專利名稱：局部使用的新的二肽基肽酶iv效應(yīng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的二肽基肽酶IV效應(yīng)物。這些效應(yīng)物可用于靶向影響限于局部的病理生理和生理過(guò)程(炎癥、趨化性、自身免疫疾病、傷口愈合)，其中通過(guò)效應(yīng)物(特別是底物、假底物、抑制劑、抗體、結(jié)合蛋白、結(jié)合拮抗劑、結(jié)合激動(dòng)劑)影響二肽基肽酶IV和具有相似或相同活性的酶和具有相關(guān)一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(例如FAP，成纖維細(xì)胞激活蛋白(Fibroblast Activation Protein)(Levy等，1999))的酶活性和結(jié)合活性。
除了在最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)破壞成氨基酸的非特異性蛋白水解中涉及的蛋白酶之外，調(diào)節(jié)蛋白酶是已知的，它們參與內(nèi)源肽活性物質(zhì)的官能作用(激活、失活、修飾)(Kirschke等，1995)(Krusslich和Wimmer，1987)。特別是在免疫學(xué)研究和神經(jīng)肽研究中，已發(fā)現(xiàn)許多所謂的轉(zhuǎn)化酶、信號(hào)肽酶或腦啡肽酶(Gomez等，1998)(Ansorge等，1991)。
因?yàn)樵谠S多肽類激素中經(jīng)常存在氨基酸脯氨酸和因?yàn)槟切╇念惖南嚓P(guān)結(jié)構(gòu)性質(zhì)，所以討論脯氨酸特異性肽酶類似于信號(hào)肽酶的功能(Yaron和Naider，1993)；(Vanhoof等，1995)。由于其特定結(jié)構(gòu)，那些肽中的脯氨酸確定了那些肽的構(gòu)象和穩(wěn)定性，使之免遭非特異性蛋白酶的破壞(Kessler，1982)。相反，對(duì)于目前的活性物質(zhì)研究來(lái)說(shuō)，以高特異性、結(jié)構(gòu)修飾方式作用于含脯氨酸序列(特別是HIV蛋白酶、親環(huán)蛋白)的酶是有吸引力的目標(biāo)。尤其是，對(duì)于在脯氨酸之后裂解的肽酶脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)和二肽基肽酶IV(DP IV)來(lái)說(shuō)，有可能得出結(jié)論在天然肽底物的生物學(xué)活性的修飾及其被那些酶選擇性裂解之間可能存在關(guān)聯(lián)。因此認(rèn)為在免疫應(yīng)答期間，PEP參與的學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程，信號(hào)傳輸涉及DP IV(Ishiura等，1989)；(Hegen等，1990)。
在血流和幾乎所有器官中均發(fā)現(xiàn)DP IV活性和類DP IV活性(例如，溶酶體DP II的底物特異性幾乎等同于DP IV的)，當(dāng)生物學(xué)活性肽序列含有與N-末端氨基酸相鄰的脯氨酸或丙氨酸殘基時(shí)，該活性在血流和幾乎所有器官中高度特異性地從該生物學(xué)活性肽的N-末端裂解二肽。因此認(rèn)為在體內(nèi)調(diào)節(jié)多肽的生物學(xué)活性中涉及該酶(Vanhoof等，1995)。
最近已證明一系列趨化因子(特別是RANTES、SDF-1α、MDC、eotaxin)是DP IV的底物，通過(guò)DP IV調(diào)節(jié)它們的功能(Proost等，1998；Proost等，1998；Proost等，1999)；(Shioda等，1998)。由于其趨化作用，趨化因子基本上在局部免疫過(guò)程如自身免疫過(guò)程、炎癥和傷口愈合的調(diào)節(jié)中被涉及(Nelson和Krensky，1998)。在最近的工作中，我們已能證明生物學(xué)活性肽在P1-位置上具有絲氨酸或蘇氨酸(胰高血糖素、VIP、PACAP)，而且還是DP IV的底物。
在皮膚中的神經(jīng)元、免疫和血管活性過(guò)程的調(diào)節(jié)中涉及一系列生物學(xué)活性DP IV底物(特別是物質(zhì)P、促生長(zhǎng)素抑制素、VIP、PACAP)(Scholzen等，1998)；(Wallengren，1997)。因此，在調(diào)節(jié)胃腸道、免疫和神經(jīng)活性肽的活性方面，二肽基肽酶IV代表重要的調(diào)控中心，因此它是令人感興趣的治療靶(Augustyns等，1999)。然而，信號(hào)級(jí)聯(lián)的精確細(xì)節(jié)尚未得到充分闡明。
已更詳細(xì)地了解DP IV在血糖調(diào)節(jié)中的作用。由于有限的蛋白水解，腸降血糖素GIP1-4和GLP7-37失活。通過(guò)延長(zhǎng)腸降血糖素的活性和增加胰島素的釋放，血漿DP IV活性的抑制導(dǎo)致血糖水平正常化(Demuth等，1996；Pauly等，1999；Pauly等，1996)。
DP IV在免疫系統(tǒng)中的作用尚未得到充分闡明。它是T淋巴細(xì)胞的激活標(biāo)志和腺苷脫氨酶的受體。在細(xì)胞培養(yǎng)物中和體內(nèi)使用DPIV抑制劑具有免疫抑制作用(Ansorge等，1995；Reinhold等，1997；Kubota等，1992)。使用抗CD26的單克隆抗體，已獲得對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)(Ca2+流入、激酶活化)的激活作用，有時(shí)與酶的酶活性無(wú)關(guān)(Hegen等，1993；Kameoka等，1995；Tanaka等，1993；Khne等，1995)。
衍生于物質(zhì)P的N-末端序列的賴氨酰-脯氨酰類似物顯示促進(jìn)傷口愈合的作用，這歸因于與物質(zhì)P類似的結(jié)構(gòu)。相反，全身使用不可逆的DP IV抑制劑導(dǎo)致抑制傷口愈合(Buntrock等，1998；Kohl等，1991；Kohl等，1989)。
除了將DP IV抑制劑用于使血糖正常化之外，至今DP IV抑制劑還被全身使用以治療動(dòng)物模型的關(guān)節(jié)炎。
在關(guān)節(jié)炎患者和動(dòng)物關(guān)節(jié)炎模型中，已觀察到DP IV活性的降低(Küllertz和Boigk，1986(Fujita等，1992))。尤其是，由于口服或皮下給予全身作用的DP IV抑制劑，在動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)了抑制烷基二胺誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Tanaka等，1997；Tanaka等，1998)。
使用DP IV抑制劑，還獲得了對(duì)其它自身免疫疾病的作用。例如，由于DP IV抑制，可能實(shí)現(xiàn)抑制髓磷脂堿性蛋白特異性T細(xì)胞克隆的增殖(Reinhold等，1998)。
在各種皮膚病(銀屑病、扁平苔癬)和致癌的皮膚病中，可能證明在角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中DP IV活性增加(Novelli等，1996)(Raynaud等，1992)。成纖維細(xì)胞激活蛋白與DP IV密切相關(guān)，其與DP IV有約50％序列同源性，其可能與Pineiro-Sanchez等，1997所描述的seprase相同，成纖維細(xì)胞激活蛋白也通過(guò)失活的上皮癌成纖細(xì)胞以更高程度表達(dá)并愈合傷口(Niedermeyer等，1998)。
由于蛋白在人體中的廣泛分布和涉及DP IV、DP IV活性和DPIV相關(guān)蛋白的各種機(jī)理，用DP IV抑制劑進(jìn)行的全身治療(腸內(nèi)或非胃腸給藥)可能導(dǎo)致一系列不期望的副作用。例如，DP IV抑制劑的非胃腸或腸內(nèi)給藥將以調(diào)節(jié)或去調(diào)節(jié)的方式干擾葡萄糖代謝。
現(xiàn)已可能證明酶二肽基肽酶IV的側(cè)鏈修飾的底物可被酶識(shí)別并以與未修飾的底物相同的方式被裂解(DEMUTH，H.-U.，HEINS，J.，1995)。
例如，現(xiàn)已可能表明磷酸化二肽-(B)-對(duì)硝基酰苯胺[KASPARI，A.等，1996]是DP IV、DP IV抑制劑的底物，例如Glu(Gly)-Thia或Lys(Z-NO2)-Thia[REINHOLD，D.等，1998]被完全轉(zhuǎn)運(yùn)。
本發(fā)明要解決的問(wèn)題在于制備可靶向影響限于局部的病理生理和生理過(guò)程的化合物。本發(fā)明的問(wèn)題特別在于得到DP IV或DP IV類似物活性的限于局部的抑制，其目的是對(duì)局部活性肽激素活性的調(diào)節(jié)進(jìn)行靶向干擾。
通過(guò)提供通式 的化合物解決本發(fā)明的問(wèn)題其中A是側(cè)鏈中具有至少一個(gè)官能團(tuán)的氨基酸，B是與A的側(cè)鏈中的至少一個(gè)官能團(tuán)共價(jià)結(jié)合的化合物，即- 鏈長(zhǎng)為至多20個(gè)氨基酸的寡肽，除了由至多6個(gè)甘氨酸單體組成的甘氨酸均聚物之外，或- 摩爾質(zhì)量為至多20000g/mol的聚乙二醇，C是與A酰胺鍵合的噻唑烷、吡咯烷、氰基吡咯烷、羥脯氨酸、脫氫脯氨酸或哌啶基。
根據(jù)本發(fā)明，特別地提供至少一種藥物組合物，其包含至少一種通式 的化合物和至少一種適用于作用部位的常規(guī)輔劑，其中A是氨基酸，優(yōu)選為α-氨基酸，特別是側(cè)鏈中具有至少一個(gè)官能團(tuán)的天然α-氨基酸，優(yōu)選是蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸，B是與A的側(cè)鏈中的至少一個(gè)官能團(tuán)共價(jià)結(jié)合的化合物，即鏈長(zhǎng)為至多20個(gè)氨基酸的寡肽，摩爾質(zhì)量為至多20000g/mol的聚乙二醇，具有8至50個(gè)碳原子的任選地取代的有機(jī)胺、酰胺、醇、酸或芳族化合物，C是與A酰胺鍵合的噻唑烷、吡咯烷、氰基吡咯烷、羥脯氨酸、脫氫脯氨酸或哌啶基。
而且，這種化合物或藥物組合物用于局部影響，特別是降低二肽基肽酶IV或類似酶的活性。
說(shuō)明書和權(quán)利要求書中的術(shù)語(yǔ)“烷基”可以指C1-50烷基，優(yōu)選是C6-30烷基，特別是C8-12烷基；例如，烷基可以是甲基、乙基、丙基、異丙基或丁基；術(shù)語(yǔ)“烷”，例如術(shù)語(yǔ)“烷氧基”中的“烷”，以及術(shù)語(yǔ)“烷酰基”中的術(shù)語(yǔ)“烷”均定義為“烷基”。
芳族化合物優(yōu)選是取代的或任選地未取代的苯基、芐基、萘基、聯(lián)苯基或蒽基，它們優(yōu)選具有至少8個(gè)碳原子；術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”可以指C2-10鏈烯基，優(yōu)選為C2-6鏈烯基，它們?cè)谌魏纹谕恢镁哂须p鍵并可以是取代的或未取代的；術(shù)語(yǔ)“炔基”可以指C2-10炔基，優(yōu)選為C2-6炔基，它們?cè)谌魏纹谕恢镁哂腥I并可以是取代的或未取代的；術(shù)語(yǔ)“取代的”或取代物可以指任何期望的被一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選一個(gè)或兩個(gè)烷基、鏈烯基、炔基、單或多價(jià)?；?、烷酰基、烷氧烷?；蛲檠跬榛〈?；因此前述取代物可以具有一個(gè)或多個(gè)(但優(yōu)選零個(gè))作為側(cè)基的烷基、鏈烯基、炔基、單或多價(jià)?；?、烷酰基、烷氧烷?；蛲檠跬榛桓髯跃哂?至50個(gè)碳原子，優(yōu)選10至20個(gè)碳原子的有機(jī)胺、酰胺、醇或酸可以具有如下分子式(烷基)2N-或烷基-NH-，-CO-N(烷基)2或-CO-NH(烷基)，-烷基-OH或-烷基-COOH。
盡管有延長(zhǎng)的側(cè)鏈官能團(tuán)，但本發(fā)明的化合物仍然可以與酶二肽基肽酶IV和類似酶的活性中心結(jié)合，但不再被肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pep T1活性轉(zhuǎn)運(yùn)。所得的降低的或大大限制的本發(fā)明化合物的可轉(zhuǎn)運(yùn)性，以理想的方式，導(dǎo)致DP IV和類似酶的局部抑制。
本發(fā)明的化合物或根據(jù)本發(fā)明所使用的化合物可以分別以外消旋體的形式或純的光學(xué)異構(gòu)體化合物的形式，相對(duì)于A優(yōu)選以L-蘇型或L-別型(L-allo)的形式存在或使用[此處是否不應(yīng)讀成A？]。
因此，通過(guò)局部給予特異性DP IV抑制劑以局部干擾肽的調(diào)節(jié)，由于僅僅發(fā)生限于局部的DP IV活性抑制，所以有可能避免由腸內(nèi)或非胃腸給予DP IV抑制劑所引起的全身副作用。因?yàn)楸苊饬嘶衔锏目焖偃矸植?，所以在很大程度上不影響全身調(diào)節(jié)過(guò)程或在其它組織中的調(diào)節(jié)過(guò)程。
通過(guò)延長(zhǎng)/擴(kuò)展側(cè)鏈修飾，例如多于七個(gè)碳原子，從而根據(jù)本發(fā)明有可能獲得可轉(zhuǎn)運(yùn)性的顯著降低(表1)。表1的實(shí)施例清楚地表明，隨著側(cè)鏈空間大小的增加，物質(zhì)的可轉(zhuǎn)運(yùn)性降低。通過(guò)側(cè)鏈的空間和立體擴(kuò)展，例如大于單取代的苯基、羥胺基或氨基酸殘基的原子基團(tuán)大小，根據(jù)本發(fā)明有可能修飾或抑制靶物質(zhì)的可轉(zhuǎn)運(yùn)性。
因此，可能以有差別的方式影響活體中的DP IV活性。
因此，一方面，通過(guò)本發(fā)明，可能實(shí)現(xiàn)抑制劑在所治療的組織中的有效作用，另一方面，通過(guò)限于局部，也就是說(shuō)局部給予DP IV抑制劑，可能在很大程度上避免抑制劑的全身作用。因此，有可能有效地影響局部的生理和病理生理過(guò)程(炎癥、銀屑病、關(guān)節(jié)炎、自身免疫疾病、變態(tài)反應(yīng))，且?guī)缀鯖](méi)有副作用。
本發(fā)明得到下述事實(shí)的支持· 腸內(nèi)或非胃腸，也就是說(shuō)口服和靜脈內(nèi)或皮下給予的DP IV抑制劑全身分布，并抑制全身的DP IV及類似活性。· 但是，在調(diào)節(jié)局部信號(hào)級(jí)聯(lián)(趨化性、炎癥、神經(jīng)傳遞)中涉及一系列DP IV的生物學(xué)活性肽底物?！? 本發(fā)明的側(cè)鏈修飾的DP IV抑制劑令人驚奇地顯示高的抑制能力，但幾乎不或根本不被吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，因此不導(dǎo)致顯著的全身作用。
因此本發(fā)明提供新的DP IV抑制劑和在體內(nèi)應(yīng)用DP IV抑制劑的新方法。這種抑制劑可以通過(guò)化學(xué)修飾和/或配方而與使用類型相適應(yīng)。例如，通過(guò)在側(cè)鏈上的體積大的親水性取代基使全身分布困難或防止全身分布。
可以在藥物和化妝品制劑中給予該抑制劑。
局部使用包括通過(guò)以下方式局部使用抑制劑用軟膏、乳膏或化妝品直接施用到待治療的組織(例如皮膚、傷口、腫瘤)上，和用含效應(yīng)物的藥貼、敷料等的間接施用，以滴劑、噴霧劑或吸入劑等的形式間接施用在身體的部分(嘴、鼻、耳、眼睛、肺)上，直接注射入待治療的組織或注射到待治療的組織附近，以及植入含效應(yīng)物的材料。局部使用進(jìn)一步包括口服或肛門給予非吸收或不易吸收的二肽基肽酶IV或類DP IV序列的效應(yīng)物，其目的是選擇性影響胃腸DP IV。
根據(jù)本發(fā)明，特別地使用的化合物是其中鏈長(zhǎng)為3至15，特別是4至10個(gè)氨基酸的寡肽，和/或摩爾質(zhì)量至少為250g/mol，優(yōu)選至少為1500g/mol至15000g/mol的聚乙二醇，和/或具有至少12個(gè)碳原子且優(yōu)選至多30個(gè)碳原子的任選地取代的有機(jī)胺、酰胺、醇、酸或芳族化合物。而且，本發(fā)明公開(kāi)了藥物和化妝品組合物，其包含至少一種本發(fā)明的化合物，任選地與本領(lǐng)域的常規(guī)載體或輔劑組合。
本發(fā)明的化合物或藥物或化妝品組合物可用于局部影響二肽基肽酶IV或類似酶的活性，特別是用于預(yù)防或治療皮膚病或粘膜病、自身免疫疾病和炎癥如銀屑病、變態(tài)反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、腫瘤或自身免疫疾病。
該化合物和藥物或化妝品組合物可以軟膏、乳膏、化妝品、藥貼、敷料、滴劑、噴霧劑、吸入劑、植入物或注射溶液的形式配方并使用。
本發(fā)明所使用的輔劑是本領(lǐng)域已知的。
因此，本發(fā)明涉及二肽基肽酶IV和類DP IV酶活性和類DP IV蛋白的效應(yīng)物的局部使用。局部使用可以局部修飾前述高度特異性的酶的活性，所述酶在生物學(xué)活性肽(特別是趨化因子、物質(zhì)P、VIP、PHM、PACAP、生長(zhǎng)因子)的失活和活化關(guān)鍵性地被涉及。
因此，在局部免疫過(guò)程中的靶向干擾是可能的，有效的和靶向治療與其相關(guān)的病理生理和生理過(guò)程(銀屑病、牙周炎、關(guān)節(jié)炎、變態(tài)反應(yīng)、炎癥)也是可能的。本發(fā)明使簡(jiǎn)單地和高局部濃度地使用抑制劑成為可能。
作為相應(yīng)效應(yīng)物的低全身負(fù)荷的結(jié)果，避免了對(duì)腸降血糖素系統(tǒng)或全身免疫應(yīng)答的影響。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，側(cè)鏈修飾僅輕微程度地改變與化合物的結(jié)合特性。相反，該抑制劑被肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的能力通過(guò)側(cè)鏈修飾得到顯著地降低。
所述DP IV抑制劑因此特別適于在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)DP IV的限于局部的抑制。表1所選擇的DP IV抑制劑的可轉(zhuǎn)運(yùn)性和抑制常數(shù)
1使3H-D-Phe-Ala(80mM)與表達(dá)PepT1的P.pastoris細(xì)胞的結(jié)合抑制至50％的化合物有效濃度(EC50值)2X.leavis的表達(dá)PepT1卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)特性-通過(guò)兩個(gè)電極電壓鉗方法，I＝轉(zhuǎn)運(yùn)所產(chǎn)生的內(nèi)部電流3實(shí)施例的化合物對(duì)純化的腎DP IV的競(jìng)爭(zhēng)性抑制的抑制常數(shù)4不可檢測(cè)實(shí)施例2口服給予DP IV抑制劑對(duì)血清DP IV活性的影響研究在健康Wistar大鼠中，口服給予側(cè)鏈修飾的DP IV抑制劑(5μM/300mg大鼠)后和口服給予未修飾的抑制劑相比，血漿DP IV的抑制(全身作用)。
盡管抑制劑具有與DP IV近似相等的Ki值(表1)，但總的來(lái)說(shuō)，新的側(cè)鏈修飾的抑制劑對(duì)血漿DP IV的抑制慢得多且程度較低。這意味著在腸內(nèi)更不易吸收或根本不吸收抑制劑。特別地，在Glu(Gly)5-Thia的情況下，沒(méi)有可檢測(cè)到的口服給予活性成分的全身作用。
因此，那些抑制劑可以用作合成新的且不產(chǎn)生全身作用的可局部給予的DP IV抑制劑的基本結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3合成側(cè)鏈修飾的DP IV抑制劑3.1合成Boc-Glu-Thia根據(jù)方法B(方法參見(jiàn)3.4節(jié))的Boc-Glu(OMe)-OH與Thia*HCl的反應(yīng)，根據(jù)方法G的Boc-Glu(OMe)-Thia的水解。表2 Boc-Glu-Thia的分析數(shù)據(jù)
1薄層色譜系統(tǒng)A氯仿/甲醇90∶10系統(tǒng)B苯/丙酮/乙酸25∶10∶0.5系統(tǒng)C正丁醇/EA/乙酸/水1∶1∶1∶12HPLC分離條件柱子Nucleosil C-18，7μ250mm×21mm洗脫劑恒溶劑洗脫，40％ACN/水/0.1％TFA流速6ml/分λ＝220nm3.2側(cè)鏈修飾的Boc-谷氨酰噻唑烷通過(guò)引入各種大小的游離基，在γ-羧酸官能團(tuán)處修飾Boc-Glu-Thia。游離基通過(guò)它們的氨基形成結(jié)合于γ-羧酸官能團(tuán)的酰胺而偶聯(lián)，取決于自由基的不同而使用各種偶聯(lián)方法。
使用所述方法，使下述氨基成分連接于Boc-Glu-Thia
在2情況下，反應(yīng)產(chǎn)物的純化不同于合成的一般描述。Boc-Glu(Gly5)-Thia攪拌過(guò)夜，產(chǎn)物從混合物中沉淀出；隨后過(guò)濾之并用0.1N HCl和大量水洗滌。接著在真空下用P4O10干燥之。Boc-Glu(PEG)-Thia與一般過(guò)程相反，將用于合成的起始物質(zhì)溶于500倍過(guò)量的DMF中。反應(yīng)完成后，在真空下完全除去DMF，并將殘余物溶于大量甲醇中。在傾入醚后形成上層，產(chǎn)物與未反應(yīng)的PEG一起沉淀出。在凝膠過(guò)濾柱(Pharmazia，Sephadex G-25，90μm，260mm-100mm)上，通過(guò)制備HPLC分離進(jìn)行精細(xì)純化。
分離條件洗脫劑水；流速5ml/min；λ＝220nm表3側(cè)鏈修飾的Boc-谷氨酰噻唑烷的合成數(shù)據(jù)
2HPLC分離條件柱子Nucleosil C-18，7μ，250mm×21mm洗脫劑無(wú)梯度，40％ACN/水/0.1％TFA流速6ml/minλ＝220nm3.3.側(cè)鏈修飾的谷氨酰噻唑烷使用方法F將N-末端Boc保護(hù)基從表3所列的化合物裂解下來(lái)。通過(guò)制備HPLC分離純化用Gly衍生物修飾的物質(zhì)，該物質(zhì)以三氟乙酸鹽的形式存在。以與Boc保護(hù)的前體相同的方式，在凝膠過(guò)濾柱上純化H-Glu(PEG)-Thia。表4側(cè)鏈修飾的谷氨酰噻唑烷的合成數(shù)據(jù)
3HPLC分離條件柱子Nucleosil C-18，7μ，250mm×21mm洗脫劑ACN/水/0.1％TFA梯度30分鐘內(nèi)20％ACN→90％ACN流速6ml/minλ＝220nmn.dm.-未檢測(cè)或不可檢測(cè)3.4一般合成步驟方法A使用CFIBE作為活化劑，通過(guò)混合酸酐方法進(jìn)行的肽鍵連接將10mmol N-端保護(hù)的氨基酸或肽溶于20ml無(wú)水THF中。將溶液冷卻到-15℃±2℃。在各例中在攪拌下逐步加入10mmolN-MM和10mmol氯甲酸異丁酯，嚴(yán)格遵守所述的溫度范圍。約6分鐘后，加入10mmol氨基成分。當(dāng)氨基成分是鹽時(shí)，接著向反應(yīng)混合物中進(jìn)一步加入10mmol N-MM。然后將反應(yīng)混合物在冷態(tài)下攪拌2小時(shí)并在室溫下攪拌過(guò)夜。
使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮反應(yīng)混合物，在EA中收集，用5％KH2SO4溶液、飽和NaHCO3溶液和飽和NaCl溶液洗滌，并用Na2SO4干燥。真空除去溶劑之后，在EA/戊烷中重結(jié)晶該化合物。方法B使用新戊酰氯作為活化劑，通過(guò)混合酸酐方法進(jìn)行的肽鍵連接將10mmol N-端保護(hù)的氨基酸或肽溶于20ml無(wú)水THF中。將溶液冷卻到0℃。在各例中，在攪拌下逐步加入10mmolN-MM和10mmol新戊酰氯，嚴(yán)格遵守所述的溫度范圍。約6分鐘后，將混合物冷卻到-15℃，一達(dá)到更低的溫度后，就加入10mmol氨基成分。當(dāng)氨基成分是鹽時(shí)，接著向反應(yīng)混合物中進(jìn)一步加入10mmol N-MM。然后將反應(yīng)混合物在冷態(tài)下攪拌2小時(shí)并在室溫下攪拌過(guò)夜。
按方法A進(jìn)行進(jìn)一步的操作。方法C使用TBTU作為活化劑進(jìn)行的肽鍵連接將10mmol N-端保護(hù)的氨基酸或肽和10mmol C-端保護(hù)的氨基酸成分溶于20ml無(wú)水THF中。將溶液冷卻到0℃。在各例中在攪拌下逐步加入10mmol DIPEA和10mmol TBTU，將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌1小時(shí)接著在室溫下攪拌過(guò)夜。在真空下完全除去DMF并按方法A所述對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行操作。方法D合成活性酯(N-羥基琥珀酰亞胺酯)將10mmol N-端保護(hù)的氨基酸或肽和10mmol N-羥基琥珀酰亞胺溶于20ml無(wú)水THF中。將溶液冷卻到0℃，并在攪拌下加入10mmol二環(huán)己基碳二酰亞胺。將反應(yīng)混合物在0℃下進(jìn)一步攪拌2小時(shí)接著在室溫下攪拌過(guò)夜。過(guò)濾所得到的N，N′-二環(huán)己基脲，在真空下除去溶劑并從EA/戊烷中重結(jié)晶殘留的產(chǎn)物。方法E使用N-羥基琥珀酰亞胺酯進(jìn)行的酰胺鍵連接將10mmol C-端未保護(hù)的氨基成分引入到NaHCO3溶液(20mmol溶于20ml水中)中。室溫下，在攪拌下緩慢地逐滴加入溶于10ml二噁烷的10mmol N-端保護(hù)的N-羥基琥珀酰亞胺酯。繼續(xù)攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜并在真空下除去溶劑。
按方法A進(jìn)行進(jìn)一步的操作。方法FBoc保護(hù)基的裂解向1mmol Boc-保護(hù)的氨基酸吡咯酰胺(pyrrolidide)、噻唑酰胺(thiazolidide)或肽中加入3ml 1.1N HCl/冰醋酸(方法F1)或3ml 1.1N HCl/二噁烷(方法F2)或3ml 50％溶于DCM的TFA(方法F3)。通過(guò)TLC監(jiān)控室溫下的裂解。反應(yīng)完成后(約2小時(shí))，使用無(wú)水乙醚以鹽酸鹽的形式沉淀出化合物，抽濾分離該化合物并在真空下用P4O10干燥之。使用甲醇/醚重結(jié)晶或再沉淀該產(chǎn)物。方法G水解將1mmol肽甲酯溶于10ml丙酮和11ml 0.1M NaOH溶液中并在室溫下攪拌。通過(guò)TLC監(jiān)控水解進(jìn)程。反應(yīng)完成后，真空下除去丙酮。使用濃KH2SO4溶液酸化殘留的水溶液，直到pH達(dá)到2-3。接著用EA提取產(chǎn)物數(shù)次；用飽和NaCl溶液洗滌合并的乙酸乙酯部分并用Na2SO4干燥之，真空下除去溶劑。用EA/戊烷進(jìn)行結(jié)晶。


圖1顯示每300g大鼠(n＝2)口服給予5μmol抑制劑后，血漿DPIV活性的百分抑制隨時(shí)間的進(jìn)程。
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權(quán)利要求
1.通式 的化合物其中A是側(cè)鏈中具有至少一個(gè)官能團(tuán)的氨基酸，B是與A的側(cè)鏈中的至少一個(gè)官能團(tuán)共價(jià)結(jié)合的化合物，即- 鏈長(zhǎng)為至多20個(gè)氨基酸的寡肽，除了由至多6個(gè)甘氨酸單體組成的甘氨酸均聚物之外，或- 摩爾質(zhì)量為至多20000g/mol的聚乙二醇，C是與A酰胺鍵合的噻唑烷、吡咯烷、氰基吡咯烷、羥脯氨酸、脫氫脯氨酸或哌啶基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其特征在于A是α-氨基酸。
3.前述權(quán)利要求之一的化合物，其特征在于A是天然α-氨基酸。
4.前述權(quán)利要求之一的化合物，其特征在于氨基酸是蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸。
5.前述權(quán)利要求之一的化合物，其特征在于寡肽的鏈長(zhǎng)為3至15個(gè)氨基酸。
6.前述權(quán)利要求之一的化合物，其特征在于寡肽是均聚物、共聚物或嵌段共聚物。
7.前述權(quán)利要求之一的化合物，其特征在于聚乙二醇的摩爾質(zhì)量至少為250g/mol。
8.前述權(quán)利要求之一的化合物，其特征在于C是噻唑烷、吡咯烷、氰基吡咯烷基。
9.藥物組合物，其包含前述權(quán)利要求之一的化合物，任選地與本領(lǐng)域的常規(guī)載體或輔劑組合。
10.化妝品組合物，其包含權(quán)利要求1至8之一的化合物，任選地與本領(lǐng)域的常規(guī)載體或輔劑組合。
11.至少一種前述權(quán)利要求之一的化合物或藥物或化妝品組合物用于局部影響二肽基肽酶IV或類似酶的活性的用途。
12.至少一種權(quán)利要求1至10之一的化合物或藥物或化妝品組合物用于預(yù)防或治療皮膚病或粘膜病、自身免疫疾病和炎癥的用途。
13.至少一種權(quán)利要求1至10之一的化合物或藥物或化妝品組合物用于預(yù)防或治療炎癥、銀屑病、變態(tài)反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、腫瘤或自身免疫疾病的用途。
14.軟膏、乳膏、化妝品、藥貼、敷料、滴劑、噴霧劑、吸入劑、植入物或注射溶液形式的至少一種權(quán)利要求1至10之一的化合物或藥物或化妝品組合物的用途。
15.藥物組合物，其包含至少一種通式 的化合物和至少一種適用于作用部位的常規(guī)輔劑，其中A是側(cè)鏈中具有至少一個(gè)官能團(tuán)的氨基酸，B是與A的側(cè)鏈中的至少一個(gè)官能團(tuán)共價(jià)結(jié)合的化合物，即鏈長(zhǎng)為至多20個(gè)氨基酸的寡肽，摩爾質(zhì)量為至多20000g/mol的聚乙二醇，具有8至50個(gè)碳原子的任選地取代的有機(jī)胺、酰胺、醇、酸或芳族化合物，C是與A酰胺鍵合的噻唑烷、吡咯烷、氰基吡咯烷、羥脯氨酸、脫氫脯氨酸或哌啶基。
16.權(quán)利要求15的藥物組合物，其特征在于A是α-氨基酸。
17.權(quán)利要求15或16的藥物組合物，其特征在于A是天然α-氨基酸。
18.權(quán)利要求15至17之一的藥物組合物，其特征在于氨基酸是蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸。
19.權(quán)利要求15至18之一的藥物組合物，其特征在于寡肽的鏈長(zhǎng)為3至15個(gè)氨基酸。
20.權(quán)利要求15至19之一的藥物組合物，其特征在于寡肽是均聚物、共聚物或嵌段共聚物。
21.權(quán)利要求15至20之一的藥物組合物，其特征在于聚乙二醇的摩爾質(zhì)量至少為250g/mol。
22.權(quán)利要求15至21之一的藥物組合物，其特征在于C是噻唑烷、吡咯烷或氰基吡咯烷基。
23.權(quán)利要求15至22之一的藥物組合物，其特征在于其以軟膏、乳膏、化妝品、藥貼、敷料、滴劑、噴霧劑、吸入劑、植入物或注射溶液的形式使用。
24.權(quán)利要求15至23之一的藥物組合物，其特征在于其與本領(lǐng)域的常規(guī)載體組合使用。
25.權(quán)利要求15至24之一的藥物組合物用于局部影響二肽基肽酶IV或類似酶的活性的用途。
26.權(quán)利要求15至24之一的藥物組合物用于預(yù)防或治療皮膚病或粘膜病、自身免疫疾病和炎癥的用途。
27.權(quán)利要求15至24之一的藥物組合物用于預(yù)防或治療炎癥、銀屑病、牙周炎、變態(tài)反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、腫瘤或自身免疫疾病的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)的化合物,其中A是側(cè)鏈中具有至少一個(gè)官能團(tuán)的氨基酸;而B(niǎo)是與A的側(cè)鏈中的官能團(tuán)共價(jià)結(jié)合的化合物,即,除由至多6個(gè)甘氨酸單體組成的甘氨酸均聚物之外的鏈長(zhǎng)為至多20個(gè)氨基酸的寡肽或摩爾質(zhì)量為至多20000g/mol的聚乙二醇;C是與A酰胺鍵合的噻唑烷、吡咯烷、氰基吡咯烷、羥脯氨酸、脫氫脯氨酸或哌啶基。這些化合物可用于局部影響二肽基肽酶IV的活性。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1370181SQ00811936
公開(kāi)日2002年9月18日 申請(qǐng)日期2000年8月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月24日
發(fā)明者漢斯-烏爾里?！さ履绿? 托爾斯滕·霍夫曼, 達(dá)格瑪·施萊茵澤格, 烏爾里?！ず?申請(qǐng)人:前體生物藥物股份公司