專利名稱：抑制細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的矢車菊苷配質(zhì)低聚體和以此為有效成分的藥物的制作方法
本申請是以1999年7月16日向韓國工業(yè)產(chǎn)權(quán)局提交的申請?zhí)枮?0-1999-0028877的專利申請為基礎(chǔ)，該專利申請的內(nèi)容已包含在下文中。
特別是，膠原酶IV的MMP(MMP-2和MMP-9)，即72-kD和92-kD膠原酶是癌細(xì)胞滲透和轉(zhuǎn)移中最重要的酶，因?yàn)樗鼈兎纸饽z原酶IV，該膠原酶IV是基膜的主要結(jié)構(gòu)構(gòu)成，該基膜是阻止癌轉(zhuǎn)移的第一道防線。在牙科疾病中MMP引起從成纖維細(xì)胞，多形核白細(xì)胞，上皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞中分泌膠原酶，以及從牙周細(xì)菌分泌出膠原酶以分解作為牙周組織基質(zhì)的膠原，形成牙齦退化，并繼續(xù)發(fā)展成牙周疾病。更進(jìn)一步的是，近來發(fā)現(xiàn)MMP與皮膚衰老，光引起的皮膚老化，及皺紋形成有密切的關(guān)系(Br.J.Dermatoal.，2000；142，267-273，ARCHDermatol.Res，2000；292，27-31，F(xiàn)ree Radical Biol.Med.，1999；27，729-737)。
因此，膠原酶抑制劑作為藥物的功能是有用于預(yù)防和治療癌癥滲透和轉(zhuǎn)移，膠原相連組織的分解引起的疾病，如牙周疾病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎癥，皮膚皺紋和老化，糖尿病，角膜潰瘍，表皮潰瘍，胃潰瘍，骨質(zhì)疏松癥，外傷，和燒傷，癌癥滲透和轉(zhuǎn)移，膠原相連組織的分解。
已發(fā)現(xiàn)的能抑制MMP活性的藥物包括四環(huán)素類藥物如四環(huán)素，二甲胺四環(huán)素和強(qiáng)力霉素，和肽衍生物。
肽衍生物與膠原酶很相似，酶抑制劑包括抑制用羥肟酸，硫醇，和能螯合在膠原酶活性部位的鋅離子的羧基烷基基團(tuán)(Pharmacol.Ther.，1997；75，69-75，U.S.Patent Nos.4996358，5183900，5300674，5861436，等)。例如，在美國專利5514677已經(jīng)公開類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎癥，皮膚疾病，骨質(zhì)疏松疾病，癌癥轉(zhuǎn)移，和傷口等能通過用羥肟酸抑制膠原酶來治療。更進(jìn)一步的是，美國專利4666897公開了膠原酶的過高活性能用四環(huán)素，二甲胺四環(huán)素，強(qiáng)力霉素來抑制。
下列化學(xué)式1所代表的矢車菊苷配質(zhì)是一個(gè)低聚體和多聚體的通式，或更多具有以兒茶精(catechin)，表兒茶精(epicatechin)，兒茶精沒食子酸鹽(catechingallate)，表兒茶精沒食子酸鹽(epicatechin gallate)，沒食子酸鹽兒茶精(gallocatechin gallate)，或表沒食子兒茶精沒食子酸鹽(epigallocatechin gallate)為主軸的二聚體體，這是一個(gè)在大多數(shù)植物體中都有的非水解性丹寧。這樣的矢車菊苷配質(zhì)具有一個(gè)結(jié)合蛋白的能力，特別是二聚體具有抗炎癥能力。兒茶精(catechin)被認(rèn)為是綠茶丹寧，被報(bào)道為具有顯著的抗癌能力。
(化學(xué)式1) 其中，當(dāng)矢車菊苷配質(zhì)是兒茶精(catechin)，則R1＝OH，R2，R3＝H；當(dāng)它是表兒茶精(epicatechin)時(shí)，則R1＝H，R2＝OH，R3＝H；當(dāng)它是表兒茶精-3-O-沒食子酸鹽(epicatechin-3-O-gallate)，則R1＝H，R2＝O-galloyl，R3＝；當(dāng)它是表兒茶精沒食子酸鹽(epigallocatechin)，則R1＝H，R2，R3＝OH；當(dāng)它是表兒茶精-3-O-沒食子酸鹽(epigallocatechin-3-O-gallate)，則R1＝H，R2＝O-galloyl，R3＝OH。更進(jìn)一步的是，多聚體是通過單聚體(4-8或4-6)之間鍵連接形成。
在美國專利5494661，5877206，5646178，4797421和國際申請專利(公開號(hào)WO93/24106)等中均已公開了與抗氧化影響和抗病毒的有關(guān)技術(shù)，防止矢車菊苷配質(zhì)影響的細(xì)菌粘連。另，用矢車菊苷配質(zhì)作藥物的相關(guān)技術(shù)(歐洲專利公開號(hào)812592，日本專利Laid-open公開號(hào)Sho 61-83958，等)，用矢車菊苷配質(zhì)作化妝品的相關(guān)技術(shù)(歐洲專利公開號(hào)694305，日本專利Laid-open公開號(hào)Sho63-36420，等)，用矢車菊苷配質(zhì)作食物添加劑的相關(guān)技術(shù)(日本專利Laid-open公開號(hào)Hei 10-004923，Hei 7-49333等)，及矢車菊苷配質(zhì)的制備方法(日本專利Laid-open公開號(hào)Sho 63-3267774，南非專利公開號(hào)8205023等)均已得到公開。
更進(jìn)一步的是，與用綠茶成分抑制細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶有關(guān)的各種研究均已有報(bào)道。例如，綠茶成分，表兒茶精沒食子酸鹽，表沒食子兒茶精沒食子酸鹽(epigallocatechin gallate)，微生物和牙齦裂縫溶液中溶膠原的抑制活性(JPeriodontal.，1993；64，630-636)；表兒茶精沒食子酸鹽，表沒食子兒茶精沒食子酸鹽，茶黃素抑制癌細(xì)胞滲透入膠膜(J.Agric.Food Chem.1999；47，2350-2354)；已表明綠茶的表兒茶精沒食子酸鹽和表沒食子兒茶精沒食子酸鹽有作用于MMP-2，MMP-9，MMP-12的影響(Biochem.Biophys.Acta，2000；1478，51-60)；已表明綠茶和紅茶的兒茶精和茶黃素有抑制肺癌細(xì)胞株的MMP-2和MMP-9怕活性(Biosci Biotech Biochem.，1997；61，1504-1506)，等。然而，所有這些發(fā)現(xiàn)表明兒茶精或兒茶精沒食子酸鹽衍生物具有較低的分子量，而用本發(fā)明的矢車菊苷配質(zhì)低聚體混合液抑制MMP酶卻是未知的，該混合液是以3-12個(gè)黃烷-3-醇單體多聚連接成的。
另一方面，榆樹皮質(zhì)，即榆樹屬的榆樹macrocarpa，Pumila，Daviciana，Americana的根和莖的樹皮被傳統(tǒng)地用于炎癥，胃潰瘍等。近來，美國專利6045800報(bào)道榆樹皮質(zhì)具有抑制與牙周疾病有關(guān)的膠原酶的顯著活性，與炎癥抑制評(píng)估有關(guān)的結(jié)果已被公開(J.Ethanopharm，1998；62，129-135)。發(fā)明目的調(diào)查研究結(jié)果表明，榆樹皮質(zhì)的成分具有顯著的膠原酶抑制活性，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)矢車菊苷配質(zhì)低聚體是個(gè)主要成分。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一個(gè)抑制細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性的矢車菊苷配質(zhì)低聚體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一個(gè)包含天然成分，矢車菊苷配質(zhì)低聚體和天然的表沒食子兒茶精沒食子酸鹽的藥物組合物。其中，矢車菊苷配質(zhì)低聚體與合成的細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(如傳統(tǒng)的強(qiáng)力霉素等)相比較則更高效，更安全。其中，表沒食子兒茶精沒食子酸鹽作為活性成分。


圖1表明用HPLC/ESI質(zhì)譜儀(高效液相色譜層析/電子噴霧電離)，F(xiàn)inniganLCQ分析硅乙基乙酸部分的結(jié)果。結(jié)果表明，矢車菊苷的分子量為290(9.1minutes)，兩種矢車菊苷配質(zhì)二聚體的分子量578(17.08minutes，18.33minutes)，和分子量為422(13.34minutes，13.75minutes)的不明確物質(zhì)。
圖2表明檢測餾分4主要成分(矢車菊苷配質(zhì)低聚體)的分子量中加入鈉后的[M+鈉]+質(zhì)量的結(jié)果，以氰-4-羥基肉桂酸作為基質(zhì)，并用MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight)。
圖3表明用HPLC/ESI質(zhì)譜儀跟蹤五聚物的質(zhì)量為1441的[M-H]和質(zhì)量為1555的[M+TFA-]-的結(jié)果。
圖4表明用HPLC/ESI質(zhì)譜儀的結(jié)果，可以預(yù)測餾分4中檢測到的三聚體和十二聚體的矢車菊苷配質(zhì)低聚體的峰值，具可預(yù)測質(zhì)量的離子分配從餾分4色譜分析的較早期向較晚期轉(zhuǎn)變，多聚程度則從3開始增加。
圖5表明在色譜儀上檢測的保留時(shí)間區(qū)段掃描得到的質(zhì)峰，與用HPLC/ESI質(zhì)譜儀的指定質(zhì)峰相鄰近，如果為四聚體設(shè)置保留時(shí)段時(shí)，當(dāng)主峰為1153([M-H]-)和1267([M+TFA-]-)，則表明餾分4的主要成分是矢車菊苷配質(zhì)低聚體；如果為五聚體設(shè)置保留時(shí)段時(shí)，當(dāng)主峰為1441([M-H]-)和1555([M+TFA-]-)，則表明餾分4的主要成分是矢車菊苷配質(zhì)低聚體；和圖6表示矢車菊苷配質(zhì)低聚體與從牙齦韌帶細(xì)胞上通過信號(hào)識(shí)別蛋白體受體分泌的膠原酶IV型MMP上的強(qiáng)力霉素的抑制效果的比較，表明矢車菊苷配質(zhì)低聚體的抑制效果約是強(qiáng)力霉素的10倍。在圖6，數(shù)字1是矢車菊苷配質(zhì)低聚體的抑制效果，數(shù)字2是強(qiáng)力霉素的抑制效果。
因而，本說明書被認(rèn)為是解釋而不是限制本發(fā)明。
為達(dá)到以上所述的目的，本發(fā)明提供了一種抑制細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性的矢車菊苷配質(zhì)低聚體。
本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和/或治療由細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性引起的疾病的藥物組合物，包括以矢車菊苷配質(zhì)低聚體作為活性組分的藥物組合物。
現(xiàn)在更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
本發(fā)明人已研究了美國專利6045800公開的榆樹皮質(zhì)中的活性成分，該成分被傳統(tǒng)地認(rèn)為使用在傷口，癌癥轉(zhuǎn)移，牙科疾病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎癥，角膜潰瘍，骨質(zhì)疏松癥，胃潰瘍，外傷，皮膚皺紋，痤瘡和燒傷等上是有效的，是為了發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)更安全更具有活性的MMP活性抑制劑。本發(fā)明人確定了矢車菊苷配質(zhì)低聚體(3-12個(gè)基本單體黃烷-3-醇多聚連接而成)是榆樹皮質(zhì)中的主要活性成分，其對MMP的抑制效力高于傳統(tǒng)的強(qiáng)力霉素或表沒食子兒茶精沒食子酸鹽，并完成了本發(fā)明。
矢車菊苷配質(zhì)低聚體宜用作MMP活性抑制劑。MMP選自溶膠原蛋白酶，MMP-1，MMP-8，和MMP-2和MMP-9的膠原酶IV。
矢車菊苷配質(zhì)低聚體宜制成片劑，膠囊，粉末，軟膏，溶液，凝膠，糊劑，補(bǔ)片或粒劑等，制備物中矢車菊苷配質(zhì)低聚體的含量宜為0.0001-5wt％。
矢車菊苷配質(zhì)低聚體是從正丁醇部分分離得到的，而初級(jí)提取物是從榆樹屬植物的榆樹皮質(zhì)中，用極性溶劑經(jīng)n-己烷、二氯甲烷、乙基乙酸和正丁醇溶劑分餾后提取的。正丁醇部分進(jìn)行葡聚糖凝膠LH-20柱層析，分離該部分濃縮得到矢車菊苷配質(zhì)低聚體。例如，正丁醇部分經(jīng)水-甲醇混合液(甲醇濃度由80％-100％遞增)進(jìn)行逐級(jí)洗脫，或用其他辦法，用100％甲醇連續(xù)洗脫成不同部分，以薄層層析為基礎(chǔ)，結(jié)合濃縮得到矢車菊苷配質(zhì)低聚體。
矢車菊苷配質(zhì)低聚體是一種三聚體至十二聚體的混合物，其中有3至12個(gè)黃烷-3-醇單體連接構(gòu)成，其分子量為1518，平均聚合度為5.3，它可以從許多與榆樹皮質(zhì)成分相同的葡萄子(grapestone)、大黃、多邊多花根(polygoni multifloriradix)、樟樹、肉桂樹皮、中國香柏、茶屬籽、高粱、蕎麥、橡膠樹等植物中提取。它也可以從榆樹皮質(zhì)中提取。
結(jié)合以下的實(shí)驗(yàn)、實(shí)施例、對照實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行更詳盡的解釋。然而，這些只是闡明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1-1粗提取制備物和膠原酶活性抑制初級(jí)提取物是通過將榆樹皮質(zhì)壓碎成10-200目(mesh)的粉末，在壓碎的植物粉末中加入提取溶劑，室溫下冷浸混合物72小時(shí)，過濾生成物，再濃縮過濾提取物得到的。提取溶劑適宜從包括純化水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、甘油、乙烯乙二醇、丙烯乙二醇、1，3-丁烯乙二醇、乙烷基醋酸、丙酮及其混合物中選擇。
將初級(jí)提取物懸浮于水，再利用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行依次的溶劑分餾來得到餾分。溶劑分餾后殘存的過濾物作為是水餾分。MMP的一種膠原酶的活性抑制是用得到的五種餾分進(jìn)行檢測。
因此，正己烷或二氯甲烷部分沒有顯示出酶活性抑制效果，而乙酸乙酯和正丁醇部分顯示出活性抑制效果。
進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)是為了闡明顯示出酶活性抑制效果的正己烷或二氯甲烷部分的活性成分。在得到的乙酸乙酯餾分上用硅凝膠柱層析法。
硅氯仿，硅乙酸乙酯，硅丙酮和硅甲醇部分是通過用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇洗脫液依次洗脫來分別得到的。盡管作為測試膠原酶這些餾分抑制效果的結(jié)果，抑制效果顯示在硅乙酸乙酯餾分，但是它們并不優(yōu)于榆樹皮質(zhì)初級(jí)提取物和強(qiáng)力霉素(見下面的實(shí)施例2)。
硅乙酸乙酯餾分是利用HPLC/ESL質(zhì)譜儀，F(xiàn)innigan LCQ和薄層層析來獲得圖1的結(jié)果，其顯示出具有低分子量的矢車菊苷配質(zhì)單聚體、兩種矢車菊苷配質(zhì)二聚體和未確定的物質(zhì)存在。
就象硅乙酸乙酯部分的結(jié)果一樣，對每個(gè)成分膠原酶活性抑制測試的結(jié)果與通常作為藥物的那些強(qiáng)力霉素和榆樹皮質(zhì)初級(jí)提取物相比較，沒有顯示出更好的效果。
另一方面，利用溶劑分餾初級(jí)提取物得到的正丁醇餾分進(jìn)行葡萄糖凝膠LH-20柱層析。初級(jí)提取物依次用100wt％甲醇洗脫，通過層析法分餾和重新組合來指定它們?yōu)轲s分1，2，3和4。
以20wt％甲醇、50wt％甲醇、80wt％甲醇和100wt％甲醇作為洗脫液，用不同的方法，來洗脫初級(jí)提取物后，分別得到20％甲醇餾分、50％甲醇餾分、80％甲醇餾分和100％甲醇餾分。
對獲得的餾分1，2，3，4以及甲醇餾分進(jìn)行膠原酶活性的抑制測試，餾分1，2和3以及20wt％甲醇餾分和50wt％甲醇餾分沒有顯示任何效果，而餾分4，80wt％甲醇餾分和100wt％甲醇餾分則顯示出了效果。尤其是，餾分4和100wt％的甲醇餾分顯示出了極好的效果，顯示出比通常的強(qiáng)力霉素和表沒食子兒茶精沒食子酸鹽藥物更高的酶抑制活性。
當(dāng)加入10％FeCl3溶液時(shí)，觀察到所得餾分4和100wt％甲醇餾分的顏色變?yōu)楹＼娝{(lán)，可證實(shí)矢車菊苷配質(zhì)的存在。在下文中，也指矢車菊苷配質(zhì)低聚體。
實(shí)施例1-2(分析餾分4的結(jié)構(gòu)(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀)將鈉加入到[M+sodium]+中，用PF生物航行系統(tǒng)4095(PF BiosystemsVoyager System 4095，Perkin Elmer)，并用氰基-4-羥基苯乙烯酸(cyano-4-hydroxycinnamic acid)作為基質(zhì)來檢測矢車菊苷配質(zhì)低聚體的分子量。
從如圖2所示的顯示出質(zhì)量從288增長到889(m/z)離子峰值的餾分4的MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果中，可以估計(jì)餾分4是兒茶精或表兒茶精單體通過單鍵連接成的矢車菊苷配質(zhì)低聚體。889m/z的離子峰值與三聚體相對應(yīng)，該三聚體中加入鈉原子量23至分子量866。如果以同樣的方法計(jì)算其余峰值，可以看出峰值與3-12個(gè)矢車菊苷配質(zhì)單體聚合成的各種矢車菊苷配質(zhì)低聚體相對應(yīng)。事實(shí)上，未檢測到預(yù)料中的二聚體峰值(601m/z峰值)，而餾分中的三至十二聚體則具有極好的效果。
這些結(jié)果與在可可和巧克力中含有的矢車菊苷配質(zhì)的分配非常相似(J.Agric.Food Chem.，1999，47，490-496，U.S.Patent No.5,877,206)。這個(gè)質(zhì)譜分析方法被應(yīng)用于計(jì)算分子分配度和聚合度，因?yàn)樗炔粫?huì)產(chǎn)生矢車菊苷配質(zhì)低聚體分子的餾分，也不會(huì)產(chǎn)生多重電荷(Phytochemistry 2000；54；173-181，and Rapid Comm.Mass Spectrometry 1997；11；31-36)。通過分析餾分4的峰高比率和分子量，如下面的表1所示。從表1可以看出平均分子量是1,518，平均聚合度是5.3。
實(shí)施例1-3(餾分4結(jié)構(gòu)的分析HPLC/ESI質(zhì)譜儀，F(xiàn)innigan LCQ)為獲得補(bǔ)充MALDI-TOF質(zhì)譜分析結(jié)果的結(jié)構(gòu)信息，用HPLC/ESI質(zhì)譜分析來檢測未完全電離合成物的分子量，如矢車菊苷配質(zhì)低聚體(Phytochemistry1997；44；351-357，J.Agric.Food Chem.，1999，47，3693-3710)，并產(chǎn)生大量電荷。
用HP1100系列HPLC(Hewlett-Palo Alto，U.S.A)來層析儀。硅(ZoRBOXSil，4.6×250mm，5um)被用做層析柱，溶劑條件設(shè)置為溶劑1(CH2Cl2∶CH3OH∶H2O∶CH3COOH＝82∶14∶2∶2)與溶劑2(CH3OH∶H2O∶CH3COOH＝96∶2∶2)的比率從開始時(shí)的100∶0至50分鐘時(shí)的12∶88，流率是1m/min。矢車菊苷配質(zhì)低聚體的280毫微米的吸收值用DAD探測器測出。利用與DAD探測器結(jié)合的質(zhì)譜分光計(jì)獲得的結(jié)果與利用MALDI-TOF質(zhì)譜分光計(jì)得到的結(jié)果進(jìn)行比較。在一個(gè)選擇質(zhì)譜跟蹤模式中，[M-H]-是從矢車菊苷配質(zhì)低聚體的分子量中去掉氫，[M+TFA-]-是在矢車菊苷配質(zhì)低聚體的分子量中加入三氟醋酸(TFA)，[M-H+TFA-]-2和[M+2TFA-]-2的質(zhì)峰的電荷數(shù)是2。例如，如圖3所示，五聚體通過指定的[M-H]-質(zhì)量1441和[M+TFA-]-質(zhì)量1555來追蹤，三聚體至六聚體以同樣方法通過指定它們的質(zhì)量來追蹤。因?yàn)槠呔垠w至十二聚體有2個(gè)而不是1個(gè)電荷數(shù)(J.Agric.Food Chem.，1999，47，490-496)，相關(guān)的質(zhì)量，例如七聚體中[M-H+TFA-]-2的1065峰值和[M+2TFA-]-2的1122峰值被追蹤。八至十二聚體以同樣方法被追蹤。
如圖4所示，三聚體至十二聚體的矢車菊苷配質(zhì)低聚體的期望峰值在活性餾分4中被檢測出，可以看出當(dāng)聚合度從3開始起增加時(shí)，具有預(yù)期質(zhì)量的離子的分配從餾分4的層析初始部位移動(dòng)到后部。
下面的表2顯示出利用電子噴射電離質(zhì)譜分光計(jì)檢測出的餾分4中的預(yù)期矢車菊苷配質(zhì)離子質(zhì)量和離子類型，空白部分表示它們沒有被檢測到。
圖5顯示出利用HPLC/ESI質(zhì)譜儀在掃描模式下，保持時(shí)間區(qū)域內(nèi)對層析圖檢測出接近質(zhì)量峰值的結(jié)果。顯示出餾分4的主要成分是矢車菊苷配質(zhì)低聚體，因?yàn)槿绻麑λ木垠w設(shè)置時(shí)間區(qū)域，主要質(zhì)量峰值是1153([M-H]-)和1267([M+TFA-]-)，如果對五聚體設(shè)置時(shí)間區(qū)域，主要質(zhì)量峰值是1141([M-H]-)和1555([M+TFA-]-)，因此，可以看出餾分4的主要成分是矢車菊苷配質(zhì)低聚體。
參考基質(zhì)輔助激光解吸附/離子化飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析儀和高性能液體色譜/電子噴射電離質(zhì)譜分光計(jì)(HPLC/ESI)的結(jié)果，餾分4的組分有極好MMP抑制效果，是通過單鍵連接的3至12的黃烷-3-醇單體構(gòu)成的矢車菊苷配質(zhì)低聚體混合物，其分子量為1,518，平均聚合度為5.3。實(shí)施例1-4(分析構(gòu)成矢車菊苷配質(zhì)低聚體的單體)用間苯三酚酸解(phloroglucinol acidolysis)來分析餾分中構(gòu)成矢車菊苷配質(zhì)低聚體的單體(J.Chromatogr.，1992；594，117-123)。當(dāng)聚合體和間苯三酚在酸性條件下反應(yīng)時(shí)，間苯三酚酸解是一個(gè)用間苯三酚分離聚合體中單體間的聯(lián)結(jié)來引發(fā)一個(gè)副反應(yīng)的反應(yīng)，并產(chǎn)生單體間苯三酚化合物作為反應(yīng)產(chǎn)物。利用HPLC對間苯三酚和餾分4在酸性環(huán)境下反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行分離和比較，結(jié)果表明表兒茶精的間苯三酚派生物、兒茶精沒食子酸鹽、表兒茶精沒食子酸鹽、沒食子兒茶精沒食子酸鹽，表兒茶精沒食子酸鹽沒有被檢測出焦兒茶酸間苯三酚的估計(jì)峰值。用ESI質(zhì)譜儀分析純化的兒茶精-間苯三酚來確定期望的分子量414。
碳和氫原子核磁共振方法(13C、1HNMR)被用來從表兒茶精中區(qū)分出兒茶精。依據(jù)化學(xué)變化，兒茶精和表兒茶精間的2號(hào)碳元素的化學(xué)反應(yīng)不同，即與結(jié)合在雜環(huán)4號(hào)碳元素的間苯三酚的陣列(J.Chem.Soc.Perkin，Trans.，l1980；2278-2286，J.Chem.Soc.Perkin，Trans.，l 1983；1535-1543，and J.C.S.Perkin l 1982，1217-1221)，可以看出間苯三酚派生物的2號(hào)碳元素的化學(xué)變化是與兒茶精-4-間苯三酚對應(yīng)的83.4ppm。
因此，可以看出本發(fā)明的矢車菊苷配質(zhì)低聚體的第一單體是兒茶精。
參考MALDI-TOF和HPLC/ESI質(zhì)譜分光計(jì)和NMR質(zhì)譜分光計(jì)的效果，餾分4有極好MMP抑制效果的成分是3至12個(gè)黃烷-3-醇單體通過單鍵連接的矢車菊苷配質(zhì)低聚體，具平均分子量1,518，平均聚合度5.3，與低效的硅乙酸乙酯不同。
實(shí)施例2(利用Azocoll的紅色膠原質(zhì)基質(zhì)，對矢車菊苷配質(zhì)低聚體對MMP活性抑制效果的估計(jì)(Anal.Biochem.，1984，136；446-450))。
矢車菊苷配質(zhì)低聚體對溶膠的蛋白酶(得自堪察加半島螃蟹，買自Sigma公司)、MMP-1(纖維原細(xì)胞膠原酶)、MMP-8(分葉核的白細(xì)胞膠原酶)的抑制效果可以用下面的方法計(jì)算。
100μl2％紅色膠原質(zhì)基質(zhì)Azocoll的溶液被加入到每一個(gè)1.5ml微管中。一個(gè)微管作為空白對照。將Sigma溶膠原酶標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入三個(gè)微管中，使微管含有10、100、200ppm的溶液，來繪制酶標(biāo)準(zhǔn)活性曲線。每個(gè)100μl溶膠原酶標(biāo)準(zhǔn)溶液被加入其他微管中，加入榆樹皮質(zhì)初級(jí)提取物、硅乙酸乙酯餾分、矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分，四環(huán)素、二甲胺四環(huán)素和強(qiáng)力霉素，和表沒食子兒茶精沒食子酸鹽使其濃度分別為0.0001，0.001，0.005和0.01％(重量百分比)。
一種緩沖溶液(0.05M Tris-HCL，1nMCaCl2，PH7.8)被加入到每個(gè)試管中以使總反應(yīng)溶液達(dá)到500μl，它們在37℃的溫度下在培養(yǎng)器中反應(yīng)18小時(shí)。接下來，微管在10,000g下離心5分鐘以沉淀分解的膠原質(zhì)。然后，提取包含未分解的膠原質(zhì)的上清液，其中在540nm測量吸收度以繪制標(biāo)準(zhǔn)活性曲線，酶活性從標(biāo)準(zhǔn)曲線中折算出來，來比較和估計(jì)測試組和對照組的酶活性。用上述同樣的方法檢測試MMP-1和MMP-8的抑制效果。每種酶標(biāo)準(zhǔn)溶液都買自Calbiochem。檢測數(shù)據(jù)如下。
各種試劑作用于溶膠原活性的抑制結(jié)果如表2所示，其中，酶抑制率利用下面的公式1計(jì)算公式1酶抑制率(％)＝100-(檢測組酶活性×100÷對照組酶活性)表2
而且，矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分對MMP-1(纖維原細(xì)胞膠原酶)活性的抑制效果的計(jì)算結(jié)果如表3所示，其中酶抑制率用公式1計(jì)算。表3
此外，矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分對MMP-8(分葉核的白細(xì)胞膠原酶)活性的抑制作用的測量結(jié)果如下表4，其中，酶抑制率按公式1計(jì)算。表4
基于上述所有結(jié)果，矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分對溶膠原酶、MMP-1和MMP-8顯示出比對表沒食子兒茶精沒食子酸鹽、綠茶成分和我們已經(jīng)了解的強(qiáng)力霉素要高的抑制作用，同時(shí)還顯示出比榆屬皮質(zhì)原生提取物和二氧化硅乙酸乙酯餾分高的抑制作用。因此，可以判斷，矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分是榆屬皮質(zhì)的MMP酶抑制作用的主要的活性成分。實(shí)驗(yàn)3(用膠原體試劑(CLN-100，日本Cosmobio)，檢測矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分對MMP活性的抑制作用)本測試方法基于的事實(shí)是，當(dāng)與熒光物質(zhì)fluorosceiniso硫代氰酸鹽(FITC)共軛的膠原質(zhì)I型用作膠原酶時(shí)，僅有已分解的膠原質(zhì)在35℃下變性和被乙醇萃取。本實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)物溶液被離心機(jī)分離，上清液的熒光強(qiáng)度(FI)在520nm(EM)/495(EX)下用熒光光譜測量儀測量，(《炎癥》，1994，18；613-623)。200μl，0.05％的FITC膠原質(zhì)分別加入到1.5ml微管中。一個(gè)微管作空白對照，購自Calbiochem的MMP-1標(biāo)準(zhǔn)酶溶液分別加入到三個(gè)微管中，為了畫出酶的標(biāo)準(zhǔn)活性曲線，相應(yīng)地，溶液濃度分別為10、100、200ppm。100μl酶標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)的被加入到其他試管中，并且，分別加入矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分、二氧化硅乙酸乙酯餾分、四環(huán)素、二甲胺四環(huán)素和強(qiáng)力霉素，相應(yīng)地，溶度為0.001、0.01、0.03、和0.05％(重量比)。每個(gè)試管分別加入緩沖溶液(0.05M三氨基甲烷鹽酸緩沖液(tris-HCI)，1Mm CaCL2，PH7.8)使每一反應(yīng)物溶液總量為500μl，37℃下，在恒溫箱中反應(yīng)18小時(shí)。加入10μl溶解在50％(重量比)的乙醇的80mM的鄰二氮雜菲作為反應(yīng)終止溶液，繼續(xù)在37℃下，在恒溫箱中反應(yīng)18小時(shí)，并冷卻。在冷卻的微管中分別加入0.5μl，70％(重量比)的乙醇，再以3000rpm的速度離心分離10分鐘。離心分離后，從每個(gè)試管中提取500μl的上清液，在520nm(EM)/495(EX)下，用熒光光譜測量儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度(FI)的測量，然后作出對應(yīng)酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將酶活性濃度從標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換成測量組份和對照組份的對比酶活性。對MMP-8的活性抑制測試采用與上面同樣的方法。測試結(jié)果如下。
矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分對MMP-1活性的抑制作用的測量結(jié)果列在表5中，其中，酶抑制率按公式1計(jì)算。表5
此外，矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分對MMP-8活性的抑制作用的測量列在下表6中，其中，酶抑制率是按公式1計(jì)算的。表6
基于上面的測量結(jié)果，矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分也表明，對MMP-8活性的抑制作用高于四環(huán)素，也表現(xiàn)出對兩種酶，即濃度為0.03重量％的MMP-1和MMP-8，幾乎是100％的抑制作用?？梢钥闯?，由黃烷-3-醇或酚單體，二種二聚體，某些三聚體和不確定物質(zhì)組成的二氧化硅乙酸乙酯餾分的抑制作用顯然小于本發(fā)明中的那些矢車菊苷配質(zhì)低聚體。除四環(huán)素外，強(qiáng)力霉素表現(xiàn)出最高的抑制作用，濃度為0.05％的MMP-1和MMP-8都表現(xiàn)為90％的抑制作用，四環(huán)素和二甲胺四環(huán)素表現(xiàn)出較低的酶活性抑制作用。實(shí)驗(yàn)4(使用信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體測量矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分對膠原酶IV型(MMP-2和MMP-9)的抑制作用)購自Calbiochem的MMP-2和MMP-9酶標(biāo)準(zhǔn)溶液混合有緩沖溶液(2.5％ SDS(十二烷基硫酸鈉鹽)50mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液(tris-HCI)，PH6.8，10％丙三醇，0.005％溴酚藍(lán)，3％蔗糖)，然后，在含有2％的凝膠物質(zhì)膠原酶IV型(8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠)的凝膠極板上電泳。電泳完成后，用50mM含有2.5％三氯乙腈X-100的三氨基甲烷鹽酸緩沖液(tris-HCI)(PH7.5)洗滌凝膠兩次30分鐘，去掉SDS。將凝膠縱向切成數(shù)片，放入反應(yīng)緩沖液中，在37℃下反應(yīng)18小時(shí)，其中緩沖液中包含酶標(biāo)準(zhǔn)溶液和各種濃度為0.0001、0.001、0.005和0.01％的矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分、四環(huán)素、二甲胺四環(huán)素、和強(qiáng)力霉素。
然后，用0.1％的考馬斯亮藍(lán)對凝膠染色并漂白，以便用比重計(jì)測量凝膠的分解性能從而畫出標(biāo)準(zhǔn)活性曲線。然后，將測量組份和對照組份的酶活性與從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算值進(jìn)行比較。對膠原酶IV型，即MMP-9的活性抑制測試采用與上面描述相同的測量方法，結(jié)果如下。
矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分對MMP-2活性的抑制作用的測量結(jié)果如下表7，其中，酶抑制率按等式1計(jì)算。表7
此外，矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分對MMP-9活性的抑制作用的測量結(jié)果列在下表8中，其中，酶抑制率按公式1計(jì)算。表8
基于上述所有的結(jié)果，矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分顯示出對膠原酶IV型MMP-2和MMP-9的酶活性的抑制作用高于四環(huán)素，并且在MMP-2和MMP-9的濃度為0.01％時(shí)具有100％的抑制作用。除四環(huán)素外，強(qiáng)力霉素表現(xiàn)出最高的抑制作用，而二甲胺四環(huán)素和四環(huán)素的抑制作用較低?；谟牲S烷-3-醇或酚單體，兩種二聚體，某些三聚體和不確定物質(zhì)組成的二氧化硅乙酸乙酯餾分的抑制作用顯然低于本發(fā)明中的那些矢車菊苷配質(zhì)低聚體這一事實(shí)，可以看到，榆屬的初級(jí)提取物滴定主要用于本發(fā)明中的矢車菊苷配質(zhì)低聚體。實(shí)驗(yàn)5(牙周韌帶細(xì)胞分泌的MMP的抑制測試)用解剖刀刮下選取的牙齒表面上的牙周韌帶組織，并在介質(zhì)中培養(yǎng)。用的是從組織往外生長的第六到第八代細(xì)胞。
本測試中用將牙周韌帶組織的上清液作為實(shí)驗(yàn)3中的酶原進(jìn)行操作。牙周韌帶分泌的MMP看上去象膠原酶IV型，因?yàn)樗姆肿又亓?，它的滴定率完全被EDTA抑制，并且它不被其他蛋白酶抑制劑所抑制的事實(shí)，如PMSF(基于蛋白酶抑制劑的絲氨酸)和抑胃肽。
如圖6所示，矢車菊苷配質(zhì)低聚體的作用高出那些強(qiáng)力霉素10倍。實(shí)驗(yàn)6(對二氯苯細(xì)菌膠原酶的作用)為了從兩種外部病原菌(periopathogenic bacteria)(真菌屬gingivalis密螺旋體denticola)的培養(yǎng)提取物中測試膠原酶活性的抑制作用，標(biāo)有膠原基質(zhì)的放射性物質(zhì)(3H-膠原膠原4型(N-丙酸鹽-2，3-3H-丙酸鹽，mCi/ml荷蘭國家標(biāo)準(zhǔn)生命科學(xué)產(chǎn)品，波士頓，馬薩諸塞州))與各種濃度的藥劑混合并培養(yǎng)18小時(shí)。未分解的膠原用0.05％的丹寧酸和三氯乙酸沉淀，然后，測量殘余在上清液中的放射性與藥劑的抑制作用進(jìn)行對比。
也可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中的矢車菊苷配質(zhì)低聚體高于二氧化硅乙酸乙酯餾分和強(qiáng)力霉素10倍或更多倍。實(shí)驗(yàn)7(矢車菊苷配質(zhì)低聚體對酶抑制作用的選擇性)為了知道矢車菊苷配質(zhì)是否是一種由普通蛋白質(zhì)纏結(jié)成的非特定酶抑制劑，這里用實(shí)驗(yàn)2中的Azocoll矢車菊苷配質(zhì)的膠原酶的抑制作用和彈性蛋白酶抑制作用與那些強(qiáng)力霉素進(jìn)行比較。
將含有剛果紅的彈性蛋白(彈性蛋白-剛果紅，Sigma)與帶有各種藥劑濃度(10Mm TES緩沖，PH7.0)的反應(yīng)物溶液混合。將彈性蛋白酶(Sigma E-150)加入到混合液中培養(yǎng)18小時(shí)。然后，將未分解的彈性蛋白沉淀并且在495nm下測量其上清液的吸光率。相關(guān)反應(yīng)抑制作用程度列在下表9中，以％抑制活性表示，控制酶活性使得僅存在酶而不存在藥劑，也就是說分解被充分進(jìn)行至100％，即0％的抑制作用。酶抑制率按公式1計(jì)算。表9
從上面的結(jié)果，可以看出，矢車菊苷配質(zhì)不是一種由普通蛋白纏結(jié)成的非特定酶抑制劑，因?yàn)槭杠嚲哲张滟|(zhì)對溶膠原酶的抑制作用高于那些強(qiáng)力霉素，但其對彈性蛋白酶的抑制作用則低于那些強(qiáng)力霉素。
本發(fā)明中的矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分能被制備成任何形式用于抑制MMP的活性，如溶膠原酶。這里的形式可能包括片劑、膠囊、粉劑、軟膏、溶液、凝膠、漿糊、塊體、顆粒等。但是，本發(fā)明中測試的是軟膏。
矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分的含量是0.0001到5％(重量比)，尤其是0.01到1％(重量比)。當(dāng)其中的含量少于0.0001％(重量比)時(shí)，酶活性抑制作用或者效率不能得到實(shí)現(xiàn)，當(dāng)含量超過5％(重量比)時(shí)，矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分的顏色過度地變成棕色，使得很難利用它們。
下面實(shí)施例和對比實(shí)施例中使用的軟膏合成物采用下面的方法制備。
軟膏合成物的制備是通過分解由下列物質(zhì)構(gòu)成的混合物得到的矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分、聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物、低濃度酒精、丙三醇、凝膠、膠質(zhì)、羧甲基纖維素、泊洛沙姆(泊洛沙姆407)、甘油一酸酯(myverol 18-19)、聚丙二醇或聚乙二醇、甲醇和緩沖溶液中的防腐劑和已分解的混合物的膠質(zhì)。在對比實(shí)施例中，軟膏合成物的制備除了用強(qiáng)力霉素替代矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分外，其他都相同。
0-20％(重量比)的乙醇、異丙醇或他們的混合物可以用來作低純度酒精，5-30％(重量比)的聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物F-127或F-108能用作用來增強(qiáng)軟膏穩(wěn)定性的聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物的衍生物。濕潤劑用來獲得合成物的含潮量并防止干燥，他可從由下獵物質(zhì)構(gòu)成的足種選擇丙三醇、山梨糖醇、聚乙二醇、聚丙二醇、泊洛沙姆(Poloxamer 407)、甘油一酸酯(myverol 18-19)和他們的混合物，用量為5-30％(重量比)。特別地，聚乙二醇包括有聚乙二醇200，聚乙二醇400，聚乙二醇600和聚乙二醇1000。
此外，1-20％(重量比)的凝膠或膠質(zhì)或他們的混合物被用作是將藥物的活性成分釋放到皮膚組織的系統(tǒng)。調(diào)節(jié)軟膏合成物PH值的緩沖劑包括鄰-堿金屬磷酸鹽、特別是一價(jià)磷酸鈉鹽、二價(jià)磷酸鈉鹽、三價(jià)磷酸鈉鹽，檸檬酸和檸檬酸鈉鹽、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉或焦磷酸鈉，焦磷酸鹽等。實(shí)施例中的軟膏合成物中，是一價(jià)磷酸鹽，二價(jià)磷酸鹽，和三價(jià)磷酸鹽中的兩種適當(dāng)混合，使用前將混合物的PH值調(diào)節(jié)在5-8。
另外，偏亞硫酸氫鈉鹽用來防止矢車菊苷配質(zhì)低聚體餾分被漂白，并且其用量為軟膏合成物重量的0.05-1％(重量比)。天然香料、薄荷油和荷蘭薄荷油都用作香料，并且其用量為軟膏合成物重量的0.1-1％(重量比)。此外，為了防止在制備和使用軟膏合成物的過程中發(fā)生的微生物污染，使用甲基對羥基苯甲酸鹽、丙基對羥基苯甲酸鹽、安息香酸、苯(甲)酸鈉、水楊酸、通?？捎糜谑称泛退幬镏械奈镔|(zhì)或他們的混合物，其用量為0.01-0.5％(重量比)。實(shí)施例1-8和對照實(shí)施例1-8每個(gè)實(shí)施例和對照實(shí)施例的軟膏組成成分如下表10-13所示。[表10]
每個(gè)軟膏對溶膠原蛋白酶起抑制作用的檢測步驟和結(jié)果，如下所示。
100μl的2％ Azocoll溶液作為紅的膠原蛋白基質(zhì)分別加入到20個(gè)1.5ml微量離心管(Eppendorf tube)。以一個(gè)微管作為空白對照，溶膠原酶蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)溶液(Sigma)分別加入三管，使其每管濃度分別至10ppm，100ppm，200ppm，以便畫出酶的標(biāo)準(zhǔn)活性曲線。每個(gè)檢測組中，實(shí)施例1-8的軟膏和對照實(shí)施例1-8的對照軟膏，用蒸餾水以1∶2混合并搖勻，經(jīng)離心得到上清液10μl，離心條件為5000g，10min，然后將100μl酶標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到剩余的16個(gè)微管。將緩沖液(0.05M Tris-HCL，1mMCaCL2，pH7.8)加入每管，使每管的反應(yīng)溶液總量為500μl，在37℃恒溫箱中反應(yīng)18小時(shí)，然后將微管離心(10,000g，5min)使未分解的膠原沉淀下來。提取含有分解的膠原的上清液，在540nm處測吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)活性曲線，比較測試組和對照組，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線折算酶活性濃度來估算酶活性。根據(jù)公式1計(jì)算的酶抑制率得到下列結(jié)果。[表14]
如上述的測試結(jié)果，表明了如本發(fā)明所示，在矢車菊苷配質(zhì)濃度為0.05％或更低時(shí)，含有樣品的矢車菊苷配質(zhì)低聚體部分的組合物與含有強(qiáng)力霉素的對照組樣品比較，對溶膠原蛋白酶活性有較高抑制活性。
因而是，含有以本發(fā)明的矢車菊苷配質(zhì)低聚體作為活性成分的藥物能用于預(yù)防和治療與MMP活性有關(guān)疾病，如癌癥轉(zhuǎn)移，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病，炎癥，角膜潰瘍，表皮潰瘍，胃潰瘍，皮膚皺紋和老化，牙周炎，骨質(zhì)疏松癥，痤瘡，受傷和燒傷，和甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)。
本發(fā)明可以參考上述的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的解釋，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明權(quán)利要求的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種修改和補(bǔ)充。
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的矢車菊苷配質(zhì)低聚體。
2.如權(quán)利要求1所述的矢車菊苷配質(zhì)低聚體，其中，細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶選自溶膠原蛋白酶，MMP-1，MMP-8，MMP-2和MMP-9的膠原酶IV型，和細(xì)菌分泌的膠原酶。
3.如權(quán)利要求1所述的矢車菊苷配質(zhì)低聚體，其中，矢車菊苷配質(zhì)低聚體是初級(jí)提取物經(jīng)溶劑分餾后制備得到的正丁醇部分，所述初級(jí)提取物是從榆樹皮質(zhì)中，即榆樹屬植物的根或樹皮中用極性溶劑提取的。
4.如權(quán)利要求1所述的矢車菊苷配質(zhì)低聚體，其中，矢車菊苷配質(zhì)低聚體是經(jīng)甲醇濃度遞增過程中連續(xù)洗脫得到正丁醇部分的濃縮的制備物，當(dāng)正丁醇部分是通過極性分配從榆樹皮質(zhì)中，即榆樹屬植物的根或樹皮中用極性溶劑得到的提取物來制備得到時(shí)，則結(jié)合以薄層層析為基礎(chǔ)的洗脫液，通過水-甲醇混合液展開進(jìn)一步的葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析。
5.如權(quán)利要求1所述的矢車菊苷配質(zhì)低聚體，其中，矢車菊苷配質(zhì)低聚體是通過在100％甲醇中連續(xù)洗脫正丁醇部分濃縮得到的制備物，當(dāng)正丁醇部分是通過溶劑分配(solvent-partitioning)從榆樹皮質(zhì)中，即榆樹屬植物的根或樹皮中用極性溶劑得到的提取物來制備得到時(shí)，則結(jié)合以薄層層析為基礎(chǔ)的洗脫液，通過100％甲醇展開進(jìn)一步的葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析。
6.如權(quán)利要求1所述的矢車菊苷配質(zhì)低聚體，其中，矢車菊苷配質(zhì)低聚體是以單鍵連接，并以黃烷-3-醇為主軸的3-12個(gè)單體構(gòu)成。
7.用于預(yù)防和/或治療由細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性引起的疾病的藥物組合物，包括以矢車菊苷配質(zhì)低聚體作為活性組分的藥物組合物。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中，所述疾病選自下列一組疾病，包括癌癥轉(zhuǎn)移，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，糖尿病，炎癥，角膜潰瘍，表皮潰瘍，胃潰瘍，皮膚皺紋和老化，牙周炎，骨質(zhì)疏松癥，痤瘡，受傷和燒傷，和甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)。
9.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中，細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)選自下列一組，包括溶膠原蛋白酶，MMP-1，MMP-8，MMP-2和MMP-9的膠原酶IV型，和細(xì)菌分泌的膠原酶。
10.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物可以以片劑，膠囊，粉末，軟膏，溶液，凝膠，糊劑，補(bǔ)片或粒劑。
11.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中，所述矢車菊苷配質(zhì)低聚體的含量為0.0001-5％(重量比)。
12.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中，所述矢車菊苷配質(zhì)低聚體是通過溶劑分餾(solvent-fractionating)提取制備得到的正丁醇部分，所述提取物是從榆樹皮質(zhì)中，即榆樹屬植物的根或樹皮中用極性溶劑提取的。
13.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中，矢車菊苷配質(zhì)低聚體是經(jīng)甲醇濃度遞增過程中連續(xù)洗脫得到正丁醇部分的濃縮的制備物，當(dāng)正丁醇部分是通過溶劑分配(solvent-partitioning)從榆樹皮質(zhì)中，即榆樹屬植物的根或樹皮中用極性溶劑得到的提取物來制備得到時(shí)，則結(jié)合以薄層層析為基礎(chǔ)的洗脫液，通過水-甲醇混合液展開進(jìn)一步的葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析。
14.如權(quán)利要求7所述的矢車菊苷配質(zhì)低聚體，其中，矢車菊苷配質(zhì)低聚體是通過在100％甲醇中連續(xù)洗脫正丁醇部分濃縮得到的制備物，當(dāng)正丁醇部分是通過溶劑分配(solvent-partitioning)從榆樹皮質(zhì)中，即榆樹屬植物的根或樹皮中用極性溶劑得到的提取物來制備得到時(shí)，則結(jié)合以薄層層析為基礎(chǔ)的洗脫液，通過100％甲醇展開進(jìn)一步的葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析。
15.如權(quán)利要求7所述的矢車菊苷配質(zhì)低聚體，其中，矢車菊苷配質(zhì)低聚體是以單鍵連接，并有以黃烷-3-醇為主軸的3-12個(gè)單體構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明公開了與細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)相比較具有顯著生物活性的矢車菊苷配質(zhì)低聚體。所述矢車菊苷配質(zhì)低聚體能從榆樹屬和其他植物中分離出來,并包含具有黃烷－3－醇單體結(jié)構(gòu)的十二個(gè)矢車菊苷配質(zhì)低聚體構(gòu)成的三聚體。本發(fā)明還公開了矢車菊苷配質(zhì)低聚體在治療腫瘤轉(zhuǎn)移或入侵,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,糖尿病,角膜潰瘍,表皮潰瘍,和胃潰瘍,皮膚皺紋,牙周炎,骨質(zhì)疏松癥的應(yīng)用;并促進(jìn)受傷傷口和燒傷傷口的愈合,及促進(jìn)其他相關(guān)病癥的恢復(fù),在這些疾病中不能控制的高水平的MMP被認(rèn)為是在致病過程中起了重要作用。
文檔編號(hào)A61K9/06GK1364082SQ00810429
公開日2002年8月14日 申請日期2000年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月16日
發(fā)明者金祥年, 安浩井, 樸相奇, 金文武, 金正勳, 李鶴模, 樸炯國, 趙惠星, 鄭勝永 申請人:Lg生活健康株式會(huì)社