專利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的疫苗制劑、制備它們的方法及其在治療中的應(yīng)用。本發(fā)明尤其涉及新的輪狀病毒疫苗制劑。
在世界上的許多地區(qū)，急性感染性腹瀉是疾病和死亡的一個主要病因。在發(fā)展中國家里，腹瀉病的影響是驚人的。對于亞洲、非洲及拉丁美洲，估計每年有三十億至四十億的腹瀉病例，且那些病例中的大約500-1000萬病例導(dǎo)致死亡(Walsh，J.A.等N.Engl.J.Med.，301967-974(1979))。
已判明輪狀病毒為嬰幼兒重癥腹瀉的最重要病因之一(Estes，M.K.Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology，第三版，由Fields等編輯，Raven Publishers，Philadelphia，1996)。估計輪狀病毒病是造成每年超過一百萬人死亡的主要原因。輪狀病毒誘發(fā)的疾病最常侵襲年齡在6個月和24個月之間的兒童，且所述疾病的流行高峰一般發(fā)生于溫帶氣候中較涼的月份期間以及熱帶地區(qū)的全年期間。輪狀病毒一般通過糞便-口途徑在人群中傳播，其潛伏期大約1天至大約3天。和6個月至24個月年齡組的感染不同，新生兒通常是無癥狀的或僅有輕度的病。與在幼兒中通常遇到的重癥疾病比較起來，大多數(shù)成年人由于先前的輪狀病毒感染而得到保護，因此大多數(shù)成年人的感染是輕度的或是無癥狀的(Offit，P.A.等，Comp.Ther.，8(8)21-26，1982)。
輪狀病毒通常是球形的，且它們的名字來源于其特殊的外部和內(nèi)部衣殼結(jié)構(gòu)或雙層衣殼結(jié)構(gòu)。通常，輪狀病毒的雙層衣殼結(jié)構(gòu)包圍著一個包含基因組的蛋白內(nèi)殼或核心。輪狀病毒的基因組由11個雙鏈RNA節(jié)段組成；所述11個雙鏈RNA節(jié)段至少編碼11種特殊的病毒蛋白。這些病毒蛋白中稱為VP4和VP7的兩種蛋白排列在雙層衣殼結(jié)構(gòu)的外部。輪狀病毒的內(nèi)衣殼呈現(xiàn)一種蛋白，該蛋白是名為VP6的輪狀病毒蛋白。還不清楚這三種特殊的輪狀病毒蛋白在引發(fā)輪狀病毒感染后的免疫應(yīng)答方面的相對重要性。然而，VP6蛋白決定組抗原和亞組抗原，而VP4和VP7蛋白是血清型特異性的決定因子。
VP7蛋白是一種38,000MW的糖蛋白(而非糖基化的該蛋白為34,000MW)，所述蛋白是基因組節(jié)段7、8或9的翻譯產(chǎn)物，具體的基因組節(jié)段號隨病毒株而定。在輪狀病毒感染后，這種蛋白刺激主要中和抗體的形成。VP4蛋白是一種非糖基化的、大約88,000MW的蛋白，該蛋白是基因組節(jié)段4的翻譯產(chǎn)物。在輪狀病毒感染后，這種蛋白也激發(fā)中和抗體。
因為VP4和VP7蛋白是中和抗體所針對的病毒蛋白，所以相信它們是用于開發(fā)輪狀病毒疫苗、從而提供抗輪狀病毒病的保護作用的主要候選物。
已知在兒童期早期天然輪狀病毒感染引起保護性免疫。因此，一種減毒的輪狀病毒活疫苗是非常合乎需要的。這種疫苗最好應(yīng)該是一種口服疫苗，因為這是該病毒的天然感染途徑。
預(yù)防輪狀病毒感染的早期疫苗開發(fā)開始于發(fā)現(xiàn)該病毒后的二十世紀(jì)七十年代。最初，研究了來自動物和人的減毒株，且得到了混淆的或令人失望的結(jié)果。近來，更多的工作集中在更為成功的人-動物重配體(reassortant)上。
Ward描述了稱為89-12的輪狀病毒株，參見美國專利第5,474,773號和Bernstein，D.L.等，Vaccine，16(4)，381-387，1998。從一份大便樣品中分離出89-12病毒株，該大便樣品于1988年采集自一位14個月大的、患有天然輪狀病毒病的兒童。接著，按照美國專利第5,474,773號，如Ward在J.Clin.Microbiol.，19，748-753，1984中所述，通過在原代非洲綠猴腎(AGMK)細(xì)胞中傳代2次以及在MA-104細(xì)胞中傳代4次，使所述HRV 89-12人輪狀病毒適應(yīng)培養(yǎng)。然后，在MA-104細(xì)胞中將其噬斑純化3次(達到第9次傳代)，且在另外2次傳代后，使其于這些細(xì)胞中生長。進行了一次另外的傳代(第12次傳代)，以保藏于ATCC，保藏號為ATCCVR 2272。將所保藏的病毒株稱為89-12C2。
在下文將1998年在Vaccine雜志中由Bernstein等發(fā)表的論文稱為Vaccine(1998)論文。該論文描述了一種口服的人輪狀病毒活疫苗候選物的安全性和免疫源性。由病毒株89-12獲得這種疫苗；即通過在原代AGMK細(xì)胞中不經(jīng)噬斑純化傳代26次將其減毒，然后，在一種建立的AGMK細(xì)胞系中將其再傳代7次(總計傳代33次)。
在下文里，把上述連續(xù)傳代26次的材料稱為P26，且把連續(xù)傳代33次的材料稱為P33。總的來說，把通過將89-12傳代n次而獲得的輪狀病毒稱為Pn。
在下文的實施例中，用Vero細(xì)胞將P33材料進一步傳代5次。把這種病毒稱為P38。
在Vaccine(1998)論文中描述的P26和P33分離物并沒有保藏在培養(yǎng)物保藏中心，也沒有分析確定它們的遺傳特性。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在該文獻中描述的P26種群包含變異體的混合物。正如在下文中描述的(參見實施例)，根據(jù)遺傳鑒定，已證實了這一點。因此，P26不是一種用于進一步傳代的、尤其不是用于所述疫苗批量生產(chǎn)的可靠一致的種群。同樣，P33包含變異體的混合物，且對于疫苗的批量生產(chǎn)，P33不是可靠一致的。
已發(fā)現(xiàn)P26材料是至少三種VP4基因變異體的混合物。同樣，P33和P38是兩種變異體的混合物。如果評價來自用P33接種過的嬰兒的血清針對這些變異體中和抗體效價，則依據(jù)中和表位看來，這些變異體在抗原性方面是不同于保藏在ATCC的89-12C2病毒株的。在圖3中闡明了這一點。
此外，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)將P33材料給予嬰兒時，復(fù)制及排泄出兩種標(biāo)記的變異體。在100個接種過的嬰兒中，只有2個顯示出由于輪狀病毒感染引起的胃腸炎體征，而安慰劑組有20％被感染。這些研究的結(jié)果暗示所述已鑒定的變異體與保護人或動物不患輪狀病毒病有關(guān)。本發(fā)明提供一種分離輪狀病毒變異體的方法，且提供一種來源于一個經(jīng)克隆的(均一的)人輪狀病毒株的、減毒輪狀病毒改良活疫苗。
因此，按照第一個方面，本發(fā)明提供一個減毒輪狀病毒種群(分離物)，其特點在于減毒輪狀病毒種群由單一的變異體或基本上由單一的變異體組成；所述的變異體由編碼稱為VP4和VP7的主要病毒蛋白中的至少一種之核苷酸序列來限定。
按照本發(fā)明的輪狀病毒種群最好是一個克隆變異體。
所謂由單一的變異體或基本上單一的變異體組成的種群指的是含有不多于10％、優(yōu)選少于5％、最優(yōu)選少于1％的一種或多種不同變異體的一個輪狀病毒種群?？赏ㄟ^在合適的細(xì)胞類型中傳代，或通過進行一系列的一個或多個克隆步驟，將病毒種群純化為均質(zhì)或基本均質(zhì)。
本發(fā)明的一個優(yōu)點是由單一的變異體組成的種群更適合于一種一致的批量疫苗的配制。由編碼該主要病毒蛋白的核苷酸序列限定的特定變異體也可能與增強的預(yù)防輪狀病毒感染的功效有關(guān)。
在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明輪狀病毒種群中的單一或基本上單一的變異體是其中VP4基因包含一段特定核苷酸序列的變異體，所述的特定核苷酸序列包括下面堿基中的至少一種從起始密碼子起在788位的腺嘌呤堿基(A)、在802位的腺嘌呤堿基(A)以及在501位的胸腺嘧啶堿基(T)。
在另外的一個方面，本發(fā)明病毒種群中的單一或基本上單一的變異體是其中VP7基因包含一段特定核苷酸序列的變異體，所述的特定核苷酸序列包括下面堿基中的至少一種從起始密碼子起在605位的胸腺嘧啶(T)、在897位的腺嘌呤(A)或在897位的鳥嘌呤(G)。在897位最好有一個腺嘌呤(A)。
在一個優(yōu)選的方面，按照本發(fā)明的所述種群中的單一變異體在VP4基因序列中從起始密碼子起的788位和802位具有腺嘌呤(A)及在501位具有胸腺嘧啶(T)。
在另一個優(yōu)選的方面，按照本發(fā)明的所述種群中的單一變異體在VP7序列中從起始密碼子起的605位具有胸腺嘧啶(T)和在897位具有腺嘌呤/鳥嘌呤(A/G)。最優(yōu)選在VP7序列中于897位有一個腺嘌呤(A)。
在一個特別優(yōu)選的方面，按照本發(fā)明的所述種群中的單一變異體在VP4基因序列中從起始密碼子起的788位和802位具有腺嘌呤(A)及在501位具有胸腺嘧啶(T)以及在VP7序列中從起始密碼子起的605位具有胸腺嘧啶(T)和在897位具有腺嘌呤/鳥嘌呤(A/G)。最優(yōu)選在VP7序列中于897位有一個腺嘌呤(A)。
在另一個方面，所述單一變異體包含編碼VP4蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列如

圖1所示；和/或編碼VP7蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列如圖2所示。
本發(fā)明也提供一種產(chǎn)生由基本上單一的變異體組成的輪狀病毒種群的方法，該方法包括將輪狀病毒制劑在合適的細(xì)胞類型上傳代；任選地采用以下任一步驟選擇均一的培養(yǎng)物a)有限稀釋；或b)分離單個的噬斑；以及通過對VP4和/或VP7基因序列的適當(dāng)區(qū)域進行序列測定而檢驗基本上單一的變異體的存在。
用諸如狹線印跡雜交或噬斑雜交之類的定量或半定量雜交技術(shù)，可適當(dāng)?shù)剡M行序列測定。
當(dāng)把起始輪狀病毒制劑給予一位人類對象、尤其是兒童時，所選定的變異體最好是一種被復(fù)制及排泄的變異體。
通過在一種合適的細(xì)胞系中進一步傳代，可擴增通過按照本發(fā)明方法而產(chǎn)生的克隆的病毒種群。
適合于用上述方法使輪狀病毒種群傳代的細(xì)胞類型包括非洲綠猴腎(AGMK)細(xì)胞，所述非洲綠猴腎細(xì)胞可以是建立的細(xì)胞系或原代AGMK細(xì)胞。合適的AGMK細(xì)胞系包括例如Vero(ATCC CCL-81)、DBS-FRhL-2(ATCC CL-160)、BSC-1(ECACC 85011422)和CV-1(ATCCCCL-70)。同樣合適的是MA-104(恒河猴)細(xì)胞系和MRC-5(人的-ATCCCCL-171)細(xì)胞系。為了擴增的目的，尤其優(yōu)選Vero細(xì)胞。在Vero細(xì)胞中傳代產(chǎn)生高產(chǎn)量的病毒。
用于檢驗在一個用所述方法產(chǎn)生的病毒種群中是否有單一變異體的技術(shù)以及測定該單一變異體性質(zhì)的技術(shù)，涉及本技術(shù)領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測序步驟或雜交步驟；且在下文描述它們。
在一個優(yōu)選的方面，用一種合適的輪狀病毒，特別是用具有89-12病毒株或其傳代衍生物之特性的輪狀病毒，來實施本發(fā)明的方法。
一個特別優(yōu)選的單一變異體種群是P43；通過一系列終點稀釋克隆步驟，繼之以在Vero細(xì)胞中將克隆的病毒傳代以進行擴增，由P33(一種分離的人輪狀病毒在適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型培養(yǎng)物中傳代33次)獲得該P43。
根據(jù)布達佩斯條約的條款，將P43種群于1999年8月13日保藏于歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心-European Collection of Animal CellCultures(ECACC)，Vaccine Research and Production Laboratory，PublicHealth Laboratory Service，Centre for Applied Microbiology and Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，United Kingdom，保藏號為99081301。
雖然這表明公眾可得到是獲得人輪狀病毒P43的最簡易方式，但是，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，用這些或其它方法可以產(chǎn)生類似的和功能基本等同的輪狀病毒并不是完全不可能的、或者不是不大可能發(fā)生的。這樣的功能基本等同的輪狀病毒被認(rèn)為是在生物學(xué)上等同于本發(fā)明的人輪狀病毒P43的，且因此它們是在本發(fā)明的總體范圍內(nèi)的。因此，應(yīng)明白本發(fā)明包括具有本文中描述的P43變異體特征的輪狀病毒種群。
人們會理解，本發(fā)明包括由于使該P43經(jīng)受另外的處理的來源于所保藏的P43 ECACC 99081301的材料；所述另外的處理例如通過進一步地傳代、克隆或使用所述活病毒的其它步驟來繁殖它，或者以包括通過用基因工程技術(shù)或重配技術(shù)的任一方式來修飾P43。在本技術(shù)領(lǐng)域中，這樣的步驟和技術(shù)是眾所周知的。
來源于本發(fā)明所包括的保藏的P43的材料包括蛋白和遺傳物質(zhì)。值得特別關(guān)注的是包含P43的至少一種抗原或至少一個節(jié)段的重配輪狀病毒；例如，由一種毒性輪狀病毒株組成的重配子，在所述重配子中，11個基因組節(jié)段中的一個或一個的一部分已被P43基因組節(jié)段或其一部分取代。具體地講，其中編碼NSP4的節(jié)段或部分節(jié)段為P43之節(jié)段或部分節(jié)段的輪狀病毒重配子可具有有用的特性。重配輪狀病毒和用于制備它們的技術(shù)是眾所周知的(Foster，R.H.和Wagstaff，A.J..TetravelentRotavirus Vaccine，a review.ADIS drug evaluation，BioDrugs，Gev，9(2)，155-178，1998)。
值得特別關(guān)注的材料是P43的后代及P43的免疫學(xué)活性衍生物。免疫學(xué)活性衍生物是指由P43病毒或用P43病毒獲得的、當(dāng)被注射到宿主動物體內(nèi)時能夠引起對輪狀病毒反應(yīng)的免疫應(yīng)答的物質(zhì)，尤其是該病毒的抗原。
為了使輪狀病毒適應(yīng)于例如Vero細(xì)胞的合適細(xì)胞系，處理該病毒以便除去任何潛在的污染物可能是必需的；所述潛在的污染物例如可能存在的且在其它方面可能導(dǎo)致污染的任何意外產(chǎn)生的因子。在意外產(chǎn)生的醚敏感型病毒的情況下，通過進行如同下文描述的乙醚處理，則可以完成這種除去。本發(fā)明也涉及在獲得一種減毒活輪狀病毒或以此配制的疫苗之全過程中，包含作為一個可任選步驟的這樣的乙醚處理。
同樣在本發(fā)明范圍內(nèi)的是P43與其它輪狀病毒變異體(例如其它克隆的變異體)的混合物，或者是P43與其它病毒、尤其是其它減毒病毒的混合物。在下文描述的本發(fā)明疫苗中，這樣的混合物是有用的。
本發(fā)明也提供一種減毒輪狀病毒活疫苗，所述疫苗包括與一種合適佐劑或藥用載體混合的一個基本上單一的變異體種群。
按照本發(fā)明的輪狀病毒疫苗最好是一種包含單一輪狀病毒株的單價輪狀病毒疫苗。
在提供輪狀病毒活疫苗方面，本發(fā)明是特別有益的；在所述輪狀病毒活疫苗中，減毒的活輪狀病毒是人輪狀病毒，且不導(dǎo)致腸套疊。
用于按照本發(fā)明的疫苗中的合適藥用載體包括適合于口服給藥的本領(lǐng)域已知的那些載體，尤其是適用于嬰兒的那些載體。這樣的載體包括但不限于糖類、多元醇、氨基酸、氫氧化鋁、氫氧化鎂、羥基磷灰石、滑石、氧化鈦、氫氧化鐵、硬脂酸鎂、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素、明膠、營養(yǎng)蛋白胨(vegetal peptone)、黃原膠、角叉藻聚糖、阿拉伯樹膠、β-環(huán)糊精。
本發(fā)明也提供一種用于制備輪狀病毒疫苗的方法；例如，通過在存在合適穩(wěn)定劑的情況下凍干該病毒，或?qū)凑毡景l(fā)明的病毒與一種合適的佐劑或藥用載體混合來制備。
將本發(fā)明的病毒配制在例如病毒體或脂質(zhì)體的基于脂質(zhì)的載體中、配制在水包油乳狀液或用載體粒子配制，也可能是有益的。另一方面或另外，在所述制劑中可包含免疫刺激劑，諸如本技術(shù)領(lǐng)域中已知的用于口服疫苗的免疫刺激劑。這樣的免疫刺激劑包括細(xì)菌毒素、尤其是全毒素(holotoxin)(完整分子)或僅B鏈(CTB)形式的霍亂毒素(CT)、以及大腸桿菌的熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)。在WO 96/06627、WO 93/13202和US5,182,109中，描述了與天然LT相比不太可能轉(zhuǎn)變成活性形式的突變型LT(mLT)。
可能最好包括的另外的免疫刺激劑是例如QS21的皂苷衍生物及單磷酰脂質(zhì)A，尤其是3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)。在WO98/56415中描述了作為口服佐劑的純化的皂苷?？煞謩e地或以聯(lián)合方式使用皂苷和單磷酰脂質(zhì)A(例如WO 94/00153)，且可以將其與其它因子一起配制為佐劑系統(tǒng)。3D-MPL是由Ribi Immunochem，Montana制造的一種眾所周知的佐劑，且在GB 2122204中描述了其制造。
在Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach，Powell和Newman編輯，Plenum Press，New York，1995中，可找到用于口服免疫的載體和佐劑的一般論述。
本發(fā)明也提供一種方法，用于通過將有效量的按照本發(fā)明的疫苗組合物給予需要接種的人類對象，尤其是嬰兒，來為所述對象接種。最好是通過口服給藥而給予減毒的活疫苗。
在一個優(yōu)選的方面，用一種抗酸劑配制本發(fā)明的疫苗組合物，從而將由于胃酸所致的所述疫苗的失活減至最小。合適的抗酸劑組分包括例如氫氧化鋁Al(OH)3和氫氧化鎂Mg(OH)2的無機抗酸劑。適用于本發(fā)明的市售抗酸劑包括含有氫氧化鋁和氫氧化鎂的Mylanta(商標(biāo))。這些抗酸劑在水中是不溶的，因而將其以懸浮液的形式給予。
氫氧化鋁是根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物中的特別優(yōu)選的組分；因為它不僅能提供抗酸劑的效應(yīng)，而且能提供佐劑(adjuvantation)的效應(yīng)。
同樣適合于在本發(fā)明疫苗中用作抗酸劑的是諸如有機酸羧酸鹽之類的有機抗酸劑。本發(fā)明疫苗組合物中的一種優(yōu)選的抗酸劑包含一種有機酸羧酸鹽，最好是例如檸檬酸鈉或檸檬酸鉀的一種檸檬酸鹽。
可用于本發(fā)明疫苗組合物中的一種特別優(yōu)選的抗酸劑是不溶性無機鹽碳酸鈣(CaCO3)。碳酸鈣能與輪狀病毒結(jié)合，且在輪狀病毒與碳酸鈣結(jié)合期間保持該輪狀病毒的活性。
為了防止在填充步驟期間碳酸鈣沉降，最好在所述制劑中存在粘性劑。
可使用的可能的粘性劑包括假塑性賦形劑。假塑性溶液的定義為與溶液在攪動期間的粘度相比在靜置時具有較高粘度的溶液。這種類型的賦形劑是天然的聚合物或是半合成的聚合物；所述天然的聚合物例如阿拉伯樹膠、黃耆膠(adragante gum)、瓊脂、藻酸鹽、果膠，所述半合成的聚合物例如羧甲基纖維素(Tyloses C)、甲基纖維素(Methocels A、Viscotrans MC、Tylose MH和MB)、羥丙基纖維素(Klucels)以及羥丙基甲基纖維素(Methocels E和K、Viscontrans MPHC)。通常，同觸變劑一起使用這些假塑性賦形劑?？墒褂玫钠渌承詣┦蔷哂械土鲃幽芰Φ募偎苄再x形劑。那些聚合物在足夠濃度下發(fā)生產(chǎn)生在靜置時具有低流動能力的高粘度溶液的結(jié)構(gòu)流體排列。需要給予該系統(tǒng)一定量的能量，從而讓其流動和轉(zhuǎn)移。為了獲得流體溶液，需要外來能量(攪動)暫時破壞該結(jié)構(gòu)流體排列。這樣的聚合物的實例是Carbopols和黃原膠。
在靜置時，觸變賦形劑變成一種凝膠結(jié)構(gòu)；而在攪動時，它們形成一種流體溶液。觸變賦形劑的實例是Veegum(硅酸鋁鎂)和AvicelRC(大約89％的微晶纖維素和11％的羧甲基纖維素鈉)。
本發(fā)明的疫苗組合物最好包括一種選自黃原膠或淀粉的粘性劑。
因此，最好用碳酸鈣和黃原膠的組合來配制本發(fā)明的疫苗組合物。
用于本發(fā)明組合物的其它組分適當(dāng)?shù)匕ɡ缯崽呛?或乳糖的糖。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物可包含另外的組分，包括例如調(diào)味劑(特別是用于口服疫苗的)和抑菌劑。
設(shè)想了根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的不同規(guī)格。
在一個優(yōu)選的實施方案中，以液體制劑形式給予所述的疫苗。最好在給予之前，由至少下面兩種組分重建該液體制劑i)病毒組分，ii)液體組分。
在這個實施方案中，所述病毒組分和液體組分通常存在于單獨的容器中；所述容器可以便利地為單個容器的分隔室；或是可以以這樣的一種方式連通的分隔室，以致在不暴露最終的疫苗組合物于空氣的情況下重建最終的疫苗組合物。
在重建之前，該病毒可以呈干的狀態(tài)，或呈液體狀態(tài)。最好凍干該病毒組分。凍干的病毒比在水溶液中的病毒更加穩(wěn)定。該凍干的病毒可以用一種液體抗酸組合物來適當(dāng)?shù)刂亟ǎ瑥亩a(chǎn)生液體疫苗制劑。用另一種方法，該凍干病毒可以用水或水溶液來重建；在這種情況中，所述凍干病毒組合物最好包含一種抗酸劑組分。
所述疫苗制劑最好包括在一個分隔室或容器中用碳酸鈣和黃原膠配制的一種病毒組分，且這種病毒組分用存在于第二個分隔室或容器中的水或水溶液來重建。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述的疫苗組合物是一種固體制劑，最好是一種適合于當(dāng)放置于口中時立即溶解的凍干塊。可以以藥用泡罩片中的片劑形式方便地提供凍干制劑。
在另一方面，本發(fā)明提供一種用于口服給藥的、速溶片劑形式的輪狀病毒疫苗。
在另一方面，本發(fā)明提供一種包含一種減毒活輪狀病毒株、尤其是人輪狀病毒株的組合物；其中，該組合物是一種當(dāng)放置于口中時能立即溶解的凍干固體。
根據(jù)本發(fā)明的速溶片劑最好在受接種者口中足夠快地溶解，從而防止吞下未溶解的片劑。這種途徑對兒科輪狀病毒疫苗是特別有益的。
所述病毒最好是與一種例如碳酸鈣的無機抗酸劑及一種例如黃原膠的粘性劑一起配制的、活的減毒人輪狀病毒。
本發(fā)明的再一方面是提供一種凍干制劑；在所述的凍干制劑中，該病毒組分是用碳酸鈣和黃原膠配制的任一輪狀病毒株。
本發(fā)明的疫苗可以用已知技術(shù)，用提供針對輪狀病毒感染的有效保護且沒有常用疫苗之顯著有害副作用的適宜量的活病毒配制和給予。每一劑活病毒的適宜量通常在104和107ffu之間。疫苗的常用劑量可包括每一劑105-106ffu。且可以在一個時期內(nèi)，以幾劑給予；例如，以兩個月的間隔將其分兩劑給予。然而，通過應(yīng)用不止2劑后，例如3或4劑方案，則可以得到好處，尤其是在發(fā)展中國家里。一劑與一劑之間的間隔可以多于或少于兩個月。通過涉及觀測抗體效價和受接種者之其它反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)研究，可確定一劑方案或多劑方案的活病毒的最適量以及各劑的最適給藥時間。
本發(fā)明的疫苗也可包含其它合適的活病毒，以提供針對其它疾病的保護作用，例如包含脊髓灰質(zhì)炎病毒。另一方面，可以以獨立一劑但在給予根據(jù)本發(fā)明的輪狀病毒疫苗組合物的同一時刻，給予其它合適的口服給予的病毒活疫苗。圖3的圖面說明檢驗了來自用Vaccine(1998)論文中描述的P33材料接種的12位4-6個月大嬰兒的血清針對P33、P38、P43和89-12C2的中和作用。
對于P33、P38和P43，檢驗過的所有血清的中和效價的范圍是類似的。統(tǒng)計學(xué)分析顯示針對全部三種病毒的整體中和效價沒有顯著的差異。這暗示P33、P38和P43的構(gòu)象和非構(gòu)象中和表位都同等良好地被接種了P33的嬰兒之抗P33血清識別。這一觀測間接地暗示在P33、P38和P43之間，在這種體外分析中顯露的中和表位沒被改變的。
然而，P89-12C2的中和效價的范圍顯著不同于P33、P38和P43。這一觀測暗示P33、P38和P43的構(gòu)象和非構(gòu)象中和表位不是同樣良好地被接種了P33的嬰兒之抗P33血清識別。這一觀測間接地暗示在89-12C2與P33、P38及P43之間，在這種體外分析中所顯露的中和表位是改變了的。
下面的實施例闡明本發(fā)明。
實施例實施例1傳代26次的89-12病毒株(P26)為變異體混合物的證明來自不同傳代次數(shù)之病毒的VP4基因和VP7基因的序列測定對來自傳代物P26(原代AGMK細(xì)胞)、傳代物P33(建立的(與原代相對)AGMK細(xì)胞系)、傳代物P41以及傳代物P43的VP4基因和VP7基因進行序列測定。將總RNA提取物逆轉(zhuǎn)錄，并在一支管/一個步驟中通過PCR，將其擴增。
引物Rota 5bis和引物Rota 29bis擴增完整的VP4基因，引物Rota 1和引物Rota 2bis擴增完整的VP7基因。已用不同的引物測定了所述PCR材料的序列(參見表1)。
傳代物P26之序列傳代物P33之序列在VP4中相差三個堿基(位于從起始密碼子起的501、788及802bp處)且在VP7中相差三個堿基(從起始密碼子起的108、605及897bp)。
對傳代物P26之VP4和VP7的序列掃描表明在突變的位置，存在作為本底的傳代物P33之序列。因此，可看出傳代物P26是至少2種變異體的混合物。
對傳代物P33的序列掃描似乎就VP4而言是均一的，而就VP7而言則是不均一的(參見表2)。
在Vero細(xì)胞中使傳代物P38(來源于傳代物P33)傳代5次；顯示出與傳代物P33(AGMK細(xì)胞系)相同的一組的VP4和VP7序列。因此，在P33和P38之間的種群中，沒有較大的變化。表1用于RT-PCR和序列測定的寡核苷酸
表2用于雜交的寡核苷酸
在表2中以粗體顯示的堿基是VP4和VP7中的具體序列變異的位點。表3VP4基因和VP7基因的序列變異3.1
注意在來自發(fā)展到生產(chǎn)批量水平之3個克隆的第二個克隆中，VP7的897bp位置的核苷酸為G，而不是所選定的P43克隆中的A。這導(dǎo)致在氨基酸序列中一個甲硫氨酸取代一個異亮氨酸。在用P33材料接種的嬰兒的糞便中，既排泄出對應(yīng)于所選定的P43克隆的變異體，又排泄出與VP7中從起始密碼子起的897bp位置上有一個G的克隆對應(yīng)的變異體。
在表3.1中，在一個特定位置上有兩種可變堿基的情況下，兩者中的第一種代表在較多的群體中出現(xiàn)的堿基，而第二種是在較少的群體中出現(xiàn)的堿基。根據(jù)序列分析中的信號強度來斷定較多的變異體群體和較少的變異體群體。3.2
表3.2顯示了由變異體之間的核苷酸差異而引起的氨基酸變化。表4
狹線印跡雜交通過狹線印跡雜交，進一步證實了AGMK細(xì)胞上的傳代物P26至P33之間的種群變化。使通過RT/PCR產(chǎn)生的VP4基因片段和VP7基因片段與各變異體特異性的寡核苷酸探針雜交(參見表3.1和表3.2)。跟與Rota 16、Rota 35和Rota 36雜交而不與Rota 15雜交的P26比較起來，P33材料之VP4的PCR片段在788和802位僅與Rota 16雜交，而不與或Rota 15或Rota 35或Rota 36雜交。這些結(jié)果證實了在P26中至少存在3種變異體(參見表4)。
至于P33材料之VP7的PCR片段，所述897位與Rota 41和Rota 42雜交。這些結(jié)果證實了在P33材料中至少存在2種變異體。實施例2P43克隆的分離和特性鑒定為了分離作為均一病毒種群的P33組分，在Vero細(xì)胞上進行P33/AGMK的三次終點稀釋；并用所得到的病毒感染Vero細(xì)胞。
運用兩種標(biāo)準(zhǔn)來挑選陽性孔由在孔中檢測出的最大轉(zhuǎn)化灶數(shù)表明的生長，以及在板上分離出最多的陽性孔，正如常規(guī)所作的。在用96孔微量滴定板進行3次終點稀釋傳代后，在Vero細(xì)胞中相繼擴增了10個陽性孔，并評價了其產(chǎn)量。
基于產(chǎn)量，將三個克隆發(fā)展到生產(chǎn)批量的傳代水平。已顯示在所述三個克隆之間以及在所述克隆和P33之間，多克隆抗體的免疫識別都是類似的。根據(jù)狹線印跡雜交，評價了所述克隆的均一性。單一克隆的最終選擇是基于產(chǎn)量和序列的。
通過在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代來擴增所選定的克隆，從而產(chǎn)生原種(Master seed)、工作種(Working seed)，且最終產(chǎn)生生產(chǎn)批量。
通過測定VP4和VP7的序列(同一性)以及通過PCR擴增材料之VP4和VP7的特異性狹線印跡雜交(均一性)，從遺傳學(xué)角度來鑒定所選定克隆在不同傳代水平的特征。在圖1和圖2中分別給出了P43材料之VP4基因的序列和VP7基因的序列，且這些序列和P41的相應(yīng)序列是一樣的。
通過使用鑒別在P26/原代AGMK序列測定期間所鑒定的各變異體VP4和/或VP7區(qū)域中核苷酸變化的寡核苷酸探針(參見表4)進行選擇性雜交，來評價所選定克隆的均一性。
該VP4片段與Rota 16雜交，而不與Rota 15、Rota 35或Rota 36雜交。
所述VP7片段與Rota 41雜交，而不與Rota 42雜交。
這些結(jié)果證實了P43是一個均一的種群。實施例3除去可能意外產(chǎn)生的病毒按20％的終濃度將乙醚添加到P33(AGMK培養(yǎng)的)中達1小時。然后，用N2使乙醚以氣泡排出達35分鐘。沒有觀測到對P33種子滴度的影響。實施例4減毒活疫苗的配制用下面的方法配制用于口服給予嬰兒的上述生產(chǎn)批量。
1.凍干的病毒運用制備病毒劑的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。將純化病毒的冷凍塊解凍，并用合適的培養(yǎng)基組合物(在本實例中為Dulbecco改進的eagle培養(yǎng)基)將其稀釋到所需的病毒標(biāo)準(zhǔn)濃度(在本實例中為106.2ffu/ml)。然后，用凍干穩(wěn)定劑(蔗糖4％、葡聚糖8％、山梨醇6％、氨基酸4％)將該稀釋過的病毒進一步稀釋至目標(biāo)病毒滴度，在本實例中為105.6ffu/劑。將穩(wěn)定的病毒組合物的0.5ml等分試樣無菌轉(zhuǎn)移至3ml的小瓶中。然后，用橡膠塞將各小瓶部分封閉，在真空下凍干所述的樣品；接著，完全密封所述小瓶，并在環(huán)繞小瓶的適當(dāng)位置壓上鋁帽，以使所述瓶塞保持在適當(dāng)?shù)奈恢谩?br> 至于使用，用下面抗酸的重建劑中的一種將該病毒重建(a)檸檬酸鹽重建劑將檸檬酸鈉溶解于水中，通過過濾除菌；并按1.5ml的量、以544mg檸檬酸鈉·2H2O/1.5ml之劑的濃度，將其無菌轉(zhuǎn)移至重建劑容器中。所述重建劑容器可以例如是3ml的小瓶、或4ml的小瓶、或2ml的注射器、或用于口服給藥的可壓縮的軟塑料膠囊。作為在無菌條件下保存無菌組分的一種可供選擇的方法，可以將最終的容器高壓滅菌。
(b)Al(OH)3重建劑在無菌水中無菌稀釋無菌氫氧化鋁懸浮液(Mylanta-商標(biāo))；并以每份2ml的量，將其無菌轉(zhuǎn)移至各重建劑容器(例如2ml的注射器或可壓縮的軟塑料膠囊)中，每份2ml的量包含48mg Al(OH)3。在無菌條件下使用無菌組分的一種可采用的方法是用γ射線照射氫氧化鋁懸浮液(最好處于經(jīng)稀釋的階段)。
包含阻止該懸浮液澄清的標(biāo)準(zhǔn)成分。這樣的標(biāo)準(zhǔn)成分包括例如，硬脂酸鎂、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素以及硅氧烷聚合物。也可包含用于食品的抑菌劑及調(diào)味劑，所述抑菌劑例如對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸丙酯或其它標(biāo)準(zhǔn)的抑菌劑。
2.在液體制劑中和Al(OH)3一起被凍干的病毒運用制備病毒劑的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。將純化病毒的冷凍塊解凍，并用合適的培養(yǎng)基組合物(在本實例中為Dulbecco改進的eagle培養(yǎng)基)將其稀釋到所需的病毒標(biāo)準(zhǔn)濃度(在本實例中為106.2ffu/ml)。加入氫氧化鋁懸浮液而達到48mg/劑的最終量，且用凍干穩(wěn)定劑(蔗糖4％、葡聚糖8％、山梨醇6％、氨基酸4％)將該病毒組合物稀釋至目標(biāo)病毒滴度，在本實例中該目標(biāo)滴度為105.6ffu/劑。將穩(wěn)定的病毒組合物的0.5ml等分試樣無菌轉(zhuǎn)移至3ml的小瓶中。然后，如同在第1部分中描述的，進行所述小瓶的凍干和密封。
3.用于泡罩片規(guī)格的、和Al(OH)3一起被凍干的病毒運用制備病毒劑的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。將純化病毒的冷凍塊解凍，并用合適的培養(yǎng)基組合物(在本實例中為Dulbecco改進的eagle培養(yǎng)基)將其稀釋到所需的病毒標(biāo)準(zhǔn)濃度(在本實例中為106.2ffu/ml)。加入氫氧化鋁懸浮液而達到48mg/劑的最終量，且用凍干穩(wěn)定劑將該病毒組合物稀釋至105.6ffu/劑的目標(biāo)病毒滴度；所述凍干穩(wěn)定劑可以是蔗糖、葡聚糖或4％的氨基酸、或明膠、或營養(yǎng)蛋白胨、或黃原膠。用無菌裝填操作將各份0.5ml或最好更少的劑量轉(zhuǎn)移至各泡罩腔中。凍干該組合物，并通過熱封而密封所述的泡罩腔。
可任意選擇地包含阻止氫氧化鋁懸浮液澄清的標(biāo)準(zhǔn)成分。這樣的標(biāo)準(zhǔn)成分包括例如，硬脂酸鎂、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、微晶纖維素以及硅氧烷聚合物。也可以包含調(diào)味劑。實施例5用于不同制劑的輪狀病毒之病毒滴度5.1基于制劑的乳糖和蔗糖之間的比較
正如在上表中顯示的，或者用蔗糖、或者用乳糖配制P43輪狀病毒。凍干前的病毒滴度是在完成配制的液體(包含蔗糖、葡聚糖、山梨醇、氨基酸)中的、且無凍干步驟的病毒滴度。
良好的結(jié)果是在凍干步驟時實現(xiàn)＜0.5log的減小、且在“37℃1周”(加速穩(wěn)定性試驗)期間實現(xiàn)＜0.5log的減小的那些結(jié)果。
所述病毒滴度的精密度大約是+或-0.2log。
所述結(jié)果表明，可以用蔗糖代替乳糖。
5.2精氨酸的作用及用麥芽糖醇代替山梨醇
所述結(jié)果表明添加精氨酸(已知精氨酸在凍干期間改善所述病毒的穩(wěn)定性且還提供堿性介質(zhì)以便平衡胃的酸性)保持該病毒的滴度。
山梨醇往往會將凍干塊的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度降低太多。如上所示，通過用麥芽糖醇代替山梨醇，可以克服這一點；且仍保持該病毒的滴度。
5.3各種各樣的制劑的成分這個實驗表明許多配方是可允許的。
5.4輪狀病毒和Al(OH)3抗酸劑之間的結(jié)合
將Al(OH)3用作抗酸劑。該表表明輪狀病毒與不溶性無機鹽(Al(OH)3)結(jié)合，因為輪狀病毒與Al(OH)3一起離心(上清液中的病毒活性降低)。5.5在病毒滴定前用檸檬酸鈉溶解Al(OH)3抗酸劑
當(dāng)輪狀病毒和Al(OH)3結(jié)合時，凍干有關(guān)的一切(包括Al(OH)3)是可能的。凍干后，通過在檸檬酸鈉中溶解Al(OH)3而回收所述的輪狀病毒是可能的。這個步驟不損害所述的輪狀病毒，且在這個溶解步驟后保持其活性。
5.6Al(OH)3-輪狀病毒之結(jié)合解離后輪狀病毒的感染性病毒釋放的機制(通過溶解該載體)可以很好地在體內(nèi)發(fā)生。實際上，在pH6以下，氫氧化鋁成為完全溶解的，因此在胃中將放出輪狀病毒。
在胃中，Al+++離子不被吸收(J.J.Powell，R.Jugdaohsingh和R.P.H.Thompson，The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinaltrack，Proceedings of the Nutrition Society(1999)，58，147-153)。
在腸道中，由于pH升高，沉淀出鋁的不溶形式(Al(OH)3或AlPO4)，且通過天然的方式將其排除。
不了解新形成的Al(OH)3(或AlPO4)沉淀是否能和游離的輪狀病毒重新結(jié)合。這提出了Al(OH)3-輪狀病毒結(jié)合物本身的感染性問題。
通過其它機制由Al(OH)3-輪狀病毒結(jié)合物釋放出輪狀病毒也是可能的。例如，賴氨酸干擾在Al(OH)3上的病毒吸附。已知象硼酸根(borate)、硫酸根、碳酸根和磷酸根那樣的其它陰離子被特異性地吸附到氫氧化鋁上，因此在理論上，從Al(OH)3-輪狀病毒結(jié)合物置換出(通過競爭吸附位點)輪狀病毒應(yīng)該是可能的。 因此，可以由輪狀病毒-Al(OH)3結(jié)合物釋放出輪狀病毒，釋放出的輪狀病毒仍是活性的。
可以或者通過溶解Al(OH)3(在胃中用鹽酸或在體外用檸檬酸鈉)，或者通過用一種堿性氨基酸(賴氨酸)置換出輪狀病毒，來完成這種釋放。
5.7Al(OH)3-輪狀病毒結(jié)合物的感染性一劑凍干的輪狀病毒用水重建，并將其分成兩部分。被認(rèn)為是參照的第一部分得到了追加體積的水。第二部分得到懸浮于0.240ml水中的24mg Al(OH)3(臨床前病毒滴定)。 當(dāng)存在Al(OH)3時，該輪狀病毒是有活性的，且與參照樣品相比，病毒的滴定值較高。
不分割該凍干劑且通過添加12mg Al(OH)3或24mg Al(OH)3，來重做這個實驗。
這里的參照樣品是用一種檸檬酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液重建的樣品。這樣，在存在Al(OH)3情況下，病毒滴度又是較高的。
DRVC003A46 DRVC003A46 DRVC003A46+++1.5ml WL緩沖液 在0.120ml中的在0.240ml中的12mg Al(OH)324mg Al(OH)3++1.380ml H2O 1.260ml H2O5.34 6.24 6.055.32 5.95 6.26同上面實施例中一樣，輪狀病毒與Al(OH)3微粒結(jié)合，因為可通過離心拋棄該病毒。DRVC003A46是一種凍干的經(jīng)配制的輪狀病毒(蔗糖2％；葡聚糖4％；山梨醇3％；氨基酸2％)。 SDSAA＝蔗糖2％、葡聚糖4％、山梨醇3％、氨基酸2％。
根據(jù)對上清液進行的病毒滴定，吸附該輪狀病毒所需的Al(OH)3量似乎是少的(始于一劑凍干劑5.7log)。
輪狀病毒吸附于Al(OH)3所需的時間似乎是短的。
在存在24mg Al(OH)3的情況下，重建一劑凍干的輪狀病毒，并于0分鐘、15分鐘、60分鐘和24小時后，將其離心。在病毒滴定前，把“離心下層塊”(“culot”)重新懸浮于SDSAA中。
5.8將CaCO3用作抗酸劑為了在疫苗中避免鋁，用另一種不溶性無機鹽CaCO3(碳酸鈣)來取代抗酸劑Al(OH)3。
用CaCO3觀測到的現(xiàn)象類似于所描述的有關(guān)Al(OH)3的那些現(xiàn)象-輪狀病毒與所述無機鹽結(jié)合；-當(dāng)與該無機鹽結(jié)合時，保持輪狀病毒的活性；-通過用一種酸溶解該無機堿有可能由該結(jié)合物釋放出輪狀病毒；-有可能將所述抗酸劑與該輪狀病毒的共凍干。
CaCO3與輪狀病毒的結(jié)合在最初的一個試驗中，凍干的輪狀病毒(病毒滴度為5.7)用CaCO3在水中的懸浮液(50mg在1.5ml中)來重建；然后，將其離心，并將上清液的病毒滴度與沉淀(Culot)的進行比較。 這表明多于90％的輪狀病毒與CaCO3結(jié)合。而且，當(dāng)病毒被結(jié)合時，完成滴定和回收原始病毒量是可能的。同樣，病毒滴度稍微高于無CaCO3時獲得的病毒滴度。
CaCO3與輪狀病毒結(jié)合的量凍干的輪狀病毒用CaCO3在水(1.5ml)中的懸浮液來重建；CaCO3的量為10mg50mg100mg然后，將其離心，并將上清液的病毒滴度與沉淀(Culot)的進行比較。
因此，顯然更多的CaCO3和更多的病毒是結(jié)合的，而在上清液中發(fā)現(xiàn)較少的病毒。然而，沒完全回收全部的劑量(預(yù)期總量至少為5.3或甚至如同較早獲得的5.8-參見上文)。
CaCO3在Rossett-Rice抗酸劑滴定期間對輪狀病毒的保護用10劑凍干的輪狀病毒(DRVC003A46)和50mg CaCO3，來進行兩種類型的嬰兒Rossett-Rice滴定在傳統(tǒng)的Rossett-Rice滴定中，把該抗酸劑與輪狀病毒混合，并將鹽酸注入到這種介質(zhì)中。
在“反向”嬰兒的Rossett-Rice中，情況相反將抗酸劑滴入到鹽酸池中(如同體內(nèi)發(fā)生的情況一樣)。
因此，在這個體外實驗中，碳酸鈣能夠保護大約20％的輪狀病毒，使其不受鹽酸存在的影響；而氫氧化鋁則不能。5.9在存在CaCO3抗酸劑情況下輪狀病毒的凍干
這是“整體型(all in one)”的，即輪狀病毒和抗酸劑(CaCO3)在同一小瓶中一起凍干。為了防止在裝填步驟期間CaCO3沉降，需要粘性劑。這樣的粘性劑的實例包括黃原膠和淀粉。甚至在存在黃原膠和淀粉情況下，所述輪狀病毒的活性也得以保持。
5.10當(dāng)放置于口中時快速崩解的凍干片劑下面的配方表明“凍干塊(lyoc)”概念，即凍干塊在口中迅速溶解。
在所述“凍干塊概念”方面，既可以用黃原膠，又可以用淀粉(保持該凍干塊的迅速溶解性質(zhì))。實施例6應(yīng)用碳酸鈣作為輪狀病毒疫苗組合物的抗酸劑當(dāng)把CaCO3在水中的懸浮液用作輪狀病毒的抗酸劑時，有一個問題，即當(dāng)將碳酸鈣粉末放置于水中時，因為該粉末密度值接近2.6，且平均粒徑為30μm，所以碳酸鈣粒子迅速沉降。
可以通過以下方法減慢這種沉降(1)增加周圍介質(zhì)的密度，(2)增加周圍介質(zhì)的粘度，(3)減小所述粒子的大小，(4)保持粒子相互遠(yuǎn)離。
6.1增加周圍介質(zhì)的密度如果把CaCO3-水懸浮液(當(dāng)置于注射器中時)置于凍干塊(包含蔗糖2％、葡聚糖4％、山梨醇3％、氨基酸2％)上，則增加周圍介質(zhì)的密度；但CaCO3沉降的速率與CaCO3-水懸浮液的并無很大差異。
6.2增加周圍介質(zhì)的粘度假塑性賦形劑假塑性溶液的定義為與在攪動期間的溶液粘度相比在靜置時具有較高粘度的溶液。
常見的這種類型的賦形劑是天然的聚合物，例如阿拉伯樹膠黃耆膠瓊脂藻酸鹽果膠半合成的聚合物，例如羧甲基纖維素(Tyloses C)、甲基纖維素(Methocels A、Viscotrans MC、Tylose MH和MB)、羥丙基纖維素(Klucels)、羥丙基甲基纖維素(Methocels E和K、Viscontrans MPHC)。
通常，這些假塑性賦形劑與觸變劑一起使用。
具有低流動能力的假塑性賦形劑這些聚合物在足夠濃度下引起產(chǎn)生在靜置時具有低流動能力的高粘度溶液的結(jié)構(gòu)流體排列。需要給予該系統(tǒng)一定量的能量，以讓其流動和轉(zhuǎn)移。
為了獲得一種流體溶液，需要外來能量(攪動)暫時破壞該結(jié)構(gòu)流體排列。
這樣的聚合物的實例是Carbopols和黃原膠。
觸變賦形劑用這些賦形劑在靜置時得到一種凝膠結(jié)構(gòu)；而在攪動時，則獲得一種流體溶液。
觸變賦形劑的實例是Veegum(硅酸鋁鎂)和Avicel RC(大約89％的微晶纖維素和11％的羧甲基纖維素鈉)。
6.3減小所述粒子的大小CaCO3粒徑的減小導(dǎo)致該化合物抗酸能力降低。
6.4保持粒子相互遠(yuǎn)離這是在Veegum和Avicel RC中的情況；對于這種情況，不溶性粒子比CaCO3粒子小些(大約小1μm)，將所述不溶性粒子置于CaCO3粒子之間以便防止聚集。實施例7產(chǎn)品設(shè)計下面方案顯示了可能的產(chǎn)品設(shè)計的實例。
7.1在注射器中的CaCO3在得到多批臨床用的凍干小瓶中的輪狀病毒后，可以把所述抗酸劑置于注射器中所含有的重建液體之中。 在這種產(chǎn)品規(guī)格中，不僅在裝填步驟期間，而且在該產(chǎn)品的整個貯藏期內(nèi)(至少2年)，CaCO3的沉降都必須在控制之下。
7.2在凍干小瓶中的CaCO3
7.3在泡罩中凍干在這種情況中，將輪狀病毒、CaCO3和黃原膠在所述泡罩中一起直接凍干。
實施例8不同輪狀病毒株的凍干
在“Fields”(Raven press，1990年，第二版)的第1361頁上，將病毒株DS-1、P和VA70分別描述為血清型為G2、G3和G4的人輪狀病毒參照株。
在這個實驗中，凍干了不同的輪狀病毒株。
對于所有這些病毒株而言，既在凍干期間保持了病毒滴度，又顯示了加速穩(wěn)定性(在37℃一周)。實施例9在成人中口服給予一次輪狀病毒疫苗的I期安全性研究在年齡18至45歲的健康成人中，進行了一項I期研究，來評價口服一劑106.0ffu的P43疫苗的安全性和反應(yīng)原性。
該臨床試驗是雙盲和隨機的。該試驗是以安慰劑作對照并且是自給的。在比利時的一個中心里進行該研究。
研究人群登記了總共33個被試者，其中11個在安慰劑組里，而22位在疫苗組中；且所有被試者都完成了所述的研究。所有的志愿者都是白種人(Caucasian)。在接種時，他們的平均年齡是35.3歲，年齡從18歲至44歲。該試驗開始于一月且進行了稍多于一個月。
材料疫苗按照Good Manufacturing Practices來生產(chǎn)、純化、配制及凍干多批臨床用P43疫苗。按照Quality Control and Quality Assurance交付各批疫苗。每個小瓶的疫苗含有下面的組分活性成分P43病毒株 最少105.8ffu賦形劑、穩(wěn)定劑蔗糖 9mg葡聚糖18mg山梨醇13.5mg氨基酸9mg
安慰劑制備并交付安慰劑小瓶。每個小瓶的安慰劑包含下面的組分賦形劑、穩(wěn)定劑蔗糖 9mg葡聚糖 18mg山梨醇 13.5mg氨基酸 9mg稀釋劑用注射用水作為稀釋劑，來重建疫苗和安慰劑。
給予在給予所述疫苗或安慰劑之前大約10至15分鐘，口服給予兩個組的被試者10ml Mylanta。Mylanta是一種已注冊的抗酸劑。該抗酸劑增加胃的pH，并在輪狀病毒通過胃期間防止輪狀病毒失活。
為了制備所述疫苗，用1.5ml注射用稀釋水來重建每小瓶含有105.8ffu的兩小瓶凍干P43。這達到每劑106.1ffu的計算的病毒滴度。迅速地給予作為單獨一劑口服的所述重建的疫苗。
為了制備所述安慰劑，用1.5ml注射用水來重建兩小瓶凍干的安慰劑；并將其作為單獨一劑口服給予。
安全性和反應(yīng)原性應(yīng)用以下安全性和反應(yīng)原性標(biāo)準(zhǔn)誘發(fā)的一般癥狀是發(fā)熱、腹瀉、嘔吐、惡心、腹痛和食欲不振。在給予疫苗后的8天期間記錄這些癥狀。
在給予疫苗后30天期間記錄非誘發(fā)的癥狀。
在整個研究期間記錄嚴(yán)重有害的事件。
應(yīng)該在給予疫苗后的8天期間，收集腹瀉樣品。
結(jié)果是在各個觀測期期間，沒有報告誘發(fā)的癥狀、非誘發(fā)的癥狀及嚴(yán)重有害的事件。
沒有報告腹瀉的病例。
結(jié)論當(dāng)按雙盲方式口服給予年齡18至44歲的成年健康志愿者作為單獨一劑106.1ffu劑量的SB Biologicals P43疫苗時，該SB Biologicals P43疫苗相對于所述安慰劑是安全的。
序列表<110>史密絲克萊恩比徹姆有限公司(SmithKline Beecham Biologicals S.A.)<120>疫苗<130>B45194<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>2350<212>DNA<213>人<400>1atggcttcac tcatttatag acaacttctc actaattcat attcagtaga tttacatgat 60gaaatagagc aaattggatc agaaaaaact cagaatgtaa ctataaatcc gggtccattt 120gcacagacta gatatgctcc agtcaattgg gatcatggag agataaatga ttcgactaca 180gtagaaccaa ttttagatgg tccttatcag ccaactacat ttactccacc taatgattat 240tggatactta ttaattcaaa tacaaatgga gtagtatatg aaagtacaaa taatagtgac 300ttttggactg cagtcgttgc tattgaaccg cacgtcaacc cagtagatag acaatatatg 360atatttggtg aaagcaagca atttaatgtg agtaacgatt caaataaatg gaagttttta 420gaaatgttta gaagcagtag tcaaaatgaa ttttataata gacgtacatt aacttctgat 480accagacttg taggaatatt taaatatggt ggaagagtat ggacatttca tggtgaaaca 540ccgagagcta ctactgacag ttcaagtact gcaaatttaa ataatatatc aattacaatt 600cattcagaat tttacattat tccaaggtcc caggaatcta aatgtaatga atatattaat 660aatggtctgc caccaattca aaatactaga aatgtagttc cattgccatt atcatctaga 720tcgatacagt ataagagagc acaagttaat gaagacatta tagtttcaaa aacttcatta 780tggaaagaaa tgcagtataa tagggatatt ataattagat ttaaatttgg taatagtatt 840gtaaagatgg gaggactagg ttataaatgg tctgaaatat catataaggc agcaaattat 900caatataatt acttacgtga cggtgaacaa gtaaccgcac acaccacttg ttcagtaaat 960ggagtgaaca attttagcta taatggaggg tttctaccca ctgattttgg tatttcaagg1020tatgaagtta ttaaagagaa ttcttatgta tatgtagact attgggatga ttcaaaagca1080tttagaaata tggtatatgt tagatcatta gcagctaatt taaattcagt gaaatgtaca1140ggtggaagtt attatttcag tataccagta ggtgcatggc cagtaatgaa tggtggcgct1200gtttcgttgc attttgccgg agttacatta tccacgcaat ttactgattt tgtatcatta1260aattcactac gatttagatt tagtttgaca gttgatgaac cacctttctc aatactgaga1320acacgtacag tgaatttgta tggattacca gccgctaatc caaataatgg aaatgaatac1380tacgaaatat caggaaggtt ttcactcatt tctttagttc caactaatga tgattatcag1440actccaatta tgaattcagt gacggtaaga caagatttag agcgccaact tactgattta1500cgagaagaat ttaactcatt gtcacaagaa atagctatgg cacaattgat tgatttagca1560ctgttgcctc tagatatgtt ttccatgttt tcaggaatta aaagtacaat tgatttaact1620aaatcaatgg cgactagtgt aatgaagaaa tttagaaaat caaaattagc tacatcaatt1680tcagaaatga ctaattcatt gtcagatgct gcttcatcag catcaagaaa cgtttctatt1740agatcgaatt tatctgcgat ttcaaattgg actaatgttt caaatgatgt gtcaaacgta1800actaattcat tgaacgatat ttcaacacaa acatctacaa ttagtaagaa acttagatta1860aaagaaatga ttactcaaac tgaaggaatg agctttgacg acatttcagc agctgtacta1920aaaacaaaaa tagatatgtc tactcaaatt ggaaaaaata ctttacctga tatagttaca1980gaagcatctg agaaatttat tccaaaacga tcatatcgaa tattaaagga tgatgaagta2040atggaaatta atactgaagg aaaattcttt gcatacaaaa ttaatacatt tgatgaagtg2100ccattcgatg taaataaatt cgctgaacta gtaacagatt ctccagttat atcagcgata2160atcgatttta agacattgaa aaatttaaat gataattatg gaatcactcg tacagaagcg2220ttaaatttaa ttaaatcgaa tccaaatatg ttacgtaatt tcattaatca aaataatcca2280attataagga atagaattga acagttaata ctacaatgta aattgtgaga acgctattga2340ggatgtgacc 2350<210>2<211>1009<212>DNA<213>人<400>2atgtatggtc ttgaatatac cacaattcta atctttctga tatcaattat tctactcaac 60tatatattaa aatcagtaac tcgaataatg gactacatta tatatagatc tttgttgatt 120tatgtagcat tatttgcctt gacaagagct cagaattatg ggcttaactt accaataaca 180ggatcaatgg acactgtata cgctaactct actcaagaag gaatatttct aacatccaca 240ttatgtttgt attatccaac tgaagcaagt actcaaatta atgatggtga atggaaagac 300tcattgtcac aaatgtttct cacaaaaggt tggccaacag gatcagtcta ttttaaagag 360tattcaagta ttgttgattt ttctgtcgat ccacaattat attgtgatta taacttagta 420ctaatgaaat atgatcaaaa tcttgaatta gatatgtcag agttagctga tttaatattg 480aatgaatggt tatgtaatcc aatggatata acattatatt attatcaaca atcgggagaa 540tcaaataagt ggatatcaat gggatcatca tgtactgtga aagtgtgtcc actgaatacg 600caaatgttag gaataggttg tcaaacaaca aatgtagact cgtttgaaat ggttgctgag 660aatgagaaat tagctatagt ggatgtcgtt gatgggataa atcataaaat aaatttgaca 720actacgacat gtactattcg aaattgtaag aagttaggtc caagagagaa tgtagctgta 780atacaagttg gtggctctaa tgtattagac ataacagcag atccaacgac taatccacaa 840actgagagaa tgatgagagt gaattggaaa aaatggtggc aagtatttta tactatagta 900gattatatta accaaatcgt gcaggtaatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgca 960gctttttatt atagagtata gatatatctt agattagatc gatgtgacc1009
權(quán)利要求
1.一種減毒輪狀病毒種群，其特征在于它由單一的變異體或大體上單一的變異體組成，所述變異體由編碼名為VP4和VP7的主要病毒蛋白中至少一種的核苷酸序列限定。
2.一種權(quán)利要求1的輪狀病毒種群，所述種群為一個克隆株。
3.一種權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的輪狀病毒種群，所述種群來源于人輪狀病毒感染。
4.一種權(quán)利要求1-3中任一項的輪狀病毒種群，所述種群在人體中復(fù)制且被人體排泄出。
5.一種權(quán)利要求1-4中任一項的輪狀病毒種群，其中所述大體上單一的變異體是其中所述VP4基因包含一段包括以下堿基中至少一種的核苷酸序列的變異體從起始密碼子起，在788位的腺嘌呤堿基(A)、在802位的腺嘌呤堿基(A)以及在501位的胸腺嘧啶堿基(T)。
6.一種權(quán)利要求5的輪狀病毒種群，其中所述VP4基因包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列包括從起始密碼子起，在788位和802位的腺嘌呤堿基(A)，以及在501位的胸腺嘧啶堿基(T)。
7.一種權(quán)利要求1-6中任一項的輪狀病毒種群，其中所述大體上單一的變異體是其中所述VP7基因包含一段包括以下堿基中至少一種的核苷酸序列的變異體從起始密碼子起，在605位的胸腺嘧啶(T)、在897位的腺嘌呤(A)和在897位的鳥嘌呤(G)。
8.一種權(quán)利要求7的輪狀病毒種群，其中所述VP7基因包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列包括從起始密碼子起，在605位的胸腺嘧啶(T)、以及在897位的腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)。
9.一種權(quán)利要求5-8的輪狀病毒種群，其中所述VP4基因包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列包括從起始密碼子起，在788位和802位的腺嘌呤(A)及在501位的胸腺嘧啶(T)；且所述VP7基因包含一段核苷酸序列，所述核苷酸序列包括從起始密碼子起，在605位的胸腺嘧啶(T)和在897位的腺嘌呤(A)。
10.一種輪狀病毒，所述輪狀病毒包含一種編碼VP4蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列如圖1中所示；和/或一種編碼VP7蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列如圖2中所示。
11.一種權(quán)利要求1-10中任一項的輪狀病毒種群，所述輪狀病毒種群稱為P43且以保藏號ECACC 99081301保藏。
12.一種輪狀病毒變異體、其輪狀病毒后代和其免疫學(xué)活性衍生物、以及由它而獲得的材料，所述輪狀病毒變異體稱為P43且以保藏號ECACC 99081301保藏。
13.一種輪狀病毒重配體，所述輪狀病毒重配體包含權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的輪狀病毒變異體P43之至少一種抗原或至少一個節(jié)段。
14.一種產(chǎn)生由大體上單一的變異體組成的純化輪狀病毒種群的方法，所述方法包括在合適的細(xì)胞系中將一種輪狀病毒制劑傳代；可任意選擇地采用或者有限稀釋步驟或者單個噬斑分離的步驟，來選擇均一的培養(yǎng)物；以及通過對所述VP4和/或所述VP7基因序列的適當(dāng)區(qū)域進行序列測定而檢驗大體上單一的變異體的存在。
15.一種權(quán)利要求14的方法，其中在AGMK細(xì)胞中將所述輪狀病毒制劑傳代。
16.一種權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的方法，其中所述輪狀病毒制劑具有89-12病毒株或其衍生物的特征。
17.一種權(quán)利要求14-16中任一項的方法，所述方法包括附加的乙醚處理步驟，以除去意外產(chǎn)生的乙醚敏感性污染因子。
18.一種疫苗組合物，所述組合物包含與一種合適的藥用載體或佐劑混合的一種權(quán)利要求1-13中任一項的活減毒病毒。
19.一種權(quán)利要求18的疫苗組合物，所述疫苗組合物適合于口服給予。
20.一種權(quán)利要求19的疫苗組合物，其中所述活減毒病毒是與一種抗酸劑組合物一起配制的。
21.一種權(quán)利要求20的疫苗組合物，其中所述抗酸劑組合物包括一種有機抗酸劑。
22.一種權(quán)利要求21的疫苗組合物，其中所述抗酸劑為檸檬酸鈉。
23.一種權(quán)利要求20的疫苗組合物，其中所述抗酸劑組合物包括一種無機抗酸劑。
24.一種權(quán)利要求23的疫苗組合物，其中所述抗酸劑是氫氧化鋁。
25.一種權(quán)利要求23的疫苗組合物，其中所述抗酸劑是碳酸鈣。
26.一種權(quán)利要求25的疫苗組合物，所述組合物還包括一種粘性劑。
27.一種權(quán)利要求26的疫苗組合物，其中所述粘性劑為黃原膠。
28.一種權(quán)利要求25-27中任一項的疫苗組合物，其中所述活減毒病毒是與碳酸鈣和黃原膠一起配制的，且用水溶液重建。
29.一種權(quán)利要求20-28中任一項的疫苗組合物，其中所述減毒活疫苗是與所述抗酸劑組合物一起配制的，且是在泡罩片中凍干的。
30.權(quán)利要求18-29中任一項的疫苗組合物，其中所述病毒為凍干形式。
31.一種權(quán)利要求30的疫苗組合物，其中所述活減毒病毒和所述抗酸劑組合物存在于獨立的容器中，以供在給予之前配制為液體疫苗組合物。
32.一種權(quán)利要求30的疫苗組合物，其中所述活減毒病毒和所述抗酸劑組合物存在于同一容器中，以供配制為在給予之前用水溶液重建的凍干疫苗組合物。
33.一種包含活減毒輪狀病毒的疫苗組合物，其中所述病毒為凍干形式。
34.一種權(quán)利要求33的疫苗組合物，其中所述組合物為當(dāng)被置于舌上時立即溶解的速溶片劑形式。
35.一種權(quán)利要求33或權(quán)利要求34的疫苗組合物，所述組合物包含與一種例如碳酸鈣的無機抗酸劑及一種例如黃原膠的粘性劑一起混合的一種凍干的減毒活輪狀病毒。
36.一種權(quán)利要求35的疫苗組合物，其中所述減毒病毒和所述抗酸劑組合物存在于獨立的容器中，以供在給予之前配制為液體疫苗組合物。
37.一種權(quán)利要求35的疫苗組合物，其中所述減毒病毒和所述抗酸劑組合物被配制到同一容器中，作為一種在給予之前用含水溶液重建的凍干疫苗組合物。
38.一種制造輪狀病毒疫苗的方法，所述方法包括將一種凍干的、活減毒人輪狀病毒與一種抗酸劑及一種粘性劑一起混合。
39.一種在人類中預(yù)防輪狀病毒感染的方法，所述方法包括給予需要預(yù)防輪狀病毒感染的人類對象有效量的一種權(quán)利要求18-27中任一項的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供一個由單一的變異體或基本上單一的變異體的減毒輪狀病毒種群,所述變異體由編碼稱為VP4和VP7的主要病毒蛋白中至少一種的核苷酸序列限定。本發(fā)明特別提供一個稱為P43的輪狀病毒種群。本發(fā)明還提供一種輪狀病毒疫苗的新型制劑,所述制劑為置于舌上時立即溶解的速溶形式。
文檔編號A61P31/12GK1379683SQ00814349
公開日2002年11月13日 申請日期2000年8月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月17日
發(fā)明者B·D·A·科勞, F·德納穆爾, I·克諾特, A·波利斯查克, G·蒂里, V·范德維爾德 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司