專利名稱：假單胞菌素n－酰基側(cè)鏈類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及假單胞菌素(pseudomycin)化合物，尤其是具有新N-酰基側(cè)鏈的半合成的假單胞菌素化合物。
背景技術(shù)：
假單胞菌素是從丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae，與植物有關(guān)的細(xì)菌)的液體培養(yǎng)物中分離的天然產(chǎn)物，并且已顯示具有抗真菌活性。(例如參見，Harrison，L.等，“假單孢菌素，一族得自丁香假單胞菌的具有廣譜抗真菌活性的新肽” J.Gen.Microbiology，137(12)，2857-65(1991)以及美國(guó)專利US5,576,298和5,837,685)。與前面所述得自丁香假單胞菌的抗霉菌劑(例如丁香霉素、丁香假單胞菌毒素和丁香假單胞菌抑制素)不同，假單胞菌素A-C含有羥基天冬氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、脫氫氨基丁酸、賴氨酸和二氨基丁酸。假單胞菌素A、A’、B、B’、C、C’的肽部分相應(yīng)于具有末端羧基的L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl)，該羧基在N-末端Ser的OH上將大環(huán)閉合。這些類似物是通過N-?；鶄?cè)鏈加以區(qū)別的，即假單胞菌素A是被3，4-二羥基十四烷酰基N-?；模賳伟谹’是被3，4-二羥基十五烷酰基N-?；?，假單胞菌素B是被3-羥基十四烷酰基N-?；?，假單胞菌素B’是被3-羥基十二烷?；鵑-?；模賳伟谻是被3，4-二羥基十六烷酰基N-?；?，以及假單胞菌素C’是被3-羥基十六烷酰基N-?；摹?例如參見Ballio，A.，等人，“得自丁香假單胞菌的生物活性脂縮肽假單孢菌素，”FEBS Letters，355(1)，96-100，(1994)和Coiro，V.M.，等人，“使用得自NMR數(shù)據(jù)的幾何位距和分子動(dòng)力學(xué)通過計(jì)算機(jī)模擬確定的丁香假單胞菌MSU 16H植物毒性脂縮肽假霉素A的溶液構(gòu)象，”Eur.J.Biochem.，257(2)，449-456(1998))。
已知假單胞菌素具有一定的生物副作用。例如，當(dāng)假單胞菌素經(jīng)靜脈內(nèi)給藥時(shí)，已觀察到靜脈內(nèi)皮破壞、組織破壞、發(fā)炎和宿主組織的局部毒性。因此，需要從這類化合物中鑒別出對(duì)治療真菌感染有用而沒有目前觀察到的副作用的化合物。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了用作抗真菌劑或者用于抗真菌劑設(shè)計(jì)的下面結(jié)構(gòu)式所表示的假單胞菌素化合物、其可藥用的鹽及其溶劑化物， 其中R是 其中Ra和Ra′獨(dú)立地是氫或甲基，或者Ra或Ra′是烷基氨基，與Rb或Rb′一起形成6-元環(huán)烷基環(huán)、6-元芳族環(huán)或雙鍵，或者與Rc一起形成6-元芳族環(huán)；Rb和Rb′獨(dú)立地是氫、鹵素或甲基，或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基或羥基，條件是當(dāng)Ra、Rb、Rd、Re為氫、Rc為氫且Rf為正己基、正辛基或正癸基，或者Ra、Rb、Rd、Re為氫、Rc為羥基且Rf為正辛基、正壬基或正癸基時(shí)，Rb’不是羥基；Rc是氫、羥基、C1-C4烷氧基、羥基烷氧基、或者與Re一起形成6-元芳族環(huán)或C5-C6環(huán)烷基環(huán)；Re是氫，或者與Rf一起形成6-元芳族環(huán)、C5-C14烷氧基取代的6-元芳族環(huán)、或者C5-C14烷基取代的6-元芳族環(huán)，和Rf是C8-C18烷基，或C5-C11烷氧基；或R是 其中Rg是氫或C1-C13烷基，并且Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、或-(CH2)n-(C5-C6環(huán)烷基)，其中n＝1或2；或者R是 其中Ri是氫、鹵素、或C5-C8烷氧基，而且m是1、2或3；R是 其中Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基并且p＝0、1或2；R是 其中Rk是C5-C14烷氧基，或者R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm是氫、-CH3或-C(O)CH3。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了一種藥用制劑，它包括上述結(jié)構(gòu)I代表的假單胞菌素化合物和可藥用的載體。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供了一種在需要治療的動(dòng)物中治療抗真菌感染的方法，該方法包括給所述動(dòng)物施用上述的假單胞菌素化合物I。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了一種制備假單胞菌素化合物游離胺核的方法，該胺核可被?；缮鲜鼋Y(jié)構(gòu)I代表的化合物。該方法包括用三氟乙酸或乙酸處理含有至少具有一個(gè)γ或δ羥基的N-?；榛鶄?cè)鏈的假單胞菌素化合物(例如，假單胞菌素A、A’或C)的步驟。
定義本文所用的術(shù)語(yǔ)“游離胺假單胞菌素核”或“假單胞菌素核”是指下列I-A的結(jié)構(gòu) 其中，R’是-NH2或-NHp-Pg，其中Pg為氨基保護(hù)基及p為0或1。
術(shù)語(yǔ)“烷基”指的是含有1-30個(gè)碳原子的通式CnH2n+1烴基。烷基可以是直鏈(例如甲基、乙基、丙基、丁基等)、支鏈(例如異丙基、異丁基、叔丁基、新戊基等)、環(huán)狀(例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、甲基環(huán)戊基、環(huán)己基等)、或者多環(huán)狀(例如二環(huán)[2.2.1]庚烷、螺[2.2]戊烷等)。所述烷基可以是被取代或者沒有取代的。類似地，烷氧基、烷?；蜴溚樗狨ブ械耐榛糠志哂猩厦娴南嗤x。
術(shù)語(yǔ)“烯基”指的是含有至少一個(gè)碳碳雙鍵的無(wú)環(huán)烴。所述烯基可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或多環(huán)狀。所述烯基可以取代或者沒有取代的。烯氧基、烯?；蛳┧狨ブ械南┗糠志哂猩厦娴南嗤x。
術(shù)語(yǔ)“炔基”是指至少含有一個(gè)碳碳三鍵的無(wú)環(huán)烴。炔基可以是直鏈的或支鏈的，可以是取代的或未取代的。炔氧基、炔?；蛉菜狨セ鶊F(tuán)中的炔基部分具有與上述相同的含義。
術(shù)語(yǔ)“芳基”指的是具有單環(huán)體系(例如苯基)或稠環(huán)體系(例如萘、蒽、菲等)的芳族部分。所述芳族可以是被取代或者沒有取代的。
術(shù)語(yǔ)“雜芳基”指在芳環(huán)體系中至少含有一個(gè)雜原子的芳基(例如吡咯、吡啶、吲哚、噻吩、呋喃、苯并呋喃、咪唑、嘧啶、嘌呤、苯并咪唑、喹啉等)。芳基可包含單或稠合環(huán)系。雜芳基可以是取代的或未取代的。
“NHp-Pg”和“氨基保護(hù)基”是指常用作氨基取代基以在化合物的其它官能團(tuán)反應(yīng)時(shí)阻止或保護(hù)氨基官能團(tuán)。當(dāng)p為0時(shí)，氨基保護(hù)基與其相連的氮一起形成環(huán)酰亞胺，例如鄰苯二甲酰亞胺和四氯鄰苯二甲酰亞胺。當(dāng)p為1時(shí)，氨基保護(hù)基可與其相連的氮一起形成氨基甲酸酯，例如甲基、乙基和9-芴基甲基氨基甲酸酯；或酰胺，例如N-甲?；蚇-乙酰基酰胺。
在有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，特別是有機(jī)生化領(lǐng)域，應(yīng)廣泛地理解為，化合物的有效取代是允許的，或者甚至是有用的。例如，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)烷基允許包括典型的烷基取代基，例如甲基、乙基、丙基、己基、異辛基、十二烷基、硬脂基(stearyl)等。術(shù)語(yǔ)“基團(tuán)”特定涉及并允許包括在本領(lǐng)域常規(guī)的烷基上取代，例如羥基、鹵素、烷氧基、羰基、酮基、酯基、氨基甲酸酯基(Carbamato)等，以及包括沒有取代的烷基部分。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解為，取代基應(yīng)經(jīng)選擇，以便對(duì)化合物的藥理特性沒有負(fù)面影響，或者對(duì)該藥物的使用沒有負(fù)面干擾。上面定義的任意基團(tuán)的合適取代基包括烷基、烯基、炔基、芳基、鹵素、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、一-和二-烷基氨基、季銨鹽、氨基烷氧基、羥基烷基氨基、氨基烷硫基、氨基甲?；?、羰基、羧基、羥乙?；?、甘氨?；㈦禄?、脒基、及其組合。
術(shù)語(yǔ)“溶劑化物”指聚集體，其包含一個(gè)或多個(gè)溶質(zhì)分子，例如結(jié)構(gòu)I的化合物，和一個(gè)或多個(gè)可藥用溶劑分子，例如水和乙醇等。
術(shù)語(yǔ)“可用藥鹽”是指結(jié)構(gòu)I代表的化合物的有機(jī)或無(wú)機(jī)鹽，其對(duì)接受者在給藥劑量基本無(wú)毒。
術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”指的是人、寵物(例如狗、貓和馬)、食物源動(dòng)物(例如牛、豬、羊和家禽)、動(dòng)物園動(dòng)物、海洋動(dòng)物、鳥類和其它類似動(dòng)物種。
發(fā)明詳述申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)假單胞菌素化合物的L-絲氨酸單元的N-酰基脫?；?，隨后用新的N-酰基重新?；玫叫碌幕衔?，體外實(shí)驗(yàn)表明這些新化合物可能有抗白色念珠菌(C.albican)、新型隱球酵母(C，neoformans)和/或煙曲霉(Aspergillus fumigatus)活性。
下面反應(yīng)路線I表示由任一種天然存在的假單胞菌素合成化合物I的一般方法。雖然在反應(yīng)路線I中畫出了一種天然存在的假單胞菌素化合物，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解天然存在的假單胞菌素化合物的半合成衍生物的側(cè)鏈修飾可按類似方法完成。一般地，制備化合物I需要四步合成(1)選擇性氨基保護(hù)；(2)N-酰基側(cè)鏈的化學(xué)脫?；蛎复倜擋；?3)用不同的側(cè)鏈重新?；缓?4)所述氨基脫保護(hù)。 反應(yīng)路線I
在2、4和5位的側(cè)鏈氨基可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何保護(hù)氨基的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行保護(hù)。氨基保護(hù)基的具體種類不很重要，只要衍生的氨基在中間體分子其它位置上隨后發(fā)生的反應(yīng)條件下穩(wěn)定并且保護(hù)基在合適的時(shí)間可以選擇性除去而不影響分子的其余部分，包括任何其它的氨基保護(hù)基即可。合適的氨基保護(hù)基包括芐基氧基羰基、對(duì)硝基芐基氧基羰基、對(duì)溴芐基氧基羰基、對(duì)甲氧基芐基氧基羰基、對(duì)甲氧基苯基偶氮芐基氧基羰基、對(duì)苯基偶氮芐基氧基羰基、叔丁基氧基羰基、環(huán)戊基氧基羰基和鄰苯二甲酰亞氨基。優(yōu)選的氨基保護(hù)基是叔丁氧基羰基(t-Boc)、烯丙基氧基羰基(Alloc)、鄰苯二甲酰亞氨基和芐基氧基羰基(CbZ或CBZ)。最優(yōu)選為烯丙基氧基羰基和芐基氧基羰基。此外，合適的保護(hù)基描述于T.W.Greene“Protective Groupsin Organic Synthesis”John Wiley and Sons，New York，N.Y.，(2nd ed.，1991)，第7章。
具有γ或δ羥基化的側(cè)鏈(例如，3，4-二羥基十四酸酯(tetradeconoate))的N-?；拿擋；赏ㄟ^用5-20％酸水溶液處理氨基保護(hù)的假單胞菌素化合物來完成。合適的酸包括乙酸和三氟乙酸。優(yōu)選的酸是三氟乙酸。如果用三氟乙酸，該反應(yīng)可在室溫或接近室溫下完成。但是當(dāng)用乙酸時(shí)，該反應(yīng)一般在約40℃進(jìn)行?？捎靡环N可水溶的有機(jī)溶劑促進(jìn)假單胞菌素化合物的溶解。合適的水溶劑體系包括乙腈、水和其混合物。當(dāng)保護(hù)的假單胞菌素化合物去?；瘯r(shí)乙腈特別有用。用于保護(hù)的假單胞菌素化合物脫?；瘍?yōu)選的酸溶液是8％三氟乙酸的乙腈水溶液。有機(jī)溶劑加速該反應(yīng)，然而，加入有機(jī)溶劑會(huì)導(dǎo)致其它副產(chǎn)物。側(cè)鏈上缺少δ羥基的假單胞菌素化合物(例如，假單胞菌素B和C’)可經(jīng)酶促脫酰化。合適的脫?；赴ǘ嗾尘仵；?164-16081脂肪?；?粗品)或161-16091脂肪?；?純品)可購(gòu)自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，或ECB脫?；?參見，例如U.S.Patent No.5,573,936)。酶促脫酰化可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)脫?；椒ㄍ瓿?。例如，用多粘菌素?；傅囊话惴椒ㄒ奩asuda，N.等，Agric.Biol.Chem.，53，3245(1989)和Kimura，Y.等，Agric.Biol.Chem.，53，497(1989)。
脫?；a(chǎn)物(也稱為假單胞菌素核或“PSN”)用目的?；南鄳?yīng)酸在羰基活化劑存在下重新?；！棒驶罨鶊F(tuán)”是指促進(jìn)在該羰基上的親核加成反應(yīng)的取代基。合適的活性取代基是羰基上具有凈拉電子作用的那些。這些基團(tuán)包括，但不限于，烷氧基、芳氧基、含氮芳香雜環(huán)或氨基(例如，氧基苯并三唑、咪唑基、硝基苯氧基、五氯苯氧基、N-氧基琥珀酰亞胺、N，N’-二環(huán)己基異脲-O-基和N-羥基-N-甲氧基氨基)；乙酸酯；甲酸酯；磺酸酯(例如，甲烷磺酸酯、乙烷磺酸酯、苯磺酸酯和對(duì)甲苯磺酸酯)和鹵化物(例如，氯化物、溴化物和碘化物)。
或者，可用固相合成，其中用羥基苯并三唑樹脂(HOBt-樹脂)作偶聯(lián)劑用于該?；磻?yīng)。
在?；^程中可應(yīng)用各種酸。合適的酸包括含有一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈芳基、烷基、氨基(包括伯、仲和叔胺)、羥基、烷氧基和氨基的脂肪族酸；在脂肪族鏈中含有氮或氧的脂肪族酸；被烷基、羥基、烷氧基和/或烷基氨基取代的芳香族酸；和被烷基、羥基、烷氧基和/或烷基氨基取代的雜芳香族酸。?；a(chǎn)物可用作活性抗真菌劑或用作制備活性化合物的中間體。即使一些化合物不如其它化合物有用，其活性譜也對(duì)欲獲得最佳活性的設(shè)計(jì)思路提供有價(jià)值的信息。
一旦氨基被酰化，可通過在氫化催化劑(例如10％Pd/C)的存在下除去氨基保護(hù)基(2、4和5位)。當(dāng)氨基保護(hù)基是烯丙基氧基羰基時(shí)，該保護(hù)基可用三丁基錫氫化物和三苯膦鈀二氯化物除去。這一特定的保護(hù)/脫保護(hù)路線的優(yōu)點(diǎn)是降低了氫化假單胞菌素Z-Dhb單元的乙烯基的可能性。
正如早先所討論的，假單胞菌素是從丁香假單胞菌分離的天然產(chǎn)物，它被表征為酯縮肽(Lipodepsinonapetpides)，其含有通過內(nèi)酯鍵閉環(huán)的環(huán)肽部分并包括不尋常的氨基酸4-氯蘇氨酸(ClThr)、3-羥基天冬氨酸(HOAsp)、2，3-脫氫-2-氨基丁酸(Dhb)和2，4-二氨基丁酸(Dab)。生長(zhǎng)丁香假單胞菌的不同菌株從而生產(chǎn)不同假單胞菌素類似物(A、A’、B、B’、C和C’)的方法描述如下并且更詳細(xì)地描述在Hilton等人于2000年4月14日提交的題為“通過丁香假單胞菌生產(chǎn)假單胞菌素(Pseudomycin Production by PseudomonasSyringae)”的PCT專利申請(qǐng)，其序列號(hào)為PCT/US00/08728、Kulanthaivel等人于2000年4月14日提交的題為“假單胞菌素天然產(chǎn)物(Pseudomycin Natural Products)”的PCT專利申請(qǐng)，其序列號(hào)為PCT/US00/08727、以及US 5,576,298和5,837,685中，在此將它們都引入作為參考。
產(chǎn)生一種或多種假單胞菌素的丁香假單胞菌分離菌株在本領(lǐng)域?yàn)橐阎Ｒ吧途闙SU 174和通過轉(zhuǎn)座子誘變產(chǎn)生的該菌株突變體MSU 16H(ATCC 67028)，描述在US 5,576,298和5,837,685；Harrison等人的“Pseudomycins，a family of novel peptides fromPseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungalactivity，”J.Gen.Microbiology，137，2857-2865(1991)；以及Lamb等人的“Transposon mutagenesis and tagging offluorescent pseudomonasAntimycotic production is necessaryfor control of Dutch elm disease，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，6447-6451(1987)中。
適合生產(chǎn)一種或多種假單胞菌素的丁香假單胞菌菌株可以從包括植物(例如大麥植物、柑橘植物和丁香植物)的環(huán)境源以及，例如土壤、水、空氣和灰塵的源分離。優(yōu)選菌株是從植物分離的。從環(huán)境源分離的丁香假單胞菌菌株可以稱之為野生型。正如本文所用的，“野生型”是指天然存在于丁香假單胞菌正常菌群中的顯性基因型(例如在自然界中發(fā)現(xiàn)且不是通過實(shí)驗(yàn)室操作生產(chǎn)的丁香假單胞菌菌株或分離物)。與大多數(shù)生物體相同，所用的產(chǎn)假單胞菌素(丁香假單胞菌菌株如MSU 174、MSU 16H、MSU 206、25-B1、7H9-1)的培養(yǎng)物的特性易于變化。因此，這些菌株的后代(例如重組體、突變體和變種)可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得。
丁香假單胞菌MSU 16H從the American Type CultureCollection，Parklawn Drive，Rockville，MD，USA是公眾可得的，其保藏號(hào)ATCC 67028獲得。丁香假單胞菌菌株25-B1、7H9-1和67 H1于2000年3月23日保藏在the American Type Culture Collection并且分別具有以下保藏號(hào)25-B1保藏號(hào)PTA-16227H9-1保藏號(hào)PTA-162367H1保藏號(hào)PTA-1621丁香假單胞菌的突變體菌株也適合生產(chǎn)一種或多種假單胞菌素。正如本文所用的，“突變體”是指在菌株表型中突然可遺傳的變化，它可以是自發(fā)的或者通過已知誘變劑誘導(dǎo)的，例如輻射(例如紫外線輻射或x-射線)、化學(xué)誘變劑(例如甲基磺酸乙酯(EMS)、二環(huán)氧辛烷、N-甲基-N-硝基-N’-硝基鳥嘌呤(NTG)和亞硝酸)、位置特異性誘變和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)誘變。產(chǎn)假單胞菌素的丁香假單胞菌突變體可以通過用有效地產(chǎn)生突變體的量的誘變劑處理該細(xì)菌來生產(chǎn)，所示突變體過量地生產(chǎn)一種或多種假單胞菌素、生產(chǎn)一種超過其它假單胞菌素的假單胞菌素(例如假單胞菌素B)、或者在有利的生長(zhǎng)條件下生產(chǎn)一種或多種假單胞菌素。盡管所用誘變劑的類型和數(shù)量可以變化，但是優(yōu)選方法是可系列地將NTG稀釋到1-100μg/ml的水平。優(yōu)選突變體是過量地產(chǎn)生假單胞菌素B并在最小限定的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的那些。
為了以下所需特性生長(zhǎng)習(xí)性、生長(zhǎng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)源、碳源、生長(zhǎng)條件、氨基酸需要等，可以對(duì)丁香假單胞菌的環(huán)境分離物、突變體菌株和其它所需的丁香假單孢菌菌株經(jīng)過選擇。優(yōu)選選擇在最小限定的培養(yǎng)基例如N21培養(yǎng)基上生長(zhǎng)和/或產(chǎn)生一種或多種量大于約10μg/ml的假單胞菌素的產(chǎn)假單胞菌素的丁香假單胞菌菌株。優(yōu)選菌株當(dāng)在含有三種或更少氨基酸，任選含有脂類、馬鈴薯產(chǎn)品或其組合的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，呈現(xiàn)產(chǎn)生一種或多種假單胞菌素的特性。
使用本領(lǐng)域中已知的方法，通過轉(zhuǎn)化丁香假單胞菌菌株，可以培育重組菌株。除了這些菌株產(chǎn)生的抗生素之外，通過使用重組DNA技術(shù)，可將丁香假單胞菌菌株轉(zhuǎn)化而表達(dá)不同的基因產(chǎn)物。例如，人們可以修飾這些菌株，從而引入多重拷貝的內(nèi)源假單胞菌素生物合成基因，以獲得更大的假單胞菌素產(chǎn)量。
為了從丁香假單胞菌野生型或突變體菌株生產(chǎn)一種或多種假單胞菌素，該生物體在含有有效量的三種或更少氨基酸，優(yōu)選谷氨酸、甘氨酸、組氨酸或其組合的水性營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中攪拌培養(yǎng)?；蛘?，將甘氨酸與一種或多種的馬鈴薯產(chǎn)品和脂類組合。在丁香假單胞菌能夠有效生長(zhǎng)并產(chǎn)生所需假單胞菌素的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。有效條件包括溫度為約22℃-約27℃，時(shí)間為約36小時(shí)-約96小時(shí)。在丁香假單胞菌的培養(yǎng)過程中控制培養(yǎng)基中的氧濃度對(duì)假單胞菌素的生產(chǎn)是有益的。優(yōu)選氧水平保持在約5-50％飽和度，更優(yōu)選約30％飽和度。用空氣、純氧或含有氧的氣體混合物噴射可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的氧濃度。
在丁香假單胞菌的培養(yǎng)過程中控制培養(yǎng)基的pH也是有益的。假單胞菌素在堿性pH下不穩(wěn)定，并且如果培養(yǎng)基的pH在約6以上持續(xù)約12小時(shí)以上的時(shí)間，能夠產(chǎn)生明顯的降解。優(yōu)選培養(yǎng)基的pH保持在6-4之間。丁香假單胞菌當(dāng)在分批培養(yǎng)物中生長(zhǎng)時(shí)可以產(chǎn)生一種或多種假單胞菌素。然而，分批補(bǔ)加(fed-bath)或半連續(xù)加入葡萄糖和任選，加入酸或堿(例如氫氧化銨)控制pH可以提高產(chǎn)量。假單胞菌素產(chǎn)量還可以使用自動(dòng)加入葡萄糖和氫氧化銨的連續(xù)培養(yǎng)法來提高。
丁香假單胞菌菌株的選擇可以影響產(chǎn)生的假單胞菌素的量和分布。例如，菌株MSU 16H和67 H1各自主要產(chǎn)生假單胞菌素A，但是還產(chǎn)生假單胞菌素B和C，其比例典型地為4∶2∶1。菌株67 H1典型地產(chǎn)生的假單胞菌素的量要比菌株MSU 16H所產(chǎn)生的高約3-5倍。與菌株MSU 16H和67 H1相比，菌株25-B1產(chǎn)生更多的假單胞菌素B和更少的假單胞菌素C。菌株7H9-1的特點(diǎn)是主要產(chǎn)生假單胞菌素B，并且假單胞菌素B的產(chǎn)量比其它菌株的高。例如，該菌株可以產(chǎn)生的假單胞菌素B是假單胞菌素A或C的至少10。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意不同方法將每種假單胞菌素、假單胞菌素中間體及混合物檢測(cè)、確定、分離和/或提純。例如，肉湯培養(yǎng)基或分離物或提純的組合物中的假單胞菌素或假單胞菌素的活性水平可以通過抗例如假絲酵母屬的真菌的抗真菌活性來確定，并且可以通過高效液相色譜法分離和提純。
可以將該假單胞菌素化合物分離出并且以本身或以其可藥用的鹽或溶劑化物的形式使用。術(shù)語(yǔ)“可藥用的鹽”是指由無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸獲得的非毒性酸加成鹽。適合的鹽衍生物包括鹵化物、硫氰酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、芳基磺酸鹽、烷基硫酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、鏈烷酸鹽、環(huán)烷基鏈烷酸鹽、芳基鏈烷酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、富馬酸鹽、葡糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酯酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、三氟乙酸鹽等。
術(shù)語(yǔ)“溶劑化物”是指含有一個(gè)或多個(gè)溶質(zhì)分子(即假單胞菌素前藥化合物)和一個(gè)或多個(gè)藥用溶劑分子如水、乙醇等的聚集體。當(dāng)溶劑為水時(shí)，該聚集體稱之為水合物。溶劑化物通常是通過將前藥加熱溶解于適宜溶劑中并慢慢冷卻產(chǎn)生非晶形或結(jié)晶溶劑化物形式來形成的。
典型地將活性成分(即假單胞菌素衍生物)配制成提供易于控制的藥物劑量且給患者、醫(yī)師或獸醫(yī)一種高雅且易于操作的產(chǎn)品的藥用劑量形式。制劑可以含有0.1％-99.9％wt的活性成分，更常規(guī)的是約10％-約30％wt。
正如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“單位劑量”或“劑量單位”是指含有經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量活性成分的物理離散單位。當(dāng)單位劑量經(jīng)口服或非腸道給藥時(shí)，典型地以片劑、膠囊、丸劑、粉末包、局部組合物、栓劑、糯米紙囊劑、安瓿或多劑量容器中的測(cè)定單元等的形式提供?；蛘?，單位劑量可以可吸入或噴霧的干燥或液體氣溶膠的形式給藥。
給藥劑量可以根據(jù)動(dòng)物的身體特性、動(dòng)物病癥的嚴(yán)重程度、和用于給藥的方式而變化。給定動(dòng)物的具體劑量經(jīng)常由醫(yī)師或獸醫(yī)的判斷來確定。
適合的載體、稀釋劑和賦形劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為公知并包括如下物料碳水化合物、蠟、水溶性和/或水膨脹性聚合物、親水或疏水材料、明膠、油、溶劑、水等。所用的特定載體、稀釋劑或賦形劑將取決于活性成分的使用方式和目的。制品還可以包括潤(rùn)濕劑、潤(rùn)化劑、表面活性劑、緩沖劑、增強(qiáng)劑、填充劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、甜味劑、香味劑、調(diào)味劑及其組合。
藥用組合物可以使用各種方法給藥。適合的方法包括局部(例如軟膏或噴霧劑)、口服、注射和吸入。所用的具體處理方法將取決于治療的感染的類型。
當(dāng)非腸道靜脈應(yīng)用時(shí)，在給藥之前，這些制品典型地經(jīng)過稀釋或重新配制(如果經(jīng)過凍干的話)，如果需要的話進(jìn)一步稀釋。凍干產(chǎn)品的重新配制說明的例子是將10ml注射用水(WFI)加入到小瓶中并輕輕攪拌溶解。典型重新配制時(shí)間低于1分鐘。然后在給藥之前，將所得溶液進(jìn)一步稀釋于輸液如5％葡萄糖的水(D5W)中。
假單胞菌素化合物已顯示具有抗真菌活性，例如包括抑制以下的傳染性真菌的生長(zhǎng)假絲酵母屬各種(即白色念珠菌(C.albicans)、近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)、克魯絲氏假絲酵母(C.krusei)、光滑假絲酵母(C.glabrata)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)或葡萄牙假絲酵母(C.lusitania))；球擬酵母屬各種(即光滑球擬酵母(T.glabrata)；曲霉屬各種(即煙曲霉(A.fumigatus))；組織胞漿菌屬各種(即莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum))；隱球酵母屬各種(即新型隱球酵母(C.neoformans))；芽生菌屬各種(即皮炎芽生菌(B.dermatitidis))；鐮孢屬各種；發(fā)癬菌屬各種、Pseudallescheria boydii、粗球孢子菌、申克氏孢子絲菌等。
所以，本發(fā)明的化合物和制劑在制備可用于對(duì)抗全身性真菌感染或者真菌皮膚感染的藥物中有用。因此，提供了一種抑制真菌活性的方法，該方法包括將本發(fā)明的化合物I與真菌接觸。優(yōu)選方法包括抑制白色念珠菌、新型隱球酵母或煙曲霉活性。術(shù)語(yǔ)“接觸”包括本發(fā)明化合物與真菌的結(jié)合或接合，或者表面接觸或相互接觸。該術(shù)語(yǔ)對(duì)該方法沒有賦予任何其它限制，例如通過抑制機(jī)理。這些方法定義為包含通過這些化合物的作用及其內(nèi)在抗真菌性能抑制真菌的活性。
還提供了一種治療真菌感染的方法，包括對(duì)需要這種治療的宿主動(dòng)物給藥有效量的本發(fā)明藥物制劑。優(yōu)選方法包括治療白色念珠菌、新型隱球酵母或煙曲霉感染。術(shù)語(yǔ)“有效量”是指能夠抑制真菌活性的活性化合物的量。給藥劑量隨例如以下因素而變化感染的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、宿主的年齡和總體健康狀況、宿主對(duì)抗真菌劑的耐受性和宿主的種類。具體劑量方案同樣可以根據(jù)這些因素而變化。藥物可以單一日劑量或在一天期間的多次劑量的方式施用。該方案可以從約2-3天延續(xù)至約2-3周或更長(zhǎng)。典型的日劑量(以單一或均分劑量給藥)含有約0.01mg/kg-100mg/kg體重的活性化合物的劑量水平。優(yōu)選日劑量通常為約0.1mg/kg-60mg/kg，更優(yōu)選為約2.5mg/kg-40mg/kg。宿主可以是任何動(dòng)物，包括人、寵物(例如狗、貓和馬)、食物源動(dòng)物(例如牛、豬、羊和家禽)、動(dòng)物園動(dòng)物、海洋動(dòng)物、鳥類和其它類似的動(dòng)物種類。
實(shí)施例除非另有說明，所有化學(xué)試劑購(gòu)自Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)。
生物樣品丁香假單孢菌MSU 16H是從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection)，Parklawn Drive，Rockville，MD，USA公眾可得的，保藏號(hào)為ATCC 67028。丁香假單孢菌菌株25-B1，7H9-1和67 H1于2000年3月23日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)如下25-B1保藏號(hào)為PTA-16227H9-1保藏號(hào)為PTA-162367H1保藏號(hào)為PTA-1621化學(xué)縮寫在所用實(shí)施例中用下列縮寫表示分別列出的材料ACN-乙腈TFA-三氟乙酸DMF-二甲基甲酰胺DEAD-二乙基偶氮二甲酸酯EDCI-1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽BOC＝叔丁氧基羰基，(CH3)3C-O-C(O)-CBZ＝芐基氧基羰基，C6H5CH2-O-C(O)FMOC＝芴基甲基氧基羰基HPLC條件除非另有說明，分析反相HPLC操作是用裝配著WatersμBondapak(C18，3.9×300mm)柱的Waters 600E系統(tǒng)進(jìn)行的。所用的洗脫劑是65∶35乙腈/0.1％TFA水溶劑體系-100％乙腈(用20分鐘)，流速是1.5ml/分鐘，并在230nm使用UV檢測(cè)。
制備HPLC處理是用采用Dynamax 60埃C18柱的Waters Prep2000系統(tǒng)進(jìn)行的，其中使用與分析HPLC系統(tǒng)相同的溶劑體系，但是流速為40ml/分鐘。
生物分析抗真菌活性的檢測(cè)和定量測(cè)定通過使用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂稀釋測(cè)試或圓盤展開測(cè)試獲得化合物的最小抑制濃度(MIC)來在體外測(cè)定抗真菌活性。在抗真菌活性測(cè)試中使用的典型真菌是白色念珠菌。當(dāng)測(cè)試樣本(50μl)對(duì)接種到瓊脂板上的白色念珠菌的抑制引起10-12mm直徑區(qū)域時(shí)認(rèn)為有顯著抗真菌活性。尾靜脈毒性在第0、24、48和72小時(shí)，用0.1ml測(cè)試化合物(20mg/kg)經(jīng)由側(cè)尾靜脈靜脈內(nèi)(IV)給藥來治療小鼠。每組包括2只小鼠。將化合物配制在0.5％葡萄糖和無(wú)菌注射用水中。首次治療后監(jiān)測(cè)小鼠7天，并仔細(xì)觀察包括紅斑、腫脹、變色、壞死、尾損失在內(nèi)的刺激征狀以及表明毒性的其它副作用征狀。
在該實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠是遠(yuǎn)系繁殖的，雄性ICR小鼠的平均體重為18-20g(得自Harlan Sprangue Dawley，Indianapolis，IN)。
一般方法用于在假單胞菌素A、A’、B、B’、C或C’的2、4和5位保護(hù)側(cè)鏈氨基的一般方法將假單胞菌素化合物(R1＝H)溶解/懸浮于DMF中(20mg/ml，Aldrich Sure Seal)。在室溫、攪拌下加入N-(芐基氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(6eq)，在室溫下攪拌32小時(shí)，通過HPLC(4.6×50mm，3.5μm，300-SB，C8，Zorbax column)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。在室溫、高真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10ml，將該物料冷凍直至準(zhǔn)備好色譜制備。經(jīng)反相制備HPLC并冷凍干燥后得到無(wú)定型、白色固體。用于L-絲氨酸單元N-?；瘜W(xué)去酰化的一般方法。
將保護(hù)的假單胞菌素A溶解/懸浮于水/乙腈(2∶1 H2O∶ACN，約3.5mg/ml)中并在室溫下慢慢加入TFA(8％體積)。在室溫下攪拌反應(yīng)直到原料消耗完。在室溫、真空下除去乙腈并冷凍干燥物料。將得到的固體溶于少量DMF(若需要，加水，然后加入等量的ACN)中，經(jīng)制備HPLC和冷凍干燥后一般得到白色、無(wú)定型固體(可能為TFA鹽)。假單胞菌素核用HOBt樹脂的固相?；?。下列實(shí)施例用十四烷酸；然而對(duì)于其它的有機(jī)酸，也可用同樣的一般方法。
在一100ml兩端玻璃燒結(jié)的反應(yīng)管中，將十四烷酸(1.03g，3.62mmol)溶于50ml 1∶1 DMF/THF中。向這一溶液中加入樹脂HOBt(1.94g，2.9mmol)和EDCI(0.556g，2.9mmol)并震搖過夜。排掉溶劑，樹脂用2xDMF、2xTHF和2x 1∶1DMF/THF洗滌。將CBZ-保護(hù)的假單胞菌素核(1.0克，0.723mmol)溶于50ml DMF/THF(20mg/ml)中，并加到該樹脂結(jié)合的活化酯中并在旋轉(zhuǎn)器或震搖器上混合過夜。將產(chǎn)物與樹脂分開并用2xDMF、2xTHF和2x 1∶1 DMF/THF洗滌剩余樹脂。合并的濾液經(jīng)反相HPLC分離并冷凍干燥得到(129mg，10％)十四烷?；；腃BZ-保護(hù)的假單胞菌素產(chǎn)物。假單胞菌素核用活化酯(HOBt-甲磺酸酯)的?；Ｏ铝袑?shí)施例用甘氨酸十四烷酸，然而對(duì)于其它有機(jī)酸也可使用該一般方法。
在一500ml圓底燒瓶中，將甘氨酸十四烷酸(0.309g，1.1mmol)溶于100ml DMF中。向該溶液中加入HOBt-甲磺酸酯(0.229g，1.1mmol)和三乙胺(0.081g，0.8mmol)。在1atm N2下快速攪拌該溶液過夜，在高真空下干燥除去DMF和TEA。殘余油狀物用甲苯共沸蒸餾3次直到形成白色固體。向該固體中加入100ml DMF和1g CBZ-保護(hù)的假單胞菌素核。攪拌溶液過夜并在高真空下干燥。產(chǎn)物經(jīng)反相HPLC純化并冷凍干燥得到(233mg，20％)十四?；；腃BZ-保護(hù)的假單胞菌素產(chǎn)物。用于經(jīng)氫化在2、4和5位側(cè)鏈氨基去保護(hù)的一般方法將CBZ-保護(hù)的活化衍生物溶于冷的13％乙酸/甲醇溶液(5mg/ml)中并加入當(dāng)量的10％Pd/C。通過脫氣并用H2置換體積4-7次向反應(yīng)中充氫氣。在室溫下進(jìn)行反應(yīng)，用HPLC和質(zhì)譜儀每15分鐘監(jiān)測(cè)反應(yīng)一次直到原料消耗完。當(dāng)反應(yīng)完成后，除去氣囊并用0.45μm的濾片(Acrodisk GHP，GF by Gelman)過濾反應(yīng)液，濃縮到約1/10體積并用制備HPLC純化，冷凍干燥含有產(chǎn)物的級(jí)分。制備側(cè)鏈前體(1c)的制備 向含有100ml脫氣ACN的250ml圓底燒瓶中加入間-溴苯甲醛(5.000g，27.02mmol)、三乙胺(5.490g，54.25mmol)和1-十二炔(5.000g，30.06mmol)。向該混合物中加入PdCl2(243.1mg，1.370mmol)、三苯膦(718.8mg，2.740mmol)和CuI(173.8mg，0.9120mmol)。然后加熱回流并反應(yīng)過夜。然后將反應(yīng)液冷至室溫并在真空下除去溶劑，得到的殘余物用二氯甲烷處理并用2×1N HCl和1X鹽水洗滌。有機(jī)層用MgSO4干燥。濾出干燥劑，在真空下除去溶劑，經(jīng)硅膠柱色譜純化并用3％EtOAc/己烷洗脫得到3.73克棕色油狀標(biāo)題化合物。光譜數(shù)據(jù)與間-(l-十二炔基)苯甲醛(la)的結(jié)構(gòu)一致。
向100 mL EtOAc中加入上述化合物(1.00g，3.70mmol)和0.1g 5％Pd/Al2O3。在室溫、50psi的H2下處理反應(yīng)混合物1小時(shí)。反應(yīng)混合物經(jīng)硅藻土過濾以除去催化劑，硅藻土用大量的EtOAc漂洗。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去EtOAc得到882.1mg的產(chǎn)物。該產(chǎn)物未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步。光譜數(shù)據(jù)與間-十二烷基苯甲醛(lb)一致。
在氮?dú)夥铡?78℃下，向烤箱干燥過的50ml圓底燒瓶中加入6.0ml無(wú)水THF并隨后加入二異丙基氨化鋰(1.2mL 2M的庚烷/THF/乙基苯溶液，2.41mmol)。向其中加入乙酸叔丁酯(0.331ml，2.45mmol)并將得到的溶液升溫到約-40℃并在此溫度下保持1小時(shí)。然后向該陰離子中滴加上述化合物(501.9mg，1.83mmol)溶于4mL無(wú)水THF并預(yù)冷至-40℃的溶液。攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)，然后用2ml飽和的氯化銨水溶液和10ml水終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物在乙醚和水之間分配，有機(jī)層用鹽水洗滌一次并用硫酸鈉干燥。濾出干燥劑，在真空下除去溶劑，經(jīng)硅膠柱色譜純化，用5％EtOAc/己烷洗脫得到238.1mg黃色油狀物。光譜數(shù)據(jù)與3-羥基-3-(間十二烷基芐基)丙酸叔丁酯一致。
將預(yù)冷的(0℃)4ml TFA溶液加到含有粗品3-羥基-3-(間十二烷基芐基)丙酸叔丁酯的50ml圓底燒瓶中。在這一溫度下攪拌反應(yīng)25min，TLC(10％EtOAC/己烷)顯示原料酯完全消耗。在真空下除去TFA得到油狀物(1c)。側(cè)鏈前體(2c)的制備 化合物2a用與上述合成化合物1a相同的方法，用1-辛炔代替1-十二炔合成?；衔?b和2c分別用與上述合成1b和1c相同的方法合成。側(cè)鏈前體(3b)的制備 向含有100mL丙酮的500mL圓底燒瓶中加入間羥基苯甲醛(5.00g，40.94mmol)、1-溴十一烷(9.65g，41.02mmol)和K2CO3(8.48g，61.36mmol)。加熱反應(yīng)混合物至回流并反應(yīng)10小時(shí)。將反應(yīng)冷卻并在真空下除去丙酮。得到的殘余物在醚/水之間分配，有機(jī)層用飽和NaHCO3水溶液洗滌兩次并用鹽水洗滌一次。有機(jī)層用MgSO4干燥，然后濾出干燥劑并在真空下除去溶劑，在硅膠柱上純化，用3％EtOAc/己烷洗脫得到1.6876黃色油狀物。光譜數(shù)據(jù)與化合物3a一致，然后該醛通過用與制備1c描述的相同方法制備化合物3b。側(cè)鏈前體(4c)的制備 除化合物1a在與乙酸叔丁酯縮合前不氫化外，用與上述合成化合物1c的相同方法合成化合物4a。
在50ml圓底燒瓶中加入3-羥基-3-(間十二炔基芐基)丙酸叔丁酯4a(346.8mg，0.897)并溶于10ml MeOH/1mL冰AcOH中。用10％Pd/C(304.5mg)標(biāo)準(zhǔn)氫化24h，通過過濾除去催化劑，在真空下除去溶劑得到302.4mg 3-(間十二烷基芐基)丙酸叔丁酯，然后用TFA處理除去叔丁酯得到化合物4b。側(cè)鏈前體(5a)的制備 在-78℃下，向含有5mL THF的50ml圓底燒瓶中加入仲丁基鋰(1.56mmol，1.2mL 1.3M的環(huán)己烷溶液)。向這一混合物中滴加入溴異丁酸叔丁酯(在-78℃的2ml THF中)，攪拌反應(yīng)30min，然后向反應(yīng)混合物中滴加化合物1b(318.9mg，1.16mmol在2ml THF中，-78℃)。在-78℃攪拌得到的反應(yīng)混合物30min，然后在30min以上時(shí)間升溫至0℃并在該溫度下攪拌1.75小時(shí)，然后用2ml飽和氯化銨水溶液終止反應(yīng)并溫?zé)嶂潦覝?。該反?yīng)混合物在乙醚/水之間分配并且有機(jī)層用鹽水洗滌一次并用MgSO4干燥。然后濾出干燥劑并在真空下除去溶劑得到370.5mg粗品，為外消旋混合物。然后用TFA除去該叔丁基酯得到化合物5a。側(cè)鏈前體(6a)的制備 向含有100mL MeOH和1mL濃H2SO4的250mL圓底燒瓶中加入間溴對(duì)甲氧基苯甲酸(5.00g，21.6mmol)。加熱所得到的混合物至回流并維持24小時(shí)。冷卻反應(yīng)液并在真空下除去溶劑，將得到的固體用乙醚處理，有機(jī)層用水洗滌兩次，用飽和NaHCO3水溶液和鹽水各洗滌一次并用MgSO4干燥。然后濾出干燥劑并在真空下除去溶劑得到4.72g粗品，該粗品未經(jīng)進(jìn)一步純化使用。然后該產(chǎn)物與1-十四炔縮合并經(jīng)過氫化得到與前面實(shí)施例類似的烯烴。該甲酯經(jīng)下列步驟轉(zhuǎn)換成甲酸將甲酯(538.4mg，1.48mmol)懸浮于20ml 30％HBr的AcOH溶液中并加熱回流，回流24h后將該溶液倒入150ml水中并用2×200ml CH2Cl2萃取。有機(jī)相用大量的水洗滌并用MgSO4干燥，然后濾出干燥劑并在真空下除去溶劑得到398.7g粗品6a，其未經(jīng)進(jìn)一步純化使用。側(cè)鏈前體(7a)的制備 將化合物6a(385.2mg)加到鹽酸吡啶鎓固體中。加熱兩固體至～220℃熔融并維持混合物反應(yīng)3小時(shí)，然后將反應(yīng)物冷卻并在CH2Cl2/1N HCl之間分配。有機(jī)相然后用1N HCl洗滌5次并用MgSO4干燥，然后濾出干燥劑并在真空下除去溶劑得到158.8mg粗品(7a)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化使用。側(cè)鏈前體(8b)的制備 在250ml圓底燒瓶中加入在60mL甲苯/30mL 2 M Na2CO3水溶液中的聯(lián)苯基硼酸(2.00g，10.1mmol)和Pd(PPh)4(980.0mg，0.848mmol)。向該漿狀物中加入間溴苯甲醛(在10mL MeOH中)。加熱反應(yīng)混合物至回流并維持反應(yīng)20h。冷卻反應(yīng)物，有機(jī)層用水洗滌兩次，鹽水洗滌一次并用用MgSO4干燥，然后濾出干燥劑并在真空下除去溶劑。得到的固體用冷的己烷漂洗除去任何殘留的間溴苯甲醛，然后在熱己烷中攪拌該固體漿化，并熱過濾除去所有固體。濾液在真空下除去溶劑得到目的醛8a。用在制備1c描述的相同方法將化合物8a轉(zhuǎn)化成8b得到不可分離的非對(duì)映異構(gòu)體。側(cè)鏈前體(9a)的制備 將乙酸叔丁酯(2.02ml，0.015mol)的無(wú)水THF(25ml)溶液冷至-78℃并滴加正丁基鋰(1.6M在己烷中)(9.35ml，0.015mol)。45min后滴加2-十三烷酮(2.0g，0.01mol)的THF溶液，繼續(xù)在低溫下攪拌1小時(shí)，然后在15min以上將反應(yīng)物溫至室溫。加入過量的1N HCl終止反應(yīng)，水溶液用乙醚萃取(2x)，乙醚層用MgSO4干燥并在真空下濃縮得到粗品油狀物。經(jīng)硅膠柱色譜純化(5％乙酸乙酯/己烷)得到1.01g(收率32％)叔丁基酯。NMR與目的產(chǎn)物一致。然后用三氟乙酸處理叔丁酯將叔丁酯分解定量得到化合物9a。側(cè)鏈前體(10e)的制備 R＝n-C5H11在室溫下，向間羥基苯甲醛(1.00g，8.20mmol)的THF溶液(16mL)中加入DEAD(1.29mL，8.20mmol)、PPh3(2.15g，8.20mmol)和正戊醇(723mg，8.20mmol)。在室溫下攪拌混合物過夜，用硅膠純化后得到1.02g(65％)目的產(chǎn)物10a。
在0℃下，向10a(6.70g，34.90mmol)的THF溶液中加入Ph3P＝CHO(10.6g，34.90mmol)。在室溫下攪拌過夜后，過濾反應(yīng)混合物并在真空下濃縮得到殘余物，經(jīng)硅膠色譜純化得到3.57g(47％)目的不飽和醛10b。
用10％Pd/C(1.64g，1.55mmol)氫化(1.5atm)10b(3.37g，15.5mmol)的EtOAc溶液(30mL)。攪拌反應(yīng)液過夜，經(jīng)過Celite板過濾反應(yīng)混合物。在真空下濃縮濾液和漂洗液，殘余物經(jīng)硅膠柱色譜純化(10％EtOAc/己烷)得到2.37g(70％)10c。
在0℃下，向醛10c(1.26g，5.71mmol)的二氯甲烷溶液(23mL)中加入烯丙基三甲基甲硅烷(0.91mL，5.71mmol)，隨后加入TiCl4(0.63mL，5.71mmol)。在0℃下攪拌1小時(shí)后，用飽和的NaHCO3溶液終止反應(yīng)，用二氯甲烷(75mL)稀釋該混合物，有機(jī)層依次用飽和NaHCO3、水和鹽水洗滌。有機(jī)層經(jīng)干燥、濃縮并經(jīng)硅膠色譜純化(10％EtOAc/己烷)得到0.91g(61％)目的烯丙基醇10d。
將烯丙基醇10d(0.91g，3.47mmol)溶于丙酮水溶液(各7mL)中，并向該溶液中加入NMO(704mg，5.21mmol)和OsO4(44mg，0.17mmol)的THF溶液。在室溫下攪拌2小時(shí)后，用NaHSO3(750mg)終止反應(yīng)以終止過量的氧化劑。反應(yīng)混合物經(jīng)鹽水(10mL)稀釋并用EtOAc(3×50mL)萃取，合并的有機(jī)層經(jīng)干燥并在真空下濃縮得到850mg(82％)目的三醇中間體。將如此得到的三醇(850mg，2.87mmol)溶于MeOH(30mL)和水(6mL)中，在室溫下用NaIO4(1.38g，6.46mmol)處理該溶液，1小時(shí)后，反應(yīng)混合物經(jīng)Celite板過濾，在真空下小心濃縮濾液得到相應(yīng)的β-羥基醛。將該醛溶于t-BuOH(14mL)和環(huán)己烷(2mL)中，向該溶液中加入含有KH2PO4(2.33g，17.7mmol)和NaClO2(2.08g，23.0mmol)的水(15mL H2O)溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)5小時(shí)，然后用1N HCl酸化至pH＝3，反應(yīng)混合物用EtOAc(3×50mL)萃取，合并的有機(jī)相用水和鹽水洗滌。有機(jī)層經(jīng)干燥并在真空下濃縮得到粗品酸10e(1.5g，～3.4mmol)。
用上述相同方法也可制得其中R為n-C6H13、n-C7H15、n-C8H17、n-C9H19、n-C10H21和n-C14H29的化合物。側(cè)鏈前體(11d)的制備 在-78℃下，向手性縮醛11a(6.22g，19.1mmol)的二氯甲烷溶液(190mL)中加入三甲基烯丙基硅烷(10.9mL，68.69mmol)，然后加入純的TiCl4(2.94mL，26.71mmol)。在-78℃攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)，然后在-40℃攪拌2小時(shí)，此時(shí)用甲醇(15mL)終止反應(yīng)并用二氯甲烷(200mL)稀釋，得到的反應(yīng)混合物用1N HCl(2×50mL)、水和鹽水洗滌，有機(jī)層經(jīng)干燥并在真空下濃縮得到殘余物，其用硅膠色譜(10％EtOAc/己烷)純化得到5.51g(78％)目的產(chǎn)物11b。11a的1H NMR(CDCl3)δ4.73(m，1H)，4.21(m，1H)，3.86(m，1H)，1.75(m，1H)，1.60-1.10(m，35H)，0.80(m，3H)。11b的1H NMR(CDCl3)δ5.81(m，1H)，5.05(m，2H)，4.12(m，1H)，3.86(m，1H)，3.41(m，1H)，2.22(m，2H)，1.67-1.18(m，36H)，0.88(m，3H)。
向11b(8.56g，23.3mmol)的二氯甲烷溶液(155mL)中加入PCC(10.0g，46.5mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)18小時(shí)，然后經(jīng)過Celite板過濾。在真空下濃縮濾液得到微紅色殘余物，經(jīng)硅膠色譜純化(10％EtOAc/己烷)得到8.36g(80％)甲基酮中間體(結(jié)構(gòu)未給出)。將這里得到的中間體(8.36g，22.8mmol)溶于THF(60mL)和MeOH(30mL)中，向該溶液中加入7.5M KOH(15mL)，在室溫下攪拌3小時(shí)后，除去部分溶劑，剩下的反應(yīng)混合物用EtOAc/Et2O(比例3∶1，350mL)稀釋。有機(jī)層用水(3×50mL)和鹽水洗滌，得到的有機(jī)層經(jīng)干燥并在真空下濃縮得到殘余物，其經(jīng)硅膠色譜(10％EtOAc/己烷)純化得到6.22g(96％)目的產(chǎn)物11c，為白色固體。11c的1H NMR(CDCl3)δ5.75(m，1H)，5.06(m，2H)，3.56(m，1H)，2.23(m，1H)，2.07(m，1H)，1.75-1.17(m，28H)，0.80(m，3H)。
將甲醇11c(6.22g，22.0mmol)溶于THF水溶液(5.5mL水和55mL THF)，向該溶液中加入NMO(4.42g，33.0mmol)，隨后加OsO4(280mg溶于THF中，1.10mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)過夜，此刻，加入二硫化鈉(4g)，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，然后用EtOAc(300mL)稀釋，全部混合物用水(2×40mL)和鹽水洗滌，得到的有機(jī)層經(jīng)干燥并在真空下濃縮得到相應(yīng)的三醇中間體。將其溶于MeOH(200mL)和水(40mL)中，向該溶液中加入NaIO4(10.6g，49.5mmol)，在室溫下攪拌1小時(shí)后，經(jīng)Celite過濾反應(yīng)混合物并用短硅膠柱色譜純化(30％EtOAc/己烷)得到～10g(＞100％)的粗品β-羥基醛。將這一得到的不純?nèi)┤苡趖-BuOH(100mL)和環(huán)己烷(14mL)中，在室溫下向該溶液中加入NaClO2(15.97g，176mmol)和KH2PO4(17.8g，132mmol)的(50mL)水溶液。在室溫下攪拌反應(yīng)6小時(shí)，然后在0℃下用5N HCl終止反應(yīng)到pH4。用3∶1的EtOAc/Et2O混合溶劑(3×250ml)萃取，有機(jī)層用鹽水洗滌、干燥并濃縮得到7.3g(＞100％)的粗品酸11d，其直接用于偶合反應(yīng)。11d的1H NMR(CDCl3)δ3.95(m，1H)，2.60-2.35(m，2H)，1.40-1.10(m，28H)，0.82(m，3H)。側(cè)鏈前體(12c)的制備 在1升的圓底燒瓶中加入在600ml無(wú)水MeOH中的十三烷醛(5.00g，25.2mmol)和Gly-Ome的鹽酸鹽(12.66g，100.8mmol)。向該反應(yīng)混合物中加入NaCNBH3(1.787g，28.44mmol)并在室溫下攪拌反應(yīng)過夜。濾出固體并在真空下除去溶劑，所得殘余物在CH2Cl2/飽和NaHCO3水溶液之間分配。有機(jī)層用NaHCO3溶液洗滌2次并用MgSO4干燥，然后濾出干燥劑并在真空下除去溶劑，在硅膠柱上純化，用50％EtOAc/己烷洗脫得到2.94g白色固體(12a)。
在50ml圓底燒瓶中加入在10ml無(wú)水THF中的甘氨酸衍生物12a(504.6mg，1.86mmol)、三乙胺(224.6mg，2.22mmol)。向其中一次加入(BOC)2O(494.3mg，2.26mmol)，攪拌反應(yīng)18小時(shí)，然后在真空下除去溶劑，所得油狀物用EtOAc處理并用1N HCl洗兩次，用水和鹽水各洗一次并用MgSO4干燥，然后濾出干燥劑并在真空下除去溶劑得到463.3mg無(wú)色油狀物(12b)，其未經(jīng)純化使用。
向含有5ml THF的50ml圓底燒瓶中加入甲酯12b(463.3mg，1.25mmol)，向其中加入1.8ml 1N LiOH溶液，攪拌得到的反應(yīng)混合物過夜。加入1.8ml 1N HCl溶液終止反應(yīng)，然后在真空下除去THF并用CH2Cl2萃取得到的水層2次。有機(jī)相用MgSO4干燥，然后濾出干燥劑并在真空下除去溶劑得到246.2mg無(wú)色油狀物(12c)，其未經(jīng)純化使用。側(cè)鏈前體(13a)的制備 在50mL圓底燒瓶中，將上面得到的甲酯12b(499.7mg/1.84mmol)溶于1∶1乙酐/吡啶混合物中，攪拌反應(yīng)過夜。然后在真空下除去溶劑，得到的油狀物用CH2Cl2處理并用1N HCl洗滌2次，用水和鹽水各洗滌1次并用MgSO4干燥，然后濾出干燥劑并在真空下除去溶劑得到319.9mg無(wú)色油狀物(13a)，其未經(jīng)純化使用。甘氨酸側(cè)鏈前體(14-a)的一般制備例如下列方法描述用Fmoc-甘氨酸-wang樹脂和十三烷酸合成十三烷酰基-甘氨酸。
在一兩端玻璃封端的100mL反應(yīng)管中，將Fmoc-甘氨酸-wang樹脂(10g，4.4mmol)加到50mL 30％哌啶/DMF中，震搖反應(yīng)20分鐘并用DMF洗滌3次，用異丙醇洗滌3次，再用DMF洗滌3次。向樹脂中加入十三烷酸(4.708g，22mmol)的50mL DMF溶液并向這一混合物中加入HOBt(2.97g，22mmol)和DIC(2.77g，22mmol)。將反應(yīng)器置于振蕩器上過夜。然后用下列溶劑洗滌樹脂DMF 3次，二氯甲烷3次，MeOH 3次，THF 3次和二氯甲烷3次。在真空爐中干燥樹脂珠1小時(shí)，向樹脂中加入100 mL 95％的TFA/H2O，震搖反應(yīng)1.5小時(shí)并用TFA洗滌非-樹脂產(chǎn)物并收集。在真空爐中干燥得到白色殘余物，用甲苯共沸蒸餾得到十三烷酰基-甘氨酸(1.14g，95％)1H NMR(THF)0.82-0.92(t，J＝7.2，3H)，1.2-1.4(s，18H)，1.52-1.62(m，2H)，2.10-2.17(t，J＝7.2，2H)，3.83-3.89(d，J＝7.1，2H)，7.04-7.17(s，1H)，10.8-10.9(s，1H)。
下述結(jié)構(gòu)II用于描述在實(shí)施例1-17中得到的產(chǎn)品。 實(shí)施例1非對(duì)映異構(gòu)體1-1和1-2的合成 將羥基苯并三唑(55.8mg，0.413mmol)和1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(82.4mg，0.430mmol)加到化合物1c的4ml無(wú)水DMF中。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物反應(yīng)10小時(shí)，此后加入Z-PSN(375.2mg，0.271mmol)。5小時(shí)后HPLC顯示CBZ-保護(hù)的假單胞菌素核(Z-PSN)消耗完。在真空下除去溶劑并用1∶1 ACN/H2O處理得到的殘余物并經(jīng)制備HPLC純化，這樣得到2個(gè)較大的峰，其質(zhì)譜表明這些峰相應(yīng)于2個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體1-1(88.3mg)和1-2(166.3mg)。非對(duì)映異構(gòu)體1-1的去保護(hù) 在一50ml圓底燒瓶中加入10ml MeOH/1ml冰AcOH和非對(duì)映異構(gòu)體1-1(82.0mg，0.048mmol)，脫氣后向反應(yīng)混合物加入89.1mg 10％Pd/C并在1atm H2氫化30分鐘。經(jīng)過濾除去催化劑后經(jīng)制備HPLC純化并冷凍干燥得到21.7mg化合物1-3(R1＝H)。MS(Ionspray)對(duì)于C58H94ClN12O19(M+H)+計(jì)算值為1297.64，實(shí)驗(yàn)值為1297.8。非對(duì)映異構(gòu)體1-2的去保護(hù) 如對(duì)于非對(duì)映異構(gòu)體1-1所述用152.8mg的10％Pd/C氫化非對(duì)映異構(gòu)體1-2(152.8mg，0.089mmol)30分鐘，HPLC顯示原料完全消耗并形成兩個(gè)產(chǎn)物峰，經(jīng)制備HPLC純化并冷凍干燥后得到化合物1-4(18.0mg)和化合物1-5(11.3mg)?；衔?-4MS(Ionspray)對(duì)于C58H94ClN12O19(M+H)+計(jì)算值為1297.89，實(shí)驗(yàn)值為1297.8?；衔?-5MS(Ionspray)C58H92ClN12O18(M+H)+計(jì)算值為1279.63，實(shí)驗(yàn)值為1281.7。
下表1中所列的化合物是用與上述相同的酰化和去保護(hù)方法，用標(biāo)出的側(cè)鏈前體合成的。對(duì)于表1中列出的每一化合物，R1為氫。
表1 *雖然該化合物和無(wú)N-甲基的化合物表現(xiàn)出很低的活性，但其中烷基鏈連續(xù)從C11增加到C15的化合物，其活性明顯升高。這一類側(cè)鏈可通過在14-a的制備中描述的制備方法制備。
實(shí)施例15化合物15-1的合成 向50ml圓底燒瓶中加入31.3mg(0.0237mmol)化合物12-1和5ml TFA(預(yù)冷至0℃)。在該溫度下攪拌該反應(yīng)混合物15min，在真空下除去TFA，然后用水處理殘余物并冷凍干燥得到24.3mg化合物15-1。不需要進(jìn)一步純化。
實(shí)施例16實(shí)施例16說明β-氨基取代的側(cè)鏈的連接化合物16a、16b、16c和16d的制備
加熱叔丁氧基羰基亞甲基三苯基正膦(5.0g，13.3mmol)和十二醛(2.2ml，10mmol)的甲苯(50ml)溶液回流1小時(shí)20分鐘。經(jīng)硅膠塞過濾該溶液以除去磷試劑，然后在真空下濃縮得到粗品油狀物，該油狀物經(jīng)硅膠柱純化，用2％的乙酸乙酯的己烷溶液洗脫得到2.36g(收率84％)的化合物16a。MS-283.4(M+1)NMR與結(jié)構(gòu)一致。
在-78℃下，將丁基鋰(1.6M在己烷中)(1.19ml，1.9mmol)慢慢加到(R)-芐基甲基芐基胺(0.42ml，2.0mmol)的THF(5ml)溶液中，然后滴加16a(500mg，1.77mmol)的THF溶液。在-78℃下攪拌混合物1小時(shí)，然后將反應(yīng)混合物倒到飽和的NH4Cl溶液中并用乙醚萃取(2x)。乙醚溶液用MgSO4干燥并在真空下濃縮得到0.95g16b，為粗品油狀物，該油狀物不用純化用于下一步。
在55℃下，將16b(0.95g)的乙醇(25ml)溶液和Pd(OH)2/C(0.47g)置于60psi H2下18小時(shí)。過濾懸浮液，然后在真空下濃縮得到280mg(收率53％)粗品16c，其直接用于下一步。
在THF(10ml)中混合化合物16c(280mg，0.93mmol)和N-芐基氧基羰基氧基琥珀酰亞胺(274mg，1.1mmol)并攪拌過夜。在真空下除去溶劑并將油狀產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱色譜純化，用5％乙酸乙酯的己烷溶液作為洗脫劑得到268mg(收率66％)的叔丁基酯16d。NMR與目標(biāo)結(jié)構(gòu)吻合。在0℃下，將該酯(97mg，0.224mmol)溶于三氟乙酸(2ml)中0.5小時(shí)按定量收率除去叔丁基酯(16d)?；衔?6-1的合成 將化合物16d溶于DMF(2ml)中，加入羥基苯并三唑(36.4mg，0.269mmol)和1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(47.1mg，0.246mmol)并攪拌該溶液18小時(shí)。加入CBZ保護(hù)的假單胞菌素核(Z-PSN)(277mg，0.185mmol)并再攪拌反應(yīng)18小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化并冷凍干燥得到136.3mg(收率42％)酰化的CBZ保護(hù)的假單胞菌素衍生物，為白色固體。MS-1743(M)并且NMR與預(yù)定結(jié)構(gòu)一致。
將酰化的化合物(130mg，0.0746mmol)的甲醇(10ml)和乙酸(1.5ml)溶液與10％Pd/C(120mg)置于氫氣囊下20分鐘。過濾該溶液并用制備HPLC純化，冷凍干燥得到23mg(收率18％)16-1的三氟乙酸鹽，為白色固體。MS-1206.8(M)并且NMR與預(yù)定結(jié)構(gòu)一致?；衔?6-1抗白色念珠菌和新型隱球酵母活性很低或無(wú)活性，與羥基類似物相比，其活性顯著降低。
實(shí)施例17實(shí)施例17說明手性側(cè)鏈的連接側(cè)鏈前體17d的制備 向(S)-聯(lián)萘酚(240mg，0.84mmol)的THF溶液中加入4A分子篩(4g)，然后加入純的Ti(OPr-I)4(0.25mL，0.84mmol)。反應(yīng)混合物很快變紅并保持紅色，將由此制備的手性催化劑(17b)用于以下反應(yīng)。
在-78℃下、15分鐘以上，向新制的(S)-聯(lián)萘酚-Ti催化劑17b(0.42mmol)的THF溶液(4mL)中加入含有三甲基甲硅烷基二甲基乙烯酮縮醇(trimethylsilyldimethylketene acetal)(0.43mL，2.1mmol)和不飽和醛17a(500mg，2.1mmol)的THF溶液。在-78℃下攪拌反應(yīng)1小時(shí)，然后在室溫下攪拌過夜。用飽和NaHCO3溶液終止反應(yīng)并用EtOAc(100mL)萃取。有機(jī)層用NaHCO3、鹽水洗滌并用無(wú)水MgSO4干燥，過濾并在真空下濃縮，殘余物用硅膠柱色譜純化(10％EtOAc/己烷)得到257mg(36％)目的產(chǎn)物17c。17c的1H NMR(CDCl3)δ5.29(m，2H)，3.65(s，3H)，3.53(t，J＝7.3Hz，1H)，2.33(d，J＝6.3Hz，1H，3’-OH)，1.97(m，4H)，1.65-1.22(m，20H)，1.13(s，3H)，1.12(s，3H)，0.84(m，3H)。
用NaOH水溶液(0.30mL，5N，1.52mmol)處理17c(259mg，0.76mmol)的THF溶液(5mL)，在50℃加熱反應(yīng)過夜。將反應(yīng)混合物冷至0℃并用5N HCl酸化到pH＝3，然后用EtOAc(75mL)萃取，有機(jī)層用水和鹽水洗滌，干燥并在真空下濃縮得到222mg(90％)粗品酸17d，其直接用于側(cè)鏈偶聯(lián)反應(yīng)。17d的1H NMR(CDCl3)δ5.28(m，2H)，3.56(m，1H)，1.95(m，4H)，1.60-1.10(m，26H)，0.83(m，3H)。17-1和17-2的制備 在室溫下，用HOBt(90.5mg，0.67mmol)和EDCI(128mg，0.67mmol)處理粗品酸17d(240mg，0.74mmol)的THF溶液(7mL)。攪拌1.5小時(shí)后加入DMAP(41mg，0.33mmol)。再攪拌2小時(shí)后加入在DMF(4mL)中的CBZ-保護(hù)的假單胞菌素核(614mg，0.44mmol)并在室溫下攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)混合物經(jīng)制備HPLC純化，冷凍干燥得到(160mg，21％)目的產(chǎn)物。
在0℃下，用TMSI(77mg，0.38mmol)處理CBZ-保護(hù)的化合物(53.4mg，0.032mmol)的乙腈溶液(2mL)。100分鐘后，用1∶1CH3CN/H2O終止反應(yīng)，得到的反應(yīng)混合物經(jīng)反相制備HPLC純化得到25.8mg(65％)目的最終產(chǎn)物17-1。
用R*為氫的適當(dāng)?shù)脑虾蜕鲜鱿嗤姆椒ㄖ频没衔?7-2。
實(shí)施例18實(shí)施例18說明手性烯基側(cè)鏈的連接側(cè)鏈前體18d的制備 在-78℃下，向18a(993mg，3.73mmol)的二氯甲烷溶液(25mL)中加入二甲基乙烯酮縮甲醇縮三甲基甲硅醇(methyltrimethylsilyl dimethylketene acetal)(2.27mL，11.2mmol)和純的TiCl4(0.49mL，4.48mmol)。2小時(shí)后，在-78℃下用MeOH(5mL)終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物用二氯甲烷(3×40mL)萃取，合并的有機(jī)層用NaHCO3和鹽水洗滌。有機(jī)層經(jīng)干燥并在真空下濃縮得到殘余物，該殘余物經(jīng)色譜純化(15-20％EtOAc/己烷)得到837mg(61％)目的產(chǎn)物18b。18a的1H NMR(CDCl3)δ6.28-5.87(m，2H)，5.62-5.43(m，2H)，4.75(m，1H)，4.22(m，1H)，3.87(m，1H)，2.08-1.93(m，2H)，1.80-1.60(m，3H)，1.60-1.40(m，3H)，1.38-1.10(m，15H).18b的1H NMR(CDCl3)5.98-5.90(m，2H)，5.55-5.47(m，2H)，4.08(m，1H)，3.86(m，1H)，3.61(s，3H)，3.50(m，1H)，2.00-1.96(m，2H)，1.74-1.63(m，3H)，1.50-1.00(m，24H)。
向18b(837mg，2.27mmol)的二氯甲烷溶液(22mL)中加入PCC(0.98g，4.54mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)18小時(shí)，然后經(jīng)過Celite板過濾，在真空下濃縮濾液得到粉紅色殘余物，經(jīng)硅膠色譜純化(20％EtOAc/己烷)得到441mg(53％)目的甲基酮18c。18c的1H NMR(CDCl3)δ5.92-5.87(m，2H)，5.48-5.43(m，2H)，3.88(m，1H)，3.56(s，3H)，3.49(m，1H)，2.59(dd，J＝6.4，14.7Hz，1H)，2.29(dd，J＝5.9，15.2Hz，1H)，2.06(s，3H)，1.96(m，2H)，1.63(m，2H)，1.40-0.90(m，20H)。
在室溫下，向18c(440mg，1.20mmol)的THF(4mL)和甲烷(methane)(2mL)溶液中加入7.5M KOH(1mL)。在室溫下攪拌4小時(shí)后，用1N HCl酸化到pH＝3，用EtOAc(3×30mL)萃取反應(yīng)混合物，合并的萃取液用水(2×10mL)和鹽水洗滌，有機(jī)層經(jīng)干燥和在真空下濃縮得到388mg(＞100％)粗品酸18d，其被直接用于側(cè)鏈的偶聯(lián)反應(yīng)?；衔?8-1的制備 向粗品酸18d(～1.66mmol)的THF溶液(10mL)中加入HOBt(244mg，1.66mmol)和EDCI(318mg，1.66mmol)。在室溫下攪拌5小時(shí)后，加入Alloc-保護(hù)的假單胞菌素核(614mg，0.50mmol)的DMF溶液(5mL)，在室溫下攪拌幾天后，向反應(yīng)混合物加入DMAP(61mg，0.50mmol)。再攪拌12小時(shí)后，反應(yīng)混合物經(jīng)反相HPLC純化，然后冷凍干燥得到225mg(30％)alloc-保護(hù)的酰化衍生物。
在室溫下，向脫氣的alloc-保護(hù)的酰化衍生物(240mg，0.16mmol)的THF(20mL)和HOAc(1mL)溶液中加入PdCl2(PPh3)2(23mg，0.032mmol)和Bu3SnH(0.87mL，3.23mmol)。1.5小時(shí)后，反應(yīng)混合物經(jīng)制備HPLC純化得到33mg(17％)化合物18-1。
除了上述實(shí)施例中列出的化合物外，也制備了下列N-?；苌铮@些衍生物表現(xiàn)出有限的活性或者非顯著的活性。即使這些化合物不能用作殺真菌劑，它們也能為設(shè)計(jì)具有最佳活性的化合物提供有價(jià)值的參考。
除非另有說明，實(shí)施例中的每一化合物都表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)目拱咨钪榫⑿滦碗[球酵母、煙曲霉、近平滑假絲酵母或莢膜組織胞漿菌的活性。但根據(jù)合成的這些化合物觀察到了在活性中有下列基本趨勢(shì)。β-羥基的立體化學(xué)優(yōu)選為R型；不考慮立體化學(xué)和不飽和程度，較長(zhǎng)的烷基鏈長(zhǎng)(即，C12-C20)趨于比較短的烷基鏈(例如，＜C11)具有更高的活性；除去β-羥基、α，α-二取代、降低在烷基和烷氧基取代基中的烷基鏈長(zhǎng)、特別剛性及增加側(cè)鏈中的支鏈都趨于具有比長(zhǎng)的柔性鏈低的活性。
因此，下列結(jié)構(gòu)表示的烷基側(cè)鏈對(duì)殺真菌治療是優(yōu)選的 其中Ra和Ra’獨(dú)立為氫或甲基、或者Ra或Ra’之一為烷基氨基、與Rb或Rb’一起形成六元的環(huán)烷基環(huán)、六元的芳環(huán)或雙鍵、或者與Rc一起形成六元的芳環(huán)；Rb或Rb’獨(dú)立為氫或甲基，及Rb或Rb’為羥基，條件是當(dāng)Ra、Rb、Rd、Re為氫，Rc為氫和Rf為正己基、正辛基或正癸基，或者Ra、Rb、Rd、Re為氫，Rc為羥基和Rf為正辛基、正壬基或正癸基時(shí)，Rb’不為羥基；Rc為氫、羥基、C1-C4烷氧基、羥基烷氧基，或者與Re一起形成6元芳環(huán)或C5-C6環(huán)烷基環(huán)；Re為氫，或與Rf一起為六元芳環(huán)、C5-C14烷氧基取代的六元芳環(huán)或者C5-C14烷基取代的六元芳環(huán)；Rf為C8-C14烷基，或C5-C11烷氧基。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)I表示的化合物和其可藥用鹽和其溶劑化物 其中R為 其中Ra和Ra’獨(dú)立為氫或甲基、或者Ra或Ra’為烷基氨基、與Rb或Rb’一起形成六元環(huán)烷基環(huán)、六元芳香環(huán)或雙鍵、或與Rc一起形成六元芳香環(huán)；Rb和Rb’獨(dú)立為氫、鹵素或甲基，或者Rb或Rb’為氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羥基，條件是當(dāng)Ra、Rb、Rd、Re為氫、Rc為氫和Rf為正己基、正辛基或正癸基，或Ra、Rb、Rd、Re為氫，Rc為羥基和Rf為正辛基、正壬基、或正癸基時(shí)，Rb不為羥基；Rc為氫、羥基、C1-C4烷氧基、羥基烷氧基，或與Re一起形成六元芳香環(huán)或C5-C6環(huán)烷基環(huán)；Re為氫、或與Rf一起形成六元芳香環(huán)、C5-C14烷氧基取代的六元芳香環(huán)、或C5-C14烷基取代的六元芳香環(huán)，和Rf為C8-C18烷基、C5-C11烷氧基或聯(lián)苯基；或R為 其中Rg為氫或C1-C13烷基，和Rh為C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n芳基、或-(CH2)n-(C5-C6環(huán)烷基)，其中n＝1-2；或R為 其中Ri為氫、鹵素、或C5-C8烷氧基，和m為1、2或3；R為 其中Rj為C5-C14烷氧基或C5-C14烷基，和p＝0、1或2；R為 其中Rk為C5-C14烷氧基；或R為-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基)，其中Rm為H、-CH3或-C(O)CH3。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中結(jié)構(gòu)I具有下列立體化學(xué)
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R為 其中Ra和Ra’獨(dú)立為氫或甲基，或者Ra或Ra’為烷基氨基，與Rb或Rb’一起形成六元環(huán)烷基環(huán)、六元芳香環(huán)或雙鍵，或與Rc一起形成六元芳香環(huán)；Rb和Rb’獨(dú)立為氫、鹵素、或甲基、或者Rb或Rb’為氨基、烷基氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羥基，條件是當(dāng)Ra、Rb、Rd、Re為氫，Rc為氫和Rf為正己基、正辛基或正癸基，或Ra、Rb、Rd、Re為氫，Rc為羥基和Rf為正辛基、正壬基或正癸基時(shí)，Rb’不為羥基；Rc為氫、羥基、C1-C4烷氧基、羥基烷氧基、或與Re一起形成六元芳香環(huán)或C5-C6環(huán)烷基環(huán)；Re為氫，或與Rf一起為六元芳香環(huán)、C5-C14烷氧基取代的六元芳香環(huán)、或C5-C14烷基取代的六元芳香環(huán)；和Rf為C8-C18烷基、C5-C11烷氧基、或聯(lián)苯基。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中Rb’為羥基，條件是當(dāng)Ra、Rb、Rd、Re為氫和Rf為正己基、正辛基或正癸基時(shí)，Rc不為氫或當(dāng)Rf為正辛基、正壬基、或正癸基時(shí)Rc不為羥基。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求保護(hù)的化合物在制備用于治療全身真菌感染或真菌皮膚感染的藥物中的用途。
6.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求2的假單胞菌素化合物和可藥用載體。
7.一種在需要治療的動(dòng)物中治療抗真菌感染的方法，它包括對(duì)所述動(dòng)物給藥權(quán)利要求2中的假單胞菌素化合物的步驟。
8.制備假單胞菌素核的方法，它包括提供具有包含至少一個(gè)γ或δ羥基的N-?；榛鶄?cè)鏈的假單胞菌素化合物和所述假單胞菌素化合物與一種酸反應(yīng)制備所述假單胞菌素核的步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述假單胞菌素核由結(jié)構(gòu)I-A表示。 其中R’為-NH2或-NHp-Pg，其中Pg為氨基保護(hù)基和p為0或1。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述具有包含至少一個(gè)γ或δ羥基的N-?；榛鶄?cè)鏈的假單胞菌素化合物選自假單胞菌素A、假單胞菌素A’和假單胞菌素C。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述酸為三氟乙酸和乙酸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述酸為三氟乙酸。
13.假單胞菌素核，它是由權(quán)利要求8的方法制備的。
14.權(quán)利要求13的假單胞菌素核，其中所述核由結(jié)構(gòu)I-A表示。 其中R’為-NH2或-NHp-Pg，其中Pg為氨基保護(hù)基和p為0或1。
15.由結(jié)構(gòu)I-A表示的假單胞菌素核。 其中R’為-NH2或-NHp-Pg，其中Pg為氨基保護(hù)基和p為0或1。
全文摘要
描述了具有結(jié)構(gòu)(I)的半合成假單胞菌素化合物,其可用作殺真菌劑或設(shè)計(jì)殺真菌劑的中間體。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1360593SQ00810291
公開日2002年7月24日 申請(qǐng)日期2000年6月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月15日
發(fā)明者M·D·貝爾沃, S·H·陳, C·W·德克, S·L·赫爾曼, J·A·亞米森, L·E·帕特森, M·J·羅德里格茨, X·D·孫, W·W·圖爾納, V·瓦蘇德范, M·J·茨維菲爾 申請(qǐng)人:伊萊利利公司