專(zhuān)利名稱(chēng)：?jiǎn)捂湽丫勖撗鹾塑账嵬蛔冚d體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為申報(bào)于1999年8月27日的U.S.申請(qǐng)序列號(hào)No.09/384,960的后續(xù)部分申請(qǐng)，所述的申請(qǐng)之披露在此全部引為參考。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及到單鏈寡聚脫氧核苷酸、其特定衍生物以及使用它們向活體細(xì)胞的靶基因的預(yù)定位置引入預(yù)定的變化的方法。該細(xì)胞可以是人工培養(yǎng)基或者生物體中的哺乳類(lèi)、昆蟲(chóng)、魚(yú)類(lèi)、蠕蟲(chóng)類(lèi)或者鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞，該細(xì)胞還可以是細(xì)菌細(xì)胞或者植物細(xì)胞。該靶基因可以是染色體基因或染色體外基因，即處于細(xì)菌人工染色體中的基因。
2.發(fā)明背景在一種細(xì)胞的某一靶核酸的預(yù)定位置產(chǎn)生預(yù)定的變化的技術(shù)已經(jīng)有所描述。這些技術(shù)利用了參與DNA修復(fù)以及同源重組的細(xì)胞酶。在這些技術(shù)中合成了一種含一種寡核苷酸或者寡核苷酸類(lèi)似物，該類(lèi)似物含有兩個(gè)區(qū)域，這些區(qū)域具有靶基因的序列，這些序列側(cè)生于被稱(chēng)為“增變區(qū)域(mutator region)”的區(qū)域，這些區(qū)域不同與靶基因。在本應(yīng)用中，這樣的寡核苷酸和類(lèi)似物被統(tǒng)稱(chēng)為“突變載體”。這樣的突變載體可向靶基因引入預(yù)定的遺傳變化，該引入所利用的機(jī)制據(jù)信涉及到同源重組和/或核苷酸切割和修復(fù)。
Kmiec的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.5,565,350和5,731,181描述了含有互補(bǔ)鏈的突變載體，其中第一條鏈含有核苷酸類(lèi)似物，該類(lèi)似物同第二條鏈的脫氧核苷酸形成Watson-Crick堿基對(duì)。Kumar和Metz的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.6,004,804描述了二體突變載體的改進(jìn)，該改進(jìn)包括一種變體，增變區(qū)域只在該變體中的兩條鏈的其中之一上存在。Kmiec類(lèi)型突變載體在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的應(yīng)用在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.5,760,012中有所描述，并且同Kren等人的國(guó)際專(zhuān)利出版物WO98/49350和相關(guān)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)No.09/108,006中的大分子載體相關(guān)聯(lián)。Kmiec類(lèi)型的突變載體的應(yīng)用的描述可見(jiàn)于Cole-Staussetal.，1996，Science2731386；Krenetal.，1998，Nature Med 4285；Bandyopadhyayet al.，1999，J.Biol.Chem.27410163。
Kmiec類(lèi)型突變載體在植物細(xì)胞中的應(yīng)用的描述見(jiàn)Pioneer Hi-Bred International的國(guó)際專(zhuān)利出版物WO99/25853，Kimeragen，Inc.的WO99/07865以及Zeneca Ltd.的WO98/54330。描述Kmiec類(lèi)型載體在植物細(xì)胞中的應(yīng)用的科學(xué)出版物包括Beetham et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA968774和Zhu et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA968768。
雙鏈的Kmiec類(lèi)型突變載體及其變體的應(yīng)用的描述見(jiàn)Kumar和Metz的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.6,004,804。Kumar和Metz的該出版物中指出Kmiec類(lèi)型的載體及其變體可被用于細(xì)菌細(xì)胞。
單鏈寡核苷酸作為突變載體在啤酒酵母染色體基因中產(chǎn)生變化的應(yīng)用，在來(lái)自耶魯大學(xué)Dr.F.Sherman實(shí)驗(yàn)室的報(bào)道中有所描述。Moerschell et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85542-528以及Yamamoto et al.，1992，Yeast 8935-948。在這些研究中所使用的突變載體的最佳長(zhǎng)度為50個(gè)核苷酸。
使用一條160個(gè)核苷酸的單鏈和雙鏈多聚核苷酸在染色體基因中產(chǎn)生變化的單獨(dú)報(bào)道，可見(jiàn)于Hunger-Bertling et al.，1990，Mol.Cell.Biochem.92107-116。單鏈聚核苷酸的結(jié)果是不明確的，這是因?yàn)閮H僅分析了使用雙鏈聚核苷酸的實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)物。
488個(gè)堿基對(duì)的單鏈DNA片段，在囊性纖維化轉(zhuǎn)膜傳導(dǎo)調(diào)控基因中產(chǎn)生特定遺傳變化的應(yīng)用的報(bào)道見(jiàn)goncz et al.，1998，Hum.Mol.Genetics 71913；以及Kunze lmann et al.，1996，Gene Ther.3859。
長(zhǎng)約40個(gè)核苷酸的單鏈寡聚脫氧核苷酸作為參照，而在哺乳類(lèi)細(xì)胞中用于進(jìn)行附加體基因的研究，在該研究中該寡聚脫氧核苷酸被共價(jià)連接于一種可形成三體的寡核苷酸，并且該寡聚脫氧核苷酸單獨(dú)可導(dǎo)致附加體基因中每5×104中一次或更低頻率的的預(yù)定遺傳變化。Chanet al.，1999，J.Biol Chem.7411541。單鏈寡聚脫氧核苷酸用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞附加體基因中產(chǎn)生預(yù)定的變化的更早的報(bào)道見(jiàn)于Campbell et al.，1989，The New Biologist1223。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及到一些寡聚脫氧核苷酸，這些寡聚脫氧核苷酸通過(guò)一種indocarbocyanine染料的連接而被修飾。indocarbocyanine染料已知為出色的熒光團(tuán)。適用于固相核苷酸合成的blocked indocarbocyanine β cyanoethylN，N-diisoproprylphosphoroamididites的合成的描述，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.5,556,959和5,808,044。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及到一種組合物，該組合物含有一種單鏈寡核苷酸，該寡核苷酸編碼一種預(yù)定的遺傳變化，該組合物還含有一種大分子組合物，該組合物含有一種該靶細(xì)胞表面受體的配基。在國(guó)際專(zhuān)利出版物WO93/04701中描述了一種組合物，該組合物含有多聚L-賴(lài)氨酸，它是去唾液酸糖蛋白受體的配基，以及一種21到24個(gè)核苷酸的反義寡聚脫氧核苷酸。
本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及到對(duì)寡聚脫氧核苷酸的一種修飾，該修飾通過(guò)以一種3’-3’連接的核苷酸進(jìn)行連接而完成。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.5,750,669對(duì)這樣一種修飾的寡聚脫氧核苷酸進(jìn)行了說(shuō)明。
在第二部分或者本申請(qǐng)的任何部分中對(duì)任何參考文獻(xiàn)的引述和確證不應(yīng)被解釋成為承認(rèn)這些參考為本發(fā)明的之前的技術(shù)。
3.發(fā)明概要本發(fā)明基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即單鏈寡聚脫氧核苷酸，特別是在經(jīng)適當(dāng)?shù)男揎椈蛱幱诤羞m當(dāng)?shù)拇蠓肿虞d體的組合物中的情況下，該寡聚脫氧核苷酸在對(duì)細(xì)胞中的靶基因上產(chǎn)生預(yù)定的遺傳突變中可以同先前工藝一樣，即同Kmiec類(lèi)型突變載體一樣有效或者更為有效。適于本發(fā)明的應(yīng)用的單鏈寡聚脫氧核苷酸在后文中被稱(chēng)為單鏈寡聚脫氧核苷酸突變載體或者SSOMV。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物以用于在諸如哺乳類(lèi)這樣的動(dòng)物的細(xì)胞染色體基因中產(chǎn)生突變，該組合物由編碼遺傳變化的寡聚脫氧核苷酸和一種大分子載體組成。該載體可以是多陽(yáng)離子水核脂囊泡或者脂類(lèi)納米球。在一個(gè)適用于體內(nèi)應(yīng)用的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該載體進(jìn)一步含有一種配基，該配基同被內(nèi)化的一種細(xì)胞表面受體結(jié)合，該配基的例子如一種披網(wǎng)格蛋白小窩受體的配基，這樣的受體的例子有去唾液酸糖蛋白受體、葉酸受體或者轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該單鏈寡聚脫氧核苷酸通過(guò)3’和5’封閉取代物進(jìn)行連接而修飾，這樣的取代物的例子如3’-3’連接的胞嘧啶核苷酸和5’連接的靛羰花青(indocarbocyanine)染料。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該修飾由以一種不可水解的鍵最3’和/或最5’的核苷酸間的磷酸二酯連接進(jìn)行，該不可水解的鍵的例子如硫代磷酸二酯鍵或者phosphoramidiate鍵。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)編碼預(yù)定的遺傳變化的寡聚脫氧核苷酸的3’和5’末端核苷酸的修飾。本發(fā)明進(jìn)一步基于預(yù)期之外的發(fā)現(xiàn)，即有些這樣的修飾并不阻斷該寡聚脫氧核苷酸產(chǎn)生遺傳變化的效能。一個(gè)這樣實(shí)施方案為3’-3’連接的胞嘧啶核苷酸和5’連接的靛羰花青染料的組合。經(jīng)過(guò)這樣的修飾，這些寡聚脫氧核苷酸在用于產(chǎn)生細(xì)菌細(xì)胞中的遺傳變化時(shí)比對(duì)應(yīng)的未修飾寡聚脫氧核苷酸有效50倍。
在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一些化合物以及用于向植物細(xì)胞中引入預(yù)定的遺傳變化的方法，該過(guò)程通過(guò)向植物細(xì)胞的細(xì)胞核中引入一種編碼預(yù)定的遺傳變化的寡聚脫氧核糖核酸來(lái)完成。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該寡聚脫氧核糖核酸通過(guò)3’和5’封閉取代物進(jìn)行連接而修飾，這樣的取代物的例子如3’-3’連接的胞嘧啶核苷酸和5’連接的靛羰花青染料。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，該修飾由以一種不可水解的鍵替換最3’和/或最5’的核苷酸間的磷酸二酯連接進(jìn)行，該不可水解的鍵的例子如硫代磷酸二酯鍵或者phosphoramidiate鍵。在替代的情況下，5’連接的indocarbocyanine染料和最3’核苷酸間的磷酸二酯鍵，這些不能水解的鍵，能夠用于第三個(gè)實(shí)施方案。
本發(fā)明可通過(guò)參考下列具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述和闡釋性實(shí)施例來(lái)進(jìn)行全面的了解。
4.發(fā)明詳述SSOMV的序列基于與先前工藝的突變載體相同的原理。SSOMV的序列含有兩個(gè)與靶序列同源的區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域被的含有所需遺傳變化的名為“增變區(qū)域”的區(qū)域所分隔。該增變區(qū)域所具有的序列可以同在靶序列上分隔這兩個(gè)同源序列的序列長(zhǎng)度相等，但是具有不同的序列。這樣的一種增變區(qū)域?qū)е铝艘粋€(gè)替換。或者，SSOMV中的同源區(qū)域可以彼此毗鄰。而在靶基因上的具有相同的序列的這兩個(gè)區(qū)域被一個(gè)、兩個(gè)或者更多個(gè)核苷酸分隔。這樣的一種SSOMV導(dǎo)致了這些SSOMV中缺乏的核苷酸從靶基因中被缺失。同樣，靶基因中與這些同源區(qū)域相同的的序列可能在該靶基因上相互毗鄰但在SSMOV的序列上被一個(gè)或者更多個(gè)核苷酸所分隔。這樣的一種SSOMV導(dǎo)致了對(duì)靶基因序列的插入。
SSOMV的核苷酸為脫氧核苷酸，除3’末端和/或5’末端的核苷酸間的鍵或者兩個(gè)3’末端和/或5’末端的核苷酸間的鍵可以為硫代磷酸酯(phosphorothioate)或者phosphoramidate之外，這些核苷酸通過(guò)未修飾的磷酸二酯鍵連接。本文所用的核苷酸間鍵為一種SSOMV的核苷酸之間的鍵，并且該核苷酸間的鍵不包括3’末端核苷酸或者5’末端核苷酸與封閉替代物之間的的鍵，見(jiàn)下文。
SSOMV的長(zhǎng)度取決于該靶基因所定位的細(xì)胞的類(lèi)型。在靶基因?yàn)橐环N諸如哺乳動(dòng)物或者鳥(niǎo)類(lèi)這樣的動(dòng)物細(xì)胞的染色體基因的情況下，該SSOMV長(zhǎng)度在25到65個(gè)核苷酸之間，優(yōu)選的情況下在31到59個(gè)脫氧核苷酸之間，在最優(yōu)選的情況下在34到48個(gè)脫氧核苷酸之間。同源區(qū)域的總長(zhǎng)度通常比該SSOMV的長(zhǎng)度短一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)核苷酸。增變核苷酸可在該SSOMV的多于一個(gè)位點(diǎn)引入，這在該SSOMV中產(chǎn)生了多于兩個(gè)的同源區(qū)域。無(wú)論同源區(qū)域?yàn)閮蓚€(gè)還是多個(gè)，這些同源區(qū)域中至少兩個(gè)區(qū)域的長(zhǎng)度應(yīng)各自不少于8個(gè)脫氧核糖核酸。
對(duì)于原核細(xì)胞，該SSOMV的長(zhǎng)度在15到41個(gè)脫氧核苷酸之間。用于原核應(yīng)用的寡聚脫氧核苷酸的優(yōu)選長(zhǎng)度取決于所使用的3’保護(hù)基團(tuán)。當(dāng)該3’保護(hù)基團(tuán)為一種3’-3’連接的脫氧胞苷時(shí)，該寡聚核苷酸在優(yōu)選的情況下為21到28個(gè)脫氧核苷酸，除此情況之外該最佳長(zhǎng)度為25到35個(gè)脫氧核苷酸。因此，該同源區(qū)域的長(zhǎng)度為總長(zhǎng)度至少為14個(gè)脫氧核苷酸，并且至少兩個(gè)同源區(qū)域應(yīng)各自具有至少為7個(gè)脫氧核苷酸的長(zhǎng)度。
對(duì)于植物細(xì)胞，該SSOMV的長(zhǎng)度在21到55個(gè)脫氧核苷酸之間，并且由此該同源區(qū)域的長(zhǎng)度為總長(zhǎng)度至少20個(gè)脫氧核苷酸，并且至少兩個(gè)同源區(qū)域應(yīng)各自具有至少為8個(gè)脫氧核苷酸的長(zhǎng)度。
在這些范圍之內(nèi)，該寡聚脫氧核苷酸的最佳長(zhǎng)度根據(jù)GC含量而確定，GC含量越高，最佳寡聚脫氧核苷酸越短。但是，高于50％的GC含量是優(yōu)選的。
SSOMV可被用于任何類(lèi)型的動(dòng)物細(xì)胞，例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、魚(yú)類(lèi)細(xì)胞或者蠕蟲(chóng)(worm)(線(xiàn)蟲(chóng))細(xì)胞。該SSOMV還可被用于任何類(lèi)型的植物細(xì)胞。另外，該SSOMV還可被用于任何類(lèi)型的細(xì)菌細(xì)胞，例如，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞或者革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。這些細(xì)菌的示例性類(lèi)型包括，沙門(mén)菌屬、大腸桿菌、假單胞菌、Rostani等等。該細(xì)胞是否進(jìn)行活躍的復(fù)制或者該靶基因是否活躍轉(zhuǎn)錄并不重要。但是，但該靶基因位于細(xì)菌內(nèi)時(shí)，該細(xì)菌為RecA+十分重要。因此，常用于重組DNA工作的多數(shù)細(xì)菌株并不適用于本發(fā)明，這是由于為降低其中所克隆的質(zhì)粒的穩(wěn)定性這些細(xì)菌均為RecA-。進(jìn)一步，在細(xì)菌細(xì)胞中該靶基因可定位于一種質(zhì)?；蛘咭环N細(xì)菌人工染色體(BAC)以及該細(xì)菌的染色體。
該SSOMV可經(jīng)設(shè)計(jì)而互補(bǔ)于該靶基因的編碼或者非編碼鏈。當(dāng)所需的突變?yōu)橐环N單堿基的替換時(shí)，在優(yōu)選的情況下該增變核苷酸為一個(gè)嘧啶核苷酸。在一致于獲得所需的功能性結(jié)果的程度上，增變核苷酸和互補(bǔ)鏈上靶定核苷酸在優(yōu)選的情況下均為嘌呤核苷酸。編碼顛換突變的SSOMV是特別優(yōu)選的，即一個(gè)C或者T增變核苷酸分別同互補(bǔ)鏈上的C或者T核苷酸進(jìn)行錯(cuò)配。
除寡聚脫氧核苷酸外，該SSOMV還可含有5’封閉的替代物，該替代物通過(guò)接頭連接于5’末端碳原子。該接頭除長(zhǎng)度之外的化學(xué)性質(zhì)并不重要，該長(zhǎng)度在優(yōu)選的情況下應(yīng)至少6個(gè)原子并且該接頭應(yīng)是柔性的。
用于哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)或者植物細(xì)胞的5’封閉替代物除分子量之外的的化學(xué)性質(zhì)并不重要，除了其分子量應(yīng)少于1000道爾頓。多種無(wú)毒替代物如生物素、膽固醇或者其它甾類(lèi)化合物或者一種非嵌加陽(yáng)離子熒光染料(non-intercalating cationic fluorescent dye)均可被使用。然而，對(duì)于細(xì)菌系統(tǒng)的應(yīng)用，該封閉替代物對(duì)于SSOMV的效果具有主要的影響，并且在優(yōu)選的情況下為一種3，3，3’，3’-四甲基N，N’-氧烷基取代的靛羰花青。特別優(yōu)選的用于制造SSOMV的試劑如Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ的Cy3TM以及Cy5TM，它們封閉phosphoroamidites，在摻入到寡聚核苷酸時(shí)它們分別產(chǎn)生了3，3，3’，3’-四甲基N，N’-異丙基取代的靛羰花青和靛羰花青染料。當(dāng)?shù)弭驶ㄇ酁镹-氧烷基取代時(shí)，它可以同5末端磷酸通過(guò)一個(gè)磷酸二酯鍵方便地連接于該寡聚脫氧核苷酸5’末端。染料和寡聚脫氧核苷酸之間的染料接頭的化學(xué)性質(zhì)并不重要，可為合成的方便進(jìn)行選擇。當(dāng)根據(jù)指導(dǎo)而使用商業(yè)化的Cy3 phosphoroamidites時(shí)，所產(chǎn)生的5’修飾由一個(gè)封閉替代物和接頭共同組成，它們?yōu)镹-羥丙烷基，N’-磷脂?；榛?，3，3’，3’-四甲基靛單羰花青(indomonocarbocyanine)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該靛羰花青染料，例如Cy3phosphoroamidites，可在該寡聚脫氧核苷酸被合成之后與其進(jìn)行連接。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該靛羰花青染料在吲哚環(huán)的3位和3’位被四取代。這些取代物在理論上不受限制地防止該染料成為加嵌染料。在這些位置上的取代物的性質(zhì)并不重要。
該SSOMV還可額外地含有3’封閉取代物。在該靶基因位于除細(xì)菌細(xì)胞之外的細(xì)胞中時(shí)，該3’封閉取代物的化學(xué)性質(zhì)也不重要，只要無(wú)毒并且分子量低于1000。然而，當(dāng)該靶基因位于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)時(shí)，該優(yōu)選的3’封閉取代物為所謂的反向核苷酸(inverted nucleotide)，即，通過(guò)未取代的3’-3’磷酸二酯鍵進(jìn)行連接的核苷酸，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)No.5,750,669所述。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，該反向核苷酸為一個(gè)胸苷或者在最優(yōu)選的情況下為脫氧胞苷。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞中的應(yīng)用，Cy3 5’封閉的替代物和反向脫氧胞苷3’封閉替代物的組合特別優(yōu)選，這是因?yàn)檫@兩種修飾對(duì)于SSOMV的效能具有協(xié)同作用，具有上述修飾的SSMOV可通過(guò)傳統(tǒng)固相核苷酸合成方法合成。
該SSOMV可通過(guò)一些用于向植物或者動(dòng)物細(xì)胞中引入Kmiec類(lèi)型突變載體的技術(shù)，而引入含有該靶基因的細(xì)胞。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，引入該SSMOV的一種優(yōu)選的方法為電穿孔。
對(duì)于以包括哺乳類(lèi)細(xì)胞和鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞在內(nèi)的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行的應(yīng)用，向細(xì)胞進(jìn)行遞送的優(yōu)選的方法通過(guò)使用保護(hù)性的大分子載體而進(jìn)行。商業(yè)化的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑如LipofectamineTM和SuperfectTM經(jīng)設(shè)計(jì)以使待轉(zhuǎn)染核酸通過(guò)靜電連接于該脂質(zhì)體的表面。這樣的載體的優(yōu)選程度不如保護(hù)性的大分子載體。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性大分子載體披露于國(guó)際專(zhuān)利出版物WO98/49350以及WO99/40789以及Bandyopadhay et al.，1999，J.Biol.Chem.27410163，這些均在此全部引為參考。
一種特別優(yōu)選的大分子載體為水核心的脂類(lèi)囊泡或者脂質(zhì)體，其中SSOMV深埋于水核心中。這樣的囊泡的制作是通過(guò)利用不含溶劑的脂薄膜并向其中加入SSOMV的水溶液，隨后進(jìn)行振蕩、擠出或者通過(guò)一種微濾膜排出。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該脂組分為二油?；字Ｄ憠A/二油?；字＝z氨酸/半乳糖腦苷脂(galactocerebroside)的1∶1∶0.16的混合物。其它的載體包括多陽(yáng)離子，例如聚乙醇胺，該多陽(yáng)離子的分子量在500到1.3Md之間，適當(dāng)?shù)姆N類(lèi)的分子量為25Kd，其它的載體還包括脂類(lèi)納米球體，SSOMV在其中以親脂性鹽類(lèi)的形式提供。
當(dāng)該SSOMV被用于向哺乳動(dòng)物或者鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞中引入遺傳變化時(shí)，該大分子載體在優(yōu)選的情況下進(jìn)一步含有一種內(nèi)化的細(xì)胞表面受體的配基。適當(dāng)?shù)氖荏w為可經(jīng)過(guò)披網(wǎng)格蛋白小窩途徑進(jìn)行內(nèi)化的受體，例如脫唾液酸糖蛋白受體、表皮生長(zhǎng)因子受體以及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。同樣適用的還有通過(guò)caveolar途徑進(jìn)行內(nèi)化的受體，例如葉酸受體。半乳糖腦苷脂為脫唾液酸糖蛋白受體的一種配基。本文所使用的可內(nèi)化的受體為一種可通過(guò)披網(wǎng)格蛋白小窩途徑或者通過(guò)caveolar途徑進(jìn)行內(nèi)化的受體。
該SSOMV可被用于任何先前工藝的突變載體所應(yīng)用的目的。具體的應(yīng)用包括通過(guò)回復(fù)導(dǎo)致疾病的遺傳損害而進(jìn)行的遺傳疾病的治療；這樣的疾病包括血友病、α1抗胰島素缺陷和Crigler-Najjar癥以及國(guó)際專(zhuān)利出版物WO98/49350所指出的的其它疾病。
在替代的情況下，該SSOMV可用于對(duì)植物進(jìn)行修飾，該修飾出于國(guó)際專(zhuān)利出版物WO99/07865所描述的目的，該出版物在此全文引為參考。SSOMV在植物中的其它用途為抗除草劑植物的產(chǎn)生，該產(chǎn)生過(guò)程通過(guò)避免向作物植物中引入外源或者異源基因的手段進(jìn)行。特別令人感興趣的是對(duì)除草劑草甘磷(ROUNDUP)的抗性。對(duì)導(dǎo)致草甘磷抗性的突變的鑒別可見(jiàn)于國(guó)際專(zhuān)利出版物WO99/25853以及WO97/04103。
在替代的情況下，該SSOMV可被用于修飾細(xì)菌。SSOMV對(duì)于細(xì)菌的遺傳操作在抗生素生產(chǎn)，以及用于疫苗生產(chǎn)的具體減毒菌的構(gòu)建的領(lǐng)域中特別具有價(jià)值。在上述兩種應(yīng)用中，抗生素抗性基因不存留于最終的修飾細(xì)菌中是十分重要的。
更進(jìn)一步，該SSOMV可同一種細(xì)菌人工染色體(BAC)聯(lián)合應(yīng)用于修飾一種靶基因，該靶基因來(lái)自于任何物種，且被克隆入該BAC。比該靶基因更大的片段可被引入。具有該被克隆的靶基因的BAC可被置入一種細(xì)菌宿主中，并且根據(jù)本發(fā)明而引入了一種預(yù)定的遺傳變化?？蓪?duì)具有該預(yù)定的遺傳變化的BAC亞克隆進(jìn)行鑒定，并且取出該插入片段用于進(jìn)一步的應(yīng)用。本發(fā)明允許進(jìn)行預(yù)定變化，而不需要進(jìn)行PCR片段的制備以及將該片段插回源基因的過(guò)程中所伴隨的時(shí)間和花銷(xiāo)。5.實(shí)施例1Gunn大鼠的處理Gunn大鼠在UDP-葡萄糖醛酰轉(zhuǎn)移酶基因上含有突變，該基因與Crigler-Najjar病中被突變的基因?yàn)橥换?。Roy-Chowdhury etal.，1991，J.Biol.Chem.26618294；Iyanangi et al.，1989，J.Biol.Chem.26421302。在Gunn大鼠中核苷酸1206上有一個(gè)突變，該突變?nèi)笔Я艘粋€(gè)G。名為CN3-35UP的一個(gè)35個(gè)核苷酸的SSOMV同該反義鏈相對(duì)應(yīng)，該SSOMV被構(gòu)建用于反轉(zhuǎn)該突變并且具有以下的序列5′-ATCATCGGCAGTCATTT C CAGGACATTCAGGGTCA-3′(SEQ ID NO1)。對(duì)應(yīng)于反義鏈的第二條SSOMV，CN3-35LOW，具有以下的序列5′-TGACCCTGAATGTCCTG G AAATGACTGCCGATGAT-3′(SEQ ID NO2)。黑體字為增變核苷酸。
5’Cy3，3’-3’dC修飾的CN3-35UP(兩只動(dòng)物)以及CN3-35LOW以及未修飾的CN3-35UP在水核心的脂囊泡中被制劑化，該脂囊泡具有的脂類(lèi)組分為比例為1∶1∶0.16的二油基磷脂酰膽堿/二油基磷脂酰絲氨酸/半乳糖腦苷脂。約2ml的含有500μg該SSMOV的5％的葡萄糖被用于水化2mg的脂，隨后排擠出直徑為0.5μm的囊泡。包囊化的效率為80％。陽(yáng)性參照組以等摩爾量的Kmiec型MV(2只動(dòng)物)在同樣的載體中進(jìn)行處理。以300μg的SSOMV或者載體對(duì)重250克的大鼠連續(xù)處理5天。mg/dl表示的所產(chǎn)生的血清膽紅素如下。
數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)修飾或者未經(jīng)修飾的SSMOV以及有義和反義序列至少是等價(jià)的，并且在更長(zhǎng)的時(shí)間點(diǎn)上SSOMV表現(xiàn)出優(yōu)于Kmiec型突變載體。6.實(shí)施例2人類(lèi)UDP-葡萄糖醛酰轉(zhuǎn)移酶基因的修飾以下的例子顯示，在大分子載體中的未修飾的SSOMV可被用于向人工培養(yǎng)基中的哺乳類(lèi)細(xì)胞中引入特定的遺傳變化，其比率為Kmiec型DNA/2’OMERNA突變載體中所觀(guān)察到的比率的三倍之內(nèi)。數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示最小如單phosphorothioate鍵這樣的修飾可導(dǎo)致完全可比的比率。
安曼教派(Amish)的一個(gè)群體的人患有Crigler-Najjar病，該病由UDP-葡萄糖醛酰轉(zhuǎn)移酶基因上的222位核苷酸上的一個(gè)C→A替換所導(dǎo)致。該突變導(dǎo)致TAC(Tyr)變?yōu)橐粋€(gè)TAA終止密碼子。一種SSMOV經(jīng)設(shè)計(jì)用于向人類(lèi)肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系HuH-7中引入該致病突變。名為CNAM3-35UP的一種35個(gè)核苷酸的SSOMV對(duì)應(yīng)于反義序列并且具有以下序列5′-GGGTACGTCTTCAAGGT T TAAAATGCTCCGTCTCT-3′(SEQ ID NO3)。增變核苷酸為黑體字。
向106/cm2的HuH-7細(xì)胞中加入300μl的根據(jù)實(shí)施例1的方法制造的載體，這些載體含有CNAM3-35UP，各種修飾的CNAM3-35UP以及等摩爾量的82核苷酸的Kmiec型突變載體。收集細(xì)胞并且通過(guò)PCR擴(kuò)增相關(guān)基因，克隆并根據(jù)上文提及的Bandyopadhyay的方法，通過(guò)等位基因特異雜交進(jìn)行分析。觀(guān)察到了下列轉(zhuǎn)換比率未修飾SSOMV 6％5’Cy3 SSOMV 15％3’-3’dC SSOMV 5％5’Cy3，3’-3’dC SSOMV 15％5’phos’thioate SSOMV 16％3’phos’thioate 12％Kmiec型MV14％這些數(shù)據(jù)顯示，在大分子載體存在的情況下，經(jīng)修飾的SSOMV同Kmiec型突變載體同樣有效，并且未經(jīng)修飾的SSOMV的效率在其三倍之內(nèi)。7.實(shí)施例3一個(gè)BAC中的卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)換以下的例子顯示，修飾的SSOMV在細(xì)菌細(xì)胞中比KmiecDNA/2’OMeRNA突變載體更為有效。
卡那霉素經(jīng)一個(gè)框架內(nèi)的ATG終止密碼子的插入而失活?？敲顾乜剐酝ㄟ^(guò)將第三個(gè)核苷酸轉(zhuǎn)換成為C而恢復(fù)，即，在第三位核苷酸上進(jìn)行轉(zhuǎn)換。
對(duì)應(yīng)于用于卡那霉素抗性恢復(fù)的有義鏈的41個(gè)nt的SSOMV的序列如下5′-GTGGAGAGGCTATTCGGCTA C GACTGGGCACAACAGACAAT-3′(SEQ ID NO4)。增變核苷酸為黑體字。
為產(chǎn)生pBACKans，向pKans的單一SmaI位點(diǎn)內(nèi)插入一個(gè)BamHI接頭，并將所產(chǎn)生的含有該突變卡那霉素基因的1.3kb的BamHI-HindIII片段插入克隆有載體pBeloBACll的BAC的BamHI/HindIII位點(diǎn)(Genome Systems，Inc.，St.Louis，MO)。pBACKans轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株MC1061和DH10B，在LB氯霉素平板上進(jìn)行選擇，并且制造電感受態(tài)。
以5到10μg的SSOMV對(duì)40μl電感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，該電穿孔使用以下的條件25KV/cm，200ohms，25微法。電穿孔后立即向這些細(xì)胞中加入1mL的SOC，培養(yǎng)物在37℃下振蕩生長(zhǎng)1小時(shí)。加入4mL的LB+氯霉素(終濃度12.5μg/mL)并且該培養(yǎng)物在37℃下再振蕩生長(zhǎng)2小時(shí)。適當(dāng)稀釋度的培養(yǎng)物被涂布于LB-氯霉素平板上以使其生存，并同樣在LB-卡那霉素平板上涂布以進(jìn)行轉(zhuǎn)換。通過(guò)以每毫升的卡那霉素抗性菌落數(shù)除以每毫升的氯霉素抗性菌落數(shù)來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)換頻率。
使用5’Cy3，3’-3’dC修飾的25個(gè)核苷酸的SSOMV的轉(zhuǎn)換率對(duì)應(yīng)于每100個(gè)存活細(xì)菌一次轉(zhuǎn)換。相對(duì)轉(zhuǎn)換率為68 nt Kmiec MV w/2′OMe RNA 接頭 0.0468 nt Kmiec MV w/DNA 接頭 0.00441 nt SSOMV w/3′，5′phos′thioate0.435 nt SSOMV w/3′，5′phos′thioate4.029 nt SSOMV w/3′，5′phos′thioate0.925 nt SSOMV w/3′，5′phos′thioate1.041 nt SSOMV w/3′-3′dC，5′Cy32.035 nt SSOMV w/3′-3′dC，5′Cy32.935 nt SSOMV w/3′-3′dC， 2.535 nt SSOMV w/5′Cy3 2.529 nt SSOMV w/3′-3′dC，5′Cy34.225 nt SSOMV w/3′-3′dC，5′Cy342.025 nt SSOMV w/3′-3′dC1.325 nt SSOMV w/5′Cy3 1.825 nt SSOMV w/3′phos′thioate，5′Cy3 8.435 nt SSOMV w/3′phos′thioate，5′Cy3 10.2這些數(shù)據(jù)顯示，最優(yōu)的SSOMV的轉(zhuǎn)換率比Kmiec型突變載體高出103到104。8.實(shí)施例4無(wú)保護(hù)性載體的SSOMV在哺乳動(dòng)物細(xì)胞-潮霉素抗性中的應(yīng)用本實(shí)施例顯示了在不存在保護(hù)性大分子載體的情況下，使用經(jīng)修飾的SSOMV對(duì)哺乳類(lèi)細(xì)胞的修飾。經(jīng)修飾的SSOMV能夠在高出Kmiec型突變載體15到30倍的效率下引入遺傳修飾。該實(shí)施例使用了與實(shí)施例3相同的基因；但是該基因在HuH-7細(xì)胞系中表達(dá)。
HUH7細(xì)胞的一個(gè)克隆，在含有IRES的載體(pIRESkan-)中含有一個(gè)穩(wěn)定整合的突變體卡那霉素基因的拷貝，該克隆在潮霉素選擇下產(chǎn)生。這些細(xì)胞在DEME高葡萄糖/10％FBS中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有100mg/ml的潮霉素以維持整合結(jié)構(gòu)體的高表達(dá)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)這些細(xì)胞在1.0×106的細(xì)胞密度下在100mm培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染前2小時(shí)以10ml的0pti-MEMTM替換該生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在含有200ml pH 8.5的Opti-MEM的隔離試管中稀釋40微克寡聚核苷酸以及40ml(80μg)的LipofectamineTM。隨后將該Lipofectamine加入寡聚核苷酸，以微量移液器進(jìn)行混合，并在加入3.6ml pH 8.5的Opti-MEM之前在室溫下溫育30分鐘。從細(xì)胞中析出該培養(yǎng)基并代之以4ml轉(zhuǎn)染混合物。在以轉(zhuǎn)染混合物替換標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基之前在37℃下培養(yǎng)這些細(xì)胞2小時(shí)。轉(zhuǎn)染后2天這些細(xì)胞被分入兩個(gè)100mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中有10ml含有450mg/ml G418的培養(yǎng)基。在10天內(nèi)每天更換含G418的培養(yǎng)基，隨后每更換兩次直至在顯微鏡下可見(jiàn)到細(xì)胞菌落(轉(zhuǎn)染后16-18天)。在轉(zhuǎn)染后約21天檢選克隆并擴(kuò)增用于分子分析。
潮霉素抗性基因的發(fā)生的背景頻率為約每106一次，當(dāng)使用Kmiec型突變載體時(shí)在抗性菌落數(shù)量上沒(méi)有增加。對(duì)5個(gè)菌落中的一個(gè)進(jìn)行的序列分析表明該菌落已經(jīng)獲得了特異性突變。其它4個(gè)菌落的突變不可鑒定。當(dāng)使用一種41核苷酸的SSOMV w/3’-3’dC，5’Cy3時(shí)，潮霉素抗性基因的發(fā)生頻率增加了15到30倍，即，提高至每105三次。對(duì)這些菌落的序列分析表明100％到80％菌落具有正確的遺傳變化。使用35nt SSOMV w/3’-3’dC，5’Cys或者w/3’phosphorthiote5’Cy3或者w/在3’和5’末端的2個(gè)phosphorthioate接頭而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)所顯示的潮霉素抗性基因的發(fā)生頻率，約為經(jīng)修飾的41個(gè)核苷酸的SSOMV的一半。9.實(shí)施例5無(wú)保護(hù)性載體的SSOMV在哺乳動(dòng)物細(xì)胞-酪氨酸酶中的應(yīng)用本實(shí)施例表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中無(wú)保護(hù)性載體的未經(jīng)修飾的SSOMV可能優(yōu)于經(jīng)5’Cy3/3’-3’dC修飾的SSOMV，并且優(yōu)于Kmiec型DNA/2’OMe RNA突變載體。
這些實(shí)驗(yàn)使用Melan-c，一種小鼠黑色素細(xì)胞系，該細(xì)胞系在酪氨酸酶基因的82位密碼子上具有一個(gè)C→G，該突變產(chǎn)生了一個(gè)框架內(nèi)終止。Bennett，et al.，1989，Development 105379。一個(gè)35個(gè)核苷酸的SSOMV經(jīng)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于編碼序列，并且具有以下的序列5’-CCCCAAATCCAAACTTACAGTTTCCGCAGTTGAAA-3’(SEQ ID NO5)。增變序列為黑體字母。
在RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)Melan-c細(xì)胞，該培養(yǎng)基中含有10％的胎牛血清，100nM的(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(PMA)以及0.1mMβ-巰基乙醇(Gibco，Bethesda，MD)。轉(zhuǎn)染前兩天，在一個(gè)6孔板中以0.5-1.5×105細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)細(xì)胞并且在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)換新培養(yǎng)基。在室溫下將5-10微克(220-440nM)的寡聚核苷酸同6-9μg的SuperfectinTM在0.1ml的TE(10mM TRIS pH7.5，1mM EDTA)中保溫30分鐘。向含有0.9mlDMEM高葡萄糖培養(yǎng)基的細(xì)胞中加入轉(zhuǎn)染混合物，該培養(yǎng)基中含有10％的血清和100nM的PMA。6-18個(gè)小時(shí)之后，以磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞并加入2ml的DMEM培養(yǎng)基。通過(guò)顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞在染色中的變化。通過(guò)在轉(zhuǎn)染后5到8天計(jì)算染色細(xì)胞或細(xì)胞簇的數(shù)目來(lái)確定轉(zhuǎn)換事件數(shù)。
每105個(gè)細(xì)胞中的白化→野生型(被染色)轉(zhuǎn)換頻率如下Kmiec型MV1未修飾的SSOMV5SSOMV w/3’，5’phos’thioate6SSOMV w/3’-3’dC2SSOMV w/ 5’Cy3 3SSOMV w/3’-3’dC，5’Cy3110.實(shí)施例6經(jīng)修飾的SSOMV在植物中的應(yīng)用本實(shí)施例涉及到SSOMV在向arabodopsis thaliana的乙酰羥酸合成酶(亦稱(chēng)為acetolatate合成酶)的653位引入Ser→Asn突變中的應(yīng)用。該突變需要將一個(gè)AGT密碼子轉(zhuǎn)換成為AAT密碼子，并且該突變引入了對(duì)咪唑啉除草劑以及磺酰基脲除草劑的抗性。
一種25個(gè)核苷酸的SSOMV和35個(gè)核苷酸的SSOMV經(jīng)合成而具有3’-3’dC以及5’Cy3修飾，并且它們分別具有以下的序列5’-CGATCCCGAA TGGTGGCACTTT-3’(SEQ ID NO6)，5′-CGATCCCGA A TGGTGGCACTTT-3′(SEQ ID NO6)，5′-GTTGCCGATCCCGA ATGGTGGCACTTTCAACG-3′(SEQ ID NO7)。增變核苷酸為黑體字母。
制備106每平板的A.thaliana分散細(xì)胞群體并且對(duì)其進(jìn)行該SSOMV或者具有相同序列的Kmiec型MV的生物彈射擊法引入。使用一種質(zhì)粒的參照平板測(cè)定該生物彈射擊法系統(tǒng)效率約為每200個(gè)平板細(xì)胞一次遞送。以10μM ImazaquinTM進(jìn)行2個(gè)月的選擇后，各個(gè)經(jīng)生物彈射擊法處理的細(xì)胞群體表現(xiàn)出的對(duì)Imazaquin抗性的背景校正率約為每103個(gè)成的引入該突變載體的細(xì)胞出現(xiàn)一次。11.實(shí)施例7葉酸鹽偶聯(lián)的PEI的制備本實(shí)施例描述了葉酸鹽偶聯(lián)的PEI的制備，該P(yáng)EI適于在本發(fā)明中被用作為大分子載體。
磷酸鈉緩沖液(1.5mL，133mM，pH4.5)中的葉酸(4.4mg，10μmole)經(jīng)200μL吡啶和1-(3-)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC，15.5mg，98μmol)處理并且在室溫下溫育1小時(shí)。將該活化的葉酸鹽溶液(1.7mL)加入聚乙烯亞胺的水溶液(25kDa，24.55mg/ml；1.02mL)并且在室溫下輕微攪拌保溫3天。通過(guò)以一種12kDa分子量阻留膜對(duì)水進(jìn)行透析而純化被偶聯(lián)的聚乙烯亞胺。該產(chǎn)物經(jīng)水合茚三酮分析為胺陽(yáng)性，經(jīng)在最大為259，289和368nm的UV吸收分析為葉酸鹽陽(yáng)性。
偶聯(lián)結(jié)果為每1000胺上1-2個(gè)葉酸結(jié)構(gòu)，這相當(dāng)于每個(gè)PEI分子1-2個(gè)葉酸。
本發(fā)明并非局限于本文所描述的具體實(shí)施方案的范圍內(nèi)。實(shí)際上，從先前的描述和附圖
出發(fā)，除本文所描述之外的本發(fā)明的各種修飾對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很明顯的。這些修飾也應(yīng)處于附上的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
本文引用了多種出版物，這些出版物全部引為參考。
序列表<110>VALIGEN(美國(guó))公司<120>單鏈寡聚脫氧核苷酸突變載體<130>7991-085-228<140>PCT/US00/23457<141>2000-08-25<150>09/384,960<151>1999-08-27<160>7<170>適用于Windows 3.0版的Fast SEQ<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡聚脫氧核苷酸突變載體<400>1atcatcggca gtcatttcca ggacattcag ggtca 35<210>2<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡聚脫氧核苷酸突變載體<400>2tgaccctgaa tgtcctggaa atgactgccg atgat 35<210>3<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡聚脫氧核苷酸突變載體<400>3gggtacgtct tcaaggttta aaatgctccg tctct 35<210>4<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡聚脫氧核苷酸突變載體<400>4gtggagaggc tattcggcta cgactgggca caacagacaa t 41<210>5<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡聚脫氧核苷酸突變載體<400>5ccccaaatcc aaacttacag tttccgcagt tgaaa35<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡聚脫氧核苷酸突變載體<400>6cgatcccgaa tggtggcact tt 22<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>單鏈寡聚脫氧核苷酸突變載體<400>7gttgccgatc ccgaatggtg gcactttcaa cg 3權(quán)利要求
1.一種組合物，該組合物用于在一種動(dòng)物細(xì)胞的靶染色體基因上產(chǎn)生預(yù)定的遺傳變化，該組合物含有(a)一種單鏈寡聚脫氧核苷酸，該寡聚脫氧核苷酸具有一個(gè)3’末端核苷酸，一個(gè)5’末端核苷酸，并且具有不少于25個(gè)脫氧核苷酸和最多65個(gè)脫氧核苷酸，并且其具有的序列含有至少兩個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域至少8個(gè)脫氧核苷酸，這些區(qū)域分別與靶染色體基因上的兩個(gè)區(qū)域相同，這些區(qū)域在該靶染色體基因或者在該寡聚脫氧核苷酸的序列或同時(shí)兩者的序列上的被至少一個(gè)核苷酸所分隔，并且這些區(qū)域總共至少長(zhǎng)24個(gè)核苷酸；以及(b)一種大分子載體，這些載體選自(i)一種水核心的脂類(lèi)囊泡，其中該水核心含有該單鏈寡聚核苷酸(ii)一種脂類(lèi)納米球體，該球體含有該單鏈寡聚核苷酸的一種親脂性鹽類(lèi)，以及(iii)一種多聚陽(yáng)離子，其具有500道爾頓至1.3Md的分子量，其中該多陽(yáng)離子同該寡聚核苷酸形成鹽。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中單鏈寡聚核苷酸的長(zhǎng)度為至少31個(gè)脫氧核苷酸并且不多于59個(gè)脫氧核苷酸。
3.一種用于獲得一種動(dòng)物細(xì)胞的方法，該動(dòng)物細(xì)胞在一種靶基因上含有一種預(yù)定的遺傳變化，該方法包括(a)提供一種培養(yǎng)基中的動(dòng)物細(xì)胞群體；(b)將權(quán)利要求2的組合物加入培養(yǎng)基；并且(c)對(duì)群體中的具有預(yù)定的遺傳變化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
4.權(quán)利要求3的方法，該方法進(jìn)一步包括對(duì)被鑒定的細(xì)胞進(jìn)行分離。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中該大分子載體進(jìn)一步含有動(dòng)物細(xì)胞的一種可內(nèi)化受體的一種配基，該配基附于該大分子受體的表面。
6.一種方法，該方法用于在一種哺乳類(lèi)受試者的一種組織中產(chǎn)生一種預(yù)定的遺傳變化，該方法包括(a)以處于藥學(xué)可接受的載體中的權(quán)利要求5的組合物，對(duì)該哺乳類(lèi)受試者進(jìn)行給藥；以及(b)在該哺乳類(lèi)受試者的組織細(xì)胞中檢測(cè)該預(yù)定遺傳變化的存在
7.權(quán)利要求6的方法，其中該哺乳類(lèi)受試者為患有遺傳損傷的人類(lèi)，該遺傳損傷為該預(yù)定的遺傳變化所修復(fù)，該方法包括以一定數(shù)量的組合物進(jìn)行給藥，該組合物應(yīng)對(duì)于改善該遺傳損傷的影響有效。
8.權(quán)利要求6的方法，其中的組織為肝臟。
9.權(quán)利要求5的組合物，其中該受體選自脫唾液酸糖蛋白受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和表皮生長(zhǎng)因子受體。
10.權(quán)利要求5的組合物，其中該受體為葉酸受體。
11.權(quán)利要求1的組合物，其中連接于3’末端核苷酸的核苷酸間的鍵為一種phosphorothioate鍵。
12.權(quán)利要求1的組合物，其中連接于5’末端核苷酸的核苷酸間的連接為一種phosphorothioate鍵。
13.權(quán)利要求1的組合物，其中5’末端核苷酸的5’羥基被連接于一種5’封閉取代基。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中該5’封閉取代基為一種N’-羥烷基取代3，3，3’，3’-四取代的靛羰花青染料，該染料通過(guò)一種接頭連接于5’羥基。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中該四甲基靛單羰花青染料同接頭一起為N-羥丙烷基，N’-磷脂?；榛?，3，3’，3’-四甲基靛單羰花青。
16.權(quán)利要求14的組合物，其中連接于3’末端核苷酸的核苷酸間的鍵為一種phosphorothioate鍵。
17.權(quán)利要求1的組合物，其中3’末端核苷酸的3’羥基被連接于一種3’封閉取代基。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中該3’封閉取代基為一種封閉核苷酸，該核苷酸經(jīng)3’-3’連接于該3’末端核苷酸的3’羥基。
19.一種化合物，該化合物用于在一種動(dòng)物細(xì)胞的靶染色體基因上產(chǎn)生預(yù)定的遺傳變化，該化合物含有一種單鏈脫氧核苷酸，該核苷酸具有一個(gè)3’末端核苷酸，一個(gè)5’末端核苷酸，并且具有不少于25個(gè)脫氧核苷酸和最多65個(gè)脫氧核苷酸，并且其具有的序列含有至少兩個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域至少8個(gè)脫氧核苷酸，這些區(qū)域分別與靶染色體基因上的兩個(gè)區(qū)域相同，這些區(qū)域在該靶染色體基因或者該寡聚脫氧核苷酸的序列或同時(shí)兩者的序列上，被至少一個(gè)核苷酸所分隔，并且這些區(qū)域總共至少長(zhǎng)24個(gè)核苷酸。
20.一種用于獲得一種動(dòng)物細(xì)胞的方法，該動(dòng)物細(xì)胞在一種靶基因上含有一種預(yù)定的遺傳變化，該方法包括(a)提供一種培養(yǎng)基中的動(dòng)物細(xì)胞群體；(b)將權(quán)利要求19的組合物加入培養(yǎng)基；并且(c)對(duì)群體中的具有預(yù)定的遺傳變化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
21.權(quán)利要求19的化合物，其中連接于3’末端核苷酸的核苷酸間的鍵為一種phosphorothioate鍵。
22.權(quán)利要求21的化合物，其中連接于5’末端核苷酸的核苷酸間的鍵為一種phosphorothioate鍵。
23.一種用于獲得一種動(dòng)物細(xì)胞的方法，該動(dòng)物細(xì)胞在一種靶基因上含有一種預(yù)定的遺傳變化，該方法包括(a)提供一種培養(yǎng)基中的動(dòng)物細(xì)胞群體；(b)將權(quán)利要求22的組合物加入培養(yǎng)基；并且(c)對(duì)群體中的具有預(yù)定的遺傳變化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
24.權(quán)利要求21的化合物，其中該N’-羥烷基取代3，3，3’，3’-四取代的靛羰花青染料通過(guò)一種接頭連接于5’末端核苷酸的5’羥基。
25.權(quán)利要求19的化合物，其中連接于5’末端核苷酸的核苷酸間的鍵為一種phosphorothioate鍵。
26.權(quán)利要求25的化合物，其中連接于3’末端核苷酸的核苷酸間的鍵為一種phosphorothioate鍵或者在該化合物中一種脫氧胞苷或者胸腺嘧啶核苷酸或者兩者同時(shí)經(jīng)3’-3’連接于該3’末端核苷酸的3’羥基。
27.一種化合物，該化合物用于在一種細(xì)菌細(xì)胞的靶基因上產(chǎn)生預(yù)定的遺傳變化，該化合物含有(a)一種單鏈寡聚核苷酸，該寡聚核苷酸具有一個(gè)3’末端核苷酸，一個(gè)5’末端核苷酸，并且具有不少于15個(gè)脫氧核苷酸和最多41個(gè)脫氧核苷酸，并且其具有的序列含有至少兩個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域至少7個(gè)脫氧核苷酸，這些區(qū)域分別與該靶基因上的兩個(gè)區(qū)域相同，這些區(qū)域在該靶染色體基因或者該寡聚脫氧核苷酸的序列或同時(shí)兩者的序列上，被至少一個(gè)核苷酸所分隔，并且這些區(qū)域總共至少長(zhǎng)14個(gè)核苷酸；(b)一種5’修飾，其中連接于5’末端核苷酸的核苷酸間的鍵為一種phosphorothioate鍵，或者其中一種N’-羥烷基取代3，3，3’，3’-四取代的靛羰花青染料通過(guò)一種接頭連接于5’末端核苷酸的5’羥基；以及(c)一種3’修飾，其中連接于3’末端核苷酸的核苷酸間的鍵為一種phosphorothioate鍵，或者一種脫氧胞苷或者胸腺嘧啶核苷酸或者兩者同時(shí)經(jīng)3’-3’連接于該3’末端核苷酸的3’羥基。
28.權(quán)利要求27的化合物，其中該5’修飾為一種N-羥丙基，N’-磷脂酰丙基3，3，3’，3’-四甲基靛單羰花青。
29.權(quán)利要求27的化合物，其中該3’修飾由3’-3’連接的脫氧胞苷組成。
30.權(quán)利要求27的化合物，其中該3’修飾由一種連接與3’末端核苷酸的phosphorothioate核苷酸間鍵組成。
31.一種化合物，該化合物用于在一種植物細(xì)胞的靶基因上產(chǎn)生預(yù)定的遺傳變化，該化合物含有一種單鏈寡核苷酸，該核苷酸具有一個(gè)3’末端核苷酸，一個(gè)5’末端核苷酸，并且具有不少于21個(gè)脫氧核苷酸和最多55個(gè)脫氧核苷酸，并且其具有的序列含有至少兩個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域至少8個(gè)脫氧核苷酸，這些區(qū)域分別與靶基因上的兩個(gè)區(qū)域相同，這些區(qū)域在該靶染色體基因或者該寡聚脫氧核苷酸的序列或同時(shí)兩者的序列上，被至少一個(gè)核苷酸所分隔，并且這些區(qū)域總共至少長(zhǎng)20個(gè)核苷酸。
32.一種用于獲得一種植物細(xì)胞的方法，該動(dòng)物細(xì)胞在一種靶基因上含有一種預(yù)定的遺傳變化，該方法包括(a)將權(quán)利要求31的化合物引入植物細(xì)胞的群體；并且(b)對(duì)群體中的具有預(yù)定的遺傳變化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定
33.權(quán)利要求32的方法，該方法進(jìn)一步包括對(duì)被鑒定的細(xì)胞進(jìn)行分離。
34.權(quán)利要求31的化合物，其中5’末端核苷酸的5’羥基被連接于一種5’封閉替代物。
35.權(quán)利要求34的化合物，其中3’末端核苷酸的3’羥基被連接于一種3’封閉替代物。
36.權(quán)利要求35的化合物，其中(a)該5’封閉取代基為一種N’-羥烷基取代3，3，3’，3’-四取代的靛羰花青染料，該染料通過(guò)一種接頭連接于5’末端核苷酸的5’羥基；并且(b)該3’封閉取代基為一種封閉核苷酸，該核苷酸經(jīng)3’-3’連接于該3’末端核苷酸的3’羥基。
37.權(quán)利要求36的化合物，其中該單鏈核苷酸至少為25個(gè)核苷酸并且不多于35個(gè)核苷酸。
38.權(quán)利要求36的化合物，其中該封閉核苷酸為脫氧胞苷或者胸苷。
39.權(quán)利要求36的化合物，其中該四甲基靛單羰花青染料同接頭一起為N-羥丙烷基，N’-磷脂?；榛?，3，3’，3’-四甲基靛單羰花青。
40.權(quán)利要求3的化合物，其中連接于3’末端核苷酸的核苷酸間的連接為一種phosphorothioate鍵。
41.權(quán)利要求31的化合物，其中連接于5’末端核苷酸的核苷酸間的連接為一種phosphorothioate鍵。
42.權(quán)利要求31的化合物，其中(a)5’末端的5’羥基被連接于一種5’封閉取代基；并且(b)連接于3’末端核苷酸的核苷酸間的連接為一種phosphorothioate鍵。
43.權(quán)利要求42的化合物，其中該5’封閉取代基為一種N’-羥烷基取代3，3，3’，3’-四取代的靛羰花青染料，該染料通過(guò)一種接頭連接于5’末端核苷酸的5’羥基。
44.權(quán)利要求1或3的組合物，其中該動(dòng)物細(xì)胞選自哺乳類(lèi)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、蠕蟲(chóng)細(xì)胞和魚(yú)類(lèi)細(xì)胞。
45.權(quán)利要求1或3的化合物，其中該動(dòng)物細(xì)胞選自哺乳類(lèi)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、蠕蟲(chóng)細(xì)胞和魚(yú)類(lèi)細(xì)胞。
46.權(quán)利要求20或23的方法，其中該動(dòng)物細(xì)胞選自哺乳類(lèi)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、蠕蟲(chóng)細(xì)胞和魚(yú)類(lèi)細(xì)胞。
47.權(quán)利要求27的化合物，其中該靶基因位于一種細(xì)菌人工染色體之中。
全文摘要
本發(fā)明涉及到預(yù)定的遺傳變化在活體細(xì)胞的靶基因中的引入,該引入通過(guò)引入編碼預(yù)定遺傳變化的寡聚脫氧核苷酸來(lái)完成。該寡聚脫氧核苷酸在動(dòng)物、植物和細(xì)菌細(xì)胞中有效。對(duì)于極大的提高了該寡聚脫氧核苷酸在細(xì)菌中的效能的特異的末端修飾進(jìn)行了描述。令人驚奇的,未經(jīng)修飾的寡聚脫氧核苷酸在包括肝細(xì)胞在內(nèi)的哺乳類(lèi)細(xì)胞中與經(jīng)修飾的核苷酸同樣有效,并且可能與雜體寡聚核苷酸同樣有效或者更為有效,該雜體寡聚核苷酸由脫氧核苷酸和2’－O－甲基核苷酸的混合物組成。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1384759SQ00814996
公開(kāi)日2002年12月11日 申請(qǐng)日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月27日
發(fā)明者R·A·梅茨, B·L·弗蘭克, D·M·瓦爾特 申請(qǐng)人:瓦利根美國(guó)有限公司