国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      用于預(yù)防hiv經(jīng)上皮傳播的組合物和方法

      文檔序號(hào):1108235閱讀:567來(lái)源:國(guó)知局
      專(zhuān)利名稱(chēng):用于預(yù)防hiv經(jīng)上皮傳播的組合物和方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及用于阻止人類(lèi)免疫缺陷病毒(“HIV”)傳播的方法、組合物和制品。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑以及它們?cè)谧柚笻IV經(jīng)粘膜表面而傳播中的應(yīng)用。
      參考本文引用了多篇文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)的完全引用見(jiàn)下。除非特別指明,這些文獻(xiàn)均全文引入本文作參考。
      背景技術(shù)
      理解病毒傳播的機(jī)制是防止HIV,這種獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子擴(kuò)散的關(guān)鍵。限制AIDS的世界范圍內(nèi)大流行,很大程度上取決于阻止HIV進(jìn)一步傳播和擴(kuò)散的能力。
      HIV-1性傳播的一個(gè)關(guān)鍵特點(diǎn)是最初與該病毒接觸的陰道或粘膜表面覆蓋著上皮細(xì)胞,它們并非一般情況下與HIV-1感染相關(guān)的細(xì)胞。為了跨過(guò)這道屏障,病毒必須(1)直接跨過(guò)上皮細(xì)胞或感染上皮細(xì)胞,(2)與能在上皮細(xì)胞間移動(dòng)的那些細(xì)胞結(jié)合,或(3)延伸(extend)在上皮細(xì)胞間的那些可被感染的宿主細(xì)胞接觸。已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持所有這些可能性。此前的研究提示,上皮細(xì)胞可被生殖性(productively)感染,但傳播至這些細(xì)胞或從這些細(xì)胞開(kāi)始傳播需要直接與已感染的細(xì)胞或可感染的細(xì)胞接觸。
      HIV潛伏感染的白細(xì)胞,CD4白細(xì)胞和不相關(guān)個(gè)體的上皮細(xì)胞之間的物理接觸可激發(fā)HIV-1快速裝配并釋放至供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的封閉空間。在這一過(guò)程中,單核細(xì)胞形成與上皮膜親密接觸的微絨毛。隔離在這些部位的病毒體隨后通過(guò)內(nèi)在化而進(jìn)入上皮細(xì)胞內(nèi)的吞噬體中。這些觀(guān)察得到其它很多項(xiàng)研究的支持,它們證實(shí),細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用是HIV-1有效傳播至上皮細(xì)胞和從上皮細(xì)胞有效傳播至其它部位的關(guān)鍵。
      ICAM-1是組成型表達(dá)于靜息態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞、靜息態(tài)單核細(xì)胞、靜息態(tài)上皮細(xì)胞以及活化的T細(xì)胞上的一種單鏈糖蛋白粘附分子。ICAM-1的表達(dá)可由各種細(xì)胞因子包括IFN-γ,TNF-α,和IL-1來(lái)誘導(dǎo)。CD18家族的細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)免疫系統(tǒng)與炎癥系統(tǒng)的細(xì)胞之間的相互作用。LFA-1(也稱(chēng)為淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1或CD11a/CD18)可識(shí)別并結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面的ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3。LFA-1的異二聚體結(jié)構(gòu)由一條α鏈以及一條β鏈組成。作為整合蛋白家族的一個(gè)成員,LFA-1在多種細(xì)胞過(guò)程如遷移、抗原提呈、和細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。例如,LFA-1介導(dǎo)白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合,使得白細(xì)胞可從血液中遷移至組織中。ICAM-1是LFA-1的主要配體。ICAM-1通過(guò)一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域而錨著在內(nèi)皮細(xì)胞上,它具有一個(gè)較短的胞漿尾,含有5個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域,可在被HIV感染的單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞上表達(dá)。
      美國(guó)專(zhuān)利5,891,841(“841專(zhuān)利”)涉及用細(xì)胞間粘附分子(ICAM-3)抑制HIV-1所感染的細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)遷移至其它部位的方法。根據(jù)此“841專(zhuān)利”,對(duì)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、和成纖維細(xì)胞表面的ICAM-1的誘導(dǎo)可介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的LFA-1依賴(lài)性粘附(第12欄,第48-50行)。LFA-1和ICAM-1互為受體,它們?cè)凇?41專(zhuān)利”中分別被稱(chēng)為“受體”和“配體”。同前。具體是,“841專(zhuān)利”涉及在HIV誘導(dǎo)的合胞體形成中ICAM-1與LFA-1之間的相互作用。根據(jù)“841專(zhuān)利”,LFA-1對(duì)ICAM-1的親和力相對(duì)于ICAM-2和ICAM-3為最大(第14欄,第9-16行)。
      美國(guó)專(zhuān)利5,674,982(“982專(zhuān)利”)涉及抗ICAM-1抗體通過(guò)干擾LFA-1與ICAM-1之間的相互作用而降低鼻病毒的感染性的應(yīng)用。PCT申請(qǐng)WO90/13316A1涉及通過(guò)使被HIV感染的白細(xì)胞具有與ICAM-1或CD11/CD18家族的一種分子結(jié)合的能力而抑制HIV-1感染細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)中遷移而出的方法。
      這類(lèi)粘附分子在與細(xì)胞結(jié)合的病毒或未與細(xì)胞結(jié)合的病毒的經(jīng)上皮傳播中的作用尚無(wú)人提及。此前的方法和組合物都是通過(guò)阻斷ICAM-1與LFA-1的相互作用而阻止病毒從循環(huán)系統(tǒng)遷移至遠(yuǎn)離最初感染部位的其它部位。ICAM-1,除了與LFA-1相互作用以外,在暴露于HIV的部位或在病毒進(jìn)入機(jī)體的部位的病毒傳播中的作用,至今無(wú)人提及。
      目前需要的是用于在暴露于HIV的部位阻斷該病毒經(jīng)上皮傳播的方法和組合物。
      發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了用于阻止HIV經(jīng)上皮傳播至動(dòng)物的方法、組合物、和制品?,F(xiàn)有涉及ICAM-1的方法均是干擾ICAM-1/LFA-1結(jié)合和阻止病毒從循環(huán)系統(tǒng),穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞,遷移至機(jī)體組織中。本發(fā)明涉及在暴露于HIV的部位阻斷該病毒的經(jīng)上皮傳播,并阻止HIV感染而不是在發(fā)生了感染后治療感染。
      在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了在暴露于HIV的部位用ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑阻斷該病毒經(jīng)上皮傳播的方法。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,對(duì)病毒傳播的阻斷不需要阻斷ICAM-1與LFA-1的結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了用含有ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑的組合物或制品阻斷該病毒跨過(guò)粘膜表面而經(jīng)上皮傳播的方法,所述粘膜如生殖器粘膜、陰道粘膜、直腸粘膜、口腔粘膜、胃腸道粘膜。本發(fā)明還提供了用能產(chǎn)生ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑的遺傳改造細(xì)菌接種粘膜表面的方法。
      在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了用于阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的藥用組合物,其含有ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑及一種可藥用載體。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了含有ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑和一種基體(substrate)的制品。優(yōu)選的基體包括宮頸環(huán)、避孕套和宮內(nèi)避孕器。
      本發(fā)明的其它實(shí)施方案和優(yōu)點(diǎn)將在下文舉例說(shuō)明,并可從這些說(shuō)明中顯而易見(jiàn),或可通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐而領(lǐng)悟。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)所附權(quán)利要求書(shū)中具體指出的方法和組合物而實(shí)現(xiàn)。
      附圖簡(jiǎn)述

      圖1A-B顯示與單核細(xì)胞結(jié)合的HIV-1Ba-L、與PBL(外周血淋巴細(xì)胞)結(jié)合的HIVBa-L、以及不與細(xì)胞結(jié)合的病毒跨過(guò)單層上皮細(xì)胞的能力。
      圖2A-B顯示被HIV感染的單核細(xì)胞隨時(shí)間的傳播(A)和具有不同接種細(xì)胞數(shù)的情況下的傳播(B)。
      圖3證實(shí),人的宮頸上皮細(xì)胞單層提供了一道從單核細(xì)胞結(jié)合型HIV-1、PBL結(jié)合型HIV-1、或非細(xì)胞結(jié)合型病毒傳播非細(xì)胞結(jié)合型HIV-1的屏障。
      圖4A-B證實(shí),抗ICAM-1抗體阻斷單核細(xì)胞結(jié)合型HIV-1的傳播。當(dāng)抗ICAM-1抗體針對(duì)LFA-1的β亞單位、E-鈣依粘連蛋白(cadherin)、CD103時(shí),可阻斷單核細(xì)胞結(jié)合型HIV-1的傳播(4A),同種型對(duì)照不能阻斷傳播(4B)。
      圖5證實(shí),抗ICAM-1抗體可體內(nèi)阻止細(xì)胞結(jié)合型HIV通過(guò)陰道傳播所致感染。在Hu-PBL-SCID小鼠體內(nèi),HIV的陰道傳播被抗ICAM-1單克隆抗體徹底阻斷。
      圖6A-B證實(shí),293T細(xì)胞不表達(dá)LFA-1。既不表達(dá)ICAM-1又不表達(dá)LFA-1的293T細(xì)胞感染了HIV后,所致的HIV經(jīng)上皮傳播可被抗ICAM-1抗體阻斷,說(shuō)明在暴露部位阻止HIV傳播不需要ICAM-1與LFA-1的結(jié)合。
      優(yōu)選實(shí)施方案詳述目前絕大多數(shù)HIV-1感染是性傳播、主要是異性傳播所致。雖然機(jī)械屏障,如避孕套,可非常有效地阻止性傳播,但這種依賴(lài)于男性的保護(hù)方法通常不被接受或使處于最大危險(xiǎn)的婦女無(wú)法實(shí)施。絕大多數(shù)情況下,處于新HIV感染的最大危險(xiǎn)的婦女來(lái)自發(fā)展中國(guó)家。然而,HIV-1感染在非洲和東南亞的快速傳播已增加了對(duì)防止STD傳播的預(yù)防性干預(yù)的最新緊迫需求。
      本發(fā)明提供了在暴露于人類(lèi)免疫缺陷病毒的部位使用ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑阻斷該病毒經(jīng)上皮傳播的組合物和方法。術(shù)語(yǔ)“ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑”指能阻斷或刺激與ICAM-1正常功能相關(guān)的事件的化合物或生物分子。術(shù)語(yǔ)“暴露部位”指動(dòng)物機(jī)體上暴露于HIV的部分,如生殖器、口腔、直腸、眼組織、耳組織、皮膚等。根據(jù)本發(fā)明,對(duì)HIV傳播的阻斷無(wú)需阻斷ICAM-1與LFA-1的結(jié)合。
      在一優(yōu)選實(shí)施方案中,將ICAM拮抗劑提供至動(dòng)物的粘膜表面,包括但不限于生殖器、陰道、直腸、口腔或胃腸道的表面。粘膜表面具有通過(guò)性接觸、母嬰傳播途徑、以及其它機(jī)制而接觸HIV的潛在部位。ICAM激動(dòng)劑/拮抗劑可應(yīng)用于諸如避孕套或?qū)m內(nèi)避孕器等基體表面,或提供在各種形式,如陰道洗液(vaginal wash)、潤(rùn)滑劑、殺精劑、沖洗劑(douche)、栓劑、母乳添加劑(breast milk supplement)、或嬰兒配方食品(infant formula)中。
      抗體是多功能的預(yù)防性干預(yù)手段,特別適用于機(jī)體的各種部位,尤其粘膜表面。本發(fā)明的抗體可在HIV感染的流行病學(xué)中調(diào)節(jié)ICAM-1的功能。其它激動(dòng)劑/拮抗劑,如反義核苷酸序列和核酶,也可用于調(diào)節(jié)ICAM-1的功能。抗體是可在疾病的預(yù)防中應(yīng)用的一種高度特異性殺微生物劑。粘膜抗體尤其有效,因?yàn)樗鼈円话阃ㄟ^(guò)使病原體脫離上皮而發(fā)揮作用。此外,抗體結(jié)構(gòu)的多樣性使得能產(chǎn)生一種幾乎是無(wú)窮盡的全能型抗原結(jié)合特異性,這對(duì)產(chǎn)生針對(duì)具體病原體的特異性殺微生物劑很重要。
      術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中指人類(lèi)免疫球蛋白(Ig)、人源化動(dòng)物免疫球蛋白、或衍生自植物的人源化免疫球蛋白的全部,所述Ig包括但不限于IgG,IgM,IgA,IgE,以及單價(jià)片段、二價(jià)片段、和多價(jià)片段等片段。優(yōu)選的抗體包括在植物中產(chǎn)生的二價(jià)IgG型和多價(jià)IgA型人類(lèi)單克隆抗體(“植物抗體(plantibody)”)。另一種優(yōu)選抗體是抗人ICAM-1 IgG1。植物抗體系統(tǒng)可輕易地用于產(chǎn)生具有指定特異性的大量抗體。具有特殊化合價(jià)、類(lèi)別的抗體,以及在IgA的情況下含有分泌型成分的抗體,都可在谷類(lèi)植物中產(chǎn)生。
      出于多種原因,分泌型IgA聚合物在植物中的表達(dá)要優(yōu)于更傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)。sIgA的產(chǎn)生在植物中是一種單細(xì)胞系統(tǒng),而在哺乳動(dòng)物產(chǎn)生系統(tǒng)中需要兩種不同類(lèi)型的細(xì)胞。植物抗體系統(tǒng)具有一種IgA聚合物支架,可在該支架中插入現(xiàn)有成熟抗體的cDNA。植物抗體與產(chǎn)生并維持在細(xì)胞培養(yǎng)中的抗體相比,還具有較高穩(wěn)定性,且較不易被誘變。能產(chǎn)生抗體的植物比傳統(tǒng)的雜交瘤細(xì)胞系保存時(shí)間長(zhǎng),可使維持成本縮減3-6個(gè)數(shù)量級(jí)。此外,植物抗體可無(wú)限增產(chǎn),即從一棵植物至數(shù)千畝植物,并且無(wú)需考慮因細(xì)胞培養(yǎng)中潛在的病毒污染所帶來(lái)的安全性問(wèn)題。
      另一類(lèi)優(yōu)選的抗體是sIgA,它是粘膜表面(包括陰道和宮頸)的一種常見(jiàn)抗體。該抗體與IgG類(lèi)抗體在功能上的區(qū)別是,大多數(shù)吞噬細(xì)胞表面缺乏IgA的Fc受體,且sIgA不能通過(guò)經(jīng)典途徑固定補(bǔ)體。這些特性降低了sIgA的前炎性潛力,這種潛力是在諸如胃腸道或小支氣管等部位,當(dāng)炎癥可能導(dǎo)致功能受損的情況下,一種非常有用的特征。sIgA的Fc受體較少以及補(bǔ)體結(jié)合能力較弱使得這類(lèi)免疫球蛋白不太可能誘導(dǎo)與某些HIV-1特異性IgG相關(guān)的感染惡化問(wèn)題。IgA區(qū)別于IgG的另一點(diǎn)是,它只與上皮細(xì)胞反應(yīng),這種反應(yīng)通過(guò)表達(dá)于上皮細(xì)胞的basolateral表面的聚合物式Ig受體來(lái)介導(dǎo)。IgA二聚體與上皮細(xì)胞表面的這些受體結(jié)合,這些受體允許該抗體分子,以及與之結(jié)合的任何抗原,穿過(guò)上皮細(xì)胞而不被降解。該受體的一部分在IgA分子脫離上皮細(xì)胞后仍與IgA結(jié)合,產(chǎn)生IgA的分泌片。聚合物式Ig受體的功能成分在不同物種(包括小鼠和人類(lèi))之間高度保守。
      在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,提供了一種預(yù)防性藥用組合物,其含有ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑及一種可藥用載體?!翱伤幱幂d體”指適用于粘膜表面的載體或賦形劑??蓪CAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑配制在任何合適的載體中,只要拮抗劑和載體相容。拮抗劑的活性應(yīng)不被載體降低至不再阻斷HIV傳播的程度。載體可以為水性或非水性,如含醇類(lèi)或?yàn)橛托?,或它們的組合,還可含有其它表面活性劑、軟化劑、潤(rùn)滑劑、穩(wěn)定劑、染料和活性成分如防腐劑、抗生素、避孕藥、殺精劑或藥用試劑。所述組合物可以是乳膏、泡沫劑、洗劑、軟膏劑、溶液、固體和噴霧劑。
      優(yōu)選的載體適用于陰道、口腔、胃腸道、及直腸。特別優(yōu)選的載體為粘膜粘著劑。適當(dāng)?shù)妮d體可包含有機(jī)溶劑、乳化劑、膠凝劑、增濕劑(moisturizer)、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑(wetting agent)、控釋劑、多價(jià)螯合劑、染料、香料以及在粘膜給藥的藥用組合物中常用的其它成分。
      本發(fā)明的組合物可以是能用于陰道的陰道洗液或沖洗劑。含有ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑的母乳添加劑和嬰兒配方食品優(yōu)選通過(guò)口腔粘膜表面為嬰兒提供ICAM-拮抗劑。
      固體劑型包括栓劑、粉劑、和顆粒。在固體劑型中,所述組合物可與至少一種惰性稀釋劑如蔗糖、乳糖、或淀粉混合且還可包含潤(rùn)滑劑、緩沖劑、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它成分。
      在本發(fā)明的方法、組合物、以及制品中,ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑的實(shí)際用量可以變化,以便在暴露于病毒的部位或病毒進(jìn)入的部位獲得具有所需預(yù)防性應(yīng)答的量。相應(yīng)地,對(duì)劑量水平的選擇取決于,接觸病毒的部位或病毒進(jìn)入的部位的特點(diǎn)和位置,所需的預(yù)防性應(yīng)答,給藥途徑,預(yù)防作用需要維持的時(shí)間以及其它因素。
      用于本發(fā)明組合物、制品、和方法中的優(yōu)選的激動(dòng)劑/拮抗劑是抗ICAM-1抗體。抗體的有效濃度通常為約20-約2000μg/ml,但該濃度可根據(jù)具體情況變化??笽CAM-1植物抗體的用量可達(dá)約5-10mg/ml。
      本發(fā)明的ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑可用任何適當(dāng)?shù)姆椒ńo藥。優(yōu)選將ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑局部應(yīng)用于粘膜表面以防止HIV傳播。優(yōu)選使抗ICAM-1抗體包含在一種粘膜粘著劑賦形劑中而運(yùn)送,該賦形劑能使免疫球蛋白活性維持一至數(shù)天。
      本發(fā)明的激動(dòng)劑/拮抗劑還可通過(guò)能表達(dá)抗ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑(如抗ICAM-1抗體、抗ICAM-1反義分子、ICAM-1抗原、或核酶)的遺傳改造型細(xì)菌來(lái)運(yùn)送。“遺傳改造型”細(xì)菌含有或轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒DNA載體或其它載體,如病毒載體,裸露的DNA或RNA,它們包含編碼抗ICAM抗體的核苷酸,抗ICAM反義核苷酸序列,或核酶。優(yōu)選的遺傳改造型細(xì)菌是屬于目標(biāo)粘膜(即生殖道、口腔等)表面的正常菌群成員的那些。遺傳改造型細(xì)菌可用任何適當(dāng)?shù)闹亟MDNA方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法產(chǎn)生。
      在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,提供了含有一種基體以及一種ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑的制品。術(shù)語(yǔ)“支持物”指能浸透或涂布ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑并將ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑運(yùn)送至機(jī)體的粘膜表面的物品,如海綿,避孕套,隔膜,宮內(nèi)避孕器,或?qū)m頸環(huán)。例如,避孕套可通過(guò)噴射方式將所述拮抗劑涂布在其表面,或在生產(chǎn)過(guò)程中用領(lǐng)域內(nèi)已知的方法將所述拮抗劑浸透在避孕套中。嬰兒奶嘴也可用類(lèi)似的方法涂布。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中,將抗ICAM-1抗體置于一種緩釋產(chǎn)品中來(lái)運(yùn)送,如浸透了該抗體的宮頸環(huán)。
      由于HIV主要通過(guò)性活動(dòng)傳播,本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法包括在性活動(dòng)期間或之前使本發(fā)明的激動(dòng)劑/拮抗劑組合物與陰道上皮或其它粘膜表面接觸。優(yōu)選使用涂布或浸透了ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑的避孕套等避孕用品,或局部用藥組合物如膠質(zhì)或泡沫劑時(shí),所用量足以防止HIV傳播和感染。當(dāng)希望強(qiáng)化避孕效果時(shí),可將所述組合物與一種殺精劑聯(lián)合使用。
      在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中,可將ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑固定在一種固體(如塑料、或類(lèi)似材料)的表面,以便運(yùn)送至暴露于HIV的部位。適當(dāng)?shù)乃芰嫌?,聚氯乙烯、聚乙烯、聚氨基甲酸酯或硅以及常用于容器和奶瓶的其它物質(zhì)。奶瓶,包括配有奶嘴的奶瓶,或其它容器以及能裝生物流體的導(dǎo)管可用足量的ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑涂布,其量足以防止或阻斷與細(xì)胞結(jié)合的HIV的傳播。所述激動(dòng)劑/拮抗劑還可在塑料聚合物的聚合期間摻入,然后以控釋形式從表面浸出。
      具體ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑和組合物阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的能力可在跨孔(transwell)培養(yǎng)系統(tǒng)中評(píng)估。優(yōu)選的跨孔系統(tǒng)包含一種插件,其能將24孔板的孔通過(guò)一種可拆式網(wǎng)格分隔為上下兩個(gè)室,該網(wǎng)格含有直徑5m的孔。將人類(lèi)宮頸上皮細(xì)胞系如ME180(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,Rockville,MD)在該可拆式網(wǎng)格上培養(yǎng)至長(zhǎng)滿(mǎn)。使長(zhǎng)滿(mǎn)的上皮細(xì)胞形成一道屏障,該屏障不可通透C14-菊粉,而且相對(duì)于與外周血淋巴細(xì)胞(PBL)結(jié)合的病毒,可選擇性通透與巨噬細(xì)胞結(jié)合的病毒。穿過(guò)這道上皮障礙而傳播的HIV將出現(xiàn)在跨孔系統(tǒng)的下層小室中。因此,可評(píng)估ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑阻斷HIV跨過(guò)這道支持已長(zhǎng)滿(mǎn)之上皮細(xì)胞屏障的網(wǎng)格而傳播的能力。該跨孔系統(tǒng)允許快速而直接地檢查具有不同特異性的Mab阻斷與細(xì)胞結(jié)合的HIV-1跨過(guò)上皮細(xì)胞單層的能力。這類(lèi)系統(tǒng)也可用于比較抗體類(lèi)別和同種型之間的相對(duì)效力。
      ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑還可在具有十分接近于真實(shí)傳播狀況的動(dòng)物模型體內(nèi)進(jìn)行評(píng)估。例如,Hu/PBL-SCID小鼠陰道傳播模型是研究HIV-1傳播的極好模型。移植到這種小鼠體內(nèi)的人類(lèi)PMBC細(xì)胞在感染時(shí)(細(xì)胞移植的8-10天后),其活化狀態(tài)類(lèi)似于人的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中所見(jiàn),而明顯區(qū)別于通常用于培養(yǎng)HIV的組織培養(yǎng)中所見(jiàn)。此外,對(duì)傳播至Hu-PBL-SCID小鼠的變體的種系發(fā)生分析顯示,病毒傳播不是隨機(jī)的,具有巨噬細(xì)胞向性的病毒變體亞組被優(yōu)選傳播。這種傳播模式與某些人類(lèi)中的完全一樣,在這些人體內(nèi),只有非常有限范圍的巨噬細(xì)胞向性病毒從供體傳播至受體。可將ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑應(yīng)用于已暴露給HIV的Hu-PBL-SCID小鼠,以評(píng)估ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑阻斷HIV體內(nèi)傳播的能力。
      本發(fā)明的教導(dǎo)在具體問(wèn)題或環(huán)境中的應(yīng)用是在本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本文之教導(dǎo)而能實(shí)施的范圍之內(nèi)。本發(fā)明之產(chǎn)物及其應(yīng)用方法的其它實(shí)例見(jiàn)于以下實(shí)施例。
      實(shí)施例1分離無(wú)細(xì)胞的HIV以及被HIV感染的外周血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞HIV-1Ba-L(Advanced Biotechnologies Inc.,Columbia,MD)是HIV的一種巨噬細(xì)胞向性、NSI、CCR5-應(yīng)用型變體,其市售產(chǎn)品為1.0ml等份試樣(1×10650%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)/ml)且保存在液氮中。應(yīng)用于培養(yǎng)物之前將病毒原液新鮮解凍。
      將已經(jīng)白細(xì)胞分離術(shù)處理過(guò)的血液在Ficoll Hypaque(Pharmacia,Piscataway,NJ)上離心而分離人的PBMC。將總PBMC用添加了100U/ml青霉素/100mcg鏈霉素、10ng/ml慶大霉素、和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640(培養(yǎng)基和所有添加物均來(lái)自L(fǎng)ife Technologies,Grand Island,NY)稀釋成1×107/ml,然后鋪板于75或150cm2組織培養(yǎng)燒瓶(Corning ScientificProducts,Inc.,Cambridge,MA)中。在培養(yǎng)的最初12小時(shí)內(nèi),將細(xì)胞重懸在添加了20%熱滅活的FCS(56℃45min,Gemini Bio-Products,Inc.Calabasas,CA)和10%熱滅活的A/B型人類(lèi)血清(HS;Nabi,Boca Raton,F(xiàn)L)的上述RPMI-1640(后文稱(chēng)cRPMI)中。收集單核細(xì)胞。棄去未粘附的PBMC;將粘附的細(xì)胞用冷HBSS(Life Technologies)從燒瓶中取出。通過(guò)測(cè)定表面抗原CD14的表達(dá)(FITC-標(biāo)記的抗人CD14抗體,My-4;Coulter Immunotech,Hialeah,F(xiàn)L),確定粘附細(xì)胞中>95%是單核細(xì)胞。將單核細(xì)胞洗滌并以5×106/ml與1×103TCID50的HIV-1Ba-L重懸于25cm2燒瓶(Corning ScientificProducts,Inc.)中的5ml cRPMI-10%FCS或cRPMI-10%HS中,于37℃、5%CO2中培養(yǎng)。24小時(shí)后取出病毒培養(yǎng)液,細(xì)胞用cRPMI洗滌一次,添加新鮮的cRPMI-10%FCS或cRPMI-10%HS。在感染后(pi)第3和第7天給培養(yǎng)物添加新鮮培養(yǎng)基。用冷HBSS或0.02%EDTA(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)從燒瓶中取出單核細(xì)胞,用于在感染后第10天進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。
      將PBL(外周血淋巴細(xì)胞)在添加了PHA(5μg/ml,Sigma)的cRPMI-10%FCS中以2×106/ml的密度重懸48小時(shí)。用1×103TCID50HIV-1Ba-L感染后,用培養(yǎng)單核細(xì)胞的類(lèi)似方法培養(yǎng)PBL,區(qū)別在于PBL培養(yǎng)基含10U/mlIL-2(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)。單核細(xì)胞和PBL受HIV-1感染的程度可通過(guò)用HIV-1 gag-特異性引物(正向引物5’-GCG-AGA-GCG-TCA-GTA-TTA-AGC-GG-3’,和反向引物5’-TCT-GAT-AAT-GCT-GAA-AAC-ATG-GG-3’)以及如前述的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)照進(jìn)行有限稀釋PCR來(lái)確定。PCR產(chǎn)物可通過(guò)在1%瓊脂糖凝膠上電泳來(lái)觀(guān)察。
      無(wú)細(xì)胞的病毒衍生自cRPMI-10%FCS或cRPMI-10%HS中被HIV-1Ba-L感染的單核細(xì)胞或被HIV-1Ba-L感染的PBL。離心并濾過(guò)0.2μm的注射器濾膜(Millipore,Bedford,MA)使上清不含細(xì)胞。無(wú)細(xì)胞的病毒可通過(guò)HIV p24ELISA(Dupont NEN,Boston,MA)定量,并通過(guò)與來(lái)自HIV陰性健康供體的PBMC共培養(yǎng)來(lái)確定TCID50。
      實(shí)施例2人類(lèi)宮頸上皮細(xì)胞跨孔培養(yǎng)將自發(fā)轉(zhuǎn)化的人類(lèi)宮頸上皮細(xì)胞系ME-180(ATCC,Rockville,MD)培養(yǎng)在75cm2燒瓶中的cRPMI-10%FCS中,每3天通過(guò)用0.05%胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies)處理細(xì)胞而常規(guī)傳代。將ME-180細(xì)胞以2×105/0.1ml cRPMI-10%FCS或-10%HS/5.0μm鋪在12mm直徑的跨孔插件(insert)(Corning Scientific Products,Inc.)上。將跨孔中的ME-180細(xì)胞維持在37℃,5%CO2下。每2-3天換培養(yǎng)基。7天后,細(xì)胞在跨孔插件上形成極化的完整單層,這可利用歐姆計(jì)(ohmmeter)(Millipore)監(jiān)控橫跨上皮的阻抗和用熒光染料標(biāo)記的抗ZO1抗體染色來(lái)證實(shí),其中所述ZO1是一種在上皮細(xì)胞緊密連接處發(fā)現(xiàn)的蛋白(20)(1∶50稀釋?zhuān)琙ymed,San Francisco,CA)。插件上的ME-180單層隨時(shí)可用于在培養(yǎng)至第7-第10天時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
      實(shí)施例3經(jīng)上皮遷移和HIV-1的傳播如Bomsel所述進(jìn)行經(jīng)上皮遷移試驗(yàn),有幾處改動(dòng)。簡(jiǎn)短說(shuō),將1×106被HIV-1Ba-L感染的單核細(xì)胞、1×106被HIV-1Ba-L感染的PBL、或單核細(xì)胞或PBL培養(yǎng)上清中的無(wú)細(xì)胞HIV-1添加至上皮細(xì)胞單層的頂側(cè)(apical side)。進(jìn)行時(shí)間過(guò)程的分析,在將已感染的細(xì)胞添加至插件后的1-48小時(shí)之間收集頂側(cè)和基側(cè)(basal side)的培養(yǎng)基。在24小時(shí)的時(shí)候橫跨單層的傳播接近最大值,選此時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)。單核細(xì)胞和PBL的活力通過(guò)臺(tái)盼蘭(Sigma)排除法來(lái)評(píng)估,然后將細(xì)胞添加至跨孔中,傳播24小時(shí)后,結(jié)果總是>90%。用HIV-1 p24抗原ELISA試驗(yàn)(Dupont NEN)定量頂側(cè)和基側(cè)上清液中HIV-1 p24抗原的量(靈敏度為12.5pg/ml-350pg/ml)。
      實(shí)施例4
      傳播阻斷研究將小鼠抗人ICAM-1抗體(20μg/ml;及其稀釋液;HA58(IgG1),Pharmingen),抗人E-鈣依粘連蛋白抗體(20μg/ml;67A4(IgG1)CoulterImmunotech,和E4.6(IgG1))、抗人CD103抗體(20μg/ml;2G5(IgG2a),CoulterImmunotech,和αE7-1(IgG2a)、αE7-2(IgG1)和αE7-3(IgG1))、以及抗人CD18抗體(20μg/ml;L130(IgG1),Becton Dickinson)、或它們各自的同種型對(duì)照添加至1×106被HIV感染的單核細(xì)胞或被HIV感染的293T細(xì)胞(含或不含ICAM-1),然后將它們迅速添加至ME-180跨孔培養(yǎng)中。根據(jù)AIDS ClinicalTrials Group(ACTG)Antibody Selection Working Group為證實(shí)某種抗體在低至體內(nèi)可獲得的濃度(20-25μg/ml)時(shí)的效力而建立的標(biāo)準(zhǔn),選擇抗體的最高濃度(20μg/ml)。37℃,5%CO2下培養(yǎng)24小時(shí)后,收集頂側(cè)和基側(cè)的上清液。用ELISA定量HIV-1p24抗原。
      實(shí)施例5與單核細(xì)胞結(jié)合的HIV-1比與PBL結(jié)合的HIV-1或無(wú)細(xì)胞病毒更有效地跨過(guò)人的宮頸上皮細(xì)胞HIV-1感染的單核細(xì)胞、HIV-1感染的PBL、或衍生自單核細(xì)胞或PBL培養(yǎng)的無(wú)細(xì)胞的病毒(cfv),將它們各自的cRPMI-10%FCS溶液,置于含有ME-180上皮細(xì)胞的鋪滿(mǎn)單層的跨孔培養(yǎng)物的頂端(apical)小室中。評(píng)估與單核細(xì)胞結(jié)合的、與PBL結(jié)合的、或無(wú)細(xì)胞的HIV-1跨過(guò)完整的人類(lèi)宮頸上皮單層的程度(圖1A)。(cRPMI-10%FCS培養(yǎng)基(n=8個(gè)供體,比較單核細(xì)胞和PBL以及PBL和cfv之間ap<0.05;比較單核細(xì)胞和cfv之間bp<0.001))。結(jié)果表示為來(lái)自ME-180跨孔培養(yǎng)物的基底(basal)上清液和各種接種物的HIV-1 p24抗原濃度(pg/ml)。
      與單核細(xì)胞結(jié)合的病毒比與PBL結(jié)合的病毒跨過(guò)宮頸上皮的效力高約5倍。衍生自任一種細(xì)胞類(lèi)型的無(wú)細(xì)胞型病毒不能有效跨過(guò)該上皮單層,且通常在p24 ELISA試驗(yàn)中低于可檢測(cè)的極限。
      為明確無(wú)細(xì)胞的HIV-1是否能被Kage及其同事提到的FCS(胎牛血清)中的糖蛋白抑制而不能跨過(guò)上皮單層,用已在含10%HS的cRPMI中培養(yǎng)的被HIV-1感染的單核細(xì)胞或cfv(無(wú)細(xì)胞的病毒)進(jìn)行研究。在這些實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)在cRPMI-10%HS中的單核細(xì)胞結(jié)合型HIV-1,比培養(yǎng)在cRPMI-10%FCS中的單核細(xì)胞結(jié)合型病毒更有效地跨過(guò)該上皮,也比培養(yǎng)在cRPMI-10%FCS或cRPMI-10%HS中的cfv更有效(圖1B)(cRPMI-10%FCS或HS培養(yǎng)基(每一實(shí)驗(yàn)中n=3,比較單核細(xì)胞(mono)FCS和mono HS之間ap<0.5,比較cfv FCS和cfv HS之間bp<0.05,比較mono HS和cfv HS之間cp<0.005))。相對(duì)于在10%FCS中測(cè)得的經(jīng)上皮傳播,培養(yǎng)在cRPMI-10%HS中的cfv能跨過(guò)完整上皮,但水平顯著低于與細(xì)胞結(jié)合的病毒(P<0.005)(圖1B)。
      在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)估頂部上清液中HIV-1 p24抗原,以便確定病毒從接種至上皮頂側(cè)的被感染的單核細(xì)胞或PBL中釋放出的程度。培養(yǎng)在FCS或HS中的被HIV-感染的單核細(xì)胞和被HIV-感染的PBL,它們的上清液中p24抗原的濃度在整個(gè)感染期間保持彼此相當(dāng)?shù)乃剑闯霈F(xiàn)顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。
      我們發(fā)現(xiàn),在基底(basilar)上清中測(cè)得的HIV-1(用p24濃度表示)當(dāng)與未被感染的單核細(xì)胞或受PHA刺激的PBL混合培養(yǎng)時(shí)具有感染性,隨時(shí)間的推移,培養(yǎng)物中p24抗原的量增加(數(shù)據(jù)未顯示)。
      實(shí)施例6單核細(xì)胞以時(shí)間-依賴(lài)性且劑量-依賴(lài)性方式跨過(guò)宮頸上皮制備帶有ME-180的跨孔培養(yǎng)物,將cRPMI-10%HS中1×106個(gè)被HIV-感染的單核細(xì)胞添加至該上皮的頂部側(cè)以分析經(jīng)上皮傳播的動(dòng)力學(xué)。被感染的單核細(xì)胞早在4小時(shí)的時(shí)候就可以測(cè)到經(jīng)上皮的遷移和/或經(jīng)上皮的HIV-1傳播(圖2A),伴有基底p24水平的升高,直至48小時(shí)達(dá)到頂峰。類(lèi)似地,將1×106個(gè)細(xì)胞,或其5倍稀釋液,添加至該上皮的頂側(cè),取基底側(cè)上清液樣品檢測(cè)p24抗原的存在以確定能在上皮的基底側(cè)檢測(cè)到病毒所需的最小細(xì)胞接種量。當(dāng)應(yīng)用5,000個(gè)被HIV感染的單核細(xì)胞時(shí),在基底培養(yǎng)基中一直能檢測(cè)到HIV p24抗原。如LD-PCR所測(cè),其中1-5%的細(xì)胞被HIV-1感染(數(shù)據(jù)未顯示),因此這意味著少至500個(gè)被感染細(xì)胞就可持續(xù)傳播HIV-1。在跨孔的頂側(cè)加入少至1,000個(gè)的單核細(xì)胞(感染率同樣為1-5%),就可在基底側(cè)上清液中檢測(cè)到p24(圖2B)。
      圖2所示實(shí)驗(yàn)使用被HIVBa-L-感染的單核細(xì)胞在cRPMI-10%HS中的溶液進(jìn)行。結(jié)果表示為基底上清中HIV-1 p24抗原的濃度(pg/ml)。圖中分別顯示了隨時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)(n=4)和隨接種量變化的實(shí)驗(yàn)(n=2)。+基底p24介于100-1,000pg/ml之間;++基底p24介于1,001-5,000pg/ml之間;+++基底p24介于5,001-30,000pg/ml之間;-基底p24低于檢測(cè)的極限(12.5pg/ml)。
      實(shí)施例7完整的人類(lèi)宮頸上皮限制了HIV-1的傳播此前曾顯示,位于跨孔插件中的人類(lèi)宮頸上皮細(xì)胞單層形成了一種完整的極性表面,并提供了一種針對(duì)無(wú)細(xì)胞的HIV-1的明確屏障。以下實(shí)驗(yàn)用于確定宮頸上皮單層和將跨孔小室分隔開(kāi)的膜是否能提供一種限制HIV-1經(jīng)上皮傳播的屏障。為此,測(cè)定跨孔下層小室培養(yǎng)基中無(wú)ME-180存在時(shí)的p24抗原濃度。與由HIV-感染的單核細(xì)胞或HIV-感染的PBL所傳播的基底HIV-1 p24抗原的不同水平(如圖1所示)相比,在沒(méi)有宮頸上皮細(xì)胞的情況下,下層小室的跨孔培養(yǎng)物中測(cè)得的p24抗原的量在單核細(xì)胞結(jié)合型HIV-1、PBL-結(jié)合型HIV-1、或無(wú)細(xì)胞型病毒之間無(wú)顯著差異(p>0.005)(圖3)。這些數(shù)據(jù)表明,膜的組成和孔徑大小不能限制HIV-1的傳播,反而是上皮細(xì)胞層的緊密連接以及被HIV-感染的細(xì)胞與上皮之間的假定相互作用決定了經(jīng)上皮傳播HIV-1的程度。
      圖3所示數(shù)據(jù)分別表示為,插件膜上有或沒(méi)有ME-180上皮細(xì)胞時(shí),跨孔培養(yǎng)物的基底側(cè)或下層小室上清液中的p24抗原(pg/ml)。圖中還顯示了另一個(gè)試驗(yàn)(n=3),有或沒(méi)有ME-180的接種組之間的比較p<0.05,沒(méi)有ME-180的接種組之間的比較p>0.05。
      實(shí)施例8抗ICAM-1抗體阻斷單核細(xì)胞結(jié)合型HIV-1的傳播為了檢查被HIV感染的單核細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間的粘附作用是否經(jīng)上皮遷移和HIV-1傳播的關(guān)鍵,將針對(duì)數(shù)種粘附分子的抗體添加至跨孔培養(yǎng)物中。在被HIV感染的單核細(xì)胞以及培養(yǎng)中剩余的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的同時(shí)添加針對(duì)ICAM-1、CD18、E-鈣依粘連蛋白、或αE-β7整合蛋白(CD103)的抗體(1-20μg/ml)。所選抗體能靶向已顯示參與免疫細(xì)胞與上皮細(xì)胞之結(jié)合的特異性配體-受體相互作用。
      ICAM-1在被HIV感染的單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞上表達(dá)??笽CAM-1抗體阻斷單核細(xì)胞結(jié)合型HIV-1的傳播,如上皮細(xì)胞單層基底側(cè)的p24抗原量所示(圖4A)。CD18分子是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)性抗原LFA-1的β亞單位,其結(jié)合ICAM-1并參與HIV誘導(dǎo)的合胞體形成??笴D18抗體及其同種型對(duì)照不能阻斷HIV-1的經(jīng)上皮傳播(圖4A)。
      為了測(cè)定對(duì)經(jīng)上皮傳播的抑制作用是否特異性針對(duì)ICAMLFA-1相互作用,檢驗(yàn)了抗E-鈣依粘連蛋白和CD103的抗體在跨孔系統(tǒng)中抑制HIV-1傳播的能力。E-鈣依粘連蛋白表達(dá)在上皮細(xì)胞表面,其配體CD103表達(dá)在單核細(xì)胞以及一個(gè)PBL亞類(lèi)的表面??笶-鈣依粘連蛋白抗體、抗CD103抗體、以及它們各自的同種型對(duì)照不能阻斷HIV-1的經(jīng)上皮傳播(圖4,A和B)。經(jīng)測(cè)定,被HIV感染的單核細(xì)胞與這些實(shí)驗(yàn)中使用的抗體一起保溫不改變從被感染細(xì)胞釋放出的病毒量,如保溫24小時(shí)后頂部上清液中所測(cè)(數(shù)據(jù)未顯示)。將抗E-鈣依粘連蛋白(20mg/ml)、抗CD103(20mg/ml)、抗CD18(LFA-1)(20mg/ml)、鼠IgG1(20mg/ml)和鼠IgG2a(20mg/ml)抗體與被感染的單核細(xì)胞一起添加至跨孔培養(yǎng)物中,對(duì)HIV-1的經(jīng)上皮傳播沒(méi)有影響。圖4的結(jié)果表示為基底側(cè)上清液中的HIV-1 p24抗原,p<0.05。
      實(shí)施例9抗ICAM-1 MAB抑制HIV-1在HU-PBL-SCID小鼠中的陰道傳播單克隆抗體在Hu-PBL-SCID小鼠中可提供對(duì)抗HIV-1的保護(hù)作用,如此前的三項(xiàng)研究所示。但是,這些研究無(wú)一涉及抗ICAM-1抗體或提到對(duì)抗病毒之陰道傳播的保護(hù)作用。在所有例子中,Mab可有效對(duì)抗攜有其所針對(duì)的特異性表位的病毒,但不能對(duì)抗異源HIV-1變體而提供交叉保護(hù)。
      如表1所示,陰道中應(yīng)用抗ICAM-1的Mab徹底阻斷了SCID小鼠模型中細(xì)胞結(jié)合型HIV-1的陰道傳播。結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p=0.03,單側(cè)Fisher真實(shí)性(exact)檢驗(yàn);p=0.06,雙側(cè)Fisher真實(shí)性檢驗(yàn))。
      表1
      實(shí)施例10對(duì)細(xì)胞結(jié)合型HIV的經(jīng)上皮傳播的阻斷不需要阻斷ICAM-1與LFA-1的結(jié)合對(duì)并不在其表面表達(dá)ICAM-1的293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,以確定對(duì)細(xì)胞結(jié)合型HIV的經(jīng)上皮傳播的阻斷是否需要阻斷ICAM-1與LFA-1的結(jié)合。結(jié)果表明,被感染的293T細(xì)胞能夠跨過(guò)上皮細(xì)胞屏障傳播HIV-1,而這種傳播(如跨孔系統(tǒng)的基底小室中HIV-1 p24抗原的濃度所測(cè))可被抗ICAM-1抗體阻斷(表2)。
      表2
      *p<0.001,比較p24濃度的差異由于ICAM-1不在293T細(xì)胞表面表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示),抗ICAM-1抗體阻斷傳播的能力必須通過(guò)與ME180宮頸上皮細(xì)胞系(已知其表達(dá)ICAM-1)表面的ICAM-1的相互作用。流式細(xì)胞儀分析表明,293T細(xì)胞不表達(dá)LFA-1(圖6A-B)。由于293T細(xì)胞缺乏LFA-1,抗ICAM-1抗體不能通過(guò)阻斷ICAM-1與其對(duì)應(yīng)受體LFA-1之間的相互作用而阻斷傳播。
      實(shí)施例11抗ICAM-1 MAB不引起陰道炎性應(yīng)答有一種潛在的擔(dān)心是,陰道內(nèi)給與能針對(duì)免疫應(yīng)答中起作用的配體的抗體可能激發(fā)局部炎性應(yīng)答。為了了解該問(wèn)題,我們每天2次,連續(xù)14天在正常BALB/c小鼠陰道內(nèi)給與20mg/ml抗小鼠ICAM-1的IgG2a型Mab、20mg/ml無(wú)關(guān)的IgG2a型Mab、或5mg傷寒沙門(mén)菌(Salmonella typhimirium)脂多糖。抗ICAM-1 Mab在所處理的小鼠陰道上皮中未顯示毒性。
      實(shí)施例12MAB均未從陰道內(nèi)給藥處被吸收至血清中Mab均未從陰道內(nèi)給藥處被吸收至血清中。這一點(diǎn)可能使針對(duì)宿主抗原的Mab具有潛在的臨床應(yīng)用意義。三只SCID小鼠每天2次接種20mg正常小鼠IgG,共10天。在第4天、第7天、和第10天注射后的剛剛2小時(shí)后,用靈敏度為0.1mg/ml的ELISA試驗(yàn)分析小鼠血清中小鼠Ig濃度的增加。小鼠Ig的基線(xiàn)值范圍為0-4mg/ml。在任何一只小鼠中,在所分析的任何時(shí)間點(diǎn),均未觀(guān)察到小鼠抗體濃度的增加。
      參考文獻(xiàn)1.Fultz,P.N.,H.M.McClure,H.Daugharty,A.Brodie,C.R.McGrath,B.Swenson,和D.P.Francis.1986.人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)經(jīng)陰道傳播至黑猩猩,J.Infect.Dis.154896.
      2.Burkhard,M.J.,L.A.Obert,L.O“Neil,L.J.Diehl,和E.A.Hoover.1997.細(xì)胞結(jié)合型及無(wú)細(xì)胞型貓科動(dòng)物免疫缺陷病毒的粘膜傳播,AIDS Res.Hum.Retrovir.13347.
      3.Miller,C.J.,N.J.Alexander,S.Sutjipto,A.A.Lackner,A.Gettie,A.G.Hendrickx,L.J.Lowenstein,M.Jennings,和P.A.Marx.1989.猴免疫缺陷病毒的生殖器粘膜傳播人類(lèi)免疫缺陷病毒異性傳播的動(dòng)物模型,病毒學(xué)雜志(J.Virol.)634277.
      4.Zacharopoulos,V.R,M.-E.Perotti,和D.M.Phillips.1997.細(xì)胞遷移在HIV-1性傳播中的作用,Curr.Biol.7R534.
      5.Fortin,J.-F.,R Cantin,G.Lamontagne,和M.Tremblay.1997.摻入在I型人類(lèi)免疫缺陷病毒中的宿主衍生性ICAM-1糖蛋白具有生物學(xué)活性并能增強(qiáng)病毒的感染力,病毒學(xué)雜志713588.
      6.Fortin,J.-F.,R,,R Cantin,和M.Tremblay.1998.表達(dá)活化型LFA-1的T細(xì)胞更易被攜有宿主編碼的ICAM-1的I型人類(lèi)免疫缺陷病毒顆粒感染,病毒學(xué)雜志7221057.Rizzuto,C.D.,和J.G.Sodroski.1997.病毒體ICAM-1對(duì)人類(lèi)免疫缺陷病毒的感染力以及其對(duì)中和作用的敏感性的貢獻(xiàn),病毒學(xué)雜志714847.
      8.Bomsel,M.1997.感染性人類(lèi)免疫缺陷病毒跨過(guò)致密的人類(lèi)上皮細(xì)胞系屏障的跨細(xì)胞作用(transcytosis),Nat.Med.342.
      9.D′Souza,M.P.,D.Livnat,J.A.Bradac,和S.H.Bridges.1997.通過(guò)中和試驗(yàn)評(píng)估I型人類(lèi)免疫缺陷病毒原代分離物的單克隆抗體篩選臨床試驗(yàn)候選抗體時(shí)的性能標(biāo)準(zhǔn),J.Infect.Dis.1751056.
      10.Kage,A.,E.Shoolian,K.Rokos,M.TMzel,R.Nuck,W.Reutter,E.K”ttgen,和G.Pauli.1998.無(wú)細(xì)胞的I型人類(lèi)免疫缺陷病毒以及gp 120包被的微粒的上皮吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),病毒學(xué)雜志724231.
      11.Fais,S.,P.Borghi,G.Gherardi,M.Logozzi,F(xiàn).Belardelli,和S.Gossani.1996.I型人類(lèi)免疫缺陷病毒在人類(lèi)原代單核細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞極化、細(xì)胞間粘附分子-1的再分配和多形核巨細(xì)胞的產(chǎn)生,但不在單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)上述結(jié)果,Lab.Invest.75783.
      12.Vermot-Desroches,C.,D.Rigal,S.Escaich,J.Bemaud,C.Pichoud,J.P.Lamelin,和C.Trepo.1991.參與HIV-1誘導(dǎo)的合胞體形成的人類(lèi)CDlla/CD18分子(LFA-1,淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1)的功能性表位分析,Scand J.Immunol.34461.
      13.Anderson,D.J.,和E.J.Yunis.1983.AIDS中的“特洛伊木馬(TrojanHorse)”白細(xì)胞,N.Engl.J.Med.309984.
      14.Levy,J.A.1988.AIDS的傳播感染細(xì)胞的情況(the case of theinfected cell).J.A.M.A.2593037.
      15.Collins,K.B.,B.K.Patterson,G.J.Naus,D.V.Landers和P.Gupta.2000.開(kāi)發(fā)一種體外器官培養(yǎng)模型以便研究HIV-1在女性生殖道中的傳播,Nat.Med.6475.
      16.Agracetus.1994.植物生物反應(yīng)器系統(tǒng),Agraceuts,Inc.
      17.Bomsel,M.,M.Heyman,H.Hocini,S.Lagaye,L.Belec,C.Dupont,和C.Desgranges.1998.抗HIV包膜蛋白dIgA或IgM對(duì)HIV跨過(guò)致密上皮屏障的跨細(xì)胞作用的胞內(nèi)中和效應(yīng),免疫(Immunity).9277-287.
      18.Bourinbaiar,A.S.,和D.M.Phillips.1991.人類(lèi)免疫缺陷病毒從單核細(xì)胞向上皮的傳播,J Acquir Immune Defic Syn dr.456-63.
      19.Butini,L.,A.R.De Fougerolles,M.Vaccarezza,C.Graziosi,D.I.Cohen,M.Montroni,T.A.Springer,G.Pantaleo,和A.S.Fauci.1994.細(xì)胞間粘附分子(ICAM)-1 ICAM-2和ICAM-3在人類(lèi)免疫缺陷病毒介導(dǎo)的合胞體形成中作為淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子1的對(duì)應(yīng)受體而發(fā)揮作用,歐洲免疫學(xué)雜志(EurJ Immunol).242191-5.
      20.de Fougerolles,A.R.,X.Qin,和T.A.Springer.1994.免疫應(yīng)答中細(xì)胞間粘附分子(ICAM)-3的功能鑒定以及與ICAM-1和ICAM-2的比較,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J Exp Med).179619-29.
      21.de Fougerolles,A.R,和T.A.Springe r.1992.細(xì)胞間粘附分子3,即靜息態(tài)淋巴細(xì)胞上淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子1的粘附作用的第三種對(duì)應(yīng)受體,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志175185-90.
      22.Dustin,M.L.,O.Carpen,和T.A.Springer.1992.LFA-1與ICAM-1受體對(duì)移動(dòng)及細(xì)胞與細(xì)胞間接觸區(qū)域的調(diào)節(jié),免疫學(xué)雜志(J Immunol.)1482654-63.
      23.Fiedler,U.,和U.Conrad.1995.轉(zhuǎn)基因煙草種子中工程化抗體的高水平產(chǎn)生和長(zhǎng)期保存,生物技術(shù)(Biotechnology).131090-1093.
      24.Fortin,J.F.,R.Cantin,G.Lamontagne,和M.Tremblay.1997.摻入在I型人類(lèi)免疫缺陷病毒中的宿主衍生性ICAM-1糖蛋白具有生物學(xué)活性并能增強(qiáng)病毒的感染力,病毒學(xué)雜志713588-96.
      25.Gauduin,M.C.,P.W.Parren,R.Weir,C.F.Barbas,D.R.Burton,和R.A.Koup.1997.用人類(lèi)單克隆抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫可保護(hù)hu-PBL-SCID小鼠抵抗HIV-1原代分離物的攻擊,Nat Med.31389-93.
      26.Gauduin,M.C.,J.T.Safrit,R.Weir,M.S.Fung,和R.A.Koup.1995.單克隆抗體介導(dǎo)的針對(duì)I型人類(lèi)免疫缺陷病毒感染的暴露前和暴露后保護(hù)作用,J Infect Dis.1711203-9.
      27.Hiatt,A.,R.Caffertey,和K.Bowdish.1989.抗體在轉(zhuǎn)基因植物中的生成,自然34276-78.
      28.Hiatt,A.,和J.K.-C.Ma.1992.通過(guò)工程化方法整合至植物中的單克隆抗體,F(xiàn)EBS Letters.30771-75.
      29.Ma,J.K.-C.,A.Hiatt,M.Hein,N.D.Vine,F(xiàn).Wang,P.Stabila,C.vanDolleweerd,K.Mostov,和T.Lehner.1995.分泌型抗體在植物中的產(chǎn)生和裝配,科學(xué)268716-719.
      30.Markham,R.B.,D.H.Schwartz,A.Templeton,J.B.Margolick,H.Farzadegan,D.Vlahov,和X.F.Yu.1996.I型人類(lèi)免疫缺陷病毒變體選擇性傳播至已經(jīng)用人類(lèi)外周血單克隆細(xì)胞重建的SCID小鼠,病毒學(xué)雜志706947-54.
      31.Marlin,S.D.,和T.A.Springer.1987.純化的細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(LFA-1)的配體,細(xì)胞(cell)51813-9.
      32.Milman,G,和O.Sharma.1994.HIV/SIV粘膜傳播的機(jī)制,AIDSRes Hum Retroviruses.101305-12.
      上述說(shuō)明和實(shí)施例僅為舉例說(shuō)明實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)的優(yōu)選實(shí)施方案,并非意圖將本發(fā)明限制在該范圍內(nèi)。落在后續(xù)權(quán)利要求書(shū)的精神和范疇之內(nèi)的本發(fā)明任何修飾可以被認(rèn)為是本發(fā)明的部分。
      權(quán)利要求
      1.一種阻斷HIV經(jīng)上皮傳播至動(dòng)物體內(nèi)的方法,其包括在所述動(dòng)物的暴露于所述HIV的部位處提供一種抗ICAM-1抗體。
      2.權(quán)利要求1的方法,其中所述抗ICAM-1抗體是植物抗體。
      3.權(quán)利要求1的方法,其中所述抗ICAM-1抗體是抗人ICAM-1 IgG1抗體。
      4.權(quán)利要求1的方法,其中所述ICAM-1抗體的量足以阻斷HIV經(jīng)上皮傳播。
      5.權(quán)利要求4的方法,其中所述量為約20μg/ml-約1000μg/ml。
      6.權(quán)利要求4的方法,其中所述量為約5mg/ml-約10mg/ml。
      7.權(quán)利要求1的方法,其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
      8.權(quán)利要求1的方法,其中所述動(dòng)物是人類(lèi)。
      9.權(quán)利要求1的方法,其中所述抗ICAM-1抗體所用劑型選自乳膏、泡沫劑、口服液、固體、噴霧劑、陰道洗液、陰道沖洗劑、栓劑、母乳添加劑、和嬰兒配方食品。
      10.權(quán)利要求1的方法,其中所述抗ICAM-1抗體提供在一種載體中,該載體含有選自下組的物質(zhì)潤(rùn)滑劑、表面活性劑、膠質(zhì)、有機(jī)溶劑、乳化劑、膠凝劑、增濕劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、控釋劑、多價(jià)螯合劑、染料、和香料。
      11.權(quán)利要求1的方法,其中所述對(duì)HIV與細(xì)胞結(jié)合后傳播的阻斷不需要阻斷ICAM-1與LFA-1的結(jié)合。
      12.權(quán)利要求1的方法,其中所述暴露位點(diǎn)為粘膜表面。
      13.權(quán)利要求12的方法,進(jìn)一步包括在所述粘膜表面接種已經(jīng)得到遺傳改造的細(xì)菌,其中所述細(xì)菌能產(chǎn)生抗ICAM-1抗體。
      14.權(quán)利要求12的方法,其中所述粘膜表面選自生殖器、陰道、直腸、口腔、和胃腸道的表面。
      15.一種阻斷HIV與細(xì)胞結(jié)合后經(jīng)上皮傳播的方法,其包括在動(dòng)物的陰道上皮上提供一種抗ICAM-1抗體,其中所述對(duì)HIV與細(xì)胞結(jié)合后傳播的阻斷發(fā)生在所述動(dòng)物的陰道上皮處。
      16.一種能在暴露于HIV的經(jīng)上皮位點(diǎn)處阻斷所述HIV經(jīng)上皮傳播的組合物,其包含一種抗ICAM-1抗體和一種賦形劑,其中所述抗ICAM-1抗體的量足以阻斷HIV經(jīng)上皮傳播。
      17.權(quán)利要求16的組合物,其中所述量為約20μg/ml-約1000μg/ml,
      18.權(quán)利要求16的組合物,其中所述抗ICAM-1抗體是植物抗體。
      19.權(quán)利要求16的組合物,其中所述抗ICAM-1抗體是抗人ICAM-1IgG1抗體。
      20.權(quán)利要求18的組合物,其中所述植物抗體的量為約5mg/ml-約10mg/ml。
      21.權(quán)利要求16的組合物,其中所述組合物為母乳添加劑。
      22.權(quán)利要求16的組合物,其中所述組合物為嬰兒配方食品。
      23.權(quán)利要求16的組合物,其中所述組合物為陰道洗液。
      24.權(quán)利要求16的組合物,其中所述組合物為口服液。
      25.權(quán)利要求16的組合物,其中所述組合物為栓劑。
      26.權(quán)利要求16的組合物,其中所述組合物為抗ICAM-1抗體,而所述賦形劑為一種可藥用的載體。
      27.權(quán)利要求26的組合物,其中所述賦形劑選自潤(rùn)滑劑、表面活性劑、膠、有機(jī)溶劑、乳化劑、膠凝劑、增濕劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、控釋劑、多價(jià)螯合劑、染料、和香料。
      28.權(quán)利要求26的組合物,其中所述賦形劑為粘膜粘著劑。
      29.一種用于阻斷HIV與細(xì)胞結(jié)合后經(jīng)上皮傳播的制品,其包括一種基體和一種抗ICAM-1抗體。
      30.權(quán)利要求29的制品,其中所述抗ICAM-1抗體浸透在所述基體中。
      31.權(quán)利要求29的制品,其中所述抗ICAM-1抗體涂布在所述基體表面。
      32.權(quán)利要求29的制品,其中所述基體選自海綿、避孕套、宮內(nèi)避孕器、宮頸環(huán)和隔膜。
      33.權(quán)利要求29的制品,其中所述基體含有一種避孕用品。
      全文摘要
      本發(fā)明提供了用ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的方法,組合物和制品。所述ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑在暴露至病毒的位點(diǎn)阻斷病毒傳播。對(duì)病毒傳播的阻斷不需要阻斷ICAM-1對(duì)LFA-1的結(jié)合。所述ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑可應(yīng)用于粘膜表面,避孕用品表面或內(nèi)部或口服液如母奶添加劑和嬰兒配方食品中。
      文檔編號(hào)A61K9/08GK1402797SQ00811362
      公開(kāi)日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2000年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月24日
      發(fā)明者理查德·B·馬卡姆, 克里斯騰·V·卡納 申請(qǐng)人:約翰·霍普金斯大學(xué)
      網(wǎng)友詢(xún)問(wèn)留言 已有0條留言
      • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1