zhì)，例如突變蛋白，另外或者修飾的蛋白質(zhì)。通過(guò)在CHO-，BHK-或HeLa細(xì)胞系中表達(dá)，通過(guò)重組DNA技術(shù)或者通過(guò)內(nèi)源基因激活，可以制備重組EPO，即通過(guò)內(nèi)源基因激活表達(dá)促紅細(xì)胞生成素糖蛋白。用于制備促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物的優(yōu)選的EPO物質(zhì)是人EPO物質(zhì)。更優(yōu)選地，所述EPO物質(zhì)是具有圖1(SEQ ID NO1)或圖2(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的人EPO，最優(yōu)選具有圖1(SEQ ID NO1)所示氨基酸序列的人EPO。
人促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)也可以修飾至少一個(gè)附加的糖基化位點(diǎn)，例如1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)，例如但不限于下面所述氨基酸序列。下面的注釋意思是圖1給出的序列通過(guò)將所示的上腳注位置處的天然氨基酸取代為指明上腳注標(biāo)號(hào)左邊的氨基酸而被修飾了。
Asn30Thr32圖1；Asn51Thr53圖1；Asn57Thr59圖1；Asn69圖1；Asn69Thr71圖1；Ser68Asn69Thr71圖1；Val87Asn88Thr90圖1；Ser87Asn88Thr90圖1；Ser87Asn88Gly89Thr90圖1；Ser87Asn88Thr90Thr92圖1；Ser87Asn88Thr90Ala162圖1；Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90圖1；Asn30Thr32Val87Asn88Thr90圖1；Asn89Ile90Thr91圖1；Ser87Asn89Ile90Thr91圖1；Asn136Thr138圖1；Asn138Thr140圖1；Thr125圖1；和Pro124Thr125圖1。
人促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)也可以是在該糖蛋白的羧基末端具有至少一個(gè)附加的氨基酸的類(lèi)似物，其中所述附加的氨基酸包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)，即所述糖蛋白具有包括人促紅細(xì)胞生成素序列和在人促紅細(xì)胞生成素序列的羧基末端的第二個(gè)序列的序列，其中所述第二個(gè)序列包含至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。
附加的氨基酸可以包括從人絨毛膜促性腺激素的羧基末端衍生的肽片段。優(yōu)選地，所述糖蛋白是選自下面的類(lèi)似物(a)具有從羧基末端延伸的氨基酸序列Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser ArgLeu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln(SEQ ID NO3)的人促紅細(xì)胞生成素；(b)進(jìn)一步包括Ser87Asn88Thr90EPO的(a)中的類(lèi)似物；和(c)進(jìn)一步包括Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO的(a)中的類(lèi)似物。
人促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)也可以是具有包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的重排的氨基酸序列的類(lèi)似物。所述重排可以包括在人促紅細(xì)胞生成素中缺失任何N-連接的糖基位點(diǎn)和在人促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的88位處加入一個(gè)N-連接的糖基位點(diǎn)。優(yōu)選地，所述糖蛋白選自Gln24Ser87Asn88Thr90EPO；Gln38Ser87Asn88Thr90EPO；和Gln83Ser87Asn88Thr90EPO。
1995年3月1日公開(kāi)的Elliot的歐洲專(zhuān)利公開(kāi)No.640619中公開(kāi)了具有附加的糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素類(lèi)似物，該文獻(xiàn)的內(nèi)容在此引入作為參考。
在式1中，R可以是任何低級(jí)烷基，其意思是指具有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基，乙基，異丙基等。優(yōu)選的烷基是甲基。
在式1中，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1至大約10。優(yōu)選地，k是1至大約4，更優(yōu)選地k是1或2。最優(yōu)選地，X是-(CH2)-。
在式1中，Y是 優(yōu)選地，Y是 最優(yōu)選地，Y是 在式1中，選擇m的數(shù)，使得得到的式1的偶聯(lián)物具有可與未修飾的EPO相當(dāng)?shù)纳砘钚?，其活性可以與未修飾的EPO的相應(yīng)的活性相同，或者大于未修飾的EPO的相應(yīng)的活性，或者是未修飾的EPO的相應(yīng)的活性的一部分。m代表PEG單元中環(huán)氧乙烷殘基的數(shù)目。一個(gè)PEG亞基-(OCH2CH2)-具有大約44道爾頓的分子量。因此，偶聯(lián)物的分子量(不包括EPO的分子量)取決于m數(shù)目?！按蠹s”某一數(shù)目的分子量指分子量在通過(guò)常規(guī)分析技術(shù)測(cè)定的數(shù)目的合理范圍內(nèi)。m是大約450至大約900范圍內(nèi)的整數(shù)(相應(yīng)于20-40kDa分子量)，優(yōu)選地，m是大約550至大約800(大約24-35kDa)，最優(yōu)選地，m是大約650至大約700(大約29至大約31kDa)。
在式1中，n數(shù)是通過(guò)酰胺鍵與PEG單元共價(jià)鍵合的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)中賴(lài)氨酸的ε-氨基的數(shù)目。本發(fā)明的偶聯(lián)物每個(gè)EPO分子可以具有一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)PEG單元。n是1-3范圍內(nèi)的整數(shù)，優(yōu)選n是1或2，更優(yōu)選n是1。
優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物由下式代表 其中P，R，X，m和n如上定義。
最優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物由下式代表 其中P，R，X，m和n如上定義。
其它優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物由下式代表 其中P和n如上定義。
最優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物由下式代表 其中P和n如上定義。
優(yōu)選的化合物是其中X是-(CH2)k-的那些化合物，尤其是其中k是1-4的那些化合物，最優(yōu)選其中X是-(CH2)-的那些化合物。
本發(fā)明還涉及其中m是550-800的整數(shù)，優(yōu)選地m是650-700的整數(shù)的上述偶聯(lián)物。
本發(fā)明優(yōu)選的化合物是其中n是1和/或R是甲基的那些化合物。
另外，本發(fā)明涉及其中每個(gè)聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約24千道爾頓至大約35千道爾頓，更優(yōu)選至大約30千道爾頓的上述化合物。
此外，本發(fā)明涉及其中糖蛋白與一個(gè)或兩個(gè)低級(jí)烷氧基封端的聚(乙二醇)部分共價(jià)連接，更優(yōu)選與一個(gè)低級(jí)烷氧基封端的聚(乙二醇)部分共價(jià)連接的化合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚(乙二醇)部分由甲氧基封端。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中X是-(CH2)-，m是650-700的整數(shù)，n是1，R是甲基，并且其中每個(gè)聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約30千道爾頓的上述化合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療人貧血的方法，其包括對(duì)人施用治療有效量的式1代表的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種具有引起骨髓細(xì)胞提高網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的產(chǎn)量的體內(nèi)生物學(xué)活性的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物的制備方法，包括步驟(a)使式P-[NH2]n代表的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸的ε-氨基與式Z-CO-X-S-Q代表的雙功能試劑共價(jià)反應(yīng)，形成式P-[NH-CO-X-S-Q]n代表的具有酰胺鍵的中間體，其中P是缺少形成酰胺鍵的氨基的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)；n是1-3范圍的整數(shù)；Z是反應(yīng)基團(tuán)，例如羧基-NHS酯；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1至大約10；Q是保護(hù)基團(tuán)，象烷?；缫阴；?。(b)使來(lái)自步驟(a)的具有酰胺鍵的該中間體與式W-[OCH2CH2]m-OR代表的活化的聚乙二醇衍生物共價(jià)反應(yīng)，形成下式代表的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物 其中W是Y的巰基反應(yīng)形式；m是大約450至大約900范圍的整數(shù)；R是低級(jí)烷基；Y是 在該實(shí)施方案中，所述雙功能試劑優(yōu)選是N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；蚧狨セ騈-琥珀酰亞胺基-S-乙?；蚧宜狨?，Z優(yōu)選是N-羥基琥珀酰亞胺，活化的聚乙二醇衍生物W-[OCH2CH2]m-OR優(yōu)選選自碘-乙?；?甲氧基-PEG，甲氧基-PEG-乙烯基砜，和甲氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及含有偶聯(lián)物的組合物，所述偶聯(lián)物包括具有至少一個(gè)自由氨基并且具有引起骨髓細(xì)胞提高網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的產(chǎn)量的體內(nèi)生物學(xué)活性的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白，所述促紅細(xì)胞生成素糖蛋白選自人促紅細(xì)胞生成素和具有通過(guò)加入1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)或者通過(guò)至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排而修飾的人促紅細(xì)胞生成素的一級(jí)結(jié)構(gòu)的其類(lèi)似物；所述糖蛋白共價(jià)連接1至3個(gè)低級(jí)烷氧基聚(乙二醇)基團(tuán)，每個(gè)聚(乙二醇)基團(tuán)通過(guò)式-C(O)-X-S-Y-的連接基團(tuán)與糖蛋白共價(jià)連接，該連接基團(tuán)的C(O)與所述氨基中的一個(gè)形成酰胺鍵，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1至10，Y是 每個(gè)聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約20千道爾頓至大約40千道爾頓，偶聯(lián)物的分子量是大約51千道爾頓至大約175千道爾頓，其中n是1的偶聯(lián)物的百分比至少是90％。優(yōu)選地，組合物含有如上定義的偶聯(lián)物，其中n是1的偶聯(lián)物的百分比至少是90％，更優(yōu)選，其中n是1的偶聯(lián)物的百分比至少是92％，甚至更優(yōu)選地，其中n是1的偶聯(lián)物的百分比至少是96％，最優(yōu)選地，其中n是1的偶聯(lián)物的百分比是90％-96％。
此外，本發(fā)明涉及含有如上定義的偶聯(lián)物或組合物和藥學(xué)可接受賦形劑的藥物組合物，涉及如上定義的偶聯(lián)物或組合物在制備用于治療或預(yù)防與慢性腎衰竭患者(DRF)貧血，艾滋病相關(guān)的疾病，和治療接受化療的癌癥患者的藥物中的用途。另外，本發(fā)明涉及預(yù)防和/或治療與慢性腎衰竭患者(DRF)，艾滋病和接受化療的癌癥患者貧血相關(guān)的疾病的方法，包括對(duì)患者施用如上定義的組合物的步驟。
本發(fā)明還涉及制備如上定義偶聯(lián)物或組合物的方法，該方法包括使硫羥基與促紅細(xì)胞生成素糖蛋白共價(jià)連接，并且將得到的活化的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白與聚(乙二醇)(PEG)衍生物偶聯(lián)。另外，本發(fā)明涉及用如上所述的方法制備的如上定義的偶聯(lián)物和組合物，和涉及用于治療與慢性腎衰竭患者(DRF)，艾滋病和接受化療的癌癥患者貧血相關(guān)的疾病的如上定義的偶聯(lián)物和組合物。表達(dá)EPO蛋白質(zhì)的方法促紅細(xì)胞生成素(EPO)是刺激紅細(xì)胞生成的人源糖蛋白。其制備和治療應(yīng)用例如詳細(xì)描述于美國(guó)專(zhuān)利No.5547933和5621080，EP-B0148605，Huang，S.L.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1984)2708-2712，EP-B0205564，EP-B0209539和EP-B0411678以及Lai，P.H.等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)261(1986)3116-3121，Sasaki，H.等生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)262(1987)12059-12076。通過(guò)重組方法可以制備用于治療應(yīng)用的促紅細(xì)胞生成素(EP-B0148605，EP-B0209539和Egrie，J.C.，Strickland，T.W.，Lane，J.等(1986)免疫生物學(xué)(Immunobiol)72213-224)。通過(guò)內(nèi)源基因激活表達(dá)蛋白質(zhì)，包括EPO，是本領(lǐng)域公知的，并且例如公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利Nos.5733761，5641670和5733746，和國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)Nos.WO93/09222，WO94/12650，WO95/31560，WO90/11354，WO91/06667和WO91/09955，每一篇文獻(xiàn)的內(nèi)容在此引入作為參考。
例如在1996年11月14日公開(kāi)的Burg的WO96/35718和在1992年6月12日公開(kāi)的Koch的歐洲專(zhuān)利公開(kāi)No.513738中描述了在無(wú)血清培養(yǎng)基中表達(dá)和制備促紅細(xì)胞生成素的方法。純化人EPO蛋白質(zhì)的方法除了上述參考之外已知可以進(jìn)行包含EPO基因的重組CHO細(xì)胞的無(wú)血清發(fā)酵。這樣的方法描述于例如EP-A0513738，EP-A0267678，并且以Kawamoto，T等，分析生物化學(xué)(Analytical Biochem.)130(1983)445-453，EP-A0248656，Kowar，J.和Franek，F(xiàn).，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)421(1986)277-292，Bavister，B.，Expology271(1981)45-51，EP-A0481791，EP-A0307247，EP-A0343635，WO88/00967描述的一般形式。
在EP-A0267678中，對(duì)于在無(wú)血清培養(yǎng)基中制備的EPO在透析后的純化，描述了在S-Sepharose上進(jìn)行離子交換層析，在C8柱子上進(jìn)行制備反相HPLC和凝膠過(guò)濾層析。與此相關(guān)，可以用在S-Sepharose上快速流過(guò)的離子交換層析代替凝膠過(guò)濾層析步驟。還提議在離子交換層析之前進(jìn)行在Blue Trisacryl柱子上的染料層析。
Nobuo，I.等，生物化學(xué)雜志(J.Biochem)107(1990)352-359描述了重組EPO的純化方法。在該方法中，在純化步驟之前用下面的溶液處理EPOTween20，苯基甲基磺酰氯，乙基馬來(lái)亞酰胺，胃蛋白酶抑制劑A，硫酸銅和草氨酸。
多篇參考如1996年11月14日公開(kāi)的Burg的WO96/35718公開(kāi)了一種在無(wú)血清發(fā)酵方法中制備促紅細(xì)胞生成素的制備方法(EPOsf)。下文舉例解釋了作為聚乙二醇基化作用的起始材料的EPO的制備方法。測(cè)定EPO和EPO偶聯(lián)物的特異活性的生物學(xué)測(cè)試通過(guò)本領(lǐng)域公知的各種測(cè)試可以測(cè)定EPO或根據(jù)本發(fā)明的EPO偶聯(lián)物的特異活性。本發(fā)明的純化的EPO蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性如此，使得通過(guò)注射對(duì)人患者施用EPO蛋白質(zhì)導(dǎo)致與沒(méi)有注射的或?qū)φ战M的受試者相比骨髓細(xì)胞增加網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的產(chǎn)量。通過(guò)根據(jù)Pharm.EuropaSpec.Issue Erythropoietin BRP Bio1997(2)的方法可以檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明獲得的和純化的EPO蛋白質(zhì)或者其片段的生物學(xué)活性。
實(shí)施例4描述了測(cè)定EPO蛋白質(zhì)的另一種生物測(cè)試方法，正常血紅細(xì)胞(normocythaemic)小鼠測(cè)試聚乙二醇基化EPO的制備方法式1代表的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白的制備方法包括使巰基與EPO共價(jià)連接(“活化”)并且使得到的活化的EPO與一種聚(乙二醇)(PEG)衍生物偶聯(lián)。制備根據(jù)本發(fā)明的聚乙二醇化EPO的第一步包括通過(guò)EPO的NH2-基團(tuán)共價(jià)連接巰基。用分別攜帶保護(hù)的巰基和另外的反應(yīng)基團(tuán)例如活化酯(例如琥珀酰亞胺基酯)，酸酐，磺酸酯，羧酸的鹵化物和磺酸的雙功能試劑進(jìn)行EPO的活化。用本領(lǐng)域公知的基團(tuán)例如乙?；Ｗo(hù)巰基。通過(guò)形成酰胺鍵這些雙功能試劑能與賴(lài)氨酸的ζ-氨基反應(yīng)。下面給出了該反應(yīng)的第一步 EPO，n和X如上定義，Z是本領(lǐng)域公知的反應(yīng)基團(tuán)，例如下式的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)取代基 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)與具有琥珀酰亞胺基部分的雙功能試劑反應(yīng)進(jìn)行賴(lài)氨酸的ζ-氨基的活化。所述雙功能試劑可以帶有不同的間隔基團(tuán)，例如-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-部分，其中k是1至大約10，優(yōu)選1至大約4，更優(yōu)選1或2，最優(yōu)選1。這些試劑的例子是N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；蚧狨?SATP)和N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；蚧宜狨?SATA) 乙?；蚧榛?羧酸-NHS-酯，如 2-(乙?；蚧?-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯其中k如上定義。
雙功能試劑的制備是本領(lǐng)域公知的。DE-3924705描述了2-(乙酰基硫基)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯的母體，而March，J.，高等有機(jī)化學(xué)(Advanced Organic Chemistry)，McGraw-Hill，1977，375-376描述了對(duì)乙?；蚧衔锏难苌饔谩ATA可以商業(yè)上購(gòu)得(分子探針(MolecularProbes)，Eugene，OR，USA和Pierce，Rockford，IL)。
通過(guò)判斷反應(yīng)參數(shù)即蛋白質(zhì)(EPO)濃度和蛋白質(zhì)/雙功能試劑之比可以選擇加給EPO分子的巰基數(shù)目。優(yōu)選地，通過(guò)對(duì)每一個(gè)EPO分子共價(jià)連接1-5個(gè)巰基，更優(yōu)選地對(duì)每一個(gè)EPO分子共價(jià)連接1.5-3個(gè)巰基來(lái)活化EPO。這些范圍指巰基對(duì)EPO蛋白質(zhì)總體的統(tǒng)計(jì)學(xué)分布。
例如在pH6.5-8.0的緩沖溶液，例如10mM磷酸鉀，50mM NaCl，pH7.3中進(jìn)行該反應(yīng)?？梢栽贒MSO中加入雙功能試劑。反應(yīng)完全后，優(yōu)選30分鐘后，通過(guò)加入賴(lài)氨酸而中止反應(yīng)。通過(guò)本領(lǐng)域公知方法例如透析或柱過(guò)濾可以分離過(guò)量的雙功能試劑。通過(guò)例如Grasetti，D.R.和Murray，J.F.，應(yīng)用生物化學(xué).生物技術(shù)雜志(J.Appl.Biochem.Biotechnol)119，41-49(1967)中描述的光度法可以測(cè)定加給EPO的巰基的平均數(shù)。
上述反應(yīng)之后共價(jià)連接活化的聚乙二醇(PEG)衍生物。合適的PEG衍生物是具有大約20至大約40kDa，更優(yōu)選大約24至大約35kDa，最優(yōu)選大約30kDa平均分子量的活化PEG分子。
活化的PEG衍生物是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如Morpurgo，M.等，生物偶聯(lián)化學(xué)雜志(J.Bioconj，Chem.)(1996)Z，p.363，關(guān)于PEG-乙基砜。直鏈或支鏈PEG物質(zhì)適合制備式1的化合物。反應(yīng)PEG試劑的例子是碘-乙酰基-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯基砜 這些碘活化物質(zhì)的應(yīng)用是本領(lǐng)域已知的，并且描述于Hermanson，G.T.，生物偶聯(lián)技術(shù)(Bioconjugate Techniques)，Academic Press，San Diego(1996)p.147-148。
最優(yōu)選地，使用(烷氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺)，例如甲氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺，活化PEG物質(zhì)(MW30000；Shearwater Polymers，Inc.)。烷氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺的結(jié)構(gòu)如下 其中R和m如上定義。
最優(yōu)選的衍生物是 其中R和m如上定義。
在緩沖水溶液例如10mM磷酸鉀，50mM NaCl，2mM EDTA，pH6.2中，在巰基保護(hù)基原位裂解之后進(jìn)行與烷氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺的偶聯(lián)反應(yīng)。例如25℃下用DMSO中的羥胺，pH6.2反應(yīng)大約90分鐘可以進(jìn)行保護(hù)基團(tuán)的裂解。對(duì)于PEG修飾，活化的EPO/烷氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺摩爾比應(yīng)該是大約1∶3至大約1∶6，優(yōu)選地1∶4。通過(guò)加入半胱氨酸并且使殘留的巰基(-SH)與N-甲基馬來(lái)酰亞胺或者能形成二硫鍵的其它合適的化合物可以中止反應(yīng)。因?yàn)樗械臍埩舻幕罨瘞€基與保護(hù)基團(tuán)例如N-甲基馬來(lái)酰亞胺或者其它合適的保護(hù)基團(tuán)反應(yīng)，所以本發(fā)明的偶聯(lián)物中的EPO糖蛋白可以含有這樣的保護(hù)基團(tuán)。一般情況下，這里描述的方法將產(chǎn)生具有不同數(shù)目的保護(hù)基保護(hù)的不同數(shù)目的巰基的分子的混合物，取決于沒(méi)有與PEG-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的糖蛋白上的活化的巰基的數(shù)目。
當(dāng)用來(lái)封閉聚乙二醇化蛋白質(zhì)上的殘留巰基時(shí)N-甲基馬來(lái)酰亞胺形成相同類(lèi)型的共價(jià)鍵，而二硫化合物將導(dǎo)致分子內(nèi)硫化/二硫化交換反應(yīng)，形成封閉劑二硫橋偶聯(lián)。該封閉反應(yīng)類(lèi)型的優(yōu)選的封閉劑是氧化的谷胱甘肽(GSSG)，半胱氨酸和胱胺。使用半胱氨酸時(shí)，沒(méi)有另外的靜電荷引入到聚乙二醇化蛋白質(zhì)之中，而使用封閉劑GSSG或胱胺則導(dǎo)致另外的負(fù)電荷或正電荷。
通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法，例如柱色譜法，可以對(duì)式1的化合物進(jìn)行進(jìn)一步純化，包括分離一-，二和三-聚乙二醇化EPO物質(zhì)。藥物組合物根據(jù)本發(fā)明制備的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法用藥學(xué)可接受載體或賦形劑制成適合注射的藥物組合物。例如，合適的組合物公開(kāi)于WO97/09996，WO97/40850，WO98/58660和WO99/07401。用于配制本發(fā)明的產(chǎn)物的優(yōu)選的藥學(xué)可接受載體是人血清白蛋白，人血漿蛋白質(zhì)等。本發(fā)明的化合物可以在含有等張劑例如132mM氯化鈉的10mM磷酸鈉/鉀緩沖液pH7中配制。任選地，藥物組合物可以含有防腐劑。藥物組合物可以含有不同量的促紅細(xì)胞生成素，例如10-1000微克/毫升，例如50微克或400微克。治療特征在于紅細(xì)胞產(chǎn)量低或缺乏的血液病使用本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物，導(dǎo)致在人體中生成紅細(xì)胞。因此，施用促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物以補(bǔ)充在紅細(xì)胞的產(chǎn)生中非常重要的該EPO蛋白質(zhì)?？梢耘渲坪写偌t細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物的藥物組合物，以非常有效地通過(guò)各種方法對(duì)患有特征在于紅細(xì)胞產(chǎn)量低或缺乏的血液病(或者是單一癥狀或疾病或者是部分癥狀或疾病)的人患者施藥。通過(guò)注射例如皮下或靜脈內(nèi)注射可以施用藥物組合物。促紅細(xì)胞生成素糖蛋白產(chǎn)物的平均量可以不同，并且特別應(yīng)該以有資格的醫(yī)生的建議和藥方為基礎(chǔ)。該偶聯(lián)物的精確量是要治療的癥狀的準(zhǔn)確類(lèi)型，要治療的患者的狀況，以及組合物中其它成分這樣的因素的優(yōu)選主題。例如，可以施用0.01-10微克/千克體重，優(yōu)選地0.1-1微克/千克體重，例如每星期給藥一次。
本申請(qǐng)始終參考很多公開(kāi)出版物。為了更完全描述本領(lǐng)域背景，這些公開(kāi)出版物所公開(kāi)的內(nèi)容在這里引作參考。
通過(guò)下面的實(shí)施例更詳細(xì)描述本發(fā)明，這些實(shí)施例只是證明目的而不是限制本發(fā)明的化合物的制備和本發(fā)明的組合物。
實(shí)施例實(shí)施例1人EPO的發(fā)酵和純化a)種菌制備和發(fā)酵從液氮貯存器的氣相中取出源自產(chǎn)生EPO的CHO細(xì)胞系(可以使用ATCC CRL8695，公開(kāi)于EP411678(遺傳研究所)(Genetics Institute))的工作細(xì)胞庫(kù)的一個(gè)小瓶。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到玻璃旋轉(zhuǎn)瓶中，并且在濕潤(rùn)的CO2培養(yǎng)箱中在碳酸氫鹽緩沖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。1992年6月12日公開(kāi)的Koch的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)513738或者1996年11月14日公開(kāi)的Burg的WO96/35718中公開(kāi)了用于種菌制備和發(fā)酵的典型的無(wú)血清培養(yǎng)基，例如含有培養(yǎng)基DMEM/F12(例如JRH Biosciences/Hazleton Biologics，Denver，US，序號(hào)57-736)和另外的碳酸氫鈉，L+谷氨酰胺，D+葡萄糖，重組胰島素，亞硒酸鈉，二氨基丁烷，氫化可的松，硫酸亞鐵(II)，天冬酰胺，天冬氨酸，絲氨酸和用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定劑例如聚乙烯醇，甲基纖維素，葡聚糖，聚乙二醇，Pluronic F68，血漿擴(kuò)張劑polygelin(HEMACCEL)或聚乙烯吡咯烷酮(WO96/35718)的培養(yǎng)基。
對(duì)培養(yǎng)物顯微鏡檢查是否存在污染的微生物，并且測(cè)定細(xì)胞密度。在每一個(gè)分裂步驟進(jìn)行這種檢測(cè)。
初始生長(zhǎng)期后，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋至起始細(xì)胞密度并且進(jìn)行另一個(gè)生長(zhǎng)周期。重復(fù)該過(guò)程，直到每個(gè)玻璃旋轉(zhuǎn)瓶獲得大約2升體積的培養(yǎng)物。大約12次倍增之后，獲得1-5升該培養(yǎng)物，其然后用作10升接種發(fā)酵罐的種菌。
3-5天之后，10升發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物可以用作100升接種發(fā)酵罐的種菌。
再培養(yǎng)3-5天之后，100升發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物可以用作1000升接種發(fā)酵罐的種菌。b)收獲和細(xì)胞分離采用批量反復(fù)進(jìn)料方法，即當(dāng)達(dá)到期望的細(xì)胞密度時(shí)，收集大約80％的培養(yǎng)物。用新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充殘留的培養(yǎng)物并且培養(yǎng)直到再次收集。一次生產(chǎn)周期包括最多10次順序收集9次部分收集和1次發(fā)酵最后總收集。每3-4天進(jìn)行收集。
將測(cè)定過(guò)的體積轉(zhuǎn)移到冷卻容器中。離心或過(guò)濾分離細(xì)胞并棄除。該離心步驟的含有上清液的EPO線內(nèi)過(guò)濾并且收集到第二個(gè)冷卻容器中。在純化過(guò)程每一次收集分開(kāi)進(jìn)行。
在1996年11月14日公開(kāi)的Burg的WO96/35718中公開(kāi)了EPO-蛋白質(zhì)的典型純化方法。下面舉例說(shuō)明該純化方法。a)藍(lán)瓊脂糖凝膠層析藍(lán)瓊脂糖(Pharmacia)由表面共價(jià)鍵合Cibacron藍(lán)染料的瓊脂糖小球組成。因?yàn)榕c大多數(shù)非蛋白質(zhì)污染物(一些蛋白質(zhì)雜質(zhì)和PVA)相比，EPO更強(qiáng)地結(jié)合藍(lán)瓊脂糖，因此在該步驟中可以富集EPO。通過(guò)逐步提高鹽濃度和pH值進(jìn)行藍(lán)瓊脂糖柱的洗脫。
將用氫氧化鈉再生并且用平衡緩沖液(氯化鈉/鈣和乙酸鈉)平衡過(guò)的80-100升藍(lán)瓊脂糖裝入柱子。裝入酸化的和過(guò)濾過(guò)的發(fā)酵罐上清液。上樣完之后，首先用與平衡緩沖液類(lèi)似的含有更高濃度的氯化鈉的緩沖液沖洗柱子，并且連續(xù)用Tris-堿緩沖液沖洗。用Tris-堿緩沖液洗脫產(chǎn)物，并且根據(jù)總洗脫曲線一個(gè)一個(gè)級(jí)分收集。b)丁基Toyopearl層析丁基Toyopearl 650C(TosoHaas)是共價(jià)偶聯(lián)了脂肪族丁基殘基的聚苯乙烯基體。因?yàn)榕c大多數(shù)雜質(zhì)和PVA相比EPO更強(qiáng)地結(jié)合該凝膠，所以用含有異丙醇的緩沖液洗脫。
將用氫氧化鈉再生，用Tris-堿緩沖液洗滌并且用含有異丙醇的Tris-堿緩沖液平衡過(guò)的30-40升丁基Toyopearl 650C裝入柱子。
將藍(lán)瓊脂糖洗脫液調(diào)節(jié)至柱平衡緩沖液中的異丙醇的濃度并且裝載到柱子上。然后用具有提高的異丙醇濃度的平衡緩沖液沖洗柱子。用洗脫緩沖液(具有高異丙醇含量的Tris-堿緩沖液)洗脫產(chǎn)物并且根據(jù)總洗脫曲線一個(gè)一個(gè)級(jí)分收集。c)羥基磷灰石超凝膠(Ultrogel)層析羥基磷灰石超凝膠(Biosepra)由在瓊脂糖基體中摻入以提高機(jī)械性能的羥基磷灰石組成。EPO對(duì)羥基磷灰石具有低的親合力，因此與蛋白質(zhì)雜質(zhì)相比可以以更低的磷酸鹽濃度洗脫出來(lái)。
將用磷酸鉀/氯化鈣緩沖液和氫氧化鈉之后用Tris-堿緩沖液再生的30-40升羥基磷灰石超凝膠裝入柱子。然后用含有低含量異丙醇和氯化鈉的Tris-堿緩沖液平衡。
將含有丁基Toyopearl層析洗脫液的EPO裝載到柱子上。然后用平衡緩沖液和沒(méi)有異丙醇與氯化鈉的Tris-堿緩沖液沖洗柱子。用含有低濃度磷酸鉀的Tris-堿緩沖液洗脫產(chǎn)物并且根據(jù)總洗脫曲線一個(gè)一個(gè)級(jí)分收集。d)在多孔層實(shí)心球C4上的反相HPLCRP-HPLC材料多孔層實(shí)心球C4(Vydac)由表面帶有C4-烷基鏈的二氧化硅凝膠顆粒組成。從蛋白質(zhì)雜質(zhì)分離EPO是以疏水性相互作用的強(qiáng)度的不同為基礎(chǔ)。用在稀釋的三氟乙酸中的乙腈梯度進(jìn)行洗脫。
使用不銹鋼柱子(裝入了2.8-3.2升VydacC4二氧化硅凝膠)進(jìn)行制備HPLC。通過(guò)加入三氟乙酸來(lái)酸化羥基磷灰石超凝膠洗脫液，并且裝載到VydacC4柱子上。使用在稀釋的三氟乙酸中的乙腈梯度進(jìn)行洗滌和洗脫。收集級(jí)分并且立即用磷酸鹽緩沖液中和。集中IPC限制內(nèi)的EPO級(jí)分。e)DEAE瓊脂糖層析DEAE瓊脂糖(Pharmacia)材料由二乙基氨基乙基(DEAE)組成-基團(tuán)在瓊脂糖小球表面共價(jià)鍵合。離子相互作用介導(dǎo)EPO與DEAE基團(tuán)的結(jié)合。乙基和三氟乙酸通過(guò)柱子沒(méi)有保留。將這些物質(zhì)洗出之后，通過(guò)用低pH的乙酸鹽緩沖液沖洗柱子來(lái)去除痕量雜質(zhì)。然后用中性磷酸鹽緩沖液沖洗柱子，并且用提高的離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫EPO。
用DEAE瓊脂糖高流速裝填柱子。調(diào)節(jié)柱體積以保證以3-10毫克EPO/毫升凝膠范圍裝載EPO。用水和平衡緩沖液(磷酸鈉/鉀)沖洗柱子。加載HPLC洗脫液的合并的級(jí)分并且用平衡緩沖液沖洗柱子。然后用沖洗緩沖液(乙酸鈉緩沖液)沖洗柱子，接著用平衡緩沖液沖洗柱子。接著，用洗脫緩沖液(氯化鈉，磷酸鈉/鉀)從柱子上洗脫EPO，并且根據(jù)總洗脫曲線一個(gè)一個(gè)級(jí)分收集。
將DEAE瓊脂糖柱子的洗脫液調(diào)節(jié)具有具體的導(dǎo)電率。將得到的藥物物質(zhì)滅菌過(guò)濾到聚四氟乙烯瓶中并且在-70℃下貯存。
實(shí)施例2巰基與EPO共價(jià)連接該實(shí)施例公開(kāi)了巰基與EPO共價(jià)連接的反應(yīng)條件的確定。為了確定反應(yīng)條件，向EPO溶液，這里向1毫升10mM磷酸鉀，50mM氯化鈉，pH7.3中的5毫克/毫升EPO，加入不同量的含有保護(hù)的巰基的試劑，這里是SATA或SATP(溶解于DMSO，ad 10毫克/毫升)。將反應(yīng)攪拌大約30分鐘(25℃)，并且通過(guò)加入1M賴(lài)氨酸溶液(10mM)中止反應(yīng)。通過(guò)用10mM磷酸鉀，50mM氯化鈉和2mM EDTA，pH6.2透析去除過(guò)量的SATA和SATP。用羥胺去除保護(hù)的乙?；?，根據(jù)Grasetti，D.R.和Murray，J.F.在生物化學(xué).生物技術(shù)應(yīng)用雜志(J.Appl.Biochem.Biotechnol.)中描述的方法用二硫基二吡啶光度法測(cè)定與EPO共價(jià)連接的巰基的數(shù)目。
下面給出每個(gè)EPO分子共價(jià)連接的巰基的數(shù)目。
實(shí)施例3用甲氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺修飾活化的EPOA)EPO的活化根據(jù)實(shí)施例2用SATA(摩爾比EPO/SATA＝1/5)活化根據(jù)實(shí)施例1制備的100毫克EPO(正常血紅細(xì)胞(normocythaemic)小鼠測(cè)試測(cè)定為190000 IU/毫克)。如實(shí)施例1所述通過(guò)透析從副產(chǎn)物象N-羥基-琥珀酰亞胺或沒(méi)有反應(yīng)的SATA分離攜帶共價(jià)連接的保護(hù)的巰基的產(chǎn)物EPO(“活化EPO”)。獲得10mM磷酸鉀，50mM氯化鈉和2mM EDTA，pH6.2中4.5毫克/毫升活化EPO溶液。B)活化EPO的聚乙二醇化作用。
將380毫克具有上述“最優(yōu)選的”結(jié)構(gòu)的甲氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺(MW30000；Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville(Alabama，USA))溶解于含有95毫克活化EPO(4.5毫克/毫升，于10mM磷酸鉀，50mM氯化鈉和2mM EDTA，pH6.2中的上述溶液中)?；罨疎PO與甲氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺之間最終摩爾比是1∶4。通過(guò)向上述溶液加入1M羥胺水溶液(ad 30mM，pH6.2)，將活化EPO的共價(jià)連接的保護(hù)的巰基去保護(hù)。該溶液的反應(yīng)混合物中得到的活化EPO包含自由巰基(-SH)。巰基去保護(hù)之后立即進(jìn)行現(xiàn)在包含自由巰基(-SH)的活化EPO和甲氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺之間的偶聯(lián)反應(yīng)90分鐘(攪拌，25℃)。通過(guò)向反應(yīng)混合物中加入0.2M 2mM半胱氨酸水溶液中止偶聯(lián)反應(yīng)。30分鐘之后，通過(guò)加入DMSO中的0.5M N-甲基馬來(lái)酰亞胺達(dá)到5mM的濃度保護(hù)沒(méi)有與甲氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)的活化EPO的過(guò)量的自由巰基。30分鐘之后，用10mM磷酸鉀，pH7.5將現(xiàn)在含有聚乙二醇化EPO物質(zhì)所得到的反應(yīng)混合物透析≥15小時(shí)。C)聚乙二醇化EPO物質(zhì)的純化關(guān)于從反應(yīng)混合物分離聚乙二醇化EPO物質(zhì)，進(jìn)行下面的純化方法用10mM磷酸鉀，pH7.5平衡50毫升Q-瓊脂糖ff柱。將步驟B)獲得的反應(yīng)混合物加載到柱子上(流速每小時(shí)3柱體積(CV))。為了分離沒(méi)有反應(yīng)的甲氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺試劑，用5CV的10mM磷酸鉀，pH7.5沖洗柱子。以每小時(shí)3CV的流速，用由5CV的緩沖液A(10mM磷酸鉀，pH7.5)和5CV的緩沖液B(10mM磷酸鉀，500mM氯化鈉，pH7.5)組成的漸增鹽梯度洗脫，分離聚乙二醇化EPO物質(zhì)。根據(jù)氯化鈉梯度，首先洗脫出聚乙二醇化EPO物質(zhì)(三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物質(zhì))，接著洗脫出沒(méi)有聚乙二醇化EPO物質(zhì)。集中含有聚乙二醇化EPO物質(zhì)(三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物質(zhì))的洗脫液級(jí)分，并且過(guò)濾(用0.2微米過(guò)濾器滅菌過(guò)濾)。
在考馬斯染色的SDS-PAA凝膠(Laemmli，自然(Nature)227，680-685(1970))上評(píng)價(jià)三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物質(zhì)的內(nèi)含物和純度，同時(shí)根據(jù)Beer-Lambert定律在280nm處測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)SDS-PAA凝膠電泳測(cè)定的EPO物質(zhì)的表觀分子量是大約68千道爾頓(一-聚乙二醇化EPO物質(zhì))，大約98千道爾頓(二-聚乙二醇化EPO物質(zhì))，和大約128千道爾頓(三-聚乙二醇化EPO物質(zhì))。
通過(guò)層析法，例如通過(guò)大小排阻層析(Superdex，pg200；Pharmacia)，可以實(shí)現(xiàn)三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物質(zhì)的進(jìn)一步分離。
通過(guò)實(shí)施例4描述的方法進(jìn)行含有三-，二-和一-聚乙二醇化EPO物質(zhì)的洗脫液的體內(nèi)生物學(xué)活性的測(cè)定。
實(shí)施例4通過(guò)正常血紅細(xì)胞(normocythaemic)小鼠測(cè)試測(cè)定聚乙二醇化EPO的體內(nèi)活性正常血紅細(xì)胞(normocythaemic)小鼠生物測(cè)試是本領(lǐng)域公知的(Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio1997(2))，并且Ph.Eur.BRP的促紅細(xì)胞生成素的專(zhuān)題論文公開(kāi)了一種方法。用BSA-PBS稀釋樣品。對(duì)7-15周齡的正常健康小鼠皮下施用0.2毫升含有如實(shí)施例2所述三-，二-和一-聚乙二醇化EPO的EPO級(jí)分。自給藥后72小時(shí)起過(guò)4天，通過(guò)穿刺術(shù)從尾靜脈抽血并且稀釋?zhuān)沟?毫升0.15微摩爾吖啶橙染色溶液中存在1微升血樣。染色時(shí)間是3-10分鐘。在流式細(xì)胞儀中通過(guò)分析紅熒光直方圖顯微熒光法進(jìn)行網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。以獨(dú)立圖表給出網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(每30000分析的紅細(xì)胞)。對(duì)于給出的數(shù)據(jù)，每個(gè)組包括每天5只小鼠，小鼠只抽血一次。
對(duì)小鼠施用根據(jù)實(shí)施例3的與EPO偶聯(lián)的甲氧基-PEG-馬來(lái)酰亞胺，未修飾的EPO和緩沖液。圖3給出了結(jié)果。通過(guò)對(duì)每只小鼠使用同劑量的明顯增加量的網(wǎng)織紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞最大量的位移表征，結(jié)果表明聚乙二醇化EPO物質(zhì)的卓越活性和延長(zhǎng)的半壽期。
序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司<120>促紅細(xì)胞生成素與聚乙二醇的偶聯(lián)物<130>PC01520<160>3<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>165<212>PRT<213>人<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp165<210>2<211>166<212>PRT<213>人<400>2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>3<211>28<212>PRT<213>人<400>3Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg1 5 10 15Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln20 2權(quán)利要求
1.一種偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包括具有至少一個(gè)自由氨基的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白，并且所述促紅細(xì)胞生成素糖蛋白具有引起骨髓細(xì)胞提高網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞產(chǎn)量的體內(nèi)生物學(xué)活性，所述促紅細(xì)胞生成素糖蛋白選自人促紅細(xì)胞生成素和具有通過(guò)加入1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)或者通過(guò)至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的重排而修飾的人促紅細(xì)胞生成素的一級(jí)結(jié)構(gòu)的其類(lèi)似物；所述糖蛋白共價(jià)連接1至3個(gè)低級(jí)烷氧基聚(乙二醇)基團(tuán)，每個(gè)聚(乙二醇)基團(tuán)通過(guò)式-C(O)-X-S-Y-的連接基團(tuán)與糖蛋白共價(jià)連接，該連接基團(tuán)的C(O)與所述氨基中的一個(gè)形成酰胺鍵，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1至10，Y是 每個(gè)聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約20千道爾頓至大約40千道爾頓，偶聯(lián)物的分子量是大約51千道爾頓至大約175千道爾頓。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，具有下式結(jié)構(gòu)P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n其中X和Y如權(quán)利要求1定義，m是450-900，n是1-3，R是低級(jí)烷基，P是缺少能與X形成酰胺鍵的一個(gè)或多個(gè)氨基的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白。
3.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，具有下式結(jié)構(gòu) 其中P，R，X，m和n如權(quán)利要求2定義。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的偶聯(lián)物，具有下式 其中P，R，X，m和n如權(quán)利要求2定義。
5.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中X是-(CH2)k-。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的偶聯(lián)物，其中k是1-4。
7.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中X是-CH2-。
8.前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中m是550-800的整數(shù)。
9.前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中m是650-700的整數(shù)。
10.前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中n是1。
11.前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中R是甲基。
12.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中每個(gè)聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約24千道爾頓至大約35千道爾頓。
13.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中每個(gè)聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約30千道爾頓。
14.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中糖蛋白與一個(gè)或兩個(gè)低級(jí)烷基封端的聚(乙二醇)部分共價(jià)連接。
15.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中聚(乙二醇)部分由甲氧基封端。
16.前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中X是-CH2-，m是650-700的整數(shù)，n是1，R是甲基，并且其中每個(gè)聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約30千道爾頓。
17.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中促紅細(xì)胞生成素糖蛋白是人促紅細(xì)胞生成素。
18.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中促紅細(xì)胞生成素糖蛋白通過(guò)內(nèi)源基因激活表達(dá)。
19.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中促紅細(xì)胞生成素糖蛋白具有圖1(SEQ ID NO1)或圖2(SEQ ID NO2)列出的序列。
20.權(quán)利要求19的偶聯(lián)物，其中促紅細(xì)胞生成素糖蛋白具有圖1(SEQ ID NO1)列出的序列。
21.根據(jù)任一項(xiàng)權(quán)利要求1-16的偶聯(lián)物，其中糖蛋白具有通過(guò)加入1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)而修飾的人促紅細(xì)胞生成素的序列。
22.根據(jù)任一項(xiàng)權(quán)利要求1-6，8和10的偶聯(lián)物，其中糖蛋白具有通過(guò)選自下面的修飾而進(jìn)行修飾的人促紅細(xì)胞生成素的序列Asn30Thr32；Asn51Thr53；Asn57Thr59；Asn69；Asn69Thr71；Ser68Asn69Thr71；Val87Asn88Thr90；Ser87Asn88Thr90；Ser87Asn88Gly89Thr90；Ser87Asn88Thr90Thr92；Ser87Asn88Thr90Ala162；Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90；Asn30Thr32Val87Asn88Thr90；Asn89Ile90Thr91；Ser87Asn89Ile90Thr91；Asn136Thr138；Asn138Thr140；Thr125；和Pro124Thr125。
23.根據(jù)前面任一項(xiàng)權(quán)利要求的偶聯(lián)物，其中糖蛋白具有包括人促紅細(xì)胞生成素的序列和處于人促紅細(xì)胞生成素的序列的羧基末端的第二序列的序列，其中所述第二序列包含至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的偶聯(lián)物，其中所述第二序列包括從人絨毛膜促性腺激素的羧基末端序列衍生的序列。
25.權(quán)利要求24的偶聯(lián)物，其中糖蛋白具有選自下面的序列(a)具有從羧基末端延伸的氨基酸序列Ser Ser Ser Ser Lys Ala ProPro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile LeuPro Gln(SEQ ID NO3)的人促紅細(xì)胞生成素；(b)Ser87Asn88Thr90修飾的(a)中的序列；和(c)Asn30Thr32Val87Asn88Thr90修飾的(a)中的序列。
26.根據(jù)任一項(xiàng)權(quán)利要求1-16的偶聯(lián)物，其中糖蛋白具有通過(guò)至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排而修飾的人促紅細(xì)胞生成素的序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中重排包括人促紅細(xì)胞生成素中任何N-連接的糖基位點(diǎn)的缺失和人促紅細(xì)胞生成素的序列的88位處N-連接的糖基位點(diǎn)的加入。
28.權(quán)利要求14的偶聯(lián)物，其中糖蛋白具有通過(guò)選自下面的修飾而修飾的人促紅細(xì)胞生成素的序列Gln24Ser87Asn88Thr90EPO；Gln38Ser87Asn88Thr90EPO；和Gln83Ser87Asn88Thr90EPO。
29.一種含有偶聯(lián)物的組合物，所述偶聯(lián)物的每一種包括具有至少一個(gè)自由氨基的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白，并且所述促紅細(xì)胞生成素糖蛋白具有引起骨髓細(xì)胞提高網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的產(chǎn)量的體內(nèi)生物學(xué)活性，所述促紅細(xì)胞生成素糖蛋白選自人促紅細(xì)胞生成素和具有通過(guò)加入1-6個(gè)糖基化位點(diǎn)或者通過(guò)至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的重排而修飾的人促紅細(xì)胞生成素的一級(jí)結(jié)構(gòu)的其類(lèi)似物；所述糖蛋白共價(jià)連接1至3個(gè)低級(jí)烷氧基聚(乙二醇)基團(tuán)，每個(gè)聚(乙二醇)基團(tuán)通過(guò)式-C(O)-X-S-Y-的連接基團(tuán)與糖蛋白共價(jià)連接，該連接基團(tuán)的C(O)與所述氨基中的一個(gè)形成酰胺鍵，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1至10，Y是 每個(gè)聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約20千道爾頓至大約40千道爾頓，偶聯(lián)物的分子量是大約51千道爾頓至大約175千道爾頓；其中n是1的偶聯(lián)物的百分比至少是90％。
30.含有任一項(xiàng)權(quán)利要求1-27定義的偶聯(lián)物的組合物，其中n是1的偶聯(lián)物的百分比至少是90％。
31.根據(jù)權(quán)利要求28或29的組合物，其中n是1的偶聯(lián)物的百分比至少是92％。
32.權(quán)利要求30的組合物，其中n是1的偶聯(lián)物的百分比至少是96％。
33.權(quán)利要求29或32的組合物，其中n是1的偶聯(lián)物的百分比是90％-96％。
34.含有根據(jù)任一項(xiàng)權(quán)利要求1-33的偶聯(lián)物或組合物和藥學(xué)可接受的賦形劑的藥物組合物。
35.根據(jù)任一項(xiàng)權(quán)利要求1-33的偶聯(lián)物或組合物在制備用于治療或預(yù)防與慢性腎衰竭患者(CRF)貧血相關(guān)的疾病、艾滋病和用于治療接受化療的癌癥患者的藥物中的應(yīng)用。
36.一種預(yù)防和/或治療涉及慢性腎衰竭(CRF)患者、艾滋病和接受化療的癌癥患者的貧血的疾病的方法，包括對(duì)患者施用權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物或組合物的步驟。
37.一種根據(jù)任一項(xiàng)權(quán)利要求1-33的偶聯(lián)物或組合物的制備方法，該方法包括使巰基與促紅細(xì)胞生成素糖蛋白共價(jià)連接并且使得到的活化的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白與聚(乙二醇)(PEG)衍生物偶聯(lián)。
38.通過(guò)權(quán)利要求36的方法制備的根據(jù)任一項(xiàng)權(quán)利要求1-33的偶聯(lián)物或組合物。
39.用于治療慢性腎衰竭(CRF)患者、艾滋病和接受化療的癌癥患者的與貧血相關(guān)的疾病的根據(jù)任一項(xiàng)權(quán)利要求1-33的偶聯(lián)物或組合物。
40.基本上如本文描述的新的化合物，制備步驟和方法以及這些化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了促紅細(xì)胞生成素糖蛋白偶聯(lián)物,所述偶聯(lián)物包括具有至少一個(gè)自由氨基的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白,并且所述促紅細(xì)胞生成素糖蛋白具有引起骨髓細(xì)胞提高網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的產(chǎn)量的體內(nèi)生物學(xué)活性,所述促紅細(xì)胞生成素糖蛋白選自人促紅細(xì)胞生成素和具有通過(guò)加入1－6個(gè)糖基化位點(diǎn)或者通過(guò)至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排而修飾的人促紅細(xì)胞生成素的一級(jí)結(jié)構(gòu)的其類(lèi)似物;所述糖蛋白共價(jià)連接1至3個(gè)低級(jí)烷氧基聚(乙二醇)基團(tuán),每個(gè)聚(乙二醇)基團(tuán)通過(guò)式－C(O)－X－S－Y－的連接基團(tuán)與糖蛋白共價(jià)連接,該連接基團(tuán)的C(O)與所述氨基中的一個(gè)形成酰胺鍵,其中X和Y如在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中的定義,每個(gè)聚(乙二醇)部分的平均分子量是大約20千道爾頓至大約40千道爾頓,偶聯(lián)物的分子量是大約51千道爾頓至大約175千道爾頓。
文檔編號(hào)A61P13/12GK1359392SQ00809895
公開(kāi)日2002年7月17日 申請(qǐng)日期2000年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月2日
發(fā)明者約瑟夫·布爾格, 貝恩德·希爾格, 漢斯-彼得·約澤爾 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司