專利名稱：治療前列腺癌的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療前列腺癌的方法，通過單獨(dú)施用膠原酶或與糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、鏈激酶或它們的混合物合并施用。典型的實(shí)施例包括施用包括膠原酶、透明質(zhì)酸酶、非離子表面活性劑、抗生素和鈣離子的混合物的組合物。
背景技術(shù)：
如今據(jù)信約有10,000,000美國男性患有前列腺癌。雖然只有不到3％患有該病的男性因此而死亡，但前列腺癌依舊是男性癌癥死亡的第二殺手。這種癌癥通常局限于前列腺，但在某些情況中癌癥被診斷出時已擴(kuò)散到骨骼、腎或腦。
疾病的年度檢查增加了早期檢測的可能性，尤其在疾病擴(kuò)散之前。這些檢查包括直腸指檢和血液前列腺-特異性-抗原(PSA)測試。其它檢查方法包括超聲波成像、放射性核素掃描和活組織檢查。
血液PSA測試已使前列腺癌的早期診斷和有效治療有了革命性的進(jìn)展。PSA是絲氨酸蛋白酶家族的一種蛋白酶，且是前列腺分泌的最豐富蛋白質(zhì)中的一種。PSA是在管上皮和前列腺腺泡中合成的，且位于細(xì)胞中的胞質(zhì)粒和小泡、粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、分泌顆粒和溶酶體(lyosomal)密體。PSA被分泌到前列腺小管腔內(nèi)，在那里成為精清的成分。為了到達(dá)血清，PSA從腔細(xì)胞擴(kuò)散，通過上皮基膜和前列腺基質(zhì)，或通過毛細(xì)管基膜和上皮細(xì)胞或進(jìn)入淋巴。一旦進(jìn)入血流，大部分PSA就與α-1-抗胰凝乳蛋白酶(PSA-ACT)和α-2-巨球蛋白形成復(fù)合物，少量PSA仍為游離狀態(tài)(游離PSA)。對前列腺癌而言游離PSA的水平通常會升高。
一旦診斷出前列腺癌，就必須確定并施用合適的治療方法。已有的治療方法包括根治性前列腺切除術(shù)、放療和激素抑制。為了確定合適的治療方法，通?？紤]一些因素如患者的年齡和疾病的嚴(yán)重程度。通常這種病對較年輕的患者攻擊性較高。通常將任何大于0.5cc的腫瘤視為是臨床顯著的。局部前列腺癌的優(yōu)選治療是根治性前列腺切除術(shù)。但這種治療可能會導(dǎo)致死亡、失禁、陽痿、直腸受損或肺栓塞。
因此，需要改善前列腺癌的治療方法，以降低一種或多種此類不良副作用的可能性。具體說，需要提供改善的治療方法以降低患者患陽痿的可能性。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療活哺乳動物前列腺癌的方法。一方面，該治療涉及體內(nèi)激活PSA?？梢杂靡恍┓椒ㄖ械囊环N來激活前列腺內(nèi)或附近的PSA，如通過局部施用鈣離子，優(yōu)選的是與膠原酶和任選地其它水解酶如透明質(zhì)酸酶聯(lián)用。
PSA是一種蛋白酶，是前列腺分泌的最豐富蛋白質(zhì)中的一種?；罨腜SA可以降解前列腺癌性腫瘤，通過如干擾腫瘤的初始生長期和/或干擾血管生成期。前列腺癌生長的初期是指腫瘤生長到豌豆大小左右。除非腫瘤在其周圍或內(nèi)部形成其本身的血管，即所謂的血管生成的過程，否則腫瘤不能再長大。血管生成包括將化學(xué)信號送遞入周圍血管從而侵蝕血管壁，將毛細(xì)血管送入腫瘤。通過干擾血管生成，腫瘤就不能生長超過其初始大小。在本發(fā)明的一方面，通過施用鈣離子可激活PSA。
在本發(fā)明的另一方面，前列腺癌的治療方法指施用含有治療有效濃度膠原酶的組合物。膠原酶可能降解前列腺癌性腫瘤，通過如維持癌性腫瘤周圍或內(nèi)部的連接組織，包括血管生成所產(chǎn)生的毛細(xì)血管。
另一方面，本發(fā)明的方法涉及局部施用治療有效濃度的膠原酶，并與糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、鏈激酶或它們的混合物聯(lián)用。與膠原酶一起給予的優(yōu)選酶是糖苷酶，如透明質(zhì)酸酶。
用于本發(fā)明的組合物還可含有鈣離子、非離子表面活性劑(如TritonX-100)和抗生素(如慶大霉素)或與它們合并施用。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種治療前列腺癌的方法。在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)可以用含有至少一種水解酶的組合物來治療前列腺癌。本文所用的“治療”包括預(yù)防、抑制、治愈和減輕前列腺癌或其癥狀和預(yù)防或減輕前列腺癌的轉(zhuǎn)移。
前列腺癌的緩解包括降解前列腺腫瘤，如分解前列腺腫瘤結(jié)構(gòu)的完整性或連接組織，從而當(dāng)與治療前腫瘤的大小相比此時腫瘤的大小減少了。前列腺癌的治愈包括降解前列腺腫瘤，從而在治療后就不再檢測到腫瘤。可以減少腫瘤的大小或使腫瘤大小變得檢測不到，如通過由于供血的缺乏而萎縮或受一種或多種由本發(fā)明方法所施用的成分的攻擊或降解。
前列腺癌擴(kuò)散的緩解包括減緩前列腺癌擴(kuò)散到其它組織的速度。前列腺癌擴(kuò)散的防止包括預(yù)防前列腺腫瘤擴(kuò)散到前列腺之外。
依據(jù)本發(fā)明的一種療法是通過施用治療有效濃度的組合物，所述的組合物含有能有效緩解、治愈、抑制或防止前列腺癌或預(yù)防或減輕前列腺癌擴(kuò)散量的骨膠原。
將含有膠原酶的組合物局部施用于前列腺。局部施用包括將組合物送入前列腺和/或癌性治療內(nèi)或周圍。局部施用還包括用組合物包圍前列腺和/或癌性腫瘤或?qū)⒔M合物施用于前列腺和/或癌性腫瘤表面。癌性腫瘤包括前列腺癌、癌細(xì)胞等。
本發(fā)明的其它治療可以通過激活體內(nèi)PSA進(jìn)行。體內(nèi)PSA激活包括激活在前列腺內(nèi)和/或附近的PSA，尤其是哺乳動物內(nèi)源性PSA。PSA是一種蛋白酶，被激活后能有助于前列腺腫瘤的溶解或降解。在另一實(shí)施例中，通過在前列腺中局部施用鈣離子可以激活PSA。
雖然本發(fā)明中的方法不希望束縛于理論，現(xiàn)描述涉及本發(fā)明方法如何治療前列腺癌的理論。在初始階段，癌性治療生長到豌豆大小。然后通過血管生成，腫瘤長大(即通過將化學(xué)信號送遞到周圍血管，腫瘤在其周圍和內(nèi)部長出血管向腫瘤提供毛細(xì)血管)。據(jù)信本發(fā)明的治療干擾這種進(jìn)展。
PSA是一種分子量約為3.3萬道爾頓的絲氨酸蛋白酶，且是前列腺分泌物中最豐富的蛋白質(zhì)之一。據(jù)信通過激活PSA，PSA可以部分或完全溶解或降解前列腺內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。這種過程特別可用于初始生長階段的腫瘤以及血管生成階段的腫瘤。可以通過如施用鈣離子激活PSA。
膠原酶是一種金屬蛋白酶。據(jù)信少量蛋白水解酶的存在可以增加膠原酶的活性，即所存在的蛋白酶的量不能高到蛋白酶將膠原酶消化到使其失活的程度。分泌到前列腺的PSA可能足以增加膠原酶的活性。通過增加膠原酶的活性，膠原酶的活性由不能有效降解足量的底物(如降解結(jié)締組織)的水平上升至能有效降解足夠底物的水平。隨后例如，在PSA存在下，膠原酶可以降解膠原或結(jié)締組織、腫瘤血管和/或腫瘤細(xì)胞基膜。結(jié)果，腫瘤的供血減少或停止，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。這也可能會導(dǎo)致人免疫系統(tǒng)向腫瘤進(jìn)一步的攻擊，和輔助前列腺癌的減輕和治愈或減輕或防止前列腺癌的擴(kuò)散。
在本發(fā)明的方法中，膠原酶可以與其它蛋白酶、酶或適用于增加膠原酶活性或輔助腫瘤降解的蛋白質(zhì)合并施用。例如，膠原酶可以與蛋白酶、糖苷酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、鏈激酶或它們的混合物合并施用。
糖苷酶包括任何能催化糖苷鍵水解的酶。合適的例子包括透明質(zhì)酸酶、神經(jīng)氨酸酶、淀粉酶和溶菌酶。優(yōu)選的糖苷酶包括透明質(zhì)酸酶。
蛋白酶包括任何能催化蛋白質(zhì)或肽中一種或多種肽鍵水解的酶，如羧肽酶、氨肽酶和內(nèi)肽酶。特別適用的例子包括彈性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、鏈霉蛋白酶、分散酶、菠蘿蛋白酶、梭菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、纖溶酶、舍雷硫代肽酶(serrathiopeptidase)、胰酶、組織蛋白酶-G、纖溶酶原激活劑和多形核(PMN)白細(xì)胞絲氨酸蛋白酶。
核酸酶包括任何能催化核酸內(nèi)酯鍵水解的酶，如核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶。合適的例子包括DNase I和RNase。
酯酶包括任何能催化酯水解的酶。合適的例子包括膽固醇酯酶。
脂肪酶包括任何能催化?；视汪人狨ニ獾拿?。合適的例子包括磷酸酯酶。
鏈激酶包括能與纖溶酶原形成復(fù)合物從而催化纖溶酶原活化成纖溶酶的蛋白質(zhì)。
該組合物還可以含有鈣離子、表面活性劑和/或抗生素，或與它們合并施用。
可以單獨(dú)、順序施用組合物中的成分-膠原酶、其它蛋白酶、蛋白質(zhì)、或酶、鈣離子、表面活性劑和抗生素，較佳地以適用于局部用藥的液體藥用單位劑型與另一種混合。所施用的組合物的劑量可以在很大的范圍中變化這易于由臨床醫(yī)生確定。為獲得理想治療目的的優(yōu)選劑量取決于患者的年齡、疾病的特性和嚴(yán)重程度、組合物的效力和施用的方式。
較佳地，適用于本發(fā)明方法的組合物含有膠原酶和至少一種糖苷酶(較佳地為透明質(zhì)酸酶)、蛋白酶(較佳地為胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、鏈霉蛋白酶、彈性蛋白酶、分散酶或纖溶酶)、或核酸酶(較佳地為DNase I)。更佳地，組合物含有膠原酶和糖苷酶(較佳地為透明質(zhì)酸酶)。Gokcen等人的美國專利No.5,116,615中描述了適用于本發(fā)明方法的組合物，本文將其納入作為參考。
膠原酶細(xì)菌膠原酶如溶組織梭菌(Clostridium hystolyticum)的膠原酶EC3.4.24.3是一種已很好定性且可購得的酶，通過在三股螺旋上多個位點(diǎn)的水解，它將膠原降解成短肽。膠原酶在其活性位點(diǎn)含有Zn2+，且與其底物的結(jié)合及形成能完全催化活性所需的構(gòu)型需要Ca2+。
靜脈內(nèi)注射膠原酶顯現(xiàn)出對試驗(yàn)動物有極低程度的危害。對小鼠而言，靜脈注射膠原酶粗制品的LD-50為300mg/kg體重。已顯示膠原酶的口服水溶液在劑量高到8,000mg/kg體重時仍無毒性。對膠原酶而言，大鼠急性靜脈注射LD-50可達(dá)1272單位/公斤。
細(xì)菌膠原酶的商業(yè)產(chǎn)品通常含有少量污染蛋白酶、肽酶、粘多糖酶和糖苷酶，包括梭菌蛋白酶、胰蛋白酶和酪蛋白酶樣氨肽酶。梭菌蛋白酶是粗制膠原酶制劑中最多的污染酶。梭菌蛋白酶含有必需SH基團(tuán)，且能被半胱氨酸激活而受巰基結(jié)合劑的抑制。梭菌蛋白酶也具有胰蛋白酶類的特異性。粗制膠原酶制劑中含有少量污染酶如胰蛋白酶，梭菌蛋白酶常常比高純度的膠原酶制劑具有更高的效力，表明在前列腺癌的治療中可能有多種酶或蛋白酶的共同作用。這些酶和/或蛋白酶能輔助活化膠原和/或輔助降解腫瘤，通過催化水解對腫瘤生長或其結(jié)構(gòu)完整性而言很重要的鍵。
當(dāng)與其它蛋白質(zhì)和/或酶(如糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、鏈激酶或它們的混合物)聯(lián)用時，粗制膠原酶制劑在治療中特別有用。
糖苷酶適用于本發(fā)明方法的糖苷酶包括透明質(zhì)酸酶、神經(jīng)氨酸酶、淀粉酶和溶菌酶。較佳地糖苷酶是透明質(zhì)酸酶。
已知透明質(zhì)酸酶(透明質(zhì)酸-4-聚糖水解酶)是一種已知的催化透明質(zhì)酸(酸性粘多糖)水解成雙糖、四糖或它們混合物的酶。優(yōu)選的是從綿羊睪丸(EC2.1.1.35)衍生出的透明質(zhì)酸酶。
將75,000國際單位的透明質(zhì)酸酶注射入動物，血壓、呼吸、體溫或腎功能都沒有明顯的變化。通常透明質(zhì)酸酶是不注射到已知感染的區(qū)域的。
淀粉酶包括酶如α-淀粉酶或β-淀粉酶，淀粉酶能水解淀粉、糖原和相關(guān)多糖中的O-葡糖基。
神經(jīng)氨酸酶將連接末端非還原性N-和O-酰基神經(jīng)氨基酸殘基的2，3-、2，6-和2，8-葡糖苷鍵水解成半乳糖，將N-乙酰基己糖胺、或N-或O-?；窠?jīng)氨基酸殘基水解成半乳糖，將寡糖中的N-乙?；禾前贰⒒騈-或O-?；窠?jīng)氨基酸殘基水解成糖蛋白或糖脂。
溶菌酶水解葡聚糖肽異聚物中N-乙?；谒岷?-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖殘基間的β-1，4-鍵。溶菌酶為EC3.21.17。
蛋白酶適用于本發(fā)明方法蛋白酶的例子包括彈性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、鏈霉蛋白酶、分散酶、菠蘿蛋白酶、梭菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、纖溶酶、舍雷硫代肽酶、胰酶、組織蛋白酶-G、纖溶酶原激活劑和多形核白細(xì)胞絲氨酸蛋白酶。
彈性蛋白酶包括任何能水解彈性蛋白的酶。胰彈性蛋白酶EC 3.4.21.36就是一個例子。胰彈性蛋白酶催化蛋白質(zhì)(包括彈性蛋白)的水解，擇優(yōu)切割A(yù)la-Xaa。
胰蛋白酶是一種擇優(yōu)切割A(yù)rg-Xaa和Lys-Xaa的絲氨酸內(nèi)切蛋白酶。胰蛋白酶為EC 3.4.21.4。
胰凝乳蛋白酶是絲氨酸內(nèi)切酶EC3.4.21.1。
鏈霉蛋白酶(Calbiochem/Behring，La Jolla，California的注冊商品名)是從鏈霉菌得到的各種菌外和菌內(nèi)蛋白酶的混合物。它能將任何蛋白質(zhì)基本上完全水解成游離氨基酸。
分散酶是一種通常從多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)得到的中性金屬蛋白酶。
菠蘿蛋白酶是一種具有廣特異性的半胱氨酸蛋白酶，鑒定為EC 3.4.22.32。
梭菌蛋白酶是一種特異性切割A(yù)rg-Xaa和Arg-Pro鍵的半胱氨酸蛋白酶，鑒定為EC 3.4.22.8。
嗜熱菌蛋白酶是一種擇優(yōu)切割Xaa-Leu和Xaa-Phe的金屬內(nèi)切蛋白酶，鑒定為EC3.4.24.27。
枯草桿菌蛋白酶是一種催化蛋白質(zhì)水解的絲氨酸內(nèi)切蛋白酶，對肽鍵特異性廣，鑒定為EC 3.4.21.62。
木瓜酶是一種半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶，其擇優(yōu)水解結(jié)合于Arg、Lys、Phe殘基上羰基的肽，鑒定為EC 3.4.22.2。木瓜酶還具有酯酶、硫酯酶、酰胺轉(zhuǎn)移酶和轉(zhuǎn)酯酶活性。
木瓜凝乳蛋白酶是一種具有與木瓜酶類似特異性的內(nèi)切蛋白酶。木瓜凝乳蛋白酶為EC3.4.22.6。
纖溶酶也稱為血纖蛋白溶酶，是一種將血凝塊中的難溶性纖維蛋白轉(zhuǎn)化成可溶性產(chǎn)物的絲氨酸蛋白酶。它是通過蛋白水解從纖溶酶原形成的，擇優(yōu)切割Lys-Xaa和Arg-Xaa。纖溶酶為EC 3.4.21.7。
組織蛋白酶G是一種具有與木瓜凝乳蛋白酶類似特異性的糖蛋白絲氨酸內(nèi)切蛋白酶。該蛋白酶為EC 3.4.21.20。
纖溶酶原激活劑包括任何能將纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶的絲氨酸蛋白酶。
多形核(PMN)白細(xì)胞絲氨酸蛋白酶包括在多形核白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶。
其它蛋白酶包括(但不限制于)胰酶和舍雷硫代肽酶。
核酸酶、脂肪酶和酯酶適用于本發(fā)明方法的核酸酶例子包括DNase I和RNase。DNase I(脫氧核糖核酸酶I)是一種能催化將DNA內(nèi)切成5’-磷酸二核苷酸和5’-磷酸寡核苷酸終產(chǎn)物的酶。DNase為EC 3.1.21.1。RNase是一類切割磷酸二酯鍵和RNA鏈的核酸酶。
適用于本發(fā)明方法脂肪酶的例子包括膽固醇脂肪酶。
適用于本發(fā)明方法酯酶的例子包括磷酸酯酶。磷酸酯酶是一種催化甘油磷脂水解的酶。已將磷酸酯酶分成A1、A2、B、C和D型。
鈣離子還可施用鈣離子來治療前列腺癌。鈣離子可以用以激活膠原酶和/或PSA?？梢酝ㄟ^如氯化鈣來提供鈣離子。通常鈣離子的濃度約在1mM到50mM之間，較佳地在10mM和50mM之間，更佳地約為20mM。
在一治療實(shí)例中，活化的PSA能降解或溶解前列腺腫瘤并干擾初始腫瘤生長和/或血管生成。在另一治療實(shí)例中，可以將活化的PSA與膠原酶聯(lián)合施用，活化的PSA可以增加膠原酶的降解蛋白活性。從而使膠原酶降解前列腺腫瘤。在另一治療實(shí)例中，可以將膠原酶與鈣離子和/或蛋白酶、酶、蛋白質(zhì)、非離子表面活性劑或抗生素一起聯(lián)合施用來治療前列腺癌。
非離子表面活性劑適用于本發(fā)明方法的組合物還可含有非離子表面活性劑或與其一起施用。表面活性劑輔助前列腺癌組織的溶解和裂解。合適的表面活性劑的例子包括烷基苯基多氧乙烯表面活性劑如TritonX-100(辛烷基苯氧基多乙氧基乙醇，可以從Rohm and Haas，Philadelphia，PA購得的一種辛烷基苯基多氧環(huán)氧乙烷)和其它多氧亞烷基-基的非離子表面活性劑如Tween20/80(Atlas Chemical)、Genapol X-080/100/150、C-100(Hoechst AG)、Thesit(Destin-Werk GMBH)、Brij35、Lubrol PX(ICI Americas)、Igepal CO-630/710(GAF)、Surfonic N-95(Jefferson)、Tergitol NP-27(Union Carbide)。其它合適的表面活性劑包括環(huán)氧乙烷與山梨糖醇的部分脂肪酸脂及山梨糖醇酐的縮合產(chǎn)物，如Tween系列(Atlas Chemical)，其中環(huán)氧乙烷與醇的摩爾比例在15∶1到25∶1的范圍內(nèi)，脂肪酸成分包括月桂酸、硬脂酸或油酸(C10-C20)。
其它可有用本發(fā)明的非離子表面活性劑包括C6-C12烷基酚的環(huán)氧乙烷酯，如壬烷苯氧基多氧乙烯醚。特別有用的由8-10摩爾環(huán)氧乙烷與壬基苯酚縮合制備的酯?？少彽玫倪@種類型的表面活性劑包括Igepal CO系列(GAF Corp.)。
其它可用的非離子表面活性劑包括環(huán)氧乙烷與疏水聚氧亞烷基縮合的產(chǎn)物，如環(huán)氧丙烷與丙二醇縮合。這種類型的化合物包括可購得的表面活性劑Pluronic E-127、Pluronic PX和Pluronic L-62(Wyandotte Corp.)。
其它可用的表面活性劑包括C8-C22烷基醇(每摩爾醇含有2-50摩爾環(huán)氧乙烷)的縮合產(chǎn)物。這種類型的表面活性劑包括C10-C20脂肪烷基醇(每摩爾醇含有3-45摩爾環(huán)氧乙烷)的縮合產(chǎn)物。這些化合物是可購得的，如Poly-Tergent SLF系列(Olin Chemicals)或Tergitol系列(Union Carbide)。
這些適合的表面活性劑的表現(xiàn)會受如pH、溫度、離子強(qiáng)度和表面活性劑濃度的影響。
較佳地，加入濃度占組合物體積約0.1％到10％的表面活性劑。更佳地，表面活性劑存在的濃度約為0.5％到5％(體積)。
抗生素適用于本發(fā)明方法的組合物還可含有抗生素，或可與抗生素一起施用。一般，通過如直接注射前列腺局部適用于前列腺是安全、簡單且有效的將組合物引入身體的手段。當(dāng)然一些局部施用方法可能會有患細(xì)菌感染的危險，而后者將導(dǎo)致如發(fā)燒、菌尿和菌血病。
抗生素常?？梢匝杆贉p輕急性前列腺感染的癥狀。但，沒有一種抗生素是能夠有效抵抗所有致病尿道微生物。各種抗生素都具有其自身抗一種或幾種微生物品種的范圍。較佳地，用于治療細(xì)菌前列腺炎的藥物是高脂溶性的；具有堿性pKa；對血漿蛋白質(zhì)的結(jié)合極??；且是常規(guī)革蘭氏陰性尿路病原體的殺菌劑。
較佳地，本發(fā)明的組合物含有合適的抗生素以預(yù)防或降低可能與本發(fā)明自身方法相關(guān)的細(xì)菌感染的發(fā)病率。所用的抗生素通常提供足夠的保護(hù)抵抗常遇到的尿路病原體細(xì)菌菌株包括大腸桿菌、糞鏈球菌、變形菌/單孢菌和凝固酶陽性葡萄球菌。較佳地，抗生素選自基本不抑制組合物酶促活性的抗生素。
本發(fā)明組合物中的抗生素(較佳地為慶大霉素或三甲氧芐二胺嘧啶/磺胺甲噁唑)可選自表現(xiàn)出具有合適抗常遇到的尿道病原體細(xì)菌菌株活性范圍的抗生素，包括青霉素(青霉素G、青霉素V、芐星青霉素)、氨基青霉素(氨芐青霉素、羥氨芐青霉素)、羧基青霉素(羧芐青霉素、氧哌嗪青霉素、美洛西林)、抗青霉素酶的青霉素(甲氧苯青霉素、苯唑青霉素、乙氧萘青霉素)、先鋒霉素(頭孢氨芐、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢唑啉)、氨基糖苷類(鏈霉素、新霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星、西索米星)、四環(huán)素(脫氧土霉素、米諾四環(huán)素、四環(huán)素)、多粘菌素(多粘菌素B和E)、磺胺類藥(磺胺異噁唑、琥珀磺胺噻唑)、氟代喹諾酮(環(huán)丙沙星、諾氟沙星)、堿性大環(huán)內(nèi)酯(紅霉素、竹桃霉素)、潔霉素、氯潔霉素、氯霉素、呋喃妥因和萘定酸。
適用于本發(fā)明方法的抗生素包括硫酸慶大霉素(Garamicin，ScheringCrop.，Kenilworth，New Jersey)、三甲氧芐二胺嘧啶/磺胺甲噁唑(Septra，Burroughs Wellcome，Research Triangle Park，N.C.)、呋喃妥因、萘定酸、妥布霉素、阿米卡星和硫酸奈替米星。
較佳地，施用硫酸慶大霉素或三甲氧芐二胺嘧啶/磺胺甲噁唑。如今施用三甲氧芐二胺嘧啶/磺胺甲噁唑是治療細(xì)菌性前列腺炎的首選藥物。最近的研究表明在預(yù)防手術(shù)后細(xì)菌的尿道感染中，單劑量慶大霉素、三甲氧芐二胺嘧啶/磺胺甲噁唑或硫酸奈替米星能有效地長期起作用。
三甲氧芐二胺嘧啶是脂溶性堿，與血漿蛋白質(zhì)的結(jié)合有限，通常表現(xiàn)為前列腺組織血清濃度為2∶1到3∶1。三甲氧芐二胺嘧啶/磺胺甲噁唑(TMP/SMX)在尿和前列腺分泌物中產(chǎn)生治療濃度，且有合適的抗菌活性范圍。最佳用TMP/SMX的治療包括160mg TMP和800mg SMX劑量，一天口服2次，共30天。如果不能耐受TMP/SMX(過敏)，推薦慶大霉素治療。
在組合物中抗生素存在的量通常約為0.15到150μg/ml濃度。優(yōu)選的抗生素(硫酸慶大霉素)在組合物中存在的濃度為1.5-150μg/ml，較佳地為10-25μg/ml。另外，就那些一般對氨基糖苷過敏，尤其是對慶大霉素過敏的人而言，甲氧芐啶/磺胺甲噁唑的聯(lián)用藥物可以替代慶大霉素作為本發(fā)明組合物中的優(yōu)選抗生素。甲氧芐啶存在的優(yōu)選濃度為1-10μg/ml，較佳地為5-10μg/ml。磺胺甲噁唑存在的優(yōu)選濃度為30-105μg/ml，較佳地為50-105μg/ml。
所示組合物的制備和測試本發(fā)明作為優(yōu)選實(shí)施例公開了局部施用的組合物水溶液，其含有安全且有效治療濃度的水解酶膠原酶和透明質(zhì)酸酶除垢劑TritonX-100和抗生素慶大霉素。較佳地，將所公開的組合物制備成在相對小體積中水解酶較濃的水溶液。
較佳地，所公開的組合物以適用于前列腺內(nèi)注射的單位制劑提供?？梢栽谏砜山邮芤簯B(tài)稀釋劑(如無熱原的鹽水)中化合物的溶液或懸浮液的可注射用劑型適用于患者。例如，可以制備裝有該冷凍干燥組合物的小瓶，從而可以重新溶解該組合物的無菌成分，得到適用于注射入活哺乳動物的藥學(xué)上可接受的水溶液。單位劑型優(yōu)選含有250到250,000U/ml膠原酶；160到160,000U/ml透明質(zhì)酸酶；0.1％到10％非離子表面活性劑；和0.15到150μg/ml抗生素。較佳地，單位劑型含有2,500到25,000U/ml膠原酶；1,600到16,000U/ml透明質(zhì)酸酶；0.5到5％非離子表面活性劑；和15到150μg/ml抗生素。
制備本發(fā)明的組合物。得到冷凍干燥的膠原酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)和透明質(zhì)酸酶(Boehringer/Mannheim Corp.，Indianapolis，Ind.)，用含有20mM到50mM CaCl2(CBSCa)的檸檬酸鹽緩沖鹽水重新溶解所需的濃度。將從溶組織梭菌(Clostridium hystolyticum)中得到的膠原酶進(jìn)行層析純化，此膠原酶含有原低污染量的酶梭菌蛋白酶、胰蛋白酶和酪蛋白酶。同樣層析純化自綿羊睪丸得到的透明質(zhì)酸酶。所有酶的活性都以每mg國際單位表示。
當(dāng)在4℃以冷凍干燥保存時，這些酶都是穩(wěn)定的。但這有利于防止?jié)駳膺M(jìn)入冷凍干燥的酶。例如，通常在開啟前將裝有冷凍干燥酶的冷小管升溫至室溫。一般將酶稀釋重新溶解的溶液避光存儲于4℃，當(dāng)在工作臺進(jìn)行操作使將它們置于冰浴中。
較佳地，用新鮮蒸餾的去離子無菌水來還原酶，和制備用于注射用溶液的緩沖液。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所用的緩沖液是0.05M檸檬酸鹽緩沖鹽水(CBS，pH6.7)，含有足夠量(較佳地為0.01M到0.05M，更佳地為0.02M到0.05M)的鈣離子以活化膠原酶。據(jù)信任何合適的緩沖溶液如Ringers鹽水或Tris緩沖鹽水都是可用的。但緩沖液通常含有足以活化膠原酶的鈣離子，且通常不含鈣鰲合劑如EDTA或酶活性的其它抑制劑(如半胱氨酸)。
優(yōu)選的緩沖液表現(xiàn)為生理pH，其范圍約為6.5到7.5，優(yōu)選的是6.7到7.0。鹽水如氯化鈉濃度約0.1M到0.2M，優(yōu)選的是0.15M到0.2M。類似地，檸檬酸鹽的濃度較佳地為0.02M到0.1M，優(yōu)選的為0.05M到0.1M。，0.05M CBS+20mM CaCl2(pH 6.7)的制備物由550mg檸檬酸鈉、190mgNaOH和876mg NaCl溶解于100ml無菌無熱原的去離子水中構(gòu)成。用3ml 1NNaOH將溶液的pH調(diào)節(jié)至6.7，并加入294mg CaCl2。加入表面活性劑TritonX-100(Malinckrodt，Paris，Ky)和抗生素慶大霉素(Sigma Chemical Co.)至合適的終濃度。TritonX-100在20℃的密度為1.082g/ml(20℃924μl/g)。在100ml混合物中加入1.5ml 10mg/ml(15mg)抗生素的無菌溶液，從而得到含有終濃度為150μg/ml慶大霉素的溶液。
用標(biāo)準(zhǔn)方法純化和滅菌此法得到的溶液。用含有TritonX-100(0.1％到10％)、抗生素慶大霉素(1.5到150μg/ml)和CaCl2(20mM)的檸檬酸鹽緩沖鹽水(pH6.7)無熱原的水制備膠原酶和透明質(zhì)酸酶(0.1％到10％)的酶溶液(5ml)，并通入1ml柱(Detoxi-Gel)中以除去潛在的內(nèi)毒素。藥學(xué)上可接受的溶液制備的最后步驟包括將此組合物通過孔徑為0.2m微米的已確定為無菌無熱原的微孔聚砜過濾器。由聚砜構(gòu)成的低蛋白結(jié)合濾膜顯示明顯比相當(dāng)?shù)拇姿?硝酸纖維素膜過濾器更少的蛋白質(zhì)吸收。用0.2mm無菌過濾器過濾起到抗微生物污染的保護(hù)作用。另外，過濾使患者接觸不溶性顆?；蛭F(tuán)聚體的危險性最小。
按醫(yī)院藥房標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行人腸胃外用藥的藥學(xué)上可接受的溶液的重新溶解和制備。當(dāng)在4℃儲存時，在含有20mM CaCl2(CBSCa 6.7)(濃度范圍為0.1％到10％)的0.05M檸檬酸鹽緩沖鹽水的膠原酶/透明質(zhì)酸酶/TritonX-100/慶大霉素(CHTG)的溶液能穩(wěn)定2周，且保持高度有效地溶解人和犬的前列腺組織。據(jù)信組合物的毒性不會高于已知的各成分的毒性。
從Sigma Chemical Company購得自溶組織梭菌(Clostridium hystolyticum)衍生的膠原酶(EC 3.4.24.3)(XI型，產(chǎn)品#C-7657，批號96F-6801和96F-6838；XI-S型，產(chǎn)品#C-4785，批號17F-6814)。觀察到酶活性(以膠原酶U/mg計)和污染酶水平的批間的變化，范圍為膠原酶1910到2450 U/mg、梭菌蛋白酶0.86到1.4U/mg、酪蛋白酶40到85U/mg和胰蛋白酶0.05到0.52U/mg。
一個單位膠原酶活性的定義為在鈣離子存在時，37℃，pH7.4，5小時內(nèi)能從天然膠原釋放肽(相當(dāng)于茚三酮顏色)成1微摩爾L-亮氨酸的膠原酶量。存在2.5mM二硫蘇糖醇時，在25℃pH7.6，1個單位梭菌蛋白酶每分鐘能水解1微摩爾N-α-苯甲?；?L-精氨酸乙酯(BAEE)。在pH7.5，37℃，1個單位的酪蛋白酶(非特異性蛋白酶)在5小時內(nèi)能將酪蛋白水解產(chǎn)生顏色相當(dāng)于1微摩爾(181μg)L-酪氨酸。pH 7.6，37℃，一個單位的胰蛋白酶活性每分鐘能水解1微摩爾N-α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)。
可以按本領(lǐng)域已知的方法確定膠原酶和其它酶的活性。Gokcen等人的美國專利No.5,116,615公開了膠原酶和透明質(zhì)酸酶分析的實(shí)例，本文將其納入作為參考。
組合物基本無內(nèi)毒素，內(nèi)毒素指已知對人和動物有劇烈副作用的革蘭氏陰性菌的熱原性脂多糖成分。
給藥方法本發(fā)明的一個方法涉及活化體內(nèi)PSA。在一實(shí)施例中，通過如局部施用治療有效濃度的鈣離子在體內(nèi)活化PSA。通過與局部施用治療有效量的膠原酶(通常可以和選定的蛋白酶、蛋白質(zhì)或酶、鈣離子、表面活性劑和/或抗生素合并施用)聯(lián)用，可以在體內(nèi)活化PSA。
本發(fā)明的其它方法涉及施用可用于治療前列腺癌的腸胃外組合物的水溶液。合適的組合物如上所述，且包括治療有效量的膠原酶且任選含有一種或多種如下成分如上所述選定的蛋白酶、蛋白質(zhì)或酶、鈣離子、表面活性劑和抗生素。在一實(shí)施例中，該組合物含有膠原酶、透明質(zhì)酸酶、鈣離子、表面活性劑和抗生素?？捎萌鏑aCl2提供鈣離子。表面活性劑可以是如TritonX-100，而抗生素可以是如慶大霉素。
將此組合物局部施用于前列腺。局部施用包括將組合物施用于前列腺和/或癌細(xì)胞或腫瘤內(nèi)或其附近，較佳地為腫瘤內(nèi)。局部施用包括用組合物包圍前列腺和/或癌性腫瘤或?qū)⒔M合物適用于前列腺和/或癌性腫瘤的表面。例如，通過直接的前列腺內(nèi)注射或灌注入前列腺，能局部施用組合物。較佳地，小容量如約5cc或更少，通過注射。而較大的容量如5cc以上通過緩慢灌注約15-20分鐘。
為了證明施用的精確性，即組合物是否施用于前列腺細(xì)胞或腫瘤的附近或進(jìn)入它們，泌尿科醫(yī)生通常可以通過如成像(可以在診斷過程和前列腺活體檢查過程中得到)得到前列腺圖像。
局部施用組合物，從而局部給予治療有效量的組合物來治療前列腺癌。較佳地，該量足以降解前列腺腫瘤，治愈或減輕前列腺癌。
在一實(shí)施例中，通過前列腺內(nèi)局部注射施用組合物。通過在指診直腸控制(digital rectal control)和/或超聲波指導(dǎo)下，將一長的細(xì)針插入前列腺內(nèi)進(jìn)行前列腺內(nèi)注射。這種注射通常是在局部麻醉下進(jìn)行的，且注射溶液可以用碘卡因(iodocaine)稀釋。在注射過程中，針可以不時地重定位，以使組合物得到能最好地分布。有一些注射途徑將本文所公開的組合物引入前列腺。
施用的優(yōu)選路徑是經(jīng)尿道的前列腺內(nèi)(病損內(nèi))注射。經(jīng)尿道方法是在插入導(dǎo)管后迅速進(jìn)行的。注射的組合物的量通常為1到50cc。
為了使注射的組合物的有效性最佳，可以用充氣囊擴(kuò)張前列腺尿道。通過膀胱鏡插入的囊，抑制注射入的酶溶液通過多孔管道系統(tǒng)(流注入尿道)的立即溢出。這種注射方法的優(yōu)點(diǎn)是此方法能直接用膀胱鏡觀察病損的瘤狀區(qū)域。在前列腺直接注射的過程中，患者所經(jīng)受的痛苦和不適最小，且可以與肌內(nèi)注射相比。
另外，可以用前列腺注射的經(jīng)腹膜或經(jīng)直腸路徑。注射的經(jīng)腹膜路徑包括在超聲波和/或指診指導(dǎo)下，將22g×20cm的針吸活檢用的針通過會陰插入前列腺。然后，將1-50cc所公開的組合物局部注射入前列腺的各側(cè)葉。通常在局部麻醉下進(jìn)行注射。在注射過程中，針可以不時地重定位，以使組合物得到能最好地分布。在指診直腸控制下可以用超聲波指導(dǎo)針的定位。這種經(jīng)會陰路徑的注射是一種較好的替代經(jīng)尿道或經(jīng)直腸的方法，能減少由注射后細(xì)菌感染而引起的潛在并發(fā)癥。
為了降低與經(jīng)會陰前列腺內(nèi)注射相關(guān)的細(xì)菌感染，推薦使用無菌注射方法而且這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。將多種標(biāo)準(zhǔn)殺菌制劑(如Phiso-Hex、Betadine、聚乙烯吡啶酮-碘或洗必泰)中的任何一種施用于會陰的皮膚上，以提供適當(dāng)?shù)淖⑸淝暗目咕Ｗo(hù)。使用無菌尿、適當(dāng)?shù)钠つw保護(hù)和殺菌方法，整個過程發(fā)生感染并發(fā)癥的比例應(yīng)較低。
經(jīng)直腸路徑將針引入直腸壁，并在進(jìn)行直腸指診時注射入前列腺。用微弧形的22g×20cm柔韌型針吸活檢用的針進(jìn)行通過經(jīng)直腸路徑的注射。使用Franzen針導(dǎo)向器(Precision Dynamics，San Fernando，Calif)，在超聲波和/或觸感指導(dǎo)方法下，能讓針安全地插入所懷疑的病損處。將無菌前列腺針導(dǎo)向器置于帶有手套的食指上。通過導(dǎo)向器將針插入直腸，并觸摸前列腺疑有病損的區(qū)域。可以將約1-50cc溶液注射入前列腺的側(cè)葉。為了注射足夠的物質(zhì)，將針前后移動3-5次?？梢栽谧⑸淝笆褂寐樽砟z以降低針插入時的疼痛。
一旦注射，前列腺葉就膨脹，尺寸增加并變得漲滿。在注射位點(diǎn)通過的注射液可以引起的分布很廣的與微梗塞相關(guān)靜脈痙攣。在注射后可能發(fā)生急性無尿。注射入前列腺的液體充滿注射位點(diǎn)葉泡，且通過泡小管可以通過鄰近的葉泡進(jìn)入前列腺尿道。有1/3到1/2的注射液最終進(jìn)入前列腺尿道。
在前列腺原位將5cc以上的組合物注射入體內(nèi)，導(dǎo)致反射性平滑肌收縮，使治療性酶溶液迅速通過多孔管遠(yuǎn)離靶組織而進(jìn)入尿道。注射的沖力將導(dǎo)致注射位點(diǎn)的前列腺組織破裂。注射的液體可能進(jìn)入腺泡系統(tǒng)的管，并完全充滿該腺。一旦腺被充滿，液體就占據(jù)了阻力最小的通道并進(jìn)入尿道。
注射液可以進(jìn)入前列腺循環(huán)并可能會分散梗塞的小區(qū)域。引起血管血栓靜脈炎的酶可能是廣布的出血性梗塞產(chǎn)生的原因。由包括腎的亞甲籃分泌的試驗(yàn)證明約1/5前列腺注射用可能進(jìn)入體循環(huán)。前列腺的囊下和尿道周的區(qū)域天然具有更多的血管，且可以提高液體進(jìn)入血流的循環(huán)。將印度碳黑染料顆粒注射入前列腺，在股盆的淋巴腺內(nèi)肉眼或顯微鏡未觀察到可檢查的顆粒。前列腺注射液通過針的插入點(diǎn)可能還到達(dá)前列腺表面和前列腺周圍的組織。
在前列腺內(nèi)注射硫酸鋇的不透放射線的微乳劑后，立即進(jìn)行的放射照相顯示前列腺囊下液體漏出，并進(jìn)入膀胱。偶爾，看見液體還滲漏到囊外。
被注射的前列腺小葉會壞死，主要是因?yàn)樽⑸浣M合物的酶促反應(yīng)，部分是因?yàn)樽⑸湟后w在壓力下的剪切力。通過針插入點(diǎn)漏出的部分液體可能會導(dǎo)致表面血管的形成血栓且可能會造成附近臟器的粘附。滲漏出的液體量取決于局部壓力，而且可能為增加注射的壓力。通過尿道周圍靜脈的注射液可能會使它們發(fā)炎和形成血栓，而后尿道上皮壞死和脫落。
預(yù)計在前列腺尿道的周圍可能為發(fā)生尿道和尿道周增溶，而導(dǎo)致尿道上皮剝落。與注射組織增溶酶相關(guān)的組織生理學(xué)變化包括那些因腺管的液體逸出而造成的導(dǎo)管和周圍小泡的損傷。自針孔留出的液體可能為影響那里的囊管和平滑肌纖維肌性的基質(zhì)。
前列腺的直接局部注射而導(dǎo)致的高濃度治療性酶是主要問題，但沒有代謝失效的危險。當(dāng)感染急性加劇時不推薦這種前列腺內(nèi)注射，因?yàn)橥ǔ凶⑸鋭┣秩炯翱赡艿臄⊙Y的危險。在注射后的幾周可能會存在血尿和血性精液。
按所治療的患者的情況，所施用的組合物的治療有效劑量范圍為1cc到50cc，較佳地含有160到160,000U/ml透明質(zhì)酸酶、250到250,000膠原酶、0.1到10％非離子表面活性劑(較佳地為TritonX-100)；和0.15到150μg/ml抗生素(較佳地為慶大霉素)。更佳地，劑量包括2,500到25,000U/ml膠原酶、1,600到16,000U/ml透明質(zhì)酸酶、0.5到5％非離子表面活性劑(較佳地TritonX-100)和15到150μg/ml抗生素(較佳地慶大霉素)。這些劑量范圍表示估計能有效治療前列腺癌的組合物各成分的量。但組合物的劑量可以按患者的年齡、病癥的特性和嚴(yán)重程度、組合物的效力及施用的途徑變化?？梢悦刻?、每周或每月注射施用指示劑直到達(dá)到所需的治療結(jié)果。
在一些實(shí)施例中，為了確定合適的劑量，確定腫瘤的尺寸因?yàn)檩^大的腫瘤可能需要較高濃度的施用于本發(fā)明方法的組合物。例如，對小于7g的腫瘤，通常施用單次灌輸?shù)膭┝?。灌輸劑量可以?cc，較佳地含有250-250,000U/ml膠原酶、160-160,000透明質(zhì)酸酶、0.1％到10％非離子表面活性劑、0.15-150μg/ml抗生素和20mM-50mM CaCl2的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.7)。較佳地緩慢將此注射劑注射入腫瘤，如約幾分鐘。如果需要在此注射后還可再注射。例如，可以再次施用這種治療，如在1周或1個月內(nèi)，也可重復(fù)施用如每周或每月。
當(dāng)腫瘤為7到15g時，通常在第一次注射劑量后可以用較大劑量的組合物。例如，第一次施用所述的5cc灌注劑量。然后，緩慢地施用第二份25到45cc的相同組合物，如約15-20分鐘。如果需要可以順序施用這些指示劑，但一般不超過50cc總體積。例如，可以再次施用這種治療，如可以在一周或一個月重復(fù)施用，例如每周或每月。
對大于15g的腫瘤，第一次施用灌注劑量可以給予至多50cc，隨后可以施用如上所述的更大的劑量。
其它給藥方法如果遇到限制或抑制本發(fā)明組合物治療效果的問題，可以使用其它送遞方法。例如，酶治療的有效性可能受如下限制外部給予的酶的半衰期短、外源蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生、抗蛋白酶效應(yīng)子(α-1-抗胰蛋白酶、α-2-巨球蛋白)的抑制、或?qū)⒚柑禺愋詫?dǎo)向病損瘤狀區(qū)域的能力的喪失。
可用許多不同的載體系統(tǒng)將酶促組合物送遞到所需的前列腺位點(diǎn)。通常，合適的載體將治療劑送遞到其靶點(diǎn)而不會喪失特異性或反應(yīng)性。較佳地，載體能與治療性酶連接且可以保持成復(fù)合物直到送遞完成。較佳地載體應(yīng)避免觸發(fā)導(dǎo)致本發(fā)明組合物生物降解或失活的免疫防御機(jī)制。
可以施用緩釋組合物，即可以緩釋、防止進(jìn)入體循環(huán)并增加組合物的前列腺特異性定位。可以用緩釋植入法提供這種制劑，或以微膠囊或吸附于生物可降解聚合物或前列腺特異性免疫球蛋白提供。
較佳地將抗體用作酶脂質(zhì)體載體系統(tǒng)。用抗體作為將治療劑送遞到特定組織的載體系統(tǒng)開發(fā)了能獨(dú)特識別和結(jié)合抗原的抗體。同樣，攜帶治療劑的抗體能更有效地結(jié)合于組織(天然分布許多血管或經(jīng)歷血管生成)。另外，可用不同品種識別不同細(xì)胞類型的免疫酶螯合物混合劑。
可以產(chǎn)生組織特異性單克隆抗體，更好地確定將定位的抗原性細(xì)胞靶?？梢杂肍(ab)或F(ab’)2片段改善定位特性。含有F(c)片段的抗體比F(ab)或(Fab’)2片段能特異性結(jié)合更長的時間，而后兩者表現(xiàn)出加速的清除機(jī)制。最近對人-鼠(嵌合的)單克隆抗體的開發(fā)可以有治療應(yīng)用，且與傳統(tǒng)鼠衍生的單克隆抗體相比具有優(yōu)越性。人-小鼠抗體表現(xiàn)出廣范圍且高度的特異性。當(dāng)注射入人體時，嵌合的抗體比常規(guī)自鼠衍生的小鼠單克隆抗體更不易觸發(fā)免疫反應(yīng)。人單克隆抗體的制備及其作為載體的使用可以進(jìn)一步降低接受外源蛋白質(zhì)的接受者的免疫應(yīng)答程度。將這些因素如抗體制備、劑量和注射途徑，也可以控制抗球蛋白應(yīng)答。
免疫定向酶治療的目的是將有效濃度的酶送遞到組織的活性特異性位點(diǎn)降低對附近正常組織的毒性，從而提高治療指數(shù)?？梢詫⒚笍?fù)合于單克隆抗體，這種單克隆抗體共價結(jié)合于酶而不影響酶的催化活性。與天然的保持水解蛋白活性的酶相比，綴合于組織特異性單克隆抗體的酶能在所定向的組織中實(shí)現(xiàn)更高程度的特異性定位。
其它特異性定位構(gòu)思包括酶原-抗體復(fù)合物(胰蛋白酶原)或酶-抗體復(fù)合物(膠原酶、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶、DNase)，它們保留了酶和抗體活性。可以將酶包囊于組蛋白、血紅細(xì)胞(RBC)空胞(ghost)、聚乳酸和其它生物可降解膜或合成的微膠囊(含有前列腺特異性抗體)，以增加和維持溶解的蛋白酶在前列腺組織中的定向、定位和活性。
施用膠原酶和透明質(zhì)酸酶能有免疫效果，重復(fù)注射可能導(dǎo)致產(chǎn)生抗體滴度且伴隨過敏癥及嚴(yán)重性較低的過敏反應(yīng)的危險。另外，存在膠原酶后透明質(zhì)酸酶的特異性抗體可能為抑制酶的活性。如果受體免疫系統(tǒng)將活性酶識別為外源的，則可能發(fā)生潛在的免疫問題?？赡軙槍γ府a(chǎn)生抗體且使酶失活或沉淀。使用人類的酶或那些由重組方法產(chǎn)生的酶可以將這些潛在的免疫并發(fā)癥最小化。
避免免疫監(jiān)視系統(tǒng)的策略包括將酶制劑包埋在生物可降解小泡中的方法，以保護(hù)酶的活性且有利于特異性送遞。將組織特異性蛋白質(zhì)(單克隆抗體)附著于這些小泡，可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞病理特異性位點(diǎn)的定位。可以將酶包埋在脂質(zhì)體或其它生物可降解微膠囊中，與用于特異性定位的組織特異性單克隆抗體相連。
脂質(zhì)體是含有水相的同心磷脂雙層小球體，已表明可用作載體系統(tǒng)?，F(xiàn)今的脂質(zhì)體制備技術(shù)已可以將各種藥物、激素或酶摻入各相?？梢詫慰寺】贵w摻入脂質(zhì)體的外層，從而增加含治療劑的脂質(zhì)體的送遞特異性。
除了讓酶免受生理失活且防止免疫并發(fā)癥外，將酶包埋在合成的微膠囊或生物可降解的小泡中，還可以提供特異性送遞的有價值的方法。各種形式的酶包埋技術(shù)可用于包埋酶，包括活細(xì)胞空胞、合成的聚合物微膠囊；和由膽固醇、卵磷脂和磷脂酸構(gòu)成的脂類小泡(脂質(zhì)體)。用受體本身的紅細(xì)胞送遞活性酶可以避免由潛在的在合成載體(如脂質(zhì)體和微膠囊)中施用酶所引起的免疫和生理問題。
將聚乙二醇(PEG)共價連接于酶可以使這些蛋白質(zhì)無免疫原性，可以延長它們的循環(huán)半衰期，從而逃避天然酶抑制劑的抑制作用，而且可以在減少自體溶解的情況下提高酶活性。PEG與蛋白質(zhì)的連接是很簡單的，且可以通過超濾純化可以得到均勻的反應(yīng)產(chǎn)物。
用如下典型實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。這些實(shí)施例無任何限制作用。
實(shí)施例實(shí)施例1患有局部前列腺癌男性的研究的第一個病例一位70歲的男性被診斷出患有未擴(kuò)散前列腺癌(即由放射性核素掃描和CAT掃描檢測沒有擴(kuò)散)。估計前列腺內(nèi)腫瘤的大小為7克。由聲像圖看出腫瘤的位置為右側(cè)葉。血液的PSA水平為40ng/ml。
如上所述(組合物的制備和測試)制備注射用組合物，包括12,500U/ml膠原酶、7,500 U/ml透明質(zhì)酸酶、1％(v/v)TritonX-100、150μg/ml慶大霉素和40mmolCaCl2的0.05M檸檬酸鹽緩沖鹽水(Ph6.7)。將最終的組合物注入注射用的針筒(5cc)中。
在患者進(jìn)行膀胱鏡檢查前先局部麻醉。將膀胱鏡置于尿道中，將注射針插入病損區(qū)(腫瘤)，并用超聲波成像監(jiān)測。一旦將針固定好，將在約4-5分鐘內(nèi)緩慢地注射5cc注射用組合物。在注射過程中，監(jiān)測表征中毒、過敏或其它不良反應(yīng)的生命征象。
患者恢復(fù)正常，沒有任何表征對注射組合物不良反應(yīng)的征象。臨床過程中沒有情況發(fā)生。在3個月的過程中血液PSA水平逐漸減低到正常水平(4ng/ml或更低)并保持正常。5年后，患者被診斷為無前列腺癌。
實(shí)施例2患有局部前列腺癌男性的第二個病例一位65歲的男性被診斷出患有局部前列腺癌(即由放射性核素掃描和CAT掃描檢測沒有擴(kuò)散)。估計前列腺內(nèi)腫瘤的大小為15克。腫瘤的位置為右側(cè)葉且是一個實(shí)體瘤。
如上所述(組合物的制備和測試)制備注射用組合物，包括2,400U/ml膠原酶、1,600U/ml透明質(zhì)酸酶、1％(v/v)TritonX-100、150μg/ml慶大霉素和120mmolCaCl2的0.05M檸檬酸鹽緩沖鹽水(Ph6.7)。注射液的總體積為30cc。
在膀胱鏡的監(jiān)測下，將組合物注射入腫瘤。首先，緩慢注射5cc劑量。然后，將剩下的25cc緩慢地在約25-20分鐘內(nèi)灌注。完成注射后，監(jiān)測表征中毒、過敏或其它不良反應(yīng)的生命征象。
患者恢復(fù)和注射預(yù)后都沒有異常情況發(fā)生。在3個月的過程中血液PSA水平逐漸減低到正常水平(4ng/ml或更低)并保持正常。5年后，患者被診斷為無前列腺癌。
實(shí)施例3患有局部前列腺癌男性的第三個病例一位72歲的男性被診斷出患有局部前列腺癌(即由放射性核素掃描和CAT掃描檢測沒有擴(kuò)散)。估計前列腺內(nèi)腫瘤的大小為9克，且其分布比較分散。血液的PSA水平為30ng/ml。
制備10cc含有50mM氯化鈣的0.05M檸檬酸鹽緩沖鹽水(pH6.7)的組合物。在膀胱鏡的監(jiān)測下，將此氯化鈣組合物注射入前列腺的多個位點(diǎn)。完成注射后，監(jiān)測表征中毒、過敏或其它不良反應(yīng)的生命征象。約一個月后，約75％腫瘤已降解。隨后，在病損處第二次注射25mM氯化鈣的0.05M檸檬酸鹽緩沖鹽水指示劑(約5cc)。3年后，臨床診斷患者沒有癌癥，且患者的PSA水平在正常范圍內(nèi)。
必須指明，除非特別指明，在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中所用的“一”和“該”包括復(fù)數(shù)形式。因此，如含有“一種化合物”的組合物包括含有兩種或多種化合物的混合物。
已參考各種特別和優(yōu)選實(shí)施例和技術(shù)描述了本發(fā)明。但可以理解，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)還可以有許多變化和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動物前列腺癌的方法，其特征在于，所述的方法包括施用含有治療有效濃度膠原酶的組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括施用糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、鏈激酶或它們的混合物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的糖苷酶包括透明質(zhì)酸酶、神經(jīng)氨酸酶、淀粉酶、溶菌酶或它們的混合物。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶包括彈性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、鏈霉蛋白酶、分散酶、菠蘿蛋白酶、梭菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、纖溶酶、舍雷硫代肽酶、胰酶、組織蛋白酶-G、纖溶酶原激活劑、多形核白細(xì)胞絲氨酸蛋白酶或它們的混合物。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的核酸酶包括DNase I、Rnase或它們的混合物。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酶包括磷酸酯酶。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的酯酶包括膽固醇酯酶。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法包括施用透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、鏈霉蛋白酶、彈性蛋白酶、DNase I、分散酶、纖溶酶或它們的混合物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法包括施用透明質(zhì)酸酶。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的組合物包含濃度約為250到250,000U/ml的膠原酶和濃度約為160到160,000U/ml的透明質(zhì)酸酶。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述的組合物包含濃度約為1,600到16,000U/ml的透明質(zhì)酸酶。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的組合物還含有有效濃度的非離子表面活性劑。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的非離子表面活性劑包括C10-C20脂肪酸的縮水甘油酯、C8-C22烷基醇的縮水甘油酯或它們的混合物。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的非離子表面活性劑包括TritonX-100。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的組合物還含有有效濃度的抗生素。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述的抗生素包括慶大霉素。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的組合物還含有有效濃度的鈣離子。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述的組合物含有CaCl2。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的組合物還含有透明質(zhì)酸酶、TritonX-100、慶大霉素和鈣離子。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的局部施用包括前列腺內(nèi)注射。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的前列腺內(nèi)的注射包括病損內(nèi)的注射。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述的前列腺內(nèi)的注射包括經(jīng)尿道的注射。
23.一種治療活哺乳動物前列腺癌的方法，其特征在于，所述的方法包括局部施用含有治療有效濃度膠原酶的組合物，且所述的組合物中的膠原酶與糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、鏈激酶或它們的混合物聯(lián)用。
24.一種治療活哺乳動物前列腺癌的方法，其特征在于，所述的方法包括體內(nèi)激活前列腺-特異性-抗原。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述體內(nèi)激活前列腺-特異性-抗原包括施用鈣離子。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括局部施用治療有效濃度的膠原酶。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括施用非離子表面活性劑、抗生素或它們的混合物。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括施用糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、鏈激酶或它們的混合物。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述的糖苷酶包括透明質(zhì)酸酶、神經(jīng)氨酸酶、溶菌酶、淀粉酶或它們的混合物。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶包括彈性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、鏈霉蛋白酶、分散酶、菠蘿蛋白酶、梭菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、纖溶酶、舍雷硫代肽酶、胰酶、組織蛋白酶-G、纖溶酶原激活劑、多形核白細(xì)胞絲氨酸蛋白酶或它們的混合物。
31.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述的局部施用包括前列腺內(nèi)注射。
32.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括引發(fā)宿主的免疫應(yīng)答。
全文摘要
一種治療活哺乳動物前列腺癌的方法,包括局部施用含有治療有效濃度膠原酶的組合物。在一實(shí)施例中,治療活哺乳動物前列腺癌的方法包括局部施用含有治療有效濃度膠原酶和至少一種糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酯酶、纖溶酶原激活劑、鏈激酶和它們混合物的組合物。較佳地施用糖苷酶,如透明質(zhì)酸酶。用于治療前列腺癌方法中的組合物還包括鈣離子、非離子表面活性劑如Triton R X－100和抗生素如慶大霉素,或與它們一起施用。治療活哺乳動物前列腺癌的其它方法包括如通過局部施用鈣離子激活體內(nèi)前列腺－特異性－抗原(PSA)。
文檔編號A61K31/7036GK1384754SQ00814920
公開日2002年12月11日 申請日期2000年10月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月28日
發(fā)明者M·高克森 申請人:免疫分解學(xué)股份有限公司