專(zhuān)利名稱(chēng)：溶瘤腺病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腺病毒載體，以及用于生成和使用這些載體的方法。更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及在E1A和/或E4區(qū)啟動(dòng)子中包含突變和替代從而賦予顯著的腫瘤細(xì)胞特異性溶瘤活性的改良型腺病毒載體。
背景早在本世紀(jì)早期，病毒就已經(jīng)被用于治療癌癥。這種方法包括兩個(gè)部分第一，分離或生成在贅生性細(xì)胞中選擇性復(fù)制并選擇性殺死腫瘤細(xì)胞同時(shí)不傷害正常細(xì)胞的溶瘤病毒。研究人員最初使用野生型病毒，這種方法獲得了一些但有限的成功。在溶解腫瘤并減緩腫瘤生長(zhǎng)且很少或不損傷正常組織的同時(shí)，疾病進(jìn)程卻沒(méi)有顯著改變。參閱Smith等人，癌癥(Cancer)91211-1218，1956；W.A.Cassel等人，癌癥(Cancer)19863-868，1965；H.E.Webb等人，柳葉刀(Lancet)11206-1209，1966；S.Kenney和J.Pagano，國(guó)家癌癥協(xié)會(huì)會(huì)刊(J.Natl.Cancer Inst.)86(16)1185，1994。
最近，由于與野生型病毒應(yīng)用的有限功效有關(guān)的疾病復(fù)發(fā)，研究人員已經(jīng)開(kāi)始采取能夠以高劑量投遞、能夠在贅生性細(xì)胞而非正常細(xì)胞中復(fù)制的重組病毒。這些病毒自身是有效的溶瘤劑，而且經(jīng)改造能夠攜帶并表達(dá)增強(qiáng)病毒抗贅生物活性的轉(zhuǎn)基因。這類(lèi)病毒的范例是病毒基因組E1B區(qū)突變的腺病毒。參閱美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,677,178；J.R.Bischoff、D.H.Kim、A.Williams、C.Heise、S.Horn、M.Muna、L.Ng、J.A.Nye、A.Sampson-Johannes、A.Fattaey、和F.McCormick，科學(xué)(Science)274373-376，1996。
重要的是將含或不含用于治療癌癥的轉(zhuǎn)基因的復(fù)制型病毒與研究人員使用的第二種方法即表達(dá)轉(zhuǎn)基因的非復(fù)制型病毒區(qū)分開(kāi)來(lái)。在第二種方法中，病毒只作為投遞直接或間接負(fù)責(zé)殺死贅生性細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因的載體。這種方法已經(jīng)成為并將繼續(xù)作為使用病毒治療癌癥的主要方法。然而，它取得的成功有限，而且顯得不如復(fù)制型病毒有效。不過(guò)，已經(jīng)將外源基因插入E1區(qū)(參閱McGrory，病毒學(xué)(Virology)163614-617，1988)、E3區(qū)(參閱Hanke，病毒學(xué)(Virology)177437-444，1990；Bett，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)675911-5921，1993)，或者插入刪除E1區(qū)載體的E3區(qū)。
如上所述，為了避免正常組織受到高劑量病毒療法的損傷，優(yōu)選的是，病毒具有促進(jìn)其在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制由此增強(qiáng)溶瘤活性但對(duì)正常細(xì)胞基本上無(wú)害的突變。這種方法利用了下面的觀察結(jié)果控制正常細(xì)胞生長(zhǎng)的許多細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制在贅生性細(xì)胞中被滅活或喪失，而且病毒滅活這些相同生長(zhǎng)控制機(jī)制以促進(jìn)病毒復(fù)制。因而，滅活特定正常細(xì)胞生長(zhǎng)控制機(jī)制的病毒基因刪除或滅活將防止病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制，但是這些病毒將在缺乏特定生長(zhǎng)控制機(jī)制的贅生性細(xì)胞中復(fù)制并殺死這些腫瘤細(xì)胞。
例如，正常分裂中細(xì)胞瞬時(shí)缺乏在某些贅生性細(xì)胞中缺乏的并與其無(wú)限生長(zhǎng)有關(guān)的生長(zhǎng)控制機(jī)制，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤腫瘤抑制基因(RB)。成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤腫瘤抑制基因基因功能的喪失與多種類(lèi)型腫瘤的病因?qū)W有關(guān)。這種腫瘤抑制基因的產(chǎn)物，稱(chēng)為pRB或p105的105kD多肽，是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白。pRB多肽通過(guò)將細(xì)胞滯留在細(xì)胞周期的G1期來(lái)抑制細(xì)胞增殖。pRB蛋白質(zhì)是幾種DNA病毒癌蛋白的主要靶，包括腺病毒E1a、SV40大T抗原、和乳頭瘤病毒E7。這些病毒蛋白質(zhì)結(jié)合并滅活pRB，而滅活pRB的功能在促進(jìn)病毒復(fù)制中是重要的。pRB蛋白質(zhì)與涉及腺病毒E2基因和幾種細(xì)胞基因表達(dá)的E2F轉(zhuǎn)錄因子相互作用，并抑制這種轉(zhuǎn)錄因子的活性(Bagchi等人，細(xì)胞(Cell)651063，1991；Bandara等人，自然(Nature)351494，1991；Chellappan等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)894549，1992)。
腺病毒癌蛋白E1a破壞pRB/E2F復(fù)合物，從而導(dǎo)致E2F的激活。然而，缺乏足夠有功能的pRB來(lái)復(fù)合E2F的贅生性或正常分裂中細(xì)胞將不需要功能性癌蛋白(諸如E1a)的存在來(lái)?yè)碛修D(zhuǎn)錄活性E2F。因而認(rèn)為，缺乏復(fù)合RB能力但基本上保留其它必需復(fù)制功能的復(fù)制缺陷型腺病毒種類(lèi)將在RB功能缺陷的細(xì)胞(如正常分裂中細(xì)胞、對(duì)基本上刪除RB等位基因而言為純合子或雜合子的細(xì)胞、包含編碼基本上無(wú)功能的突變型RB蛋白質(zhì)的RB等位基因的細(xì)胞、包含導(dǎo)致RB蛋白質(zhì)功能缺失的突變的細(xì)胞)中展示復(fù)制表型，但是在不復(fù)制的非贅生性細(xì)胞中基本上不展示復(fù)制表型。這些復(fù)制缺陷型腺病毒種類(lèi)稱(chēng)為E1a-RB(-)復(fù)制缺陷型腺病毒。
將細(xì)胞群體(諸如混合細(xì)胞培養(yǎng)物或人類(lèi)癌癥患者)，其中包括包含贅生性細(xì)胞和分裂中正常細(xì)胞(二者都缺乏RB功能)的子群體和包含不分裂非贅生性細(xì)胞(表達(dá)基本上正常的RB功能)的子群體，在感染條件下(即適合腺病毒感染細(xì)胞群體的條件，通常是生理學(xué)條件)接觸包含感染劑量的E1a-RB(-)復(fù)制缺陷型腺病毒的組合物。這導(dǎo)致細(xì)胞群體受到E1a-RB(-)復(fù)制缺陷型腺病毒的感染。這一感染引起了復(fù)制表型在包含贅生性細(xì)胞和分裂中正常細(xì)胞(二者都缺乏RB功能，RB-細(xì)胞)的子群體的顯著部分細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)，但是不引起復(fù)制表型在包含不分裂贅生性細(xì)胞(具有基本上正常的RB功能)的子群體中顯著表達(dá)。復(fù)制表型在受感染RB-細(xì)胞(贅生性細(xì)胞或分裂中正常細(xì)胞)中的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，諸如通過(guò)致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)、細(xì)胞裂解、凋亡、等等，從而由細(xì)胞群體選擇性消除這些RB-細(xì)胞。參閱美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,801,029和5,972,706。
通常，適用于選擇性殺死RB-贅生性細(xì)胞的E1a-RB(-)復(fù)制缺陷型腺病毒構(gòu)建物包含可滅活E1a多肽有效結(jié)合RB蛋白質(zhì)的能力的突變(如刪除、替代、移碼)。這些滅活突變通常發(fā)生于E1a的CR1結(jié)構(gòu)域(Ad5中第30-85位氨基酸；第697-790位核苷酸)和/或CR2結(jié)構(gòu)域(Ad5中第120-139位氨基酸；第920-967位核苷酸)，它們涉及結(jié)合p105 RB蛋白質(zhì)和p107蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是，保留CR3結(jié)構(gòu)域(跨越第150-186位氨基酸)，作為截短型p289R多肽表達(dá)，并在腺病毒早期基因的反式激活中發(fā)揮功能。

圖1例示性描繪了E1a-289R多肽的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。
除了腺病毒E1a區(qū)中的改變，還希望通過(guò)構(gòu)建在轉(zhuǎn)錄活性E2F的控制下具有重要復(fù)制功能的病毒來(lái)增強(qiáng)對(duì)缺乏RB功能的贅生性細(xì)胞的病毒特異性殺傷。腺病毒復(fù)制周期包括兩個(gè)階段早期，在此階段4個(gè)轉(zhuǎn)錄單位E1、E2、E3、和E4表達(dá)；晚期，發(fā)生于病毒DNA復(fù)制開(kāi)始后，晚期轉(zhuǎn)錄本主要由主要晚期啟動(dòng)子(MLP)表達(dá)。晚期信使編碼大多數(shù)病毒結(jié)構(gòu)蛋白。E1、E2、和E4的基因產(chǎn)物負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、病毒DNA復(fù)制、以及其它病毒功能，而且是病毒生長(zhǎng)所必需的。參閱D.N.Halbert等人，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)56250-257，1985。
若能夠通過(guò)E2F反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄單位將涉及病毒復(fù)制的腺病毒區(qū)域置于E2F的控制下，這將提供可選擇性殺死缺乏RB功能的贅生性細(xì)胞而非正常細(xì)胞的增強(qiáng)型腺病毒。
作為背景，提供涉及腺病毒載體(在涉及病毒復(fù)制的區(qū)域中，包括E4區(qū)中具有改變)和E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子的下列參考文獻(xiàn)。
WO 98/091563，發(fā)明人Branton等人，呈現(xiàn)了將腺病毒E4蛋白質(zhì)用于誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法和組合物。
G-P.Gao等人描述了將包含E1和E4刪除的腺病毒載體用于指向肝臟的基因療法。參閱病毒學(xué)雜志(J.Virol.)，1996年12月，第8934-8943頁(yè)。
WO 98/46779描述了能夠表達(dá)包含經(jīng)修飾E4區(qū)但保留E4orf3的轉(zhuǎn)基因的某些腺病毒載體。
P.Yeh等人描述了最小E4功能單位在允許腺病毒E1和E4區(qū)有效雙重反式互補(bǔ)的293細(xì)胞中的表達(dá)。參閱P.Yeh等人，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)，1996年1月，第559-565頁(yè)。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,885,833描述了包含激活子序列、啟動(dòng)子模塊、和結(jié)構(gòu)基因的核酸構(gòu)建物。啟動(dòng)子模塊包含CHR區(qū)和可結(jié)合E2F家族蛋白質(zhì)的核酸序列。
Q.Wang等人在基因療法(Gene Ther.)2775-783，1995中描述了用于增殖缺乏E1和/或E4區(qū)的重組腺病毒載體的293包裝細(xì)胞系。為了避免親本293細(xì)胞中E1A基因產(chǎn)物的反式激活效應(yīng)以及E4基因的過(guò)度表達(dá)，用細(xì)胞可誘導(dǎo)激素基因啟動(dòng)子，小鼠α抑制素啟動(dòng)子，取代E4啟動(dòng)子。Krougliak和Graham描述了表達(dá)5型腺病毒的E1、E4、和pIX基因從而能夠互補(bǔ)復(fù)制這些區(qū)域缺陷的突變型腺病毒的細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)。參閱V.Krougliak和F.Graham，人類(lèi)基因療法(Human Gene Therapy)61575-1586，1995。B.Fang等人在病毒學(xué)雜志(J.Virol.)714798-4803，1997中描述了用合成GALA/VP16啟動(dòng)子取代E4啟動(dòng)子的復(fù)制缺陷型減毒腺病毒載體，該合成啟動(dòng)子可促進(jìn)腺病毒載體在穩(wěn)定表達(dá)GAL4/VP16反式激活子的293細(xì)胞中的包裝。通過(guò)刪除病毒的E1區(qū)使該病毒不能夠復(fù)制。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,670,488描述了刪除一個(gè)或多個(gè)E4開(kāi)放讀碼框但保留足夠在體外促進(jìn)病毒復(fù)制的E4序列、且將目的DNA序列可操作連接表達(dá)控制序列并插入腺病毒基因組中的腺病毒載體。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,882,877描述了刪除腺病毒基因組的E1、E2、E3、和E4區(qū)和晚期基因、且額外包含可操作連接表達(dá)控制序列的目的核酸的腺病毒載體。
WO 98/13508描述了使用可操作連接目的轉(zhuǎn)基因的E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子來(lái)選擇性靶向惡性細(xì)胞。
E.Neuman等人顯示了通過(guò)啟動(dòng)子內(nèi)的E2F DNA結(jié)合位點(diǎn)使得E2F-1基因的轉(zhuǎn)錄依賴(lài)細(xì)胞周期。參閱分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell Biol.)154660，1995。E.Neuman等人還顯示了人E2F1基因的結(jié)構(gòu)和部分基因組序列。參閱基因(Gene)173163-169，1996。
M.J.Parr等人顯示了由E2F反應(yīng)性腺病毒載體介導(dǎo)的腫瘤選擇性轉(zhuǎn)基因的體內(nèi)表達(dá)。參閱自然醫(yī)學(xué)(Nat.Med.)31145-1149，1996。P.D.Adams和Jr.W.G.Kaelin顯示了E2F的轉(zhuǎn)錄控制。參閱癌癥生物學(xué)研討會(huì)(Semin.Cancer Biol.)699-108，1995。
P.Hallenbeck等人描述了組織特異性復(fù)制的載體。這樣的一種載體是據(jù)稱(chēng)在靶組織中選擇性復(fù)制從而由載體本身或者由載體表達(dá)的異源基因產(chǎn)物提供治療性好處的腺病毒。在前一種情況中，組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操作連接載體復(fù)制必需基因的編碼區(qū)。描述了幾種編碼區(qū)，包括E1a、E1B、E2、和E4。參閱WO 96/17053和WO 96/17053。
Henderson等人在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,698,443中顯示了具有在前列腺細(xì)胞特異性反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄控制下的至少一種基因E1A、E1B、或E4的腺病毒載體。
顯然，病毒為治療癌癥提供了又一種方法。因此，在贅生性細(xì)胞中選擇性復(fù)制并殺死贅生性細(xì)胞的病毒將在針對(duì)癌癥的戰(zhàn)斗中成為醫(yī)師軍火庫(kù)中的無(wú)價(jià)武器。
發(fā)明概述本文描述的發(fā)明提供了重組腺病毒載體及其構(gòu)建方法，優(yōu)選能夠復(fù)制的腺病毒載體，它顯著的且選擇性殺死贅生性細(xì)胞而很少或不殺死非贅生性細(xì)胞，其中至少一個(gè)且優(yōu)選兩個(gè)控制立即早期基因表達(dá)的腺病毒啟動(dòng)子區(qū)被改變而除去了某些轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控起始位點(diǎn)，或者是被滅活，同時(shí)保留那些需要的或顯著促進(jìn)病毒復(fù)制的位點(diǎn)，并用腫瘤細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄單位替代除去的這些核苷酸調(diào)控起始位點(diǎn)，并任選用異源基因替代刪除的病毒基因。
本發(fā)明還提供了上文所述的重組病毒載體和方法，其中腺病毒啟動(dòng)子區(qū)域優(yōu)選是E1a和/或E4。
另一方面，本發(fā)明提供了腺病毒載體，它顯著的且選擇性殺死贅生性細(xì)胞而很少或不殺死非贅生性細(xì)胞，其中除去了某些E1a和E4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄核苷酸起始位點(diǎn)或是被滅活，并用腫瘤細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄單位進(jìn)行替代。
另一方面，本發(fā)明提供了腺病毒載體，它顯著的且選擇性殺死贅生性細(xì)胞而很少或不殺死非贅生性細(xì)胞，其中除去了至少某些E4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄核苷酸起始位點(diǎn)或是被滅活，同時(shí)保留那些促進(jìn)病毒復(fù)制的位點(diǎn)(包括Sp1、ATF、NF1、和NFIII/Oct-1結(jié)合位點(diǎn))，并用腫瘤細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄單位替代E4啟動(dòng)子核苷酸起始位點(diǎn)。
本發(fā)明的目的是描述上文所述的腺病毒載體，它除去了E1a和/或E4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄核苷酸起始位點(diǎn)，并用腫瘤細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄單位進(jìn)行替代，其中所述腺病毒載體還展示滅活E1a多肽有效結(jié)合RB蛋白質(zhì)的能力的突變(如刪除、替代、移碼)。
本發(fā)明的另一個(gè)特征包括用腫瘤細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄單位替代上文所述的E1a和/或E4啟動(dòng)子核苷酸起始序列，所述腫瘤細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄單位對(duì)pRb信號(hào)途徑有反應(yīng)性，包括pRb/p107、E2F-1/-2/-3、G1細(xì)胞周期蛋白/cdk復(fù)合物，優(yōu)選啟動(dòng)子是E2F反應(yīng)性的。
本發(fā)明還呈現(xiàn)了使用本文所述的腺病毒載體來(lái)預(yù)防或治療疾病的方法，優(yōu)選由細(xì)胞過(guò)度增殖性生長(zhǎng)引起的疾病，包括贅生性疾病。
圖的簡(jiǎn)述圖1示意性描繪了E1a-289R多肽的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。
圖2顯示了腺病毒E4啟動(dòng)子。
圖3圖解法顯示了本發(fā)明的E4穿梭載體和便于用選定的啟動(dòng)子替代E4啟動(dòng)子的限制性位點(diǎn)SpeI和XhoI的位置發(fā)明詳述將本申請(qǐng)書(shū)中提及的所有發(fā)表物(包括專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng))收入本文作為參考，就像明確的且個(gè)別的指出完整收入每一項(xiàng)單個(gè)發(fā)表物作為參考。
此外，重要的是要注意到，雖然本發(fā)明腺病毒載體的溶瘤活性要?dú)w功于涉及在pRb途徑中影響受E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子控制的病毒基因表達(dá)的分子的作用機(jī)制，但是不應(yīng)當(dāng)解釋為本發(fā)明受到這種機(jī)制的限制。更正確的說(shuō)，應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)到，本發(fā)明腺病毒載體的溶瘤活性是其中被認(rèn)為是但可能不是通過(guò)pRb途徑發(fā)揮溶瘤作用的結(jié)構(gòu)元件的功能。因而，本發(fā)明腺病毒載體通過(guò)具有至少一個(gè)驅(qū)動(dòng)E1a或E4基因表達(dá)的E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子來(lái)獲得其針對(duì)腫瘤細(xì)胞而非正常細(xì)胞的選擇性殺傷。如下所述，優(yōu)選的腺病毒載體具有兩個(gè)E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子，一個(gè)替代E1a啟動(dòng)子，另一個(gè)替代E4啟動(dòng)子。定義除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。一般而言，本文使用的命名法和下文描述的實(shí)驗(yàn)室流程在本領(lǐng)域是眾所周知的且常常采用的。
重組核酸方法、多核苷酸合成、和微生物培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。一般而言，酶促反應(yīng)和純化步驟是依照制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的。通常依照本領(lǐng)域和多種一般性參考文獻(xiàn)中的常規(guī)方法進(jìn)行各種技術(shù)和流程(通常參閱貫穿本文件所提供的Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，NY)。本文使用的命名法和下文描述的分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)、和制藥學(xué)配方的實(shí)驗(yàn)室流程在本領(lǐng)域是眾所周知的且常常采用的?；瘜W(xué)合成、化學(xué)分析、制藥學(xué)配方和投遞、以及患者的治療使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員還將認(rèn)可有助于遺傳改造本發(fā)明腺病毒以生成本發(fā)明的E1A和/或E4穿梭載體的發(fā)表物。這包括M.Hitt等人的工作，“人腺病毒載體的構(gòu)建和增殖”，在《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Cell BiologyA Laboratory Handbook)一書(shū)中，J.Celis編，Academic出版社，NY，1996；F.L.Graham和L.Prevec，“基于腺病毒的表達(dá)載體和重組疫苗”，在《疫苗解決免疫學(xué)問(wèn)題的新方法》(VaccinesNew Approaches toImmunological Problems)一書(shū)中，R.W.Ellis編，Butterworth，第363-390頁(yè)；和F.L.Graham和L.Prevec，“腺病毒載體的操作”，在《分子生物學(xué)方法》(Methods in Molecular Biology)一書(shū)第7卷“基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)技術(shù)”(Gene Transfer and Expression Techniques)中，E.J.Murray和J.M.Walker編，Humana出版公司，Clifton，NJ，第109-128頁(yè)，1991。這些文章中描述的材料和方法被用于或可用于下文。
在描繪選擇的本發(fā)明特定實(shí)施方案的公式中，雖然常常沒(méi)有具體顯示氨基和羧基末端基團(tuán)，但是應(yīng)當(dāng)理解為它們?cè)谏韺W(xué)pH值將采取的形式，除非另外說(shuō)明。本文描述的氨基酸殘基優(yōu)選“L”異構(gòu)體形式。20種常見(jiàn)氨基酸的立體異構(gòu)體(如D-氨基酸)、非天然氨基酸諸如α，α-分布的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、和其它非常見(jiàn)氨基酸也可能適用于作為本發(fā)明多肽的成份，只要多肽保留了期望的功能特性即可。對(duì)于顯示的多肽，適當(dāng)時(shí)每一個(gè)編碼殘基用符合常見(jiàn)氨基酸俗名并遵守標(biāo)準(zhǔn)多肽命名法的三字母符號(hào)表示(描述于生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2433552-3559，1969，并被37 CFR §1.822(b)(2)采用)。
在用于整篇公開(kāi)書(shū)時(shí)，除非另外指出，下列術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)理解為具有如下含義術(shù)語(yǔ)“滅活”在用于“腺病毒轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控位點(diǎn)”序列時(shí)，指通過(guò)突變使得這些序列沒(méi)有功能，包括刪除所有或部分序列，或者在腺病毒轉(zhuǎn)錄核苷酸序列中插入其它序列，使得它們沒(méi)有功能。
術(shù)語(yǔ)“腺病毒”在用于本文時(shí)指超過(guò)47種由人分離的腺病毒亞型，以及許多來(lái)自其它哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)的類(lèi)型。參閱Strauss，“人的腺病毒感染”，在《腺病毒》(Adenovirus)一書(shū)中，Ginsberg編，Plenum出版社，紐約，NY，第451-596頁(yè)，1984。該術(shù)語(yǔ)優(yōu)選用于兩種人亞型，Ad2和Ad5。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”在用于本文時(shí)指長(zhǎng)度為至少10個(gè)堿基的核苷酸多聚體形式，可以是核糖核苷酸或是脫氧核糖核苷酸或是這兩類(lèi)核苷酸的經(jīng)修飾形式。該術(shù)語(yǔ)包括DNA的單鏈和雙鏈形式。
術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”在用于本文時(shí)指通過(guò)天然發(fā)生的和非天然發(fā)生的寡核苷酸鍵連接在一起的天然和經(jīng)修飾的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的子集，長(zhǎng)度為200個(gè)堿基或更少。寡核苷酸的長(zhǎng)度優(yōu)選10-60個(gè)堿基。寡核苷酸通常是單鏈的，如探針；但是，寡核苷酸可以是雙鏈的，如用于構(gòu)建基因突變體。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義的或反義的寡核苷酸。
在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”或“經(jīng)標(biāo)記”指摻入可檢測(cè)標(biāo)記物，如摻入放射性標(biāo)記的氨基酸，或者使多肽附著可通過(guò)經(jīng)標(biāo)記親和素(如包含可通過(guò)光學(xué)或比色法檢測(cè)的熒光標(biāo)記物或酶促活性的鏈霉親和素)檢測(cè)的生物素基部分。本領(lǐng)域知道且可使用多種標(biāo)記多肽和糖蛋白的方法。
術(shù)語(yǔ)“腫瘤細(xì)胞特異性”在用于本發(fā)明腺病毒的殺傷選擇性時(shí)，指通過(guò)可操作連接E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子的病毒基因的表達(dá)而殺死腫瘤細(xì)胞?？紤]到E2F在正常細(xì)胞中，特別是分裂中的正常細(xì)胞內(nèi)也表達(dá)，預(yù)計(jì)本發(fā)明的腺病毒也將殺死分裂中的正常細(xì)胞，但是程度低于腫瘤細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“序列同源性”用于此處時(shí)描述兩種核酸序列之間匹配堿基的比率，或者兩種氨基酸序列之間匹配氨基酸的比率。在用百分比(如50％)表述序列同源性時(shí)，該百分比指與一些其它序列相比時(shí)序列全長(zhǎng)中的匹配比率。為了實(shí)現(xiàn)最大匹配可以允許缺口(兩種序列二者均可)；通常缺口長(zhǎng)度為15個(gè)堿基或更短，優(yōu)選6個(gè)堿基或更短，更優(yōu)選2個(gè)堿基或更短。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)”在用于本文時(shí)指多核苷酸序列與所有或部分的參考多核苷酸序列同源(即相同，而非嚴(yán)格的在進(jìn)化上相關(guān))，或者多肽序列與參考多肽序列相同。相反，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”在用于此處時(shí)指互補(bǔ)序列與所有或部分的參考多核苷酸序列同源。例如，核苷酸序列“TATAC”對(duì)應(yīng)參考序列“TATAC”，而與參考序列“GTATA”互補(bǔ)。
下列術(shù)語(yǔ)用于描述兩種或多種多核苷酸之間的序列相關(guān)性“參考序列”、“比較窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”、和“顯著同一性”?！皡⒖夹蛄小敝缸鳛樾蛄斜容^基礎(chǔ)使用的確定序列；參考序列可以是較大序列的子集，例如全長(zhǎng)cDNA的區(qū)段或序列表中給出的基因序列，可包含完整cDNA或基因序列。一般而言，參考序列的長(zhǎng)度是至少20個(gè)核苷酸，常常是至少25個(gè)核苷酸，常常是至少50個(gè)核苷酸。由于兩種核苷酸可各自(1)包含在兩種多核苷酸之間相似的序列(即完整多核苷酸序列的一部分)，且(2)還可包含在兩種多核苷酸之間不同的序列，因此通常在“比較窗”上比較兩種多核苷酸的序列以鑒定并比較局部區(qū)域的序列相似性，如此進(jìn)行兩種(或多種)多核苷酸之間的序列比較?！氨容^窗”在用于本文時(shí)指至少20個(gè)連續(xù)核苷酸位置的概念性區(qū)段，其中可以將多核苷酸序列與至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的參考序列進(jìn)行比較，其中為了達(dá)到兩種序列的最佳排列，比較窗中的多核苷酸序列部分與參考序列(不包含添加或刪除)相比可包含20％或更少的添加或刪除(即缺口)?？赏ㄟ^(guò)Smith和Waterman，應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展(Adv.Appl.Math.)2482，1981的局部同源性算法，通過(guò)Needleman和Wunsch，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48443，1970的同源性排列算法，通過(guò)Pearson和Lipman，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444，1988的相似性搜索法，通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行程序(威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics Software Package)第7.0版，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(Genetics Computer Group)，575 Science Dr.Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)，或者通過(guò)目測(cè)進(jìn)行序列的最佳排列，以排列出比較窗，并選擇由這多種方法產(chǎn)生的最佳排列(即導(dǎo)致比較窗有最高同源性百分比)。術(shù)語(yǔ)“序列同一性”指兩種多核苷酸序列在比較窗中是相同的(即基于核苷酸-核苷酸比較)。術(shù)語(yǔ)“序列同一性百分比”是通過(guò)在比較窗中比較兩種最佳排列序列而計(jì)算得到的，確定兩種序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(如A、T、C、G、U或I)的位置數(shù)目以得到匹配位置數(shù)目，將匹配位置數(shù)目除以比較窗中的總位置數(shù)目(即窗口大小)，并將結(jié)果乘以100而得到序列同一性百分比。術(shù)語(yǔ)“顯著同一性”在用于本文時(shí)指多核苷酸序列的特征，其中在至少20個(gè)核苷酸位置的比較窗中，通常在至少25-50個(gè)核苷酸的窗口中，與參考序列相比，多核苷酸包含具有至少85％序列同一性的序列，優(yōu)選至少90-95％序列同一性，更通常的是至少99％序列同一性，其中序列同一性百分比是通過(guò)在比較窗中比較參考序列與多核苷酸序列而計(jì)算得到的，所述多核苷酸包含的刪除或添加合計(jì)可占參考序列的20％或更少。參考序列可以是較大序列的子集。
重要的是要注意到，雖然本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是摻入人E2F-1啟動(dòng)子，但是具有“顯著同一性”的啟動(dòng)子意欲屬于E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子的定義范圍之內(nèi)。
在用于本文時(shí)，“基本上純的”指目標(biāo)種類(lèi)是組合物中存在的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)(即根據(jù)摩爾數(shù)，比組合物中任何其它個(gè)別種類(lèi)更豐富)，優(yōu)選是基本上純的部分，其中目標(biāo)種類(lèi)占組合物中存在的所有大分子種類(lèi)的至少大約50％(根據(jù)摩爾數(shù))。一般而言，基本上純的組合物將占組合物中存在的所有大分子種類(lèi)的超過(guò)大約80％，更優(yōu)選超過(guò)大約85％、90％、95％、和99％。更優(yōu)選的是，將目標(biāo)種類(lèi)純化至基本上均質(zhì)(通過(guò)常規(guī)檢測(cè)方法在組合物中檢測(cè)不到污染種類(lèi))，其中組合物基本上由單一大分子種類(lèi)構(gòu)成。
術(shù)語(yǔ)“多肽片段”或“肽片段”在用于本文時(shí)指具有氨基末端和/或羧基末端刪除但剩余氨基酸序列與推導(dǎo)的天然發(fā)生序列(例如來(lái)自全長(zhǎng)cDNA序列)的對(duì)應(yīng)位置相同的多肽。片段長(zhǎng)度通常為8-10個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少10-20個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選20-70個(gè)氨基酸。
術(shù)語(yǔ)“pRb途徑”或“pRb信號(hào)途徑”(至少部分)指影響pRb活性的分子，包括pRb/p107、E2F-1/-2/-3、和G1細(xì)胞周期蛋白/cdk復(fù)合物。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)到，當(dāng)前未知的分子也可屬于該定義。這些分子至少部分地通過(guò)E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)它們的生物學(xué)作用。
本文使用的其它化學(xué)術(shù)語(yǔ)依照本領(lǐng)域傳統(tǒng)用法，例如《McGraw-Hill化學(xué)術(shù)語(yǔ)字典》(McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms)，S.Parker編，1985，McGraw-Hill，舊金山，收入本文作為參考。
通過(guò)遺傳工程由克隆的基因生成蛋白質(zhì)是眾所周知的。參閱如授予Bell等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,761,371，第6列第3行至第9列第65行。因此，下文意欲討論本領(lǐng)域的一般概況，而非反映本領(lǐng)域的全面狀況。
如下文所述，考慮到本公開(kāi)書(shū)，可通過(guò)化學(xué)合成，通過(guò)篩選來(lái)自合適細(xì)胞或細(xì)胞系培養(yǎng)物的mRNA的反向轉(zhuǎn)錄本，通過(guò)篩選來(lái)自合適細(xì)胞的基因組文庫(kù)，或者通過(guò)這些流程的聯(lián)合，將編碼蛋白質(zhì)的DNA插入本發(fā)明的E1A和/或E4腺病毒構(gòu)建物。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是前體藥物活性酶編碼基因的表達(dá)，其中將這些基因摻入本發(fā)明腺病毒中不影響其復(fù)制能力的區(qū)域?？梢杂糜梢阎蛐蛄行畔⑸傻墓押塑账崽结樳M(jìn)行mRNA或基因組DNA的篩選?？梢杂每蓹z測(cè)基團(tuán)標(biāo)記探針。
或者，可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)流程來(lái)回收基因序列。參閱授予Mullis等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,683,195和授予Mullis的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,683,202。
載體是可復(fù)制的DNA構(gòu)建物，用于擴(kuò)增編碼期望蛋白質(zhì)的DNA和/或表達(dá)編碼蛋白質(zhì)的DNA。表達(dá)載體是其中編碼目的蛋白質(zhì)的DNA序列可操作連接能夠引起蛋白質(zhì)在合適宿主中表達(dá)的合適控制序列的可復(fù)制DNA構(gòu)建物。對(duì)這些控制序列的需要將隨選擇的宿主和選擇的轉(zhuǎn)化方法而變化。一般而言，控制序列包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、任選控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼合適mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。擴(kuò)增載體不需要表達(dá)控制區(qū)。所有需要是通常由復(fù)制起點(diǎn)賦予的在宿主中的復(fù)制能力，和便于識(shí)別轉(zhuǎn)化體的選擇基因。
當(dāng)DNA區(qū)域彼此功能相關(guān)時(shí)，則它們是可操作連接的。例如，若啟動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子可操作連接編碼序列；若核糖體結(jié)合位點(diǎn)所處位置使翻譯得以進(jìn)行，則核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作連接編碼序列。一般而言，可操作連接指毗鄰，在前導(dǎo)序列的情況中指毗鄰且符合讀碼框。在內(nèi)源腺病毒E1a和/或E4區(qū)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控起始位點(diǎn)被除去的那些情況中，本發(fā)明啟動(dòng)子的優(yōu)選實(shí)施方案是用直接或間接反應(yīng)pRb信號(hào)途徑分子(包括pRb/p107、E2F-1/-2/-3、G1細(xì)胞周期蛋白/cdk復(fù)合物)的腫瘤細(xì)胞特異性啟動(dòng)子進(jìn)行替代，優(yōu)選啟動(dòng)子是E2F反應(yīng)性的，更優(yōu)選的啟動(dòng)子是人E2F-1啟動(dòng)子。
反應(yīng)pRb信號(hào)途徑分子，指由在E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子控制下的病毒基因表達(dá)引起對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。
適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母細(xì)胞、或高等真核細(xì)胞。原核生物包括革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如大腸桿菌或芽孢桿菌。高等真核細(xì)胞包括已建立的哺乳動(dòng)物起源的細(xì)胞系，如下所述。例示性的宿主細(xì)胞是DH5α、大腸桿菌W3110(ATCC 27.325)、大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31.537)、和大腸桿菌294(ATCC 31.446)。
由多細(xì)胞生物體衍生的細(xì)胞培養(yǎng)物是用于重組蛋白合成的期望宿主。原則上，可使用任何高等真核細(xì)胞培養(yǎng)物，無(wú)論是來(lái)自脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物培養(yǎng)物。但是，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)中增殖這些細(xì)胞是常規(guī)流程。參閱《組織培養(yǎng)》(Tissue Culture)，Academic出版社，Kruse和Paterson編，1973。有用細(xì)胞系的范例是VERO和HeLa細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、和FL5.12、WI138、BHK、COS-7、CV、和MDCK細(xì)胞系。用于這些細(xì)胞的表達(dá)載體通常包含(如果需要)復(fù)制起點(diǎn)、位于待表達(dá)基因上游的啟動(dòng)子、連同核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)(若使用含內(nèi)含子的基因組DNA)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、和轉(zhuǎn)錄終止序列。
在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“復(fù)制缺陷型病毒”指優(yōu)先在支持病毒復(fù)制表型表達(dá)的預(yù)定細(xì)胞群體(如對(duì)pRb信號(hào)途徑分子有反應(yīng)性的腫瘤細(xì)胞)中抑制細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞裂解、或誘導(dǎo)凋亡(總起來(lái)說(shuō)就是殺傷)；而在不復(fù)制、不轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中基本上不能夠抑制細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞裂解、誘導(dǎo)凋亡、或表達(dá)復(fù)制表型的病毒。
術(shù)語(yǔ)“RB功能”指具有基本上正常水平的由RB基因編碼的多肽的特性(即相對(duì)于相同組織學(xué)類(lèi)型的非腫瘤細(xì)胞而言)，其中RB多肽能夠結(jié)合野生型2或5型腺病毒的E1a蛋白質(zhì)。例如，通過(guò)生成無(wú)活性(突變型)形式的RB，或者通過(guò)pRB多肽表達(dá)的顯著降低或完全喪失，或者通過(guò)pRb途徑中影響pRb水平的一種或多種分子的改變，可喪失RB功能?；蛘撸诒磉_(dá)時(shí)間和蛋白質(zhì)表達(dá)量方面，“RB功能”指在E2F反應(yīng)性、pRb途徑敏感性啟動(dòng)子控制下的基因的正常轉(zhuǎn)錄活性。
在包含編碼野生型RB蛋白質(zhì)的RB等位基因的贅生性細(xì)胞中可能基本上不存在RB功能；例如，RB基因座以外的遺傳改變，諸如導(dǎo)致異常亞細(xì)胞加工或RB定位的突變，或者pRb途徑分子可導(dǎo)致RB功能的喪失。
術(shù)語(yǔ)“復(fù)制表型”指受病毒(諸如復(fù)制缺陷型腺病毒)感染的細(xì)胞的一種或多種下列表型特征(1)由病毒晚期基因啟動(dòng)子起始的晚期基因產(chǎn)物的顯著表達(dá)，諸如衣殼蛋白(如腺病毒五鄰體基本多肽)或RNA轉(zhuǎn)錄本；(2)病毒基因組的復(fù)制或復(fù)制中間體的形成；(3)病毒衣殼或包裝后病毒體顆粒的裝配；(4)受感染細(xì)胞中致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的出現(xiàn)；(5)病毒裂解周期的完成；和(6)受編碼功能癌蛋白的能夠復(fù)制的野生型DNA病毒感染的非贅生性細(xì)胞中RB功能消除時(shí)通常可能發(fā)生的其它表型改變。復(fù)制表型包括至少一種上述表型特征，優(yōu)選超過(guò)一種表型特征。
術(shù)語(yǔ)“抗贅生物復(fù)制缺陷型病毒”在用于本文時(shí)指相對(duì)于受感染的不復(fù)制型非贅生性細(xì)胞而言?xún)?yōu)先殺死(或通過(guò)裂解或通過(guò)凋亡)受感染的贅生性細(xì)胞從而具有抑制人體內(nèi)贅生物發(fā)育或發(fā)展的功能特性的重組病毒，其中非贅生性細(xì)胞和贅生性細(xì)胞屬于相同組織學(xué)細(xì)胞類(lèi)型。
在用于本文時(shí)，“贅生性細(xì)胞”和“贅生物”指展示相對(duì)自主生長(zhǎng)從而展示特征為對(duì)細(xì)胞增殖的控制顯著喪失的異常生長(zhǎng)表型的細(xì)胞。贅生性細(xì)胞可包括活潑復(fù)制或暫時(shí)處于不復(fù)制的休眠期(G1或G0)的細(xì)胞；類(lèi)似的，贅生性細(xì)胞可包括具有良好分化表型的細(xì)胞、具有較差分化表型的細(xì)胞、或者這兩類(lèi)細(xì)胞的混合物。因此，并不是所有的贅生性細(xì)胞都必須是處于指定時(shí)間點(diǎn)的復(fù)制中細(xì)胞。定義為腫瘤細(xì)胞的集合由良性贅生物內(nèi)細(xì)胞和惡性(或坦率的)贅生物內(nèi)細(xì)胞構(gòu)成。坦率的贅生性細(xì)胞通常指腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞。一般而言，若源自?xún)?nèi)胚層或外胚層組織學(xué)來(lái)源的細(xì)胞，則稱(chēng)為癌；若源自由中胚層衍生的細(xì)胞類(lèi)型，則稱(chēng)為肉瘤。
在用于本文時(shí)，“生理學(xué)條件”指離子強(qiáng)度、pH、和溫度與完整哺乳動(dòng)物細(xì)胞中或者活的哺乳動(dòng)物的組織空間或器官中的條件基本上相似的水性環(huán)境。通常，生理學(xué)條件包括包含大約150mM NaCl(或任選KCl)、pH6.5-8.1、且溫度為大約20-45℃的水溶液。一般而言，生理學(xué)條件是適合于生物學(xué)大分子的分子間結(jié)合的合適結(jié)合條件。例如，150mM NaCl、pH7.4、37℃的生理學(xué)條件通常是合適的。
在應(yīng)用于E1a腺病毒載體時(shí)，本發(fā)明包括用展示腫瘤特異性的基本啟動(dòng)子，優(yōu)選E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子，更優(yōu)選人E2F-1啟動(dòng)子，取代基本的腺病毒E1a啟動(dòng)子，包括CAAT盒、TATA盒、和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。因此，該病毒將在缺乏激活E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的分子或這種分子沒(méi)有功能的細(xì)胞中受到抑制。正常的不分裂的或靜止的細(xì)胞屬于這一類(lèi)型，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合pRb或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)，由此使得E2F不能結(jié)合并激活E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子。相反，包含游離E2F的細(xì)胞將支持基于E2F的轉(zhuǎn)錄。這類(lèi)細(xì)胞的范例是缺乏pRb功能、允許生產(chǎn)性病毒感染發(fā)生的贅生性細(xì)胞。
增強(qiáng)子序列、包裝信號(hào)、和E1a啟動(dòng)子中DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的保留將確保腺病毒感染在缺乏pRb功能的贅生性細(xì)胞中達(dá)到野生型水平。本質(zhì)上，經(jīng)修飾E1a啟動(dòng)子賦予腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄激活，導(dǎo)致顯著的腫瘤特異性殺傷，而在正常細(xì)胞中提供增強(qiáng)的安全性。
在通過(guò)用E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子替代內(nèi)源E1a啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建E1a腺病毒載體的過(guò)程中，5型腺病毒基因組中第375位核苷酸上游的元件保持完整。核苷酸編號(hào)描述于S.I.Schmid和P.Hearing，在《微生物學(xué)和免疫學(xué)的當(dāng)前話(huà)題》(Current Topics in Microbiology and Immunology)一書(shū)中，第199卷，第67-80頁(yè)，1995。這包括經(jīng)鑒定用于包裝病毒基因組的所有7個(gè)A重復(fù)基序(參閱Schmid和Hearing(上文)的圖2)。通過(guò)BsaA1-BsrBI限制性起始位點(diǎn)，刪除了第375-536位核苷酸的序列，但仍保留了E1A蛋白質(zhì)翻譯起始密碼子上游的23個(gè)堿基對(duì)。使用已知材料和方法，用E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子，優(yōu)選人E2F-1啟動(dòng)子，替代刪除的內(nèi)源E1a啟動(dòng)子序列?？梢匀鐚?shí)施例1所述分離E2F-1啟動(dòng)子。
E4區(qū)涉及腺病毒感染晚期發(fā)生的許多事件，而且是有效病毒DNA復(fù)制、晚期mRNA積累和蛋白質(zhì)合成、剪接、以及宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的關(guān)閉所必需的。大部分E4轉(zhuǎn)錄單位缺陷的腺病毒是嚴(yán)重復(fù)制缺陷的，而且通常必須在E4互補(bǔ)性細(xì)胞系中增殖以達(dá)到高滴度。E4啟動(dòng)子位于病毒基因組右端附近，并控制多個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)的轉(zhuǎn)錄。在該啟動(dòng)子中已經(jīng)鑒定了對(duì)介導(dǎo)最大轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要的許多調(diào)控元件。除了這些序列以外，E4啟動(dòng)子區(qū)還包含病毒DNA復(fù)制所需要的調(diào)控序列。在圖2和圖3中可以看到E4啟動(dòng)子的描述和這些調(diào)控序列的位置。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是用經(jīng)證明顯示腫瘤特異性的啟動(dòng)子，優(yōu)選E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子，更優(yōu)選人E2F-1啟動(dòng)子，替代E4基本啟動(dòng)子的腺病毒載體的構(gòu)建。優(yōu)選用E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)E4表達(dá)的原因與上文“用E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子替代E1a啟動(dòng)子的E1a腺病毒載體”內(nèi)容中的討論相同。pRb的腫瘤抑制基因功能與它抑制E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子(諸如E2F-1啟動(dòng)子)的能力有關(guān)(P.D.Adams和Jr.W.G.Kaelin，癌癥生物學(xué)(Cancer Biol.)699-108，1995；W.R.Sellers和W.G.Kaelin，生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)1999年12月9日1288(3)E-1中的印刷錯(cuò)誤，生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(Biochim Biophys Acta)1288M1-5；W.R.Sellers、J.W.Rodgers、和Jr.W.G.Kaelin，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9211544-11548)。人E2F-1啟動(dòng)子已被深入鑒定，而且顯示反應(yīng)pRb信號(hào)途徑，包括pRb/p107、E2F-1/-2/-3、和G1細(xì)胞周期蛋白/cdk復(fù)合物、和E1A(D.G.Johnson、K.Ohtani、和J.R.Nevins，基因和發(fā)育(Genes Dev.)81514-1525，1994；E.Neuman、E.K.Flemington、W.R.Sellers、和Jr.W.G.Kaelin，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)154660，1994；E.Neuman、W.R.Sellers、J.A.McNeil、J.B.Lawrence、和Jr.W.G.Kaelin，基因(Gene)173163-169，1996)。這種調(diào)控的大部分(如果不是全部的話(huà))要?dú)w功于E2F-1啟動(dòng)子內(nèi)多個(gè)E2F位點(diǎn)的存在。因此，預(yù)計(jì)攜帶這種(這些)修飾的病毒在包含完整(野生型)pRb途徑的正常細(xì)胞中將被減毒，但在pRb抑制性功能缺陷的細(xì)胞中展示正常感染/復(fù)制特征。為了維持這種突變型病毒的正常感染/復(fù)制特征，我們?cè)贓4啟動(dòng)子的遠(yuǎn)端保留了末端反向重復(fù)片段(ITR)，因?yàn)樗《綝NA復(fù)制所需要的所有調(diào)控元件(L.Hatfield和P.Hearing，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)673931-3939，1993；D.R.Rawlins、P.J.Rosenfeld、R.J.Wides、M.D.Challberg、和Jr.T.J.Kelly，細(xì)胞(Cell)37309-319，1984；P.J.Rosenfeld、E.A.O’Neill、R.J.Wides、和T.J.Kelly，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)7875-886，1987；R.J.Wides、M.D.Challberg、D.R.Rawlins、和T.J.Kelly，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)7864-874，1987)。這有助于在受這種病毒感染的pRb途徑缺陷型腫瘤細(xì)胞中保留野生型水平的病毒。
在包含E4區(qū)的本發(fā)明腺病毒構(gòu)建物中，E4啟動(dòng)子優(yōu)選位于病毒基因組的右端附近，并控制多個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)的轉(zhuǎn)錄(G.A.Freyer、Y.Katoh、和R.J.Roberts，核酸研究(Nucleic Acids Res.)123503-3519，1984；M.A.Tigges和H.J.Raskas，“腺病毒-2早期區(qū)4mRNA中的剪接點(diǎn)多個(gè)剪接位點(diǎn)產(chǎn)生18-24種RNA”(Splice junctions inadenovirus 2 early region 4 mRNAsmultiple splice sites produce18 to 24 RNAs)，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)50106-117，1984；A.Virtanen、P.Gilardi、A.Naslund、J.M.LeMoullec、U.Pettersson、和M.Perricaudet，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)51822-831，1984)。在該啟動(dòng)子中已經(jīng)鑒定了介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性的許多調(diào)控元件(A.J.Berk，遺傳學(xué)年鑒(Annu.Rev.Genet.)2045-79，1986；P.Gilardi和M.Perricaudet，核酸研究(Nucleic Acids Res.)149035-9049，1986；P.Gilardi和M.Perricaudet，核酸研究(Nucleic Acids Res.)127877-7888，1984；S.Hanaka、T.Nishigaki、P.A.Sharp、和H.Handa，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)72578-2587，1987；C.Jones和K.A.Lee，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)114297-4305，1991；K.A.Lee和M.R.Green，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J.)61345-1353，1987)。除了這些序列以外，E4啟動(dòng)子區(qū)還包含涉及病毒DNA復(fù)制的元件(L.Hatfield和P.Hearing，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)673931-3939，1993；D.R.Rawlins、P.J.Rosenfeld、R.J.Wides、M.D.Challberg、和Jr.T.J.Kelly，細(xì)胞(Cell)37309-319，1984；P.J.Rosenfeld、E.A.O’Neill、R.J.Wides、和T.J.Kelly，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)7875-886，1987；R.J.Wides、M.D.Challberg、D.R.Rawlins、和T.J.Kelly，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)7864-874，1987)。在圖1和圖2中可以看到E4啟動(dòng)子的描述和這些調(diào)控序列的位置。還可參閱C.Jones和K.A.Lee，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)114297-4305，1991。出于這些考慮，設(shè)計(jì)了E4啟動(dòng)子穿梭載體生成兩個(gè)新的限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)，即位于第35,576位核苷酸的XhoI位點(diǎn)和位于第35,815位核苷酸的SpeI位點(diǎn)(見(jiàn)圖3)。用XhoI和SpeI二者消化可除去第35,581-35,817位核苷酸。這有效消除了相對(duì)于E4轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的第-208-+29位堿基，包括已顯示對(duì)E4轉(zhuǎn)錄影響最大的所有序列。具體而言，這涵蓋已證明對(duì)啟動(dòng)子激活具有最顯著影響的E4F結(jié)合位點(diǎn)的兩個(gè)反向重復(fù)片段。然而，保留了對(duì)病毒DNA復(fù)制至關(guān)重要的所有三個(gè)Sp1結(jié)合位點(diǎn)、五個(gè)ATF結(jié)合位點(diǎn)中的兩個(gè)、NF1和NFIII/Oct-1結(jié)合位點(diǎn)。同樣，可用保留相似功能的位點(diǎn)(如轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和TATA盒)替代除去的許多E4啟動(dòng)子元件，現(xiàn)在通過(guò)E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子位點(diǎn)賦予腫瘤細(xì)胞特異性。
優(yōu)選的E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子是人E2F-1啟動(dòng)子。已經(jīng)在體外和在體內(nèi)將E2F-1啟動(dòng)子中介導(dǎo)針對(duì)pRb途徑反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控元件作圖(D.G.Johnson、K.Ohtani、和J.R.Nevins，基因和發(fā)育(Genes Dev.)81514-1525，1994；E.Neuman、E.K.Flemington、W.R.Sellers、和Jr.W.G.Kaelin，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)154660，1994；M.J.Parr、Y.Manome、T.Tanaka、P.Wen、D.W.Kufe、Jr.W.G.Kaelin、和H.A.Fine，自然醫(yī)學(xué)(Nat.Med.)31145-1149，1997)。因而，我們使用摻入SpeI和XhoI位點(diǎn)的引物通過(guò)PCR分離相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的第-218-+51位堿基的人E2F-1啟動(dòng)子片段。由此生成了存在于E4啟動(dòng)子穿梭載體中的相同位點(diǎn)，從而能夠直接用E2F-1啟動(dòng)子替代E4啟動(dòng)子。實(shí)施例更詳細(xì)的描述了這種載體的構(gòu)建細(xì)節(jié)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是描述能夠快速且容易的用應(yīng)答pRb信號(hào)途徑元件(即分子，包括pRb/p107、E2F轉(zhuǎn)錄因子諸如E2F-1/-2/-3、和G1細(xì)胞周期蛋白/cdk復(fù)合物)的核苷酸轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列替代內(nèi)源核苷酸轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(優(yōu)選E1a和/或E4啟動(dòng)子序列)的腺病毒E1a和/或E4穿梭載體。如上所述，預(yù)計(jì)E1a或E4腺病毒載體在包含完整即野生型pRb途徑的正常細(xì)胞中將被減毒，但在pRb途徑功能(包括pRb抑制性功能)缺陷的細(xì)胞中展示正常感染特征。由于E2F-1啟動(dòng)子中自身調(diào)控性E2F位點(diǎn)的存在，用應(yīng)答pRb信號(hào)途徑元件的核苷酸轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列替代內(nèi)源E1a和/或E4序列的任何E1A或E4腺病毒載體，將優(yōu)選在E1A-CR2(保守區(qū)2)結(jié)構(gòu)域中具有第二種突變。希望這能夠使E1A破壞由pRb介導(dǎo)的對(duì)E2F元件的抑制的能力最小化。
如上所述，腺病毒癌蛋白E1a破壞pRB/E2F復(fù)合物，導(dǎo)致釋放并由此激活E2F。優(yōu)選的E1a和/或E4腺病毒穿梭載體構(gòu)建物是E1a中結(jié)合pRb并取代E2F的那些區(qū)域遭到突變的載體。因而，適合在生成本發(fā)明E1a和/或E4穿梭載體的本發(fā)明方法和組合物中使用的E1a-RB復(fù)制缺陷型腺病毒構(gòu)建物包括但不限于下列實(shí)例(1)腺病毒血清型5 NT dl 1010，其編碼缺乏有效結(jié)合RB所必需的CR1和CR2結(jié)構(gòu)域(刪除第2-150位氨基酸；第560-1009位核苷酸)但基本上保留CR3結(jié)構(gòu)域的E1a蛋白質(zhì)(Whyte等人，細(xì)胞(Cell)5667，1989)；和(2)腺病毒血清型5 dl 312，包含缺乏野生型腺病毒中編碼整個(gè)E1a區(qū)的跨越第448-1349位核苷酸的區(qū)域的刪除型病毒基因組(N.Jones和T.Shenk，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)763665，1979)。Ad5 NT dl 1010是優(yōu)選的E1a-RB復(fù)制缺陷型腺病毒，可由E.Harlow博士處獲得(Massachusetts GeneralHospital，波士頓，MA)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可如下構(gòu)建缺乏RB結(jié)合能力(E1a(-))的其它E1a突變體在編碼E1a多肽的E1a基因區(qū)中、通常是CR1和/或CR2結(jié)構(gòu)域中生成突變，表達(dá)突變型E1a多肽，在水性結(jié)合條件下使突變型E1a多肽接觸p105或RB結(jié)合片段，并將不特異性結(jié)合RB的突變型E1a多肽鑒定為適用于本發(fā)明的候選E1a(-)突變體。其它測(cè)定法包括在水性結(jié)合條件下使突變型E1a多肽接觸300kD蛋白質(zhì)和/或p107蛋白質(zhì)或其結(jié)合片段，并將不特異性結(jié)合300kD和/或p107多肽的突變型E1a多肽鑒定為適合在本發(fā)明中用于生成E1a和/或E4穿梭載體的候選E1a(-)突變體。其它結(jié)合測(cè)定法包括確定E1a(-)突變體蛋白質(zhì)不能夠(或者不存在E1a蛋白質(zhì))在生理學(xué)條件下與轉(zhuǎn)錄因子E2F形成復(fù)合物和/或由RBE2F復(fù)合物解離RB蛋白質(zhì)(Chellappan等人，1991，見(jiàn)上文)。
或者，可使用確定突變體缺乏E1a功能的功能測(cè)定法，諸如喪失E1a對(duì)連接E1a依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的多種報(bào)告多肽轉(zhuǎn)錄的反式激活，等等。這些滅活突變通常發(fā)生于涉及結(jié)合p105 RB蛋白質(zhì)和p107蛋白質(zhì)的E1aCR1結(jié)構(gòu)域(Ad5中的第30-85位氨基酸；第697-790位核苷酸)和/或CR2結(jié)構(gòu)域(Ad5中的第120-139位氨基酸；第920-967位核苷酸)中。優(yōu)選的是，保留CR3結(jié)構(gòu)域(跨越第150-186位氨基酸)，其作為截短型p289R多肽表達(dá)，并在腺病毒早期基因的反式激活中發(fā)揮功能。
重要的是要注意到，E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子人E2F-1是用于取代E1a和/或E4內(nèi)源啟動(dòng)子的優(yōu)選啟動(dòng)子，而且被pRb途徑元件直接或間接激活的任何E2F反應(yīng)性核苷酸序列將適用于替代內(nèi)源啟動(dòng)子。
重要的是還要注意到，在E1a和/或E4腺病毒載體的構(gòu)建包括除去某些轉(zhuǎn)錄核苷酸起始位點(diǎn)時(shí)，不應(yīng)當(dāng)將除去的或保留的這些位點(diǎn)的準(zhǔn)確數(shù)目解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。描述本發(fā)明的目的是，在內(nèi)源啟動(dòng)子的位置，E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子發(fā)揮驅(qū)動(dòng)E1a和/或E4基因殺死腫瘤細(xì)胞的功能。這個(gè)過(guò)程的程度將隨E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子中存在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的數(shù)目或類(lèi)型而變化。
重要的是要注意到，雖然本文描述的發(fā)明是關(guān)于腺病毒和E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子，但是本發(fā)明不限于腺病毒。事實(shí)上，本領(lǐng)域熟練從業(yè)人員將認(rèn)可可應(yīng)用于展示與腺病毒相似生活史的事實(shí)上所有病毒，即可以摻入E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子來(lái)控制某些基因的表達(dá)，從而賦予這些病毒以選擇性腫瘤細(xì)胞殺傷。發(fā)明用途如上所述，本發(fā)明的腺病毒可用于治療pRb途徑功能發(fā)生改變的疾病。另外，本發(fā)明的腺病毒療法可以聯(lián)合其它抗腫瘤方案(諸如常規(guī)化療)或其它病毒。參閱美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,677,178?？赏ㄟ^(guò)熟練從業(yè)人員眾所周知的方法施用化療，包括全身性直接注射到癌中，或者，通過(guò)將期望的化療劑與合適的緩釋材料相聯(lián)合或動(dòng)脈內(nèi)灌注腫瘤而局限于癌癥位點(diǎn)。優(yōu)選的化療劑是順鉑，優(yōu)選的劑量可由從業(yè)人員根據(jù)待治療癌癥的本質(zhì)和在施用順鉑時(shí)常規(guī)考慮的其它因素進(jìn)行選擇。優(yōu)選的是，以3-6小時(shí)50-120mg/m2的劑量靜脈內(nèi)施用順鉑。更優(yōu)選的是，以4小時(shí)80mg/m2的劑量靜脈內(nèi)施用順鉑。優(yōu)選與順鉑聯(lián)合施用的第二種化療劑是5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶的優(yōu)選劑量是每天800-1200mg/m2，連續(xù)5天。
使用本發(fā)明腺病毒的腺病毒療法可聯(lián)合其它抗腫瘤方案，諸如基因療法。參閱美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,648,478。如上所述，用于本發(fā)明的腺病毒構(gòu)建物將展示特異性癌細(xì)胞殺傷。這些構(gòu)建物還可具有在存在合適藥物前體時(shí)增強(qiáng)本發(fā)明E1a和/或E4病毒載體的抗腫瘤效果的藥物前體激活劑基因，包括胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶、等。參閱美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,631,236。
同樣，在本發(fā)明腺病毒突變體在動(dòng)物宿主中引發(fā)抑制其效果的免疫反應(yīng)的情況下，可將它們與合適的免疫抑制藥物一起進(jìn)行施用，使其效果最大化?；蛘撸嬖诙喾N方法可修飾腺病毒的外部蛋白質(zhì)外殼而生成免疫原性較低的病毒。參閱PCT/US98/0503，它顯示了可對(duì)腺病毒外部外殼的主要免疫原性成分六鄰體蛋白質(zhì)進(jìn)行遺傳工程改造以降低免疫原性。這是如下進(jìn)行的，用正常不存在于正常六鄰體蛋白質(zhì)中的氨基酸序列替代正常病毒六鄰體蛋白質(zhì)表位而生成嵌合六鄰體蛋白質(zhì)。這些腺病毒構(gòu)建物的免疫原性低于野生型病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是在E1a和/或E4穿梭載體中(優(yōu)選病毒的E1B、E3區(qū))摻入異源基因。這些編碼生物學(xué)活性肽的異源基因或其片段的范例包括編碼免疫調(diào)控蛋白質(zhì)和上文所述的藥物前體激活劑(即胞嘧啶脫氨酶、胸苷激酶、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,358,866、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,677,178)的基因。前者的范例包括白介素-2，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,738,927或5,641,665；白介素-7，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,965,195或5,328,988；和白介素-12，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,457,038；腫瘤壞死因子-α，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,677,063或5,773,582；干擾素-γ，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,727,138或4,762,791；或GM-CSF，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,393,870或5,391,485。其它免疫調(diào)控蛋白質(zhì)還包括巨噬細(xì)胞炎性蛋白，包括MIP-3(參閱T.N.Well和M.C.Peitsch，白細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Leukoc.Biol.)61(5)545-550，1997)，和細(xì)胞自殺或凋亡誘導(dǎo)蛋白，包括BAD和BAX(參閱E.Yang等人，細(xì)胞(Cell)80285-291，1995；和R.Sandeep等人，細(xì)胞(Cell)91231-241，1997)。還可使用單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-3α)。異源基因的優(yōu)選實(shí)施方案是由編碼穿越細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)的基因(例如VP22或TAT)融合編碼優(yōu)先毒害癌細(xì)胞而非正常細(xì)胞的蛋白質(zhì)的基因而構(gòu)成的嵌合基因。
為了提高本發(fā)明腺病毒E1A突變體構(gòu)建物的功效，可對(duì)它們進(jìn)行修飾以展示對(duì)特定腫瘤細(xì)胞類(lèi)型有增強(qiáng)的向性。例如，如PCT/US98/04964中所示，可對(duì)腺病毒外部衣殼上的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾以展示化學(xué)試劑，優(yōu)選多肽，它結(jié)合腫瘤細(xì)胞上存在的受體，結(jié)合程度高于正常細(xì)胞。還可參閱美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,770,442和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,712,136。多肽可以是抗體，優(yōu)選單鏈抗體。腺病毒突變體的純化通過(guò)許多技術(shù)可常規(guī)純化腺病毒，包括使用超速離心的氯化銫條帶。然而，對(duì)于腺病毒的大規(guī)模生產(chǎn)，比通過(guò)氯化銫超速離心易于達(dá)到的產(chǎn)率具有更高產(chǎn)率的方法較為理想，可包括一次或多次層析步驟。優(yōu)選方法利用離子交換層析。參閱例如PCT/US97/21504；和Huyghe等人，人基因療法(Human Gene Therapy)61403-1416，1996。配方可配制腺病毒(包括腺病毒突變體)從而治療性和診斷性施用于患者。對(duì)于治療性或預(yù)防性用途，將包含制藥學(xué)有效劑量的腺病毒的無(wú)菌組合物施用于人類(lèi)患者或獸醫(yī)的非人患者，用于治療例如腫瘤狀況。一般而言，組合物將在水性懸浮液中包含大約103-1015個(gè)或更多腺病毒顆粒。在這些無(wú)菌組合物中常常采用制藥學(xué)可接受載體或賦形劑。可使用多種水性溶液，如水、緩沖水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸、等。這些溶液是無(wú)菌的，而且通常不含除了期望腺病毒載體以外的微粒物質(zhì)。根據(jù)合適生理學(xué)條件的要求，諸如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑、等，組合物可包含制藥學(xué)可接受的輔助性物質(zhì)，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、等?？砂鰪?qiáng)腺病毒感染細(xì)胞的賦形劑。
還可以通過(guò)脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體投遞將本發(fā)明的腺病毒或其中所含的DNA投遞至腫瘤細(xì)胞，這種投遞可根據(jù)腫瘤細(xì)胞群體上存在的細(xì)胞表面特性(如可結(jié)合免疫脂質(zhì)體中免疫球蛋白的細(xì)胞表面蛋白的存在)而選擇性靶向腫瘤細(xì)胞。通常，將包含病毒體的水性懸浮液包裹在脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體中。例如，可通過(guò)常規(guī)方法將腺病毒病毒體的懸浮液包裹在微團(tuán)中形成免疫脂質(zhì)體(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,043,164；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,957,735；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,925,661；Connor和Huang，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)101582，1985；D.D.Lasic，自然(Nature)355279，1992；《新型藥物投遞》(Novel Drug Delivery)，L.F.Prescott和W.S.Nimmo編，Wiley，紐約，1989；Reddy等人，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1481585，1992)。包含可特異性結(jié)合個(gè)體癌細(xì)胞上存在的癌細(xì)胞抗原(如CALLA、CEA)的抗體的免疫脂質(zhì)體可用于將病毒體或病毒體DNA靶向那些細(xì)胞。
可施用包含本發(fā)明腺病毒或其混合物的組合物，以用于腫瘤疾病的預(yù)防性和/或治療性處理。在治療性應(yīng)用中，以足以治愈或至少部分抑制狀況及其并發(fā)癥的量，將組合物施用于早已患有特定腫瘤疾病的患者。將足以實(shí)現(xiàn)該目的的量定義為“治療有效劑量”或“有效劑量”。對(duì)這種用途有效的量將取決于狀況的嚴(yán)重程度、患者的全面狀況、和施用路徑。
在預(yù)防性應(yīng)用中，將包含本發(fā)明腺病毒或其混合物的組合物施用于目前不處于腫瘤疾病狀況的患者，以增強(qiáng)患者對(duì)癌癥復(fù)發(fā)的抵抗力或延長(zhǎng)緩解時(shí)間。將這種量定義為“預(yù)防有效劑量”。在這種用途中，精確量同樣取決于患者的健康狀況和免疫力的全面水平。
實(shí)施例實(shí)施例1E2F-1E4腺病毒載體的構(gòu)建由Patrick Hearing處獲得重組質(zhì)粒pAd75-100(14)，其在pBR322的EcoRI和BamHI位點(diǎn)之間包含病毒基因組中位于75.9m.u.(圖距單位)處的EcoRI位點(diǎn)至位于100m.u.處的右端(BamHI接頭位于100m.u.處)的Ad5dl309片段。將這種EcoRI-BamHI片段定向亞克隆到Litmus28(New EnglandBiolabs)中，產(chǎn)生了L28p75-100.dl309。用來(lái)自pAd5-SN(描述于美國(guó)專(zhuān)利流水號(hào)09/347,604中，未發(fā)表的內(nèi)部載體)的野生型NotI-NdeI片段(Ad5核苷酸第29,510-31,089位)取代L28p75-100.dl309中的NotI-NdeI片段，從而恢復(fù)了dl309中缺失的野生型Ad5 E3序列(Ad5核苷酸第30,005-30,750位)。將產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為L(zhǎng)28p75-100.wt。為了生成啟動(dòng)子穿梭，構(gòu)建了略微更小的載體作為誘變模板。將來(lái)自pAD75-100的EcoRI-BamHI片段(Ad5核苷酸第33758-33939)直接亞克隆到pKSII+中，構(gòu)建了質(zhì)粒pKSII+p94-100。使用Stratagene的Quickchange定點(diǎn)誘變方法，產(chǎn)生了位于第35,577位核苷酸的XhoI位點(diǎn)和位于第35,816位的SpeI位點(diǎn)。用于生成這些位點(diǎn)的寡核苷酸是XhoI(5’-GCTGGTGCCGTCTCGAGTGGTGTTTTTTTAATAGG-3’及其互補(bǔ)物5’-CCTATTAAAAAAACACCACTCGAGACGGCACCAGC-3’)和SpeI(5’-GGGCGGAGTAACTAGTATGTGTTGGG-3’及其互補(bǔ)物5’-CCCAACACATACTAGTTACTCCGCCC-3’)。將包含XhoI和SpeI兩種限制性位點(diǎn)的這種載體命名為pKSII+E4PSV。由于在pKSII+主鏈中存在XhoI和SpeI兩種位點(diǎn)，通過(guò)PvuII和BamHI位點(diǎn)將來(lái)自pKSII+E4PSV的EcoRV-BamHI片段亞克隆到pRSET(Invitrogen)中，并命名為pRSETE4PSV。在ABI自動(dòng)化測(cè)序儀上通過(guò)雙鏈序列分析確認(rèn)了所有載體和點(diǎn)突變。
通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由模板pGL3E2F-1(-242)和pGL3E2F-1ΔE2F(-242)分離人E2F-1啟動(dòng)子。pGL3E2F-1(-242)包含野生型人E2F-1啟動(dòng)子向外直至相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的第-242位。pGL3E2F-1ΔE2F(-242)包含相同序列，但是兩個(gè)E2F結(jié)合位點(diǎn)回文序列都包含滅活性點(diǎn)突變。用于PCR的引物是SpeI-E2F1P(5’-GTGAGCACTAGTCGCCTGGTACCATCCGGACAAAGCC-3’)和XhoI-E2F1P(5’-GTGAGCCTCGAGCTCGATCCCGCTCCGCCCCCGG-3’)。使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)對(duì)100ng模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件如下最初的變性98℃ 5min；隨后30個(gè)循環(huán)，98℃變性1min，68℃退火/引物延伸1min；最后68℃引物延伸5min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行Qiagen純化，XhoI和SpeI消化，凝膠純化，并連接到經(jīng)XhoI和SpeI消化的pRSETE4PSV中。將這些啟動(dòng)子穿梭載體命名為E2F1-E4PSV和E2F1Δ-E4PSV，它們攜帶相對(duì)于人E2F1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的第-218位至第+51位的序列。將來(lái)自E2F1-E4PSV和E2F1Δ-E4PSV的BstEII-BamHI片段亞克隆到經(jīng)相同酶消化的L28p75-100.dl309和L28p75-100.wt中，產(chǎn)生了用于生成功能性病毒的最終載體。將這些載體命名為E2F1-E4PSV.309、E2F1-E4PSV.wt、E2F1Δ-E4PSV.309、和E2F1Δ-E4PSV.wt。如上所述，通過(guò)雙鏈序列分析確認(rèn)了所有載體。實(shí)施例2E2F1-E4腺病毒的構(gòu)建取10μg E2F1-E4PSV.309進(jìn)行EcoRI和BamHI消化，小牛腸磷酸酶處理，并凝膠純化。取1μg經(jīng)EcoRI消化的dl922/47 TP-DNA和約5μg經(jīng)純化的片段(包含驅(qū)動(dòng)E4區(qū)的野生型E2F-1啟動(dòng)子)于16℃連接過(guò)夜。使用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。簡(jiǎn)而言之，將連接后的DNA與24μg鮭魚(yú)精DNA、50μl 2.5M CaCl2混合，并用H2O調(diào)至終體積500μl。將該溶液逐滴加到500μl Hepes緩沖液(pH7.05)中。靜置25分鐘后，將沉淀逐滴加到兩個(gè)60mm板中，板上293細(xì)胞已經(jīng)在添加10％胎牛血清(FBS)的DMEM中生長(zhǎng)至60-80％匯合。16小時(shí)后，用磷酸緩沖液(無(wú)鈣和鎂)清洗細(xì)胞單層一次，隨后是5ml瓊脂上層(在添加2％ FBS的DMEM中含1％ Seaplaque瓊脂糖)。每3-4天用3-4ml上述瓊脂上層覆蓋板，直至分離得到噬斑。實(shí)施例3E2F1-E4病毒的增殖和確認(rèn)用巴氏滴管分離初級(jí)噬斑，并在6孔板中在2ml添加2％ FBS的DMEM中在293細(xì)胞上增殖，直至完成致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。留出十分之一(200ml)的病毒上清液用于DNA分析，剩余物裝在冷凍管中保存于-80℃。使用Qiagen的血液試劑盒依照其建議分離DNA。通過(guò)PCR對(duì)十分之一的這種材料篩選期望突變的存在，所用引物如下用于dl922/47(5’-GCTAGGATCCGAAGGGATTGACTTACTCACT-3’和5’-GCTAGAATTCCTCTTCATCCTCGTCGTCACT-3’)，用于E4區(qū)中的E2F-1啟動(dòng)子(5’-GGTGACGTAGGTTTTAGGGC-3’和5’-GCCATAACAGTCAGCCTTACC-3’)。使用Clontech高級(jí)cDNA PCR試劑盒在Perkin Elmer 9600設(shè)備中進(jìn)行PCR，條件如下最初的變性98℃ 5min；隨后30個(gè)循環(huán)，變性98℃ 1min，退火/引物延伸68℃ 3min；最后引物延伸68℃ 5min。隨后通過(guò)序列分析確認(rèn)(通過(guò)PCR測(cè)定的)陽(yáng)性噬斑。將上述PCR產(chǎn)物凝膠純化，并用相同引物測(cè)序。然后如上所述將陽(yáng)性噬斑進(jìn)行第二輪噬斑純化和確認(rèn)。在293細(xì)胞中增殖病毒，并通過(guò)兩輪氯化銫梯度超速離心進(jìn)行純化。實(shí)施例4E2F1-E1a和E2F1-E1a/E2F1-E4載體的構(gòu)建通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，由模板pGL3E2F-1(-242)和pGL3E2F-1ΔE2F(-242)分離人E2F-1啟動(dòng)子。pGL3E2F-1(-242)包含野生型人E2F-1啟動(dòng)子向外直至相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的第-242位。pGL3E2F-1ΔE2F(-242)包含相同序列，但是兩個(gè)E2F結(jié)合位點(diǎn)回文序列都包含滅活性點(diǎn)突變。用于PCR的引物是BamHI-E2F1P(5’-GTGAGCGGATCCGCTCGATCCCGCTCCGCCCCCGG-3’)和HindIII-E2F1P(5’-GTGAGCAAGCTTCGCCTGGTACCATCCGGACAAAGCC-3’)。使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)對(duì)100ng模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件如下最初的變性98℃ 5min；隨后30個(gè)循環(huán)，變性98℃ 1min，退火/引物延伸68℃1min；最后的引物延伸68℃ 5min。將PCR產(chǎn)物用Qiaquick柱(Qiagen)進(jìn)行純化，BamHI和HindIII消化，凝膠純化，并連接到經(jīng)BamHI和HindIII部分消化的p922/47-SV(見(jiàn)下文)中。將這些啟動(dòng)子穿梭載體命名為E2F1wt-922/47.PSV和E2F1Δ-922/47.PSV，它們攜帶相對(duì)于人E2F1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的第-218位至第+51位的序列。在ABI自動(dòng)化測(cè)序儀上通過(guò)雙鏈序列分析確認(rèn)了所有載體。
p922/47-SV是E1A啟動(dòng)子穿梭載體，其中還包含第922-947位核苷酸的E1A-CR2刪除。質(zhì)粒p922/47-SV是如下構(gòu)建的首先用HindIII消化pSP64(Promega)，用Klenow DNA聚合酶補(bǔ)平，重新連接，產(chǎn)生pSP64ΔH3。然后將來(lái)自pXC1(Microbix)的1,737bp EcoRI-XbaI片段(包含Ad5和pBR322二者的DNA)連接到經(jīng)EcoRI和XbaI消化的pSP64ΔH3中，產(chǎn)生pSP64-RI/Xba。然后用HindIII和BamHI消化pSP64-RI/Xba，用Klenow DNA聚合酶補(bǔ)平，重新連接，產(chǎn)生pΔE1Δ+。這種分子內(nèi)刪除除去了pXC1質(zhì)粒第9529-9875位的序列，從而有效除去了HindIII、BamHI、和ClaI位點(diǎn)。然后用BsAaI消化pΔE1Δ，并連接HindIII接頭(NEB)在Ad5第376位核苷酸處生成了新的HindIII位點(diǎn)，由此產(chǎn)生了pΔE1Δ+H。然后通過(guò)PCR誘變?cè)贏d5第539位核苷酸處生成新的BamHI位點(diǎn)。進(jìn)行了兩個(gè)初級(jí)PCR反應(yīng)。一個(gè)PCR反應(yīng)以pΔE1Δ+H作為模板，引物是5’EcoXC1(5’-CGCGGAATTCTTTTGGATTGAAGCCAATATG-3’)和3’Bam(5’-CAGTCCCGGTGTCGGATCCGCTCGGAGGAG-3’)；另一個(gè)PCR反應(yīng)以質(zhì)粒pXC1(Microbix)作為模板，引物是Bsr-Bam(5’-CTCCTCCGAGCGGATCCGACACCGGGACTG-3’)和3’E1A.Xba(5’-GCGGGACCACCGGGTGTATCTCAGGAGGTG-3’)。在瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，并使用Qiagen凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化。然后混合兩種PCR產(chǎn)物，并使用最外部的引物5’EcoXC1和3’E1A.Xba重復(fù)PCR。然后用EcoRI和XbaI消化產(chǎn)生的約1,400bp PCR產(chǎn)物，并連接到經(jīng)EcoRI和XbaI消化的pΔE1Δ+H中，產(chǎn)生pΔE1Δ+H+B。然后用EcoRI和XbaI消化pΔE1Δ+H+B，并將1,393bp片段連接到經(jīng)EcoRI和XbaI消化的pXC1(Microbix)中，由此產(chǎn)生了pXC1-SV。最后，以pCIA-922/47(由Peter White提供)作為模板，通過(guò)PCR產(chǎn)生了p922/47-SV，所用引物如下Bsr-Bam(5’-CTCCTCCGAGCGGATCCGACACCGGGACTG-3’)和3’E1A.Xba(5’-GCATTCTCTAGACACAGGTG-3’)。將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用Qiagen的Qiaquick柱進(jìn)行純化，BamHI和XbaI消化，隨后連接到經(jīng)BamHI和XbaI消化的pXC1-SV中。實(shí)施例5E2F1-E1a和E2F1-E1a/E2F1-E4病毒的構(gòu)建使用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，將10μg E2F1wt-922/47.PSV或E2F1Δ-922/47.PSV與10μg pJM17(Microbix)分別共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，產(chǎn)生了ONYX-150(E2F1wt-922/47)和ONYX-151(E2F1Δ-922/47)。如下構(gòu)建ONYX-411(E2F1wt-922/47+E2F1wt-E4)取10μg質(zhì)粒E2F1-E4PSV.309(ID-086)進(jìn)行EcoRI和BamHI消化，用小牛腸磷酸酶處理，并凝膠純化。然后取1μg經(jīng)EcoRI消化的ONYX-150(E2F1wt-922/47)TP-DNA和5μg經(jīng)純化的片段(包含驅(qū)動(dòng)E4區(qū)的野生型E2F-1啟動(dòng)子)于16℃連接過(guò)夜。將連接后的DNA與50μl 2.5M CaCl2混合至終體積500μl，進(jìn)行磷酸鈣轉(zhuǎn)染。在ONYX-411的情況中，轉(zhuǎn)染混合物除了連接后的DNA以外還包含24μg鮭魚(yú)精DNA。將該溶液逐滴加到500μl Hepes緩沖液(pH7.05)中。靜置25分鐘后，將沉淀逐滴加到兩個(gè)60mm板的293細(xì)胞中，其中該細(xì)胞已經(jīng)在添加10％胎牛血清(FBS)的DMEM中生長(zhǎng)至60-80％匯合。16小時(shí)后，用磷酸緩沖液(無(wú)鈣和鎂)清洗單層一次，隨后是5ml瓊脂上層(在添加2％FBS的DMEM中溶解1％ Seaplaque瓊脂糖)。每3-4天用3-4ml上述瓊脂上層覆蓋板，直至分離得到噬斑。實(shí)施例6E2F1-E1a和E2F1-E1a/E2F1-E4病毒的增殖和確認(rèn)用巴氏滴管分離初級(jí)噬斑，并在6孔板中在2ml添加2％ FBS的DMEM中在293或A549細(xì)胞上增殖，直至完成致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。留出十分之一(200μl)的病毒上清液用于DNA分析，剩余物裝在冷凍管中保存于-80℃。使用Qiagen的血液試劑盒依照其建議分離DNA。通過(guò)PCR對(duì)十分之一的這種材料篩選期望突變的存在，其中使用下列引物對(duì)。使用引物Ad5-left(5’-GGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCC-3’)和E1Astart.NC(5’-GGCAGATAATATGTCTCATTTTCAGTCCCGG-3’)確認(rèn)驅(qū)動(dòng)E1A的人E2F1啟動(dòng)子的存在。使用引物Af-7(5’-GCTAGGATCCGAAGGGATTGACTTACTCACT-3’)和Af-5(5’-GCTAGAATTCCTCTTCATCCTCGTCGTCACT-3’)確認(rèn)E1A內(nèi)第922-947位核苷酸的刪除。使用引物E4.3NCb(5’-GCCATAACAGTCAGCCTTACC-3’)和Ad5-3’end(5’-GGTGACGTAGGTTTTAGGGC-3’)確認(rèn)驅(qū)動(dòng)整個(gè)E4區(qū)的人E2F1啟動(dòng)子的存在。使用引物E3.C8(5’-CCTTTATCCAGTGCATTGACTGGG-3’)和3’-E3I(5’-GGAGAAAGTTTGCAGCCAGG-3’)確認(rèn)了E3區(qū)中存在的刪除(dl309)。使用Clontech高級(jí)cDNA PCR試劑盒在Perkin Elmer 9600設(shè)備中進(jìn)行PCR，條件如下最初的變性98℃ 5min；隨后30個(gè)循環(huán)，變性98℃ 1min，退火/引物延伸68℃ 3min；最后的引物延伸68℃ 5min。隨后通過(guò)序列分析確認(rèn)陽(yáng)性噬斑(通過(guò)PCR測(cè)定)。將上述PCR產(chǎn)物凝膠純化，并用相同引物測(cè)序。然后將陽(yáng)性噬斑在293或A549細(xì)胞中進(jìn)行第二輪噬斑純化，并完全如上所述進(jìn)行確認(rèn)。在293細(xì)胞中增殖病毒，并通過(guò)兩輪氯化銫梯度超速離心進(jìn)行純化。通過(guò)上述相同PCR和序列分析確認(rèn)所有大規(guī)模病毒制劑。另外，通過(guò)HindIII或XhoI消化及片段在0.9％瓊脂糖凝膠上的分離分析確認(rèn)所有大規(guī)模病毒制劑。
現(xiàn)在已經(jīng)充分描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會(huì)到，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多變化和更改而不違背所附權(quán)利要求的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.包含控制病毒基因表達(dá)的E2F反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控位點(diǎn)的病毒載體。
2.權(quán)利要求1的病毒載體，其中所述病毒基因是立即早期基因。
3.權(quán)利要求2的病毒載體，其中所述病毒載體是腺病毒。
4.權(quán)利要求3的病毒載體，其中所述轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控位點(diǎn)是啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求4的病毒載體，其中所述E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子替代了內(nèi)源腺病毒E1a啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求4的病毒載體，其中所述E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子替代了內(nèi)源腺病毒E4啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求6的病毒載體，其中所述病毒載體還包含實(shí)質(zhì)性促進(jìn)病毒復(fù)制的核苷酸調(diào)控位點(diǎn)，包括Sp1、ATF、NF1、和NFIII/Oct-1。
8.包含控制病毒基因表達(dá)的病毒轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控位點(diǎn)的病毒載體，其中通過(guò)插入E2F反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控位點(diǎn)而滅活了所述位點(diǎn)，使得所述E2F反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控位點(diǎn)控制所述病毒基因的表達(dá)。
9.權(quán)利要求8的病毒載體，其中所述病毒基因是立即早期基因。
10.權(quán)利要求9的病毒載體，其中所述病毒載體是腺病毒。
11.權(quán)利要求10的病毒載體，其中所述滅活的轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控位點(diǎn)是啟動(dòng)子。
12.權(quán)利要求11的病毒載體，其中所述滅活的轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控位點(diǎn)是內(nèi)源腺病毒E1a啟動(dòng)子。
13.權(quán)利要求11的病毒載體，其中所述滅活的轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控位點(diǎn)是內(nèi)源腺病毒E4啟動(dòng)子。
14.權(quán)利要求11的病毒載體，其中所述滅活的轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控位點(diǎn)包含內(nèi)源腺病毒E1a和E4啟動(dòng)子二者。
15.權(quán)利要求1或8的病毒載體，其中具E2F反應(yīng)性的所述轉(zhuǎn)錄核苷酸調(diào)控序列是人E2F-1。
16.用于在存在正常細(xì)胞的情況中殺死癌細(xì)胞的方法，包括下列步驟在感染條件下使(1)權(quán)利要求1或8的病毒載體接觸(2)包含癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞群，接觸時(shí)間足以使所述載體感染所述細(xì)胞群。
全文摘要
本發(fā)明描述了優(yōu)先殺死贅生性細(xì)胞而非正常細(xì)胞的病毒載體和用于生成這些載體的方法,優(yōu)選載體是用腫瘤特異性啟動(dòng)子(優(yōu)選E2F反應(yīng)性啟動(dòng)子)替代E1A和/或E4區(qū)中的內(nèi)源啟動(dòng)子后生成的腺病毒。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1382218SQ00813593
公開(kāi)日2002年11月27日 申請(qǐng)日期2000年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月15日
發(fā)明者L·約翰遜, A·法塔伊, T·漢密斯頓 申請(qǐng)人:昂尼克斯藥物公司