專利名稱：使用抗cd40l抗體并聯(lián)合抗cd20抗體和/或化療劑和放療治療b細胞惡性瘤的制作方法
技術領域：
本發(fā)明描述了通過調控CD40與其配體CD40L之間的相互作用或調控CD40信號來治療B細胞淋巴瘤和白血病以及其它CD40+惡性瘤的方法和聯(lián)合療法。具體而言，可使用抗CD40L抗體來防止CD40L結合CD40，從而抑制相互作用。這些抗體或能夠抑制CD40/CD40L相互作用的其它試劑還可聯(lián)合化療劑、放療、和/或抗CD20抗體、和抗CD40抗體使用。
背景技術：
淋巴瘤即淋巴細胞瘤。90％的淋巴瘤是B細胞起源的，剩余的10％是T細胞起源的。大多數(shù)患者經(jīng)診斷患有何杰金(Hodgkin)病或非何杰金型淋巴瘤(NHL)。
根據(jù)診斷的淋巴瘤，治療選擇包括放療、化療、和使用單克隆抗體。1.抗CD20抗體CD20是在超過90％的B細胞淋巴瘤上表達的細胞表面抗原，它在贅生性細胞中不脫落或調控(McLaughlin等人，J.Clin.Oncol.，162825-2833，1998b)。CD20抗原是非糖基化的35kDa B細胞膜蛋白，其涉及胞內信號、B細胞分化、和鈣通道動員(Clark等人，Adv.CancerRes.，5281-149，1989；Tedder等人，Immunology Today，15450-454，1994)。該抗原似乎是人B細胞譜系的早期標記，而且以多種抗原密度廣泛表達于正常和惡性B細胞群。然而，完全成熟的B細胞(如漿細胞)、早期B細胞群、和干細胞上不存在該抗原，使之適合于作為抗體介導療法的靶子。
已經(jīng)制備了抗CD20抗體,以用于研究和治療。一種抗CD20抗體是單克隆B1抗體(美國專利號5,843，398)。已經(jīng)以用于治療B細胞淋巴瘤的放射性核素的形式(如131I標記的抗CD20抗體)，以及用于減輕由前列腺癌和乳腺癌轉移引起的骨痛的89Sr標記形式制備了抗CD20抗體(Endo，Gan To Kagaku Ryoho，26744-748，1999)。
據(jù)報導，通過連續(xù)靜脈內輸注將鼠單克隆抗體1F5(抗CD20抗體)施用于B細胞淋巴瘤患者。然而，據(jù)報道，消除循環(huán)中的腫瘤細胞需要極高水平(＞2克)的1F5，而且結果據(jù)說是“暫時的”(Press等人，Blood，69584-591，1987)。在治療中使用單克隆抗體的潛在問題是非人單克隆抗體(如鼠單克隆抗體)通常缺乏人效應子功能性，如它們尤其不能介導依賴補體的裂解或者通過依賴抗體的細胞毒性或由Fc受體介導的吞噬來裂解人靶細胞。另外，非人單克隆抗體可被人宿主識別成外來蛋白質；因此，重復注射這些外來蛋白質可誘導免疫應答，導致有害的超敏反應。對于鼠基單克隆抗體，這常常稱為人抗小鼠抗體應答或“HAMA”應答。另外，這些“外來”抗體可受到宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，使之在到達靶位點之前就被有效中和。
RITUXANRITUXAN(也稱為Rituximab、MabThera、IDEC-C2B8、和C2B8)是第一種經(jīng)FDA批準的單克隆抗體，并在IDEC Pharmaceuticals(參閱美國專利號5,843,439、5,776,456、和5,736,137)進行開發(fā)，用于治療人B細胞淋巴瘤(Reff等人，Blood 83435-445，1994)。RITUXAN是嵌合型抗CD20單克隆抗體，它抑制某些淋巴瘤細胞系的生長，而且據(jù)報道在體外使之對由化療劑誘導的凋亡敏感(Demidem等人，Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals，12177-缺，1997)。在使用鼠異種移植動物模型的體內測試中還證明了RITUXAN的抗腫瘤活性。RITUXAN有效結合人補體，具有強FcR結合，而且能夠通過依賴補體(CDC)和依賴抗體(ADCC)的兩種機制在體外有效殺死人淋巴細胞(Reff等人，Blood 83435-445，1994)。在恒河猴中，該抗體選擇性消除來自血液和淋巴結的正常B細胞。
RITUXAN已經(jīng)被推薦用于治療低級或濾泡B細胞非何杰金淋巴瘤患者(McLaughlin等人，Oncology(Huntingt)，121763-1777，1998a；Maloney等人，Oncology，1263-76，1998；Leget等人，Curr.Opin.Oncol.，10548-551，1998)。在歐洲，RITUXAN已經(jīng)批準用于治療復發(fā)III/IV期濾泡淋巴瘤(White等人，Pharm.Sci.Technol.Today，295-101，1999)，而且據(jù)報道可有效抗擊濾泡中心細胞淋巴瘤(FCC)(Nguyen等人，Eur.J.Haematol.，6276-82，1999)。用RITUXAN治療的其它紊亂包括濾泡中心細胞性淋巴瘤(FCC)、套細胞淋巴瘤(MCL)、彌漫型大細胞淋巴瘤(DLCL)、和小淋巴細胞淋巴瘤/慢性淋巴細胞白血病(SLL/CLL)(Nguyen等人，1999)。據(jù)報道，難治或無治NHL患者可應答RITUXAN與CHOP(如環(huán)磷酰胺、長春花新堿、強的松、和阿霉素)的聯(lián)合療法(Ohnishi等人，Gan To Kagaku Ryoho，252223-2228，1998)。在I期和II期臨床研究中，RITUXAN在低級非何杰金淋巴瘤(NHL)中展示最小的毒性和顯著的治療活性(Berinstein等人，Ann.Oncol.，9995-1001，1998)。
單獨用于治療B細胞NHL的RITUXAN(以通常375mg/m2的每周劑量達4周用于復發(fā)或難治的低級或濾泡NHL)得到很好的耐受而且具有顯著的臨床活性(Piro等人，Ann.Oncol.，10655-661，1999；Nguyen等人，1999；和Coiffier等人，Blood，21927-1932，1998)。然而，在使用該抗體的實驗期間，還給與了高達500mg/M2的每周劑量達4周(Maloney等，Blood 902188-2195(1997)。RITUXAN還聯(lián)合了化療劑諸如CHOP(如環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春花新堿、和強的松)，以治療低級或濾泡B細胞非何杰金淋巴瘤的患者(Czuczman等人，J.CLin.Oncol.，17268-276，1999；和McLaughlin等人，1998a)。2.CD40和CD40LCD40表達于成熟B細胞、白血病和淋巴細胞B細胞、以及何杰金病(HD)的何杰金細胞和Reed-Sternberg(RS)細胞的表面(Valle等人，Eur.J.Immunol.，191463-1467，1989；和Gruss等人，Leuk.Lymphoma，24393-422，1997)。CD40是導致正常和惡性B細胞(諸如非何杰金濾泡淋巴瘤)激活和存活的B細胞受體(Johnson等人，Blood，821848-1857，1993；和Metkar等人，Cancer Immunol.Immunother.，47104，1998)。通過CD40受體的信號可保護未成熟B細胞和B細胞淋巴瘤免于由IgM或Fas誘導的凋亡(Wang等人，J.Immunology，1553722-3725，1995)。相似的，套細胞淋巴瘤細胞具有高水平的CD40，而且加入外源CD40L可增強它們的存活并挽救它們免于由氟達拉濱誘導的凋亡(Clodi等人，Brit.J.Haematol.，103217-219，1998)。相反的，其他人報道了CD40刺激在體外(Funakoshi等人，Blood，832787-2794，1994)和在體內(Murphy等人，Blood，861946-1953，1995)都可抑制贅生性B細胞生長。
對小鼠施用抗CD40抗體(參閱美國專利號5,874,082和5,667,165)可增加患有人B細胞淋巴瘤的小鼠的存活(Funakoshi等人，1994；和Tutt等人，J.Immunol.，1613176-3185，1998)。美國專利號5,674,492(1997)(完整收入本文作為參考)描述了使用模擬CD40L的作用由此送遞死亡信號的抗CD40抗體來治療腫瘤(包括B細胞淋巴瘤和由EBV誘導的淋巴瘤)的方法。CD40信號還與CD20的協(xié)同作用有關(Ledbetter等人，Circ.Shock，4467-72，1994)。描述抗CD40抗體的制備和使用的其它參考包括美國專利號5,874,085(1999)、5,874,082(1999)、5,801,227(1998)、5,674,492(1997)、和5,667,165(1997)(完整收入本文作為參考)。
CD40配體gp39(也稱為CD40配體、CD40L、或CD154)表達于激活的而非休眠的CD4+Th細胞(Spriggs等人，J.Exp.Med，1761543-1550，1992；Lane等人，Eur.J.Immunol.，222573-2578，1992；和Roy等人，J.Immunol.，1511-14，1993)。CD40和CD40L都已經(jīng)克隆并表征(Stamenkovi等人，EMBO J.，81403-1410，1989；Armitage等人，Nature，5780-82，1992；Lederman等人，J.Exp.Med，1751091-1101，1992；和Hollenbaugh等人，EMBO j.，114313-4321，1992)。美國專利號5,945,513也描述了人CD40L。用CD40L基因轉染并在其表面表達CD40L蛋白質的細胞可觸發(fā)B細胞增殖，并能夠與其它刺激信號一起誘導抗體生成(Armitage等人，1992；和美國專利號5,945,513)。CD40L可能在何杰金病區(qū)域中的贅生性濾泡內的腫瘤B細胞(CD40+)或Reed-Sternberg細胞(CD40+)之依賴細胞接觸的相互作用中發(fā)揮重要作用(Carbone等人，Am.J.Pathol.，147912-922，1995)。據(jù)報道，抗CD40L單克隆抗體可有效用于抑制LP-BM5感染小鼠中鼠AIDS(MAIDS)的誘導(Green等人，Virology，241260-268，1998)。然而，導致惡性B細胞的存活對細胞死亡應答的CD40L-CD40信號的機制尚不清楚。例如，有人提出，濾泡淋巴瘤細胞中誘導凋亡的TRAIL分子(APO-2L)(Riberiro等人，British J.Haematol.，103684-689，1998)的下調和BCL-2的過度表達，以及B-CLL中CD95(Fas/APO-1)(Laytragoon-Lwein等人，Eur.J.Haematol.，61266-271，1998)的下調是存活的機制。相反，在濾泡淋巴瘤中存在證據(jù)表明CD40激活導致TNF(Worm等人，International Immunol.，61883-1890，1994)和CD95分子(Plumas等人，Blood，912875-2885，1998)的上調。
已經(jīng)制備了抗CD40抗體，以預防或治療由抗體介導的疾病，諸如美國專利號5,874,082(1999)中描述的變態(tài)反應和自身免疫紊亂。據(jù)報道，抗CD40抗體可有效聯(lián)合抗CD20抗體，在抑制細胞培養(yǎng)中非何杰金B(yǎng)細胞淋巴瘤的生長方面產(chǎn)生加性效應(Benoit等人，Immunopharmacology，35129-139，1996)。據(jù)說，小鼠體內研究證明，在促進攜有一些而非所有淋巴瘤系的小鼠的存活而進行個別施用時，抗CD20抗體比抗CD40抗體更有效(Funakoshi等人，J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.，1993-101，1996)。據(jù)報道，抗CD19抗體在體內治療兩種同系小鼠B細胞淋巴瘤BCL1和A31中也是有效的(Tutt等人，1998)。針對CD40L的抗體據(jù)說可用于治療與B細胞激活有關的紊亂(歐洲專利號555，880，1993)。抗CD40L抗體包括美國專利號5,7474,037(1998)中描述的單克隆抗體3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76、和89-79，美國專利號5,876,718(1999)中描述的用于治療移植物抗宿主疾病的抗CD40L抗體。
因此，不管先前的文獻中已經(jīng)報道了什么，需要改進用于治療B細胞淋巴瘤和白血病的治療方法和聯(lián)合療法。含抗CD40L抗體和拮抗CD40-CD40L相互作用的其它試劑的組合物的使用提供了另一種治療癌癥患者的方法，它的毒性可能低于現(xiàn)有療法。具體而言，建議用于抑制CD40刺激以防止癌細胞變成耐受由化療或其它癌癥療法引起的程序性細胞死亡的方法和組合物，提供了先前未知的方法，可增強癌癥療法并降低細胞對療法產(chǎn)生耐受性的潛力。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供用于治療B細胞淋巴瘤、B細胞白血病、和其它CD40+惡性瘤的方法，包括施用治療有效量的可結合CD40L的抗體或抗體片段。B細胞淋巴瘤包括任何等級的何杰金淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于治療B細胞淋巴瘤或B細胞白血病的聯(lián)合療法，包括抗CD40L抗體或抗體片段或者CD40L拮抗劑，和下列至少一種(1)化療劑或化療劑組合、(2)放療、(3)抗CD20抗體或其片段、和(4)抗CD40抗體或其片段。
圖的簡述

圖1。暴露4小時后B淋巴瘤細胞對阿霉素的敏感性。
圖2。(A圖)抗CD40L(IDEC-131)消除由CD40L介導的針對ADM殺傷B淋巴瘤細胞的耐受性。(B圖)RITUXAN對正常的和用sCD40L預處理的DHL-4細胞的作用。
圖3。(A圖)用抗CD40L抗體(IDEC-131)阻斷由CD40L介導的B-CLL細胞存活。(B圖)用IDEC的C2B8阻斷由CD40L介導的B-CLL存活。
圖4。比較與和不與sCD40L一起培養(yǎng)的CD19+CLL細胞中HLA-DR表達的FACS分析。
發(fā)明詳述本發(fā)明的另一方面是提供用于治療白血病和淋巴瘤以及表達CD40的其它惡性瘤的組合物。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是組合物和使用它們來治療B細胞譜系的淋巴瘤和白血病的方法。該組合物可包含拮抗CD40信號或CD40與CD40L之間的相互作用的試劑。該試劑任選可包含一種試劑，諸如抗CD40L抗體或其片段，以及肽片段、肽模擬物、或化學化合物。或者，該組合物可包含靶向除CD40信號或CD40/CD40L相互作用外的其它惡性方面的多種活性劑(諸如化療劑、其它抗體)，并/或可與放療聯(lián)合施用。1.定義在用于本文時，術語“CD40L抗體”意欲包括可與CD40L蛋白質或其肽或CD40L融合蛋白發(fā)生特異性反應的免疫球蛋白及其片段。CD40L抗體可包括人抗體、靈長類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、和人源化抗體。
在用于本文時，“CD40抗體”意欲包括可與CD40蛋白質或其肽或CD40融合蛋白發(fā)生特異性反應的免疫球蛋白及其片段。CD40抗體可包括人抗體、靈長類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、和人源化抗體。
在用于本文時，“CD20抗體”意欲包括可與CD20蛋白質或其肽或CD20融合蛋白發(fā)生特異性反應的免疫球蛋白及其片段。CD40抗體可包括人抗體、靈長類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、和人源化抗體。抗CD20抗體包括單克隆B1抗體和RITUXAN。
“人源化抗體”指由非人抗體(通常是鼠抗體)衍生的、保留或基本保留親本抗體的抗原結合特性但在人體中免疫原性較低的抗體。這可以通過多種方法來實現(xiàn)，包括(1)將整個非人可變結構域移植到人恒定區(qū)上以產(chǎn)生嵌合抗體；(2)只將非人互補決定簇(CDR)移植到人框架和恒定區(qū)中，保留或不保留至關重要的框架殘基；和(3)移植整個非人可變結構域，但通過表面殘基的取代用人樣區(qū)段 “掩蓋”它們。這些方法公開于Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855，1984；Morrison等人，Adv.Immunol.，4465-92，1988；Verhoeyen等人，Science，2391534-1536，1988；Padlan，Molec.Immun.，28489-498，1991；和Padlan，Molec.Immun.，31169-217，1994(都完整收入本文作為參考)。可以如1995年11月7日提交的美國專利申請?zhí)?8/554,840(也完整收入本文作為參考)中所述來制備人源化的抗CD40L抗體。
“人抗體”指通過任何已知標準方法產(chǎn)生的包含整個人輕鏈和重鏈以及恒定區(qū)的抗體。
“靈長類化抗體”指經(jīng)改造包含猴(或其它靈長類)抗體(特別是食蟹猴抗體)的重鏈和輕鏈可變結構域且包含人恒定結構域序列(優(yōu)選人免疫球蛋白γ1或γ4恒定結構域(或PE變體))的重組抗體。這些抗體的制備描述于Newman等人，Biotechnology，101458-1460，1992；還有共同轉讓的08/379,072、08/487,550、或08/746,361(都完整收入本文作為參考)。據(jù)報道，這些抗體展示與人抗體有高度同源性(即85-98％)，展示人效應子功能，具有降低的免疫原性，并可展示與人抗原的高親和力。
“抗體片段”指諸如Fab、F(ab’)2、Fab’、和scFv等抗體片段。
“嵌合抗體”指包含由兩種不同抗體(通常來自不同物種)衍生的序列的抗體。最常見的是，嵌合抗體包含人和鼠抗體片段，而且通常是人恒定區(qū)和鼠可變區(qū)。
“雙特異性抗體”指具有對一種抗原特異的一個抗原結合位點和對另一種抗原特異的另一個抗原結合位點的抗體分子。
“免疫原性”指靶向蛋白質或治療性部分在施用于受試者后引發(fā)免疫應答(如體液或細胞)的能力。
特別有利的是將胃腸外組合物配制成劑量單位形式，以便于施用和統(tǒng)一劑量。在用于本文時， “劑量單位形式”指適合作為單元劑量用于待治療的哺乳動物受試者的物理上離散的單位；計算包含預定量的活性化合物的每個單位，以產(chǎn)生期望的治療效果，并聯(lián)合所要求的制藥學載體。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格是通過并直接根據(jù)下列各項規(guī)定的(1)活性化合物的獨特特征和待實現(xiàn)的具體治療效果；和(2)本領域內為了個體中的治療靈敏度而復合這種活性化合物的內在限制。2.CD40L拮抗劑依照本發(fā)明的方法，對受試者施用CD40L拮抗劑以干預CD40L與其結合配偶體CD40的相互作用?！癈D40L拮抗劑”定義為干預這種相互作用的分子。CD40L拮抗劑可以是針對CD40L的抗體(如針對CD40L的單克隆抗體)、針對CD40L的抗體的片段或衍生物(如Fab或F(ab’)2片段)、嵌合抗體或人源化抗體、CD40的可溶性形式、包含CD40的融合蛋白的可溶性形式、或破壞或干預CD40L-CD40相互作用或者干預CD40信號的制藥學試劑。
抗體為了制備抗CD40L抗體，可以用CD40L蛋白質或蛋白質片段(如肽片段)的免疫原形式免疫哺乳動物(如小鼠、倉鼠、兔、或有蹄類)，從而在動物中引發(fā)抗體應答。在其表面上表達CD40L的細胞也可用做免疫原。其它免疫原包括純化的CD40L蛋白質或蛋白質片段?？梢酝ㄟ^標準純化技術由表達CD40L的細胞純化CD40L(Armitage等人，1992；Lederman等人，1992；和Hollenbaugh等人，1992)?；蛘撸梢愿鶕?jù)Armitage等人(1992)公開的CD40L氨基酸序列來制備CD40L肽。賦予蛋白質以免疫原性的技術包括綴合載體或本領域眾所周知的其它技術。例如，可以在存在佐劑時施用蛋白質?？梢酝ㄟ^檢測血漿或血清中的抗體效價來監(jiān)控免疫過程。標準ELISA或其它免疫測定法可以與作為抗原的免疫原一起用于評估抗體水平。免疫后，可獲取抗血清并分離多克隆抗體。為了生成單克隆抗體，可以獲取生成抗體的細胞，并如美國專利號5,833,987(1998)和5,747,037(1997)中所述，使用標準體細胞融合流程來融合骨髓瘤細胞。
抗體可以是使用常規(guī)技術獲得的片段，并以上文關于完整抗體所述的相同方式篩選片段的效用。例如，可以通過用胃蛋白酶處理抗體來產(chǎn)生F(ab’)2片段。可以處理得到的F(ab’)2片段以還原二硫鍵，從而產(chǎn)生Fab’片段。預期的其它抗體片段包括Fab和scFv。
除了常用的免疫遏制，在將非人抗體治療性用于人時使對其的識別最小化的一種方法是生成嵌合抗體衍生物，即包含非人動物可變區(qū)和人恒定區(qū)的抗體分子。人源化嵌合抗體分子可包含例如來自小鼠、大鼠、或其它物種抗體的抗原結合結構域和人恒定區(qū)。用于生成這些人源化嵌合抗體的方法包括美國專利號5,833,987(1998)中引用的參考文獻。
為了人治療性目的，可通過生成人可變區(qū)嵌合物，其中可變區(qū)部分(尤其是抗原結合結構域的保守框架區(qū))是人類起源的，而只有高變區(qū)是非人起源的，從而將可與CD40L蛋白質或肽發(fā)生特異性反應的抗體進一步人源化。可以通過本領域知道的幾種技術來生成這些改變的免疫球蛋白分子(如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，807308-7312，1983；Kozbor等人，Immunology Today，47279，1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.，923-16，1982)，優(yōu)選依照PCT發(fā)表物WO 92/06193或EP 0,239,400的技術。人源化抗體可以通過商業(yè)途徑生成，例如Scotgen Limited，2 Holly Road，Twickenham，Middlesex，英國。優(yōu)選的人源化gp39(CD40L)抗體IDEC-131公開于準許的美國申請08/554,840(完整收入本文作為參考)。
用于生成與CD40L蛋白質或肽(諸如美國專利號5,945,513中描述的gp39融合蛋白)發(fā)生反應的特異性抗體或抗體片段的另一種方法是用CD40L蛋白質或肽篩選在細菌中表達的編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達文庫。例如，可以使用噬菌體表達文庫在細菌中表達完整Fab片段、VH區(qū)、和Fv區(qū)。參閱例如Ward等人，Nature，341544-546，1989；Huse等人，Science，2461275-1281，1989；和McCafferty等人，Nature，348552-554，1990。用例如CD40L肽篩選這些文庫可鑒定與CD40L發(fā)生反應的免疫球蛋白片段?；蛘?，可使用SCID-hu小鼠(可由Genpharm獲得)來生成抗體或其片段。
用于生成針對CD40L(包括人CD40L和小鼠CD40L)的單克隆抗體(MAb)和適用于本發(fā)明方法的單克隆抗體的方法學描述于題為“Anti-gp39 Antibodies and Uses Therefor”(抗gp39抗體及其用途)的PCT專利申請?zhí)朩O 95/06666(將其傳授完整收入本文作為參考)。本發(fā)明中特別優(yōu)選的抗人CD40L抗體是分別由雜交瘤24-31和89-76生成的Mab 24-31和89-76。根據(jù)布達佩斯條約，將分別生成89-76和24-31抗體的89-76和24-31雜交瘤于1994年9月2日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)，10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)。89-76雜交瘤指定ATCC編號HB 11713，24-31雜交瘤指定ATCC編號HB 11712。
可依照標準重組DNA技術通過操作編碼抗CD40L抗體的核酸(如DNA或cDNA)來生成重組抗CD40L抗體，諸如嵌合和人源化抗體。因此，本發(fā)明的另一方面是關于編碼可與CD40L(特別是人CD40L)發(fā)生反應的免疫球蛋白重鏈或輕鏈或其部分的分離核酸分子。編碼免疫球蛋白的核酸可編碼免疫球蛋白輕鏈(VL)或重鏈(VH)可變區(qū)，包含或不含相連的重鏈或輕鏈恒定區(qū)或其部分?？梢酝ㄟ^標準技術由生成抗人CD40L MAb的細胞(如雜交瘤)分離這些核酸。例如，可以通過cDNA文庫篩選、PCR擴增、或其它標準技術，分別由24-31和89-76雜交瘤分離編碼24-31或89-76 MAb的核酸。此外，可以將編碼抗人CD40L MAb的核酸摻入表達載體并導入合適的宿主細胞，以便于表達并生成抗人CD40L抗體的重組形式。
靈長類化抗體用于生成重組抗體的另一種高效方法公開于Newman，Biotechnology，101455-1460，1992(完整收入本文作為參考)。更具體的說，這種技術導致包含猴可變結構域和人恒定序列的靈長類化抗體的生成。此外，這種技術還描述于共同轉讓的1995年1月25日提交的美國申請?zhí)?8/379,072，這是1992年7月10日提交的美國流水號07/912,292的繼續(xù)申請，這又是1992年3月23日提交的美國流水號07/856,281的部分繼續(xù)申請，這最后是1991年7月25日提交的美國流水號07/735,064的部分繼續(xù)中請(都完整收入本文作為參考)。
這種技術可修飾抗體，使之在施用于人時不被抗原性排斥。這種技術依賴用人抗原或受體免疫食蟹猴。開發(fā)這種技術是為了生成針對人細胞表面抗原的高親和力單克隆抗體。
可使用共同轉讓的1995年6月7日提交的美國申請?zhí)?8/487,550(完整收入本文作為參考)中描述的方法，通過篩選噬菌體展示文庫或猴異種雜交瘤(使用來自用CD40L免疫的猴子的B淋巴細胞而獲得的)來鑒定針對人CD40L的恒河猴抗體。
據(jù)報道，使用這些申請書中描述的方法而生成的抗體展示人效應子功能，具有降低的免疫原性，和較長的血清半壽期。該技術依賴于如下事實盡管食蟹猴與人在系統(tǒng)發(fā)生上相似，但它們仍然將許多人蛋白質識別成外來的，因此發(fā)動免疫應答。此外，因為食蟹猴在系統(tǒng)發(fā)生上接近人，所以發(fā)現(xiàn)在這些猴子中生成的抗體與在人中生成的抗體具有高度氨基酸同源性。事實上，在對恒河猴免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區(qū)基因測序后，發(fā)現(xiàn)每個基因家族的序列與其人對應物85-98％同源(Newman等人，1992)。以這種方式生成的第一種抗體(抗CD40抗體)與人免疫球蛋白框架區(qū)的共有序列91-92％同源(Newman等人，1992)。
如上所述，本發(fā)明部分涉及對人CD40L抗原特異且能夠抑制CD40信號或抑制CD40/CD40L相互作用的單克隆抗體或其靈長類化形式的鑒定。用經(jīng)鑒定的抗體(或其治療有效片段)阻斷CD40與CD40L之間的主要激活位點，同時使對陽性共刺激的拮抗效應與對陰性信號的激動效應聯(lián)合，將是用于干預惡性瘤(尤其是B細胞淋巴瘤和白血病)的復發(fā)形式的有用治療方法。通過阻斷CD40的信號從而允許它存活并避免由IgM或Fas誘導的凋亡來確定經(jīng)鑒定抗體的功能性。
可以使用共同待審的美國申請流水號08/487,550中描述的方法和本文所列方法生產(chǎn)可特異性結合人CD40L或CD40的新型猴單克隆抗體以及由其衍生的靈長類化抗體。這些抗體具有對CD40L的高親和力，因此可用作抑制CD40L/CD40途徑的免疫遏制劑。
優(yōu)選通過篩選噬菌體展示文庫或通過制備猴異種雜交瘤(使用由用CD40L(如人CD40)免疫的猴子得到的B淋巴細胞)來進行猴單克隆抗體的制備。人CD40還可以來自美國專利號5,945,513中描述的融合蛋白。
如上所述，用于生成抗CD40L抗體的第一種方法包括重組噬菌體展示技術。上文一般性描述了這種技術。
本質上，這將包括構建針對展示在絲狀噬菌體表面上的CD40L抗原的重組免疫球蛋白文庫和篩選分泌對CD40L抗原具有高親和力的抗體的噬菌體。如上所述，優(yōu)選選擇可結合人CD40L和CD40二者的抗體。為了進行這種方法學，本發(fā)明的發(fā)明人構建了猴庫的獨特文庫，它降低了重組的可能性并改進了穩(wěn)定性。
本質上，為了將噬菌體展示用于恒河猴庫，該載體包含用于PCR擴增猴免疫球蛋白基因的特異引物。在開發(fā)靈長類化技術和包含人序列的數(shù)據(jù)庫時，這些引物基于得到的恒河猴序列。
合適的引物公開于共同轉讓的08/379,072(收入本文作為參考)。
第二種方法包括針對人CD40L抗原的猴子(即恒河猴)免疫。上文討論了恒河猴用于生成單克隆抗體的內在優(yōu)勢。具體而言，可針對人抗原或受體免疫這些猴子(即食蟹猴)。此外，可依照Newman等人(1992)和Newman等人，共同轉讓的1995年1月25日提交的美國流水號08/379,072(完整收入本文作為參考)的方法學，將得到的抗體用于生成靈長類化抗體。
得自食蟹猴的抗體的重大優(yōu)勢是這些猴子將許多人蛋白質識別成外來的，因此提供抗體形成，有些具有對期望人抗原(如人表面蛋白質和細胞受體)的高親和力。此外，因為它們在系統(tǒng)發(fā)生上接近人，所以得到的抗體展示與在人中生成的抗體有高度氨基酸同源性。如上所述，在對恒河猴免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區(qū)基因測序后，發(fā)現(xiàn)每個基因家族的序列與其人對應物85-88％同源(Newman等人，1992)。
本質上，對食蟹猴施用人CD40L抗原，由其分離B細胞，如由該動物采集淋巴結活組織標本，然后使用聚乙二醇(PEG)使B淋巴細胞融合KH6/B5(小鼠x人)異種骨髓瘤細胞。然后鑒定分泌可結合人CD40L抗原的抗體的異種雜交瘤。
可以中斷或調控CD40信號的方式結合CD40L或CD40的抗體比較合乎需要，因為這些抗體潛在可用于抑制CD40L與CD40、與它們的對應受體的相互作用。若能夠開發(fā)針對CD40L或CD40上超過一個表位的抗體，并一起利用這些抗體，則它們的聯(lián)合活性可潛在提供協(xié)同效應。
本文公開的發(fā)明包括使用已接觸抗原以生成特定抗體的動物(如靈長類，諸如organgutan、狒狒、恒河猴、和食蟹猴)?？捎糜谏舍槍θ薈D40L的抗體的其它動物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、猴、豬、山羊、和兔。
共同擁有的、共同待審的美國專利申請流水號08/488,376中公開了使用SCID小鼠生成人抗體的優(yōu)選方法。
已經(jīng)克隆了編碼CD40、CD40L、和CD20抗原的人基因，并進行了測序，因此可容易的通過重組方法進行生產(chǎn)。
優(yōu)選的是，例如通過表達編碼已除去了跨膜和胞質結構域由此只剩下胞外部分(即胞外超家族V和C樣結構域)的抗原的基因，而以可溶性形式施用人CD40L、CD40、或CD20抗原。
在導致其特異性抗體生成的條件下用CD40L抗原(優(yōu)選其可溶性形式)免疫恒河猴。優(yōu)選的是，可溶性人CD40L抗原將與佐劑聯(lián)合施用，如完全弗氏佐劑(CFA)、明礬(Alum)、皂苷(Saponin)、或其它已知佐劑，及其組合。一般而言，這將需要重復免疫，如通過幾個月的重復注射。例如，在佐劑中進行可溶性人CD40L抗原的施用，以及3-4個月的加強免疫，得到的血清包含結合人CD40L抗原的抗體。
免疫后，收集B細胞，如通過由經(jīng)免疫動物采集的淋巴結活組織標本，并使用聚乙二醇使B淋巴細胞融合KH6/B5(小鼠x人)異種骨髓瘤細胞。用于制備這些異種骨髓瘤的方法是已知的，而且可以在Newman等人于1995年1月25提交的美國流水號08/379,072(收入本文作為參考)中找到。
然后鑒定分泌可結合人CD40L的抗體的異種雜交瘤。這可以通過已知技術來進行。例如，這可以通過使用酶或放射性核素標記的人CD40L抗原經(jīng)ELISA或放射免疫測定法來測定。
然后將分泌具有對人CD40L抗原的期望特異性的抗體的細胞系亞克隆成單克隆性。
然后將表達可特異性結合人CD40L抗原的抗體的細胞系用于克隆可變結構域序列，從而基本上如Newman等人(1992)和Newman等人于1995年1月25日提交的美國流水號08/379,072(都收入本文作為參考)中所述生成靈長類化抗體。本質上，這必需由所述細胞系提取RNA，轉變成cDNA，并使用Ig特異引物通過PCR擴增所述序列。合適的引物描述于Newman等人，1992和美國流水號08/379,072。
然后將克隆的猴可變基因插入包含人重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因的表達載體。優(yōu)選的是，這是使用IDEC公司專有的表達載體(稱為NEOSPLA)進行的。該載體包含巨細胞病毒啟動子/增強子、小鼠β珠蛋白主要啟動子、SV40復制起點、牛生長激素聚腺苷酸化信號、新霉素磷酸轉移酶外顯子1和外顯子2、人免疫球蛋白κ或λ恒定區(qū)、二氫葉酸還原酶基因、人免疫球蛋白γ1或γ4 PE恒定區(qū)、和前導序列。發(fā)現(xiàn)在摻入猴可變區(qū)基因、轉染CHO細胞、隨后在含G418培養(yǎng)基中選擇和氨甲蝶呤擴增之后，該載體產(chǎn)生很高水平的靈長類化抗體表達。
例如，根據(jù)先前的報道，該表達系統(tǒng)產(chǎn)生了針對CD4和其它人細胞表面受體具有高親合力(Kd≤10-10M)的靈長類化抗體。此外，發(fā)現(xiàn)這些抗體展示與原始猴抗體相同的親和力、特異性、和功能活性。該載體系統(tǒng)基本公開于共同轉讓的美國流水號379,072(收入本文作為參考)以及1993年11月3日提交的美國流水號08/149,099(也完整收入本文作為參考)。該系統(tǒng)提供了高表達水平，即＞30pg/細胞/天。
可通過本領域普通技術人員眾所周知的標準技術來測定產(chǎn)生治療效果所需要的抗體量。通常將通過標準技術在制藥學可接受緩沖劑中提供抗體，而且可以通過任何期望路徑來進行施用。由于本文要求的抗體的功效和人對它們的耐受，有可能重復施用這些抗體以抗擊人的多種疾病或疾病狀態(tài)。
本領域技術人員通過常規(guī)實驗將能夠測定對于誘導免疫遏制目的所需要的抗體的有效、無毒量是多少。然而，一般而言，有效劑量的范圍將是大約0.05-100mg/kg體重/天。
本發(fā)明的抗體或其片段還應當可用于治療哺乳動物的腫瘤。更具體的說，它們應當可用于縮小腫瘤大小、抑制腫瘤生長、和/或延長攜有腫瘤的動物的存活時間。因此，本發(fā)明還涉及通過對人或其它動物施用有效、無毒量的抗體來治療所述人或動物的腫瘤的方法。本領域技術人員通過常規(guī)實驗將能夠測定對于治療致癌腫瘤目的所需要的抗CD40L抗體的有效、無毒量是多少。然而，一般而言，有效劑量的范圍預計將是大約0.05-100mg/kg體重/天。
可以依照上述治療方法，以足以產(chǎn)生治療或預防程度的這種效果的量將本發(fā)明的抗體施用于人或其它動物?？梢猿Ｒ?guī)劑量形式將本發(fā)明的這些抗體施用于這些人或其它動物，所述常規(guī)劑量形式是通過依照已知技術聯(lián)合本發(fā)明抗體與常規(guī)制藥學可接受載體或稀釋劑而制備的。本領域技術人員將認識到，制藥學可接受載體或稀釋劑的形式和特性是由它將聯(lián)合的活性成份的量、施用的路徑、和其它眾所周知的變量規(guī)定的。
本發(fā)明抗體或其片段的施用路徑可以是口服、胃腸外、吸入、或局部。在用于本文時，術語胃腸外包括靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、直腸、或陰道施用。胃腸外施用的皮下和肌內形式通常是優(yōu)選的。
采用本發(fā)明化合物在預防或治療上誘導免疫遏制或者在治療上治療致癌腫瘤的日常胃腸外和口服劑量方案的范圍通常是大約0.05-100mg/kg體重/天，但優(yōu)選是大約0.5-10mg/kg體重/天。
還可以通過吸入來施用本發(fā)明的抗體。“吸入”指鼻內和口服吸入施用?？梢酝ㄟ^常規(guī)技術來制備用于這種施用的合適劑量形式，諸如氣霧劑配方或計量劑量吸入器。將采用的本發(fā)明化合物的優(yōu)選劑量的范圍通常是大約10-100mg。
還可以局部施用本發(fā)明的抗體。局部施用指非全身施用，包括將本發(fā)明的抗體或其片段化合物外部應用于表皮、口腔，和將這種抗體滴注到耳、眼、和鼻中，和它不顯著進入血流的部位。全身施用指口服、靜脈內、腹膜內、和肌內施用。當然，治療或預防效果所需要的抗體量將隨著選擇的抗體、待治療狀況的本質和嚴重性、和接受治療的動物而變化，而且最終取決于醫(yī)生的判斷。本發(fā)明抗體的合適局部劑量的范圍通常將是大約1-100mg/kg體重/天。3.CD40L的可溶性配體除了可識別并結合CD40L且抑制它與CD40的相互作用的抗體，其它CD40L拮抗劑也試圖用于治療B細胞淋巴瘤和白血病，其或是單獨施用或是聯(lián)合其它療法(如放療或化療)使用。其它CD40L拮抗劑是CD40L配體的可溶性形式。CD40L的單價可溶性配體(諸如CD40)可結合CD40L，由此抑制CD40L與表達于B細胞上的CD40的相互作用。術語“可溶性”指配體不是永久的結合細胞膜?？梢酝ㄟ^化學合成或優(yōu)選通過重組DNA技術(例如通過只表達配體的胞外結構域而缺乏跨膜和胞質結構域)來制備可溶性CD40L配體。優(yōu)選的可溶性CD40L配體是可溶性CD40?；蛘?，可溶性CD40L配體可以是融合蛋白的形式。這種融合蛋白包含CD40L配體的至少一個部分且附著于第二種分子。例如，可以與免疫球蛋白的融合蛋白(即CD40Ig融合蛋白)的形式表達CD40。在一個實施方案中，生成的融合蛋白包含CD40分子的胞外結構域部分的氨基酸殘基，且連接對應于免疫球蛋白重鏈(如Cα)的鉸鏈、CH2、和CH3區(qū)序列的氨基酸殘基，以形成CD40Ig融合蛋白(參閱例如Linsley等人，J.Exp.Med.，1783721-730，1991；Capon等人，Nature，337525-531，1989；和美國專利號5,116,964(1992))。可以通過化學合成或優(yōu)選通過基于CD40的cDNA的重組DNA技術來生成這些融合蛋白(Stamenkovic等人，EMBO J.，81403-1410，1989)。4.抗CD40L的施用以適用于體內制藥學施用的生物學相容形式將CD40L拮抗劑施用于受試者?！斑m用于體內施用的生物學相容形式”指待施用的拮抗劑的形式，其中蛋白質的治療作用超過任何有毒作用。在用于本說明書時，術語“受試者”意欲包括其體內可引發(fā)免疫應答的活的生物體，如哺乳動物。優(yōu)選受試者的范例包括人、狗、貓、馬、有蹄類、牛、豬、山羊、綿羊、小鼠、大鼠、及其轉基因物種?？梢匀魏沃扑帉W形式施用CD40L拮抗劑，任選在制藥學可接受載體中施用。治療有效量的拮抗劑的施用定義為在劑量和時間方面實現(xiàn)期望結果(如抑制待治療淋巴瘤的進展或增殖)所必需的有效量。例如，CD40L拮抗劑的治療活性量可隨著諸如疾病階段(如I期對IV期)、年齡、性別、醫(yī)學并發(fā)癥(如與AIDS有關或由其引起的淋巴瘤或其它免疫遏制狀況或疾病)、受試者的體重、和拮抗劑在受試者中引發(fā)期望應答的能力等因素而變化?？梢哉{整劑量方案以提供最佳治療應答。例如，可每天施用幾次分開的劑量，或者可根據(jù)治療情況的緊急事件成比例降低劑量。
可以方便的方式，諸如注射(皮下、肌內、靜脈內等)、口服施用、吸入、經(jīng)皮施用、或直腸施用，來施用活性化合物(諸如抗CD40L抗體)自身或聯(lián)合其它活性劑。根據(jù)施用的路徑，可以用某種材料包被活性化合物，以保護化合物免于酶、酸、和可能滅活該化合物的其它天然條件的作用。優(yōu)選的施用路徑是靜脈內(i.v.)注射。
為了通過胃腸外施用以外的方式施用CD40L拮抗劑，可能必需用某種材料包被拮抗劑或與其共施用以防止它的滅活。例如，可以在適當載體或稀釋劑中對個體施用拮抗劑，與酶抑制劑共施用，或者在適當載體(諸如脂質體)中進行施用。制藥學可接受稀釋劑包括鹽水和含水緩沖液。酶抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸(DFP)、和抑肽酶。脂質體包括水包油包水乳劑和常規(guī)的脂質體(Strejan等人，J.Neuroimmunol.，727-41，1984)。其它制藥學可接受載體和賦形劑在本領域是知道的。
也可以胃腸外或腹膜內施用活性化合物。還可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇、及其混合物、和油中制備分散體。在儲存和使用的普通條件下，這些制劑可包含防腐劑以防止微生物的生長。
適用于注射的制藥學組合物包括無菌水性溶液(水溶性時)或分散體，和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉劑。在所有情況中，組合物必須是無菌的，且流態(tài)程度必須易于注射。它在生產(chǎn)和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，而且必須受到針對微生物(諸如細菌和真菌)污染作用的防護。載體可以是溶劑或分散劑，包括例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、和液態(tài)聚乙二醇等等)、及其合適混合物。例如可以通過敷料(諸如卵磷脂)的使用、通過所需顆粒大小的維持(在分散體的情況中)、和通過表面活性劑的使用來維持適當?shù)牧鲃有浴？梢酝ㄟ^多種抗細菌和抗真菌劑來實現(xiàn)對微生物作用的防護，例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等。在許多情況中，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖)、山梨醇、或氯化鈉。可通過在組合物中包含延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來延長可注射組合物的吸收。
可以將在合適溶劑中包含所需量的活性化合物(如CD40L拮抗劑自身或聯(lián)合其它活性劑)摻入適量的一種或組合的本文所列成份，隨后過濾除菌，由此制備無菌可注射溶液。一般而言，通過將活性化合物摻入包含基本的分散劑和所需的上文所列其它成份的無菌載體來制備分散體。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，它能夠由先前的無菌過濾溶液產(chǎn)生活性成份加任何額外期望成份的粉末。
當活性成份如上所述受到適當保護時，則可以口服施用該蛋白質，例如與惰性稀釋劑或可同化可食用載體一起。在用于本文時，“制藥學可接受載體”包括任何和所有溶劑、分散劑、敷料、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等等。這些介質和試劑用于制藥學活性物質的用途在本領域是眾所周知的。除非任何常規(guī)介質或試劑都與活性化合物不相容，否則就涵蓋將它們用于治療性組合物的用途。上文所述用于CD40L拮抗劑的所有組合物還可在組合物中包含輔助活性化合物(如抗CD20抗體中的化療劑)。5.抗CD40L與其它試劑的施用何杰金病在美國每年診斷大約7500件何杰金病(HD)新病例。單獨的放療已經(jīng)用于治療I、II、和甚至III期HD。還已經(jīng)聯(lián)合使用放療與化療(如ABVD和MOPP)。參閱V.T.DeVita等人，“Hodgkin’s Disease”(何杰金病)，在《CancerPrinciples & Practice of Oncology》(癌癥腫瘤學原理和實踐)一書中，第2卷，第2 142-2283頁，DeVita等人編，第5版，1997，及其關于施用放療和化療方案以治療HD的參考文獻。
可用于治療HD的化療藥物包括烷化劑、長春花生物堿(如長春花新堿和長春花堿)、甲基芐肼、氨甲蝶呤、和強的松。四種藥物的聯(lián)合MOPP(二氯甲基二乙胺(mechlethamine)(氮芥子氣)、長春花新堿(Oncovin)、甲基芐肼、和強的松)在治療HD中很有效。在MOPP耐受性患者中，可以使用ABVD(如阿霉素、博來霉素、長春花堿、和達卡巴嗪)、ChlVPP(苯丁酸氮芥、長春花堿、甲基芐肼、和強的松)、CABS(洛莫司汀、阿霉素、博來霉素、和鏈脲菌素)、MOPP加ABVD、MOPP加ABV(阿霉素、博來霉素、和長春花堿)、或BCVPP(亞硝基脲氮芥、環(huán)磷酰胺、長春花堿、甲基芐肼、和強的松)組合。Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，“Malignant Lymphomas”惡性淋巴瘤)，在《Harrison’s Principles of Internal Medicine》(內科醫(yī)學的哈里森原則)一書中，第1774-1788頁，Kurt J.Isselbacher等人編，第13版，1994和V.T.DeVita等人(1997)，及其引用的關于標準劑量和方案的參考文獻。這些療法可以不變的使用，或者根據(jù)特定患者的需要進行改變，聯(lián)合CD40L拮抗劑本身或進一步聯(lián)合抗CD20抗體或其片段。
對于復發(fā)或抗性HD，可以聯(lián)合利用常規(guī)劑量搶救聯(lián)合方案與抗CD40L抗體(單獨或聯(lián)合抗CD20抗體)。常規(guī)劑量搶救聯(lián)合HD方案的范例包括使用V.T.DeVita等人(1997)中所述劑量和方案的VABCD(長春花堿、阿霉素、達卡巴嗪、洛莫司汀、和博來霉素)、ABDIC(阿霉素、博來霉素、達卡巴嗪、洛莫司汀、和強的松)、CBVD(洛莫司汀、博來霉素、長春花堿、和地塞米松)、PCVP(長春花堿、甲基芐肼、環(huán)磷酰胺、和強的松)、CEP(洛莫司汀、依托泊苷、和潑尼氮芥(prednimustine))、EVA(依托泊苷、長春花堿、和阿霉素)、MOPLACE(環(huán)磷酰胺、依托泊苷、強的松、氨甲蝶呤、阿糖胞苷、和長春花新堿)、MIME(甲基GAG、異環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤、和依托泊苷)、MINE(米托喹酮(mitoquazone)、異環(huán)磷酰胺、長春瑞賓(vinorelbine)、和依托泊苷)、MTX-CHOP(氨甲蝶呤和CHOP)、CEM(洛莫司汀、依托泊苷、和氨甲蝶呤)、CAVP(洛莫司汀、苯丙氨酸氮芥、依托泊苷、和強的松)、EVAP(依托泊苷、長春花堿、阿糖胞苷、和順式鉑氨)、EPOCH(依托泊苷、長春花新堿、阿霉素、環(huán)磷酰胺、和強的松)。
非何杰金氏淋巴瘤(NHL)在美國每年診斷大約40,000件NHL新病例，而且這個數(shù)目似乎在增加。此外，NHL在每年死于癌癥的患者總數(shù)中排名第四。NHL包括淋巴瘤的幾種亞型，它們具有獨特的臨床表現(xiàn)和自然史。通過NHL的常用分類即操作公式(Working Formulaton)列出了NHL亞型的細目分類。表1列出了3級操作公式。
NHL的B細胞型包括小淋巴細胞性淋巴瘤/B細胞慢性淋巴細胞性白血病(SLL/B-CLL)、淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、彌漫型大細胞淋巴瘤(DLCL)、和Burkitt淋巴瘤(BL)。參閱Gaidano等人，“Lymphomas”(淋巴瘤)，在《CancerPrinciples & Practice of Oncology》(癌癥腫瘤學原理和實踐)一書中，第2卷，第2131-2145頁，DeVita等人編，第5版，1997。其它兩種公式(如基爾公式和修訂后的歐洲美洲淋巴瘤分類(REAL)也用于腫瘤學，而且NHL的名稱可以在兩種分類系統(tǒng)之間變化。參閱M.A.Shipp等人，“Non-Hodgkin’s Lymphomas”(非何杰金淋巴瘤)，在《CancerPrinciples & Practice of Oncology》(癌癥腫瘤學原理和實踐)一書中，第2卷，第2165-2220頁，DeVita等人編，第5版，1997。NHL淋巴瘤可根據(jù)診斷的患者年齡進一步分類。參閱M.A.Shipp等人(1997)。
放療通常受限于治療診斷患有I或II期低級NHL的患者，而且可以作為階段已經(jīng)進展的患者的潛在治療形式。本發(fā)明包括聯(lián)合CD40L拮抗劑與放療還有其它癌癥治療形態(tài)來治療NHL。
化療可用于大多數(shù)II期患者和所有III和IV期患者。方案包括使用單一烷化劑，諸如環(huán)磷酰胺或苯丁酸氮芥，或者組合，諸如CVP(環(huán)磷酰胺、長春花新堿、和強的松)、CHOP(CVP和阿霉素)、C-MOPP(環(huán)磷酰胺、長春花新堿、強的松、和甲基芐肼)、CAP-BOP(CHOP加甲基芐肼和博來霉素)、m-BACOD(CHOP加氨甲蝶呤、博來霉素、和甲酰四氫葉酸)、ProMACE-MOPP(強的松、氨甲蝶呤、阿霉素、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、和甲酰四氫葉酸加標準MOPP)、ProMACE-CytaBOM(強的松、阿霉素、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博來霉素、長春花新堿、氨甲蝶呤、和甲酰四氫葉酸)、和MACOP-B(氨甲蝶呤、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春花新堿、固定劑量的強的松、博來霉素、和甲酰四氫葉酸)。關于標準劑量和方案參閱Shipp等人(1977)。還將CHOP聯(lián)合博來霉素、氨甲蝶呤、甲基芐肼、氮芥子氣、阿糖胞苷、和依托泊苷使用。用于治療NHL的較少用藥物包括2-氯脫氧腺苷(2-CDA)、2’-脫氧助間型霉素、和氟達拉濱。對于患有中級和高級NHL且未能實現(xiàn)緩解或復發(fā)的患者，使用搶救療法。搶救療法采用諸如阿糖胞苷、順式鉑氨、依托泊苷、和異環(huán)磷酰胺等藥物，單獨或組合給藥。Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，“Malignant Lymphomas”惡性淋巴瘤)，在《Harrison’s Principles of Internal Medicine》(內科醫(yī)學的哈里森原則)一書中，第1774-1788頁。在NHL的復發(fā)、侵入性形式的情況中，推薦下列方案使用Shipp等人(1997)中所述劑量和方案的IMVP-16(異環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤、和依托泊苷)、MIME(甲基GAG、異環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤、和依托泊苷)、DHAP(地塞米松、高劑量的阿糖胞苷、和順式鉑氨)、ESHAP(依托泊苷、甲基強的松、HD阿糖胞苷、和順式鉑氨)、CEPP(B)(環(huán)磷酰胺、依托泊苷、甲基芐肼、強的松、和博來霉素)、和CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷、和強的松)。
根據(jù)小兒科NHL組織學和階段推薦的方案如下
APO＝阿霉素、強的松、和長春花新堿；COMP＝環(huán)磷酰胺、長春花新堿、氨甲蝶呤、和強的松。參閱H.J.Weinstein等人，“Leukemias andLymphomas of Childhood”(兒童期的白血病和淋巴瘤)，在《CancerPrinciples & Practice of Oncology》(癌癥腫瘤學原理和實踐)一書中，第2卷，第2145-2165頁，DeVita等人編，第5版，1997，及其引用的參考文獻(都收入本文作為參考)。
抗CD40L抗體和拮抗劑可用于聯(lián)合目前使用的任何化療劑和/或放療法以治療診斷的HD或NHL亞型。還可以在使用的治療劑混合物中加入抗CD20抗體。在與抗CD40L抗體或CD40L拮抗劑的組合中將使用的化療劑的量可以隨受試者而變化，或者可依照本領域所知進行施用。參閱例如Bruce A.Chabner等人，“Antineoplastic Agent”(抗腫瘤劑)，在Goodman & Gilman的《The Pharmacological Basis ofTherapeutics》(治療劑的制藥學基礎)，第1233-1287頁，Joel G.Hardman等人編，第9版，1996。
白血病和其它惡性瘤本發(fā)明的預期療法和治療方法還可用于治療B細胞白血病，包括ALL-L3(Burkitt型白血病)和慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，以及單核細胞白血病和表達CD40的其它惡性瘤。
用于ALL的治療包括長春花新堿和強的松的使用。蒽環(huán)霉素(anthracycline)、環(huán)磷酰胺、L-天冬酰胺酶也已經(jīng)加入這些治療。其它誘導療法包括四種藥物(長春花新堿、強的松、蒽環(huán)霉素、和環(huán)磷酰胺或天冬酰胺酶)或五種藥物(長春花新堿、強的松、蒽環(huán)霉素、環(huán)磷酰胺、和天冬酰胺酶)的組合。關于其它療法和劑量參閱D.A.Scheinberg等人，“Acute Leukemias”急性白血病)，在《CancerPrinciples & Practice of Oncology》(癌癥腫瘤學原理和實踐)一書中，第2卷，第2193-2321頁，DeVita等人編，第5版，1997。
用于CLL的治療包括CMP、CVP、CHOP、COP、和CAP(環(huán)磷酰胺、阿霉素、和強的松)化療劑組合?；加须y治CLL患者的治療包括嘌呤類似物(如氟達拉濱單磷酸鹽、2-氯脫氧腺苷、和戊制菌素)的使用。參閱A.B.Deisseroth等人，“Chronic Leukemias”(慢性白血病)，在《CancerPrinciples & Practice of Oncology》(癌癥腫瘤學原理和實踐)一書中，第2卷，第2193-2321頁，DeVita等人編，第5版，1997。
抗CD20和抗CD40抗體本發(fā)明還涵蓋聯(lián)合抗CD40L抗體(諸如IDEC-131)與抗CD20抗體或其治療有效片段和/或抗CD40抗體或其治療有效片段。優(yōu)選的抗CD20抗體是RITUXAN和B1(參閱美國專利號5,843,398)。關于抗CD40L(也稱為抗gp39)的描述、制備、和使用參閱共同轉讓的1995年11月7日提交的美國專利申請流水號08/554,840、1997年9月8日提交的08/925,339、1998年4月30日提交的09/069,871、和1999年6月14日提交的09/332,595，和美國專利號5,747,037。優(yōu)選的抗CD40抗體及其制備描述于美國專利號5,874,085、5,874,082、5,801,227、5,667,165、5,674,492、和5,667,165(都完整收入本文作為參考)。本文關于抗CD20抗體所述的所有討論同樣應用于抗CD40抗體。
因為外周血B細胞紊亂根據(jù)定義可指示對血液進行治療的必要性，所以免疫學活性嵌合抗CD20抗體和放射性標記抗CD20抗體的施用路徑優(yōu)選胃腸外；在用于本文時，術語“胃腸外”包括靜脈內、肌內、皮下、直腸、陰道、或腹膜內施用，其中最優(yōu)選靜脈內施用。
通常使用標準技術在制藥學可接受緩沖劑(例如無菌鹽水、無菌緩沖水、丙二醇、上述組合等)中提供免疫學活性嵌合抗CD20抗體和放射性標記抗CD20抗體。用于制備胃腸外可施用試劑的方法描述于“Pharmaceutical Carriers & Formulatons”(制藥學載體和配方)，Martin，在《Remington’s Pharmaceutical Scinece》(雷明頓制藥科學)，第15版，Mack出版公司，Easton，Pa.，1975(收入本文作為參考)，或如上所述。
可以通過本領域普通技術人員眾所周知的標準技術來確定可用于在任何指定患者中產(chǎn)生獨特治療效果的免疫學活性嵌合抗CD20抗體的具體治療有效量。免疫學活性嵌合抗CD20抗體的有效劑量(即治療有效量)的范圍是大約0.001-大約30mg/kg體重，更優(yōu)選大約0.01-大約25mg/kg體重，最優(yōu)選大約0.4-大約20.0mg/kg體重。其它劑量也是可行的。影響劑量的因素包括但不限于疾病的嚴重程度、早先的治療方法、患者的整體健康、患者的年齡、存在的其它疾病等。相信熟練技術人員能夠容易的評估特定患者并確定落入范圍內或范圍外(如果必要)的所需合適劑量?？梢宰鳛橐淮沃委熁蛞幌盗兄委焷磉M行這些劑量范圍的免疫學活性嵌合抗CD20抗體或其它CD20抗體(如RITUXAN或B1)的導入。關于嵌合抗體，優(yōu)選通過一系列治療來進行這種施用。這種優(yōu)選方法基于與這種疾病有關的治療方法學。實際上，雖然一次劑量可提供好處且能夠有效用于疾病治療/管理，但是優(yōu)選治療過程可具有幾個階段；最優(yōu)選的是，在大約2-大約10周(最優(yōu)選大約4周)的時間里每周一次將大約0.4-大約20mg/kg體重的免疫學活性嵌合抗CD20抗體或另一種抗CD20抗體導入患者。
關于放射性標記抗CD20抗體和/或抗CD40抗體的使用，偏愛的是抗體是(1)非嵌合的，或(2)刪除結構域的嵌合人源化抗體，或(3)人抗體。這種偏愛是基于刪除結構域或鼠抗體與完整的嵌合或人源化抗體相比循環(huán)半壽期顯著更短(即循環(huán)半壽期越長，放射性核素在患者體內存在的時間也越長)。然而，可以有效利用放射性標記的嵌合抗體，其中所用較低毫居(mCi)劑量聯(lián)合相對于抗體的未標記嵌合抗體。這種情況能夠將骨髓毒性降至可接受水平，同時維持治療功效?？梢匀缑绹鴮＠?,776,456和5,843,439中所述制備抗CD20的特異放射性標記嵌合形式。
釔-90標記的抗CD20抗體的有效一次治療劑量(即治療有效量)的范圍是大約5-大約120mCi，更優(yōu)選大約10-大約40mCi(鼠抗體)和大約30-大約100mCi(刪除結構域的抗體)。碘-131標記的抗CD20抗體的有效一次治療非骨髓銷蝕劑量的范圍是大約5-大約70mCi，更優(yōu)選大約5-大約40mCi。碘-131標記的抗CD20抗體的有改一次治療銷蝕劑量(即可能需要自體骨髓移植)的范圍是大約30-大約600mCi，更優(yōu)選大約50-低于大約500mCi。聯(lián)合嵌合抗CD20抗體后，由于與鼠抗體相比循環(huán)半壽期較長，因此碘-131標記的嵌合抗CD20抗體的有效一次治療非骨髓銷蝕劑量的范圍是大約5-大約40mCi，更優(yōu)選低于大約30mCi。如銦-111標記的成像標準通常低于大約5mCi?？梢栽诿绹鴮＠?,843,398和5,843,439(完整收入本文作為參考)中找到關于放射性標記抗CD20抗體的生產(chǎn)和使用的其它討論。
放射性標記的抗體關于放射性標記抗體(如對CD40、CD40L、和/或CD20特異的)的使用，偏愛的是抗體是非嵌合的；這種偏愛是基于嵌合抗體與鼠抗體相比循環(huán)半壽期顯著更長(即由于循環(huán)半壽期較長，因此放射性核素在患者體內存在的時間延長)。然而，可以有效利用放射性標記的嵌合抗體，其中相對于鼠抗體使用更低毫居(mCi)劑量的嵌合抗體。這種情況可將骨髓毒性降至可接受水平，同時維持治療功效。
多種放射性核素可應用于本發(fā)明，而且相信本領域技術人員有能力容易的確定在各種境況中哪種放射性核素是最合適的。例如，碘-131(131I)是眾所周知用于靶向免疫療法的放射性核素。然而，131I的臨床效用受限于幾個因素，包括8天身體半壽期；碘化抗體在血液中和在腫瘤位點的脫鹵；和對于腫瘤中局部化劑量沉積而言次佳的發(fā)射特征(如大γ成份)。隨著優(yōu)良螯合劑的出現(xiàn)，將金屬螯合基團附著于蛋白質的機會增加了利用其它放射性核素諸如銦-131(131In)和釔-90(90Y)的機會。90Y在放射免疫療法應用中提供了幾種利用優(yōu)勢90Y的半壽期為64小時，足以允許腫瘤積累抗體，而且與如131I不同，90Y是高能純β發(fā)射體，在它的衰變中不伴隨γ發(fā)射，組織范圍是100-1000個細胞直徑。此外，穿透放射的最小量允許對門診患者施用90Y標記的抗體。另外，細胞殺傷不要求標記抗體的內在化，而且離子化放射的局部發(fā)射對于缺乏靶抗原的鄰近腫瘤細胞應當是致死的。
對90Y的一個非治療限制是基于缺乏顯著γ放射，使得成像困難。為了避免這個問題，診斷“成像”放射性核素，諸如銦-111(111In)，可用于在施用治療劑量的90Y標記抗CD20之前確定腫瘤的位置和相對大小。銦-111作為診斷性放射性核素是特別優(yōu)選的，因為可以安全的施用大約1-大約10mCi而沒有可檢測的毒性；而且成像資料通常是隨后90Y標記抗體分布的預示。大多數(shù)成像研究利用5mCi111In標記抗體，因為這個劑量是安全的，而且與較低劑量相比增加成像效率，最佳成像發(fā)生于抗體施用后3-6天。參閱例如Murray，J.Nuc.Med，263328，1985和Carraguillo等人，J.Nuc.Med，2667，1985。
90Y標記抗體(如抗CD40L、抗CD20、和抗CD40抗體)的有效一次治療劑量的范圍是大約5-大約75mCi，更優(yōu)選大約10-大約40mCi。131I標記抗體的有效一次治療非骨髓銷蝕劑量范圍是大約5-大約70mCi，更優(yōu)選大約5-大約40mCi。131I標記抗體的有效一次治療銷蝕劑量(即可能需要自體骨髓移植)的范圍是大約30-大約600mCi，更優(yōu)選大約50-低于大約500mCi。聯(lián)合嵌合抗體后，由于與鼠抗體相比循環(huán)半壽期較長，因此碘-131(131I)標記嵌合抗體的有效一次治療非骨髓銷蝕劑量的范圍是大約5-大約40mCi，更優(yōu)選低于大約30mCi。如111In標記的成像標準通常低于大約5mCi。
關于用于治療的放射性標記抗體，還可以使用一次治療或使用多次治療的劑量。由于放射性核素成份，優(yōu)選的是在治療之前，為經(jīng)歷由放射引起的潛在致命骨髓毒性的患者“收集”周圍干細胞(“PSC”)或骨髓(“BM”)。使用標準技術收集BM和/或PSC，然后凈化并凍存，用于可能的再灌注。另外，最優(yōu)選的是在治療之前對患者進行使用診斷標記抗體(如使用111In)的診斷劑量學研究，其目的是確保治療標記抗體(如使用90Y)將不會在任何正常器官或組織中不必要的“濃縮”。
可利用的其它放射性同位素包括123I、125I、131In、32P、64Cu、67Cu、211At、177Lu、90Y、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、211At和213Bi。放射投遞量將部分取決于粒子發(fā)射的半壽期和類型。
下文所述實驗使用了下列材料和方法。下文提供的實施例不限制本文所描述或要求的發(fā)明，而僅僅是提供所要求的發(fā)明的實施方案。
實施例實施例1B淋巴瘤細胞DHL-4細胞的特性通過使用IDEC-131并將B淋巴瘤細胞系DHL-4(Roos等人，Leuk.Res.，10195-202，1986)暴露于阿霉素(ADM)，在體外測試了抗CD40L抗體能夠阻斷由CD40L-CD40介導的惡性B細胞在由化療誘導的毒性/凋亡中存活的觀點。IDEC-131是鼠單克隆抗人CD40L抗體24-31的人源化形式。
最初，通過將DHL-4細胞暴露于不同濃度的ADM達4小時而測定ADM對DHL-4細胞的胞毒最小濃度。通過Alamar Blue(一種肝細胞染料還原測定法)測量了培養(yǎng)5天后DHL-4細胞的細胞毒性(參閱Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Meth.，202163-171，1997)。簡而言之，將1×105個DHL-4細胞在含不同濃度ADM(1×10-6M-1×10-8M)的生長培養(yǎng)基(RMPI-1640加10％胎牛血清)中在細胞培養(yǎng)管中于37℃保溫4小時。保溫后，清洗細胞，以1×105個細胞/ml的濃度重懸于生長培養(yǎng)基，并向96孔平底板的每個孔中加入200μl細胞懸浮液。將平板于37℃保溫，并測試不同時間點的細胞毒性。在保溫的最后18個小時，向每個孔中加入50μl氧化還原染料Alamar Blue(BiosourceInternational，目錄編號DAL 1100)。保溫后，通過于室溫在搖床上保溫10分鐘以冷卻平板，并測定染料的胞內還原。使用96孔熒光計讀取530nm激發(fā)和590nm發(fā)射的熒光。結果表述成相對熒光單位(RFU)。如下計算細胞毒性百分比[1-(測試樣品的平均RFU÷對照細胞的平均RFU)]×100％。繪制ADM細胞毒性的滴定曲線并為隨后的測定法選擇該藥物細胞毒性的最小濃度。
如圖1所示，結果顯示培養(yǎng)了5天且在培養(yǎng)前暴露于ADM(2×10-7M和4×10-8M)4小時的DHL-4細胞的細胞毒性。如上所述，暴露后清洗細胞一次，在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，并通過Alamar Blue染料攝取測定法測定細胞毒性。另外，通過流式細胞計量術對DHL-4細胞表征選定CD分子的膜表達。發(fā)現(xiàn)DHL-4細胞表達CD19、CD20、CD40分子，但是沒有檢測到CD40L的表達。實施例2抗CD40L抗體消除由CD40L介導的針對阿霉素殺傷B淋巴瘤細胞的耐受性圖2A顯示了抗CD40L抗體(IDEC-131)對由CD40L-CD40介導的DHL-4細胞對由ADM誘導的細胞死亡的耐受性的效果。將DHL-4細胞(0.5×106個細胞/ml)在存在10μg/ml可溶性CD40L(sCD40L，P.A.Brams、E.A.Padlan、K.Hariharan、K.Slater、J.Leonard、R.Noelle、和R.Newman，“A humanized anti-human CD154 monoclonalantibody blocks CD154-CD40 mediated human B cell activation”(人源化抗人CD154單克隆抗體阻斷由CD154-CD40介導的人B細胞激活)，手稿已提交)時于37℃保溫1小時。保溫1小時后，加入低濃度的ADM(2×10-7M-4×10-8M)并在存在或缺乏CD40L(10μg/ml)時繼續(xù)保溫4小時。暴露于ADM后，清洗細胞，以0.5×106個細胞/ml的濃度重懸于生長培養(yǎng)基，并向96孔平底板的每個孔中加入100μl細胞懸浮液(雙份，包含或不含sCD40L)。向ADM處理過程中連續(xù)暴露于sCD40L的培養(yǎng)物和ADM暴露過程中沒有sCD40L的培養(yǎng)物中加入sCD40L(10μg/ml)。另外，向培養(yǎng)物中加入IDEC-131(10μg/ml)以測定其對與sCD40L和ADM一起保溫的DHL-4細胞的作用。5天后，如上所述，通過Alamar Blue染料攝取測定法測量細胞毒性。
數(shù)據(jù)顯示，sCD40L延長了DHL-4細胞在ADM處理后的存活，然而，正如預期的，在暴露于ADM且缺乏sCD40L的細胞中觀察到細胞毒性增加。此外，抗CD40L抗體(IDEC-131)的加入逆轉了由CD40L介導的細胞存活，導致細胞毒性增加(圖2A)。
IDEC-131的單獨加入對用sCD40L處理的DHL-4細胞沒有影響，這指示抗體自身對DHL-4細胞不具有任何直接抑制性或細胞毒性(圖2B)。將與或未與sCD40L預保溫的DHL-4細胞在存在不同濃度的IDEC-131、RITUXAN、抗CD20抗體CE9.1、和抗CD4抗體(Anderson等人，Clin.Immunol.& Immunopathol.，8473-84，1997)時進行培養(yǎng)。5天后，如上所述，通過Alamar Blue測定法測定DHL-4細胞的細胞毒性/增殖。圖2B顯示IDEC-131對DHL-4細胞的增殖或細胞毒性沒有影響，然而，正如預期的，RITUXAN抑制細胞增殖并誘導細胞毒性。在與抗CD4抗體一起培養(yǎng)的DHL-4細胞中沒有看到影響。實施例3CD40L-CD40信號防止由抗CD20抗體RITUXAN誘導的B淋巴瘤細胞的凋亡使用包括DHL-4細胞和RITUXAN的表面交聯(lián)的體外系統(tǒng)測定由CD40L-CD40介導的信號對由抗CD20抗體誘導的B淋巴瘤細胞凋亡的影響。將DHL-4細胞(0.5-1×106個細胞/ml)與sCD40L(10μg/ml)一起于37℃進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜后，收獲細胞并與10μg/ml RITUXAN或對照抗體(CE9.1；抗CD4抗體)一起包含或不含sCD40L(10μg/ml)在冰上保溫。保溫1小時后，離心細胞以除去未結合的抗體，以1×106個細胞/ml重懸于生長培養(yǎng)基(5％FCS-RPMI)，并在組織培養(yǎng)管中進行培養(yǎng)。通過示蹤標記山羊抗人Ig-Fcγ特異性抗體的F(ab’)2片段(15μg/ml)使細胞表面結合的抗體發(fā)生交聯(lián)，并將培養(yǎng)物于37℃保溫直至測定凋亡。使用流式細胞計量術caspase-3測定法檢測凋亡。于4或24小時后收獲培養(yǎng)細胞，清洗，并于4℃使用Cytofix(Cytofix/CytopermTM試劑盒，Pharmingen，目錄編號2075KK)固定。固定20分鐘后，清洗細胞，并加入15μl親和純化的PE綴合多克隆兔抗caspase-3抗體(Pharmingen，目錄編號67345)和50μl cytoperm(Pharmingen，目錄編號2075KK)。將細胞在冰上在黑暗中保溫30分鐘。保溫后，清洗細胞一次，并重懸于cytoperm。在FACScan上獲得流式細胞計量術數(shù)據(jù)，并使用Verity Software House的WinList軟件進行分析。
表I顯示了DHL-4淋巴瘤細胞通過暴露于sCD40L對由RITUXAN誘導的凋亡的耐受性。在這些研究中，caspase-3的激活用作代用標記，因為我們先前的研究揭示caspase-3與Tunel測定法之間的相關性較好。在存在sCD40L時RITUXAN在DHL-4細胞表面上的交聯(lián)降低了凋亡水平，而不暴露于sCD40L的細胞發(fā)生凋亡。比較而言，在存在相同同種型抗體—對照抗體(CE9.1)時保溫的培養(yǎng)物導致沒有細胞發(fā)生凋亡。因而，這些數(shù)據(jù)說明由sCD40L誘導的CD40途徑信號可導致由RITUXAN介導的B淋巴瘤細胞殺傷。
表IsCD40L對由RITUXAN介導的DHL-4凋亡的耐受性
a具有caspase-3活性的陽性細胞百分比及其對數(shù)刻度的平均熒光強度。實施例4IDEC-131對慢性淋巴細胞白血病(CLL)細胞的作用為了測定IDEC-131在體外對B-CLL細胞的生長和存活的作用，在體外在包含或不含IDEC-131且存在CD40L時培養(yǎng)B-CLL細胞。使用Ficoll-Hypaque梯度離心由CLL患者的血液分離外周血單核細胞(PBMC)。通過錐蟲藍染料排除測定生存力，為＞98％。流式細胞計量術分析揭示＞70％的淋巴細胞是CD19+/CD20+。在CLL生長培養(yǎng)基(如添加5％FCS或2％自體供體血漿、添加2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基)中培養(yǎng)CLL細胞(PBMC)。另外，對于有些實驗，使用CD19+DynabeadTM，依照制造商的指示(Dynal，目錄編號111.03/111.04)純化CD19+B細胞，并如上所述進行培養(yǎng)。在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CLL或純化的B-CLL細胞大多數(shù)經(jīng)歷自發(fā)凋亡性細胞死亡。然而，在存在sCD40L時培養(yǎng)這些細胞擴大它們在培養(yǎng)中的生存力。表II指示在存在或缺乏sCD40L(5μg/ml)時生長的CD19+B-CLL細胞在不同時間點的細胞生存力，并指示CLL細胞的生存力較長。來自患者1且與sCD40L一起培養(yǎng)的B-CLL細胞的生存力≥60％達超過2周，而在缺乏sCD40L時生長的細胞其生存力低于10％。
(a)等于通過錐蟲藍染料排除法測定的生存力百分比。
圖3A顯示了IDEC-131對培養(yǎng)7天后B-CLL細胞的生長和存活的效果。將由CLL患者純化的B-CLL細胞(2×106個細胞/ml)分到兩個培養(yǎng)管中。將一個管中的細胞與等體積生長培養(yǎng)基中的sCD40L(5μg/ml)混合，將另一個管與等體積生長培養(yǎng)基一起保溫作為對照。于37℃保溫1小時后，輕輕混合細胞，并向96孔平底板的每個孔中加入100μl細胞懸浮培養(yǎng)基，一式雙份，包含和不含不同濃度的IDEC-131(10μg/ml-0.3μg/ml)。7天后，如上所述，通過Alamar Blue測定法測定培養(yǎng)物中的細胞存活/死亡。數(shù)據(jù)顯示了包含sCD40L的培養(yǎng)物中的細胞存活。向培養(yǎng)物中加入IDEC-131導致細胞死亡增加，這指示細胞存活的逆轉或對細胞死亡的敏化。另外，以與IDEC-131相同的濃度施用RITUXAN時，對細胞死亡的效果比IDEC-131小(圖3B)。實施例5B-CLL中由CD40L-CD40介導的HLA-DR分子上調為了確定CD40L-CD40信號轉導途徑是否是完整的，在存在或缺乏CD40L(5μg/ml)時于37℃培養(yǎng)來自CLL患者的CLL細胞(5×105個細胞/ml)。48和144小時后，通過流式細胞計量術使用標準流程測定CD19+細胞上的II型分子HLA-DR表達。簡而言之，在不同時間點收集培養(yǎng)的淋巴細胞，并使用FACScan(Becton-Dickinson)流式細胞計量器用偶聯(lián)熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)用于單一或雙重染色的抗體分析所述分子的表面表達。為了染色用于流式細胞計量術，將培養(yǎng)管中的1×106個細胞與下列合適抗體一起保溫抗CD45-FITC，將淋巴細胞群控制在散點圖上；抗CD19-PE(Pharmingen，目錄編號30655)或抗CD20-FITC(Pharmingen，目錄編號33264)抗體，測定CD19+和/或CD20+B細胞；抗CD3-FITC抗體(Pharmingen，目錄編號30104)，逐出T細胞；抗CD19-RPE和抗HLA-DR-FITC抗體(Pharmingen，目錄編號32384)，測定CD19+細胞上的II型表達。通過與2ml冷的PBS一起以200xg離心6分鐘來清洗細胞一次，并與抗體一起在冰上保溫30分鐘，然后清洗細胞一次，在0.5％低聚甲醛中固定，并保存于4℃直至分析。在FACScan上獲得流式細胞計量術數(shù)據(jù)，并使用WinList軟件(Verity SoftwareHouse)進行分析。將機器設置成自動gate，以檢驗包含被RPE或FITC單一染色、未染色、或雙重染色的細胞的象限。圖4顯示了與sCD40L一起培養(yǎng)的CD19+CLL細胞與未與sCD40L一起培養(yǎng)的細胞中HLA-DR表達的比較。在存在sCD40L時培養(yǎng)的B-CLL細胞上檢測到較高水平的HLA-DR表達(表III)。
HLA-DR分子陽性的CD19+B細胞及其平均熒光強度(MIF)。實施例6IDEC-131和RITUXAN的制備對于CD40+惡性瘤的治療，將在配方緩沖液10mM檸檬酸鈉、150mMNaCl、0.02％Polysorbate 80 pH6.5中的大約10-大約50mg/mlIDEC-131靜脈內(iv)灌注到受試者中。在RITUXAN之前、之后、或與之聯(lián)合施用IDEC-131。RITUXAN灌注劑量的范圍是大約3-大約10mg/kg受試者體重。實施例7IDEC-131和CHOP的制備對于應答CHOP的CD40+惡性瘤的治療(如何杰金病、非何杰金淋巴瘤、和慢性淋巴細胞性白血病，以及對于其中細胞是CD40+的惡性瘤的搶救療法)，立即在開始CHOP循環(huán)之前以大約3-大約10mg/kg患者體重的劑量范圍灌注IDEC-131。將在合計4-8個CHOP循環(huán)的每個循環(huán)之前重復IDEC-131施用。實施例8抗CD40L與RITUXAN的聯(lián)合施用以治療受試者的B細胞淋巴瘤聯(lián)合療法作為搶救療法或用于治療復發(fā)型或侵入性形式的CD40+惡性瘤(如何杰金病、非何杰金淋巴瘤、和CLL)特別有用。在聯(lián)合施用IDEC-131與CHOP和RITUXAN時，如上文實施例6中所述施用IDEC-131，隨后進行實施例7中CHOP-IDEC-131施用特定的方案。
將上文討論的所有參考文獻完整收入本文作為參考。
權利要求
1.用于治療CD40+惡性瘤的方法，包括施用治療有效量的抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段可結合CD40L，由此抑制CD40/CD40L相互作用或CD40信號。
2.權利要求1的方法，其中CD40+惡性瘤是B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。
3.權利要求2的方法，其中B細胞淋巴瘤是何杰金病(HD)或非何杰金淋巴瘤(NHL)。
4.權利要求3的方法，其中NHL是低級、中級、或高級的。
5.權利要求3的方法，其中NHL是選自下組的亞型小淋巴細胞性、濾泡型小裂細胞為主性、濾泡型小裂和大細胞混合型、濾泡型大細胞為主型、彌漫型小裂細胞性、彌漫型小和大細胞混合性、彌漫型大細胞性、免疫母細胞性大細胞性、原始淋巴細胞性、小無裂Burkitt和非Burkitt型、AIDS相關淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴結病、套細胞淋巴瘤、和單核細胞樣B細胞淋巴瘤。
6.權利要求2的方法，其中B細胞白血病是慢性B細胞白血病、B細胞譜系的急性成淋巴細胞白血病、或B細胞譜系的慢性淋巴細胞白血病。
7.權利要求2的方法，其中可結合CD40L的抗體或抗體片段是IDEC-131、3E4、2H5、2H8、4D9-8、4D9-9、24-31、24-43、89-76、或89-79。
8.權利要求7的方法，其中抗體或抗體片段是嵌合的、雙特異性的、人的、或人源化的。
9.權利要求2的方法，其中抗體片段是Fab、Fab’、scFv、或F(ab’)2。
10.權利要求2的方法，還包括施用治療有效量的第二種抗體或抗體片段、化療劑、化療劑組合、和/或放療。
11.權利要求10的方法，其中放療是外部放射處理或放射性標記抗體。
12.權利要求11的方法，其中放射性標記抗體是放射性標記的IDEC-131、RITUXAN、或B1或其片段。
13.權利要求12的方法，其中放射性標記抗體是用123I、125I、131I、111In、131In、32P、64Cu、67Cu、211At、177Lu、90Y、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、211At、和213Bi放射性標記的。
14.權利要求10的方法，其中用于治療HD的化療劑是下列任何一種或多種烷化劑、長春花生物堿、甲基芐肼、氨甲蝶呤、或強的松。
15.權利要求10的方法，其中用于治療NHL的化療劑是下列任何一種或多種烷化劑、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、2-CDA、2’-脫氧助間型霉素、氟達拉濱、阿糖胞苷、順式鉑氨、依托泊苷、或異環(huán)磷酰胺。
16.權利要求10的方法，其中用于治療HD的化療劑組合是MOPP、ABVD、ChlVPP、CABS、MOPP加ABVD、MOPP加ABV、BCVPP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、CEM、MTX-CHOP、EVAP、或EPOCH。
17.權利要求1O的方法，其中用于治療NHL的化療劑組合是CVP、CHOP、C-MOPP、CAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEPP(B)、或CAMP。
18.權利要求10的方法，其中用于治療B細胞白血病的化療劑是下列至少一種蒽環(huán)霉素、環(huán)磷酰胺、L-天冬酰胺酶、和嘌呤類似物。
19.權利要求10的方法，其中用于治療B細胞白血病的化療劑組合是長春花新堿、強的松、蒽環(huán)霉素、和環(huán)磷酰胺或天冬酰胺酶；長春花新堿、強的松、蒽環(huán)霉素、環(huán)磷酰胺、和天冬酰胺酶；CHOP；CMP；CVP；COP；或CAP。
20.權利要求10的方法，其中第二種抗體是抗CD20抗體。
21.權利要求21的方法，其中抗CD20抗體是RITUXAN或其片段或者B1或其片段。
22.用于治療CD40+惡性瘤的方法，包括施用抗CD40L抗體或其片段的步驟，其中抗CD40L抗體或抗體片段可阻斷CD40-CD40L相互作用或抑制CD40信號；和施用抗CD20抗體或其片段。
23.權利要求22的方法，其中CD40+惡性瘤是B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。
24.用于治療CD40+惡性瘤的聯(lián)合療法，包括CD40L拮抗劑和下列至少一種(1)化療劑或化療劑組合；(2)放療；(3)抗CD20抗體或其片段；和(4)抗CD40抗體或其片段。
25.權利要求24的方法，其中放療是外部放射治療或放射性標記抗體。
26.權利要求25的方法，其中放射性標記抗體是用123I、125I、131I、111In、131In、32P、64Cu、67Cu、211At、177Lu、90Y、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、211At、和213Bi放射性標記的。
27.權利要求24的聯(lián)合療法，其中CD40+惡性瘤是B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。
28.權利要求27的聯(lián)合療法，其中B細胞淋巴瘤是HD或NHL。
29.權利要求28的聯(lián)合療法，其中NHL是低級、中級、或高級的。
30.權利要求28的聯(lián)合療法，其中NHL是選自下組的亞型小淋巴細胞性、濾泡型小裂細胞為主性、濾泡型小裂和大細胞混合型、濾泡型大細胞為主型、彌漫型小裂細胞性、彌漫型小和大細胞混合性、彌漫型大細胞性、免疫母細胞性大細胞性、原始淋巴細胞性、小無裂Burkitt和非Burkitt型、AIDS相關淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴結病、套細胞淋巴瘤、和單核細胞樣B細胞淋巴瘤。
31.權利要求28的聯(lián)合療法，其中B細胞白血病是慢性B細胞白血病、B細胞譜系的急性成淋巴細胞白血病、或B細胞譜系的慢性淋巴細胞白血病。
32.權利要求24的聯(lián)合療法，其中CD40L拮抗劑是抗CD40L抗體或其片段。
33.權利要求32的聯(lián)合療法，其中抗CD40L抗體是IDEC-131或其片段。
34.權利要求32的聯(lián)合療法，其中抗CD40L片段是Fab、Fab’、scFv、或F(ab’)2。
35.權利要求24的聯(lián)合療法，其中抗CD20抗體是RITUXAN或其片段或者B1或其片段。
36.權利要求28的聯(lián)合療法，其中用于治療HD的化療劑是下列任何一種或多種烷化劑、長春花生物堿、甲基芐肼、氨甲蝶呤、或強的松。
37.權利要求28的聯(lián)合療法，其中用于治療NHL的化療劑是下列任何一種或多種烷化劑、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、2-CDA、2’-脫氧助間型霉素、氟達拉濱、阿糖胞苷、順式鉑氨、依托泊苷、或異環(huán)磷酰胺。
38.權利要求28的聯(lián)合療法，其中用于治療HD的化療劑組合是MOPP、ABVD、ChlVPP、CABS、MOPP加ABVD、MOPP加ABV、BCVPP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、CEM、MTX-CHOP、EVAP、或EPOCH。
39.權利要求28的聯(lián)合療法，其中用于治療NHL的化療劑組合是CVP、CHOP、C-MOPP、CAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEPP(B)、或CAMP。
40.權利要求28的聯(lián)合療法，其中用于治療B細胞白血病的化療劑是蒽環(huán)霉素、環(huán)磷酰胺、L-天冬酰胺酶、和嘌呤類似物。
41.權利要求28的聯(lián)合療法，其中用于治療B細胞白血病的化療劑組合是長春花新堿、強的松、蒽環(huán)霉素、和環(huán)磷酰胺或天冬酰胺酶；長春花新堿、強的松、蒽環(huán)霉素、環(huán)磷酰胺、和天冬酰胺酶；CHOP；CMP；CVP；COP；或CAP。
42.用于治療CD40+惡性瘤的組合物，其包含(1)抗CD40L抗體或其抗體片段和下列至少一種或多種(2)放射性標記的可結合CD40L或CD20的抗體、(3)抗CD20抗體或其片段、或(4)化療劑或化療劑組合。
43.權利要求42中用于治療CD40+惡性瘤的組合物，其中惡性瘤是B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。
44.權利要求43的組合物，其中B細胞白血病是HD或NHL。
45.權利要求42的組合物，其中放射性標記抗體是放射性標記的IDEC-131、RITUXAN、或B1。
46.權利要求46的組合物，其中放射性標記抗體是用123I、125I、131I、111In、131In、32P、64Cu、67Cu、211At、177Lu、90Y、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、211At、和213Bi放射性標記的。
47.權利要求44的組合物，其中NHL是低級、中級、或高級的。
48.權利要求44的組合物，其中NHL是選自下組的亞型小淋巴細胞性、濾泡型小裂細胞為主性、濾泡型小裂和大細胞混合型、濾泡型大細胞為主型、彌漫型小裂細胞性、彌漫型小和大細胞混合性、彌漫型大細胞性、免疫母細胞性大細胞性、原始淋巴細胞性、小無裂Burkitt和非Burkitt型、AIDS相關淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴結病、套細胞淋巴瘤、和單核細胞樣B細胞淋巴瘤。
49.權利要求42的組合物，其中抗CD40抗體是IDEC-131或其片段。
50.權利要求42的組合物，其中抗CD20抗體是RITUXAN或其片段或者B1或其片段。
51.權利要求43的組合物，其中用于治療HD的化療劑是下列任何一種或多種烷化劑、長春花生物堿、甲基芐肼、氨甲蝶呤、或強的松。
52.權利要求44的組合物，其中用于治療NHL的化療劑是下列任何一種或多種烷化劑、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、2-CDA、2’-脫氧助間型霉素、氟達拉濱、阿糖胞苷、順式鉑氨、依托泊苷、或異環(huán)磷酰胺。
53.權利要求44的組合物，其中用于治療HD的化療劑組合是MOPP、ABVD、ChlVPP、CABS、MOPP加ABVD、MOPP加ABV、BCVPP、VABCD、ABDIC、CBVD、PCVP、CEP、EVA、MOPLACE、MIME、MINE、CEM、MTX-CHOP、EVAP、或EPOCH。
54.權利要求44的組合物，其中用于治療NHL的化療劑組合是CVP、CHOP、C-MOPP、CAP-BOP、m-BACOD、ProMACE-MOPP、ProMACE-CytaBOM、MACOP-B、IMVP-16、MIME、DHAP、ESHAP、CEPP(B)、或CAMP。
55.權利要求43的組合物，其中用于治療B細胞白血病的化療劑是蒽環(huán)霉素、環(huán)磷酰胺、L-天冬酰胺酶、和嘌呤類似物。
56.權利要求43的組合物，其中用于治療B細胞白血病的化療劑組合是長春花新堿、強的松、蒽環(huán)霉素、和環(huán)磷酰胺或天冬酰胺酶；長春花新堿、強的松、蒽環(huán)霉素、環(huán)磷酰胺、和天冬酰胺酶；CHOP；CMP；CVP；COP；或CAP。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于治療B細胞淋巴瘤和白血病以及其它CD40
文檔編號A61K39/395GK1407901SQ00816836
公開日2003年4月2日 申請日期2000年11月6日 優(yōu)先權日1999年11月8日
發(fā)明者N·漢納, K·哈里哈蘭 申請人:Idec藥物公司