專利名稱：對人的背根神經(jīng)節(jié)中鈉離子通道的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的人類河豚毒素耐受性鈉離子通道和相關(guān)的核苷酸，以及對可用于治療急性或慢性疼痛或其它興奮性過高狀態(tài)的試劑進(jìn)行鑒定的篩選試驗(yàn)。此申請相關(guān)于1998年1月29日提交的美國臨時(shí)申請60/072,990；1998年11月20日提交的美國臨時(shí)申請60/109,402；1998年11月20日提交的美國臨時(shí)申請60/109,666；1999年1月29日提交的PCT國際申請PCT/US99/02008，和1999年7月16日提交的美國專利申請09/354,147，在此將其全部引入作為參考。
背景A.鈉通道電壓門控鈉通道是一類特化的蛋白分子，它們作為分子電池允許可興奮性細(xì)胞(神經(jīng)元和肌纖維)產(chǎn)生和傳播電沖動。大鼠腦內(nèi)的電壓門控Na+通道由三個(gè)亞單位組成，形成孔的a亞單位(260KDa)和兩個(gè)能調(diào)節(jié)a亞單位的特性的輔助亞單位b1(36KDa)和b2(33KDa)；a亞單位足以形成能產(chǎn)生鈉離子跨膜流動的功能性通道(Catterall，(1993)神經(jīng)科學(xué)趨勢(TrendsNeurosci).16，500-506；Isom等，(1994)神經(jīng)元12，1183-1194)。在脊椎動物中已經(jīng)鑒定出九種不同的a亞單位并且它們由一個(gè)擴(kuò)展基因家族的成員編碼(Goldin(1995)受體和通道手冊(North，主編)CRC出版；Akopian等，(1996)自然379，257-262；Akopian等，(1997)FEBS Lett.400，183-187；Sangameswaran等，(1996)生物學(xué)和化學(xué)雜志271，5953-5956)，這些基因中多個(gè)已克隆出在多種哺乳動物物種包括人類中相應(yīng)的直向同源基因(orthologue)。特異性a亞單位以組織特異性和發(fā)育特異性方式表達(dá)(Beckh等，(1998)歐洲分子生物學(xué)組織雜志8，3611-3616；Mandel，(1992)膜生物學(xué)雜志125，193-205)。電壓門控鈉通道a亞單位在人或動物的多種疾病中表達(dá)模式異?；虬l(fā)生突變(Roden和George，(1997)美國生理學(xué)雜志273，H511-H525；Ptacek，(1997)神經(jīng)肌肉功能異常(Neuromuscul.Disord.)7，250-255；Cannon，(1997)神經(jīng)肌肉功能異常7，241-249；Cannon，(1996)神經(jīng)科學(xué)趨勢19，3-10)；Rizzo等，(1996)歐洲神經(jīng)病學(xué)36，3-12)。
電壓門控鈉通道a亞單位由具有不同內(nèi)在同源性但有相似的預(yù)測結(jié)構(gòu)的四個(gè)結(jié)構(gòu)域(D1-4)組成，它們由三個(gè)胞內(nèi)環(huán)(L1-3)連接。這四個(gè)結(jié)構(gòu)域折疊后形成一個(gè)通道，它經(jīng)小孔通向細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外空間?？赘鶕?jù)細(xì)胞膜的生理狀態(tài)而開放和關(guān)閉。
每個(gè)結(jié)構(gòu)域由六個(gè)允許該蛋白跨膜與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外接頭交織的跨膜部分(S1-6)組成。四個(gè)結(jié)構(gòu)域中S5-S6部分的接頭包含使通道的孔排列整齊的序列，和起過濾作用以選擇性允許鈉離子橫穿該通道孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并因此產(chǎn)生離子流的高度保守型氨基酸亞群。四個(gè)結(jié)構(gòu)域中各自的兩性S4片段富含每三個(gè)氨基酸即重復(fù)一次的堿性殘基，這種S4片段起電壓感受器的作用并因跨膜電壓差的變化而發(fā)生構(gòu)象改變。這反過來觸發(fā)所述蛋白的構(gòu)象改變，從而使其孔向細(xì)胞外鈉離子梯度開放。
在多數(shù)已知的電壓門控鈉通道a亞單位中，在通道開放(激活)后幾毫秒內(nèi)通道迅速關(guān)閉和變成不能打開的狀態(tài)(失活)；另一方面，SNS型通道緩慢失活并且需要更大的電壓變化才激活。L3，連接結(jié)構(gòu)域D3和D4的環(huán)，包含一個(gè)三肽，該三肽起到細(xì)胞內(nèi)探頭的作用，能在激活后使孔關(guān)閉，并因此誘導(dǎo)通道進(jìn)入失活狀態(tài)。失活后，這些通道進(jìn)一步發(fā)生構(gòu)象變化以恢復(fù)到它們的靜息狀態(tài)并重新等待激活。該階段稱為從失活中恢復(fù)(再啟動(repriming))。不同的通道以不同的速率再啟動，SNS中的再啟動相對較快。
根據(jù)氨基酸相似性，電壓門控鈉通道家族進(jìn)一步分成兩個(gè)亞家族(Felipe等，(1994)生物學(xué)和化學(xué)雜志269，30125-30131)。已克隆的九種通道中有八種屬于亞家族1，它們有許多共同結(jié)構(gòu)特征，尤其是它們的S4跨膜部分。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其中某些具有不同的失活和再啟動動力學(xué)特性。亞家族2僅一種通道，也稱作非典型通道，已經(jīng)在人類、大鼠和小鼠組織中鑒定出。這個(gè)亞家族基本特征是其S4部分中堿性殘基數(shù)目減少，因而預(yù)計(jì)其與亞家族1具有不同的電壓依從性。因?yàn)閬喖易?通道的電生理學(xué)特性尚未闡明故其生理功能目前尚不清楚。
通過一種神經(jīng)毒素，河豚毒素對電壓門控鈉通道的阻斷已經(jīng)把這些通道功能性分類為敏感性(TTX-S)和抵抗性(TTX-R)表型。至今已鑒定出兩種哺乳類TTX-R通道，一種是對心肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)非常局限區(qū)域具有特異性，第二種，SNS，局限于背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)的外周神經(jīng)元(PNS)。賦予對TTX抵抗性或敏感性的特異氨基酸殘基位于通道孔的離子選擇性過濾網(wǎng)中。SNS通道在國際專利申請WO97/01577中也有描述。
B.疾病狀態(tài)下鈉通道的作用因?yàn)椴煌腘a+通道同型a亞單位顯示出不同的動力學(xué)和電壓依從性，所以可興奮細(xì)胞的興奮特性依賴于所表達(dá)的通道類型的精確混合。已經(jīng)證明心肌和骨骼肌a亞單位的突變體引起多種肌肉異常。例如骨骼肌通道的S4中僅一個(gè)堿性氨基酸殘基改變就足以改變此通道的動力學(xué)特性并且在許多患者中誘導(dǎo)疾病狀態(tài)。心臟通道L3的一個(gè)三肽缺失，近乎使通道失活，導(dǎo)致稱作長QT綜合癥的心臟異常。在與通道孔排成一列的Scn8a結(jié)構(gòu)域1的S5-S6連接中僅一個(gè)氨基酸改變，就引起小鼠突變型“搖擺”。經(jīng)另外的突變使此通道完全丟失導(dǎo)致小鼠運(yùn)動終板“med”病。此突變的特征是運(yùn)動神經(jīng)元對受神經(jīng)支配的肌肉的刺激缺失。
C.鈉通道和疼痛軸突損傷(神經(jīng)纖維，也叫軸突的損傷)可以產(chǎn)生慢性痛(術(shù)語稱神經(jīng)病疼痛)。大量研究已證明軸突損傷后神經(jīng)元胞體和樹突的興奮性改變了(Eccles等，(1958)生理學(xué)雜志14311-40；Gallego等，(1987)生理學(xué)雜志(Lond)391，39-56；Kuno和Llinas，(1970)生理學(xué)雜志(Lond)210，807-821)，并且有證據(jù)表明軸突損傷后神經(jīng)元胞體和樹突的鈉通道密度改變(Dodge和Cooley，(1973)IBM J.Res.Dev.17，219-229；Titmus和Faber(1986)神經(jīng)生理學(xué)雜志55，1440-1454；Sernagor等，(1986)美國國家科學(xué)院院報(bào)83，7966-7970)。在神經(jīng)元上鈉通道不同類型的異?；旌媳磉_(dá)也可導(dǎo)致異常激活(Rizzo等，(1996)歐洲神經(jīng)病學(xué)36，3-12)，也可形成興奮性過高，感覺異?；蛱弁础?br> 最近對大鼠DRG感覺神經(jīng)元的研究已經(jīng)證明在各種損害后TTX-R和TTX-S離子流的表達(dá)圖譜和在DRG神經(jīng)元中編碼能產(chǎn)生這些離子流的通道的許多mRNA轉(zhuǎn)錄有很大改變(Rizzo等，(1995)Neurobiol.Dis.287-96；Cummins等，(1997)神經(jīng)生理學(xué)雜志17，3503-3514；Dib-Hajj等，(1996)美國國家科學(xué)院院報(bào)93，14950-14954)。例如，已顯示軸突切開術(shù)(axotomy)后在已鑒定的皮膚感覺傳入神經(jīng)元上TTX-R流緩慢失活的減弱和同時(shí)TTX-S Na+流快速失活的增強(qiáng)(Rizzo等，(1995)Neurobiol.Dis.287-96)。也有報(bào)道軸突切開術(shù)后TTX-S的丟失，緩慢再啟動離子流和TTX-R離子流以及在TTX-S上的增加，在痛覺(疼痛)神經(jīng)元上的快速再啟動離子流(Cummins和Waxman(1997)神經(jīng)生理學(xué)雜志17，3503-3514)，SNS轉(zhuǎn)錄子的下調(diào)和α-III轉(zhuǎn)錄子的同時(shí)上調(diào)(Dib-Hajj等，(1996)美國國家科學(xué)院院報(bào)93，14950-14954)。另外與軸突切開術(shù)相關(guān)的是aI和aII mRNA水平的中度升高(Waxman等，(1994)神經(jīng)生理學(xué)雜志72，466-470)。鈉通道特性的這些改變看來促成異常激活，其構(gòu)成軸突損傷后患者遭受神經(jīng)病疼痛的基礎(chǔ)。
和疼痛也有關(guān)系的炎癥(術(shù)語稱為炎性痛)，也會引起痛覺DRG神經(jīng)元上鈉流特性改變。在培養(yǎng)的小C型痛覺DRG神經(jīng)元上炎性調(diào)節(jié)物上調(diào)TTX-R離子流(Gold等，(1996)美國國家科學(xué)院院報(bào)93，1108-1112；England等，(1996)生理學(xué)雜志495，429-440)。這些調(diào)節(jié)物的快速作用提示其作用包括對現(xiàn)有TTX-R通道的翻譯后修飾?，F(xiàn)已斷定在C型DRG神經(jīng)元上炎癥也增加TTX-R Na+流并且上調(diào)SNS轉(zhuǎn)錄子(Tanaka等，(1998)Neuroreport.9，967-972)。這些數(shù)據(jù)表明Na+流特性的改變在炎癥引起的疼痛中有作用。
D.慢性痛的治療許多類藥物(抗驚厥藥如苯妥英和酰胺咪嗪(carbamazepine)；抗心律失常藥如mexitine；局麻藥如利多卡因)作用于鈉通道上。因?yàn)楦鞣N鈉通道產(chǎn)生的鈉流具有不同特性，所以預(yù)期對特異通道亞型的選擇性阻斷或激活(或其它調(diào)節(jié))會有重要治療價(jià)值。而且，在特異類型神經(jīng)元上某種同型a亞單位(PNl，SNS，NaN)的選擇性表達(dá)提供了選擇性改變其行為的方法。
DRG痛覺神經(jīng)元是PNS TTX-R Na+流的主要來源。因此，產(chǎn)生TTX-R離子流的Na+通道為操縱產(chǎn)痛覺的神經(jīng)元提供了相對特異性的靶目標(biāo)。在這些DRG神經(jīng)元中一種TTX-R通道，SNS的分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)測定出來，但是在我們的研究之前，尚未斷定這些神經(jīng)元中是否有其它TTX-R通道。如果這些通道能被鑒定，它們將是優(yōu)先在痛覺神經(jīng)元上表達(dá)并且其調(diào)節(jié)作用會減弱痛覺傳遞的理想的靶分子候選者。
發(fā)明概述本發(fā)明包括一種分離的核酸，其編碼優(yōu)先在背根神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)上表達(dá)的電壓門控Na+通道(NaN通道)。(在我們先前的美國臨時(shí)申請60/072，990中，這種NaN通道按其先前的名字稱作“NaX”)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此分離的核酸包括

圖1(SEQ ID NO1)，圖7A(SEQ ID NO4)，圖8A(SEQ ID NO6)，圖11A(SEQ ID NO41)中所示序列，該序列的等位變體或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與前述序列雜交的核酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種表達(dá)載體，其僅含有編碼優(yōu)先在背根神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)上表達(dá)的電壓門控Na+通道的分離的核酸或者還含有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)和表達(dá)控制元件。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含分離的核酸，其具有圖1(SEQ ID NO1)，圖7A(SEQ ID NO4)，圖8A(SEQ ID NO6)，圖11A(SEQ ID NO41)中所示序列，或含有該序列的等位變體或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與前述序列雜交的核酸。
本發(fā)明進(jìn)一步包括用含有分離的核酸以及適當(dāng)調(diào)節(jié)和表達(dá)控制元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述分離的核酸編碼優(yōu)先在背根神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)上表達(dá)的電壓門控Na+通道。在優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括具有圖1(SEQ ID NO1)，圖7A(SEQ ID NO4)，圖8A(SEQ ID NO6)，圖11A(SEQ ID NO41)所示序列的分離的核酸，該序列的等位變體或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與前述序列雜交的核酸。
本發(fā)明還包括優(yōu)先在背根神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)上表達(dá)的分離的電壓門控Na+通道。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該通道具有圖2(SEQ ID NO3)，圖7B(SEQID NO5)，圖8B(SEQ ID NO8)，或圖11B(SEQ ID NO42)的氨基酸序列，或者由具有圖2(SEQ ID NO3)，圖7B(SEQ ID NO5)，圖8B(SEQ ID NO8)，或圖11B(SEQ ID NO42)的核酸，該序列的等位變體或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與前述序列雜交的核酸所編碼。該通道的肽片段也包括在內(nèi)。
本發(fā)明的另一方面是鑒定能調(diào)節(jié)NaN通道活性的試劑的方法，包括將試劑與表面表達(dá)鈉通道的細(xì)胞接觸并測量去極化，或鈉流的任何相應(yīng)改變的步驟。測量步驟可用電壓鉗位測量去極化，細(xì)胞內(nèi)鈉水平或測定鈉流入而完成。
本發(fā)明的另一方面是鑒定能調(diào)節(jié)編碼NaN通道的mRNA轉(zhuǎn)錄或翻譯的試劑的方法。此方法包括將試劑與表面表達(dá)鈉通道的細(xì)胞接觸并測量鈉通道的相應(yīng)表達(dá)水平的步驟。
本發(fā)明還包括通過給予有效量的有調(diào)節(jié)作用如抑制或增強(qiáng)DRG或三叉神經(jīng)元上通過NaN通道的鈉流的試劑，在動物或人類受試者中治療疼痛，感覺異常和興奮性過高現(xiàn)象的方法。此方法可以包括給予有效量的有調(diào)節(jié)編碼NaN通道之mRNA轉(zhuǎn)錄或翻譯作用的試劑。
本發(fā)明另一方面是一種分離的核酸，其為上述核酸的反義核酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此反義核酸的長度足以調(diào)節(jié)包含NaN通道m(xù)RNA的細(xì)胞中此mRNA的表達(dá)。
本發(fā)明另一方面是一種閃爍顯像術(shù)，其通過給予特異于NaN鈉通道的標(biāo)記單克隆抗體或其它標(biāo)記配體，使動物或人類受試者中與DRG或三叉神經(jīng)元介導(dǎo)型興奮性過高相關(guān)的痛覺產(chǎn)生部位顯像或提供對該痛覺水平的測量。
本發(fā)明另一方面是鑒定能表達(dá)NaN鈉通道的組織，細(xì)胞和細(xì)胞類型的方法。此方法包括檢測細(xì)胞表面的NaN，或者其到達(dá)細(xì)胞表面的途徑，或者檢測編碼NaN的mRNA的存在。
本發(fā)明進(jìn)一步包括產(chǎn)生能表達(dá)外源NaN編碼核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，包括用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的步驟，所述載體包含具有圖1，7A，8A或11A所示序列的分離的核酸，該序列的等位變體或在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與前述序列雜交的核酸，以及適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)和表達(dá)控制元件。本發(fā)明還包括產(chǎn)生重組NaN蛋白的方法，包括在表達(dá)NaN鈉通道或蛋白的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主和回收NaN蛋白的步驟。
本發(fā)明也包括特異性針對NaN通道或其多肽片段的分離的抗體。此分離的抗體可以被標(biāo)記。
本發(fā)明的另一方面包括一種治療組合物，其含有在軸突切開的，發(fā)炎的或因其它原因而損傷的DRG神經(jīng)元或被高頻激活的正常DRG神經(jīng)元上能降低鈉流的快速再啟動的有效量試劑。本發(fā)明也包括通過給予該治療組合物而在動物或人類患者上治療急性痛或急性或慢性神經(jīng)病性或炎性痛和興奮性過高現(xiàn)象的方法。
本發(fā)明也包括篩選用于治療疼痛和興奮性過高現(xiàn)象的待選化合物的方法，即通過在軸突切開的，發(fā)炎的或其它損傷的DRG神經(jīng)元上測試化合物改變NaN通道的mRNA或蛋白的表達(dá)或活性的能力。
附圖簡述圖1顯示大鼠NaN cDNA的序列(SEQ ID NO3)。
圖2顯示大鼠NaN cDNA(SEQ ID NO3)的推斷的氨基酸序列。預(yù)測的結(jié)構(gòu)域I-IV的跨膜部分用下劃線表示。D1-SS2中與TTX-R表型有關(guān)的絲氨酸“S”用粗體字母表示。
圖3顯示預(yù)測的NaNα-亞單位二級結(jié)構(gòu)圖。
圖4表示用NaN特異引物對多種組織的提取物中的α-NaN進(jìn)行RT-PCR分析的結(jié)果。NaN在背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)中大量表達(dá)。在大腦半球和視網(wǎng)膜組織中檢測出低水平的NaN。在小腦，視神經(jīng)，脊髓，坐骨神經(jīng)，頸上神經(jīng)節(jié)，骨骼肌，心肌，腎上腺，子宮，肝和腎未能檢測到NaN信號。
圖5表示原位雜交所示α-NaN的組織分布。三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元顯示中到高強(qiáng)度的雜交信號(A)。背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元在小神經(jīng)元中顯示中到高強(qiáng)度的雜交信號(B)。在大神經(jīng)元中雜交信號變?nèi)?箭頭)。(C)感覺探針顯示在DRG神經(jīng)元中無信號。在脊髓，小腦和肝臟中未見到雜交信號(D-F)。所有組織取自成年Sprague-Dawley大鼠(標(biāo)尺＝50微米)。
圖6顯示大鼠α亞單位的結(jié)構(gòu)域I擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)測長度及它們的亞單位特異性限制性酶譜。
圖7顯示鼠NaN的(A)核苷酸序列(SEQ ID NO4)和(B)氨基酸序列(SEQID NO5)。
圖8是人NaN蛋白的部分(A)核苷酸序列(SEQ ID NO6)和人NaN蛋白的部分(B)氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
圖9顯示來自成年大鼠L4/5神經(jīng)節(jié)的DRG神經(jīng)元的培養(yǎng)物，它們與抗NaN抗體反應(yīng)，然后接受處理以備免疫熒光定位。(A-B)NaN免疫染色在DRG神經(jīng)元胞體很明顯。(C)NaN在DRG神經(jīng)元的神經(jīng)炎性向外生長物，以及細(xì)胞體中出現(xiàn)。不表達(dá)NaN蛋白的神經(jīng)元的Nomarski顯像(D)和熒光顯像(D’)。
圖10顯示Scnl 1a和相關(guān)基因在小鼠9號染色體遠(yuǎn)端的定位。(A)源自Jackson BSS回交的單倍型。黑框代表C57BL/6J等位基因，白框代表SPRET/Ei等位基因。每欄之下給出了每種單倍型的動物數(shù)目。分型不明確時(shí)缺失的數(shù)據(jù)可從其相鄰數(shù)據(jù)推斷。(B)根據(jù)(A)的數(shù)據(jù)對9號染色體遠(yuǎn)端作圖。圖中指明MGD共有圖譜中Scn5α和Scn10α的位置，以及人類直向同源基因(ortholog)的定位。數(shù)字表示該共有圖譜上的cM位置。(http//www.informatics.jax.org/bin/ccr/index)。
圖11(A)表示人類NaN基因的跨越完整開放讀碼框的cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO41)，(B)表示全長人類NaN蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO42)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及申請人發(fā)現(xiàn)的稱作NaN的新基因。NaN編碼一種以前未鑒定的蛋白，在此稱作NaN，它屬于電壓門控鈉通道蛋白家族a亞單位并可產(chǎn)生TTX-R鈉流。在象神經(jīng)元和肌纖維這樣的可興奮細(xì)胞上這些通道構(gòu)成沖動產(chǎn)生和傳播的基礎(chǔ)。NaN是與其它先前已經(jīng)鑒定的通道有不同序列的新的鈉通道。NaN優(yōu)先在感覺神經(jīng)元而不是其它神經(jīng)元上表達(dá)，這使其成為在急性和/或慢性痛病理相關(guān)的診斷和/或治療中非常有用的靶點(diǎn)。
A.定義本說明書使用的一些技術(shù)術(shù)語和短語意指下列含義短語“調(diào)節(jié)”或“改變”指上調(diào)或下調(diào)特定受體，配體或離子流的水平或活性。例如試劑可以通過抑制(降低)或增強(qiáng)(升高)鈉流來調(diào)節(jié)Na+流。同樣，試劑可以調(diào)節(jié)NaN鈉通道的表達(dá)水平或已表達(dá)的NaN通道的活性。
短語“鈉流”或“Na+流”指鈉離子的跨細(xì)胞膜流動，其經(jīng)常穿過能特異性通透某種離子(這里指鈉離子)的通道(特化的蛋白分子)而流動。
短語“電壓門控(voltage gated)”意思是細(xì)胞膜在特定電壓范圍時(shí)離子通道開放。在膜去極化時(shí)電壓敏感型鈉通道開放。然后其允許Na+離子流入細(xì)胞，產(chǎn)生進(jìn)一步去極化。這允許細(xì)胞產(chǎn)生電沖動(也稱作動作電位)。
短語“快速再啟動”意思是離子流從失活狀態(tài)再啟動的速度比在電壓門控鈉通道家族的眾多其它成員上更快。
短語“TTX-R”和“TTX-S”意思分別是指穿過細(xì)胞膜的離子流對濃度約100nM的河豚毒素(某些生物產(chǎn)生的一種神經(jīng)毒素)抵抗或敏感。
短語“外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)”指神經(jīng)系統(tǒng)中在腦和脊髓以外的部分，即脊髓根部及其相關(guān)神經(jīng)節(jié)如背根神經(jīng)節(jié)(DRG)和三叉神經(jīng)節(jié)，以及外周神經(jīng)。
短語“抑制Na+流流動”意思是相對于未暴露給所述試劑的對照細(xì)胞該試劑降低了所述離子流流動。優(yōu)選的抑制劑會選擇性抑制所述離子流流動，而不影響其它鈉通道的離子流流動；或者它抑制目的通道的鈉流程度遠(yuǎn)大于其它鈉通道。
短語“增強(qiáng)Na+流流動”意思是相對于未暴露給該試劑的對照細(xì)胞，該試劑降低了所述離子流流動。優(yōu)選的制劑會選擇性增強(qiáng)所述離子流流動，而不影響其它鈉通道的離子流流動；或者它增強(qiáng)目的通道的Na+流程度遠(yuǎn)大于其它鈉通道。
短語“特異性雜交”指核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)或中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼NaN鈉通道的核酸，如SEQ ID NO1，4，6，或41的DNA序列雜交。
短語“分離的核酸”指已經(jīng)從編碼其它多肽的雜質(zhì)核酸中分離出或基本純化出的核酸?！昂怂帷敝杆行问降腄NA和RNA，包括cDNA分子和反義RNA分子。
短語“RT-PCR”指用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄(RT)RNA，隨后用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增特定cDNA模板的過程；PCR需要通用引物或基因特異性引物以及耐熱的DNA聚合酶，例如，Taq DNA聚合酶。
短語“優(yōu)先表達(dá)”意思是電壓門控Na+通道在指定組織中的表達(dá)量比在其它組織中的高，且這種差異是可檢測的。例如，發(fā)現(xiàn)在背根神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)優(yōu)先表達(dá)的電壓門控Na+通道比其它組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)量大，并可檢測到這種差異。電壓門控Na+通道的數(shù)目可以用任何已知手段檢測，包括檢測特異RNA水平和用特異抗體檢測通道蛋白。
B.NaN鈉通道的定性本發(fā)明涉及以前未鑒定的，電壓門控鈉通道a亞單位(NaN)，預(yù)測是TTX-R，為電壓門控型，并優(yōu)先在支配軀體的感覺神經(jīng)元(背根神經(jīng)節(jié)或DRG)上和面部(三叉神經(jīng)節(jié))上表達(dá)。預(yù)測的開放讀碼框架(ORF)即NaN蛋白分子的編碼序列部分，已經(jīng)用圖2(SEQ ID NO3)，圖7B(SEQ ID NO5)，圖8B(SEQ ID NO8)或圖11B(SEQ ID NO42)代表的源自不同種屬(大鼠，小鼠，人類)的假定氨基酸序列確定。
電壓門控鈉通道的所有有關(guān)的明顯標(biāo)志序列存在于NaN的預(yù)測位置，說明NaN屬于鈉通道家族。但是NaN不同于以往鑒定的所有其它鈉通道，與它們中每一種的序列同一性低于53％。NaN有別于SNS，這是直至我們的發(fā)明時(shí)，在PNS唯一已經(jīng)鑒定的其它TTX-R鈉通道亞單位。我們在未使用以SNS為基礎(chǔ)或?qū)NS特異的引物或探針的情況下鑒定并克隆了NaN。而且，NaN和SNS在它們預(yù)測的開放讀碼框架(ORF)中僅有47％相似，類似于NaN與所有亞家族1成員的有限相似性。
與現(xiàn)有a亞單位的低序列相似性清楚證明NaN是新基因，而不僅是現(xiàn)有通道的變體。相對于其它電壓門控通道的序列變化提示NaN可能是新的且以前未鑒定過的，與SNS相比具有不同特性的第三類TTX-R通道原型。存在于痛覺DRG和三叉神經(jīng)元上的NaN和SNS可以以不同方式對藥理學(xué)干預(yù)產(chǎn)生應(yīng)答。NaN在感覺性DRG神經(jīng)元和三叉神經(jīng)元上的優(yōu)先表達(dá)為選擇性修飾這些神經(jīng)細(xì)胞的行為而不影響腦和脊髓中其它神經(jīng)細(xì)胞提供了靶點(diǎn)。NaN通道特性的進(jìn)一步闡明對更全面理解設(shè)計(jì)成調(diào)節(jié)“TTX-R”離子流功能的藥物的效應(yīng)將是非常重要的，這里的“TTX-R”離子流是有DRG痛覺神經(jīng)元的特征并且導(dǎo)致痛覺信息傳遞，以及對神經(jīng)損傷后和其它疼痛狀態(tài)時(shí)激活模式的異常。
C.NaN核酸本發(fā)明的核酸分子包括圖1，7A，8A和11A所示核苷酸序列以及編碼圖2，7B，8B和11B的氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明要求權(quán)利的核酸也包括與含有圖1，7A，8A和11A所示核苷酸序列或編碼圖2，7B，8B和11B中氨基酸序列的核苷酸序列的核酸特異性雜交的核酸。在高度或中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包括所述序列的核酸特異性雜交的核酸仍穩(wěn)定結(jié)合于該核酸上。高度嚴(yán)謹(jǐn)和中度嚴(yán)謹(jǐn)條件是指那些普通定義的和可達(dá)到的，例如由以下定義的Sambrook等，(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港出版社或者Ausubel等，(1995)分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，Greene出版。嚴(yán)謹(jǐn)度的精確水平并不重要，重要的是應(yīng)選擇在特異性雜交發(fā)生時(shí)能提供清晰的可檢測信號的條件。
雜交是在眾多變量中序列同一性(同源性)，序列的G+C含量，緩沖鹽含量，序列長度和解鏈溫度(T[m])的功能(見Maniatis等，(1982)分子克隆，冷泉港出版社)。在相似序列長度，緩沖鹽濃度和溫度時(shí)，雜交技術(shù)可提供評價(jià)序列同一性(同源性)的有效變量。例如，當(dāng)至少有90％同源性時(shí)，雜交通常在68℃的從20×SSC稀釋成6×SSC的緩沖液中進(jìn)行(見Sambrook等，(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港出版社)。用于最終Southern印跡洗滌的緩沖鹽可以用低濃度，例如，0.1×SSC和較高溫度如68℃，而且兩序列將形成雜合雙鏈(雜交)。將上述雜交和洗滌條件一起使用被定義為高度嚴(yán)謹(jǐn)條件，當(dāng)兩序列有至少約80％同源性時(shí)使用中度嚴(yán)謹(jǐn)條件。即，用溫度約50-55℃的6×SSC進(jìn)行雜交。最后洗滌的鹽濃度約為1-3×SSC，溫度約為60-68℃。這樣的雜交和洗滌條件定義為中度嚴(yán)謹(jǐn)條件。
特別是，特異性雜交發(fā)生在兩種核酸分子間存在高度互補(bǔ)性的條件下。通過特異性雜交，互補(bǔ)性一般至少約70％，75％，80％，85％，優(yōu)選約90-100％，或最優(yōu)選約95-100％。當(dāng)涉及到SEQ ID NO41和42的人類NaN序列時(shí)，優(yōu)選的同源序列一般編碼與SEQ ID NO42具有至少約81％氨基酸序列相似性或至少約75％或76％序列同一性的NaN蛋白。更優(yōu)選人類NaN序列第670位含有帶正電的氨基酸，優(yōu)選精氨酸。
本文中，同源性或同一性用適于序列相似性搜索的blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx程序中的算法(Karlin等，(1990)美國國家科學(xué)院院報(bào)87，2264-2268和Altschul，(1993)J.Mol.Evol.36，290-300，在此將兩者引入作參考)經(jīng)BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析確定。BLAST程序使用的方法是首先考慮目標(biāo)序列與數(shù)據(jù)庫序列的相似片段，然后評價(jià)所鑒定的所有配對的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最后總結(jié)出符合預(yù)定顯著性閾值的配對。對序列數(shù)據(jù)庫的相似性搜索中基本問題的討論見Altschul等，Nat.Genet.(1994)6，119-129，其引入作為參考。柱形圖(histogram)，說明(descriptions)，序列對比(alignments)，預(yù)期值(expect)(即，能報(bào)告與數(shù)據(jù)庫序列匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性閾值)，閾值(cutoff)，矩陣(matrix)和篩選(filter)的搜索參數(shù)均使用默認(rèn)設(shè)置。lastp，blastx，tblastn和tblastx使用的默認(rèn)評分矩陣是BLOSUM62矩陣(Henikoff等，(1992)美國國家科學(xué)院院報(bào)89，10915-10919，在此引入以作參考)。對于blastn，用M(即一對匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分)對N(即不匹配殘基的罰分)的比率設(shè)置評分矩陣，其中M和N的默認(rèn)值分別是5和-4。
本發(fā)明的核酸可以按照本發(fā)明的許多方式使用。例如，它們可被用作核酸探針去篩選其它c(diǎn)DNA和基因組DNA文庫以便通過雜交選出編碼同源NaN序列的其它DNA序列。所述核酸探針可以是用放射性核苷酸或用非放射性方法(例如生物素)標(biāo)記的RNA或DNA。篩選可在各種嚴(yán)謹(jǐn)度(通過調(diào)整雜交Tm，通常是將離子強(qiáng)度、溫度和/或甲酰胺的有無進(jìn)行組合)下進(jìn)行以分離近親或遠(yuǎn)親同源物。核酸也可以用來產(chǎn)生引物以便用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增cDNA或基因組DNA。本發(fā)明的核酸序列也可用來鑒定基因組中的鄰近序列，例如，NaN的側(cè)翼序列和調(diào)節(jié)元件。核酸也可用來產(chǎn)生能調(diào)節(jié)NaN基因表達(dá)水平的反義引物或構(gòu)建體。氨基酸序列可用來設(shè)計(jì)和產(chǎn)生對NaN特異的抗體，此抗體可用來定位特定細(xì)胞上的NaN和調(diào)節(jié)細(xì)胞表面表達(dá)的NaN通道的功能。
本發(fā)明的核酸還包括重組制備的NaN序列變體。例如，可制備具有本文公開的開放讀碼框的融合蛋白，或其功能片段，以及任何可獲得的融合蛋白。也可以制備編碼NaN嵌合蛋白的核酸分子，如含有分別來自不同物種的結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白。這種嵌合蛋白包括但不局限于含有小鼠或大鼠結(jié)構(gòu)域的人類NaN嵌合體，或含有人類結(jié)構(gòu)域的小鼠或大鼠嵌合體。優(yōu)選的嵌合體包括帶有圍繞在與人NaN第670位氨基酸相當(dāng)?shù)臍埢車拇笫蠡蛐∈蠼Y(jié)構(gòu)域的人類NaN。
D.載體和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞本發(fā)明也包括重組載體，其含有編碼NaN鈉通道的核酸并能在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制和指導(dǎo)所述核酸表達(dá)。例如，用如T4 DNA連接酶等酶將本發(fā)明DNA插入載體可按任何傳統(tǒng)的方式進(jìn)行。當(dāng)DNA和目的載體都用相同的限制性內(nèi)切酶切割時(shí)此插入容易完成，因?yàn)檫@樣產(chǎn)生了互補(bǔ)的DNA末端。如果此步未能完成，就必須修飾回復(fù)消化單鏈DNA所產(chǎn)生的切割末端以形成鈍性末端，或者通過用適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶補(bǔ)齊該單鏈末端產(chǎn)生相同的結(jié)果。此時(shí)，可進(jìn)行平端連接。或者，可通過在DNA末端連接核苷酸序列(接頭)產(chǎn)生想要的任何位點(diǎn)。這樣的接頭可以包含編碼限制性位點(diǎn)識別序列的特異寡核苷酸序列。
可以使用任何可得到的載體和合適的相容性宿主細(xì)胞(Sambrook等，(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港出版社；Ausubel等，(1995)分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，Greene出版)。市售載體，如New England Biolabs，Promega，Stratagene或其它市售載體均包括在內(nèi)。
用本發(fā)明的rDNA(重組DNA)分子轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞宿主可通過熟知方法完成，它們通常取決于所用載體的類型和宿主系統(tǒng)?？蓪NA注射入蛙卵母細(xì)胞并使通道表達(dá)，但一般情況下，優(yōu)選在哺乳動物細(xì)胞系(例如HEK293和CHO細(xì)胞)中表達(dá)。關(guān)于原核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，常使用電穿孔和鹽處理方法(見，例如，Cohen等，(1972)美國國家科學(xué)院院報(bào)69，2110-2114；和Maneatis等，(1982)分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港出版社)。關(guān)于用含rDNA的載體轉(zhuǎn)化脊椎動物細(xì)胞，一般使用電穿孔，陽離子脂質(zhì)體或鹽處理方法(Graham等，(1973)病毒學(xué)52，456-467；Wigler等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1979)76，1373-1376)。
成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即包含本發(fā)明rDNA分子的細(xì)胞，可用熟知的技術(shù)鑒定。例如，可將導(dǎo)入本發(fā)明rDNA后產(chǎn)生的細(xì)胞克隆以便產(chǎn)生單菌落。收獲這些菌落的細(xì)胞，裂解并且用傳統(tǒng)方法(Southern，(1975)分子生物學(xué)雜志98，503-517)檢測它們的DNA含量以確定rDNA的存在，或者用免疫學(xué)方法分析這些細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白。如果在重組DNA的構(gòu)建中使用了諸如綠色熒光蛋白等標(biāo)記，也可通過細(xì)胞分類辨別這些分子的熒光，從而體內(nèi)檢測轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
在重組通道的短暫表達(dá)中，用于測量Na+流或細(xì)胞內(nèi)Na+水平的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，通常使用鈣-磷酸鹽沉淀技術(shù)將構(gòu)建體與熒光報(bào)道質(zhì)粒(如pGreenLantern-1，Life Technologies)共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞如HEK293細(xì)胞中而制備(Ukomadu等，(1992)神經(jīng)元8，663-676)。HEK293細(xì)胞一般生長于添加了10％胎牛血清(Life Technologies)的高葡萄糖DMEM(Life Technologies)上。48小時(shí)后，挑選帶綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行記錄(Dib-Hajj等，(1997)FEBSLett.416，11-14)。
為制備連續(xù)表達(dá)重組通道的細(xì)胞系，將NaN構(gòu)建體克隆到哺乳動物細(xì)胞中帶有選擇標(biāo)記的其它載體上。用鈣磷酸鹽沉淀技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(Ukomadu等，(1992)神經(jīng)元8，663-676)。將人胚腎(HEK-293)，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，它們的衍生物或其它合適的細(xì)胞系在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件下于加有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)。將鈣磷酸鹽-DNA混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中并放置15-20小時(shí)，之后將細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基洗滌。48小時(shí)后，加入抗生素(G418)，從而選出已獲得新霉素抗性的細(xì)胞。在G418中維持2-3周后，用無菌的10ml吸管收獲10-20個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞菌落。這些菌落再培養(yǎng)4-7天，吹散并隨后使用全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)和RT-PCR檢測通道表達(dá)。
E.測量鈉流的方法使用膜片鉗位(clamp)方法測定鈉流(Hamill等，(1981)Pflugers Arch.391，85-100)，如Rizzo等，(1994)神經(jīng)生理學(xué)雜志72，2796-2815和Dib-Hajj等，(1997)FEBS Lett.416，11-14所述。這些記錄要在MacIntosh Quadra 950或相似的計(jì)算機(jī)上使用例如Pulse(v 7.52，HEKA German)等程序才能獲得。用Sutter P-87拉制器或相似儀器將毛細(xì)玻璃管制成常規(guī)玻璃燒邊的電極(0.8-1.5MW)。在最嚴(yán)密的分析中，通常只考慮分析下列細(xì)胞如果初始絕緣(seal)電阻小于5Gohm，有高漏電電流(-80mV的保持電流小于0.1nA)，膜起泡，且接通電阻(access resistance)小于5Mohm。通常通過實(shí)驗(yàn)監(jiān)測接通電阻而且如果電阻發(fā)生改變則數(shù)據(jù)不可用。用一系列電阻補(bǔ)償降低電壓誤差并且用計(jì)算機(jī)控制的放大器回路或其它相似方法取消電容假象。為對比激活和失活作用的電壓依賴性，使用補(bǔ)償后最大電壓誤差在±10mV的細(xì)胞。線性漏電減法通常用于電壓鉗位記錄。通常以5KHz過濾膜電流并以20KHz采樣。電極液(pipette solution)包含標(biāo)準(zhǔn)溶液例如140mM CsF，2mMMgCl2，1mM EGTA，和10mM Na-HEPES(pH7.3)。標(biāo)準(zhǔn)浴液通常是140nMNaCl，3mM KCl，2mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM HEPES，和10mM葡萄糖(pH7.3)。
在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或DRG神經(jīng)元上用諸如細(xì)胞內(nèi)膜片鉗位記錄等方法進(jìn)行電壓鉗位研究，可提供鈉流強(qiáng)度的定量測定(并因此提供細(xì)胞中的鈉通道數(shù))，以及通道的生理學(xué)特征。測量通過諸如鈉通道等離子通道的離子流的這些技術(shù)，參見Rizzo等，(1995)Neurobiol Dis.2，87-96?；蛘邔︹c通道功能的阻斷或增強(qiáng)可以用鈉敏感染料或同位素標(biāo)記的鈉經(jīng)光學(xué)顯像檢測。Rose等，(1997)神經(jīng)生理學(xué)雜志78，3249-3258和(Kimelberg和Waltz，(1988)神經(jīng)元的微環(huán)境(Boulton等主編)Humana發(fā)行)描述的這些方法可測量鈉通道開放時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度的增加。
F.細(xì)胞內(nèi)鈉[Na+]i的測定各種試劑對表達(dá)Na+的細(xì)胞的影響可以用SBFI或其它相似的離子敏感型染料經(jīng)[Na+]i比率度量顯像測定。在此方法中，如Sontheimer等，(1994)神經(jīng)科學(xué)雜志14，2464-2475中所述，用Na+指試劑如SBFI(鈉結(jié)合型苯并呋喃異鄰苯二甲酸酯(Harootunian等，(1989)生物學(xué)和化學(xué)雜志264，19458-19467))或相似染料測定胞質(zhì)內(nèi)游離Na+。首先在細(xì)胞中添加該染料的膜通透型乙酰氧甲基酯形式(溶于二甲亞砜中，貯存濃度為10mM)。用比率度量顯像裝置(例如，買自Georgia Instruments)在顯微鏡下進(jìn)行記錄。使用合適波長(例如，340385nm)的激發(fā)光。激發(fā)光通過二色性反光鏡(400nm)射向細(xì)胞，收集450nm以上的發(fā)射光。熒光信號用例如圖像增強(qiáng)儀(GenIISyS)放大，并用與幀接收器相連的CCD照相機(jī)或類似裝置收集。為計(jì)算熒光衰減，使用熒光比率340385評定胞質(zhì)的游離Na+。
為了校準(zhǔn)SBFI的熒光，在細(xì)胞中灌注含有已知鈉濃度(通常0和30mM，或0，30，和50mM[Na+]的校準(zhǔn)溶液，并且在每次實(shí)驗(yàn)后灌注諸如短桿菌肽和莫能菌素(見上面)等離子載體(ionophone)。如Rose和Ransom，(1996)生理學(xué)雜志(Lond)491，291-305所報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)SBFI的345/390nm熒光比率單純隨著[Na+]i變化。實(shí)驗(yàn)一般在多個(gè)不同的蓋玻片(一般至少4個(gè))上重復(fù)，以便對對照細(xì)胞和暴露于各種濃度的可能阻斷、抑制或增加Na+的試劑的細(xì)胞中的胞內(nèi)鈉進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性測量。
G.通過測量22Na或86Rb而測量Na+流入的方法22Na是γ發(fā)射者，可用于測量Na+流(Kimelberg和Waltz，(1988)神經(jīng)元的微環(huán)境(Boulton等主編)Humana發(fā)行)，而86Rb+可用來測定Na+/K+-ATP酶的活性(Sontheimer等，(1994)神經(jīng)科學(xué)雜志14，2464-2475)。86Rb+離子被Na+/K+-ATP酶樣K+離子吸收，但具有比42K+更長半衰期的優(yōu)勢(Kimelberg和Mayhew(1975)生物學(xué)和化學(xué)雜志250，100-104)。因此，對哇巴因敏感型86Rb+單向攝取的測定提供了定量測定Na+/K+-ATP酶活性(神經(jīng)細(xì)胞電激活的又一指示劑)的方法。將表達(dá)NaN的細(xì)胞用放射性22Na+保溫后，用液閃計(jì)數(shù)儀或相似方法測定放射性同位素的細(xì)胞內(nèi)含量，并用諸如二辛可寧酸蛋白測定法(Smith等，(1985)Anal Biochem 150，76-85)經(jīng)Goldschmidt和Kimelberg(1989)Anal.Biochem.177，41-45針對培養(yǎng)細(xì)胞而改良后的方法測定細(xì)胞蛋白。在存在和缺乏可能阻斷、抑制、或增強(qiáng)NaN的試劑的情況下，測定22Na流和86Rb+流。這允許測定這些試劑對NaN的作用。
H.對能調(diào)節(jié)NaN介導(dǎo)型離子流的試劑進(jìn)行鑒定的方法可以使用幾種方法鑒定能夠調(diào)節(jié)(即阻斷或放大)通過NaN鈉通道的Na+流的試劑。通常為鑒定這些試劑，使用能表達(dá)NaN鈉通道的培養(yǎng)細(xì)胞系模型，并且使用一種或多種傳統(tǒng)測定法測定Na+流。這些傳統(tǒng)測定法包括，例如，膜片鉗位法，[Na+]i比率度量顯像以及上述22Na和86Rb的使用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為評價(jià)待選化合物調(diào)節(jié)Na+流的活性，將試劑與合適的表達(dá)NaN的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞接觸?；旌匣虮剡m當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，測定Na+流以測定該試劑是否抑制或增強(qiáng)Na+流流動。
抑制或增強(qiáng)Na+流的試劑因此被鑒定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可輕易使用多種本領(lǐng)域已知技術(shù)測定特定試劑是否能調(diào)節(jié)Na+流流動。
由于Na+優(yōu)先在痛覺信號細(xì)胞上表達(dá)，也可通過測定用這些試劑處理過的實(shí)驗(yàn)動物對急性，炎性或慢性痛的反應(yīng)而設(shè)計(jì)能阻斷，抑制，或增強(qiáng)Na+通道功能的試劑。在本發(fā)明這方面的一個(gè)實(shí)施方案中，用試劑例如阻斷或抑制(或者認(rèn)為是阻斷或抑制)NaN的試劑處理如大鼠等實(shí)驗(yàn)動物。然后用諸如甩尾實(shí)驗(yàn)和縮爪反射等實(shí)驗(yàn)測定對各種痛刺激的反應(yīng)，并與未處理的對照組比較。這些方法見Dubner，(1994)Text book of Pain(Wall & Melzack，主編)Churchill Livingstone Publishers。在本發(fā)明此方面的另一實(shí)施方案中，對諸如大鼠的實(shí)驗(yàn)動物局部注射產(chǎn)生痛覺的致炎性試劑例如福爾馬林(Dubuisson & Dennis(1977)疼痛4，161-74)，弗氏佐劑(Iadarola等，(1988)疼痛35，313-326)或者carageenan，或者使之接受能產(chǎn)生持續(xù)疼痛的神經(jīng)收縮(Bennett & Xie，(1988)疼痛33，87-107；Kim & Chung(1992)疼痛50，355-363)或者神經(jīng)橫切(Seltzer等，(1990)疼痛43，205-218)。然后通過如測定從溫或熱刺激縮爪的潛伏期(Dubner，(1994)Textbook of Pain(Wall &Melzack，主編)Churchill Livingstone Publishers)而測定對多種正常和痛性刺激的反應(yīng)，以便與對照動物以及用據(jù)認(rèn)為能改變NaN的試劑處理的動物進(jìn)行比較。
優(yōu)選的NaN抑制劑和增強(qiáng)劑對NaN Na+通道有選擇性。它們可以是完全特異性的(如河豚毒素，TTX，其抑制鈉通道但是不結(jié)合或直接影響其它通道或受體)，或者相對特異性的(例如利多卡因，其結(jié)合并阻斷幾種類型的離子通道，但是對鈉通道有所偏重)。對于有功效的抑制劑或增強(qiáng)劑不要求完全特異性。其對鈉通道與對其它通道和受體的作用比通?？蓻Q定它對除靶目標(biāo)以外的若干通道的作用，并且是有效的(Stys等，(1992)神經(jīng)生理學(xué)雜志67，236-240)。NaN調(diào)節(jié)劑可以與能調(diào)節(jié)初級感覺神經(jīng)元上表達(dá)的其它通道的試劑聯(lián)合給藥或共給藥，這些試劑包括但不限于PN1/hNE和SNS/PN3(Waxman(1999)疼痛增刊6S133-140)。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)試劑可以是例如，肽，小分子，天然毒素和其它毒素和維生素衍生物，也可以是碳水化合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可輕易認(rèn)識到對于本發(fā)明的調(diào)節(jié)試劑的天然結(jié)構(gòu)沒有限制。分子文庫的篩選可以發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)NaN或者調(diào)節(jié)通過它的離子流流動的試劑。類似地，可以篩選天然產(chǎn)生的毒素(例如由某些魚類，兩棲類和無脊椎動物產(chǎn)生的那些)?？梢酝ㄟ^將轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或其它表達(dá)鈉通道的細(xì)胞暴露給待測試劑并且測定Na+流的任何相應(yīng)改變來常規(guī)鑒定這些試劑。
I.重組蛋白的表達(dá)，合成和純化重組NaN蛋白可以在例如，大腸桿菌細(xì)胞株HB101，DH5a或蛋白酶缺陷株如CAG-456中表達(dá)并且用傳統(tǒng)技術(shù)純化。
本發(fā)明的肽試劑可以用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)固相(或溶液相)肽合成方法制備。此外，可以使用市售寡核苷酸合成儀合成和用標(biāo)準(zhǔn)重組產(chǎn)生系統(tǒng)重組產(chǎn)生編碼這些肽的DNA。如果包括非基因編碼的氨基酸時(shí)使用固相肽合成法進(jìn)行產(chǎn)生是必需的。
J.抗體和免疫檢測本發(fā)明的另一類試劑是能與Na+通道發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。這些抗體可以阻斷，抑制，或增強(qiáng)通過該通道的Na+流流動。可以通過用肽免疫合適的哺乳動物獲得抗體，這些肽包含抗原性區(qū)域，NaN的那些部分，特別(但并非必需)是那些在細(xì)胞表面暴露于細(xì)胞外的部分。這樣的免疫學(xué)試劑也可用于競爭性結(jié)合研究以鑒定第二代抑制劑?？贵w用傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行了適當(dāng)標(biāo)記后還可用于顯像研究。
K.轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生包含突變、基因敲除或修飾的NaN基因的轉(zhuǎn)基因動物也包括在本發(fā)明中。NaN和SNS/PN3基因都被修飾，破壞或有某種形式修改的轉(zhuǎn)基因動物也包括在本發(fā)明中。轉(zhuǎn)基因動物是已經(jīng)用實(shí)驗(yàn)將重組，外源或克隆的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)體內(nèi)的遺傳修飾型動物。這些遺傳物質(zhì)經(jīng)常被稱作“轉(zhuǎn)基因”?？梢詫⑥D(zhuǎn)基因的核酸序列(本例中NaN的一種形式)整合到基因組中正常情況下未發(fā)現(xiàn)特定核酸序列的位點(diǎn)或者整合到轉(zhuǎn)基因的正常位點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因可由相對于靶動物相同或不同物種的基因組的核酸序列組成。
術(shù)語“生殖細(xì)胞系轉(zhuǎn)基因動物”指已將遺傳改變或遺傳信息導(dǎo)入生殖細(xì)胞，從而賦予轉(zhuǎn)基因動物把遺傳信息傳給后代的能力的轉(zhuǎn)基因動物。如果這類后代確實(shí)具有所述改變或遺傳信息的部分或全部，那么它們也是轉(zhuǎn)基因動物。
改變或遺傳信息可以是相對于受體所屬動物物種為外源的，僅針對具體受體個(gè)體為外源的，或可以是受體已經(jīng)具有的遺傳信息。在最后一種情況中，所述改變或?qū)氲幕虻谋磉_(dá)可以不同于天然基因。
轉(zhuǎn)基因動物可以通過多種不同方法產(chǎn)生，方法包括轉(zhuǎn)染，電穿孔，顯微注射，基因靶向至胚胎干細(xì)胞中以及重組病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(參見例如，美國專利4,736,866；美國專利5,602,307；Mullins等，(1993)高血壓22，630-633；Brenin等，(1997)外科腫瘤學(xué)6，99-110；Tuan(1997)重組基因表達(dá)方案，Humana出版社)。
已經(jīng)產(chǎn)生了多種的重組或轉(zhuǎn)基因小鼠，包括表達(dá)激活的癌基因序列的那些(美國專利4,736,866號)；表達(dá)猴SV 40 T抗原的那些(美國專利5,728,915)；缺乏干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)的表達(dá)的那些(美國專利5,731,490)；顯示多巴胺能障礙的那些(美國專利5,723,719)；表達(dá)至少一種參與血壓控制的人類基因的那些(美國專利5,731,489)；顯示出與天然Alzheimer’s病的癥狀更相似的那些(美國專利5,720,936號)；介導(dǎo)細(xì)胞粘附的能力降低的那些(美國專利5,602,307號)；具有牛生長激素基因的那些(Clutter等，(1996)遺傳學(xué)143，1753-1760)；或者能產(chǎn)生完整人類抗體應(yīng)答的那些(McCarthy，(1997)柳葉刀349，405)。
大多數(shù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)選擇小鼠和大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，單在某些情況下優(yōu)選或者甚至必須使用另一物種的動物。轉(zhuǎn)基因方法已成功用于多種非鼠類動物，包括綿羊，山羊，豬，狗，貓，猴，黑猩猩，倉鼠，家兔，奶牛和豚鼠(參見Kim等，(1997)分子生殖和發(fā)育46，515-526；Houdebine，(1995)Reprod.Nutr.Dev.35，609-617；Peters(1994)Reprod.Fertil.Dev.6，643-645；Schnieke等，(1997)科學(xué)278，2130-2133；Amoah，(1997)J.Animal Sci.75，578-585)。
向重組感受態(tài)哺乳細(xì)胞導(dǎo)入核酸片段的方法可以是利于共轉(zhuǎn)化多種核酸分子的任何方法。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的詳細(xì)步驟對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是容易得到的，包括美國專利5,489,743和美國專利5,602,307。
下面列舉的具體實(shí)施例僅說明而不是想限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1大鼠NaN編碼序列的克隆和鑒定
a.RNA制備從成年Sprague-Dawley大鼠上解剖出腰段(L4-L5)的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)并且用異硫氰酸胍-酸性酚法一步提取細(xì)胞總RNA(Chomczynski，(1987)Anal.Biochem.162，156-159)。為用于分析，每次從幾只動物上解剖DRG組織。在1％瓊脂糖凝膠上電泳評定RNA的質(zhì)量和相對產(chǎn)量。由于原材料有限(四個(gè)DRG重量平均10mg)，未打算定量RNA的產(chǎn)量。用PolyA Tract分離系統(tǒng)按照產(chǎn)生商的建議(Promega)從約300mg總DRG RNA(28只動物)中純化PolyA+RNA。將純化的RNA取一半不經(jīng)進(jìn)一步修飾而用于Marathon cDNA的制備(見下述)。
b.逆轉(zhuǎn)錄為分析使用，第一鏈cDNA基本按照前面所述的方法(Dib-Hajj等，(1996)FEBS Lett.384，78-82)合成。簡言之，總RNA的逆轉(zhuǎn)錄在100個(gè)單位的RNA酶抑制劑(Boehringer Mannheim)存在的情況下用1mM隨機(jī)六聚物(Bochringer Mannheim)和500單位SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies)在終體積25ml中進(jìn)行。反應(yīng)緩沖液成分為50mM Tris-HCl(pH8.3)，75mMKCl，3mM MgCl2，10mM DTT和125mM dNTP。允許反應(yīng)發(fā)生在37℃90分鐘，42℃30分鐘，然后通過加熱至65℃10分鐘而終止。
c.第一鏈cDNA合成Marathon cDNA合成方案按照如下面概述的產(chǎn)生商說明進(jìn)行(所有緩沖液和酶購自產(chǎn)生商(Clontech))在0.5ml無菌微離心管中加入如下試劑1mg(1-4ml)PolyA+RNA樣品，1ml cDNA合成引物(10mM)和無菌水至終體積5ml?；旌蟽?nèi)容物并在微量離心機(jī)中短暫旋轉(zhuǎn)試管。將混合物在70℃保溫2分鐘，然后立即將試管置入冰中兩分鐘。短暫接觸式離心(Touch-spin)試管以收集冷凝物。向每個(gè)反應(yīng)試管中加入如下試劑2ml 5×第一鏈緩沖液，1ml dNTP Mix(10mM)，1ml[α32P]dCTP(1mCi/ml)，1ml AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(20單位/ml)，終體積10ml。放射標(biāo)記的dCTP是任選的(用來測定cDNA的產(chǎn)量)而且如果不加則用無菌H2O代替。輕輕吹打以便混合內(nèi)容物并且接觸式離心試管，收集管底物質(zhì)。在空氣培養(yǎng)箱中將混合物在42℃保溫1小時(shí)以降低冷凝并增加第一鏈cDNA的產(chǎn)量。將試管放在冰上終止第一鏈的合成。
d.第二鏈cDNA的合成向上述反應(yīng)試管中加入下列成分48.4ml無菌水，16ml 5×第二鏈緩沖液，1.6ml dNTP Mix(10mM)，4ml 20×第二鏈酶混合物，總體積80ml。輕輕吹打以徹底混合內(nèi)容物并且在微量離心機(jī)上短暫離心該試管。將混合物在16℃保溫1.5小時(shí)然后加入2ml(10單位)T4 DNA聚合酶，輕輕吹打以徹底混合并將混合物在16℃保溫45分鐘。加入4ml EDTA/糖原混合物以終止第二鏈合成。用等體積的緩沖飽和的(pH7.5)酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取混合物。經(jīng)渦旋充分混合內(nèi)容物并在微量離心機(jī)中以最大速度(高達(dá)14,000rpm或13000×g)，4℃離心10分鐘以便分層。將上層水相小心轉(zhuǎn)移置一干凈的0.5ml試管中。用100ml氯仿∶異戊醇(24∶1)提取水相，渦旋，同前離心分層。收集上層相到干凈的0.5ml微量離心管中。加入一半體積的4M醋酸銨和2.5倍體積的室溫的95％乙醇將雙鏈cDNA進(jìn)行乙醇沉淀。經(jīng)渦旋而充分混合并立即在微量離心機(jī)中以最高速室溫離心20分鐘。小心移去上清并用300ml 80％乙醇洗滌沉淀。同前離心10分鐘并小心棄去上清。使沉淀風(fēng)干最多10分鐘并用10ml無菌H2O溶解cDNA并貯存于-20℃。用2ml cDNA在有合適的DNA大小標(biāo)志物(例如，1kbp序列梯，Gibco-BRL)的1.2％瓊脂糖/EtBr凝膠上電泳以分析cDNA的產(chǎn)量和大小。如果EtBr染色未顯示信號并且反應(yīng)中包括[α32P]dCTP，在真空干膠機(jī)上將該瓊脂糖凝膠干燥并于-70℃暴光于x線膠片過夜。
e.銜接子連接按照以下順序，于室溫將所述試劑加入0.5ml微量離心試管中5ml雙鏈cDNA，2ml Marathon cDNA銜接子(10mM)，2ml 5×DNA連接緩沖液，1ml T4 DNA連接酶(1單位/ml)，最終體積10ml。輕輕吹打以徹底混合內(nèi)容物并且在微量離心機(jī)上短暫離心。保溫條件是16℃過夜；或室溫(19-23℃)3至4小時(shí)。在70℃加熱混合物5分鐘以滅活連接酶。用250ml Tricine-EDTA緩沖液稀釋1ml此反應(yīng)混合物，以備RACE操作。于-20℃貯存未稀釋的銜接子連接的cDNA以備后用。
f.PCRNaN的最初發(fā)現(xiàn)中，我們使用根據(jù)a亞單位I，II和III的結(jié)構(gòu)域1(D1)中高度保守序列設(shè)計(jì)的通用引物并且隨后加入更多引物以適應(yīng)新發(fā)現(xiàn)的a亞單位。因此，使用能識別所有已知Na+通道中的保守序列的通用引物。擴(kuò)增的區(qū)段中部顯示出顯著的序列和長度多態(tài)性(圖6和Gu等，(1997)神經(jīng)生理學(xué)雜志77，236-246；Fjell等，(1997)Mol.Brain Res.50，197-204)。由于密碼簡并性，設(shè)計(jì)4個(gè)正向引物(F1-F4)和3個(gè)逆向引物(R1-R3)(表1)以確保從所有可能存在于cDNA庫中的模板進(jìn)行有效引導(dǎo)；然而，這些引物中的任一個(gè)可以依靠反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性結(jié)合于多個(gè)模板。正向引物F1與亞單位aI，aIII；aNa6；aPN1；am1，arH1和aSNS/PN3配對。每個(gè)亞單位的序列針對此引物有1或2個(gè)錯(cuò)配在16位上T與C配對和在18位上A與G配對(aNa6)；在6位上C與R配對(am1)；在18位A與G配對(arH1)和在3位上T與C配對(aSNS)。正向引物F2與亞單位aII配對。正向引物F3優(yōu)選與aNa6配對，也與arH1配對且僅在16位上有一個(gè)C與T的錯(cuò)配。逆向引物R1與亞單位aI，aII，aIII，aNa6，aPN1，am1和arH1配對。此引物與4種亞單位的錯(cuò)配有在3位上G與A配對，在4位上A與G配對和在7位上T與G配對(aI)；在1位上T與C配對和在19位上A與G配對(aPN1)；在3位上G與A配對和在7位上A與G配對(am1)；在3位后多一個(gè)G，在14-15位上為GC配CT，和21位上A與T配對(arH1)。逆向引物R2與亞單位aSNS/PN3配對。
表1用于鑒定和克隆NaN的通用引物和NaN特異性引物。
除了marathon引物外，所有引物在耶魯大學(xué)病理系，分子藥學(xué)關(guān)鍵技術(shù)項(xiàng)目組(program for critical technologies in molecular medicine)合成。
使用各自小鼠非典型鈉通道m(xù)Nav2.3序列來設(shè)計(jì)正向引物F4和逆向引物R3以從aNaG，mNav2.3預(yù)測的大鼠同源物(Filipe等，(1994)生物學(xué)和化學(xué)雜志269，30125-30131)擴(kuò)增相似序列。將擴(kuò)增的序列克隆到pCR-Script載體(Stratagene)的SrfI位點(diǎn)。此片段的核苷酸序列顯示出與mNav2.3的相應(yīng)序列有88％同一性(Dib-Hajj & Waxman，未發(fā)表)。發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶XbaI在此亞單位有唯一的作用位點(diǎn)。最近，公開了假定的鈉通道，NaG樣(SCL-11Y09164)，亞單位的全長cDNA克隆的序列(Akopian等，(1997)FEBS Lett.400，183-187)。已發(fā)表的序列與我們的序列99％相同而且進(jìn)一步證實(shí)了NaGPCR產(chǎn)物的大小和限制酶多態(tài)性。
擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)測長度和亞單位特異性限制酶識別位點(diǎn)如圖6所示。所有亞單位序列基于Genbank數(shù)據(jù)庫(錄入號αIX03638；αIIX03639；αIIIY00766；αNa6L39018；αhNE-NaX82835；αm1M26643；αrH1 M27902和aSNS X92184；mNa 2.3 L36719)。隨后，用NaN特異性引物和兩種通用逆向引物R4和R5完成NaN序列3’末端到上述片段的擴(kuò)增。R4引物的序列基于緊鄰結(jié)構(gòu)域II S6片段(見圖3電壓門控鈉通道a亞單位圖示)N-端的氨基酸序列MWV/DCMEV(SEQ ID NO38)。R5引物序列基于形成結(jié)構(gòu)域III S3片段的N-端部分的氨基酸序列AWCWLDFL(SEQ ID NO43)。
擴(kuò)增一般在60ml體積中進(jìn)行，使用1ml第一鏈cDNA，每種引物0.8mM和1.75單位的擴(kuò)增長模板(Expand Long Template)DNA聚合酶的酶混合物(Boehringer Mannheim)。對比于傳統(tǒng)的和耐熱的DNA聚合酶，擴(kuò)增長模板酶混合物在不增加非特異擴(kuò)增的情況下提高了PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量(Bames，(1994)美國國家科學(xué)院院報(bào)91，2216-2220；Cheng等，(1994)美國國家科學(xué)院院報(bào)91，5695-5699)。PCR反應(yīng)緩沖液包括50mM Tris-鹽酸(pH9.2)，16mM(NH4)2SO4，2.25mM MgCl2，2％(v/v)DMSO和0.1％吐溫20。如前所述(Dib-Hajj等，(1996)FEBS Lett.384，78-82)，用可編程熱循環(huán)儀(PTC-200，MJResearch)在兩個(gè)階段完成擴(kuò)增。首先，變性步驟是在94℃4分鐘，退火步驟是在60℃2分鐘和延伸步驟是在72℃90秒。第二，變性步驟是在94℃1分鐘，退火步驟是在60℃1分鐘和延伸步驟是在72℃90秒。在總共35個(gè)循環(huán)中將第二階段重復(fù)33次，并將最后一個(gè)循環(huán)中的延伸步驟延長到10分鐘。
初級RACE擴(kuò)增在終體積50ml中進(jìn)行，使用4ml稀釋的DRG marathoncDNA模板，0.2mM marathon AP-1和NaN-特異引物，3.5單位的擴(kuò)增長模板酶混合物。根據(jù)想要的產(chǎn)物將延長期調(diào)節(jié)為每800個(gè)堿基對1分鐘。分別使用引物對marathon AP-1/NaN-特異性R6和NaN-特異性F5/marathonAP-1進(jìn)行5’和3’RACE擴(kuò)增。PCR反應(yīng)緩沖液包括50mM Tris-鹽酸(pH9.2)，16mM(NH4)2SO4，3.0mM MgCl2，2％(v/v)DMSO和0.1％吐溫20。用可編程熱循環(huán)儀(PTC-200，MJ Research)在三個(gè)階段進(jìn)行擴(kuò)增。起始變性步驟92℃2分鐘，隨后是92℃變性20秒，60℃退火1分鐘，和68℃延伸的35個(gè)循環(huán)。最后，在68℃延伸5分鐘。嵌套式擴(kuò)增在與初級RACE反應(yīng)相同的條件下用2ml 1/500稀釋的初級RACE產(chǎn)物在終體積50ml中進(jìn)行。分別使用引物對AP-2/NaN-特異性R7和NaN-特異性F6/marathon AP-2進(jìn)行嵌套式5’和3’RACE擴(kuò)增。次級RACE產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠分帶分離并且用Qiaex凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化。
NaN假定結(jié)構(gòu)如圖3所示。不同亞單位之間細(xì)胞內(nèi)環(huán)的序列和長度差異很大。例外的是在結(jié)構(gòu)域III和IV之間的環(huán)。
實(shí)施例2對大鼠NaN通道的假定氨基酸序列的測定將NaN-相關(guān)克隆和次級RACE片段在耶魯大學(xué)W.M.Keck基金生物技術(shù)資源實(shí)驗(yàn)室，DNA測序組測序。用商業(yè)軟件，Lasergene(DNAStar)和GCG進(jìn)行序列分析包括確定預(yù)測的氨基酸序列。圖2顯示了NaN的假定氨基酸序列。結(jié)構(gòu)域I-IV的預(yù)測跨膜部分有下劃線。
實(shí)施例3鼠NaN序列的測定從小鼠三叉神經(jīng)節(jié)中提取總RNA，純化polyA+RNA，按照前面所述用于大鼠的方法進(jìn)行Marathon cDNA的構(gòu)建。用大鼠NaN引物進(jìn)行起始擴(kuò)增。正向引物對應(yīng)于大鼠序列的核苷酸765-787(5’CCCTGCTGCGCTCGGTGAAGAAG3’)(SEQ ID NO24)，逆向引物對應(yīng)于大鼠序列的核苷酸1156-1137(負(fù)鏈)(5’GACAAAGTAGATCCCAGAGG3’)(SEQ ID NO25)。擴(kuò)增產(chǎn)生了所需長度的片段。此片段的序列證明與大鼠NaN高度相似。使用不同的大鼠引物和基于待產(chǎn)生的小鼠新NaN序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增其它片段。最后，使用小鼠Marathon cDNA模板和小鼠NaN-特異的引物以及在MarathoncDNA合成期間導(dǎo)入的銜接子引物擴(kuò)增稍長的片段。將這些片段用引物步行(walking)測序并集中于圖7A。
象大鼠NaN一樣，小鼠NaN核苷酸序列在相對于第41位翻譯起始密碼子ATG的讀碼框外缺乏第8位的ATG(圖7A)。翻譯終止密碼子TGA在5314位。PolyA信號(AATAAA)位于5789位，一段推定的23個(gè)核苷酸的polyA尾始于5800位。該序列編碼1765個(gè)氨基酸的ORF(圖7B)，其與大鼠NaN有90％相似。編碼NaN的基因稱作Scnlla。
小鼠NaN的染色體定位通過對Scnlla的3’UTP中一段274bp的片段進(jìn)行SSCP分析來鑒定C57BL/6J和SPRET/Ei株之間的遺傳多態(tài)性。對BSS回交名單(Rowe等，(1994)哺乳類基因組5，253-274)中94個(gè)動物的遺傳分型證明Scnlla與9號染色體遠(yuǎn)端標(biāo)記連鎖(圖10)。在Scnlla與微衛(wèi)星標(biāo)記D9Mitl9之間未觀察到重組。將我們的數(shù)據(jù)與小鼠9號染色體的MGD共有圖譜對比發(fā)現(xiàn)Scnlla與另兩個(gè)TTX-R電壓門控鈉通道，Scn5a(George等，(1995)Cytogenet.Cell.Genet.68，67-70)和Scn10a(Kozak & Sangameswaran，(1996)哺乳類基因組7，787-788；Souslova等，(1997)基因組學(xué)41，201-209)緊密連鎖。
實(shí)施例4部分和全部人類NaN編碼序列的測定從移植供體獲得人類DRG組織。如前所述進(jìn)行總RNA提取和cDNA合成。
正向引物對應(yīng)于EST AA446878的序列310-294(負(fù)鏈)。該引物的序列是5’CTCAGTAGTTGGCATGC3’(SEQ ID NO26)。逆向引物對應(yīng)于ESTAA885211的序列270-247(負(fù)鏈)。該引物的序列是5’GGAAAGAAGCACGACCACACAGTC3’(SEQ ID NO27)。如前所述擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增成功并且獲得了2.1kbp的片段。此片段經(jīng)凝膠純化并送去通過引物步行法測序，如針對小鼠NaN的操作。將EST序列向兩個(gè)方向延伸；增加的序列在與亞單位其它部分的比較中顯示出與大鼠和小鼠NaN具有最高相似性。
根據(jù)對人類2.1kbp片段的兩端的測序獲得PCR正向和逆向引物，然后經(jīng)PCR獲得該序列。使用另外兩個(gè)引物覆蓋該序列的其它部分。然后在該2.1kbp片段的5’末端附近用正向引物1(上述)和人類NaN逆向引物(5’GTGCCGTAAACAT GAGACTGTCG3’)(SEQ ID NO44)向5’方向延伸。部分氨基酸序列列于圖8B。
人類NaN的部分ORF包括1241個(gè)氨基酸。使用可從National Center forBiotechnology Information獲得的高級BLAST程序發(fā)現(xiàn)此序列64％相同于大鼠NaN的相應(yīng)序列(73％相似，允許保守取代)。使用Clustal排序方法(Lasergene軟件，DNAStar)，人類NaN與小鼠和大鼠的NaN分別有68％和69％相似。小鼠和大鼠的相應(yīng)序列有88％相似。
進(jìn)一步測序發(fā)現(xiàn)了跨人類NaN基因開放讀碼框全長的cDNA序列。此擴(kuò)展序列如圖11A(SEQ ID NO41)所示。除了該部分cDNA序列(圖8A)顯示的特征外，此擴(kuò)展序列的顯著特征包括31位的翻譯起始密碼子(ATG)和5400位的翻譯終止密碼子。未觀察到可識別的polyA信號，推測位于本公開序列的3’端。推測的人類NaN蛋白的氨基酸序列列于圖11B(SEQ IDNO42)。
實(shí)施例5大鼠NaN的另一剪接變體的分離通過測序大鼠cDNA克隆的插入部位分離圖1和2中編碼全長大鼠NaN的C-端截?cái)嘈问降拇笫驨aN cDNA。NaN變體cDNA編碼缺少NaN全長中387個(gè)C-端氨基酸并向C-端延伸94個(gè)新氨基酸的NaN蛋白。新序列通過使用外顯子23中的隱蔽供體剪接位點(diǎn)和位于內(nèi)含子23中的新外顯子23’而產(chǎn)生。新的C末端氨基酸是AAGQAMRKQG DILGPNIHQFSQSSETPFLG CPQQRTCVSF VRPQRVLRVP WFPAWRTVTFLSRPRSSESS AWLGLVESSG WSGLPGESGP SSLL(SEQ ID NO28)。截?cái)嘧凅w的N端氨基酸相同于圖2中大鼠NaN全長的1-1378位氨基酸。通過把cDNA序列和各自區(qū)域的基因組序列對比可證實(shí)另一種外顯子和剪接模式。
實(shí)施例6分離其它NaN序列的方法a.從基因組DNA中分離NaN序列已經(jīng)鑒定了三種電壓門控Na+通道a亞單位的基因組結(jié)構(gòu)(George等，(1993)基因組學(xué)15，598-606；Souslova等，(1997)基因組學(xué)41，201-209；McClatchey等，(1992)人類分子遺傳學(xué)1，521-527；Wang等，(1996)基因組學(xué)34，9-16)。這些基因在它們的構(gòu)成中具有驚人的相似性并為大多數(shù)外顯子/內(nèi)含子邊界提供可預(yù)測的圖譜。根據(jù)在此公開的大鼠，小鼠和人類NaN的cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，以用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法從其它種屬擴(kuò)增NaN同源序列。
或者，通過使用標(biāo)準(zhǔn)文庫篩選方法(Sambrook等，(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南，Cold Spring Harbor發(fā)行；Ausubel等，(1995)分子生物學(xué)中的現(xiàn)代方法，Greene出版)，用NaN-特異的探針(以大鼠，小鼠，或更優(yōu)選人類序列為基礎(chǔ))篩選市售基因組DNA文庫。此方法產(chǎn)生基因組DNA分離物，然后可對這些分離物測序并通過與大鼠，小鼠或人類cDNA序列的同源性測定外顯子/內(nèi)含子邊界。
b.從尸檢或活檢組織中分離NaN全長序列的等位基因變體為分離人類神經(jīng)節(jié)的總RNA，從來自尸檢(post-mortem)的人體材料、胎兒組織、活檢組織或手術(shù)組織的人背根神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)或其它顱神經(jīng)節(jié)中分離人NaN全長cDNA同系物。按照實(shí)施例1所述的異硫氰酸胍提取法(Saiki等，(1985)科學(xué)230，1350-1354)從這些組織中提取總核糖核酸(RNA)。
為測定大鼠NaN鈉通道cDNA的人類同系物的全長轉(zhuǎn)錄子的大小，測定轉(zhuǎn)錄子大小的方法如實(shí)施例9中所述。
實(shí)施例7人類DRG cDNA文庫的產(chǎn)生在實(shí)施例4中使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Sambrook等，(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南，Cold Spring Harbor發(fā)行；Ausubel等，(1995)分子生物學(xué)中的現(xiàn)代方法，Greene出版)從人類DRG或三叉神經(jīng)節(jié)polyA+RNA制備cDNA文庫。
將PolyA+mRNA與oligo(dT)引物雜交，將該RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶拷貝為單鏈cDNA。然后，用RNA酶H將RNA-DNA雜合體中的RNA片段化同時(shí)用大腸桿菌DNA聚合酶I合成第二鏈片段。修復(fù)雙鏈cDNA末端，將攜帶特異性限制酶切位點(diǎn)(例如，Eco RI)的接頭用大腸桿菌DNA連接酶連接至所述末端。然后將cDNA插入子庫連接到市售噬菌體載體如Lambda-Zap(Stratagene)中。方法詳述如下a.第一鏈cDNA合成用無菌水溶解10mg poly(A)+RNA至濃度1mg/ml。于65-70℃加熱RNA2-5分鐘然后立即置于冰中。在另一試管中按下列順序加入(總180ml)20ml5mM dNTP(每種最終500μM)，40ml 5×RT緩沖液(最終為1×)，10ml200mM DTT(最終為10mM)，20ml 0.5mg/ml oligo(dT)12-18(最終為50mg/ml)，60ml去離子水，10ml(10單位)RNasin(最終為50單位/ml)。經(jīng)渦旋混合，短暫微離心，并將混合物加入含有所述RNA的試管中。向200ml中加入20ml(200U)AMV或MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶至終濃度1000單位/ml。上下吹打幾次混合并移取10ml至另一含有1mlα32P dCTP的試管中。一般地，將兩試管在室溫下保溫5分鐘，然后，將兩試管在42℃放置一個(gè)半小時(shí)。取出該放射性標(biāo)記的等份試樣，測定摻入量并允許估計(jì)回收狀況；該反應(yīng)通過加入1ml 0.5M EDTA(pH8.0)并貯存于-20℃而終止。隨后使用所述放射性標(biāo)記的反應(yīng)來估計(jì)cDNA插入子的產(chǎn)量和平均大小。通過加入4ml 0.5MEDTA(pH8.0)和200ml緩沖的酚來終止反應(yīng)。將混合物充分渦旋，在室溫下微量離心1分鐘以分層，將上層水相轉(zhuǎn)移到新試管中。用1×TE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.5)重新提取酚相并將兩次提取的水相集中。重新提取酚相提高了產(chǎn)量。用7.5M醋酸銨(終濃度2.0-2.5M)和95％乙醇沉淀cDNA。放在干冰/乙醇浴中15分鐘，溫至4℃，并在4℃以全速微量離心10分鐘使核酸沉淀。然后用冰凍的70％乙醇洗滌小的黃白色沉淀，并在4℃全速微量離心3分鐘。同樣，棄去上清并使沉淀物短暫干燥。
b.第二鏈合成一般地，將第一鏈合成得到的沉淀在284ml水中重懸并按照下列順序加入這些試劑(總400ml)4ml 5mM dNTP(最終每種50μM)，80ml 5×第二鏈緩沖液(最終為1×)，12ml 5mM β-NAD(最終150μM)，2ml 10μCi/ml α32P dCTP(最終50μCi/ml)。經(jīng)渦旋混合，短暫微量離心，并加入4ml(4單位)RNA酶H(最終為10單位/ml)，4ml(20單位)大腸桿菌DNA連接酶(最終為50單位/ml)，和10ml(100單位)大腸桿菌DNA聚合酶I(最終為250單位/ml)。經(jīng)上下吹打混合，短暫微量離心，在14℃保溫12至16小時(shí)。第二鏈合成后，移取4ml反應(yīng)物，測定將放射性標(biāo)記摻入酸不溶性物質(zhì)后的產(chǎn)量。用400ml緩沖的酚提取該第二鏈合成反應(yīng)物并按照上述用200ml TE緩沖液(pH7.5)重新提取酚相。然后將雙鏈cDNA如上述進(jìn)行乙醇沉淀。
為完成第二鏈合成，用酶混合物將雙鏈cDNA末端補(bǔ)平。沉淀在42ml水中重懸然后按照下列順序加入這些試劑(總80ml)5ml 5mM dNTP(最終每種310μM)，16ml 5×TA緩沖液(最終為1×)，1ml 5mM β-NAD(最終62μM)。經(jīng)渦旋混合，短暫微量離心，并加入4ml 2mg/ml RNA酶A(最終為100ng/ml)，4ml(4單位)RNA酶H(最終50單位/ml)，4ml(20單位)大腸桿菌DNA連接酶(最終為250單位/ml)，和4ml(8單位)T4 DNA聚合酶(最終為100單位/ml)。如上述混合并且在37℃保溫45分鐘。加入120ml TE緩沖液(pH7.5)和1ml 10mg/ml tRNA。用200ml緩沖的酚提取并且按照上述用100ml TE緩沖液重新提取酚相。將兩次水相集中并如上述進(jìn)行乙醇沉淀。
c.向雙鏈cDNA添加接頭按照下列順序于室溫將下述試劑加入0.5ml微量離心試管中100ng雙鏈cDNA，2ml接頭/銜接子(10mM)，2ml 5×DNA連接緩沖液，1ml T4 DNA連接酶(單位/ml)，終體積10ml。輕輕吹打來混合內(nèi)容物，在微量離心機(jī)中短暫離心。保溫條件是16℃過夜；或室溫(19℃-23℃)3-4小時(shí)。70℃加熱該混合物5分鐘以滅活連接酶。此cDNA通常用Eco RI消化，以制備用于與載體連接的cDNA粘性末端和切割接頭多聯(lián)體。一般此反應(yīng)物包括10ml cDNA，2ml 10×Eco RI緩沖液(根據(jù)公司來源)，2ml Eco RI(10單位/ml)和無菌水至終體積20ml。將混合物在37℃保溫2-4小時(shí)。
d.cDNA的大小分級分離一般使用大小排阻層析柱去除接頭分子和短的cDNA片段(350bp)。例如，在插有一小片無菌玻璃棉的塑料柱(5ml塑料管即可)中制備1mlSepharose CL-4B柱。該柱用溶于1×TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.5)的0.1M氯化鈉平衡。然后在柱上裝載cDNA并且收集200μl的級分。每種級分取2μl經(jīng)凝膠電泳和放射自顯影分析測定cDNA洗脫峰。一般地，將含有洗脫峰前一半的級分集中并用乙醇沉淀純化，重懸于10μl蒸餾水中。
e.將cDNA克隆入噬菌體載體從商業(yè)來源獲得可用Eco RI消化并具有磷酸酶作用末端的噬菌體載體以備cDNA的克隆和增殖(例如，購自Stratagene的λgt10)。將所制備的cDNA按照產(chǎn)生商的說明連接到入載體上。用市售包裝提取物將連接的載體-cDNA分子包裝入噬菌體顆粒內(nèi)。
實(shí)施例8篩選人類cDNA文庫a.對cDNA片段(探針)進(jìn)行標(biāo)記以備文庫篩選使用能識別NaN特異性核苷酸序列，例如NaN的1371-1751的RNA探針。其它核苷酸序列可根據(jù)NaN序列(圖2，7和8)如人類核苷酸序列中的核苷酸765-1160而開發(fā)。將NaN的Hind III/Bam HI片段插入pBluescript(SK+)載體(Stratagene)。所得構(gòu)建體的序列經(jīng)測序驗(yàn)證。插入子的方向使得，構(gòu)建體上分別由Hind III和Bam HI限制性酶切位點(diǎn)產(chǎn)生的5’和3’末端分別靠近T7和T3 RNA聚合酶啟動子。地高辛配基標(biāo)記的正義鏈(在Hind III位點(diǎn)線性化并由T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄)和反義鏈(在Bam HI位點(diǎn)線性化并由T3 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄)轉(zhuǎn)錄子使用MEGAscript轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)按照產(chǎn)生商的說明書體外制備。簡言之，將1μg線性模板用各自的RNA聚合酶在包含下列試劑的20μl終體積中轉(zhuǎn)錄包含各自RNA聚合酶和RNA酶抑制劑和反應(yīng)緩沖液(Ambion)的1×酶混合物，7.5mM ATP，GTP和CTP核苷酸，5.625mM UTP和1.725mM Dig-11UTP(BoehringerMannheim)。在體外37℃水浴3小時(shí)完成轉(zhuǎn)錄。向每種反應(yīng)物中加入1μl無RNA酶的DNA酶I(2單位/μl)并于37℃再保溫15分鐘以去除DNA模板。然后加入30μl無核酸酶的水和25μl LiCl沉淀溶液(7.5M氯化鋰，50mMEDTA)終止反應(yīng)。
將混合物在-20℃保溫30分鐘。在微量離心機(jī)中以13000×g，4℃離心15分鐘，使RNA轉(zhuǎn)錄子沉淀。棄去上清，將沉淀用100μl75％的乙醇洗滌一次。混合物再于13000×g，室溫離心5分鐘。然后將沉淀在密閉小室中風(fēng)干，隨后溶解于100ml無RNA酶的水中。轉(zhuǎn)錄子的產(chǎn)量和完整性通過與DIG/Genius試劑盒(Boehringer Mannhein)說明書所述瓊脂糖-甲醛凝膠上DIG-標(biāo)記的RNA對照進(jìn)行比較來確定?；蛘?，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)能用于放射自顯影分析放射活性探針。
大鼠，小鼠或人類NaN鈉通道cDNA的其它部分，如3’端非翻譯序列，也可以作為探針以相似方式用于cDNA文庫篩選或Northern印跡分析。尤具體地，可用市售試劑盒，如Pharmacia寡核苷酸標(biāo)記試劑盒，或Genius試劑盒(Boehringer Mannhein)制備探針。
b.cDNA文庫篩選在中度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交洗滌條件(50-60℃，5×SSC，30分鐘)下，使用源于上述3’非翻譯區(qū)或其它區(qū)的NaN-特異性非放射性(見上述)或放射性標(biāo)記型DNA或cRNA探針，檢測含有NaN鈉通道的全長人類同源物的重組噬菌斑。用標(biāo)準(zhǔn)方法篩選文庫(Sambrook等，(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港出版社；Ausubel等，(1995)分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，Greene出版)，包括產(chǎn)生帶有重組噬菌斑的硝酸纖維素濾膜或尼龍濾膜。然后將重組DNA與NaN-特異性探針(上述)雜交。進(jìn)行中嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌。
挑選影印濾膜(即，并非人工假象或背景)上的陽性噬菌斑進(jìn)一步純化。通常在稀釋后進(jìn)行一或多輪篩選以分離噬菌體。然后將所得噬菌斑純化，提取DNA，鑒定這些克隆中插入片段的大小。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook等，(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港出版社)使這些克隆相互間交叉雜交，鑒定獨(dú)特(distinct)的陽性克隆。
通常，分離編碼所述通道的重迭克隆。然后用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)產(chǎn)生含有下列序列的全長cDNA構(gòu)建體任何5’非翻譯序列，起始密碼子ATG，編碼序列，終止密碼子和任何3’非翻譯序列，poly A共有序列和可能的polyA重復(fù)(run)。如果重迭克隆不能產(chǎn)生足夠的片段來裝配全長cDNA克隆，可任選用RACE(基于PCR)等方法產(chǎn)生丟失片段或全長克隆。
c.人類同源物全長克隆的鑒定在Northern印跡分析中使用全長克隆中NaN-特異性cDNA序列作為探針，以測定人類組織中信使RNA的大小，將其與大鼠和小鼠的信使RNA大小進(jìn)行比較。使用針對大鼠NaN的相似方法證實(shí)克隆化cDNA的生物學(xué)活性。
實(shí)施例9用源自大鼠、小鼠或人類氨基酸序列的DNA序列經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法克隆其它全長人類NaN鈉通道如上述從來自尸檢的人體材料、胎兒組織、活檢/手術(shù)組織的人背根神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)或其它腦神經(jīng)節(jié)中分離總RNA和poly A+RNA。然后如前面實(shí)施例1所述使用cDNA制劑和基于PCR的方法。
使用源自大鼠，小鼠或人類NaN-特異性編碼序列(見圖2(SEQ ID NO3)，7B(SEQ ID NO5)，8B(SEQ ID NO8)和11B(SEQ ID NO41))的簡并PCR引物，將cDNA用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增(Saiki等，(1985)科學(xué)230，1350-1354)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用能在PCR的反應(yīng)中操作的多種變化衍生所需同源序列。這些改變包括但不局限于改變循環(huán)和步驟溫度，循環(huán)和步驟時(shí)間，循環(huán)次數(shù)，耐熱的聚合酶，和Mg2+濃度?？梢允褂迷醋訬aN鈉通道的更保守序列的嵌套式引物達(dá)到更好特異性。
一般在60μl體系中進(jìn)行擴(kuò)增，使用1μl第一鏈cDNA，每種引物0.8mM和1.75單位的擴(kuò)增長模板DNA聚合酶的酶混合物(Boehringer Mannheim)。對比于傳統(tǒng)的和耐熱的DNA聚合酶，擴(kuò)增長模板酶混合物在不增加非特異擴(kuò)增的情況下提高了PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量(Barnes，(1994)美國國家科學(xué)院院報(bào)91，2216-2220；Cheng等，(1994)美國國家科學(xué)院院報(bào)91，5695-5699)。PCR反應(yīng)緩沖液包括50mM Tris-鹽酸(pH9.2)，16mM(NH4)2SO4，2.25mMMgCl2，2％(v/v)DMSO和0.1％吐溫20。如前所述(Dib-Hajj等，(1996)FEBSLett.384，78-82)，用可編程熱循環(huán)儀(PTC-200，MJ Research)在兩個(gè)階段完成擴(kuò)增。首先，在94℃變性4分鐘，60℃退火2分鐘和72℃延伸90秒。第二，在94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘和72℃延伸90秒。在總共35個(gè)循環(huán)中將第二階段重復(fù)33次，且最后一個(gè)循環(huán)中的延伸步驟延長到10分鐘。此外，與樣品平行進(jìn)行對照組反應(yīng)。這應(yīng)該(1)除了cDNA外的所有成分，(陰性對照)和(2)所有反應(yīng)成分以及用于組成型表達(dá)的產(chǎn)物，例如，GAPDH的引物。
將PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1-1.6％(w/v)瓊脂糖凝膠上檢測。然后將凝膠上代表近似預(yù)測大小的擴(kuò)增產(chǎn)物帶(用溴化乙錠染色并在紫外燈下觀察顯影)切下并進(jìn)行DNA純化。
得到的DNA可以直接測序或連接到合適的載體諸如但不局限于pCRII(Invitrogen)或者pGEMT(Promega)。然后對這些克隆測序以鑒定含有相同于大鼠，小鼠或部分人類NaN鈉通道序列者。
實(shí)施例10克隆分析用傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)一步鑒定實(shí)施例9所得候選克隆。也用傳統(tǒng)技術(shù)確認(rèn)表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性。
實(shí)施例11從人類胎兒組織中分離全長NaN序列使用NaN-特異引物(通過PCR)或探針(通過文庫篩選)經(jīng)上述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法和標(biāo)準(zhǔn)文庫篩選方法，篩選市售人類胎兒cDNA文庫和/或cDNA庫。
實(shí)施例12對帶有大鼠NaN片段的大鼠DRG或三叉神經(jīng)元進(jìn)行Northern印跡將10-30μg總DRG和/或來自DRG或三叉神經(jīng)節(jié)(陽性組織)和大腦半球，小腦和肝(陰性組織)的RNA在變性的1％瓊脂糖-甲醛凝膠或瓊脂糖-乙二醛凝膠上電泳，然后如所述經(jīng)多個(gè)步驟轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，如標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)手冊詳述(Sambrook等，(1989)分子克隆-實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港出版社或者Ausubel等，(1995)分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，Greene出版)。Northern分析一般使用放射性標(biāo)記的(比活性＞108dpm/μg)或地高辛配基標(biāo)記的RNA探針。在體外從正義DNA片段合成反義RNA探針(參見實(shí)施例20，其描述用NaN-特異探針進(jìn)行的原位雜交)。帶有固相RNA的膜用6×SSC浸濕，將膜的RNA面向上放于雜交試管中。按每10cm2膜加入1ml甲酰胺預(yù)雜交/雜交液。預(yù)雜交和雜交通常于商業(yè)雜交爐中的玻璃試管內(nèi)完成。將試管放在雜交爐內(nèi)并于60℃旋轉(zhuǎn)保溫15分鐘至1小時(shí)。將所需量的探針用吸管加入雜交試管中，并繼續(xù)60℃旋轉(zhuǎn)保溫過夜。如果比活性是108dpm/μg則雜交液中探針濃度應(yīng)是10ng/ml或者如果比活性是109dpm/μg則雜交液中探針濃度應(yīng)是2ng/ml(用2-10ng/ml地高辛配基標(biāo)記的探針)。
棄去雜交液并加入等體積的2×SSC/0.1％SDS。室溫下旋轉(zhuǎn)保溫5分鐘。更換洗滌溶液，重復(fù)此步驟。為降低背景，用雙倍體積的洗滌溶液可能是有益的。將洗滌溶液用等體積的0.2×SSC/0.1％SDS置換并將試管在室溫下旋轉(zhuǎn)保溫5分鐘。更換洗滌溶液并重復(fù)此步驟(此為低嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌)。中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件是，進(jìn)一步用預(yù)熱到中溫(42℃)或高溫(68℃)的洗滌溶液洗滌。棄去最后的洗滌溶液并在室溫下用2×SSC洗滌膜。然后進(jìn)行放射自顯影長達(dá)一周?；蛘?，如果使用非放射性探針則用化學(xué)發(fā)光技術(shù)(Amersham)檢測信號。通過與凝膠上分子量標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)的對比，從凝膠上的信號計(jì)算出轉(zhuǎn)錄子的大小。
實(shí)施例13經(jīng)RT-PCR測定NaN的組織特異性分布用從多個(gè)大鼠制備的cDNA模板，使用NaN-特異性正向(5’CCCTGCTGCGCTCGGTGAAGAA3’)(SEQ ID NO39)和反向引物(5’GACAAAGTAGATCCCAGAGG3’)(SEQ ID NO25)進(jìn)行RT-PCR分析。這些引物擴(kuò)增765位和1156位核苷酸之間(392bp)的NaN序列并是NaN-特異性的，因?yàn)榕c數(shù)據(jù)庫中的序列缺乏相似性(使用國家生物技術(shù)信息中心的BLASTN等程序)。擴(kuò)增一般在60μl體系中用1μl第一鏈cDNA，0.8μM的每種引物和1.75單位的擴(kuò)增長模板DNA聚合酶的酶混合物(Boehringer Mannheim)進(jìn)行。對比于傳統(tǒng)的和耐熱的DNA聚合酶，擴(kuò)增長模板酶混合物在不增加非特異擴(kuò)增的情況下提高了PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量(Barnes，(1994)美國國家科學(xué)院院報(bào)91，2216-2220；Cheng等，(1994)美國國家科學(xué)院院報(bào)91，5695-5699)。PCR反應(yīng)緩沖液包括50mM Tris-鹽酸(pH9.2)，16mM(NH4)2SO4，2.25mM MgCl2，2％(v/v)DMSO和0.1％吐溫20。如前所述(Dib-Hajj等，(1996)FEBS Lett.384，78-82)，用可編程熱循環(huán)儀(PTC-200，MJ Research)在兩個(gè)階段完成擴(kuò)增。首先，變性步驟是在94℃4分鐘，隨后退火步驟是在60℃2分鐘，然后延伸步驟是在72℃90秒。第二階段，變性步驟是在94℃1分鐘，接著退火步驟是在60℃1分鐘，然后延伸步驟是在72℃90秒。在總共25-35個(gè)循環(huán)中將第二階段重復(fù)33次，并將最后一個(gè)循環(huán)中的延伸步驟延長到10分鐘。
使用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)部對照以確保不同組織中NaN信號的缺失不是由于模板的降解或PCR抑制物的存在。用擴(kuò)增對應(yīng)于核苷酸328-994(錄入號M17701)的66bp產(chǎn)物的引物共擴(kuò)增大鼠GAPDH序列。以人類基因結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，擴(kuò)增產(chǎn)物跨越多個(gè)外顯子/內(nèi)含子剪接位點(diǎn)(Benham等，(1987)自然328，275-278)。在反轉(zhuǎn)錄之前用DNA酶I常規(guī)處理以防止GAPDH序列從可能污染總RNA制劑的基因組加工型假基因而擴(kuò)增(Ercolani等，(1988)生物學(xué)和化學(xué)雜志263，15335-15341)。
NaN主要且優(yōu)選在DRG和三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中表達(dá)。圖4顯示用RT-PCR在各種神經(jīng)和非神經(jīng)組織中篩選NaN表達(dá)的結(jié)果。泳道1，2，4，9和16表示與400bp標(biāo)志共同電泳的單個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，其與392bp的NaN-特異產(chǎn)物相一致。泳道1，2，4，9和16含有分別用DRG，大腦半球，視網(wǎng)膜，和三叉神經(jīng)節(jié)獲得的產(chǎn)物。用此評價(jià)方法，在小腦，視神經(jīng)，脊髓，坐骨神經(jīng)，頸上神經(jīng)節(jié)，骨骼肌，心肌，腎上腺，子宮，肝或腎(分別是泳道3，5-8和10-15)未檢測到NaN。由于在平行PCR反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)中獲得了相當(dāng)?shù)腉APDH擴(kuò)增產(chǎn)物，所以在大腦半球和視網(wǎng)膜上NaN信號減弱，在其余組織上此信號缺失不是由于RNA的降解或在cDNA模板中PCR抑制物的存在。
實(shí)施例14用NaN編碼序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞制備用于測量Na+流或細(xì)胞內(nèi)Na+水平的宿主細(xì)胞，其通常通過鈣-磷酸鹽沉淀技術(shù)用熒光報(bào)道質(zhì)粒(pGreen Lantern-1，Life Technologies，Inc.)將構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞如HEK293細(xì)胞(Ukomadu等，(1992)神經(jīng)元8，663-676)而完成。一般將HEK293細(xì)胞在加有10％胎牛血清(Lif Technology)的高葡萄糖DMEM(Life Technology)上培養(yǎng)。48小時(shí)后，挑選帶有綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行記錄(Dib-Hajj等，(1997)FEBS Lett.416，11-14)。
為制備連續(xù)表達(dá)重組通道的細(xì)胞系，將NaN構(gòu)建體克隆到哺乳動物細(xì)胞中帶有選擇標(biāo)記的其它載體上。用鈣磷酸鹽沉淀技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(Ukomadu等，(1992)神經(jīng)元8，663-676)。將人胚腎(HEK-293)，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，或其它合適的細(xì)胞系在加有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基上用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件培養(yǎng)。向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入鈣磷酸鹽-DNA混合物并保持15-20小時(shí)，之后將細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基洗滌。48小時(shí)后，加入抗生素(G418)挑選獲得新霉素抗性的細(xì)胞。在G418中維持兩周后，用無菌的10ml吸管收獲10-20個(gè)分離的細(xì)胞菌落。繼續(xù)培養(yǎng)這些菌落4-7天，分離并隨后用全細(xì)胞膜片鉗位記錄和RT-PCR檢驗(yàn)通道的表達(dá)。
實(shí)施例15NaN特異抗體的產(chǎn)生用致免疫的NaN-特異肽在家兔上生產(chǎn)多克隆抗大鼠，小鼠或人類NaN的特異抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，選用肽CGPNPASNKDCFEKEK DSED(大鼠氨基酸285-304)(SEQ ID NO40)因?yàn)樗厦庖咴院捅砻嬉捉咏缘臉?biāo)準(zhǔn)。此肽的序列與公共數(shù)據(jù)庫中的任何肽序列都不能匹配。將有下劃線的半胱氨酸(C)殘基換成丙氨酸(A)以防止形成二硫鍵。此氨基酸變化預(yù)期不會對抗體特異性有重大影響。
用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行肽合成，家兔免疫，和抗肽抗體的親和純化。然后將純化的抗體在培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元上檢驗(yàn)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法在用過量的肽阻斷之前和之后分別用這些抗體進(jìn)行免疫染色。
將培養(yǎng)16-24小時(shí)后的DRG神經(jīng)元如下進(jìn)行NaN蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。將蓋玻片用完全的鹽水溶液(137mM NaCl，5.3mM KCl，1 ITLMM902 25mM山梨糖醇，10mM HEPES，3mM CaCl2(pH7.2))洗滌，用4％多聚甲醛在0.14M磷酸緩沖液中4℃固定10分鐘，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次每次5分鐘，并用含有20％正常山羊血清，1％牛血清白蛋白和0.1％Triton X-100的PBS封閉15分鐘。將蓋玻片在抗-NaN抗體(1∶100稀釋)中4℃保溫過夜。保溫過夜后，將蓋玻片在PBS中充分洗滌，然后用山羊抗家兔IgG-結(jié)合的Cy3(1∶3000，Amersham)室溫下保溫2小時(shí)。將蓋玻片用PBS清洗并且用aqua-poly-mount封于載玻片上。用裝有epifluorescence的LeitzAristoplan光學(xué)顯微鏡檢測神經(jīng)元并用Dage DC330T彩色照相機(jī)和ScionCG-7彩色PCI幀接收器捕捉圖像(參見圖7)。
實(shí)施例16在神經(jīng)性疼痛模型上NaN表達(dá)改變使用神經(jīng)性疼痛的CCI模型研究DRG神經(jīng)元上鈉通道表達(dá)的可塑性。將22只成年，體重240-260g的雌性SD大鼠用戊巴比妥鈉麻醉(50mg/Kgip)，在大腿中段暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)。如Bennett & Xie，(1988)疼痛33，87-107所述將4號鉻腸線(4-0)松松扎在神經(jīng)上。逐層縫合切口并肌注抑菌劑。
前面的研究顯示坐骨神經(jīng)橫斷誘導(dǎo)了軸突橫切術(shù)后的DRG神經(jīng)元鈉流的戲劇性變化，這與這些神經(jīng)元上表達(dá)的各種鈉通道的明顯轉(zhuǎn)錄變化相一致。在快速再啟動的靜止TTX-S離子流出現(xiàn)時(shí)和產(chǎn)生TTX-S離子流的α-III鈉通道的轉(zhuǎn)錄上調(diào)時(shí)，為TTX-R型的鈉流和兩種TTX-R鈉通道(SNS/PN3和NaN)的轉(zhuǎn)錄明顯減弱。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)術(shù)后14天，CCI-誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元上的改變和軸突切開術(shù)后的改變完全相同。當(dāng)在小直徑DRG神經(jīng)元上TTX-Sα-III鈉通道的轉(zhuǎn)錄上調(diào)時(shí)，兩種感覺神經(jīng)元特異性TTX-R通道，NaN和SNS的轉(zhuǎn)錄明顯下調(diào)，TTX-R鈉流也一樣。這些改變可能部分造成DRG神經(jīng)元興奮性過高，其與該創(chuàng)傷后引起的痛覺過敏有關(guān)。
實(shí)施例17用膜片鉗位方法評價(jià)調(diào)節(jié)NaN通道活性的試劑使用表達(dá)克隆化Na+通道的細(xì)胞系評價(jià)調(diào)節(jié)NaN通道活性的試劑，例如阻斷或抑制通道或增加通道開放的試劑。由于通道活性是電壓依賴性的，可以用去極化情況來觀察被待測試劑調(diào)節(jié)了的基線活性?？梢杂萌魏畏绞竭_(dá)到去極化，例如，升高細(xì)胞外鉀離子濃度至約20-40nM，或用重復(fù)電脈沖刺激。
將待測試劑與表達(dá)Na+通道的HEK293或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞一起保溫(Dib-Hajj等，(1997)FEBS Lett.416，11-14)。保溫足夠的時(shí)間后，可用膜片鉗位方法測量該試劑誘導(dǎo)的Na+通道活性的改變(Hamill等，(1981)Pflugers Arch.391，85-100)。這些測量的數(shù)據(jù)要在MacIntosh Quadra 950或相似的計(jì)算機(jī)上使用例如Pulse(v7.52，HEKA German)等程序才能獲得。用Sutter P-87拉制器或相似儀器將毛細(xì)玻璃管制成玻璃燒邊的電極(0.8-1.5MW)。通常只考慮分析下列細(xì)胞如果初始絕緣電阻小于5Gohm，有高漏電電流(-80mV的保持電流小于0.1nA)，膜起泡，且接通電阻小于5Mohm。監(jiān)測接通電阻而且如果電阻發(fā)生改變則數(shù)據(jù)不可用。用一系列電阻補(bǔ)償來降低電壓誤差并且用計(jì)算機(jī)控制的放大器回路或其它相似方法取消電容假象。
為對比激活和失活的電壓依賴性，通常使用補(bǔ)償后最大電壓誤差＜10mV的細(xì)胞。線性漏電減法通常用于電壓鉗位記錄。通常以5KHz過濾膜電流并以20KHz采樣。電極液包含標(biāo)準(zhǔn)溶液例如140mM CsF，2mM MgCl2，1mM EGTA，和10mM Na-HEPES(pH7.3)。標(biāo)準(zhǔn)浴液通常是140nM NaCl，3mM KCl，2mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM HEPES，和10mM葡萄糖(pH7.3)。
河豚毒素(TTX)-抗性和TTX-敏感性Na+流的測定通過暴露于適當(dāng)濃度的TTX和/或通過預(yù)脈沖方案完成，此方案可根據(jù)TTX-敏感的和TTX-抵抗的離子流各自的靜息狀態(tài)失活特性區(qū)分它們(Cummins & Waxman(1997)神經(jīng)生理學(xué)雜志17，3503-3514；Sontheimer & Waxman(1992)神經(jīng)生理學(xué)雜志68，1001-1011)。
用標(biāo)準(zhǔn)脈沖方法收集數(shù)據(jù)并分析以測定包括下列的鈉通道特性電壓依賴性，靜息狀態(tài)特征，動力學(xué)，和再啟動。電流幅度和細(xì)胞電容的測定提供了Na+流強(qiáng)度的估計(jì)值，因此允許在不同條件下對比通道密度(Cummins & Waxman(1997)神經(jīng)生理學(xué)雜志17，3503-3514，30)。細(xì)胞在電流鉗位模式下研究自發(fā)型和激型動作電位的產(chǎn)生模式，激活閾值，頻率應(yīng)答特征，和對去極化和超極化的反應(yīng)，和其它電生成方面(Sontheimer &Waxman(1992)神經(jīng)生理學(xué)雜志68，1001-1011)。這些測定既在表達(dá)NaN的對照組細(xì)胞上完成也在暴露于被測試劑的NaN表達(dá)細(xì)胞上完成。
實(shí)施例18通過測定細(xì)胞內(nèi)鈉[Na+]分析能調(diào)節(jié)NaN通道活性的試劑將被測試劑與表現(xiàn)NaN通道活性的細(xì)胞保溫。保溫足夠時(shí)間后，用SBFI通過[Na+]i的比率度量顯像測定該試劑誘導(dǎo)的Na+通道改變。在此方法中，使用Na+指示劑，例如SBFI(鈉結(jié)合型苯并呋喃異鄰苯二甲酸酯(Harootunian等，(1989)生物學(xué)和化學(xué)雜志264，19458-19467))或相似染料測定胞漿游離Na+。首先在細(xì)胞上添加SBFI的膜通透型乙酰氧甲基酯形式(SBFI/AM)或相似染料(通常溶于二甲亞砜，貯存濃度為10mM)。用市售顯像裝置(例如，買自Georgia Instruments)在顯微鏡下進(jìn)行記錄。使用合適波長(例如，340385nm)的激發(fā)光。激發(fā)光通過二色性反光鏡(400nm)射向細(xì)胞，收集450nm以上的發(fā)射光。用例如圖像增強(qiáng)儀(GenIISyS)放大熒光信號并且用已與幀接收器相連的CCD照相機(jī)，或相似裝置收集。為計(jì)算熒光衰減，使用熒光比率340385分析胞質(zhì)的游離Na+。
為了校準(zhǔn)SBFI的熒光，在細(xì)胞中灌注含有已知鈉濃度(通常0和30mM，或0，30，和50mM[Na+]的校準(zhǔn)溶液，以及短桿菌肽和莫能菌素。如Rose和Ransom，(1996)生理學(xué)雜志(Lond)491，291-305所報(bào)道，細(xì)胞內(nèi)SBFI的345/390nm熒光比率單純隨著[Na+]i變化。實(shí)驗(yàn)一般在多個(gè)不同的蓋玻片(一般至少4個(gè))上重復(fù)，以便對對照細(xì)胞和暴露于各種濃度的可能阻斷、抑制或增加Na+的試劑的細(xì)胞中的胞內(nèi)鈉進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性測量。此方法的使用如Sontheimer等，(1994)神經(jīng)科學(xué)雜志14，2464-2475所述。
實(shí)施例19用閃爍顯像法評定能調(diào)節(jié)NaN通道活性的試劑使用表達(dá)克隆化Na+通道的細(xì)胞系評價(jià)調(diào)節(jié)NaN通道活性的試劑，例如阻斷通道或增加通道開放的試劑。例如，將被測試劑與表達(dá)Na+通道的HEK293或其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞一起保溫(Dib-Hajj等，(1997)FEBS Lett.416，11-14)。保溫足夠的時(shí)間后，通過同位素方法測量Na+流入來檢測該試劑誘導(dǎo)的Na+通道活性改變。22Na是γ發(fā)射者，可用于測量Na+流(Kimelberg和Waltz，(1988)神經(jīng)元的微環(huán)境(Boulton等編)Humana發(fā)行)，而86Rb+可用來測定Na+/K+-ATP酶的活性，該活性提供了對Na通道活性的測量(Sontheimer等，(1994)神經(jīng)科學(xué)雜志14，2464-2475)。86Rb+離子被Na+/K+ATP酶樣K+離子吸收，但具有比42K+更長半衰期的優(yōu)勢(Kimelberg和Mayhew(1975)生物學(xué)和化學(xué)雜志250，100-104)。因此，對哇巴因敏感型86Rb+單向攝取的測定提供了定量測定隨動作電位改變的Na+/K+-ATP酶活性的方法。
將表達(dá)NaN的細(xì)胞用放射性同位素保溫后，用液閃計(jì)數(shù)儀或相似方法測定放射性同位素的細(xì)胞內(nèi)含量，并用諸如二辛可寧酸蛋白測定法(Smith等，(1985)Anal Biochem 150，76-85)經(jīng)Goldschmidt和Kimelberg(1989)Anal.Biochem.177，41-45針對培養(yǎng)細(xì)胞而改良后的方法測定細(xì)胞蛋白。在存在和缺乏可能阻斷、抑制、或增強(qiáng)NaN的試劑的情況下，測定22Na流和86Rb+流。這允許測定這些試劑對NaN的作用。
實(shí)施例20原位雜交a.探針按照實(shí)施例5描述的制備探針。
b.DRG神經(jīng)元的培養(yǎng)如前所述從成年大鼠建立DRG神經(jīng)元的培養(yǎng)(Rizzo等，(1994)神經(jīng)生理學(xué)雜志72，2796-2815)。簡言之，將成年雌性SD大鼠腰神經(jīng)節(jié)(L4，L5)從與它們相連的鞘內(nèi)分離出來并依次在含有膠原酶的酶溶液中然后是含木瓜蛋白酶的酶溶液中保溫。將組織在培養(yǎng)基中磨碎，培養(yǎng)基含有1∶1 DMEM和Hank’s F12培養(yǎng)基和10％胎牛血清，1.5mg/ml胰蛋白酶抑制劑，1.5mg/ml牛血清白蛋白，100單位/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素，以500-1000細(xì)胞/mm2的密度平鋪于多鳥氨酸/層粘連蛋白覆蓋的玻片上。將細(xì)胞保持在37℃、濕潤的95％空氣/5％CO2的培養(yǎng)箱中過夜，然后如前所述進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)原位雜交(Black等，(1994)Brain Res.Mol.Brain Res.23，235-245；Zur等，(1995)Brain Res.Mol.Brain Res.30，97-105)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用相似方法培養(yǎng)三叉神經(jīng)節(jié)。
c.組織制備將成年雌性SD大鼠用例如水合氯醛深麻醉并從心臟灌流，首先用磷酸鹽緩沖液(PBS)然后用0.14M Sorensen’s磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制的4％多聚甲醛于4℃灌流。灌流固定后，收集L4和L5水平的背根神經(jīng)節(jié)并收集三叉神經(jīng)節(jié)，放于新鮮的4℃固定液中。2-4小時(shí)后，將組織轉(zhuǎn)移到含有4％多聚甲醛和30％蔗糖的0.14M磷酸鹽緩沖液中并于4℃貯存過夜。切成15μm切片并鋪于有多聚L賴氨酸覆蓋的載玻片上。如前所述將載玻片進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)原位雜交(Waxman等，(1994)神經(jīng)生理學(xué)雜志72，466-470；Black等，(1994)Brain Res.Mol.Brain Res.23，235-245)。細(xì)胞化學(xué)原位雜交后，將載玻片脫水，透明并用Permount封片。結(jié)果如圖5所示。
與NaN正義核糖探針雜交的DRG切片未顯示特異性標(biāo)記(panel C，圖5)。在與NaN反義核糖探針雜交的DRG(panel A，圖5)和三叉神經(jīng)節(jié)(panel B)切片上，在大多數(shù)小神經(jīng)元上(直徑＜30mm)出現(xiàn)NaN信號；而在大多數(shù)大神經(jīng)元上(直徑＞30mm)未顯示NaN雜交信號。在與NaN反義核糖探針雜交的脊髓，小腦和肝切片上未顯示特異信號(分別是panel D，E和F)。
實(shí)施例21微衛(wèi)星序列下面是鼠的微衛(wèi)星內(nèi)含子的序列。這些微衛(wèi)星在人類SCNI 1a基因中可以是多形性的并可以用作篩選與疾病相關(guān)的等位突變的標(biāo)記。這類篩選方法，例如，雜交或擴(kuò)增分析是簡便可行的。
內(nèi)含子4；微衛(wèi)星是dTdG(SEQ ID NO29)AGTTTAATGTTGAGTGAATTGTGGTGGTGATTTCCCACTTGAGGCCTTTGTGTTAAAGCCCAATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGTTGGGGGGTGGTGGCAGAGTCTGGTATTGGTAAGGTGAGAGCAATCCCAGAACGTCCACCTGCTCTTCCATTTTATTAATCAGGCAGGCCTCT內(nèi)含子5；微衛(wèi)星是dCdTdG(dNdG2)x(X5-30)(SEQ ID NO30)GTAAGCCACTGGCTCTTAACTAAAATGCTCGTTGGCATTAGAACATTTCTGAGCTGGGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGTGGTGGTGGAGGTGGNGGTGGAGGTGGTGGCTGTGGTGGTGGNGGTGGTGGTGGTGGTGGANGTGGANGTGGTGGCCGTGGTGGTGGNGGTGGTGGTGGAGGTGGTGGCTGTGGTGGTNGTGGTGGC
內(nèi)含子6；微衛(wèi)星是dCdA(SEQ ID NO31)TGTGCATGCTTGATTCCCAGCTCCTATGGTCTGATTACTCGGTCCTTAGGAGCAAGGCCAGACTGTCCACCCTGACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGTGTAGAGAATTACCTCATTCTTGGAGTTTCTCTGGAAAAGGAATGTCTCAAAGCCAAGTTCACAGAGCAACAGCTG內(nèi)含子8；5’微衛(wèi)星是跟有一串dT的dTdC(SEQ ID NO32)TGTTAGAAACTCTAAGACAATGAAGCACCATGCTGGAAATAAGAGCACAAACTCTTTCTTCATGCATTACCCACTGCTTGTGCTTTCACCTTAGTGCTCGTGCTCTCTCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTTTTTTTTTTTT內(nèi)含子8；3’微衛(wèi)星是dCdA(SEQ ID NO33)CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGAGAAACACTGTCGCAGTCATACATATAAAGATAAATACATCTTAAAAAAAGAACCATGTGATTGAGTTATAAAATATTCCAACTTAT內(nèi)含子10B；微衛(wèi)星是dCdA，在距其三個(gè)核苷酸的下游為dCdA3(SEQID NO34)AGGTCATTTCCTCTGCAGTGTGCTTGGCAGGAAAAACTTCCTGGCTATTCAAGTCAGTGCCCTGCTTGATCATCCATGTATCACACACACACAAAACAAACAAACAAACAAACAAAACCCTGGGGAAGAAGGAAGAGGTTAAGCACATAGGCAGAGAGCAGCCAGGCTGACTCAGAGCAAACACCTGATCATTCTTCCAT內(nèi)含子12；微衛(wèi)星是dPydG(dT/dCdG)(SEQ ID NO35)GTGCTGGGATCAAAGGCGTGCGCCGCCACCACGCCCGGCCCCTTTTTATGTTTCAAATTTACTTTTATCATGTGCACGTGTGTGGGTGCGTGCATGTGTGTGCGTGCGTGTGCGTGTGNGTGTGNGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG內(nèi)含子14；微衛(wèi)星是dCdA(SEQ ID NO36)CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACTTGCATCTTTGAGTTAATTGGATAGGCTGAGTCTTACACCGGAATCATACTGTTGC內(nèi)含子15A；微衛(wèi)星是dCdA(SEQ ID NO37)CCAATGAGAGACTCTTGTCTCAAAAAAGCCATGGTGTCCAGATCCTGAGGAATAACACCTAAGAATGTGCTCTGGCCTGAAAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGTTTTATTTATTTATTTAAAAAAATATGTCTCTAGGCATTGCTGAAATGTCTCCTACAGGATTAAGTCAACCAGAGCCA應(yīng)當(dāng)理解前面的討論和實(shí)施例僅表示具體優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明。對那些本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將是明顯的即在不背離本發(fā)明的精神和范圍時(shí)可以有多種修改和等同物。本專利說明書中引用的和提及的文件以其全部在此引入以作參考。
序列表序列表<110>耶魯大學(xué)(Yale University)<120>對人的背根神經(jīng)節(jié)中鈉離子通道的調(diào)節(jié)<130>44574-5004-02-MX<140><141><150>US 09/354，147<151>1999-07-16<150>PCT/US00/19342<151>2000-07-14<160>44<170>PatentIn 2.1版<210>1<211>5875<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220><221>CDS<222>(41)..(5335)<223>大鼠NaN的cDNA序列<220><221>不確定<222>(1996)..(4042)<223>n＝a或c或g或t<400>1acggtgccct gatcctctgt accaggaaga cagggtgaag atg gag gag agg tac 55Met Glu Glu Arg Tyr1 5tac ccg gtg atc ttc ccg gac gag cgg aat ttc cgc ccc ttc act tcc 103Tyr Pro Val Ile Phe Pro Asp Glu Arg Asn Phe Arg Pro Phe Thr Ser10 15 20gac tct ctg gct gcc ata gag aag cgg att gct atc caa aag gag agg 151Asp Ser Leu Ala Ala Ile Glu Lys Arg Ile Ala Ile Gln Lys Glu Arg25 30 35aag aag tcc aaa gac aag gcg gca gct gag ccc cag cct cgg cct cag 199Lys Lys Ser Lys Asp Lys Ala Ala Ala Glu Pro Gln Pro Arg Pro Gln40 45 50ctt gac cta aag gcc tcc agg aag tta cct aag ctt tat ggt gac att 247Leu Asp Leu Lys Ala Ser Arg Lys Leu Pro Lys Leu Tyr Gly Asp Ile55 60 65ccc cct gag ctt gta gcg aag cct ctg gaa gac ctg gac cca ttc tac 295Pro Pro Glu Leu Val Ala Lys Pro Leu Glu Asp Leu Asp Pro Phe Tyr70 75 80 85aaa gac cat aag aca ttc atg gtg ttg aac aag aag aga aca att tat 343Lys Asp His Lys Thr Phe Met Val Leu Asn Lys Lys Arg Thr Ile Tyr90 95 100cgc ttc agc gcc aag cgg gcc ttg ttc att ctg ggg cct ttt aat ccc 391Arg Phe Ser Ala Lys Arg Ala Leu Phe Ile Leu Gly Pro Phe Asn Pro105 110 115ctc aga agc tta atg att cgt atc tct gtc cat tca gtc ttt agc atg 439Leu Arg Ser Leu Met Ile Arg Ile Ser Val His Ser Val Phe Ser Met120 125 130ttc atc atc tgc acg gtg atc atc aac tgt atg ttc atg gcg aat tct 487Phe Ile Ile Cys Thr Val Ile Ile Asn Cys Met Phe Met Ala Asn Ser135 140 145atg gag aga agt ttc gac aac gac att ccc gaa tac gtc ttc att ggg 535Met Glu Arg Ser Phe Asp Asn Asp Ile Pro Glu Tyr Val Phe lle Gly150 155 160 165att tat att tta gaa gct gtg att aaa ata ttg gca aga ggc ttc att 583Ile Tyr Ile Leu Glu Ala Val Ile Lys Ile Leu Ala Arg Gly Phe Ile170 175 180gtg gat gag ttt tcc ttc ctc cga gat ccg tgg aac tgg ctg gac ttc 631Val Asp Glu Phe Ser Phe Leu Arg Asp Pro Trp Asn Trp Leu Asp Phe185 190 195att gtc att gga aca gcg atc gca act tgt ttt ccg ggc agc caa gtc 679Ile Val Ile Gly Thr Ala Ile Ala Thr Cys Phe Pro Gly Ser Gln Val200 205 210aat ctt tca gct ctt cgt acc ttc cga gtg ttc aga gct ctg aag gcg 727Asn Leu Ser Ala Leu Arg Thr Phe Arg Val Phe Arg Ala Leu Lys Ala215 220 225att tca gtt atc tca ggt ctg aag gtc atc gta ggt gcc ctg ctg cgc 775Ile Ser Val Ile Ser Gly Leu Lys Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Arg230 235 240 245tcg gtg aag aag ctg gta gac gtg atg gtc ctc act ctc ttc tgc ctc 823Ser Val Lys Lys Leu Val Asp Val Met Val Leu Thr Leu Phe Cys Leu250 255 260agc atc ttt gcc ctg gtc ggt cag cag ctg ttc atg gga att ctg aac 871Ser Ile Phe Ala Leu Val Gly Gln Gln Leu Phe Met Gly Ile Leu Asn265 270 275cag aag tgt att aag cac aac tgt ggc ccc aac cct gca tcc aac aag 919Gln Lys Cys Ile Lys His Asn Cys Gly Pro Asn Pro Ala Ser Asn Lys280 285 290gat tgt ttt gaa aag gaa aaa gat agc gaa gac ttc ata atg tgt ggt 967Asp Cys Phe Glu Lys Glu Lys Asp Ser Glu Asp Phe Ile Met Cys Gly295 300 305acc tgg ctc ggc agc aga ccc tgt ccc aat ggt tct acg tgc gat aaa 1015Thr Trp Leu Gly Ser Arg Pro Cys Pro Ash Gly Ser Thr Cys Asp Lys310 315 320 325acc aca ttg aac cca gac aat aat tat aca aag ttt gac aac ttt ggc 1063Thr Thr Leu Asn Pro Asp Asn Asn Tyr Thr Lys Phe Asp Asn Phe Gly330 335 340tgg tcc ttt ctc gcc atg ttc cgg gtt atg act caa gac tcc tgg gag 1111Trp Ser Phe Leu Ala Met Phe Arg Val Met Thr Gln Asp Ser Trp Glu345 350 355agg ctt tac cga cag atc ctg cgg acc tct ggg atc tac ttt gtc ttc 1159Arg Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Arg Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Phe360 365 370ttc ttc gtg gtg gtc atc ttc ctg ggc tcc ttc tac ctg ctt aac cta 1207Phe Phe Val Val Val Ile Phe Leu Gly Ser Phe Tyr Leu Leu Asn Leu375 380 385acc ctg gct gtt gtc acc atg gct tat gaa gaa cag aac aga aat gta 1255Thr Leu Ala Val Val Thr Met Ala Tyr Glu Glu Gln Asn Arg Asn Val390 395 400 405gct gct gag aca gag gcc aag gag aaa atg ttt cag gaa gcc cag cag 1303Ala Ala Glu Thr Glu Ala Lys Glu Lys Met Phe Gln Glu Ala Gln Gln410 415 420ctg tta agg gag gag aag gag gct ctg gtt gcc atg gga att gac aga 1351Leu Leu Arg Glu Glu Lys Glu Ala Leu Val Ala Met Gly Ile Asp Arg425 430 435agt tcc ctt aat tcc ctt caa gct tca tcc ttt tcc ccg aag aag agg 1399Ser Ser Leu Asn Ser Leu Gln Ala Ser Ser Phe Ser Pro Lys Lys Arg440 445 450aag ttt ttc ggt agt aag aca aga aag tcc ttc ttt atg aga ggg tcc 1447Lys Phe Phe Gly Ser Lys Thr Arg Lys Ser Phe Phe Met Arg Gly Ser455 460 465aag acg gcc caa gcc tca gcg tct gat tca gag gac gat gcc tct aaa 1495Lys Thr Ala Gln Ala Ser Ala Ser Asp Ser Glu Asp Asp Ala Ser Lys470 475 480 485aat cca cag ctc ctt gag cag acc aaa cga ctg tcc cag aac ttg cca 1543Asn Pro Gln Leu Leu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Ser Gln Asn Leu Pro490 495 500gtg gat ctc ttt gat gag cac gtg gac ccc ctc cac agg cag aga gcg 1591Val Asp Leu Phe Asp Glu His Val Asp Pro Leu His Arg Gln Arg Ala505 510 515ctg agc gct gtc agt atc tta acc atc acc atg cag gaa caa gaa aaa 1639Leu Ser Ala Val Ser Ile Leu Thr Ile Thr Met Gln Glu Gln Glu Lys520 525 530ttc cag gag cct tgt ttc cca tgt ggg aaa aat ttg gcc tct aag tac 1687Phe Gln Glu Pro Cys Phe Pro Cys Gly Lys Asn Leu Ala Ser Lys Tyr535 540 545ctg gtg tgg gac tgt agc cct caa tgg ctg tgc ata aag aag gtc ctg 1735Leu Val Trp Asp Cys Ser Pro Gln Trp Leu Cys Ile Lys Lys Val Leu550 555 560 565cgg acc atc atg acg gat ccc ttt act gag ctg gcc atc acc atc tgc 1783Arg Thr Ile Met Thr Asp Pro Phe Thr Glu Leu Ala Ile Thr Ile Cys570 575 580atc atc atc aat acc gtt ttc tta gcc gtg gag cac cac aac atg gat 1831Ile Ile Ile Asn Thr Val Phe Leu Ala Val Glu His His Asn Met Asp585 590 595gac aac tta aag acc ata ctg aaa ata gga aac tgg gtt ttc acg gga 1879Asp Asn Leu Lys Thr Ile Leu Lys Ile Gly Asn Trp Val Phe Thr Gly600 605 610att ttc ata gcg gaa atg tgt ctc aag atc atc gcg ctc gac cct tac 1927Ile Phe Ile Ala Glu Met Cys Leu Lys Ile Ile Ala Leu Asp Pro Tyr615 620 625cac tac ttc cgg cac ggc tgg aat gtt ttt gac agc atc gtg gcc ctc 1975His Tyr Phe Arg His Gly Trp Asn Val Phe Asp Ser Ile Val Ala Leu630 635 640 645ctg agt ctc gct gat gtg ctn tac aac aca ctg tct gat aac aat agg 2023Leu Ser Leu Ala Asp Val Xaa Tyr Asn Thr Leu Ser Asp Asn Asn Arg650 655 660tct ttc ttg gct tcc ctc aga gtg ctg agg gtc ttc aag tta gcc aaa 2071Ser Phe Leu Ala Ser Leu Arg Val Leu Arg Val Phe Lys Leu Ala Lys665 670675tcc tgg ccc acg tta aac act ctc att aag atc atc ggc cac tcc gtg 2119Ser Trp Pro Thr Leu Asn Thr Leu Ile Lys Ile Ile Gly His Ser Val680 685 690ggc gcg ctt gga aac ctg act gtg gtc ctg act atc gtg gtc ttc atc 2167Gly Ala Leu Gly Asn Leu Thr Val Val Leu Thr Ile Val Val Phe Ile695 700 705ttt tct gtg gtg ggc atg cgg ctc ttc ggc acc aag ttt aac aag acc 2215Phe Ser Val Val Gly Met Arg Leu Phe Gly Thr Lys Phe Asn Lys Thr710 715 720 725gcc tac gcc acc cag gag cgg ccc agg cgg cgc tgg cac atg gat aat 2263Ala Tyr Ala Thr Gln Glu Arg Pro Arg Arg Arg Trp His Met Asp Asn730 735 740ttc tac cac tcc ttc ctg gtg gtg ttc cgc atc ctc tgt ggg gaa tgg 2311Phe Tyr His Ser Phe Leu Val Val Phe Arg Ile Leu Cys Gly Glu Trp745 750 755atc gag aac atg tgg ggc tgc atg cag gat atg gac ggc tcc ccg ttg 2359Ile Glu Asn Met Trp Gly Cys Met Gln Asp Met Asp Gly Ser Pro Leu760 765 770tgc atc att gtc ttt gtc ctg ata atg gtg atc ggg aag ctt gtg gtg 2407Cys Ile Ile Val Phe Val Leu Ile Met Val Ile Gly Lys Leu Val Val775 780 785ctt aac ctc ttc att gcc ttg ctg ctc aat tcc ttc agc aat gag gag 2455Leu Asn Leu Phe Ile Ala Leu Leu Leu Asn Ser Phe Ser Asn Glu Glu790 795 800 805aag gat ggg agc ctg gaa gga gag acc agg aaa acc aaa gtg cag cta 2503Lys Asp Gly Ser Leu Glu Gly Glu Thr Arg Lys Thr Lys Val Gln Leu810 815 820gcc ctg gat cgg ttc cgc cgg gcc ttc tcc ttc atg ctg cac gct ctt 2551Ala Leu Asp Arg Phe Arg Arg Ala Phe Ser Phe Met Leu His Ala Leu825 830 835cag agt ttt tgt tgc aag aaa tgc agg agg aaa aac tcg cca aag cca 2599Gln Ser Phe Cys Cys Lys Lys Cys Arg Arg Lys Asn Ser Pro Lys Pro840 845 850aaa gag aca aca gaa agc ttt gct ggt gag aat aaa gac tca atc ctc 2647Lys Glu Thr Thr Glu Ser Phe Ala Gly Glu Asn Lys Asp Ser Ile Leu855 860 865ccg gat gcg agg ccc tgg aag gag tat gat aca gac atg gct ttg tac 2695Pro Asp Ala Arg Pro Trp Lys Glu Tyr Asp Thr Asp Met Ala Leu Tyr870 875 880 885act gga cag gcc ggg gct ccg ctg gcc cca ctc gca gag gta gag gac 2743Thr Gly Gln Ala Gly Ala Pro Leu Ala Pro Leu Ala Glu Val Glu Asp890 895 900gat gtg gaa tat tgt ggt gaa ggc ggt gcc cta ccc acc tca caa cat 2791Asp Val Glu Tyr Cys Gly Glu Gly Gly Ala Leu Pro Thr Ser Gln His905 910 915agt gct gga gtt cag gcc ggt gac ctc cct cca gag acc aag cag ctc 2839Ser Ala Gly Val Gln Ala Gly Asp Leu Pro Pro Glu Thr Lys Gln Leu920 925 930act agc ccg gat gac caa ggg gtt gaa atg gaa gta ttt tct gaa gaa 2887Thr Ser Pro Asp Asp Gln Gly Val Glu Met Glu Val Phe Ser Glu Glu935 940 945gat ctg cat tta agc ata cag agt cct cga aag aag tct gac gca gtg 2935Asp Leu His Leu Ser Ile Gln Ser Pro Arg Lys Lys Ser Asp Ala Val950 955 960 965agc atg ctc tcg gaa tgc agc aca att gac ctg aat gat atc ttt aga 2983Ser Met Leu Ser Glu Cys Ser Thr Ile Asp Leu Asn Asp Ile Phe Arg970 975 980aat tta cag aaa aca gtt tcc ccc aaa aag cag cca gat aga tgc ttt 3031Asn Leu Gln Lys Thr Val Ser Pro Lys Lys Gln Pro Asp Arg Cys Phe985 990 995ccc aag ggc ctt agt tgt cac ttt cta tgc cac aaa aca gac aag aga 3079Pro Lys Gly Leu Ser Cys His Phe Leu Cys His Lys Thr Asp Lys Arg100010051010aag tcc ccc tgg gtc ctg tgg tgg aac att cgg aaa acc tgc tac caa 3127Lys Ser Pro Trp Val Leu Trp Trp Asn Ile Arg Lys Thr Cys Tyr Gln101510201025atc gtg aag cac agc tgg ttt gag agt ttc ata atc ttt gtt att ctg 3175Ile Val Lys His Ser Trp Phe Glu Ser Phe Ile Ile Phe Val Ile Leu1030 103510401045ctg agc agt gga gcg ctg ata ttt gaa gat gtc aat ctc ccc agc cgg 3223Leu Ser Ser Gly Ala Leu Ile Phe Glu Asp Val Asn Leu Pro Ser Arg105010551060ccc caa gtt gag aaa tta cta agg tgt acc gat aat att ttc aca ttt 3271Pro Gln Val Glu Lys Leu Leu Arg Cys Thr Asp Asn Ile Phe Thr Phe106510701075att ttc ctc ctg gaa atg atc ctg aag tgg gtg gcc ttt gga ttc cgg 3319Ile Phe Leu Leu Glu Met Ile Leu Lys Trp Val Ala Phe Gly Phe Arg108010851090agg tat ttc acc agt gcc tgg tgc tgg ctt gat ttc ctc att gtg gtg 3367Arg Tyr Phe Thr Ser Ala Trp Cys Trp Leu Asp Phe Leu Ile Val Val109511001105gtg tct gtg ctc agt ctc atg aat cta cca agc ttg aag tcc ttc cgg 3415Val Ser Val Leu Ser Leu Met Asn Leu Pro Ser Leu Lys Ser Phe Arg1110 111511201125act ctg cgg gcc ctg aga cct ctg cgg gcg ctg tcc cag ttt gaa gga 3463Thr Leu Arg Ala Leu Arg Pro Leu Arg Ala Leu Ser Gln Phe Glu Gly113011351140atg aag gtt gtc gtc tac gcc ctg atc agc gcc ata cct gcc att ctc 3511Met Lys Val Val Val Tyr Ala Leu Ile Ser Ala Ile Pro Ala Ile Leu114511501155aat gtc ttg ctg gtc tgc ctc att ttc tgg ctc gta ttt tgt atc ttg 3559Asn Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Phe Trp Leu Val Phe Cys Ile Leu116011651170gga gta aat tta ttt tct ggg aag ttt gga agg tgc att aac ggg aca 3607Gly Val Asn Leu Phe Ser Gly Lys Phe Gly Arg Cys Ile Asn Gly Thr117511801185gac ata aat atg tat ttg gat ttt acc gaa gtt ccg aac cga agc caa 3655Asp Ile Asn Met Tyr Leu Asp Phe Thr Glu Val Pro Asn Arg Ser Gln1190 119512001205tgt aac att agt aat tac tcg tgg aag gtc ccg cag gtc aac ttt gac 3703Cys Asn Ile Ser Asn Tyr Ser Trp Lys Val Pro Gln Val Asn Phe Asp121012151220aac gtg ggg aat gcc tat ctc gcc ctg ctg caa gtg gca acc tat aag 3751Asn Val Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Leu Gln Val Ala Thr Tyr Lys122512301235ggc tgg ctg gaa atc atg aat gct gct gtc gat tcc aga gag aaa gac 3799Gly Trp Leu Glu Ile Met Asn Ala Ala Val Asp Ser Arg Glu Lys Asp124012451250gag cag ccg gac ttt gag gcg aac ctc tac gcg tat ctc tac ttt gtg 3847Glu Gln Pro Asp Phe Glu Ala Asn Leu Tyr Ala Tyr Leu Tyr Phe Val125512601265gtt ttt atc atc ttc ggc tcc ttc ttt acc ctg aac ctc ttt atc ggt 3895Val Phe Ile Ile Phe Gly Ser Phe Phe Thr Leu Asn Leu Phe Ile Gly1270 127512801285gtt att att gac aac ttc aat cag cag cag aaa aag tta ggt ggc caa 3943Val Ile Ile Asp Asn Phe Asn Gln Gln Gln Lys Lys Leu Gly Gly Gln129012951300gac att ttt atg aca gaa gaa cag aag aaa tat tac aat gca atg aaa 3991Asp Ile Phe Met Thr Glu Glu Gln Lys Lys Tyr Tyr Asn Ala Met Lys130513101315aag tta gga acc aag aaa cct caa aag ccc atc cca agg ccc ctg aac 4039Lys Leu Gly Thr Lys Lys Pro Gln Lys Pro Ile Pro Arg Pro Leu Asn132013251330aan tgt caa gcc ttt gtg ttc gac ctg gtc aca agc cat gtc ttt gac 4087Xaa Cys Gln Ala Phe Val Phe Asp Leu Val Thr Ser His Val Phe Asp133513401345gtc atc att ctg ggt ctt att gtc tta aat atg att atc atg atg gct 4135Val Ile Ile Leu Gly Leu Ile Val Leu Asn Met Ile Ile Met Met Ala1350 135513601365gaa tct gcc gac cag ccc aaa gat gtg aag aaa acc ttt gat atc ctc 4183Glu Ser Ala Asp Gln Pro Lys Asp Val Lys Lys Thr Phe Asp Ile Leu137013751380aac ata gcc ttc gtg gtc atc ttt acc ata gag tgt ctc atc aaa gtc 4231Asn Ile Ala Phe Val Val Ile Phe Thr Ile Glu Cys Leu Ile Lys Val138513901395ttt gct ttg agg caa cac tac ttc acc aat ggc tgg aac tta ttt gat 4279Phe Ala Leu Arg Gln His Tyr Phe Thr Asn Gly Trp Asn Leu Phe Asp140014051410tgt gtg gtc gtg gtt ctt tct atc att agt acc ctg gtt tcc cgc ttg 4327Cys Val Val Val Val Leu Ser Ile Ile Ser Thr Leu Val Ser Arg Leu141514201425gag gac agt gac att tct ttc ccg ccc acg ctc ttc aga gtc gtc cgc 4375Glu Asp Ser Asp Ile Ser Phe Pro Pro Thr Leu Phe Arg Val Val Arg1430 143514401445ttg gct cgg att ggt cga atc ctc agg ctg gtc cgg gct gcc cgg gga 4423Leu Ala Arg Ile Gly Arg Ile Leu Arg Leu Val Arg Ala Ala Arg Gly145014551460atc agg acc ctc ctc ttt gct ttg atg atg tct ctc ccc tct ctc ttc 4471Ile Arg Thr Leu Leu Phe Ala Leu Met Met Ser Leu Pro Ser Leu Phe146514701475aac atc ggt ctg ctg ctc ttc ctg gtg atg ttc att tac gcc atc ttt 4519Asn Ile Gly Leu Leu Leu Phe Leu Val Met Phe Ile Tyr Ala Ile Phe148014851490ggg atg agc tgg ttt tcc aaa gtg aag aag ggc tcc ggg atc gac gac 4567Gly Met Ser Trp Phe Ser Lys Val Lys Lys Gly Ser Gly Ile Asp Asp149515001505atc ttc aac ttc gag acc ttt acg ggc agc atg ctg tgc ctc ttc cag 4615Ile Phe Asn Phe Glu Thr Phe Thr Gly Ser Met 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120tgtgngtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtg 158<210>36<211>113<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>36cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacttg 60catctttgag ttaattggat aggctgagtc ttacaccgga atcatactgt tgc113<210>37<211>200<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>37ccaatgagag actcttgtct caaaaaagcc atggtgtcca gatcctgagg aataacacct 60aagaatgtgc tctggcctga aaacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 120agttttattt atttatttaa aaaaatatgt ctctaggcat tgctgaaatg tctcctacag 180gattaagtca accagagcca 200<210>38<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述大鼠NaN反向引物所依據(jù)的蛋白質(zhì)序列<220><221>變體<222>(3)<223>Xaa＝Val或Asp<400>38Met Trp Xaa Cys Met Glu Val1 5<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述大鼠NaN正向引物<400>39ccctgctgcg ctcggtgaag aa 22<210>40<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于衍生多克隆抗體的表位的氨基酸序列<400>40Cys Gly Pro Asn Pro Ala Ser Asn Lys Asp Cys Phe Glu Lys Glu Lys1 5 10 15Asp Ser Glu Asp20<210>41<211>5860<212>DNA<213>人(Homo 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ttg ccc ctg cgt acc ttc cgt gtg ttc aga gct ttg aaa gca 726Lys Leu Leu Pro Leu Arg Thr Phe Arg Val Phe Arg Ala Leu Lys Ala220 225 230att tca gta gtt tca cgt ctg aag gtc atc gtg ggg gcc ttg cta cgc 774Ile Ser Val Val Ser Arg Leu Lys Val Ile Val Gly Ala Leu Leu Arg235 240 245tct gtg aag aag ctg gtc aac gtg att atc ctc acc ttc ttt tgc ctc 822Ser Val Lys Lys Leu Val Asn Val Ile Ile Leu Thr Phe Phe Cys Leu250 255 260agc atc ttt gcc ctg gta ggt cag cag ctc ttc atg gga agt ctg aac 870Ser Ile Phe Ala Leu Val Gly Gln Gln Leu Phe Met Gly Ser Leu Asn265 270 275 280ctg aaa tgc atc tcg agg gac tgt aaa aat atc agt aac ccg gaa gct 918Leu Lys Cys Ile Ser Arg Asp Cys Lys Asn Ile Ser Asn Pro Glu Ala285 290 295tat gac cat tgc ttt gaa aag aaa gaa aat tca cct gaa ttc aaa atg 966Tyr Asp His Cys Phe Glu Lys Lys Glu Asn Ser Pro Glu Phe Lys Met300 305 310tgt ggc atc tgg atg ggt aac agt gcc tgt tcc ata caa tat gaa tgt 1014Cys Gly Ile Trp Met Gly Asn Ser Ala Cys Ser Ile Gln Tyr Glu Cys315 320 325aag cac acc aaa 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tca ctt act tcc ctt gaa aca tca tat ttt acc cca aaa 1398Asp Arg Ser Ser Leu Thr Ser Leu Glu Thr Ser Tyr Phe Thr Pro Lys445 450 455aag aga aag ctc ttt ggt aat aag aaa agg aag tcc ttc ttt ttg aga 1446Lys Arg Lys Leu Phe Gly Asn Lys Lys Arg Lys Ser Phe Phe Leu Arg460 465 470gag tct ggg aaa gac cag cct cct ggg tca gat tct gat gaa gat tgc 1494Glu Ser Gly Lys Asp Gln Pro Pro Gly Ser Asp Ser Asp Glu Asp Cys475 480 485caa aaa aag cca cag ctc cta gag caa acc aaa cga ctg tcc cag aat 1542Gln Lys Lys Pro Gln Leu Leu Glu Gln Thr Lys Arg Leu Ser Gln Asn490 495 500cta tca ctg gac cac ttt gat gag cat gga gat cct ctc caa agg cag 1590Leu Ser Leu Asp His Phe Asp Glu His Gly Asp Pro Leu Gln Arg Gln505 510 515 520aga gca ctg agt gct gtc agc atc ctc acc atc acc atg aag gaa caa 1638Arg Ala Leu Ser Ala Val Ser Ile Leu Thr Ile Thr Met Lys Glu Gln525 530 535gaa aaa tca caa gag cct tgt ctc cct tgt gga gaa aac ctg gca tcc 1686Glu Lys Ser Gln Glu Pro Cys Leu Pro Cys Gly Glu Asn Leu Ala Ser540 545 550aag tac ctc gtg tgg aac tgt tgc ccc cag tgg ctg tgc gtt aag aag 1734Lys Tyr Leu Val Trp Asn Cys Cys Pro Gln Trp Leu Cys Val Lys Lys555 560 565gtc ctg aga act gtg atg act gac ccg ttt act gag ctg gcc atc acc 1782Val Leu Arg Thr Val Met Thr Asp Pro Phe Thr Glu Leu Ala Ile Thr570 575 580atc tgc atc atc atc aac act gtc ttc ttg gcc atg gag cat cac aag 1830Ile Cys Ile Ile Ile Asn Thr Val Phe Leu Ala Met Glu His His Lys585 590 595 600atg gag gcc agt ttt gag aag atg ttg aat ata ggg aat ttg gtt ttc 1878Met Glu Ala Ser Phe Glu Lys Met Leu Asn Ile Gly Asn Leu Val Phe605 610 615act agc att ttt ata gca gaa atg tgc cta aaa atc att gcg ctc gat 1926Thr Ser Ile Phe Ile Ala Glu Met Cys Leu Lys Ile Ile Ala Leu Asp620 625 630ccc tac cac tac ttt cgc cga ggc tgg aac att ttt gac agc att gtt 1974Pro Tyr His Tyr Phe Arg Arg Gly Trp Asn Ile Phe Asp Ser Ile Val635 640 645gct ctt ctg agt ttt gca gat gta atg aac tgt gta ctt caa aag aga 2022Ala Leu Leu Ser Phe Ala Asp Val Met Asn Cys Val Leu Gln Lys Arg650 655 660agc tgg cca 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1.一種分離的核酸分子，其選自含SEQ ID NO41的核酸分子，編碼SEQ ID NO42的氨基酸序列的核酸分子，編碼SEQ ID NO42的等位變體的核酸分子，編碼與SEQ ID NO42有至少約76％之氨基酸序列同一性的人類蛋白的核酸分子，以及與前述序列的任一種在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸分子。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸，其中該核酸編碼優(yōu)先在背根神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)表達(dá)的電壓門控Na+通道。
3.權(quán)利要求2的分離的核酸，其中該核酸編碼人類NaN鈉通道。
4.一種表達(dá)載體，其僅包含權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的分離的核酸，或者還包含合適的調(diào)節(jié)和表達(dá)控制元件。
5.一種宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求4的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
6.一種Na+通道，其由權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的分離的核酸分子編碼。
7.權(quán)利要求6的Na+通道，其包含SEQ ID NO42的氨基酸序列。
8.一種分離的蛋白，其由SEQ ID NO42的氨基酸序列或其肽片段組成。
9.一種蛋白，其含有從權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞分離的膜片段。
10.一種鑒定能調(diào)節(jié)權(quán)利要求6所述Na+通道之活性的試劑的方法，包括使試劑與能在表面表達(dá)鈉通道的細(xì)胞接觸的步驟，和測量鈉流的任何相應(yīng)改變，膜電位的相應(yīng)改變或細(xì)胞內(nèi)Na+的改變的步驟。
11.權(quán)利要求10的方法，其中測量步驟可通過電壓鉗位測定或膜電位測定完成。
12.權(quán)利要求10的方法，其中通過測定細(xì)胞內(nèi)鈉水平完成測定步驟。
13.權(quán)利要求10的方法，其中通過測定鈉流入完成測定步驟。
14.權(quán)利要求13的方法，其中用22Na或86Rb測定鈉流。
15.一種鑒定能調(diào)節(jié)編碼權(quán)利要求6所述Na+通道的mRNA轉(zhuǎn)錄或翻譯的試劑的方法，包括使試劑與能在表面表達(dá)Na+通道的細(xì)胞接觸的步驟，以及測量由此所致的Na+通道表達(dá)水平的步驟。
16.一種通過給予有效量的試劑而在動物或人類受試者中治療疼痛，感覺異常和/或興奮性過高現(xiàn)象的方法，所述試劑能改變DRG或三叉神經(jīng)元中流經(jīng)NaN通道的Na+流。
17.一種通過給予有效量的試劑而在動物或人類受試者中治療疼痛，感覺異常和/或興奮性過高現(xiàn)象的方法，所述試劑能對編碼權(quán)利要求6所述Na+通道的mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯進(jìn)行調(diào)節(jié)。
18.一種分離的核酸，其是權(quán)利要求1所述核酸的反義核酸并且其長度足以調(diào)節(jié)包含NaN通道的mRNA的細(xì)胞中該通道的表達(dá)。
19.一種閃爍顯像術(shù)，其通過給藥特異性針對人類NaN Na+通道的經(jīng)標(biāo)記的單克隆抗體或其它經(jīng)標(biāo)記的特異性配體，而使動物或人類受試者中與DRG或三叉神經(jīng)元介導(dǎo)型興奮性過高相關(guān)的痛覺產(chǎn)生部位顯像或提供對該痛覺水平的測量。
20.一種鑒定能表達(dá)人類NaN鈉通道的組織，細(xì)胞或細(xì)胞類型的方法，包括檢測細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的人類NaN的步驟。
21.一種鑒定能表達(dá)人類NaN的組織，細(xì)胞或細(xì)胞類型的方法，包括檢測所述組織或細(xì)胞中編碼人類NaN之mRNA的存在的步驟。
22.一種產(chǎn)生能表達(dá)外源性NaN編碼核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，包括用含有權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述分離的核酸，以及適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)或表達(dá)控制元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞的步驟。
23.一種分離的抗體，它特異性針對人類NaN通道或該通道的多肽片段。
24.權(quán)利要求23的分離的抗體，其中此抗體被標(biāo)記。
25.一種產(chǎn)生重組NaN蛋白的方法，包括在能使NaN鈉通道或蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)化宿主的步驟。
26.一種治療組合物，其包含有效量的、能在經(jīng)過了軸突切開術(shù)的，發(fā)炎的或因其它原因而損傷的DRG神經(jīng)元上改變，例如增強(qiáng)或降低快速再啟動離子流的試劑。
27.一種治療方法，其通過給予權(quán)利要求26的治療組合物而治療動物或人類患者中的急性疼痛或者急性或慢性神經(jīng)性或炎性疼痛和興奮性過高現(xiàn)象。
28.一種篩選能用于治療疼痛和興奮性過高現(xiàn)象的待選化合物的方法，其通過檢驗(yàn)待測化合物上調(diào)或下調(diào)經(jīng)過了軸突切開術(shù)的，發(fā)炎的或因其它原因而損傷的DRG神經(jīng)元上NaN通道之mRNA的能力來篩選。
29.一種嵌合型NaN通道。
30.權(quán)利要求29的嵌合通道，其中至少一個(gè)人類結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被其它物種的NaN通道的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域取代。
31.權(quán)利要求30的嵌合通道，其中所述物種是大鼠或小鼠。
32.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求29至31中任一項(xiàng)的嵌合型NaN通道。
33.一種NaN通道蛋白，其在相當(dāng)于SEQ ID NO42中670位的位置上包含一個(gè)帶正電的氨基酸。
34.權(quán)利要求33的NaN通道蛋白，其中所述帶正電的氨基酸是精氨酸。
35.一種分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求33或34的通道蛋白。
36.權(quán)利要求26的治療組合物，進(jìn)一步包括至少一種能調(diào)節(jié)初級感覺神經(jīng)元中的通道的試劑。
37.權(quán)利要求36的治療組合物，其中所述組合物包含能調(diào)節(jié)NaN和選自PN1/hNE和SNS/PN3的至少一種通道的試劑。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種新的人類河豚毒耐受性鈉離子通道,以及分離的編碼此通道的核酸分子。本發(fā)明提供了對能調(diào)節(jié)流經(jīng)此通道的鈉離子流的藥物進(jìn)行鑒定的方法,以及相關(guān)的治療和診斷方法。
文檔編號A61K48/00GK1423658SQ00812828
公開日2003年6月11日 申請日期2000年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月16日
發(fā)明者薩萊曼·迪布－哈杰, 斯蒂芬·G·韋克斯曼 申請人:耶魯大學(xué)