專利名稱：I型細(xì)胞因子受體tccr的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及新DNA的鑒定和分離、新多肽的重組產(chǎn)生，以及診斷和治療免疫相關(guān)疾病的組合物和方法，特別涉及對T-細(xì)胞向Th1和Th2亞型的分化以及細(xì)胞因子的釋放特征進(jìn)行調(diào)節(jié)的方法，還涉及與細(xì)胞因子釋放特征相關(guān)的多種疾病。
背景技術(shù)：
免疫相關(guān)疾病和炎癥性疾病的臨床表現(xiàn)和因果關(guān)系相當(dāng)復(fù)雜，常常有多個(gè)相互連接的生物學(xué)通路，所述生物學(xué)通路在正常生理學(xué)上對于損害或損傷、引發(fā)損害或損傷組織修復(fù)以及增加先天性和獲得性防御外來生物體的應(yīng)答能力而言，是至關(guān)重要的。當(dāng)這些正常生理通路引起另外的損害或損傷時(shí)，無論是作為異常調(diào)節(jié)或過度刺激而直接與反應(yīng)強(qiáng)度有關(guān)，還是對其自身的反應(yīng)，亦或是這些情況的結(jié)合，均導(dǎo)致疾病或病變發(fā)生。
盡管疾病發(fā)生常涉及多個(gè)通路并且常常具有多個(gè)不同的生物系統(tǒng)/通路，但是，干預(yù)這些通路中一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)可以產(chǎn)生改善或治療效果。通過拮抗有害過程/通路或者刺激有益過程/通路，可以實(shí)現(xiàn)治療性干預(yù)。
T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)是哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答中的重要組成部分。T細(xì)胞識別與位于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)內(nèi)的基因編碼的自體-分子聯(lián)合的抗原。該抗原可與MHC分子一起出現(xiàn)在抗原呈遞細(xì)胞、感染病毒細(xì)胞、癌細(xì)胞、移植物等的表面。T細(xì)胞系統(tǒng)清除這些對于哺乳動(dòng)物宿主的健康造成威脅的改變了的細(xì)胞。T細(xì)胞包括輔助T細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞。輔助T細(xì)胞在識別抗原呈遞細(xì)胞上的抗原-MHC復(fù)合物之后大量增殖。輔助T細(xì)胞也分泌多種細(xì)胞因子，即淋巴因子，它們在激活B細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和各種其它參加免疫應(yīng)答的細(xì)胞方面，發(fā)揮著樞紐作用。
體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的中心事件是激活輔助T細(xì)胞和后者的克隆擴(kuò)增(clonal expansion)。輔助T細(xì)胞的激活是由T細(xì)胞受體(TCR)-CD3與抗原呈遞細(xì)胞表面的抗原-MHC復(fù)合物之間的相互作用而引發(fā)的。此相互作用介導(dǎo)級聯(lián)生化事件，從而導(dǎo)致靜止?fàn)顟B(tài)的輔助T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期(G0期向G1期轉(zhuǎn)變)，并導(dǎo)致IL-2和有時(shí)IL-4的高親和力受體的表達(dá)。激活的T細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞周期各過程而增殖并分化成記憶細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞。
哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)由大量獨(dú)特細(xì)胞構(gòu)成，所述細(xì)胞協(xié)同作用從而使宿主抵御細(xì)菌、病毒、毒素和其它非-宿主自身物質(zhì)的入侵。把主要負(fù)責(zé)特異性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞類型稱為淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞有兩種類型，即B細(xì)胞和T細(xì)胞。T細(xì)胞因其在胸腺中發(fā)育而得名，而B細(xì)胞則因在骨髓中發(fā)育而被命名為B細(xì)胞。T-細(xì)胞群有數(shù)個(gè)亞群如抑制T細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和T輔助細(xì)胞。T-輔助細(xì)胞亞群限定了2條免疫通路Th1和Th2。Th1細(xì)胞是CD4+細(xì)胞的一個(gè)功能性亞群，它以增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的能力為特征。Th1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子I1-2和干擾素γ，并確定其不存在I1-10、I1-4、I1-5和I1-6。
Th2細(xì)胞也是一種CD4+細(xì)胞，但它明顯不同于Th1細(xì)胞。Th2細(xì)胞負(fù)責(zé)抗體產(chǎn)生并產(chǎn)生細(xì)胞因子I1-4、I1-5、I1-10和I1-13(見

圖1)。這些細(xì)胞因子在Th1和Th2應(yīng)答反應(yīng)的交互抑制方面起著重要作用。Th1細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素γ抑制Th2細(xì)胞增殖(圖2)，而Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10抑制干擾素γ的產(chǎn)生(圖2)。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，四螺旋束細(xì)胞因子家族的成員(Bazan，J.F.，1990，Proc NatlAcad Sci U SA，876934-8)在T輔助細(xì)胞從共同前體擴(kuò)增并最終分化為不同的Th1和Th2效應(yīng)細(xì)胞群的過程中起著非常關(guān)鍵的作用，O′Garra，A.，1998，Immunity8275-83。IL-4主要影響Th2細(xì)胞發(fā)育，而IL-12是參與Th1細(xì)胞分化的主要因子，Hsieh，C.S.等，1993，Science，260547-9；Seder，R.A.等，1993，ProcNatl Acad Sci U S A，9010188-92；Le Gros，G.等，1990，J.Exp Med，172921-9；Swain，S.L.，等，1991，Immunol Rev，123115-44。因此，IL-4缺陷小鼠(Kuhn，R.，etal，1991，Science，254707-10)，其IL-4受體鏈(Noben-Trauth，N.等，1997，Proc Natl Acad Sci U S A，9410838-43)或IL-4特異轉(zhuǎn)錄因子STAT6(Shimoda，K.等，1996，Nature，380630-3)在Th2反應(yīng)中有缺陷，而IL-12缺陷鼠(Magram，J.等，1996，Imniunity，4471-81)的IL-12受體(IL-12R)1鏈(Wu，C.等，1997，J Immunol，1591658-65)或IL-12特異轉(zhuǎn)錄因子STAT4(Kaplan，M.H.等，1996，Nature，382174-7)在Th1反應(yīng)中有缺陷。
據(jù)信，Th-1和Th-2細(xì)胞亞型起源于稱作Th-0細(xì)胞的共同前體。與Th-1和Th-2亞型產(chǎn)生交互排他性的細(xì)胞因子不同的是，Th-0細(xì)胞產(chǎn)生大多數(shù)或所有這些細(xì)胞因子。不同細(xì)胞因子對于Th-1和Th-2亞型的釋放特征，在效應(yīng)物機(jī)理和細(xì)胞毒細(xì)胞的選擇方面起著積極作用。Th-1細(xì)胞分泌的I1-2和干擾素γ傾向于激活巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒細(xì)胞，而Th-2細(xì)胞分泌的I1-4、I1-5、I1-6和I1-10，則傾向于增加嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的產(chǎn)生以及增強(qiáng)包括IgE在內(nèi)的抗體的產(chǎn)生并減低細(xì)胞毒細(xì)胞的功能。一旦建立，由產(chǎn)生的細(xì)胞因子維持Th-1或Th-2反應(yīng)模式，所述細(xì)胞因子抑制其它亞群的產(chǎn)生。Th-1細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素γ抑制Th-2細(xì)胞因子如I1-4和I1-10的產(chǎn)生，而Th-2細(xì)胞產(chǎn)生的I1-10則抑制Th-1細(xì)胞因子如I1-2和γ-干擾素的產(chǎn)生。
Th1和Th2細(xì)胞亞群之間細(xì)胞因子的微妙平衡被打破的話，將導(dǎo)致宿主患病。舉例來說，Th1細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生可導(dǎo)致自身免疫性炎癥疾病、多發(fā)性硬化和炎性腸道疾病(例如，克羅恩氏病，局限性腸炎，遠(yuǎn)端回腸炎，肉芽腫腸炎，節(jié)段性回腸炎，末端回腸炎)。類似地，Th2細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生將導(dǎo)致過敏性病癥，包括過敏性高敏癥、哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、春季結(jié)膜炎、濕疹、蕁麻疹和食物變態(tài)反應(yīng)，Umetsu等，Soc.Exp.Biol.Med.21511-20(1997)。
1997年5月19日申請的WO 97/44455和Sprecher等，Biochem.Biophys.Res.Commun.24682-90(1998)描述了細(xì)胞因子受體分子與本文所述鼠和人TCCR分子具有一定程度的序列同源性。現(xiàn)有技術(shù)聲稱，鼠和人細(xì)胞因子受體在淋巴組織表達(dá)(包括胸腺、脾、淋巴結(jié)和外周血白細(xì)胞)，并進(jìn)一步指出所述受體在B-細(xì)胞和T-細(xì)胞上均有存在而且其功能與免疫細(xì)胞增殖、分化和/或活化有關(guān)，或許在免疫應(yīng)答發(fā)展和調(diào)節(jié)中起作用。然而，WO97/44455和Sprecher等，出處同上既沒有確定TCCR和其同族體在介導(dǎo)T-細(xì)胞分化為Th1亞型和Th2亞型和細(xì)胞因子釋放特征方面的精確作用，也沒有推斷細(xì)胞因子T-細(xì)胞亞型的釋放會(huì)導(dǎo)致宿主患病。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物，包括人的免疫相關(guān)疾病，尤其由于T-細(xì)胞分化為Th1亞型或Th2亞型的通路偏置所導(dǎo)致的生理機(jī)能(例如，細(xì)胞因子釋放)和疾病的診斷和治療方法。本發(fā)明是基于鑒定TCCR(以前稱作NPOR)的編碼基因和氨基酸序列，TCCR缺乏或失活將使哺乳動(dòng)物T-細(xì)胞偏置分化成Th2亞型。一些免疫性疾病通過抑制或增強(qiáng)T-細(xì)胞分化成Th1或Th2亞型可以治療。
本發(fā)明還涉及提高、刺激或增強(qiáng)T-細(xì)胞分化為Th2亞型而不是Th1亞型的方法，包括施用有效量的TCCR拮抗劑。任選地，本方法在哺乳動(dòng)物中使用，而且有效量是治療有效量。任選地，TCCR拮抗劑誘導(dǎo)的T-細(xì)胞向Th2亞型細(xì)胞的分化還引起在抗原刺激下Th2細(xì)胞因子(例如，I1-4，11-5I1-10和II-13)釋放。以過度產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子為特征的疾病和敏感于Th2-亞型刺激對分化的平衡效果以及所致細(xì)胞因子的釋放特征的疾病包括，自身免疫性炎性疾病(例如過敏性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化、胰島素依賴型糖尿病、自身免疫性眼色素層視網(wǎng)膜炎(uveoretinitis)、炎性腸道疾病(例如克羅恩氏(Crohn’s)病，潰瘍性結(jié)腸炎)、自身免疫性甲狀腺疾病)和同種異體移植排斥。
本發(fā)明進(jìn)一步包括阻止、抑制或減弱T-細(xì)胞分化為Th2亞型(即，使T細(xì)胞分化為Th1亞型)的方法，所述方法包括施用有效量的TCCR或其激動(dòng)劑。任選地，所述方法在哺乳動(dòng)物中使用，而有效量是治療有效量。任選地，TCCR或激動(dòng)劑誘導(dǎo)的分化導(dǎo)致在抗原刺激下Th1細(xì)胞因子(例如，干擾素γ)釋放。以過度產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子(或Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生不足)為特征的疾病，和可應(yīng)答Th1-亞型刺激對分化的平衡作用的疾病，Th2細(xì)胞因子過度產(chǎn)生預(yù)期在治療傳染性疾病(例如，碩大利什曼原蟲(Leishmania major)、麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、白色念珠菌(Candida albicans)、鼠弓漿蟲(Toxoplasma gondi)、呼吸道合胞病毒、人類免疫缺陷病毒)和過敏性病癥(例如，哮喘，過敏性鼻炎，特應(yīng)性皮炎，春季結(jié)膜炎)中有效。
一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的與TCCR多肽結(jié)合的抗體(例如，抗-TCCR)。一方面，抗體摹擬TCCR多肽的活性(激動(dòng)型抗體)，或者相反，抗體抑制或中和TCCR多肽的活性(拮抗型抗體)。另一方面，抗體是單克隆抗體，其優(yōu)選具有非人互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基和人框架區(qū)(FR)殘基?？贵w可被標(biāo)記和被固定在固體載體上。再一方面，抗體是抗體片段、單鏈抗體或抗-獨(dú)特型抗體。
另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明多肽和抗體在制備具有上述用途的組合物或藥物中的應(yīng)用。
還一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼抗-TCCR抗體的核酸和載體以及含有所述核酸的重組宿主細(xì)胞。還有一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及按照下述過程生產(chǎn)所述抗體的方法在能夠表達(dá)抗體的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了編碼抗體的核酸的宿主細(xì)胞，并從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收抗體。
發(fā)明進(jìn)一步涉及抑制TCCR多肽一種或多種功能或活性的TCCR多肽拮抗劑。或者，發(fā)明涉及刺激或增強(qiáng)TCCR多肽一種或多種功能或活性的TCCR激動(dòng)劑。優(yōu)選這些拮抗劑和/或激動(dòng)劑是TCCR變體、肽片段、小分子、反義寡核苷酸(DNA或RNA)、核酶或抗體(單克隆抗體，人源化抗體，特異抗體，單鏈抗體，異源偶聯(lián)抗體或這些抗體的片段)。另外，TCCR激動(dòng)劑可包括潛在TCCR配體，而潛在TCCR拮抗劑可包括可溶性TCCR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)。
再一實(shí)施方案，發(fā)明涉及分離的與編碼TCCR多肽或其互補(bǔ)鏈的核酸分子雜交的核酸分子。核酸優(yōu)選是DNA，且雜交優(yōu)選在嚴(yán)格條件下發(fā)生。此類核酸分子可作為本文鑒定的擴(kuò)增基因的反義分子，后者反過來，可用于調(diào)節(jié)各自的擴(kuò)增基因，或者在擴(kuò)增反應(yīng)中作為反義引物。此外，所述序列可用作核酶和/或三鏈螺旋序列的一部分，反過來，核酶和/或三鏈螺旋序列可用于調(diào)節(jié)被擴(kuò)增的基因。
另一實(shí)施方案，發(fā)明涉及檢測TCCR多肽是否存在的方法，包括將懷疑含有多肽的細(xì)胞與抗-TCCR抗體接觸，并檢測抗體與細(xì)胞的結(jié)合情況。
還一實(shí)施方案，發(fā)明涉及診斷哺乳動(dòng)物中Th1-介導(dǎo)或Th2介導(dǎo)的病癥的方法，包括檢測編碼TCCR多肽的基因在(a)取自哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞的待測樣品中，和在(b)相同細(xì)胞類型的已知正常組織細(xì)胞的對照樣品中的表達(dá)水平，如果被測樣品中的表達(dá)水平相對于對照樣品低的話，則表明在取得待測組織細(xì)胞的哺乳動(dòng)物中存在Th2-介導(dǎo)的病癥，如果被測樣品中表達(dá)水平高于對照樣品的話，則表明存在Th1-介導(dǎo)的病癥。
另一實(shí)施方案，發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物免疫性疾病的診斷方法，包括(a)將采自哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞的被測樣品與抗-TCCR抗體接觸，和(b)檢測抗體和TCCR多肽之間復(fù)合物的形成。該檢測可以是定量或定性的，通過與在一相同細(xì)胞類型的已知正常組織細(xì)胞的對照樣品中監(jiān)測到的該復(fù)合物的形成進(jìn)行比較而完成。被測樣品中有大量復(fù)合物形成，則表明在取得待測組織細(xì)胞的哺乳動(dòng)物中存在TCCR和Th1-介導(dǎo)的病癥，復(fù)合物形成量較少，則表明存在Th2-介導(dǎo)的病癥。優(yōu)選抗體攜帶可檢測的標(biāo)記物?？梢员O(jiān)測復(fù)合物形成，例如使用光學(xué)顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光測定法或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)。被測樣品通常取自懷疑患有免疫系統(tǒng)缺陷或異常的個(gè)體。
另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一診斷試劑盒，其盛有在適當(dāng)包裝中的抗-TCCR抗體和載體(例如緩沖劑)。該試劑盒優(yōu)選含有使用該抗體檢測TCCR多肽的說明書。
還一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)品，包括一容器；貼在容器上的標(biāo)簽；和裝在容器中的含有活性劑的組合物；其中組合物對于刺激或抑制哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答是有效的，貼在容器上的標(biāo)簽注明該組合物可被用于治療免疫相關(guān)疾病，該組合物中的活性劑是刺激或抑制TCCR多肽表達(dá)和/或活性的物質(zhì)。在一優(yōu)選的方面，該活性劑是TCCR多肽或抗-TCCR抗體。
再一實(shí)施方案，涉及鑒定能夠調(diào)節(jié)TCCR多肽表達(dá)和/或生物活性的化合物的方法，通過使候選化合物與TCCR多肽在足以使得兩個(gè)組分互相作用的條件下和時(shí)間內(nèi)相接觸。一具體方面，將所述候選化合物或TCCR多肽固定在固相載體上。另一方面中，未固定的組分?jǐn)y帶可檢測的標(biāo)記。
附圖簡述圖1是CD4+T-細(xì)胞分化為Th1和Th2細(xì)胞的示意圖，圖中顯示了負(fù)責(zé)影響分化的主要細(xì)胞因子，在抗原刺激下向各種亞型分化時(shí)所釋放的主要細(xì)胞因子，以及所釋放的細(xì)胞因子總體(profile)所介導(dǎo)的生理學(xué)效應(yīng)。
圖2是描述Th1和Th2 T-細(xì)胞亞型釋放的細(xì)胞因子之間相互關(guān)系的負(fù)反饋環(huán)路示意圖。
圖3顯示人TCCR(hTCCR)的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。所述序列也已在1996年5月23日提交的WO97/44455中公開，并且還可以從GenBank登錄號4759327下得到。該序列還描述在Sprecher等，Biochem.Biophys，Res.Commun 246(1)82-90(1998)中。在SEQ ID NO1中，已經(jīng)鑒定出信號肽在氨基酸殘基1～約32，跨膜結(jié)構(gòu)域在約氨基酸殘基517-約538，N-糖基化位點(diǎn)在約殘基51-54，76-79，302-305，311-314，374-377，382-385，467-470，563-566，N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)在殘基約107-112、240-245、244-249、281-286、292-297、373-378、400-405、459-464、470-475、531-536和533-538，原核膜脂蛋白脂質(zhì)附著位點(diǎn)在殘基約522-532，生長因子和細(xì)胞因子受體家族識別標(biāo)記1在殘基約41-54。在殘基183-191處有一個(gè)與人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)受體的第二亞單位具有顯著同源性的區(qū)域。
圖4顯示鼠TCCR(mTCCR)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。該序列也已在1996年5月23日提交的WO97/44455中公開，并且還可以從GenBank登記號7710109下得到。該序列也描述在Sprecher等，Biochem.Biophys，Res.Commun.246(1)82-90(1998)中。在SEQ ID NO2中，已經(jīng)鑒定出信號肽在氨基酸殘基1-約24，跨膜結(jié)構(gòu)域在氨基酸殘基約514-約532，N-糖基化位點(diǎn)位于殘基約46-49、296-299、305-308、360-361、368-371和461-464，酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)在殘基約10-13、93-96、130-133、172-175、184-187、235-238、271-274、272-275、323-326、606-609和615-618，酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)約在殘基202-209，N-肉豆蔻酰(myristoylation)化位點(diǎn)位于殘基約43-48、102-107、295-300、321-326、330-335、367-342、393-398、525-530和527-532，酰胺化位點(diǎn)位于殘基約240-243，原核膜脂蛋白脂質(zhì)附著點(diǎn)在殘基約516-526，而生長因子和細(xì)胞因子受體家族識別標(biāo)志1在約殘基36-49。與(1)人紅細(xì)胞生成素在殘基約14-51和(2)鼠白介素-5受體在殘基211-219都存在顯著同源的區(qū)域。
圖5顯示hTCCR(SEQ ID NO1)與mTCCR(SEQ ID NO2)的比較。完全相同的氨基酸用陰影表示，為了進(jìn)行最佳序列比對而引入的缺口用破折號表示。預(yù)測的信號肽酶裂解位點(diǎn)用箭頭指出。潛在的N-糖基化位點(diǎn)用星號標(biāo)出。WSX基序，跨膜結(jié)構(gòu)域和1號基序盒用框表示。
圖6顯示人TCCR的Northern印跡，其指示成人組織和胎兒組織的表達(dá)特征。成人的hTCCR在胸腺中表達(dá)水平最高，在外周血白細(xì)胞(PBL′s)和脾中也有信號，在肺中僅微弱表達(dá)。胎兒組織的TCCR在肺和腎微弱表達(dá)。TCCR的表達(dá)特征表明它可能參與血細(xì)胞特別是胸腺細(xì)胞的發(fā)育和增殖。
圖7(A-B)檢驗(yàn)在TCCR-/-鼠中T-細(xì)胞的數(shù)量和表型。圖7A是取自TCCR-/-鼠的CD4+/CD8+T-細(xì)胞FACS分析圖譜，并與野生型進(jìn)行比較。圖7B是CD4+/CD8+/TcR+FACS分析圖譜。TCCR-/-鼠的T-細(xì)胞數(shù)量之間沒有任何顯著性差異，表明T-細(xì)胞增殖未受損害。
圖8(A-B)檢驗(yàn)TCCR在人T-細(xì)胞中的表達(dá)。圖8A是人T-細(xì)胞表面人TCCR和全T-細(xì)胞表面標(biāo)志CD2的FACS分析圖譜。圖8B是人B-細(xì)胞表面人TCCR和B-細(xì)胞標(biāo)志CD20的FACS分析圖譜。最左側(cè)的兩個(gè)圖代表與第二抗體偶聯(lián)的適合的熒光色素。圖8A和8B聯(lián)合起來表明TCCR存在于人T-細(xì)胞亞群而不存在于相當(dāng)數(shù)量的B-細(xì)胞上。
圖9(A-C)是使用同源重組技術(shù)的TCCR基因靶向方法學(xué)的示意圖。圖9A表示野生型等位基因，用實(shí)心塊指示TCCR外顯子，而用虛線表示內(nèi)含子?！錏″和″B″分別表示核酸內(nèi)切酶EcoRI和BamH I的裂解位點(diǎn)。圖9B代表靶向載體，其中TCCR的外顯子3-8已經(jīng)被來自質(zhì)粒載體pGK-neo的新霉素抗性基因替換。已將來自單純皰疹病毒的胸苷激酶基因插入到外顯子1的5′端，所述胸苷激酶基因提供對更昔洛韋(gancyclovir)所致選擇壓力的抗性。圖9C代表在內(nèi)源基因和靶向載體之間發(fā)生同源重組后最終被靶向或″基因敲除″的等位基因。
圖10(A-C)是Southern印跡、PCR反應(yīng)的凝膠電泳圖象和Northern印跡，分別證實(shí)用TCCR靶向載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。在圖10A中，基因組DNA取自對新霉素/更昔洛韋藥物篩選具有抗性的ES細(xì)胞，并與TCCR特異性的放射性標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。從左數(shù)第二泳道中，既存在10Kb片段也存在12Kb片段，表明TCCR等位基因之一已被切除。圖10B是取自TCCR-/-鼠尾的基因組DNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。將PCR引物設(shè)計(jì)為能將野生型TCCR等位基因與重組過程產(chǎn)生的靶向的(″基因敲除″)等位基因區(qū)分開來。第1和第2泳道(從左數(shù))是指示TCCR野生型的條帶圖案。第3泳道顯示TCCR-/-鼠的PCR條帶，第5和第6泳道表示TCCR雜合體鼠(+/-)。圖10C是已經(jīng)與TCCR特異性探針進(jìn)行過雜交的Northern印跡。第1泳道標(biāo)本取自TCCR-/-鼠，第2泳道取自野生型鼠。取自TCCR-/-鼠的泳道沒有任何信號，表明沒有產(chǎn)生TCCR的功能性全長度mRNA。
圖11(A-B)表明TCCR-/-鼠的變應(yīng)性呼吸道炎癥增強(qiáng)。圖11A顯示，通過測量浸潤肺的淋巴細(xì)胞數(shù)量而得知，被塵螨抗原(DMA)致敏的TCCR-/-鼠產(chǎn)生較大的Th2應(yīng)答。
圖12(A-B)是通過測定IFN-γ的產(chǎn)生而顯示的TCCR-/-鼠中Th1/Th2應(yīng)答的示意圖。圖12A中，自TCCR-/-鼠分離的T-細(xì)胞與引導(dǎo)沿Th 1通路分化的IL-12一起孵育。分析這些細(xì)胞中IFN-γ、IL-4和IL-5的產(chǎn)生情況。如圖12A中陰影棒所顯示的那樣，TCCR-/-鼠中IFN-γ的產(chǎn)生處于顯著低水平。這表明TCCR-/-鼠中Th1反應(yīng)被大大減弱。圖12B是有關(guān)與引導(dǎo)沿Th2通路分化的IL-4一起孵育后的T細(xì)胞情況的示意圖。該圖表明，在TCCR-/-鼠T-細(xì)胞和野生型對照細(xì)胞之間，細(xì)胞因子的產(chǎn)生沒有差異。
圖13是TCCR-/-鼠中產(chǎn)生的Ig水平的示意圖。檢測了Ig亞型IgG1、IgG2、IgG2b、IgG3、IgM和IgA的水平。如淺色陰影棒所示，TCCR-/-鼠較野生型對照鼠產(chǎn)生較少的IgG2a。其余的IgG水平無顯著差異。IgG2a由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，其在TCCR-/-鼠中的顯著缺乏證實(shí)前述其它試驗(yàn)中觀察到的Th1反應(yīng)的減低現(xiàn)象。
圖14是事先用卵白蛋白免疫過的TCCR-/-鼠中產(chǎn)生的IgG水平的示意圖。第1和第21天，給各小鼠腹腔注射100μg OVA，于第26天放血。檢測純合基因敲除鼠的IgG1和IgG2a水平并與野生型鼠進(jìn)行比較。如左側(cè)圖所示，IgG1水平在野生型和基因敲除鼠中是相等的，而TCCR-/-基因敲除鼠的IgG2a水平顯著低于野生型鼠，反映出TCCR-/-鼠中Th1反應(yīng)減弱。
圖15(A-B)是顯示鼠脾細(xì)胞中哪種細(xì)胞類型表達(dá)TCCR的示意圖。圖15A顯示CD4、CD8、CD19、NK1.1和F4/80細(xì)胞中的表達(dá)水平，CD4 T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中的表達(dá)水平最高。圖15B顯示Th0、Th1和Th2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，在Th0細(xì)胞中表達(dá)水平最高，而在Th1和Th2細(xì)胞中由于CD4細(xì)胞的分化而下調(diào)。通過即時(shí)PCR并按照rp119(一種核糖體管家基因)而標(biāo)準(zhǔn)化來檢測TCCR表達(dá)。Heid，C.A.等，1996，Genome Res.，6986-94。
圖16(A-D)是TCCR缺陷小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞受抗原誘導(dǎo)而產(chǎn)生細(xì)胞因子并增殖的示意圖。用完全弗氏佐劑(CFA)中的KLH對野生型和TCCR-缺陷小鼠進(jìn)行免疫。于9天后采集淋巴結(jié)并在所述KLH存在的條件下培養(yǎng)，分析淋巴結(jié)產(chǎn)生(圖16A)IFN、(圖16B)IL-4、(圖16C)IL-5的能力或者(圖16D)其增殖能力。數(shù)據(jù)用各組中5只動(dòng)物的均值+/-SD表示。用不成對t檢驗(yàn)分析兩個(gè)KLH濃度時(shí)WT和KO型鼠之間的IFN水平，P＜0.004。
圖17(A-C)是對IgG亞類濃度和對單核細(xì)胞增多性李斯特桿菌(L.Monocytogenes)感染敏感性的影響的示意圖。從野生型和TCCR-缺陷小鼠采集血清，用ELISA測定總IgG亞類濃度(圖17A)。OVA-特異性IgG1和IgG2a得自O(shè)VA/CFA致敏鼠。從用CFA中的OVA免疫過的野生型和TCCR-缺陷小鼠采集血清，用OVA-特異性ELISA測定IgG1(1∶320000稀釋)和IgG2a(1∶5000稀釋)水平(圖17B)。給5只TCCR-缺陷小鼠或野生型同窩鼠皮下感染3×104CFU單核細(xì)胞增多性李斯特桿菌。3天或9天后，取出肝臟并測定細(xì)菌滴度(圖17C)。數(shù)據(jù)用各組中的5只鼠的均值+/-SD表示。不成對T-檢驗(yàn)分析WT和KO在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異，P＜0.001。
圖18(A-D)是體外誘導(dǎo)Th細(xì)胞分化和增殖的示意圖。從野生型或TCCR-缺陷小鼠脾臟提純的CD4+T-細(xì)胞，在(圖18A)存在ConA和經(jīng)輻射的野生型APC或者(圖18B)用抗-CD3和抗-CD28作為刺激物的條件下，分化為Th1或Th2細(xì)胞。ELISA測定IFN和IL-4的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)用各組5只鼠總的均值+/-SD表示。ND為未檢測。圖18C表示取自野生型和TCCR-缺陷小鼠的脾細(xì)胞經(jīng)IL-12誘導(dǎo)的增殖情況。如圖所示，在遞增濃度的IL-12存在的條件下孵育被ConA活化的脾細(xì)胞24h。通過在孵育期間最后6h摻入[3H]-胸苷來測量細(xì)胞的增殖情況。圖18D表示未刺激鼠(白色棒)和ConA刺激鼠(黑色棒)脾細(xì)胞中IL-12RmRNA水平。用ConA刺激脾T-細(xì)胞72h，通過即時(shí)定量PCR(Taqman)技術(shù)測定IL-12R 1和IL-12R 2的mRNA水平。倍數(shù)增加是相對于野生型未被刺激的細(xì)胞中的RNA水平。
圖19顯示Taqman分析中使用的引物和探針SEQ ID NOS5-16的序列。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述I.定義術(shù)語″免疫相關(guān)疾病″是指哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)成分引起、介導(dǎo)的疾病，或者是免疫系統(tǒng)成分造成哺乳動(dòng)物發(fā)病率升高的疾病。也包括刺激或干預(yù)免疫應(yīng)答能夠?qū)膊∵M(jìn)展帶來改善效果的那些疾病。涵蓋在此術(shù)語中的疾病有免疫-介導(dǎo)的炎癥性疾病，非-免疫-介導(dǎo)的炎癥性疾病，傳染性疾病，免疫缺陷性疾病，瘤形成等。
術(shù)語″Th1介導(dǎo)的病癥″，是指以過度產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子為特征的疾病，包括那些由于過度產(chǎn)生或T-細(xì)胞偏置分化為Th1亞型而引起的疾病。此類疾病包括例如，自身免疫炎癥性疾病(如過敏性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化、胰島素依賴型糖尿病、自身免疫性眼色素層視網(wǎng)膜炎、甲狀腺毒癥、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕病、炎性腸道疾病(例如，克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、局限性腸炎、遠(yuǎn)端回腸炎、肉芽腫性腸炎、節(jié)段性回腸炎、末端回腸炎)、自身免疫甲狀腺、惡性貧血)和同種異體移植排斥。
術(shù)語″Th2介導(dǎo)的病癥″，是指以過度產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子為特征的疾病，包括那些由于過度產(chǎn)生或T-細(xì)胞偏置分化為Th2亞型而引起的疾病。此類疾病包括，例如，感染加劇的傳染性疾病(例如，碩大利什曼原蟲，麻風(fēng)分枝桿菌，白色念珠菌，鼠弓漿蟲，呼吸道合胞病毒，人類免疫缺陷病毒等引起的)和過敏性病癥，如過敏性高敏癥，哮喘，過敏性鼻炎，特應(yīng)性皮炎，春季結(jié)膜炎，濕疹，蕁麻疹和食物變態(tài)反應(yīng)等。
其它免疫疾病、免疫-相關(guān)疾病和炎癥性疾病的實(shí)例，其中一些是由T-細(xì)胞分化成Th1和Th2亞型的效果(例如，細(xì)胞因子釋放特征)所介導(dǎo)的和根據(jù)本發(fā)明可以治療的疾病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，幼年慢性關(guān)節(jié)炎，脊椎關(guān)節(jié)病(spondyloarthropathies)，系統(tǒng)性硬化(硬皮病)，特發(fā)性炎癥性肌病(皮膚肌炎，多肌炎)，Sjgren′s綜合征，系統(tǒng)性結(jié)節(jié)性脈管炎，肉樣瘤病，自身免疫性溶血性貧血(免疫性全細(xì)胞減少，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥)，自身免疫血小板減少癥(特發(fā)性血小板減少性子癜，免疫-介導(dǎo)的血小板減少癥)，甲狀腺炎(格雷夫斯病(Grave′s disease)，橋本甲狀腺炎，幼年淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，萎縮性甲狀腺炎)，自身免疫炎癥性疾病(例如，過敏性腦脊髓炎，多發(fā)性硬化，胰島素依賴型糖尿病，自身免疫性眼色素層視網(wǎng)膜炎，甲狀腺毒癥，硬皮病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎性腸道疾病(例如，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，局限性腸炎，遠(yuǎn)端回腸炎，肉芽腫性腸炎，節(jié)段性回腸炎，末端回腸炎)，自身免疫性甲狀腺疾病，惡性貧血)，和同種異體移植排斥，糖尿病，免疫-介導(dǎo)的腎臟疾病(腎小球性腎炎，小管間質(zhì)性腎炎)，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病(如多發(fā)性硬化、特發(fā)性脫髓鞘多神經(jīng)病或格林-巴利綜合征和慢性炎癥性脫髓鞘多神經(jīng)病)，肝膽管疾病如傳染性肝炎(甲、乙、丙、丁、戊型肝炎和其它非-嗜肝型病毒性肝炎)、自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎和致硬化性膽管炎，炎性腸道疾病(潰瘍性結(jié)腸炎，克羅恩氏病)，谷蛋白-敏感性腸病，和惠普爾病，自身免疫或免疫-介導(dǎo)的皮膚疾病包括大泡性皮膚病，多形紅斑和接觸性皮炎，牛皮癬，過敏性疾病如哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、食物高敏癥和蕁麻疹，肺的免疫學(xué)性疾病如嗜酸細(xì)胞性肺炎、特發(fā)性肺纖維癥和過敏性肺炎，移植術(shù)有關(guān)的疾病包括移植排斥和移植物抗宿主病。傳染性疾病包括病毒性疾病如AIDS(HIV感染)，甲、乙、丙、丁和戊型肝炎，皰疹等，細(xì)菌感柒，真菌感染，原蟲感染，寄生蟲感染，和呼吸道合胞病毒體感染，人類免疫缺陷病毒感染等)，以及過敏性病癥如過敏性高敏癥、哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、春季結(jié)膜炎、濕疹、蕁麻疹和食物變態(tài)反應(yīng)等″治療″是旨在阻止病癥發(fā)展或改變其病理學(xué)狀況而進(jìn)行的干預(yù)。因此，″治療″既包括治療性治療也包括預(yù)防性措施，其目的在于防止、減緩(減輕)或改善所針對的病理狀況或病癥。需要治療的病癥包括已經(jīng)患上的病癥和將被預(yù)防的病癥。在免疫相關(guān)疾病(例如，Th1-介導(dǎo)的和Th2-介導(dǎo)的病癥)治療中，治療劑可以直接降低或增加病癥中病理成分的反應(yīng)幅度，或者使得疾病對于其它治療劑(如抗生素、抗真菌劑、抗-炎劑、化療劑等)的治療更為敏感，。
術(shù)語″有效量″是指TCCR多肽、其激動(dòng)劑和/或拮抗劑能夠引發(fā)、誘導(dǎo)或?qū)е耇-細(xì)胞可檢測水平的偏置分化為Th1亞型或Th2亞型和/或這些T-細(xì)胞亞型分泌的細(xì)胞因子釋放特征的最小濃度。而″治療有效量″，則是指TCCR多肽、其激動(dòng)劑和/或拮抗劑對治療Th1-介導(dǎo)的或Th2-介導(dǎo)的病癥有效的最小濃度。
″慢性″給藥，指與快速給藥模式相反，將試劑以連續(xù)給藥模式施用，以便在長時(shí)間內(nèi)保持初始治療效果(活性)。″間斷″給藥是指治療不是沒有間歇地連續(xù)進(jìn)行，而是以周期性為特征。
免疫相關(guān)疾病的″病理學(xué)″包括有關(guān)患者健康的所有現(xiàn)象。其包括但不限于異常或無法控制的細(xì)胞生長、抗體產(chǎn)生，自身抗體產(chǎn)生，補(bǔ)體產(chǎn)生和激活，干擾鄰近細(xì)胞正常功能，細(xì)胞因子或其它分泌產(chǎn)物的異常水平釋放，抑制或加劇任何炎癥或免疫反應(yīng)，炎性細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞)向組織間隙浸潤等。
意欲治療的″哺乳動(dòng)物″，是指歸為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人、家畜和農(nóng)場動(dòng)物，以及動(dòng)物園里的動(dòng)物、參與運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的動(dòng)物或?qū)櫸锶绻?、馬、貓、牛等。優(yōu)選所述哺乳動(dòng)物為人類。
與一個(gè)或多個(gè)其它治療劑″聯(lián)合″給藥，包括同時(shí)給藥和以任何順序的聯(lián)貫給藥。
本文所用″載體″，包括在所用劑量和濃度下對細(xì)胞或哺乳動(dòng)物無毒性的可藥用載體、賦形劑、穩(wěn)定劑?？伤幱幂d體常常是含水pH緩沖液?？伤幱幂d體的實(shí)例包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷酰胺、天門冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTMTM。
本文所用術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”，是指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意在包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)，化療劑，毒素如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶活性毒素或其片段。
本文所用″生長抑制劑″，是指抑制細(xì)胞生長的化合物或組合物，特別是抑制癌細(xì)胞過度表達(dá)本文鑒定的任一種基因，無論是在體內(nèi)還是在體外。因此，細(xì)胞因子抑制劑是顯著降低過度表達(dá)此基因的S期細(xì)胞百分比的化合物或組合物。生長抑制劑的實(shí)例包括阻斷a細(xì)胞周期進(jìn)程的試劑(在S期之外的環(huán)節(jié))，譬如，誘導(dǎo)G1期和M-期停滯的試劑。傳統(tǒng)的M-期阻斷劑包括長春花堿(長春新堿和長春堿)、紫杉酚和拓?fù)涿窱I抑制劑如阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、依托泊苷和博萊霉素。那些使G1期停滯的試劑也使S-期停滯，例如，DNA烷化劑如他莫昔芬、潑尼松、達(dá)卡巴嗪、氮芥、順鉑、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞嘧啶-C。進(jìn)一步的信息可在下列文獻(xiàn)中找到TheMolecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel，eds.，Chapter 1，entitled″Cellcycle regulation，oncogens，和antineoplastic drugs″by Murakami等(WBSaundersPhiladelphia，1995)，特別是第13頁。
術(shù)語″細(xì)胞因子″是一般性術(shù)語，指由一個(gè)細(xì)胞群釋放的對另一個(gè)細(xì)胞群起細(xì)胞間培養(yǎng)基作用的蛋白。這些細(xì)胞因子的實(shí)例是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽類激素。細(xì)胞因子包括生長激素，如人生長激素，N-甲二磺酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；肝細(xì)胞生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；繆氏抑制物質(zhì)(mullerian-inhibitingsubstance)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子如NGF-β；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factors)；干擾素如干擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)；粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白細(xì)胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術(shù)語細(xì)胞因子包括天然蛋白或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白以及天然序列細(xì)胞因子的生物活性等效物。
本文使用的術(shù)語″TCCR多肽″、″TCCR蛋白″和″TCCR″，包括天然序列的TCCR和TCCR多肽變體(本文將對變體作進(jìn)一步定義)。TCCR多肽可從各種來源如人組織或其它來源中分離出來，或者使用重組和/或合成方法制得。
″天然序列TCCR″，包括具有與得自自然環(huán)境的TCCR多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此天然序列TCCR可以是從自然界分離得到的，或者是用重組和/或合成制得的。術(shù)語″天然序列TCCR″特別包括TCCR的天然-存在的截短型或分泌型(例如，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列)，天然-存在的變體型(例如，或者剪切型)和天然-存在的等位基因變體。在本發(fā)明一實(shí)施方案中，天然序列人TCCR是包括圖3(SEQ ID NO1)中1-636氨基酸的成熟或全長天然序列TCCR。類似地，天然序列小鼠TCCR是包括圖4(SEQ ID NO2)中1-623氨基酸的成熟或全長天然序列TCCR。并且，盡管圖3(SEQ ID NO1)和4(SEQ ID NO2)公開的TCCR多肽顯示由本文定義為位置1的蛋氨酸殘基開始，但是圖3(SEQ ID NO1)和4(SEQ ID NO2)中氨基酸1位上游或下游的另一蛋氨酸殘基作為TCCR多肽的起始氨基酸殘基是可以想象到并且是可能的。
″TCCR多肽細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域″或稱為″TCCR ECD″，是指TCCR多肽基本上不含跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的一種形式。通常，TCCR多肽ECD具有小于約1％的此類跨膜和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選具有小于約0.5％的此類結(jié)構(gòu)域。應(yīng)當(dāng)懂得，所確定的本發(fā)明TCCR多肽的任何跨膜結(jié)構(gòu)域(一個(gè)或多個(gè))是依據(jù)本領(lǐng)域在鑒定疏水結(jié)構(gòu)域類型中常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)而確定的?？缒そY(jié)構(gòu)域的精確的邊界會(huì)有不同但在最初確定的結(jié)構(gòu)域的兩末端之一最多不超過約5個(gè)氨基酸。因此，在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，人TCCR多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括氨基酸1或約33至X1；其中X1是圖3(SEQ ID NO1)中從殘基512到殘基522的任何氨基酸殘基。類似地，鼠TCCR多肽的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括氨基酸1或約25至X2；其中X2是圖4(SEQ ID NO2)中從殘基509到殘基519的任何氨基酸殘基。
″TCCR變體多肽″，指如下定義的與下列氨基酸殘基序列具有至少約80％氨基酸序列同源性的活性TCCR多肽(a1)圖3(SEQ ID NO1)所示人TCCR多肽的1或約33至636殘基；(a2)圖4(SEQ ID NO2)所示鼠TCCR多肽的1或約25至623殘基；(b1)圖3(SEQ ID NO1)所示人TCCR多肽的X3至636殘基，其中X3是圖3(SEQ ID NO1)中27至37的任何氨基酸殘基；(b2)圖4(SEQ ID NO2)所示鼠TCCR多肽的X4至623殘基，其中X4是圖4(SEQ ID NO2)中207至30的任何氨基酸殘基；(c1)1或約33至X1殘基，其中X1是圖3(SEQ ID NO1)中512至522的任何氨基酸殘基；(c2)1或約25至X2殘基，其中X2是圖4(SEQ ID NO2)中509至519的任何氨基酸殘基；(d1)X5至636殘基，其中X5是圖3(SEQ ID NO1)中533至543的任何氨基酸殘基；(d2)X6至623殘基，其中X6是圖4(SEQ ID NO2)中527至537的任何氨基酸殘基；(e)衍生自圖3(SEQ ID NO1)和圖4(SEQ IDNO2)所示氨基酸序列的另一特定片段。
此類TCCR變體多肽包括，例如，在衍生自圖3(SEQ ID NO1)和圖4(SEQ ID NO2)所示序列的N-和/或C-末端以及在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)結(jié)構(gòu)域內(nèi)增加或刪減一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的TCCR多肽。通常，TCCR變體多肽與下列氨基酸殘基序列(a1)圖3(SEQ ID NO1)所示人TCCR多肽的1或約33至636殘基；(a2)圖4(SEQ ID NO2)所示鼠TCCR多肽的1或約25至623殘基；(b1)圖3(SEQ ID NO1)所示人TCCR多肽的X3至636殘基，其中X3是圖3(SEQ ID NO1)中27至37的任何氨基酸殘基；(b2)圖4(SEQ IDNO2)所示鼠TCCR多肽的X4至623殘基，其中X4是圖4(SEQ ID NO2)中207至30的任何氨基酸殘基；(c1)1或約33至X1殘基，其中X1是圖3(SEQID NO1)中512至522的任何氨基酸殘基；(c2)1或約25至X2殘基，其中X2是圖4(SEQ ID NO2)中509至519的任何氨基酸殘基；(d1)X5至636殘基，其中X5是圖3(SEQ ID NO1)中533至543的任何氨基酸殘基；(d2)X6至623殘基，其中X6是圖4(SEQ ID NO2)中527至537的任何氨基酸殘基；(e)衍生自圖3(SEQ ID NO1)和圖4(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的另一特定片段，具有至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％氨基酸序列同源性。
TCCR變體多肽的長度是至少約10個(gè)氨基酸，或更經(jīng)常是至少約20個(gè)氨基酸、或者至少約30個(gè)氨基酸、或至少約40個(gè)氨基酸、或至少約50個(gè)氨基酸、或至少約60個(gè)氨基酸、或者至少約70個(gè)氨基酸、或至少約80個(gè)氨基酸、或至少約90個(gè)氨基酸、或至少約100個(gè)氨基酸、或者至少約150個(gè)氨基酸、或至少約200個(gè)氨基酸、或至少約250、或至少約300個(gè)氨基酸、或者至少約400個(gè)氨基酸、或至少約500個(gè)氨基酸、或至少約600個(gè)氨基酸或更多個(gè)氨基酸。
本文所說多肽序列″氨基酸序列同源性百分比(％)″，是指候選序列氨基酸殘基與TCCR序列氨基酸殘基相同的百分?jǐn)?shù)，所述百分?jǐn)?shù)是如下取得的校準(zhǔn)序列，如果必要，則插入間歇，以獲取最大百分比的序列同源性，而不考慮序列同源性的任何保守取代。可使用本領(lǐng)域各種方法完成校準(zhǔn)目的的氨基酸序列同源性百分比的測定，例如，使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以決定測量校準(zhǔn)的適宜參數(shù)，包括達(dá)到比較序列全長最大校準(zhǔn)所需的任何算法。然而，為此目的，氨基酸序列同源性％值是使用下述序列對比計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2而獲得的，其中ALIGN-2程序的全部源序列碼見表3(A-Q)。ALIGN-2序列對比計(jì)算機(jī)程序的作者是Genentech，Inc.，表3(A-Q)所示序列碼和用戶資料一起已經(jīng)提交地處Washington D.C.，20559的美國版權(quán)局，其美國版權(quán)注冊登記號為TXU510087。公眾通過Genentech，Inc.，South San Francisco，California可以得到ALIGN-2程序，或者從表(A-Q)提供的序列碼進(jìn)行編制。ALIGN2程序應(yīng)當(dāng)為在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選在數(shù)碼UNIX V4.0D使用而進(jìn)行編制。ALIGN-2程序設(shè)定了所有序列對比參數(shù)并且不變。
為了本發(fā)明目的，給定氨基酸序列A相對于給定氨基酸序列B的氨基酸序列同源性％(或者這樣說給定氨基酸序列A具有或含有給定氨基酸序列B相同氨基酸序列的％)如下計(jì)算X/Y比值乘以100
其中X是用序列校準(zhǔn)程序ALIGN-2比較A和B氨基酸殘基后計(jì)算出的相同氨基酸數(shù)量，其中Y是氨基酸殘基B的總數(shù)量。可以理解，當(dāng)氨基酸序列A與氨基酸序列B的長度不相等時(shí)，A與B氨基酸序列同源性％將不等于B與A氨基酸序列同源性％。作為計(jì)算氨基酸序列同源性％的一個(gè)實(shí)例，表2(A-B)說明如何計(jì)算指定氨基酸序列″對照蛋白質(zhì)″與指定氨基酸序列″PRO″的氨基酸序列同源性％。
除非另外特別聲明，否則本文所用所有氨基酸序列同源性％值是按照上述使用ALIGN-2序列對比計(jì)算機(jī)程序獲得的。然而，氨基酸序列同源性％也可使用序列對比程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic acids Res.253389-3402(1997))進(jìn)行測定。NCBI-BLAST2序列對比程序可從http//www.ncbi.nlm.nih.Gov下載，或否則從National Institute of Health，Bethesda，MD得到。NCBI-BLAST2使用數(shù)種檢索參數(shù)，其中所有這些參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值，包括例如，非掩蔽＝y(tǒng)es，股(strand)＝全部(all)，預(yù)期出現(xiàn)＝10，最低復(fù)雜長度＝15/5，多-程e-值＝0.01，多-程常數(shù)＝25，最終缺口校準(zhǔn)的離開＝25，和評分矩陣＝BLOSUM62。
當(dāng)使用NCBI-BLAST2進(jìn)行氨基酸序列比較時(shí)，給定氨基酸序列A與給定氨基酸序列B的氨基酸序列同源性％(或者說，給定氨基酸序列A具有或含有給定氨基酸序列B相同氨基酸序列的％)如下計(jì)算X/Y比值乘以100其中X是用序列校準(zhǔn)程序NCBI-BLAST2比較A和B氨基酸殘基后計(jì)算出的相同氨基酸數(shù)量，其中Y是氨基酸殘基B的總數(shù)量?？梢岳斫?，當(dāng)氨基酸序列A與氨基酸序列B的長度不相等時(shí)，A與B氨基酸序列同源性％將不等于B與A氨基酸序列同源性％。
本發(fā)明中術(shù)語“多肽”也包括前述氨基酸序列同源性比較中的多肽，不僅包括序列比較中相同的氨基酸殘基，也包括具有相似特性的氨基酸殘基。這些多肽被稱為″陽性″。對一個(gè)感興趣氨基酸殘基評分得一個(gè)陽性分值的氨基酸殘基，是那些與感興趣氨基酸殘基相同的氨基酸殘基或者是感興趣氨基酸的優(yōu)選取代基(見下表I中定義)。為了本發(fā)明目的，給定氨基酸序列A相對于給定氨基酸序列B的氨基酸序列陽性值％(或者這樣說給定氨基酸序列A具有或含有給定氨基酸序列B相同氨基酸序列的陽性％)如下計(jì)算X/Y比值乘以100
其中X是用上述序列校準(zhǔn)程序ALIGN-2比較A和B氨基酸殘基后計(jì)得出的評分陽性氨基酸數(shù)量，和其中Y是氨基酸殘基B的總數(shù)量?？梢岳斫猓?dāng)氨基酸序列A與氨基酸序列B的長度不相等時(shí)，A與B氨基酸序列陽性％將不等于B與A氨基酸序列陽性％。
“TCCR變體多肽”或“TCCR變體核酸序列”，是指編碼下述定義的活性TCCR多肽并且與編碼下列氨基酸殘基序列的核酸序列具有至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、或至少約99％核酸序列同源性的核酸分子(a1)圖3(SEQ ID NO1)所示人TCCR多肽的1或約33至636殘基；(a2)圖4(SEQ ID NO2)所示鼠TCCR多肽的1或約25至623殘基；(b1)圖3(SEQ IDNO1)所示人TCCR多肽的X3至636殘基，其中X3是圖3(SEQ ID NO1)中27至37的任何氨基酸殘基；(b2)圖4(SEQ ID NO2)所示鼠TCCR多肽的X4至623殘基，其中X4是圖4(SEQ ID NO2)中207至30的任何氨基酸殘基；(c1)1或約33至X1殘基，其中X1是圖3(SEQ ID NO1)中512至522的任何氨基酸殘基；(c2)1或約25至X2殘基，其中X2是圖4(SEQ ID NO2)中509至519的任何氨基酸殘基；(d1)X5至636殘基，其中X5是圖3(SEQID NO1)中533至543的任何氨基酸殘基；(d2)X6至623殘基，其中X6是圖4(SEQ ID NO2)中527至537的任何氨基酸殘基；(e)衍生自圖3(SEQ IDNO1)和圖4(SEQ ID NO2)所示氨基酸序列的另一特定片段。
一般地，TCCR變體多核苷酸的長度是至少約30個(gè)核苷酸，更經(jīng)常是至少約60個(gè)核苷酸，或至少約90個(gè)核苷酸，或至少約120個(gè)核苷酸，或者至少約150個(gè)核苷酸，或至少約180個(gè)核苷酸，或至少約210個(gè)核苷酸，或至少約240個(gè)核苷酸，或者至少約270個(gè)核苷酸，或至少約300個(gè)核苷酸，或至少約450個(gè)核苷酸，或至少600個(gè)核苷酸，或至少900或更多個(gè)核苷酸。
本文所述有關(guān)TCCR多肽-編碼核酸序列的″核酸序列同源性百分比(％)″，是指候選序列與發(fā)明的感興趣多肽-編碼核酸序列相比，具有相同核苷酸的百分?jǐn)?shù)，所述百分?jǐn)?shù)是如下得出的通過校準(zhǔn)序列，和如果必要?jiǎng)t引入間歇，以達(dá)到最大序列同源性百分比?？墒褂帽绢I(lǐng)域各種方法完成校準(zhǔn)目的的核苷酸序列同源性百分比的測定，例如，使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以決定測量校準(zhǔn)的適宜參數(shù)，包括達(dá)到比較序列全長最大校準(zhǔn)所需的任何算法。然而，為此目的，核苷酸序列同源性％值是使用下述序列對比計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2而獲得的，其中ALIGN-2程序的全部源序列碼見表3(A-Q)。ALIGN-2序列對比計(jì)算機(jī)程序的作者是Genentech，Inc.，表3(A-Q)所示序列碼和用戶資料一起已經(jīng)提交地處Washington D.C.，20559的美國版權(quán)局，其美國版權(quán)注冊登記號為TXU510087。公眾通過Genentech，Inc.，South San Francisco，California可以得到ALIGN-2程序，或者從表1提供的序列碼進(jìn)行編制。ALIGN2程序應(yīng)當(dāng)為在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選在數(shù)碼UNIX V4.0D使用而進(jìn)行編制。ALIGN-2程序設(shè)定了所有序列對比參數(shù)并且不變。
為了本發(fā)明目的，給定核苷酸序列C相對于給定氨基酸序列D的核苷酸序列同源性％(或者這樣說給定核苷酸序列C具有或含有給定核苷酸序列D相同核苷酸序列的％)如下計(jì)算W/Z比值乘以100其中W是用序列校準(zhǔn)程序ALIGN-2比較C和D后計(jì)算出的相同核苷酸的數(shù)量，其中Z是氨基酸殘基D的總數(shù)量?？梢岳斫?，當(dāng)核苷酸序列C與核苷酸序列D的長度不相等時(shí)，C與D核苷酸序列同源性％將不等于D與C核苷酸序列同源性％。作為計(jì)算核苷酸序列同源性％的一個(gè)實(shí)例，表2(C-D)說明如何計(jì)算″對照DNA″與指定核苷酸序列″PRO-DNA″的核苷酸序列同源性％。
除非另外特別聲明，否則本文所用所有核苷酸序列同源性％值是按照上述使用ALIGN-2序列對比計(jì)算機(jī)程序獲得的。然而，核苷酸序列同源性％也可使用序列對比程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))進(jìn)行測定。NCBI-BLAST2序列對比程序可從http//www.ncbi.nlm.nih.Gov下載，或否則從National Institute of Health，Bethesda，MD得到。NCBI-BLAST2使用數(shù)種檢索參數(shù)，其中所有這些參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值，包括例如，非掩蔽＝y(tǒng)es，股(strand)＝全部(all)，預(yù)期出現(xiàn)＝10，最低復(fù)雜長度＝15/5，多-程e-值＝0.01，多-程常數(shù)＝25，最終缺口校準(zhǔn)的離開＝25，和評分矩陣＝BLOSUM62。
當(dāng)使用NCBI-BLAST2進(jìn)行序列比較時(shí)，給定核苷酸序列C與給定核苷酸序列D的核苷酸序列同源性％(或者說，給定核苷酸序列C具有或含有給定核苷酸序列D相同核苷酸序列的％)如下計(jì)算W/Z比值乘以100其中W是用序列校準(zhǔn)程序NCBI-BLAST2比較C和D后計(jì)算出的相同核苷酸數(shù)量，其中Z是核苷酸D的總數(shù)量?？梢岳斫猓?dāng)核苷酸序列C與核苷酸序列D的長度不相等時(shí)，C與D核苷酸序列同源性％將不等于D與C核苷酸序列同源性％。
在另一實(shí)施方案中，TCCR變體多核苷酸是編碼本發(fā)明活性多肽的核酸分子，它能夠與編碼全長本發(fā)明多肽的核苷酸序列雜交，優(yōu)選在嚴(yán)格雜交和洗滌條件下雜交。本發(fā)明變體多肽包括由本發(fā)明變體多核苷酸編碼的多肽。
在上述進(jìn)行氨基酸序列同源性比較時(shí)使用的術(shù)語″陽性″，不僅包括序列比較中相同的氨基酸殘基，也包括具有相似特性的氨基酸殘基。對一個(gè)感興趣氨基酸殘基評分得一個(gè)陽性分值的氨基酸殘基，是那些與感興趣氨基酸殘基相同的氨基酸殘基或者是感興趣氨基酸的優(yōu)選取代基(見下表I中定義)。
為了本發(fā)明目的，給定氨基酸序列A相對于給定氨基酸序列B的氨基酸序列陽性值％(或者這樣說給定氨基酸序列A具有或含有給定氨基酸序列B相同氨基酸序列的陽性％)如下計(jì)算X/Y比值乘以100其中X是用上述序列校準(zhǔn)程序ALIGN-2比較A和B氨基酸殘基后計(jì)得出的評分陽性氨基酸數(shù)量，其中Y是氨基酸殘基B的總數(shù)量。可以理解，當(dāng)氨基酸序列A與氨基酸序列B的長度不相等時(shí)，A與B氨基酸序列陽性％將不等于B與A氨基酸序列陽性％。
當(dāng)用″分離的″來描述本文的各種多肽時(shí)，是指已從天然環(huán)境肽組分鑒定和分離和/或回收的多肽。優(yōu)選地，分離的多肽與天然締合的所有組分沒有任何締合。肽的天然環(huán)境中的污染成分是那些將干擾使用多肽進(jìn)行診斷和治療的物質(zhì)，可包括酶、激素和其它蛋白性或非-蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽被純化為(1)使用轉(zhuǎn)杯式蛋白測序儀，達(dá)到足以獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列至少15個(gè)殘基的程度，或者(2)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色，達(dá)到在非-還原或還原條件下SDS-PAGE電泳同質(zhì)性的程度。分離的多肽包括在重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽，因?yàn)門CCR自然環(huán)境中的至少一個(gè)組分是不存在的。然而，通常用至少一個(gè)純化步驟來制備分離的多肽。
編碼TCCR多肽的″分離的″核酸分子，是被鑒定的和從至少一個(gè)污染核酸分子中分離出來的核酸分子，天然來源的TCCR編碼核酸通常與所述污染核酸分子締合。優(yōu)選地，分離的核酸與天然締合的所有組分沒有任何締合。一分離的TCCR-編碼核酸分子不是在自然界中發(fā)現(xiàn)的形式或按其設(shè)定的形式。因而，分離的核酸分子區(qū)別于TCCR-編碼核酸分子，因?yàn)楹笳叽嬖谟谔烊患?xì)胞中。但是，分離的編碼TCCR多肽的核酸分子，包括通常表達(dá)TCCR的細(xì)胞中所含的TCCR-編碼核酸分子，例如，所述核酸分子與天然細(xì)胞所在的染色體位置不同。
術(shù)語″控制序列″，是指在特定宿主生物中表達(dá)可操作的連環(huán)編碼序列所必要的DNA序列。適宜于原核生物的控制序列是例如包括啟動(dòng)子，任選地操縱基因序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞是使用例如啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。
當(dāng)置入核酸使與另一核酸序列功能性關(guān)聯(lián)時(shí)，核酸是″可操作地連接″。例如，如果一個(gè)肽是作為參與多肽分泌的前蛋白而被表達(dá)的話，則把DNA前序列(presequence)或分泌性前導(dǎo)序列可操作性地連接于這個(gè)多肽的DNA；如果一編碼序列影響序列的轉(zhuǎn)錄，則把啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地連于該編碼序列；或者如果一編碼序列所處位置是為了促進(jìn)翻譯，則把核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連于該編碼序列。通常，″可操作地連接″是指連接的DNA序列是鄰接的，和在分泌前導(dǎo)的情況下，是鄰接的并且在閱讀相。然而，增強(qiáng)子并非必須是鄰接的。通過在適宜限制性酶切位點(diǎn)的連接反應(yīng)完成連接。如果不存在這樣的酶切位點(diǎn)，則根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接子或連接子。
本文所用術(shù)語″抗體″是指最廣義上的抗體，并特別包括例如單鏈抗-TCCR單克隆抗體(包括拮抗劑和中和抗體)、具有多表位特異性的抗-TCCR抗體組合物、單鏈抗-TCCR抗體和抗-TCCR抗體片段(見下述)。本文中術(shù)語″單克隆抗體″，是指來自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個(gè)抗體均相同。
雜交反應(yīng)的″嚴(yán)格″由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地確定，通常根據(jù)經(jīng)驗(yàn)在考慮探針長度、洗滌溫度和鹽濃度的基礎(chǔ)上計(jì)算得出。一般而言，長的探針需要較高的溫度以便適當(dāng)?shù)耐嘶?，而短的探針需要較低溫度。在低于融合溫度的環(huán)境中存在互補(bǔ)鏈時(shí)，雜交通常取決于變性DNA的重退火能力。期望探針和雜交序列之間同源程度越高，可使用的相對溫度越高。結(jié)果是，相對溫度較高將使反應(yīng)條件趨于更加嚴(yán)格，而較低溫度則相對較差。有關(guān)雜交反應(yīng)的嚴(yán)格的其它細(xì)節(jié)和解釋，見Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
本文的″嚴(yán)格條件″或″高度嚴(yán)格條件″，可以定義為(1)使用低離子強(qiáng)度和高洗滌溫度，例如，50℃ 0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交過程中使用變性劑如甲酰胺，譬如，42℃ 50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll /0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH 6.5 50mM磷酸鈉與750mM氯化鈉緩沖液，75mM檸檬酸鈉；或者(3)使用42℃ 50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×Denhardt′s溶液、超聲處理的鮭魚精子DNA(50g/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯，于42℃在0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中和在55℃ 50％甲酰胺中洗滌，接著于55℃用0.1×含EDTA SSC高度嚴(yán)格洗滌。
″中等嚴(yán)格條件″，可以按照Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，New YorkCold Spring Harbor Press，1989的描述來確定，包括使用前述洗滌溶液和較低嚴(yán)格雜交條件(例如，溫度，離子強(qiáng)度和SDS％)1。中等嚴(yán)格條件的一個(gè)實(shí)例是，于37℃在如下組成的溶液中過夜孵育20％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20mg/ml變性剪切鮭魚精子DNA，接著于37-50℃在1×SSC中洗滌濾膜。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員懂得如何必要地調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等條件以適應(yīng)諸如探針長度等因素。
本文使用的術(shù)語″表位標(biāo)記″，是指含有與″標(biāo)記多肽″融合了的TCCR多肽的嵌合多肽。該標(biāo)記多肽具有足夠多的殘基以為所制備抗體提供所針對的表位，而且要足夠短以便它不干預(yù)與其融合的多肽的活性。標(biāo)記多肽也優(yōu)選確實(shí)是獨(dú)一無二的，這樣抗體與其它表位基本上不發(fā)生交叉反應(yīng)。通常，適宜的多肽至少有6個(gè)氨基酸殘基，一般為約8～50個(gè)氨基酸殘基(優(yōu)選約10～20個(gè)氨基酸殘基)。
本文中″活性″是指保留天然或天然-存在TCCR多肽的生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性形式的蛋白質(zhì)，其中″生物學(xué)″活性指天然或天然-存在TCCR引起的生物學(xué)功能(抑制或興奮)，而不是指誘導(dǎo)產(chǎn)生針對天然或天然-存在的本發(fā)明多肽所擁有表位的抗體的能力；類似地，″免疫學(xué)″活性則是指作為抗原在誘導(dǎo)產(chǎn)生針對天然或天然-存在的本發(fā)明多肽所擁有表位的抗體方面的能力。
本文中抗體或通過本文公開的篩選實(shí)驗(yàn)可以鑒定的其它分子(例如有機(jī)或無機(jī)小分子，肽等)的“生物活性”，是指這些分子誘導(dǎo)或抑制炎性細(xì)胞浸潤進(jìn)入組織的能力，刺激或抑制T-細(xì)胞增殖或活化的能力，以及刺激或抑制細(xì)胞釋放細(xì)胞因子。另一優(yōu)選的活性是增加增加或抑制血管通透性。最優(yōu)選的活性是調(diào)節(jié)Th1/Th2反應(yīng)(例如，降低Th1和/或升高Th2反應(yīng)，降低Th2和/或升高Th1反應(yīng))。
術(shù)語″調(diào)節(jié)″，是指上調(diào)、下調(diào)或改變T-細(xì)胞分化成Th1和Th2亞群所引起的生理效應(yīng)(例如，細(xì)胞因子釋放特征)。細(xì)胞過程包括在此術(shù)語范圍之內(nèi)，包括但不限于特定基因的轉(zhuǎn)錄；正常細(xì)胞功能，如代謝、增殖、分化、粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和存活，以及異常細(xì)胞過程如轉(zhuǎn)化、阻斷分化和轉(zhuǎn)移。
本文中術(shù)語″拮抗劑″，使用其最廣義含義，包括部分或完全阻斷、抑制或中和本發(fā)明公開的天然序列TCCR多肽生物活性的任何分子。類似地，術(shù)語″激動(dòng)劑″也使用其廣義含義，包括模擬本文所述天然TCCR多肽生物活性的任何分子(例如，Th1/Th2細(xì)胞功能的下調(diào))。以類似方式，術(shù)語″激動(dòng)劑″也使用其最廣義含義，包括摹擬、增強(qiáng)或刺激發(fā)明公開的天然序列TCCR多肽生物活性的任何分子。適宜的激動(dòng)劑或拮抗劑分子特別包括激動(dòng)型或拮抗型抗體或抗體片段、本發(fā)明天然TCCR多肽的片段或氨基酸序列變體、肽、小的有機(jī)分子等。鑒定TCCR多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑的方法可包括使TCCR多肽與候選激動(dòng)劑或拮抗劑分子接觸，并測定在正常情況下與TCCR多肽有關(guān)的一個(gè)或多個(gè)生物活性的可測得變化(例如，Th1/Th2細(xì)胞功能或效應(yīng)的上調(diào)/下調(diào))。
本文中″小分子″定義為分子量低于約500道爾頓的分子，并且通常是有機(jī)化合物。
″抗體″(Abs)和″免疫球蛋白″(Ig)是具有相同一般結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w顯示出對特定抗原的結(jié)合特異性，而免疫球蛋白既包括抗體也包括其它缺乏抗原特異性的抗體-類分子。后一類多肽是例如，由淋巴系統(tǒng)少量產(chǎn)生而在骨髓瘤時(shí)含量大大增加。本文所用術(shù)語″抗體″是指最廣義上的抗體，并特別包括例如單鏈抗-TCCR單克隆抗體(包括激動(dòng)型抗體、拮抗型抗體和中和抗體)、具有多表位特異性的抗-TCCR抗體組合物、單鏈抗-TCCR抗體和抗-TCCR抗體片段(見下述)。本文中術(shù)語″單克隆抗體″，是指來自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個(gè)抗體均相同?？贵w可以結(jié)合于可接觸到的本發(fā)明多肽的任何結(jié)構(gòu)域。例如，抗體可結(jié)合于多肽的任何細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，并且當(dāng)分泌的是整個(gè)多肽時(shí)，則結(jié)合于多肽中抗體結(jié)合可利用的任何結(jié)構(gòu)域。
“天然抗體”和“天然免疫球蛋白”是約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)組成，每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈還有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)不變區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對應(yīng)，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。據(jù)信特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語“可變”是指可變區(qū)某些部分的序列在抗體之間有很大差異，它們可在各個(gè)抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性方面發(fā)揮作用。然而，該變異性不是均勻的分布于整個(gè)抗體的可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中三個(gè)或四個(gè)稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)或超變區(qū)的節(jié)段中。有至少兩種技術(shù)可以測定CDR(1)一種是基于交叉-物種的序列變異性(即，Kabat等，sequence ofProteins of immunological Interest(National Institute of Health，Bethesda，MD1987)；和(2)一種是基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體照相術(shù)研究(Chothia，C.等，Nature 342877(1989))。然而，鑒于兩種技術(shù)描述不同的殘基，故可以聯(lián)合使用之以確定雜交的CDR。
可變區(qū)中保守性較高的區(qū)域稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包括4個(gè)FR，主要采取β折疊構(gòu)象，由形成環(huán)狀連接的三個(gè)CDR相連接，而在某些情況下可形成部分β片層結(jié)構(gòu)。每條鏈的CDR通過FR緊密的靠近在一起，并且與其它鏈的CDR一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(見Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，第I卷，第647-669頁(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出各種效應(yīng)功能，例如參與抗體的抗體依賴性細(xì)胞毒性作用。
″抗體片段″包含完整抗體的一部分，優(yōu)選是完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二價(jià)抗體；線形抗體(Zapata等，Protein Eng.8(10)1057-1062)；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異抗體。
木瓜蛋白酶消化抗體可產(chǎn)生兩個(gè)相同的各帶有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段)和殘余的“Fc”片段，F(xiàn)c段的名稱反應(yīng)了其易于結(jié)晶的能力。經(jīng)胃蛋白酶處理可產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并仍然能交聯(lián)抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原識別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此區(qū)由緊密地非共價(jià)連接的一個(gè)重鏈可變區(qū)與一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。在這個(gè)構(gòu)象中每個(gè)可變區(qū)的三個(gè)CDR相互作用，在VH-VL二聚體表面限定一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。這六個(gè)CDR共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或Fv的一半僅含有三個(gè)抗原特異性CDR)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管與完整的結(jié)合位點(diǎn)相比其親和力較低。
Fab段還包括輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)(CH1)。Fab’與Fab的差別在于Fab’在重鏈CH1的羧基末端多出幾個(gè)殘基，包括抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定區(qū)半胱氨酸殘基中至少有一個(gè)游離巰基的Fab’。F(ab’)2抗體片段在最初產(chǎn)生為Fab’片段對，在它們之間具有鉸鏈區(qū)半胱氨酸。抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)是眾所周知的。
脊椎動(dòng)物任何物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，可依據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列而歸為兩種完全不同的兩類(稱為k和λ)中的一類。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將免疫球蛋白分為不同種類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進(jìn)一步分成“亞類”(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應(yīng)于不同類抗體的重鏈恒定區(qū)，分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象是眾所周知的。
本文中術(shù)語“單克隆抗體”，是指來自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個(gè)抗體均相同。單克隆抗體具有高度的特異性，針對單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，每種單克隆抗體是針對抗原上的單個(gè)表位。除了其特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)在于它們可被合成并不受其它抗體的污染。修飾詞“單克隆”表明該抗體的特點(diǎn)，即其來自基本上同質(zhì)的抗體群，不解釋為需通過任何特殊方法產(chǎn)生該抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的單克隆抗體可通過由Kohler等(自然，256495(1975))首先描述的雜交瘤法進(jìn)行制備，或者可通過重組DNA法進(jìn)行制備(例如見美國專利4816567)?！皢慰寺】贵w”還可利用例如Clackson等(自然，352624-628(1991))和Marks等(分子生物學(xué)雜志，222581-597(1991))所述技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離。也參見美國專利5750373、5571698、5403484和5223409，這些專利描述了利用噬菌粒和噬菌體載體來制備抗體。
本文中單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特殊物種或?qū)儆谔厥饪贵w種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，但所述鏈的剩余部分的序列與源自另一個(gè)物種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體種類或亞類的抗體(以及此抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性)的相應(yīng)序列相同或同源(美國專利4,816,567；和Morrison等，美國國家科學(xué)院院刊，816851-6855(1984))。
“人源化”型非人(例如小鼠)抗體是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白或其每片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab)’或抗體的其它抗原結(jié)合序列)，它們包含最非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)中受者互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基被具有所需特異性、親和力和性能的小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類等非人源物種抗體(供體抗體)的CDR殘基所取代。在一些實(shí)例中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人類殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在受者抗體或供體CDR或框架序列中不存在的殘基。這些修飾旨在進(jìn)一步改善和最大化抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(gè)(通常包括兩個(gè))可變區(qū)的全部，其中CDR的全部或基本上全部對應(yīng)于非人免疫球蛋白的相應(yīng)部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗體還任選包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。詳見Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。任選地，人源化抗體也包括“靈長類化”抗體，所述抗體的抗原結(jié)合區(qū)可從用感興趣抗原免疫接種獼猴制得的抗體中衍生獲得。抗體包括例如美國專利5658570、5693780、5681722、5750105和5756096中所述的源自非人靈長類動(dòng)物(如Old World Monkey，Ape等)的殘基。
本發(fā)明抗體及其片段也包括″親和力成熟的″抗體，在所述抗體中，氨基酸序列一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)和/或構(gòu)架區(qū)被改變，以改變抗體或其片段對所要結(jié)合的抗原的親和力。親和力成熟可導(dǎo)致成熟抗體相對于起始抗體而言對抗原的親合力增加或降低。通常，起始抗體是人源化抗體、人抗體、嵌合抗體或鼠抗體，而親和力成熟抗體較起始抗體具有更高親和力。使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法，在成熟過程中，將CDR或框架區(qū)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基改換為不同殘基。適宜方法包括，使用眾所周知的盒式誘變法進(jìn)行點(diǎn)突變(Wells等，1985，Gene 34315)或寡核苷酸介導(dǎo)的致突變法(Zoller等，1987，nucleic acids Res.，106487-6504)。使用已知選擇方法也可進(jìn)行親和力成熟，在所述方法中，產(chǎn)生許多突變，基于對抗原或配體親和力的改善而從突變體池或文庫中選擇出具有所需親和力的突變體。已知的噬菌體展示技術(shù)可被很方便地用于此選擇方法中。參見例如，美國專利5750373、5223409等。
人抗體也包括在本發(fā)明的抗體之內(nèi)。使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)可以制備人抗體，所述技術(shù)包括噬菌體展示文庫技術(shù)[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.MoL Biol，222581(1991)]。也可使用Cole等和Boemer等描述的用于制備人單克隆抗體的技術(shù)[Cole等，Monocloiaal antibody and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner et aL，J.Immunol.，147 186-95(1991)；U.S.5,750,373]。同樣地，通過把人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可以制備人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如鼠，鼠的內(nèi)源性免疫球蛋白基因已被部分或完全失活。攻擊鼠后，觀察到人抗體產(chǎn)生，所產(chǎn)生的抗體在各個(gè)方面均與在人觀察到的極為相似，包括基因重排、裝配和抗體所有組成部分。這方面的進(jìn)展參見例如，美國專利5545807、5545806、5569825、5625126、5633425、5661016，和下述科學(xué)出版物Marks等，Biol Technology 10779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368812-13(1994)；Fishwild等，NatureBiotechnology 14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。
單鏈Fv”或“scFv”抗體片段，包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈上。優(yōu)選Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含一個(gè)多肽接頭，它能使sFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述見Pluckthun在《單克隆抗體的藥理學(xué)》，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(1994)。
術(shù)語“二價(jià)抗體”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小分子抗體片段，這些片段在一條多肽鏈(VH-VL)上含有相連的一個(gè)重鏈可變區(qū)(VH)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)(VL)。利用一種非常短的接頭，其使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域無法配對，不得不與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。在EP 404097；WO93/11161；和Hollinger等，美國國家科學(xué)院院刊，906444-6448(1993)中有對二價(jià)抗體的更詳細(xì)描述。
“分離的”抗體是已從其天然環(huán)境的組成中鑒定、分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分是干擾抗體的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，可包括酶、激素本文所用術(shù)語″免疫粘附″，是指結(jié)合特異性異源蛋白質(zhì)(″粘附素″)與效應(yīng)物功能的免疫球蛋白的恒定區(qū)結(jié)合的抗體-樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附包括具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列(不是抗原識別位點(diǎn)和抗體結(jié)合位點(diǎn))(即，是″異源的″)和免疫球蛋白的恒定區(qū)序列相融合。免疫粘附分子的粘附部分通常是包括受體或配體至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的鄰接的氨基酸序列。免疫粘附中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。和其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體的純度應(yīng)達(dá)到(1)經(jīng)Lowery法確定的抗體重量的95％以上，最優(yōu)選所述重量的99％以上，(2)足以獲得用旋轉(zhuǎn)杯狀(spinning cup)序列分析儀所測至少15個(gè)殘基的N端或內(nèi)部氨基酸序列，(3)通過還原或非還原條件下的SDS-PAGE以及考馬斯亮藍(lán)染色、優(yōu)選銀染色所證實(shí)的同質(zhì)性。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)樵摽贵w的自然環(huán)境中的至少一種組分已不存在。一般情況下分離的抗體可通過至少一個(gè)純化步驟來制備。
本文中所用″標(biāo)記″一詞，是指直接或間接地與抗體偶聯(lián)從而產(chǎn)生″標(biāo)記″抗體的可檢測化合物或組分。標(biāo)記可以是其本身可被測得(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者如果是酶標(biāo)記時(shí)，可以是可測得的催化底物化合物或組分發(fā)生的化學(xué)變化。
“固相”是指本發(fā)明抗體可粘附的非水性基質(zhì)。本文中固相的實(shí)例包括部分或全部由玻璃(如控制孔徑的玻璃)、多糖(如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷制成的那些固相。在某些實(shí)例中，根據(jù)上下文的內(nèi)容，固相可包括測試板的孔；在其它的例子中，它可以是純化柱(如親和層析柱)。該術(shù)語也包括美國專利4275149中公開的分散顆粒的不連續(xù)固相。
“脂質(zhì)體”是由能向哺乳動(dòng)物有效運(yùn)送藥物(如本文公開的抗TCCR抗體，和任選地化療劑)的各類脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小分子囊泡。脂質(zhì)體的組分通常排列為雙層形式，與生物膜的脂質(zhì)排列相似。
本文所用術(shù)語″免疫粘附″，是指結(jié)合特異性異源蛋白質(zhì)(″粘附素″)與效應(yīng)物功能的免疫球蛋白的恒定區(qū)結(jié)合的抗體-樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附包括具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列(不是抗原識別位點(diǎn)和抗體結(jié)合位點(diǎn))(即，是″異源的″)和免疫球蛋白的恒定區(qū)序列相融合。免疫粘附分子的粘附部分通常是包括受體或配體至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的鄰接的氨基酸序列。免疫粘附中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
II本發(fā)明的組合物和方法A.全長TCCR多肽本發(fā)明提供使用TCCR多肽治療免疫相關(guān)病癥的新方法，包括調(diào)節(jié)T-細(xì)胞分化成Th1和Th2亞型以及治療通過Th1和Th2亞型而推斷的宿主病癥。更具體而言，已經(jīng)鑒定、分離出編碼TCCR多肽的cDNA，其在治療Th1-介導(dǎo)的和Th2-介導(dǎo)的病癥方面的應(yīng)用將在下面作更詳細(xì)的描述。需要指出的是，TCCR既指天然序列分子也指定義部分提到的變體，而術(shù)語hTCCR和mTCCR分別指圖3(SEQ ID NO1)和4(SEQ ID NO2)所示單一的天然序列多肽。為了簡明起見，在本說明書中將DNA41419(hTCCR)和/或DNA120632(mTCCR)編碼的蛋白質(zhì)以及前述定義的TCCR的所有其它天然同系物和變體均稱為″TCCR″，而不論其起源或制備模式如何。
使用常規(guī)技術(shù)，可以從核苷酸序列預(yù)測出由DNA41419(hTCCR，SEQID NO1)和DNA 120632(mTCCR，SEQ ID NO2)編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。對于本文所述TCCR多肽及其編碼核酸，申請人已經(jīng)確定此時(shí)在閱讀框上什么是與可利用序列信息最一致的。
使用上述ALIGN-2序列校準(zhǔn)計(jì)算機(jī)程序，業(yè)已發(fā)現(xiàn)全長天然hTCCR序列(圖3，SEQ ID NO1)和mTCCR序列(圖4，SEQ ID NO2)與登記號為475327和7710109的Dayhoff(GenBank)序列具有一定程度的序列同源性。
B.TCCR變體除了本文描述的全長天然序列的TCCR多肽外，還可以制備TCCR變體。通過在TCCR DNA中引入適當(dāng)?shù)暮塑账岣淖儯?或通過合成所期望的TCCR多肽，可以制得TCCR變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得，氨基酸變化將會(huì)改變TCCR的翻譯后過程，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)量和位置或者改變膜固定(anchoring)特性。
使用例如在美國專利5364934號中闡述的保守和非-保守突變的任一技術(shù)和指導(dǎo)路線，可以在天然全長序列TCCR或者在本文所述TCCR的各種結(jié)構(gòu)域中制造變化。變化可以是取代、缺失或插入編碼TCCR的一個(gè)或多個(gè)密碼子，從而導(dǎo)致相對于天然序列TCCR的TCCR氨基酸序列變化。任選地，變化是TCCR一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸被任何其它氨基酸取代。將TCCR序列與同種已知蛋白質(zhì)分子進(jìn)行比較，并使高度同源區(qū)氨基酸序列數(shù)量變化最小，可以建立決定那個(gè)氨基酸殘基可以被插入、取代或缺失而對所需活性無負(fù)面影響的指導(dǎo)原則。氨基酸取代可以是一個(gè)氨基酸被另一類似結(jié)構(gòu)和/或類似化學(xué)特性氨基酸代替的結(jié)果，如絲氨酸置換亮氨酸，即保守氨基酸置換。插入或缺失可任選地在約1～5個(gè)氨基酸的范圍。通過系統(tǒng)地在氨基酸序列中進(jìn)行插入、缺失或取代并檢測所產(chǎn)生變體顯示全長或成熟天然序列活性的情況，可以決定允許的變化。
本發(fā)明也包括TCCR多肽片段。該類片段可以是，例如，與全長天然蛋白質(zhì)相比，在N-末端或C-末端截短的或者是缺乏內(nèi)部殘基的片段。某些片段缺乏那些對于TCCR多肽期望生物活性而言非必要的氨基酸殘基。
TCCR片段可以按照大量常規(guī)技術(shù)中的任何一個(gè)來制備。可以化學(xué)合成期望的肽片段。另一途徑涉及用酶消化來產(chǎn)生TCCR片段，例如，用已知在特定氨基酸殘基限定的位點(diǎn)裂解蛋白質(zhì)的酶處理蛋白質(zhì)，或用適宜的限制性內(nèi)切酶消化DNA并分離所需片段。還有一適宜的技術(shù)，包括分離并用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼所需多肽片段的DNA片段。將限定DNA片段所需末端的寡核苷酸用于PCR引物的5′和3′端。優(yōu)選地，多肽片段與圖3(SEQID NO1)和(圖4，SEQ ID NO2)所示TCCR多肽的至少一種生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性相同。
在特定實(shí)施方案中，有關(guān)的保守取代冠以優(yōu)選取代的名稱示于下表I中。如果取代導(dǎo)致生物活性變化，進(jìn)而引起更多實(shí)質(zhì)性變化，在表I中命名為示范性取代或者如在下面將要詳述的那樣是指引入的氨基酸種類，則引入這些取代并篩選產(chǎn)物。
表6原始?xì)埢? 示范性取代 優(yōu)選取代Ala(A)val；leu；ile valArg(R)lys；gln；asn lysAsn(N)gln；his；lys；argglnAsp(D)glu gluCys(C)ser serGln(Q)asn asnGlu(E)asp aspGly(G)pro；ala alaHis(H)asn；gln；lys；argargIle(I)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸 leuLeu(L)正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe ileLys(K)arg；gln；asn argMet(M)leu；phe；ile leuPhe(F)leu；val；ile；ala；tyr leuPro(P)ala alaSer(S)thr thrThr(T)ser serTrp(W)tyr；phe tyrTyr(Y)trp；phe；thr；serpheVal(V)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸 leu通過選擇對于維持(a)取代區(qū)域多肽骨架結(jié)構(gòu)，例如，片層或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈大小具有顯著不同影響的取代基，來實(shí)現(xiàn)對本發(fā)明多肽功能或免疫學(xué)同一性的實(shí)質(zhì)性修飾?；谄胀▊?cè)鏈的特性，將天然存在的殘基分成以下幾組
(1)疏水性正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水性cys，ser，thr；(3)酸性asp，glu；(4)堿性asn，gln，his，lys，arg；(5)影響鏈取向的殘基gly，pro；和(6)芳香族trp，tyr，phe.
非-保守取代使得一類氨基酸與其它類之間一定數(shù)量的氨基酸交換成為必要。也可將取代的殘基引入到保守取代位點(diǎn)，或者更優(yōu)選地引入其余(非-保守)位點(diǎn)。
可以使用本領(lǐng)域已知方法如寡核苷酸-介導(dǎo)的(定點(diǎn))誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變技術(shù)來產(chǎn)生變異。可以對克隆的DNA進(jìn)行定點(diǎn)誘變[Carter等，Nucl.Acids Res.，134331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.，106487(1987)]、盒式誘變[Wells等，Gene，34315(1985)]、限制選擇誘變[Wells等，Philos.轉(zhuǎn).R.Soc.London SerA，317415(1986)]或其它已知技術(shù)以產(chǎn)生TCCR變體DNA。
掃描氨基酸分析也可用于確定沿著鄰接序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。優(yōu)選的掃描氨基酸是相對小的中性氨基酸。此類氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。通常，丙氨酸是此組中優(yōu)選的掃描氨基酸，因?yàn)樗淮嬖讦?碳上的側(cè)鏈并且極少改變變體的主鏈構(gòu)象[Cunningham和Wells，Science，2441081-1085(1989)]。優(yōu)選丙氨酸的另一原因是因?yàn)樗亲畛Ｓ冒被帷６?，它常常既出現(xiàn)在埋藏位置也出現(xiàn)在暴露位置[Creighton，TheProteins，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，1501(1976)]。如果丙氨酸取代不能產(chǎn)生足夠量的變體，則可使用isoteric氨基酸。
C.TCCR的修飾本發(fā)明包括TCCR的共價(jià)修飾。一種共價(jià)修飾包括使TCCR多肽的靶氨基酸殘基與能夠同TCCR的選定側(cè)鏈或N-或C-末端殘基發(fā)生反應(yīng)的有機(jī)衍生化劑進(jìn)行反應(yīng)。具有雙官能劑的衍生化是非常有用的，例如，TCCR與純化抗-TCCR抗體方法中所用水溶性載體基質(zhì)或表面交聯(lián)，反之亦然。通常使用的交聯(lián)劑包括例如，1，1-雙(二偶氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羥琥珀酰亞胺酯如與4-疊氮基水楊酸的酯，高雙官能亞胺基酯，包括二琥珀酰亞胺酯如3，3′-連二硫酸雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)、雙官能馬來酰亞胺酯如雙-N-馬來酰亞胺-1，8-辛酯和化學(xué)試劑如甲基-3-[(對-疊氮苯基)二硫]丙炔亞胺酯。
其它修飾包括，谷酰胺和天門冬酰殘基脫酰胺分別成為相應(yīng)的谷氨酰和門冬氨酰殘基，脯氨酸和賴氨酸羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基甲基化[T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983)]，胺的N-末端乙?；?，和任何C-末端羧基的酰胺化。
本發(fā)明還包括TCCR多肽的另一類共價(jià)修飾，所述共價(jià)修飾包括改變多肽的天然糖基化模式。″改變天然糖基化模式″，在這里的目的是為了刪除天然序列多肽中一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分(或者通過除去發(fā)生糖基化的位點(diǎn)或者通過利用化學(xué)和/或酶手段而刪除糖基化)，和/或在天然序列多肽中加入一個(gè)或多個(gè)本不存在的糖基化位點(diǎn)。此外，該短語包括天然蛋白質(zhì)糖基化的性質(zhì)變化，涉及不同碳水化合物部分在性質(zhì)和比例上的變化。
改變氨基酸序列可以實(shí)現(xiàn)在多肽中加入糖基化位點(diǎn)。此改變可以例如，通過向天然序列多肽(為了O-連接的糖基化位點(diǎn))中加入、或者用一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基取代而完成。任選地，可以通過DNA水平的變化，特別是通過使編碼多肽的DNA中預(yù)先選定的堿基發(fā)生突變從而產(chǎn)生將會(huì)翻譯成期望氨基酸的密碼子，來改變多肽的氨基酸序列。
在本發(fā)明多肽上增加碳水化合物部分?jǐn)?shù)目的另一方法是，將配糖體化學(xué)性或酶性地與多肽偶聯(lián)?，F(xiàn)有技術(shù)有此類方法的描述，例如1987年9月11日公布的WO 87/05330，以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.第259-306頁(1981)。
用化學(xué)或酶方法，或者通過突變性取代編碼作為糖基化靶點(diǎn)的氨基酸殘基的密碼子，來實(shí)現(xiàn)去除本發(fā)明多肽中的碳水化合物部分?；瘜W(xué)性去糖基化技術(shù)為本領(lǐng)域所公知，并描述在例如下述文獻(xiàn)中Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.，25952(1987)和Edge等，Anal.Biochem.，118131(1981)。使用Thotakura等在Meth.Enzvmol.，138350(1987)中描述的各種內(nèi)-和外-糖苷酶，可以完成多肽中碳水化合物部分的酶裂解。
本發(fā)明多肽的另一類共價(jià)修飾，包括以美國專利4640835、4496689、4301144、4670417、4791192或4179337中所述方式，將本發(fā)明多肽連接于各種非蛋白類聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙烯二醇或聚氧化亞烷基。
本發(fā)明TCCR多肽也可被修飾成嵌合分子，包括將TCCR與另一、異源多肽或氨基酸序列融合。
在一實(shí)施方案中，此類嵌合分子含有TCCR與標(biāo)記多肽的融合體，其中的標(biāo)記多肽具有抗-標(biāo)記抗體選擇性結(jié)合的表位。表位標(biāo)記一般位于TCCR的氨基-或羧基-末端。使用抗標(biāo)記多肽抗體，可以檢測到此類表位-標(biāo)記形式的本發(fā)明多肽的存在。另外，表位標(biāo)記措施，使得利用抗-標(biāo)記抗體或另一類與表位標(biāo)記結(jié)合的親和基質(zhì)來親和純化本發(fā)明多肽變得非常容易。各種標(biāo)記多肽及其各自的抗體是本領(lǐng)域眾所周知的。實(shí)例包括聚-組氨酸(poly-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標(biāo)記；flu HA標(biāo)記多肽及其抗體12CA5[Field等，Mol.Cell.Biol.，82159-2165(1988)]；c-myc標(biāo)記和它的8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗體[Evan等，Molecular and Cellular Biology，53610-3616(1985)]；和單純皰疹病毒糖蛋白質(zhì)D(gD)標(biāo)記及其抗體[Paborsky等，Protein Engineering，3(6)547-553(1990)]。其它標(biāo)記多肽包括Flag-肽[Hopp等，BioTechnology，612041210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science，255192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.，26615163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白質(zhì)肽標(biāo)記[Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876393-6397(1990)]。
在另一實(shí)施方案中，嵌合分子可包括本發(fā)明多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區(qū)域的融合。對于二價(jià)形式的嵌合分子(也指″免疫粘附″)，融合可以是與IgG分子Fc區(qū)的融合。Ig融合優(yōu)選包括溶解形式(跨膜結(jié)構(gòu)域缺失或失活)的本發(fā)明多肽取代Ig分子內(nèi)至少一個(gè)可變區(qū)。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫球蛋白融合包括IgG1分子的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)，或鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3區(qū)。為制備免疫球蛋白融合體，也參見1995年6月27日發(fā)布的美國專利5428130。
D.制備TCCR下面的描述主要涉及通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了含TCCR核酸的載體的細(xì)胞來制備TCCR。因此，當(dāng)然考慮到本領(lǐng)域熟知的供選擇方法可用于制備TCCR。譬如，通過利用固相合成技術(shù)的直接合成肽的方法來制備TCCR序列或其一部分[參見例如，Stewart等，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，，852149-2154(1963)]。使用手工或自動(dòng)操作技術(shù)，進(jìn)行蛋白質(zhì)體外合成。例如，按照制造商的指示，使用實(shí)用生物系統(tǒng)肽合成儀(Foster City，CA)，可以完成自動(dòng)合成?？梢苑謩e化學(xué)合成TCCR的各部分，然后利用化學(xué)或酶學(xué)方法制得全長TCCR。
1.編碼本發(fā)明多肽DNA的分離可以從cDNA文庫獲得編碼TCCR的DNA，所述cDNA文庫是從據(jù)信具有TCCR mRNA并且以可測得水平表達(dá)TCCR的組織制備的。因此，如實(shí)施例中所描述的那樣，從人組織制備的cDNA文庫中可以很方便地得到人的TCCR DNA。也可以從基因組文庫或者通過已知合成方法(例如自動(dòng)核酸合成)獲得TCCR-編碼基因。
使用為識別感興趣基因或其編碼的蛋白質(zhì)而設(shè)計(jì)的探針(如本發(fā)明抗體或至少約20-80個(gè)堿基的寡核苷酸)，可以篩選文庫。使用標(biāo)準(zhǔn)操作，如Sambrook等在Molecular CloningA Laboratory Manual(New YorkColdSpring Harbor Laboratory，1989出版)中所描述的方法，用選擇的探針進(jìn)行cDNA或基因組文庫的篩選。分離本發(fā)明多肽的編碼基因的另一個(gè)可選用方法，是使用PCR方法[Sambrook等，出處同上；Dieffenbach等，PCR PrimerA Laboratorv Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，1995出版)]。
下述實(shí)施例描述cDNA文庫篩選技術(shù)。選作探針的寡核苷酸序列應(yīng)當(dāng)具有足夠的長度并且足夠清晰，以便使假陽性出現(xiàn)機(jī)率最小。寡核苷酸優(yōu)選是標(biāo)記的，這樣通過與正在篩選的文庫中的DNA雜交而可被檢測到。標(biāo)記方法為本領(lǐng)域所公知，包括使用放射性標(biāo)記物如32P-標(biāo)記的ATP、生物素或酶標(biāo)記。包括中等嚴(yán)格和高度嚴(yán)格的雜交條件，見Sambrook等出處同上中所述。
可將在篩選文庫方法中鑒定的序列與其它已知的保藏序列或公共數(shù)據(jù)庫如GenBank或其它私有序列數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較和校準(zhǔn)。使用本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法，可以測定分子限定區(qū)域或全長序列的序列同源性(無論在氨基酸水平還是在核苷酸水平)。
使用本文首次公開的推定氨基酸序列，可以通過篩選選定的cDNA或基因組文庫獲得具有蛋白質(zhì)編碼序列的核酸，和如果必要，使用Sambrook等在出處同上中描述的常規(guī)引物延伸程序，以檢測沒有逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的mRNA。
2.宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化用生產(chǎn)本文所述TCCR的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在改良的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述改良是為了適宜于誘導(dǎo)增強(qiáng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼期望序列的基因。無需繁瑣的試驗(yàn)，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員就可以選擇培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基、溫度、pH等。通常，使細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)量最大化的原則、方案和實(shí)用技術(shù)見于Mammalian Cell Biotechnologya Practical Approach，M.Butler編著(IRL出版，1991)和Sambrook等出處同上。
轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞和轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所已知，例如，CaCl2、CaPO4、脂質(zhì)體-介導(dǎo)的方法和電穿孔法。取決于使用的宿主細(xì)胞，使用適合于該宿主細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。如Sambrook等在出處同上中所述，鈣處理使用氯化鈣，或電穿孔法一般用于原核生物或其它含有大量細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞。如Shaw等在Gene，23315(1983)和1989年6月29日公布的WO 89/05859中描述的那樣，植物肥大病菌屬感染用于轉(zhuǎn)化某些植物細(xì)胞。對于沒有細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物來說，可以使用Graham和van derEb在Virology，52456-457(1978)中所述的磷酸鈣沉淀法。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的總的情況在美國專利4399216中已有描述。根據(jù)Van Solingen等，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，763829(1979)所述方法，通常可以完成向酵母的轉(zhuǎn)化。然而，也可使用將DNA引入細(xì)胞的其它方法，例如通過核顯微注射、電穿孔、與完整細(xì)胞的細(xì)菌原生質(zhì)體融合，或者聚陽離子如聚凝胺、聚鳥氨酸。轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的各種方法見Keown等，Methods in Enzymology，185527-537(1990)和Mansour等，Nature，336348-352(1988)。
克隆或表達(dá)本文所述載體中DNA的適宜宿主細(xì)胞，包括原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞。適宜的原核生物包括但不限于革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌等真細(xì)菌，譬如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)如大腸桿菌。各種大腸桿菌株均是公眾可以得到的，如大腸桿菌K12株MM294(ATCC 31446)；大腸桿菌X1776(ATCC 31537)；大腸桿菌株W3110(ATCC 27325)和K5 772(ATCC 53635)。其它適宜的原核宿主細(xì)胞包括腸桿菌科如埃希氏桿菌屬，例如，大腸桿菌，腸桿菌屬，歐文菌屬，克雷白菌屬，變形菌桿屬，沙門菌屬(如鼠傷寒沙門菌)，沙雷菌屬(如粘質(zhì)沙雷菌)和志賀菌屬等，以及芽孢桿菌屬如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(例如1989年4月12日出版的DD 266710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬的銅綠菌假單胞菌，及鏈霉菌。這些實(shí)例是用于說明而并非限制于此。W3110株是一個(gè)特別優(yōu)選的宿主或母宿主，因?yàn)樗侵亟MDNA產(chǎn)生發(fā)酵的一常用宿主株。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞分泌少量蛋白水解酶。例如，修飾W3110株以使編碼宿主內(nèi)源性蛋白質(zhì)的基因發(fā)生遺傳突變，此類宿主的實(shí)例包括大腸桿菌W3110株1 A2，該株具有完整基因型tonA；大腸桿菌W3110株9E4，該株具有完整基因型tonAptr3；大腸桿菌W3110株27C7(ATCC 55244)，該株具有完整基因型tonA ptr3 phoAE15(argF-lac)169 degP ompT kanr；大腸桿菌W3110株37D6，該株具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kant；大腸桿菌W3110株40B4，它是37D6發(fā)生非-卡那霉素耐藥degP缺失突變的株；和具有1990年8月7日發(fā)布的美國專利4946783中披露的具有突變周質(zhì)蛋白水解酶的大腸桿菌株?；蛘?，克隆的體外方法，例如PCR或其它核酸聚合酶鏈反應(yīng)，是適宜的。
除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適于使編碼TCCR的載體克隆或表達(dá)的宿主。釀酒酵母，或常用的面包酵母，在低等真核宿主微生物中最為常用。其它真核微生物包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature，290140；1985年5月2日公布的EP 139383)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主(美國專利4943529；Fleer等，Bio/Technologv，9968-975(1991))，例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2)737-742)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wickeramll)(ATCC 24178)、K.waltii(ATCC 56500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906；Van den Berg等，Bio/Technology，8135(1990))、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和克魯維氏酵母屬(K.marxianus)等；yarrowia(EP402226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)(EP 183070；Sreekrishna等，J.BasicMicrobiol.，28265-278)；念珠菌屬；Trichoderma reesia(EP 244234)；粗糙鏈孢霉(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，765259-5263)；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公布的EP 394538)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、Tolypocladium(1991年1月10日公布的WO 91/00357)以及曲霉屬宿主如構(gòu)巢曲霉(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112284289；Tilburn等，Gene，26205-221；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811470-1474)和黑曲霉等(Kelly和Hynes，EMBO J.，4475-479)。在本文中Methylotropic酵母是適宜的，包括但不限于選自下述屬的能夠在甲醇中生長的酵母漢遜氏酵母屬(Hansenula)，念珠菌屬(Candida)，克勒克酵母屬(Kloeckera)，畢赤酵母屬(Pichia)，酵母屬，球擬酵母屬和紅酵母屬。此類酵母的例證性特定酵母屬的清單見C.Anthony，TheBiochemistrv of Methylotrophs，269(1982)。
用于表達(dá)糖基化TCCR多肽的適合宿主細(xì)胞來自多細(xì)胞生物。無脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括昆蟲細(xì)胞(例如果蠅屬S2和Spodoptera Sf9)和植物細(xì)胞。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和COS細(xì)胞。更特異的實(shí)例包括轉(zhuǎn)化了SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)的猴腎CV1細(xì)胞系；人胚腎細(xì)胞系(293細(xì)胞或亞克隆培養(yǎng)成在懸浮培養(yǎng)液中生長的293細(xì)胞，Graham等，J.Gen Virol.3659(1977))；中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；鼠賽爾托利細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝臟細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；和鼠乳腺癌細(xì)胞(MMT 060562，ATCC CCL51)。選擇合適宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域常識。
3.復(fù)制型載體的選擇和應(yīng)用編碼TCCR的核酸(例如cDNA或基因組DNA)可被插入到復(fù)制型載體中以進(jìn)行克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。各種載體是可以公開得到的。載體可以是例如質(zhì)粒、粘粒、病毒顆?；蚴删w的形式。使用各種方法可將合適的核酸序列插入載體。通常，利用本領(lǐng)域已知技術(shù)將DNA插入到合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。載體組成部分一般包括但不限于一個(gè)或多個(gè)信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。使用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)，構(gòu)建包括這些組成部分中一個(gè)或多個(gè)元件的適宜載體。
TCCR不僅可直接重組制備，而且還可制備成與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽為信號序列或在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特異性裂解位點(diǎn)的其它多肽。通常，信號序列是載體的一個(gè)組分或者是被插入載體的TCCR-編碼DNA的一部分。信號序列可以是選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、1pp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)區(qū)的原核信號序列。對于酵母分泌，信號序列可以是例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)區(qū)、α因子前導(dǎo)區(qū)(包括糖酵母屬和克魯維酵母屬的α因子前導(dǎo)區(qū)，后者在美國專利5010182中有述)，或酸性磷酸酶前導(dǎo)區(qū)、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)區(qū)(1990年4月4日公布的EP 362179)，或者1990年11月15日公布的WO90/13646中所述信號序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)時(shí)，可使用哺乳動(dòng)物信號序列以直接分泌蛋白質(zhì)，如得自相同物種或相關(guān)物種分泌型多肽的信號序列以及病毒分泌前導(dǎo)區(qū)。
表達(dá)載體和克隆載體均含有使載體在一個(gè)或多個(gè)選定宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。在多種細(xì)菌、酵母和病毒中，這樣的序列眾所周知。來自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)，適宜于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2μ質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)適于酵母，各種病毒復(fù)制起始點(diǎn)(SV40，多形瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)適宜于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。
表達(dá)載體和克隆載體通常包含篩選基因，也稱為可篩選標(biāo)志。典型的篩選基因編碼這樣的蛋白(a)提供對抗生素或其它毒素，如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素等的抗性，(b)彌補(bǔ)營養(yǎng)缺陷，或(c)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中不能得到的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，例如編碼芽孢桿菌屬D-丙氨酸消旋酶的基因。
適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的篩選標(biāo)志實(shí)例，是那些能勝任使接納編碼本發(fā)明多肽核酸的細(xì)胞得到識別的標(biāo)志，例如DHFR或胸苷激酶。當(dāng)使用野生型DHFR時(shí)，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是按照Urlaub等在Pric.Natl.Acad.Sci.USA 774216(1980)中描述的方法制備和繁殖的DHFR活性缺陷型中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。適用于酵母的合適篩選基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因[Stinchcomb等，Nature，28239(1979)；Kingsman等，Gene，7141(1979)；Tschemper等，Gene，10157(1980)]。trp1基因?yàn)椴荒茉谏彼嶂猩L的酵母突變株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了篩選標(biāo)志[Jones，Genetics，8512(1977)]。
表達(dá)和克隆載體通常含有可操作地連接于TCCR-編碼核酸序列的啟動(dòng)子，以指導(dǎo)mRNA合成。被各種潛在宿主細(xì)胞識別的啟動(dòng)子是眾所周知的。適用于原核宿主的啟動(dòng)子，包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)[Chang等，Nature，275615(1978)；Goeddel等，Nature，281544(1979)]，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)[Goeddel，Nucleic acids Res.，84057(1980)；EP36776]，和雜化啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983)]。適用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子，也含有可操作地連接于編碼TCCR的DNA的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。
適用于酵母宿主的啟動(dòng)序列的實(shí)例包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7149(1968)；Holl和Biochemistrv，174900(1978)]的啟動(dòng)子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母啟動(dòng)子，即那些還具有由生長條件控制轉(zhuǎn)錄優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是下述基因的啟動(dòng)子區(qū)乙醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73657中進(jìn)一步描述了用于酵母表達(dá)系統(tǒng)的適宜載體和啟動(dòng)子。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，由載體轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明多肽TCCR可受啟動(dòng)子調(diào)控，所述啟動(dòng)子來自病毒基因組如多形瘤病毒、雞痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的啟動(dòng)子，或者來自異源哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子，如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子等，和熱休克啟動(dòng)子，前提是這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
在載體中插入增強(qiáng)子序列，可以增加編碼TCCR的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是作用于啟動(dòng)子以增加轉(zhuǎn)錄的DNA的順式作用元件，一般約10～300bp。目前已經(jīng)知道了很多哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列。然而，人們通常使用真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括在其復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，在其復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的多形瘤增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。所述增強(qiáng)子可以剪接入TCCR編碼序列的5’或3’端，但優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5’端。
用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人或來自其它多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體，還包括對轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)所必須的序列。這些序列通常來自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶爾為3’)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄為編碼TCCR的mRNA的非翻譯區(qū)中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。
在重組脊椎動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中適應(yīng)TCCR合成的其它適宜方法、載體和宿主細(xì)胞，見Gething等，Nature，293620-625(1981)；Mantei等，Nature，28140-46(1979)；EP 117060；和EP 117058中的描述。
4.檢測基因擴(kuò)增/表達(dá)使用基于本文提供的序列的合適標(biāo)記的探針，利用常規(guī)技術(shù)如Southern印跡、測定mRNA轉(zhuǎn)錄量的Northern印跡[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980)]、點(diǎn)印跡(DNA分析)或原位雜交，可以直接在樣品中測定基因擴(kuò)增和/或表達(dá)?；蛘?，使用能夠識別特異雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜化雙鏈體或者DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體。依次標(biāo)記抗體，對雙鏈體與表面哪個(gè)部位結(jié)合進(jìn)行分析，從而基于雙鏈體在表面的形成，探測到與雙鏈體結(jié)合的抗體。
或者，通過免疫學(xué)方法測定基因表達(dá)以直接定量測定表達(dá)的基因產(chǎn)物，所述免疫學(xué)方法如細(xì)胞或組織切片的免疫組化染色和細(xì)胞培養(yǎng)物或體液分析。適用于免疫組化染色和/或樣品液分析的抗體，可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且可在任何哺乳動(dòng)物中制備?？梢苑奖愕刂苽淇固烊恍蛄蠺CCR多肽的抗體，或抗基于本文提供的DNA序列的合成肽的抗體，或者抗與編碼本發(fā)明多肽TCCR DNA和編碼特異抗體表位融合的外源序列的抗體。
5.多肽純化可從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞裂解物中回收TCCR。如果TCCR與膜結(jié)合，那么使用適宜去垢劑溶液(例如Triton-X 100)或通過酶裂解使之自細(xì)胞膜釋放。使用各種物理或化學(xué)手段，如凍融循環(huán)、超聲、機(jī)械破裂或細(xì)胞溶解劑，使表達(dá)TCCR所用的細(xì)胞破裂。
可以期望從重組細(xì)胞蛋白質(zhì)或多肽中純化TCCR。下述程序是例證性適宜的純化步驟在離子-交換柱上分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石或陽離子-交換樹脂如DEAE上層析；聚焦層析；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)G-75進(jìn)行凝膠過濾；過蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱以除去污染物如IgG；和結(jié)合表位-標(biāo)記形式TCCR的金屬螯合劑柱。可以使用蛋白質(zhì)純化的各種方法，這些方法是本領(lǐng)域熟知的，并在例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein PurificationPrincipesand Practice，Springer-Verlag，New York(1982)中作了描述。純化步驟的選擇，取決于例如生產(chǎn)方法的性質(zhì)和所產(chǎn)生的特定TCCR。
6.組織分布通過測定人各種組織中的mRNA表達(dá)，可以確定表達(dá)本發(fā)明多肽的組織位置。基因位置的確定，提供了哪些組織最易受到刺激和抑制本發(fā)明多肽活性影響的信息。基因在特定組織的分布，也為下面討論的活性阻斷試驗(yàn)提供了樣品組織。
如上面指出的那樣，使用基于本文提供的序列而設(shè)計(jì)并予以適當(dāng)標(biāo)記的探針，經(jīng)常規(guī)的Southem印跡、定量測定mRNA轉(zhuǎn)錄的Northern印跡(Thomas，Proc.NatL Acad.Sci.USA，775201-5205)、點(diǎn)印跡(DNA分析)或原位雜交技術(shù)，可以測量基因在各種組織的表達(dá)。或者，使用識別特異雙螺旋的抗體，所述雙螺旋包括DNA雙螺旋、RNA雙螺旋和DNA-RNA雜合雙螺旋或DNA-蛋白質(zhì)雙螺旋。
或者，為直接定量測定表達(dá)的基因產(chǎn)物，用免疫學(xué)方法測定基因表達(dá)，所述方法如細(xì)胞或組織切片的免疫組化染色和細(xì)胞培養(yǎng)物或體液分析。適用于免疫組化染色和/或樣品液分析的抗體，可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且可以在任何哺乳動(dòng)物中制備抗體?？梢苑奖愕刂苽淇固烊恍蛄斜景l(fā)明多肽的抗體，或抗基于編碼本發(fā)明多肽的DNA序列的合成肽的抗體，或者抗與編碼本發(fā)明多肽和編碼特異抗體表位的DNA融合的外源序列的抗體。下面將提供產(chǎn)生抗體的一般技術(shù)，和用于Northern印跡與原位雜交的特別方案。
E.TCCR的應(yīng)用1.一般應(yīng)用TCCR是與IL-12β-2受體、GCSFR和IL-6受體同源的WS(G)XWS類細(xì)胞因子受體，其中與IL-12β-2受體的同源性最高(26％同源性)。這些受體轉(zhuǎn)導(dǎo)控制細(xì)胞生長和分化的信號，特別是涉及血細(xì)胞生長和分化的細(xì)胞。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)G-CSF在化療后嗜中性白細(xì)胞的增殖中具有廣泛的臨床用途。這些類細(xì)胞因子受體和它們的激動(dòng)劑/拮抗劑很可能在血液學(xué)和腫瘤學(xué)病癥的治療方面起著重要的作用。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，TCCR在T-輔助細(xì)胞應(yīng)答-尤其是調(diào)節(jié)T-細(xì)胞分化為Th1和Th2亞群的過程中起重要作用。因此，取決于預(yù)期的治療目標(biāo)，TCCR及其激動(dòng)劑/拮抗劑在使哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答向T-輔助1反應(yīng)(Th1)或T-輔助-2(Th2)反應(yīng)偏置的治療方法中非常有用。
通過增強(qiáng)應(yīng)答中所涉及的所有其它類型細(xì)胞的募集、生長和分化，CD4+T細(xì)胞在過敏性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CD4+細(xì)胞的功能是通過分泌數(shù)種細(xì)胞因子而發(fā)揮的，所述細(xì)胞因子包括介素(IL-4)和IL-13，它們增強(qiáng)B細(xì)胞中IgE合成的誘導(dǎo)、肥大細(xì)胞生長以及淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞募集到炎癥部位。此外，CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-5，后者增加嗜酸性粒細(xì)胞和B細(xì)胞的生長和分化，CD4+T細(xì)胞還產(chǎn)生IL-10，后者增加肥大細(xì)胞的生長和分化并抑制γ-干擾素產(chǎn)生。
所有這些IL-4、IL-5、IL-10和IL-13是由稱為Th2細(xì)胞的CD4+T-細(xì)胞亞群產(chǎn)生的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Th2細(xì)胞在過敏個(gè)體體內(nèi)的含量大幅度增加。
Th1細(xì)胞分泌在激活巨噬細(xì)胞和在誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中起重要作用的細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2腫瘤壞死因子-β[TNF-β])。Th2細(xì)胞分泌在體液免疫和過敏性疾病中起重要作用的細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)。在Th1細(xì)胞因子抑制Th2細(xì)胞因子的同時(shí)，Th2細(xì)胞因子抑制Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這種負(fù)反饋環(huán)路增強(qiáng)免疫應(yīng)答期間產(chǎn)生多極化細(xì)胞因子的情形。保持這些“相對立”細(xì)胞因子產(chǎn)生的微妙平衡是極為關(guān)鍵的，這是因?yàn)?，?jù)信過度產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子將導(dǎo)致自身免疫性炎性疾病和同種異體移植物排斥。而過度產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子則導(dǎo)致過敏性炎性疾病如哮喘和過敏性鼻炎，或者導(dǎo)致對細(xì)胞內(nèi)病原體無效免疫。
Umetsu和DeKruyff，Proc.Soc.Exp.Bio.Med.215(1)11-20(1997)提出了一種模型，其中將感染易感性解釋為缺乏具有分泌適宜細(xì)胞因子特征的T細(xì)胞的發(fā)育，而不解釋為缺乏免疫性。過敏性疾病是由CD4+T細(xì)胞不適當(dāng)?shù)胤置赥h2細(xì)胞因子所引起的，而不過敏性個(gè)體之所以保持不發(fā)病，是因?yàn)樗麄凅w內(nèi)發(fā)育分泌Th1細(xì)胞因子的T細(xì)胞，所分泌的Th1細(xì)胞因子抑制IgE合成和肥大細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞分化。換一種方式講，過敏性鼻炎和哮喘代表病理性偏差或口腔/粘膜誤差，其中應(yīng)當(dāng)正常地發(fā)育為“Th2”調(diào)節(jié)/抑制細(xì)胞的T細(xì)胞發(fā)育成了引發(fā)和增強(qiáng)過敏性炎癥的Th2細(xì)胞。
細(xì)胞因子受體一般以具有包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)為特征。通常，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的功能是結(jié)合配體，跨膜結(jié)構(gòu)域的功能是把受體固定在細(xì)胞膜上，而細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)有關(guān)的效應(yīng)物。然而，配體-結(jié)合和效應(yīng)物功能可以位于多聚體受體分開的亞單位上。配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域本身就可以具有多結(jié)構(gòu)域。多聚體受體是一個(gè)廣義術(shù)語，一般包括(1)同型二聚體；(2)既具有配體-結(jié)合亞單位又具有效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域亞單位的異源二聚體；和(3)具有不同功能的亞單位組件的多聚體。在Urdahl，Ann.Reports Med.Chem.26221-228(1991)和Cosman，Cytokine 595-106(1993)一文中，對細(xì)胞因子受體作了進(jìn)一步的綜述和分類。
除了特異性免疫-相關(guān)的應(yīng)用外(例如，Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的生理機(jī)能)，編碼TCCR的核苷酸序列(或其互補(bǔ)鏈)在分子生物學(xué)領(lǐng)域具有多種用途，包括在染色體和基因作圖以及在生產(chǎn)反義RNA和DNA中用作雜交探針。
使用本文公開的重組技術(shù)，TCCR核酸還可用于制備TCCR多肽。
圖3(SEQ ID NO1)和圖4(SEQ ID NO2)所示全長天然序列TCCR基因或它們的一些部分，可用作cDNA文庫的雜交探針，以分離全長TCCRcDNA或分離另外一些與圖3和圖4(分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)所公開的TCCR序列具有所期望序列同源性的cDNAs(譬如，編碼天然存在的TCCR變體或來自其它物種的TCCR的cDNAs)。任選地，任選地，探針長度是約20～約50個(gè)堿基。雜交探針可源自于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2核苷酸序列的某些區(qū)域，其中所述區(qū)域是那些不需要十分繁瑣實(shí)驗(yàn)就可確定的區(qū)域，或從包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件和內(nèi)含子的天然序列TCCR基因組序列中確定的區(qū)域。舉例來說，篩選方法包括使用已知DNA序列合成約40個(gè)堿基的選定探針，來分離TCCR基因的編碼區(qū)。雜交探針可標(biāo)記上各種標(biāo)志，包括放射性核苷酸如32p或35S，或酶標(biāo)記，所述酶標(biāo)記如通過卵白素/生物素偶聯(lián)系統(tǒng)將堿性磷酸酶與探針耦合。具有與本發(fā)明TCCR基因互補(bǔ)序列的標(biāo)記探針，可用于篩選人cDNA文庫、基因組DNA或mRNA，以測定探針與哪一文庫發(fā)生雜交。下面的實(shí)施例將進(jìn)一步詳細(xì)描述雜交技術(shù)。使用本文披露的方法，本申請公開的EST序列可類似地用作探針。
TCCR核酸的其它有用片段，包括含有能與靶TCCR mRNA(正義)或TCCR DNA(反義)序列結(jié)合的單鏈核酸序列(RNA或DNA)的反義或正義寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，反義或正義寡核苷酸包括TCCR DNA編碼區(qū)的片段。該片段一般含有至少約14個(gè)核苷酸，優(yōu)選約14～30個(gè)核苷酸?；诰幋a一給定蛋白質(zhì)的cDNA序列得到反義或正義寡核苷酸的能力，在例如Stein和Cohen(Cancer Res.482659，1988)及van der Krol等(BioTechniques 6958，1988)的文章中有描述。
反義或正義寡核苷酸與靶核酸序列的結(jié)合，導(dǎo)致通過一種或多種方式阻斷靶序列轉(zhuǎn)錄或翻譯的雙螺旋形成，所述阻斷方式包括增加雙螺旋降解、轉(zhuǎn)錄或翻譯的成熟前終止或者其它方式。因此，反義寡核苷酸可用于阻斷TCCR蛋白質(zhì)的表達(dá)。反義或正義寡核苷酸進(jìn)一步包括具有修飾過的糖磷酸二酯主鏈的寡核苷酸(或其它糖鏈接，如WO 91/06629中描述的那些)，其中此類糖鏈接是耐內(nèi)源性核酸酶的。此類具有抗性糖鏈接的寡核苷酸在體內(nèi)是穩(wěn)定的(即，能夠抗酶降解)，同時(shí)保留序列與靶核苷酸序列的結(jié)合特異性。
正義或反義寡核苷酸的其它實(shí)例，包括那些與有機(jī)分子共價(jià)鍵合的寡核苷酸，如WO 90/10048中描述的那些寡核苷酸，和其它增加寡核苷酸與靶核酸序列親和力的分子，如聚-(L-賴氨酸)。另外，嵌入劑(如橢圓玫瑰樹堿)和烷基化劑或金屬絡(luò)合物可掛接在修飾反義或正義寡核苷酸結(jié)合特異性的正義或反義寡核苷酸上，以修飾反義或正義寡核苷酸對靶核苷酸序列的結(jié)合特異性。
使用任何基因轉(zhuǎn)移方法可將反義或正義寡核苷酸引入到含有靶核酸序列的細(xì)胞中，所述方法包括例如，CaPO4-介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染、電穿孔、或使用基因轉(zhuǎn)移載體如Epstein-Barr病毒。在一優(yōu)選的方法中，將反義或正義寡核苷酸插入到一適宜的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，在體內(nèi)或體外使含有靶核酸序列的細(xì)胞與重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體接觸。適宜的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括但不限于，得自小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒M-MuLV、N2(得自M-MuLV的逆轉(zhuǎn)錄病毒)，或稱為DCT5A、DCT5B和DCT5C(見WO 90/13641)的雙倍復(fù)制病毒。
也可以通過使正義或反義寡核苷酸與配體結(jié)合分子形成偶聯(lián)物的形式，而將正義或反義寡核苷酸引入到含有靶核苷酸序列的細(xì)胞中，見WO91/04753的描述。適宜的配體結(jié)合分子包括但不限于細(xì)胞表面受體、生長因子、其它細(xì)胞因子或能與細(xì)胞表面受體結(jié)合的其它配體。優(yōu)選地，配體結(jié)合分子的偶聯(lián)基本上不干擾配體結(jié)合分子與其相應(yīng)分子或受體結(jié)合的能力，或阻斷正義或反義寡核苷酸或其偶聯(lián)型進(jìn)入細(xì)胞。
或者，按照WO 90/10448描述的方法，通過形成寡核苷酸-脂復(fù)合物，而將正義或反義寡核苷酸引入到含有靶核酸序列的細(xì)胞中。優(yōu)選地，正義或反義寡核苷酸-脂復(fù)合物是使用內(nèi)源性脂酶而在細(xì)胞內(nèi)分離的。
也可在PCR技術(shù)中使用探針，以產(chǎn)生用于鑒定最接近TCCR編碼序列的一組序列。
編碼TCCR的核苷酸序列，還可用于構(gòu)建在描繪編碼TCCR的基因圖譜和對患有遺傳病個(gè)體進(jìn)行基因分析中使用的雜交探針。使用已知技術(shù)，如原位雜交、抗已知染色體標(biāo)志物的連鎖分析和與文庫的雜交篩選技術(shù)，可將本文提供的核苷酸序列整合到染色體和染色體的特定區(qū)域。
既然TCCR是受體，那么TCCR的編碼序列必然編碼與另一蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明TCCR蛋白質(zhì)可在鑒定參與結(jié)合相互作用的其它蛋白質(zhì)或分子的分析中使用。使用此類方法，可以鑒定受體/配體結(jié)合相互作用的抑制劑。還可將參與此結(jié)合相互作用的蛋白質(zhì)用于篩選肽或結(jié)合相互作用的小分子抑制劑或激動(dòng)劑。而且，受體TCCR可用于分離相關(guān)配體。篩選分析可用于設(shè)計(jì)尋找模擬天然TCCR生物活性或TCCR配體的主要化合物。此類篩選分析包括使用化學(xué)用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行高-通過量篩選分析，使之特別適宜于鑒定小分子候選藥物。小分子包括合成的有機(jī)或無機(jī)化合物?？墒褂酶鞣N形式的分析法，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合分析，生化篩選分析，免疫測定和以細(xì)胞為基礎(chǔ)的分析，這些分析法均是本領(lǐng)域公知的。
本文所述TCCR多肽也可用作電泳中蛋白質(zhì)的分子量標(biāo)志。
本文所述編碼TCCR多肽或其片段的核酸分子在染色體鑒定中非常有用。在此方面，由于基于實(shí)際序列數(shù)據(jù)只有相對少數(shù)幾個(gè)可利用的染色體標(biāo)志劑，因而一直存在著對于鑒定新染色體標(biāo)志的需求。本發(fā)明每一個(gè)TCCR核酸分子均可用作染色體標(biāo)志。
本發(fā)明TCCR多肽和核酸分子也可用于組織分型，其中本發(fā)明TCCR多肽在不同組織間有差別地表達(dá)。TCCR核酸分子還可用于制備PCR、Northern分析、Southern分析和Western分析用的探針。
2.抗體結(jié)合研究本發(fā)明TCCR多肽的活性，可通過抗體結(jié)合研究而得到進(jìn)一步證實(shí)。在該結(jié)合研究試驗(yàn)中，檢測抗-TCCR抗體抑制組織細(xì)胞上TCCR多肽的能力。例證性抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、雙特異抗體和異源偶聯(lián)抗體，它們的制備將在下面予以描述。
可使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行抗體結(jié)合研究，所述方法如競爭性結(jié)合試驗(yàn)、直接和間接夾心試驗(yàn)，及免疫沉淀試驗(yàn)。Zola，單克隆抗體技術(shù)指南，147-158頁(CRC Press，Inc.1987)。
競爭性結(jié)合試驗(yàn)，依賴于標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品在同限定量抗體結(jié)合中與測試樣品分析物競爭的能力。測試樣品中靶蛋白的量與將要同抗體結(jié)合(becomebound)的標(biāo)準(zhǔn)品的量成反比。為便于測定將要結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品的量，優(yōu)選抗體在競爭之前或之后是不溶性的，這樣可以很方便地把與抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品從保持未結(jié)合狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品中區(qū)分開來。
夾心試驗(yàn)涉及使用被檢測蛋白質(zhì)的兩種抗體，每一種抗體能夠結(jié)合不同的免疫原性蛋白質(zhì)或表位。在一夾心試驗(yàn)中，首先使測試樣品分析物與固定在固體載體上的第一抗體結(jié)合，然后再使第二抗體與分析物結(jié)合，從而形成不溶性的三部分復(fù)合物。參見例如美國專利4376110。第二抗體本身可標(biāo)記有可檢測部分(直接夾心試驗(yàn))，或者通過使用標(biāo)記有可檢測部分的抗-免疫球蛋白抗體來測定第二抗體(間接夾心試驗(yàn))。例如，一種類型的夾心試驗(yàn)是ELISA分析法，其中可檢測部分是酶。
對于免疫組織化學(xué)而言，組織樣品可以是新鮮的或冷凍的，或者是包埋在石蠟中并用防腐劑如福爾馬林固定。
3.基于細(xì)胞的分析基于細(xì)胞的分析和免疫相關(guān)疾病的動(dòng)物模型，可用于進(jìn)一步了解本文鑒定的基因和多肽與免疫相關(guān)疾病進(jìn)展和發(fā)病機(jī)理之間的關(guān)系。
在不同的研究中，用本文描述的cDNA轉(zhuǎn)染已知參與特定免疫相關(guān)疾病的細(xì)胞類型的細(xì)胞，并分析這些cDNA刺激或抑制免疫功能的能力?？捎盟璧幕蜣D(zhuǎn)染適宜細(xì)胞，并監(jiān)測免疫功能活性。然后，將此轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系用于檢測多克隆或單克隆抗體或抗體組合物抑制或刺激免疫功能的能力，譬如用于檢測調(diào)節(jié)T-細(xì)胞增殖或炎性細(xì)胞浸潤的能力。用本文鑒定的基因編碼序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，還可用于確定治療免疫相關(guān)疾病的候選藥物。
此外，盡管優(yōu)選穩(wěn)定的細(xì)胞系，但是得自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(見下述)的原代培養(yǎng)物，可用于基于細(xì)胞的分析中。從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲取連續(xù)細(xì)胞系的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知(參見例如Small等，Mol.Cell.Biol.5，642-648).
一種基于穩(wěn)定細(xì)胞的分析是混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)，見CurrentProtocols in Immunology，unit 3.12；edited by J E Coligan，A M Kruisbeek，D HMarglics，E M Shevach，W Strober，National Institutes of
Health，Published by John Wiley & Sons，Inc.。在該分析中，分析測試化合物刺激或抑制活化T細(xì)胞增殖的能力。使應(yīng)答T細(xì)胞的上清液與異源刺激物細(xì)胞一起培養(yǎng)，通過氚標(biāo)記去氧胸苷的攝取來測定T細(xì)胞增殖情況。該分析是對T細(xì)胞反應(yīng)性的一般性測定。既然大多數(shù)T細(xì)胞對活化應(yīng)答并產(chǎn)生IL-2，那么在該分析實(shí)驗(yàn)中應(yīng)答的差異，部分反映出應(yīng)答細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的差異。可以用標(biāo)準(zhǔn)淋巴因子(IL-2)檢測分析來證實(shí)此MLR結(jié)果，見前述CurrentProtocols in Immunology一書，3.15，6.3。
MLR分析中的增生性T細(xì)胞反應(yīng)，可能是由于測試分子的直接致有絲分裂性能或者由于外源性抗原誘導(dǎo)的活化作用。通過共同刺激分析實(shí)驗(yàn)，可以獲得對本發(fā)明多肽T細(xì)胞刺激活性的另外證實(shí)。T細(xì)胞活化，需要通過T-細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)的抗原特異性信號和通過第二配體結(jié)合相互作用(例如，B7(CD80，CD86)/CD28結(jié)合相互作用)介導(dǎo)的共同刺激信號。CD28交聯(lián)增加活化T分泌細(xì)胞淋巴因子。通過與具有負(fù)性或正性效應(yīng)的配體結(jié)合，T細(xì)胞活化具有負(fù)性和正性控制。CD28和CTLA-4是與B7結(jié)合的Ig超家族中的相關(guān)糖蛋白。與B7結(jié)合的CD28具有正性共同刺激T細(xì)胞活化的效應(yīng)；相反，與B7結(jié)合的CTLA-4具有負(fù)性T細(xì)胞失活效應(yīng)，Chambers，C.A.和Allison，J.P.，Curr.Opin.ImmunoL(1997)9396.Schwartz，R.H.，Cell(1992)711065；Linsey，P.S.和Ledbetter，J.A.，Annu.Rev.Immunol.(1993)11191；June，C.H.etal.，Inimunol.Today(1994)15321；Jenkins，M.K.，Immunity(1994)1405。在共同刺激分析實(shí)驗(yàn)中，分析本發(fā)明多肽對T細(xì)胞共同刺激或抑制活性。
本發(fā)明多肽以及屬于T細(xì)胞增殖刺激劑(共同刺激劑)和激動(dòng)劑的本發(fā)明其它化合物，例如激動(dòng)型抗體，例如通過MLR和共同刺激分析實(shí)驗(yàn)確定的那些化合物，在治療以免疫功能差、免疫功能在最適度以下或不充分為特征的免疫相關(guān)疾病的治療中非常有用。通過刺激T細(xì)胞增殖和活化(例如，刺激T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，Th1和/或Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生)，和通過施用刺激性化合物(如本發(fā)明刺激性多肽)而增加哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答，來治療這些疾病。刺激性多肽可以是例如TCCR配體多肽或其激動(dòng)型抗體。
在用4-1BB糖蛋白的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)證實(shí)了本發(fā)明刺激性化合物的直接使用，4-1BB是腫瘤壞死因子受體家族成員之一，它與在致敏T細(xì)胞上表達(dá)的配體(4-1BBL)結(jié)合并標(biāo)志T細(xì)胞活化和生長，Alderson，M.E.等，J.Immunol.(1994)242219。
也已實(shí)驗(yàn)性地證實(shí)了激動(dòng)型刺激性化合物的用途。用激動(dòng)型抗-4-1BB抗體處理的4-1BB活化，促進(jìn)腫瘤的根除。Hellstrom，I.和Hellstrom，K.E.，Crit.Rev.ImmunoL(1998)181。下面將要詳述的用于腫瘤治療的免疫佐劑療法，是使用本發(fā)明刺激性化合物的另一實(shí)例。
通過拮抗或阻斷在MIR分析實(shí)驗(yàn)中證明是抑制性的蛋白質(zhì)的活性，也可達(dá)到免疫刺激或增強(qiáng)效應(yīng)。取消化合物的抑制活性，產(chǎn)生凈刺激效應(yīng)。適宜的拮抗劑/阻斷性化合物，是識別并與抑制性蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體或其片段，從而阻斷蛋白質(zhì)與其受體間的相互作用并抑制通過受體的信號發(fā)送。這一效應(yīng)已被在使用增強(qiáng)T細(xì)胞增殖的抗-CTLA-4抗體的實(shí)驗(yàn)中加以證實(shí)，推測其可能是由于去除了由CTLA-4結(jié)合引起的抑制信號所致，Walunas，T.L.et al，Immunity(1994)1405。
另一方面，作為T細(xì)胞增殖/活化和/或淋巴因子分泌的直接抑制劑的本發(fā)明多肽以及本發(fā)明其它化合物，可直接用于抑制免疫應(yīng)答。這些化合物在降低免疫應(yīng)答程度而治療以免疫活動(dòng)過度、超出最適度或自身免疫反應(yīng)為特征的免疫相關(guān)疾病中非常有用。本發(fā)明化合物的此用途，可通過上述與受體B7結(jié)合的CTLA-4使T細(xì)胞失活的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。本發(fā)明直接抑制化合物以類似方式發(fā)揮作用。
或者，化合物例如抗體，與本發(fā)明刺激性多肽結(jié)合并阻斷這些分子的刺激性作用，從而產(chǎn)生凈抑制效應(yīng)，并通過抑制T細(xì)胞增殖/活化和/或淋巴因子分泌而可用于抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。阻斷多肽的刺激性效應(yīng)，抑制哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。在使用抗-IL2抗體的實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)這一用途。這些實(shí)驗(yàn)中，抗體與IL2結(jié)合并阻斷IL2與其受體結(jié)合，從而獲得T細(xì)胞抑制效應(yīng)。
4.動(dòng)物模型使用動(dòng)物模型在體試驗(yàn)，可以進(jìn)一步證實(shí)基于離體細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果并可分析T-細(xì)胞功能。各種眾所周知的動(dòng)物模型可用于進(jìn)一步了解本文鑒定的基因在免疫相關(guān)疾病的發(fā)展和發(fā)病機(jī)理中的作用，和用于檢測有效的候選治療劑，所述候選治療劑包括抗體和天然多肽的其它拮抗劑，后者包括小分子拮抗劑。此類模型的在體特性，使得它們可以預(yù)見在人類患者的反應(yīng)。免疫相關(guān)疾病的動(dòng)物模型包括非-重組動(dòng)物和重組(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物。非重組動(dòng)物模型包括例如，嚙齒動(dòng)物如小鼠模型，此類模型可如下制得利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如皮下注射、尾靜脈注射、脾埋入法、腹膜內(nèi)植入、腎囊植入法等，將細(xì)胞引入同系基因鼠體內(nèi)。
將免疫活性細(xì)胞入免疫抑制或免疫耐受患者體內(nèi)，將發(fā)生移植物抗宿主病。供體細(xì)胞識別并應(yīng)答宿主抗原。該應(yīng)答程度不等，可以是危及生命的嚴(yán)重炎癥，也可是輕度腹瀉和體重下降。抑制物抗宿主疾病模型，提供了評價(jià)T細(xì)胞抗MHC抗原和小移植抗原反應(yīng)性的手段。適合的操作詳見前述Current Protocols in Immunology，一書中unit 4.3。
皮膚同種異體移植排斥的動(dòng)物模型，是檢測T細(xì)胞介導(dǎo)體內(nèi)組織破壞能力的手段和檢測在移植排斥中作用的措施。最常用和最接受的模型是使用小鼠尾部皮膚移植。反復(fù)實(shí)驗(yàn)業(yè)已證實(shí)，皮膚同種異體移植排斥是由T細(xì)胞、輔助T細(xì)胞和殺傷-效應(yīng)物T細(xì)胞介導(dǎo)的，而不是抗體所介導(dǎo)，Auchincloss，H.Jr.和Sachs，D.H.，F(xiàn)undamental Immunology，2nd ed.，W.E.Paul ed.，RavenPress，NY，1989，889-992。適宜操作詳見前述Current Protocols in Imnaunology一書中unit 4.4?？捎糜跈z測本發(fā)明化合物的其它移植排斥模型，是Tanabe，M.等在Transplantation(1994)5823中和Tinubu，S.A.等在J.Immunol.(1994)4330-4338中描述的同種異體心臟移植模型。
遲發(fā)型過敏反應(yīng)的動(dòng)物模型，也可用于分析細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能。遲發(fā)型過敏反應(yīng)是T細(xì)胞介導(dǎo)的體內(nèi)免疫應(yīng)答，其以在抗原攻擊后一段期間之后達(dá)到炎癥高峰為特征。這些反應(yīng)也發(fā)生在組織特異性自身免疫性疾病，如多發(fā)性硬化(MS)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE，MS的模型)。適宜操作詳見前述Current Protocols in Immunology一書中unit 4.5。
EAE是T細(xì)胞介導(dǎo)的以T細(xì)胞和單核細(xì)胞細(xì)胞炎癥及中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸索繼發(fā)性脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病。EAE通常被認(rèn)為是人MS的相關(guān)動(dòng)物模型，Bolton，C.，Multilocular Sclerosis(1995)1143。已開發(fā)出急性模型和復(fù)發(fā)-緩解性模型。使用前述Current Protocols in Immunology一書中units 15.1和15.2部分公開的方案，可檢測本發(fā)明化合物對T細(xì)胞抗免疫介導(dǎo)的脫髓鞘疾病的刺激性或抑制性活性。也參見Duncan，I.D.等在Molec.Med.Today(1997)554-561中所述的髓磷脂疾病的模型，其中少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或許旺氏細(xì)胞被移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。
接觸性過敏是在體分析細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能的簡單的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。在此過程中，皮膚暴露于外原性半抗原，引發(fā)遲發(fā)型過敏反應(yīng)，測量并定量測定過敏反應(yīng)。接觸敏感性涉及起始敏化期，接著是誘發(fā)期。當(dāng)T淋巴細(xì)胞與以前曾經(jīng)接觸過的抗原再次相遇時(shí)，則出現(xiàn)誘發(fā)期。發(fā)生腫脹和炎癥，使得其成為人過敏性接觸性皮炎的極好的模型。適宜操作詳見Current Protocolsin Immunology，Eds.J.E.Cologan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober，John Wiley & Sons，Inc.，1994，unit 4.2。也參見Grabbe，S.和Schwarz，T，lmmun.Today 19(1)37-44(1998)。
關(guān)節(jié)炎的一種動(dòng)物模型是膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。該模型與人自身免疫類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有相同的臨床、組織學(xué)和免疫學(xué)特性，是人自身免疫性關(guān)節(jié)炎的合適模型。小鼠和大鼠模型以滑膜炎、軟骨和軟骨下骨侵蝕為特征。使用前述Current Protocols in Immunology一書中units 15.5部分介紹的方案，可以檢測本發(fā)明化合物抗自身免疫關(guān)節(jié)炎的活性。也參見使用Issekutz，A.C.等在Immunology(1996)88569中所述抗CD18和VLA-4整聯(lián)蛋白的單克隆抗體的模型。
哮喘模型已有描述，其中通過用卵白蛋白敏化動(dòng)物，然后用氣溶膠釋放形式的相同蛋白質(zhì)刺激動(dòng)物，從而誘導(dǎo)抗原-誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性、肺嗜酸性粒細(xì)胞增多和炎癥。數(shù)種動(dòng)物模型(豚鼠，大鼠，非-人靈長類)在氣溶膠抗原攻擊后表現(xiàn)出類似于人特應(yīng)性哮喘的癥狀。鼠模型具有人哮喘的多種特性。Wolyniec，W.W.等在Am.J.Respir. Cell Mol.BioL(1998)18777中描述了檢測本發(fā)明化合物治療哮喘活性和效力的適宜操作，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
另外，可在牛皮癬類疾病動(dòng)物模型中檢測本發(fā)明化合物。證據(jù)提示牛皮癬的T細(xì)胞發(fā)病機(jī)理?？稍赟chon，M.P.等Nat.Med.(1997)3183所述scid/scid小鼠模型中檢測本發(fā)明化合物，所述模型中小鼠表現(xiàn)出酷似牛皮癬的組織病理性皮膚病損。另一適宜的模型，是按照Nickoloff，B.J.等在Am.J.PathoL(1995)146580中所述方法制備的人皮膚/scid小鼠嵌合體。
使用生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過向感興趣動(dòng)物的基因組引入本文鑒定的基因的編碼部分，可以對重組(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物模型進(jìn)行工程改造?？勺鳛檗D(zhuǎn)基因靶的動(dòng)物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、綿羊、山羊、豬和非-人靈長目動(dòng)物如狒狒、黑猩猩和猴子。本領(lǐng)域已知的將轉(zhuǎn)基因引入動(dòng)物的技術(shù)，包括原核顯微注射(Hoppe和Wanger，美國專利4873191)；逆轉(zhuǎn)錄病毒-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移入干細(xì)胞系(germ lines)(例如，Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826148-615)；基因靶向進(jìn)入胚胎干細(xì)胞(Thompson等，Cell 56313-321)；胚胎的電穿孔(Lo，Mol.CeL.BioL3，1803-1814)；精子-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano etal，Cell 57，717-73)。有關(guān)評述參見例如美國專利4736866。
為了本發(fā)明的目的，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括那些僅在其細(xì)胞部分?jǐn)y帶轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物(″鑲嵌型動(dòng)物″)。該轉(zhuǎn)基因可以單個(gè)轉(zhuǎn)基因形式或者以多聯(lián)體形式(如頭-頭或頭-尾串聯(lián)體)進(jìn)行整入。根據(jù)例如Lasko等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6232-636(1992)中公開的技術(shù)，將轉(zhuǎn)基因選擇性引入特定類型細(xì)胞也是可能的。
使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以監(jiān)測轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。例如，Southern印跡分析或PCR擴(kuò)增技術(shù)可用于證實(shí)轉(zhuǎn)基因的整入。然后，使用諸如原位雜交、Northern印跡分析、PCR或免疫細(xì)胞化學(xué)法等技術(shù)，可分析mRNA的表達(dá)水平。
編碼TCCR或其修飾形式的核酸，也可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或″基因敲除″動(dòng)物，所得動(dòng)物反過來對于開發(fā)和篩選適合的治療劑是非常有用的。本領(lǐng)域所用術(shù)語“基因敲除動(dòng)物”，是為了描述其內(nèi)源性基因已被“基因敲除”或切除的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如由于使用同源重組而產(chǎn)生的動(dòng)物。同源重組是本領(lǐng)域用于描述與內(nèi)源性基因同源的靶向載體區(qū)域的術(shù)語。這些同源區(qū)域?qū)⒈舜穗s交并重組到宿主的基因組中，在共有同源性區(qū)域限定的位置和方向用載體插入序列替換宿主內(nèi)源性序列?；蚯贸齽?dòng)物的基因型用“-/-”基因表示。這使得它與用“-/+”表示的只有一個(gè)等位基因被“基因敲除”的動(dòng)物區(qū)別開來。已被“基因敲除”的內(nèi)源性基因，在整個(gè)動(dòng)物的所有細(xì)胞中均不再被表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)是含有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因被引入到動(dòng)物或孕期(例如胚胎期)祖代動(dòng)物中。轉(zhuǎn)基因是整合入細(xì)胞基因組的DNA，由所述細(xì)胞發(fā)展為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一實(shí)施方案中，使用已經(jīng)建立的技術(shù)，編碼TCCR的cDNA可用于克隆編碼TCCR的基因組DNA，并將基因組序列用于生產(chǎn)含有表達(dá)編碼TCCR DNA細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，特別是諸如小鼠或大鼠這樣的動(dòng)物，已經(jīng)成為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，并在例如美國專利4736866和4870009中有描述。通常，帶有組織-特異增強(qiáng)子的TCCR轉(zhuǎn)基因被整合入特定細(xì)胞中。含有胚胎期被整合入動(dòng)物干細(xì)胞的一個(gè)拷貝編碼TCCR轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可用于檢測增加編碼TCCR DNA表達(dá)的效果。此類動(dòng)物可用作檢測認(rèn)為對于例如與過度表達(dá)有關(guān)的病理病癥具有保護(hù)作用的藥劑的試驗(yàn)動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，與未經(jīng)治療的攜帶轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物相比，用藥劑治療的動(dòng)物，其病理病癥的發(fā)生率降低，這表明藥劑對于病理病癥具有潛在的治療干預(yù)作用。
或者，將編碼多肽的內(nèi)源性基因與編碼相同多肽的基因組DNA的同源重組物引入動(dòng)物胚胎干細(xì)胞，而構(gòu)建其編碼本文鑒定的多肽的基因缺陷或改變的″基因敲除″動(dòng)物。例如，按照已經(jīng)建立的技術(shù)，編碼特定多肽的cDNA可用于克隆編碼該多肽的基因組DNA。編碼特定多肽的基因組DNA的一部分，可被刪除或用其它基因替換，如被用于監(jiān)控整合的選擇性標(biāo)志的編碼基因替換。通常，將數(shù)千堿基對未被改變的旁側(cè)DNA(5′或3′末端)引入到載體中[參見例如Thomas和Capecchi，Cell，51503(1987)對同源重組載體的描述]。將載體引入胚胎干細(xì)胞系(例如通過電穿孔)，并選出引入了已經(jīng)與內(nèi)源性DNA同源重組過的DNA的細(xì)胞[參見例如，Li等，Cell，69915(1992)]。接著，將選出的細(xì)胞注入動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)的胚囊中，以形成聚集嵌合體[參見例如，Bradley，in Teratocarcinomas和Embryonic Stem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson編著(IRL，Oxford，1987)，113-152頁]。將嵌合胚胎植入適宜的假妊娠雌性養(yǎng)育動(dòng)物體內(nèi)，胚胎生長到足月即成為″基因敲除″動(dòng)物。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，鑒定出在其干細(xì)胞中攜帶有同源重組DNA的子代動(dòng)物，用這些子代動(dòng)物繁殖出在所有動(dòng)物細(xì)胞中均含有同源重組DNA的動(dòng)物?；蚯贸齽?dòng)物的特征在于，例如，抵御某些病理病癥的能力和由于動(dòng)物缺乏多肽而發(fā)生病理病癥。
對于本發(fā)明，建立基因敲除小鼠是為了研究TCCR激動(dòng)/拮抗Th1和/或Th2免疫應(yīng)答及其介導(dǎo)的病癥的效果。
5.嵌合受體另外，為了測定具有未知配體的受體發(fā)出信號的效果，可以對嵌合受體再改造。嵌合受體是檢驗(yàn)受體功能而不分離配體的證明手段，Chang等，Mol.Cell Biol.18(2)896-905(1998)。
6.免疫佐劑治療在一實(shí)施方案中，本發(fā)明免疫刺激化合物可用于腫瘤(癌)治療的免疫佐劑療法中。目前已很好地建立了識別人腫瘤特異抗原的T細(xì)胞。由MAGE、BAGE和GAGE基因家族編碼的一組腫瘤抗原，在所有成人正常組織中是不活動(dòng)的，但是在腫瘤如黑色素瘤、肺腫瘤、頭頸部腫瘤和膀胱癌中卻大量表達(dá)，DeSmet，C.et aL，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，937149。已經(jīng)證實(shí)，T細(xì)胞的共同刺激在體內(nèi)和體外均誘導(dǎo)腫瘤消退和抗腫瘤反應(yīng)，Melero，I.等，Nature Medicine(1997)3682；Kwon，E.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)948099；Lynch，D.H.等，Nature Medicine(1997)3625；Finn，O.J.和Lotzc，M.T.，J Immunol.(1998)LI114。本發(fā)明刺激性化合物可作為佐劑單獨(dú)施用或與生長調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒性劑或化療劑一起施用，以刺激T細(xì)胞增殖/活化和針對腫瘤抗原的抗腫瘤反應(yīng)。可按照已知的給藥方案來施用生長調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒性劑或化療劑。本發(fā)明化合物的免疫刺激活性允許減少生長調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞毒性劑或化療劑的用量，從而潛在地降低了對患者的毒性。
7.候選藥物篩選試驗(yàn)候選藥物篩選試驗(yàn)，目的是鑒定與由本文確定的TCCR核酸或其生物活性變體編碼的多肽結(jié)合或復(fù)合的化合物，或者相反，鑒定那些干擾基因編碼的多肽與其它細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用的化合物。此類篩選試驗(yàn)包括使用高通過量化學(xué)數(shù)據(jù)庫篩選分析，使之特別適于鑒定小分子候選藥物?？紤]到的小分子包括合成的有機(jī)或無機(jī)化合物，包括肽，特別是可溶性肽、(多)肽-免疫球蛋白融合體，和尤其是抗體，包括但不限于多克隆抗體和單克隆抗體以及抗體片段、單鏈抗體、抗-獨(dú)特型抗體和嵌合抗體或人源化抗體或片段，以及人抗體和抗體片段。
試驗(yàn)可按照多種方式進(jìn)行，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合分析、生化篩選分析、免疫測定和基于細(xì)胞的分析，這些分析方法在本領(lǐng)域已被很好描述。本文中所有的候選藥物篩選試驗(yàn)均具有共同的特性，那就是在控制條件下將候選藥物與TCCR多肽接觸足夠時(shí)間，以使兩種分子相互作用。
在結(jié)合分析中，相互作用是結(jié)合，從反應(yīng)混合物中分離或檢測形成的復(fù)合物。既然本發(fā)明TCCR多肽是受體，那么TCCR ECD片段也適用于鑒定候選藥物，后者包括TCCR變體、TCCR拮抗劑和/或激動(dòng)劑。在一特定實(shí)施方案中，通過共價(jià)或非-共價(jià)附著方式，把由本文鑒定的基因編碼的多肽或候選藥物固定在固相上，如固定微量滴定板上。非-共價(jià)附著，一般通過用TCCR多肽溶液包封固體表面并進(jìn)行干燥而實(shí)現(xiàn)?；蛘?，固定抗體，例如固定的對TCCR多肽具有特異性的單克隆抗體，可用于使TCCR多肽固定到固體表面。試驗(yàn)這樣進(jìn)行向固定組分中加入非固定組分，所述非固定組分可以標(biāo)記上可檢測的標(biāo)記物，所述固定組分譬如含有使多肽固著的組分的被包封表面。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，除去未反應(yīng)的組分(例如，通過洗滌方式)，并檢測固著在固體表面的復(fù)合物。當(dāng)原來非固定組分帶有可檢測標(biāo)記物時(shí)，檢測到固定在表面的標(biāo)記物，就表明復(fù)合物形成。如果原來非-固定組分沒有攜帶標(biāo)記物，則可以檢測復(fù)合，例如，通過使用與固定復(fù)合物特異結(jié)合的抗體來進(jìn)行檢測。
如果候選化合物與本文確定的特定TCCR蛋白相互作用但是又不與之結(jié)合，那么，使用已知的檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法來分析與TCCR蛋白的相互作用。此類分析方法包括慣常的方法，例如，交聯(lián)、共-免疫沉淀和通過梯度或?qū)游鲋墓?純化。此外，按照Fields與其同事(Fields和Song，Nature(340245-246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578-9582(1991))和Chevray和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895789-5793(1991)公開的方法，使用酵母-基遺傳系統(tǒng)可以檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。許多轉(zhuǎn)錄激活劑，如酵母GAL4，它由兩個(gè)完全分散的分子結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其一作為DNA-結(jié)合區(qū)，另一個(gè)作為激活轉(zhuǎn)錄的區(qū)。前述出版物中描述的酵母表達(dá)系統(tǒng)(一般指″二因子雜合系統(tǒng)″)利用此特性，并使用兩個(gè)雜交蛋白，其一的靶蛋白質(zhì)與GAL4的DNA-結(jié)合區(qū)融合，另一個(gè)的候選激活蛋白質(zhì)與激活區(qū)融合。在GAL4-激活的增強(qiáng)子控制下GAL1-lacZ報(bào)告基因的表達(dá)，依賴于通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用重建的GAL4活性。用β-半乳糖苷酶的顯色底物檢測含有相互作用多肽的菌叢。從Clontech可以商購利用二因子雜合技術(shù)鑒定兩個(gè)特異蛋白質(zhì)間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的全套試劑盒(MATCHMAKERTM)。該系統(tǒng)也可被擴(kuò)展到描繪參與特異蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，以及對于這些相互作用起關(guān)鍵作用的精確氨基酸殘基的圖譜。
為了尋找干擾本文確定的TCCR多肽與其它細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外組分相互作用的化合物，通常在控制條件下，制備含有基因產(chǎn)物和細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外組分產(chǎn)物的反應(yīng)混合物，使兩種產(chǎn)物相互作用和結(jié)合一定時(shí)間。為了測試候選化合物抑制上述相互作用的能力，在含有和不含有受試化合物的條件下進(jìn)行反應(yīng)。另外，可把安慰劑加入到第三反應(yīng)混合物中，作為陽性對照。按照上述方法，監(jiān)測混合物中受試化合物與細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外組分之間的結(jié)合(復(fù)合物形成)。在對照反應(yīng)中有復(fù)合物形成，而在含有受試化合物的反應(yīng)混合物中沒有復(fù)合物形成，則表明受試復(fù)合物干預(yù)受試化合物與其配伍化合物之間的相互作用。
8.治療免疫相關(guān)疾病的組合物和方法適宜于治療免疫相關(guān)疾病(例如，Th1-和/或Th2-介導(dǎo)的病癥)的組合物，包括但不限于抑制或刺激免疫功能的蛋白質(zhì)、抗體、小的有機(jī)分子、肽、磷肽、反義分子和核酶分子、三鏈螺旋分子等，所述免疫功能例如T細(xì)胞增殖/活化、淋巴因子釋放或免疫細(xì)胞浸潤。
舉例來說，反義RNA和RNA分子通過與靶mRNA雜交和阻止蛋白質(zhì)翻譯而直接阻斷mRNA翻譯。當(dāng)使用反義DNA時(shí)，優(yōu)選得自翻譯起始位點(diǎn)(例如靶基因核苷酸序列約-10～+10位)的寡脫氧核糖核苷酸。
核酶是能夠催化RNA特異性裂解的具有酶性質(zhì)的RNA分子。核酶通過序列-特異性雜交于靶RNA互補(bǔ)鏈，接著通過核酸內(nèi)裂解而發(fā)揮作用。使用已知技術(shù)，可以鑒定位于潛在RNA靶內(nèi)的特異核酶裂解位點(diǎn)。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)請參見例如Rossi，Current Biology，4469-471(1994)，和PCT出版物WO97/33551(1997年9月18日公布)。
用于抑制轉(zhuǎn)錄的三鏈螺旋構(gòu)型的核酸分子，應(yīng)當(dāng)是單鏈并由脫氧核苷酸構(gòu)成。這些寡核苷酸的堿基組成是設(shè)計(jì)好的，這樣它通過Hoogsteen堿基對原則促進(jìn)三鏈螺旋的形成，這一般需要雙螺旋中一條鏈上的嘌呤或嘧啶相當(dāng)大的延伸。更詳細(xì)情況請參見例如，PCT出版物WO 97/33551，出處同上。
用上述討論的篩選試驗(yàn)中的任何一個(gè)或其任何聯(lián)合，和/或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何其它篩選技術(shù)，可以鑒定這些分子。
本文描述的TCCR多肽、激動(dòng)劑和拮抗劑(TCCR分子)，也可用作治療劑。按照已知的方法，通過TCCR分子與可藥用載體聯(lián)合，可將本發(fā)明TCCR分子制備成有用的藥物組合物。為了治療制劑貯存方便，將具有所需純度的活性組分與任選的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(Reminaton′sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.編著(1980))，制備成冷凍干燥制劑或或水溶液形式?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑，在所用劑量和濃度范圍對接受者沒有毒性，其包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷酰胺、天門冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物如葡萄糖甘露糖或糊精；螫合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這可以在冷凍干燥和重新配制之前或之后通過除菌濾膜過濾而輕易實(shí)現(xiàn)。
本文的治療組合物一般盛放在具有無菌存取口的容器中，例如該容器是靜脈注射袋或帶有能通過皮下注射針穿刺的塞子的小瓶。
給藥途徑與已知方法一致，例如注射或靜脈輸注、腹膜內(nèi)、鹵內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或損傷內(nèi)(intralesional)給藥、局部用藥或使用持續(xù)釋放系統(tǒng)給藥。
本發(fā)明藥物組合物的劑量和所需藥物濃度將依預(yù)想的特定用途而異。決定適宜劑量或給藥途徑是普通內(nèi)科醫(yī)師完全能夠很好勝任的事情。動(dòng)物試驗(yàn)為決定治療人類患者所用劑量提供可靠指導(dǎo)?？砂凑誝acobi等編著的Toxicokinetics and New Drug Development(Pergamon Press，New York 1989)一書中，Mordenti，J.和Chappell在W.″The use of interspecies scaling intoxicokinetics″第42-96頁所給出的方法，換算種屬間有效劑量的比例。
體內(nèi)施用TCCR分子時(shí)，取決于給藥途徑，每日標(biāo)準(zhǔn)劑量范圍為約10ng/kg至高達(dá)100mg/kg哺乳動(dòng)物體重或更多，優(yōu)選地約1μg/kg/日～10mg/kg/日。文獻(xiàn)提供了有關(guān)特定劑量和給藥方法的指導(dǎo)，參見例如美國專利4657760；5206344或5225212。可以預(yù)期對于不同療法和不同病癥而言，不同制劑能夠奏效，并且意欲治療特定器官或組織的給藥使得以不同于施用于其它器官或組織的方式進(jìn)行釋放成為必需。
當(dāng)期望TCCR分子在具有適宜于治療需要施用TCCR分子的任何疾病或病癥的釋放特性的制劑中持續(xù)釋放給藥時(shí)，考慮使用微囊包封。持續(xù)釋放用的重組蛋白質(zhì)微囊包封已被成功地用于人生長激素(rhGH)、干擾素-α、-β、-γ(rhIFN-α，-β，-γ)、白介素-2和MN rgp 120的持續(xù)釋放。Johnson等，Nat.Med.，2795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，271221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technologv 8755-758(1990)；在Powell和Newman編著的Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach(Plenum PressNew York，1995)一書中第439-462頁，Cleland，″Design and Production of SingleImmunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems″；WO 97/03692，WO 96/40072，WO 96/07399；和美國專利5654010。
使用聚乳酸-共羥基乙酸(PLGA)聚合物來制備TCCR分子的持續(xù)釋放制劑，該聚合物具有生物相容性很寬范圍的生物降解特性。PLGA的降解產(chǎn)物，即乳酸和羥基乙酸，在體內(nèi)被快速清除。而且，可以根據(jù)該聚合物的分子量和構(gòu)成來調(diào)節(jié)其降解特性，可以是數(shù)月到數(shù)年不等。進(jìn)一步信息見M.Chasin和R.Langer(編著)，Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems(Marcel DekkerNew York，1990)一書中第1-41頁，Lewis，″Controlled releaseof active agents from lactide/glycolide polymer″。
9.TCCR激動(dòng)劑和拮抗劑的鑒定發(fā)明包括篩選化合物的方法，以鑒定那些模擬或增強(qiáng)TCCR多肽效應(yīng)(激動(dòng)劑)或者阻止或抑制TCCR多肽一種或多種功能或活性(拮抗劑)的化合物。優(yōu)選地，此類拮抗劑和激動(dòng)劑是TCCR變體、肽片段小分子、反義寡核苷酸(DNA或RNA)或抗體(單克隆抗體、人源化抗體、特異抗體、單鏈抗體、異源偶聯(lián)抗體或前述這些抗體的片段)。此外，TCCR拮抗劑可包括潛在的TCCR配體，而潛在的TCCR激動(dòng)劑可包括可溶性TCCR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)。
拮抗劑和/或激動(dòng)劑候選藥物的篩選試驗(yàn)，目的是鑒定與由本文確定的基因編碼的TCCR多肽結(jié)合或復(fù)合的化合物，或者相反，鑒定那些干擾編碼多肽與其它細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用的化合物。此類篩選試驗(yàn)包括使用高通過量化學(xué)數(shù)據(jù)庫篩選分析，使之特別適于鑒定小分子候選藥物。
試驗(yàn)可按照任何方式進(jìn)行，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合分析、生化篩選分析、免疫測定和基于細(xì)胞的分析，這些分析方法在本領(lǐng)域已被很好描述。
本文所述篩選拮抗劑的試驗(yàn)的共同之處是在控制條件下，使候選藥物與TCCR多肽接觸足夠時(shí)間以使得這兩種組分充分相互作用。
適宜于鑒定TCCR拮抗劑和激動(dòng)劑的有用實(shí)例已在前面第7.候選藥物篩選試驗(yàn)中確定。
作為拮抗劑試驗(yàn)的附加實(shí)例，可將TCCR多肽與被篩選化合物一起加入到細(xì)胞中，一定活性和能力的化合物抑制共存的TCCR多肽的有關(guān)活性，則表明化合物是TCCR多肽的拮抗劑?；蛘撸谶m當(dāng)條件下使TCCR多肽和潛在拮抗劑與結(jié)合在膜上的TCCR多肽受體或重組受體結(jié)合，通過競爭性抑制實(shí)驗(yàn)來檢測拮抗劑?？蓸?biāo)記TCCR多肽，如放射性標(biāo)記，這樣，與受體結(jié)合的TCCR多肽分子的數(shù)量，就可用于測定潛在拮抗劑的效力。使用本領(lǐng)域已知的眾多方法，例如，配體淘選和FACS分選，可以鑒定編碼受體的基因。Coligan等，Current Protocols in Immun.，1(2)Chapter 5(1991)。優(yōu)選使用表達(dá)克隆，其中多聚腺苷酸化RNA是從對TCCR多肽易感細(xì)胞中制備的，由該RNA建立的cDNA文庫被分成數(shù)個(gè)庫，用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞或其它對TCCR多肽不易感的細(xì)胞。使玻璃載波片上生長的轉(zhuǎn)染細(xì)胞與標(biāo)記的TCCR多肽接觸?？捎酶鞣N方法標(biāo)記TCCR多肽，包括位點(diǎn)特異蛋白激酶識別位點(diǎn)的碘化或包埋(inclusion)。固定和孵育后，載玻片接受放射自顯影分析。鑒定陽性庫，制備亞-庫(sub-pool)，并使用交互作用性亞-庫進(jìn)行再轉(zhuǎn)染，重新進(jìn)行篩選過程，直至得到編碼推定受體的單個(gè)克隆。
在拮抗劑另一分析方法中，在候選化合物存在的條件下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞或表達(dá)受體的膜制品與標(biāo)記的TCCR多肽孵育。然后測定化合物增強(qiáng)或阻斷相互作用的能力。
潛在拮抗劑的更特異實(shí)例，包括與免疫球蛋白和TCCR多肽的融合物結(jié)合的寡核苷酸，特別是抗體，包括但不限于多克隆和單克隆抗體及抗體片段、單鏈抗體、抗-獨(dú)特型抗體，和嵌合抗體或人源化抗體或抗體片段，以及人抗體和抗體片段?；蛘?，潛在拮抗劑是密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如，TCCR多肽的變種，后者識別受體但不引起效應(yīng)，從而競爭性抑制TCCR多肽的作用。最后，另一潛在TCCR拮抗劑是TCCR ECD，后者與可利用的配體競爭，有效地使天然TCCR受體信號釋放(free)。
另一潛在TCCR多肽拮抗劑是使用反義技術(shù)制備的反義RNA或DNA構(gòu)建體，其中例如，反義RNA或DNA分子通過與靶mRNA雜交和阻止蛋白質(zhì)翻譯，起著直接阻斷mRNA翻譯的作用。通過三鏈螺旋結(jié)構(gòu)形成或反義DNA或RNA，反義技術(shù)可用于控制基因表達(dá)，兩種方法均建立在多聚核苷酸與DNA或RNA結(jié)合的基礎(chǔ)上。
例如，多聚核苷酸序列的5′編碼部分，該部分編碼本文所述成熟TCCR多肽，被用于設(shè)計(jì)約10～40個(gè)堿基對長度的反義RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被設(shè)計(jì)成參與轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)的互補(bǔ)鏈(三鏈螺旋參見Lee等，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney等，Science，241456(1988)；Dervan等，Science，2511360(1991))，由此阻止轉(zhuǎn)錄和TCCR多肽產(chǎn)生。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)與mRNA雜交，阻斷mRNA分子翻譯成TCCR多肽(反義，見Okano，Neurochem.，56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑(CRC PressBoca Raton，F(xiàn)L，1988)。也可把上述寡核苷酸釋放入細(xì)胞中，這樣反義RNA或DNA可在體內(nèi)表達(dá)，而抑制TCCR多肽的產(chǎn)生。當(dāng)使用反義DNA時(shí)，優(yōu)選衍生自翻譯起始位點(diǎn)的寡脫氧核苷酸，例如，靶基因核苷酸序列的約-10和+10位。
潛在的拮抗劑包括與活性位點(diǎn)結(jié)合的小分子、受體結(jié)合位點(diǎn)、或生長因子或TCCR多肽其它相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)，從而阻斷TCCR多肽的正常生物活性。小分子的實(shí)例包括但不限于，小肽或類-肽分子，優(yōu)選溶解的肽和合成的非-肽有機(jī)或無機(jī)化合物。
核酶是能夠催化RNA特異性裂解的具有酶性質(zhì)的RNA分子。核酶通過序列-特異性雜交于靶RNA互補(bǔ)鏈，接著通過核酸內(nèi)裂解而發(fā)揮作用。使用已知技術(shù)，可以鑒定位于潛在RNA靶內(nèi)的特異核酶裂解位點(diǎn)。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)請參見例如Rossi，Current Biology，4469-471(1994)，和PCT出版物WO97/33551(1997年9月18日公布)。
用于抑制轉(zhuǎn)錄的三鏈螺旋構(gòu)型的核酸分子，應(yīng)當(dāng)是單鏈并由脫氧核苷酸構(gòu)成。這些寡核苷酸堿基組成是設(shè)計(jì)好的，這樣它通過Hoogsteen堿基對原則促進(jìn)三鏈螺旋的形成，這一般需要雙螺旋中一條鏈上的嘌呤或嘧啶相當(dāng)大的延伸。更詳細(xì)情況請參見例如，PCT出版物WO 97/33551，出處同上。
用上述討論的任何一個(gè)或多個(gè)篩選試驗(yàn)，和/或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何其它篩選技術(shù)，可以鑒定這些分子。
10.TCCR和基因治療也可將編碼TCCR多肽的核酸用于基因治療。在基因治療應(yīng)用中，將基因引入細(xì)胞以便達(dá)到在體內(nèi)合成治療有效的基因產(chǎn)物，例如置換缺陷基因。″基因治療″既包括經(jīng)單次治療就可獲得永久效果的常規(guī)基因治療，也包括基因治療劑的給藥，后者涉及一次或重復(fù)多次施用治療有效量的DNA或mRNA。反義RNA和DNA可用作阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)的治療劑。業(yè)已證明，短鏈反義寡核苷酸可整合入細(xì)胞中，在所述細(xì)胞中，短鏈反義寡核苷酸起抑制劑的作用，而不論由于細(xì)胞膜的限制性攝取所導(dǎo)致其低細(xì)胞內(nèi)濃度如何。(Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834143-4146)?？尚揎椆押塑账嵋栽鰪?qiáng)其攝取，例如用不帶電荷的基團(tuán)取代帶陰性電荷的磷酸二酯。
有各種可利用的技術(shù)來把核酸引入到活細(xì)胞中。技術(shù)依是否將核酸轉(zhuǎn)移進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞或意欲的宿主體內(nèi)細(xì)胞中而異。將核酸轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物體外細(xì)胞的適宜技術(shù)，包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀法等。目前流行的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，包括用病毒(通常為逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體轉(zhuǎn)染和用病毒包衣蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Dzau等，Trends in Biotechnology 11，205-210)。有些情況下，希望提供帶有針對靶細(xì)胞的物質(zhì)的核酸源，所述物質(zhì)如對細(xì)胞表面膜蛋白具有特異性的抗體，或靶細(xì)胞上受體的配體等。使用脂質(zhì)體時(shí)，將與參與胞吞的細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)用作靶向和/或促進(jìn)攝取的物質(zhì)，例如對特定型細(xì)胞具有向性的病毒殼體蛋白或其片段、在循環(huán)中發(fā)生內(nèi)化的蛋白質(zhì)的抗體、靶向于細(xì)胞內(nèi)定位(localization)并增加細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。有關(guān)受體-介導(dǎo)的胞吞的技術(shù)在例如Wu等，J.Biol.Chem.262，4429-4432(1987)；和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)中有描述。關(guān)于基因標(biāo)志和基因治療方案的綜述，請參見Anderson等，Science 256，808-813(1992)。
11.抗體本發(fā)明進(jìn)一步提供抗-TCCR抗體。例舉性抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、雙特異抗體和異源偶聯(lián)抗體。
i.多克隆抗體抗-TCCR抗體包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所已知。多克隆抗體可在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生，例如，通過一次或多次注射致免疫劑，如果需要，可加入佐劑。通常，對哺乳動(dòng)物皮下或腹膜內(nèi)多次注射致免疫劑和/或佐劑。致免疫劑可包括TCCR多肽或其融合蛋白。將致免疫劑與針對所免疫的哺乳動(dòng)物具有免疫原性的蛋白進(jìn)行偶聯(lián)是有效的。所述免疫原性蛋白的實(shí)例包括但不限于匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑?？梢允褂玫淖魟┑膶?shí)例包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷脂酰脂質(zhì)A，合成的海藻糖雙白喉菌酸酯(dicorynomycolate))。無需繁瑣的試驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員就可選擇致免疫方案。
ii.單克隆抗體或者，抗-TCCR抗體是單克隆抗體?？梢允褂秒s交瘤方法制備單克隆抗體，如Kohler和Milstein在Nature，256495(1975)中描述的方法。在雜交瘤方法中，通常用致免疫劑免疫小鼠、倉鼠或其它適宜宿主動(dòng)物，以引發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生將與致免疫劑特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞?；蛘撸隗w外致敏淋巴細(xì)胞。
致免疫劑通常包括TCCR多肽或其融合蛋白。一般而言，如果需要來源于人的細(xì)胞，則使用外周血淋巴細(xì)胞(“PBLs”)，如果需要非人哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞，那么就使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。然后，使用適宜的融合試劑如聚乙二醇，將淋巴細(xì)胞與無限增殖細(xì)胞系融合，從而形成雜交瘤細(xì)胞[Goding，單克隆抗體Principles和Practice，Academic Press，(1986)59-103頁]。無限增殖細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是嚙齒類、牛和人類起源的骨髓瘤細(xì)胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系?？稍谶m宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的無限增殖細(xì)胞生長或生存的物質(zhì)。例如，母代細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤的培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤、氨蝶呤和胸苷(″HAT培養(yǎng)基″)，這些物質(zhì)抑制HGPRT-缺陷型細(xì)胞生長。
優(yōu)選的無限增殖細(xì)胞系，是那些有效融合、支持篩選出的抗體-生成細(xì)胞穩(wěn)定地高水平表達(dá)抗體，并且對培養(yǎng)基如HAT敏感的細(xì)胞系。更優(yōu)選的無限增殖細(xì)胞系是小鼠骨髓瘤系，后者可得自例如Salk Institute CellDistribution Center，San Diego，California和美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，Virginia。人骨髓瘤和小鼠-人雜交骨髓瘤細(xì)胞系也已用于產(chǎn)生人單克隆抗體[Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等，Monocloneantibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，(1987)pp.51-63]。
接下來，可以檢定培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中是否存在直接抗TCCR的單克隆抗體。優(yōu)選地，用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(yàn)如放免分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，來測定雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。這些技術(shù)和試驗(yàn)分析方法是本領(lǐng)域所已知的。使用例如Scatchard analysisof Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107220(1980)公開的方法，可以測定單克隆抗體的結(jié)合親和力。
鑒定出所需的雜交瘤細(xì)胞之后，經(jīng)有限稀釋法將克隆進(jìn)行亞克隆處理并采用標(biāo)準(zhǔn)方法使之生長[Goding，出處同上]。用于此目的適宜的培養(yǎng)基包括例如，Dulbecco′s改進(jìn)的Eagle′s培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基?；蛘?，雜交瘤細(xì)胞可在哺乳動(dòng)物體內(nèi)以腹水形式生長。
使用常規(guī)免疫球蛋白純化方法，例如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、滲析或親和層析，可以從培養(yǎng)基或腹水中分離或純化由亞克隆分泌的單克隆抗體。
也可使用重組DNA方法生產(chǎn)單克隆抗體，例如在美國專利4816567中描述的方法。使用常規(guī)技術(shù)(例如，使用能夠與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)，很容易地分離編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA并進(jìn)行序列測定。本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞作為此DNA的優(yōu)選來源。一旦分離出該DNA，就可將其植入到表達(dá)載體中，然后用后者轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞如猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以便在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。也可對DNA進(jìn)行修飾，例如人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列被相應(yīng)的鼠序列置換[美國專利4816567；Morrison等，出處同上]，或者將非-免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價(jià)連接到免疫球蛋白的編碼序列上?？捎么祟惙?免疫球蛋白多肽取代本發(fā)明抗體的恒定區(qū)，或者取代本發(fā)明抗體一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，以產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體。
抗體可以是單價(jià)抗體。制備單價(jià)抗體的方法為本領(lǐng)域所已知。例如，有一個(gè)方法涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾后重鏈的重組表達(dá)。通常在Fc區(qū)的任何位點(diǎn)將重鏈截短，從而防止重鏈交聯(lián)。或者，用其它氨基酸殘基代替相關(guān)的半胱氨酸殘基或者半胱氨酸殘基缺失以防止交聯(lián)。
體外方法也適于制備單價(jià)抗體。使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)可以完成抗體消化而產(chǎn)生抗體片段，特別是Fab片段。
iii.人抗體和人源化抗體本發(fā)明抗-TCCR抗體進(jìn)一步包括人源化抗體或人抗體。非-人(例如小鼠)的人源化抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其包含非人免疫球蛋白最小序列的片段(如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列)。人源化抗體包括受者人免疫球蛋白(受者抗體)中互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基被具有所需特異性、親和力和性能的小鼠、大鼠、家兔等非人源物種抗體(供體抗體)的CDR殘基所取代。在一些實(shí)例中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)殘基由相應(yīng)的非人類殘基所取代。人源化抗體也可包含受者抗體或供體CDR或框架序列中均不存在的殘基。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變區(qū)的全部，其中CDR的全部或基本上全部對應(yīng)于非人免疫球蛋白的相應(yīng)部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗體還任選包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。詳見Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
人源化非-人抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。通常，人源化抗體中已導(dǎo)入一或多個(gè)源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為“引進(jìn)的”殘基，它們通常來自“引進(jìn)的”可變區(qū)。人源化過程基本如Winter及其同事(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))所述，用一個(gè)或多個(gè)CDR序列取代人類抗體的相應(yīng)序列來進(jìn)行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4816567)，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人類物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中一些CDR殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代。
使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)可以制備人抗體，所述方法包括噬菌體展示文庫[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991)]。也可使用Cole等和Boemer等描述的技術(shù)制備人單克隆抗體[Cole等，Monoclonal Antibody and Cancer Therapy，Alan R.Liss，(1985)第7頁，和Boerner等，J.Immunol.，147 186-95(1991)]。類似地，通過把人免疫球蛋白的基因座插入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如鼠來生產(chǎn)人抗體，所述宿主動(dòng)物的內(nèi)源性免疫球蛋白基因已被部分或全部滅活。攻擊后，觀察到人抗體產(chǎn)生，這在各個(gè)方面均與在人體所見的極為相似，包括基因重排、裝配和抗體所有組成成分。有關(guān)進(jìn)展在例如下列專利和科學(xué)出版物中作了描述美國專利5545807；5545806；5569825；5625126；5633425；5661016；Marks等，Bio/Technologv 10，779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368 856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnologv 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。
使用前述已知的選擇和/或誘變方法，也可以使抗體親和力成熟。優(yōu)選的親和力成熟抗體，較制備成熟抗體所用起始抗體(通常為鼠抗體、人源化抗體或人抗體)的親和力大5倍，更優(yōu)選10倍，甚至更優(yōu)選20或30倍。
iv.雙特異抗體雙特異抗體是單克隆抗體，優(yōu)選具有針對至少兩種不同抗原的結(jié)合特異性的人抗體或人源化抗體。在本發(fā)明中，一種結(jié)合特異性針對TCCR，另一種針對其它抗原，優(yōu)選針對細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或受體或受體亞單位。
制備雙特異抗體方法為本領(lǐng)域所已知。通常，雙特異性抗體的重組產(chǎn)生是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達(dá)，其中兩條重鏈具有不同特異性(Millstein等，Nature，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(細(xì)胞雜交瘤(quadroma))可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟來完成所述正確分子的純化。類似的方法公開在WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)中。
可將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)、CH2及CH3區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時(shí)，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染至適當(dāng)宿主生物。產(chǎn)生雙特異抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)內(nèi)容，請參見例如Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。
根據(jù)WO 96/27011所述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的異源二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補(bǔ)“溝”可通過將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產(chǎn)量比不想要的終產(chǎn)物如同型二聚體的高。
雙特異抗體可以制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab’)2雙特異抗體)。從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已有文獻(xiàn)描述。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接制備。Brennan等，Science，22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備片段的方法。這些片段在二巰基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在時(shí)被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab’片段被轉(zhuǎn)化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。然后，其中一種Fab’-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原成Fab’-硫醇，再與等分子量的其它Fab’-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固相化中的試劑。
Fab’片段可從大腸桿菌中直接回收并且經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)而形成雙特異性抗體。Shalaby等在J.Exp.Med.175217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab’)2分子的產(chǎn)生。每一Fab’片段分別從大腸桿菌中分泌出來，在體外被直接化學(xué)偶聯(lián)從而形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞結(jié)合，還能引發(fā)人類細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞對人乳腺腫瘤細(xì)胞的裂解活性。
直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)描述的“二價(jià)抗體”技術(shù)，提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無法配對。因此，同一片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。此外還報(bào)道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制備雙特異性抗體的策略。見Gruber等，免疫學(xué)雜志，1525368(1994)。還考慮了二價(jià)以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.，14760(1991)。
例證性雙特異性抗體可與本文指定的TCCR多肽上的兩種不同表位結(jié)合?；蛘撸蓪⒖?TCCR多肽臂與結(jié)合在白細(xì)胞上引發(fā)分子的臂結(jié)合，從而強(qiáng)化針對表達(dá)特定TCCR多肽細(xì)胞的細(xì)胞防御機(jī)制，所述引發(fā)分子如T細(xì)胞受體分子(CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG Fc受體(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒制劑定位至表達(dá)特定TCCR多肽的細(xì)胞上。這些抗體具有TCCR-結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒制劑或放射性同位素半抗原的臂，如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA。另一有關(guān)的雙特異抗體結(jié)合TCCR多肽并且進(jìn)一步結(jié)合組織因子(TF)。
v.異源偶聯(lián)抗體異源偶聯(lián)的抗體由兩個(gè)共價(jià)連接的抗體組成。有觀點(diǎn)認(rèn)為，這類抗體可用于將免疫細(xì)胞導(dǎo)向不想要的細(xì)胞(美國專利4676980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)?？煽紤]使用蛋白化學(xué)合成中已知方法，包括涉及使用交聯(lián)劑，在體外制備異源偶聯(lián)抗體。舉例來說，使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵，可以構(gòu)建免疫毒素。用于此目的適當(dāng)試劑的實(shí)例，包括免疫硫醇鹽和甲基-4-巰基，巰基butyrimidate以及例如在美國專利4676980中描述的那些。
vi.效應(yīng)物功能的工程改造在效應(yīng)物功能方面可能希望改進(jìn)本發(fā)明的抗體，以增強(qiáng)在治療(例如治療癌癥)時(shí)的效果。例如，可在Fc區(qū)域中引入半胱氨酸殘基，從而在該區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。這樣制得的均二聚體可能有改進(jìn)的內(nèi)化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞殺傷能力及依賴于抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見Caron等，J.Exp Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.1482918-2922(1992)。也可如Wolff等，Cancer Research 532560-2565(1993)描述的那樣，用異二聚功能性交聯(lián)劑來制備抗腫瘤活性增強(qiáng)的均二聚抗體?；蛘撸蓪⒖贵w工程改造成具有雙Fc區(qū)，從而可能增強(qiáng)補(bǔ)體裂解和ADCC能力。見Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design 3219-230(1989)。
vii.免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及含有與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的抗體的免疫偶聯(lián)物，所述細(xì)胞毒性劑如化療劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。
適用于制備這類免疫偶聯(lián)物的化療劑已在上文作過描述?？梢詰?yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制劑，白樹毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。多種放射性同位素可用于制備放射性偶聯(lián)的抗ErbB2抗體，實(shí)例包括Bi212、I131、In131、Y90和Re186。
抗體與細(xì)胞毒性劑的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，亞氨基硫烷(iminothiolane)(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二甲酯鹽酸鹽)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲酰基)己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科學(xué)2381098(1987)所述制備。C14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至抗體的偶聯(lián)劑之一。見WO94/11026。
在另一實(shí)施方案中，抗體可與組織預(yù)靶向中使用的“受體”(如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯(lián)，將該抗體-受體偶聯(lián)物施用于患者，之后用清除劑除去循環(huán)中未結(jié)合的偶聯(lián)物，再施用已偶聯(lián)了細(xì)胞毒性劑(如放射性核苷酸)的“配體”(如抗生物素蛋白)。
viii.免疫脂質(zhì)體本文公開的蛋白質(zhì)、抗體，還可制備成免疫脂質(zhì)體。含抗體的脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域已知方法制備，如Epstein等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 774030(1980)；美國專利4485045和4544545及1997年10月23日公開的WO97/38731。在美國專利5013566中公開了增加了循環(huán)時(shí)間的脂質(zhì)體。
特別有用的脂質(zhì)體，可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物經(jīng)反相蒸發(fā)法而制得。脂質(zhì)體擠壓通過限定孔徑的濾膜，獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab’片段，可如Martin等在J.Biol.Chem，257286-288(1982)中所述的那樣，經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。在所述脂質(zhì)體中可任選包含一種化療劑。見Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
ix.抗-TCCR-抗體的用途本發(fā)明抗-TCCR抗體具有多種用途。例如，抗-TCCR抗體可用于TCCR的診斷分析，譬如，檢測TCCR在特定細(xì)胞、組織或血清的表達(dá)?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的各種診斷分析試驗(yàn)，如競爭性結(jié)合試驗(yàn)、直接和間接夾心試驗(yàn)及異源或同源相進(jìn)行的免疫沉淀試驗(yàn)[Zola，Monoclonal Antibody技術(shù)指南，147-158頁(CRC Press，Inc.1987)]。還可將診斷中所用抗體標(biāo)記上可檢測部分?？蓹z測部分應(yīng)當(dāng)能夠直接或間接產(chǎn)生可測得信號。例如，可測得部分是放射性核素如3H、14C、32P、35S或125I，熒光或化學(xué)發(fā)光化合物如熒光素異硫氰酸鹽、藍(lán)光堿性蕊香紅或螢蟲素，或者酶如堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。本領(lǐng)域已知的將抗體與可檢測分偶聯(lián)的任何方法均可使用，包括在Hunter等，Nature，144945(1962)；David等，Biochemistry，131014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.，40219(1981)；和Nygren，J.Histochem.和Cytochem.，30407(1982)中描述的方法。
抗-TCCR抗體也適用于從重組細(xì)胞培養(yǎng)物或天然來源中親和純化TCCR。在該過程中，使用本領(lǐng)域已知方法將抗TCCR抗體固定在適當(dāng)載體上，所述載體如交聯(lián)葡聚糖樹脂或?yàn)V紙。然后，將固定的抗體與含有欲純化TCCR的樣品接觸，接下來用能夠基本上將樣品中與固定載體結(jié)合的TCCR之外的所有物質(zhì)去除的適宜溶劑洗滌載體。最后，用能從抗體中釋出TCCR的另一適宜溶劑洗滌載體。
10.藥物組合物為治療免疫相關(guān)疾病，可以藥學(xué)組合物形式施用本發(fā)明活性分子、多肽和抗體以及前述用篩選試驗(yàn)鑒定的其它分子。
為了靶向TCCR的細(xì)胞內(nèi)部分或靶向仍位于細(xì)胞內(nèi)的TCCR多肽，則優(yōu)選內(nèi)化抗體。另外，也可用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染物或脂質(zhì)體來把抗體或抗體片段釋放至細(xì)胞內(nèi)。使用抗體片段時(shí)，優(yōu)選與靶蛋白質(zhì)結(jié)合域特異結(jié)合的最小抑制性片段。例如，基于抗體可變區(qū)序列，可把肽分子設(shè)計(jì)為保持與靶蛋白質(zhì)序列結(jié)合能力。此類肽可以化學(xué)合成和/或用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。參見例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907889-7893(1993)。
活性分子優(yōu)選本發(fā)明多肽或抗體，其治療制劑如下制備將具有所需純度的抗體與任選的藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(雷氏藥學(xué)(Remington’sPharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.編(1980))混合，然后以凍干劑或含水劑的形式保存?？伤幱幂d體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對受治者無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯，如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，如吐溫TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以類似方式制備經(jīng)本發(fā)明篩選試驗(yàn)鑒定的化合物。
對于被治療的特定適應(yīng)征而言，如果必要，本文制劑也可含有一種以上的活性化合物，優(yōu)選那些彼此間具有互補(bǔ)活性而沒有不利影響的活性化合物。或者或另外，組合物可含有細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子或生長抑制劑。這些分子的聯(lián)合用量是對意欲治療目的而言的有效量。
也可將活性組分包封在按照例如凝聚技術(shù)或界面聚合技術(shù)制備的微膠囊中，例如，分別在膠態(tài)藥物釋放系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體，白蛋白微球體，微乳劑，納米顆粒和毫微膠囊)或粗滴乳化劑中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。這些技術(shù)公開在Remington′s PharmaceuticalSciences，16thedition，Osol，A.Ed.(1980)中。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這可以通過除菌濾膜過濾而輕易實(shí)現(xiàn)。
也可制備控釋制劑?？蒯屩苿┑倪m當(dāng)實(shí)例包括含有抗體的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠囊?？蒯屩苿?shí)例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。盡管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續(xù)釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間卻較短。當(dāng)膠囊化的抗體長時(shí)間停留在體內(nèi)時(shí)，它們會(huì)由于暴露在37℃水分下而變性或凝聚，從而導(dǎo)致生物活性損失，且免疫原性可能會(huì)改變?？梢愿鶕?jù)涉及的機(jī)理來設(shè)計(jì)穩(wěn)定化的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚的機(jī)理是通過硫代二硫鍵互換而形成了分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、自酸性溶液中凍干、控制濕度程度、采用合適的添加劑和開發(fā)特殊的聚合物基質(zhì)組合物來達(dá)到穩(wěn)定化。
11.治療方法考慮到將多肽、抗體和本發(fā)明其它活性化合物用于治療各種免疫相關(guān)疾病和病癥，如T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，包括那些以炎癥細(xì)胞浸潤到組織中，刺激T-細(xì)胞增殖，抑制T-細(xì)胞增殖，增加或降低或者抑制血管通透性為特征的疾病。
用多肽、抗體和本發(fā)明其它化合物治療的例證性病癥或障礙包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年慢性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化病(硬皮病)、特發(fā)性炎癥性肌病(皮肌炎，多肌炎)、斯耶格倫氏綜合征(Sjogretis syndrome)、全身性脈管炎、類肉瘤病、自身免疫性溶血性貧血(免疫性全血細(xì)胞減少，睡眠性血紅蛋白尿癥)、自身免疫性血小板減少癥(特發(fā)性血小板減少性子癜，免疫-介導(dǎo)的血小板減少癥)、甲狀腺炎(格雷夫斯病(Grave′s disease)，橋本甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)，幼年淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，萎縮性甲狀腺炎)、糖尿病、免疫-介導(dǎo)的腎臟疾病(腎小球腎炎，小管間質(zhì)性腎炎)、中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病(如多發(fā)性硬化，特發(fā)性脫髓鞘性多神經(jīng)病或格-巴二氏綜合征(Guillain-Barresyndrome)及慢性-炎癥性脫髓鞘性多神經(jīng)病)、肝膽管疾病(如傳染性肝炎(A、B、C、D、E型肝炎和其它非-親肝病毒性肝炎)，自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎，原發(fā)性膽汁性肝硬變，肉芽腫性肝炎和硬化性膽管炎)、炎性腸道疾病(潰瘍性結(jié)腸炎克羅恩氏病)、谷蛋白-敏感性腸病和惠普耳氏病(Whipple′sdisease)、自身免疫性或免疫-介導(dǎo)的皮膚病(包括大皰性皮膚病，多形紅斑和接觸性皮炎，牛皮癬)、過敏性疾病(如哮喘，過敏性鼻炎，特應(yīng)性皮炎，食物高敏癥和蕁麻疹)、肺免疫性疾病(如嗜酸細(xì)胞性肺炎，特發(fā)性肺纖維化癥和過敏性肺炎)、移植有關(guān)的疾病(包括移植排斥和移植物抗宿主病)。
在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，疾病的中樞介體是針對自身蛋白/組織的自體-反應(yīng)抗體的產(chǎn)生，接著發(fā)生免疫-介導(dǎo)的炎癥。抗體直接或間接介導(dǎo)組織損傷。盡管尚未證實(shí)T淋巴細(xì)胞直接參與組織損傷，但是T淋巴細(xì)胞在產(chǎn)生自體-反應(yīng)抗體的過程中是必需的。因此，疾病的發(fā)生是T淋巴細(xì)胞依賴性的。臨床上表現(xiàn)為累及多個(gè)器官和系統(tǒng)，包括腎、肺、肌肉骨骼系統(tǒng)、皮膚粘膜、眼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、胃腸道、骨髓和血液。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是主要累及多個(gè)關(guān)節(jié)滑膜以致造成關(guān)節(jié)軟骨損傷的慢性全身性自身免疫性炎性疾病。其發(fā)病是T淋巴細(xì)胞依賴性的并且與類風(fēng)濕因子的產(chǎn)生有關(guān)，所述類風(fēng)濕因子是直接針對自身IgG的自體-抗體，結(jié)果造成免疫復(fù)合物形成并在關(guān)節(jié)液和血液中達(dá)到很高水平。關(guān)節(jié)中的這些免疫復(fù)合物，可以誘導(dǎo)大量的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤進(jìn)入滑膜，繼而引起顯著的滑膜變化；關(guān)節(jié)腔隙/關(guān)節(jié)炎被類似細(xì)胞以及大量中性粒細(xì)胞浸潤。受累組織主要是關(guān)節(jié)，經(jīng)常呈對稱性。然而，也發(fā)生兩種主要形式的關(guān)節(jié)外疾病。一種是隨著關(guān)節(jié)疾病緊展而發(fā)生的關(guān)節(jié)外損害，代表性損害是肺纖維化、結(jié)節(jié)性脈管炎和皮膚潰瘍。第二種形式的關(guān)節(jié)外疾病是所謂的費(fèi)爾蒂綜合征(Felty′s syndrome)，它發(fā)生在RA疾病病程的晚期，有時(shí)出現(xiàn)在關(guān)節(jié)疾病已經(jīng)處于靜止期之后，涉及中性白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥和脾腫大。并可伴有多器官中伴隨梗塞形成的結(jié)節(jié)性脈管炎、皮膚潰瘍和壞疽?；颊呤芾奂瓣P(guān)節(jié)的皮下組織中還出現(xiàn)類風(fēng)濕結(jié)節(jié)；晚期結(jié)節(jié)具有被混合炎癥細(xì)胞浸潤圍繞的壞死中心。RA可發(fā)生的其它表現(xiàn)包括心包炎、胸膜炎、冠狀動(dòng)脈炎、伴有肺纖維化的腸性肺炎、干燥性角膜結(jié)膜炎和類風(fēng)濕結(jié)節(jié)。
幼年慢性關(guān)節(jié)炎，是常常低于16歲即開始發(fā)病的慢性特發(fā)性炎性疾病。其表型與RA有某些相似性；其中一些類風(fēng)濕因子陽性的患者分類為幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。該疾病再細(xì)分為三種主要類型少關(guān)節(jié)幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多關(guān)節(jié)幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和全身性幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎可以非常嚴(yán)重并且通常是破壞性的，因而導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)硬和生長遲緩。其它臨床表現(xiàn)包括慢性前眼色素層炎和系統(tǒng)性淀粉樣變性。
脊椎關(guān)節(jié)炎是一組具有一些共同臨床特征和與HLA-B27基因產(chǎn)物有共同關(guān)系的病癥。病癥包括強(qiáng)直性脊椎炎、萊特爾氏綜合征(反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎)、與炎性腸道疾病有關(guān)的關(guān)節(jié)炎、與牛皮癬有關(guān)的脊椎炎、幼年發(fā)病的脊椎關(guān)節(jié)炎和未分化型脊椎關(guān)節(jié)炎。區(qū)別特征包括伴有或不伴有脊椎炎的骶髂關(guān)節(jié)炎；炎性不對稱關(guān)節(jié)炎；與HLA-B27(血清學(xué)定義的I類MHCHLA-B基因座的等位基因)有關(guān)的癥狀；眼部炎癥和與其它類風(fēng)濕性疾病有關(guān)的自體抗體的缺乏。推斷誘導(dǎo)疾病的最關(guān)鍵細(xì)胞細(xì)胞是CD8+T淋巴細(xì)胞，它是靶向I類MHC分子呈遞的抗原的細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞可能對I類MHC等位基因HLA-B27進(jìn)行應(yīng)答，就好象后者是MHC I類分子表達(dá)的外來肽一樣。已有這樣的假定HLA-B27的表位可能摹擬細(xì)菌性或其它微生物表位，從而誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
系統(tǒng)性硬化病(硬皮病)的病因?qū)W尚不清楚。該疾病的標(biāo)志是皮膚硬化；皮膚硬化很可能是由活動(dòng)性炎癥過程引起的。硬皮病可以是局部的或者是全身性的；血管病變是共有的，而且微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是系統(tǒng)性硬化病發(fā)展的早期且重要事件；血管損傷可以是免疫介導(dǎo)的。皮膚病損中存在單核細(xì)胞浸潤和許多患者存在抗-核抗體的事實(shí)，暗示著其發(fā)病的免疫學(xué)基礎(chǔ)。皮膚病損中成纖維細(xì)胞的細(xì)胞表面ICAM-1常常上調(diào)，提示T細(xì)胞與這些細(xì)胞的相互作用可能在疾病的發(fā)病中起著某種作用。累及的其它器官包括，胃腸道導(dǎo)致異常蠕動(dòng)/能動(dòng)性的平滑肌萎縮和纖維化；腎臟累及小弓形動(dòng)脈和小葉間動(dòng)脈的同心性內(nèi)皮下內(nèi)膜增殖，造成腎皮質(zhì)血流減少，導(dǎo)致蛋白尿、氮質(zhì)血癥和高血壓；骨骼肌萎縮、間質(zhì)纖維化；炎癥；肺間質(zhì)性肺炎和間質(zhì)性纖維化；以及心臟收縮性帶狀壞死、瘢痕形成/纖維化。
包括皮肌炎、多肌炎等的特發(fā)性炎性肌病是不明病因?qū)е录∪鉄o力的慢性肌肉炎癥性病癥。肌肉損傷/炎癥常常是對稱性的和進(jìn)展性的。自體抗體與大多數(shù)類型有關(guān)。這些肌炎-特異性自體抗體直接對抗和抑制參與蛋白質(zhì)合成的組分、蛋白質(zhì)和RNA的功能。
斯耶格倫氏綜合征，是由于免疫-介導(dǎo)性炎癥和繼而出現(xiàn)淚腺和唾液腺功能破壞的病癥。該疾病與炎性結(jié)締組織病有關(guān)或者伴隨有炎性結(jié)締組織病。疾病與抗Ro抗原和抗La抗原的自體抗體的產(chǎn)生有關(guān)，所述兩個(gè)抗原均是小RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。病變導(dǎo)致干燥性角膜結(jié)膜炎、口腔干燥癥，伴有或相關(guān)的其它臨床表現(xiàn)包括膽汁性肝硬化、外周或感覺神經(jīng)病以及可觸知的紫癜。
全身性脈管炎，是主要病變?yōu)檠装Y并繼發(fā)血管損傷從而導(dǎo)致由受累血管供血的組織發(fā)生局部缺血/壞死/變性并在一些情況下最終以器官機(jī)能障礙為結(jié)局的疾病。脈管炎也可作為免疫炎癥介導(dǎo)的疾病的二級損傷或后遺癥而存在，所述疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化病等，尤其是也與免疫復(fù)合物形成有關(guān)的疾病。屬于原發(fā)性全身性脈管炎疾病一組的疾病包括，全身性壞死性血管炎結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、變應(yīng)性脈管炎和肉芽腫病、多脈管炎；韋格內(nèi)氏肉芽腫病；淋巴瘤樣肉芽腫?。缓途藜?xì)胞動(dòng)脈炎。雜類脈管炎包括皮膚粘膜淋巴結(jié)節(jié)綜合征(MLNS或川崎病(Kawasaki′s disease))、孤立性CNS脈管炎、Behet′s疾病、閉塞性血栓性脈管炎(伯格氏病(Buerger′s disease))和皮膚壞死性血管炎。據(jù)信，所述大多數(shù)脈管炎的致病機(jī)制主要由于免疫球蛋白復(fù)合物在管壁沉積并繼而通過ADCC、補(bǔ)體活化二者之一或者二者共同誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)所致。
肉樣瘤病，是不明原因的以機(jī)體幾乎任何組織均存在上皮樣肉芽腫為特征的病癥；最常見的是累及肺。發(fā)病機(jī)理涉及疾病部位存留活化的巨噬細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞，并繼發(fā)由于這些類型細(xì)胞釋放的活性產(chǎn)物的局部和系統(tǒng)性釋放而致的慢性后遺癥。
自體免疫性溶血性貧血，包括自身免疫溶血性貧血、免疫性全血細(xì)胞減少和發(fā)作性睡眠性血紅蛋白尿癥，它是抗體與紅細(xì)胞(和有時(shí)包括血小板在內(nèi)的其它血細(xì)胞)表面表達(dá)的抗原發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的結(jié)果，并且是通過補(bǔ)體介導(dǎo)和/或ADCC/Fc-受體-介導(dǎo)的溶解去除那些抗體包被細(xì)胞的機(jī)理的反映。
自身免疫性血小板減少癥，包括血小板減少性紫癜和其它臨床背景中免疫-介導(dǎo)的血小板減少癥，其中血小板破壞/除去的發(fā)生是抗體或補(bǔ)體附著于血小板并繼而通過補(bǔ)體溶解、ADCC或者FC-受體介導(dǎo)的機(jī)理的結(jié)果。
甲狀腺炎，包括格雷夫斯病，橋本甲狀腺炎，幼年淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎和萎縮性甲狀腺炎，是對甲狀腺抗原自身免疫性應(yīng)答伴有與甲狀腺中存在并且常常是特異性的蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的抗體產(chǎn)生的結(jié)果。現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶ㄗ园l(fā)性模型大鼠(BUF和BB大鼠)和雞(肥胖雞種系)甲狀腺炎；誘導(dǎo)模型用甲狀腺球蛋白、甲狀腺微粒體抗原(甲狀腺過氧化物酶)免疫動(dòng)物。
I型糖尿病或胰島素-依賴性糖尿病是胰腺小島β細(xì)胞的自身免疫性破壞；該破壞是由自體抗體和自體-反應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的。胰島素抗體或胰島素受體也可產(chǎn)生胰島素-非-應(yīng)答表型。
免疫介導(dǎo)性腎臟疾病，包括腎小球性腎炎和小管間質(zhì)性腎炎，是抗體或T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的對腎組織損傷的結(jié)果，所述損傷是直接由于針對腎抗原的自體反應(yīng)抗體或T細(xì)胞產(chǎn)生所致，或者是間接地由于抗其它非-腎抗原的抗體和/或免疫復(fù)合物在腎臟沉積所致。因此，導(dǎo)致免疫-復(fù)合物形成的其它免疫-介導(dǎo)性疾病也可誘導(dǎo)作為間接后遺癥的免疫介導(dǎo)性腎臟疾病。
直接和間接免疫機(jī)制導(dǎo)致腎臟組織產(chǎn)生/誘導(dǎo)損傷發(fā)展的炎癥反應(yīng)，結(jié)果造成器官功能障礙并在某些情況導(dǎo)致腎衰。體液免疫和細(xì)胞免疫機(jī)制均參與損傷的發(fā)病機(jī)制。
中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病，包括多發(fā)性硬化、特發(fā)性脫髓鞘性多神經(jīng)病或格-巴二氏綜合征以及慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病，據(jù)信具有自身免疫性基礎(chǔ)，并且由于直接損傷少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或損傷髓磷脂而導(dǎo)致神經(jīng)脫髓鞘。在MS中，有證據(jù)表明疾病誘導(dǎo)和進(jìn)展取決于T淋巴細(xì)胞。多發(fā)性硬化是T淋巴細(xì)胞-依賴性的脫髓鞘疾病，并且具有復(fù)發(fā)-緩解性病程或者慢性進(jìn)展性病程。其病因?qū)W不明；然而，與病毒感染、遺傳素質(zhì)、環(huán)境因素和自身免疫均有關(guān)。病變包含主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤性巨噬細(xì)胞浸潤；病變處，CD4+T淋巴細(xì)胞是主要細(xì)胞類型。少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞死亡和繼發(fā)的脫髓鞘機(jī)制尚屬未知，但可能是由T淋巴細(xì)胞所驅(qū)動(dòng)。
炎性和纖維化肺病，包括嗜酸性粒細(xì)胞肺炎、特發(fā)性肺纖維化和過敏性肺炎，可能涉及錯(cuò)誤調(diào)節(jié)性(disregulated)免疫-炎癥反應(yīng)。抑制該反應(yīng)將有益于治療。
自身免疫性或免疫-介導(dǎo)的皮膚病，包括大泡性皮膚病、多形紅斑和由自體抗體介導(dǎo)的接觸性皮炎，其發(fā)生是T淋巴細(xì)胞-依賴性的。
牛皮癬是T淋巴細(xì)胞-介導(dǎo)的炎性疾病。病損處包括T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、抗原加工細(xì)胞以及一些中性白細(xì)胞浸潤。
過敏性疾病，包括哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、食物高敏癥和蕁麻疹，是T淋巴細(xì)胞依賴性的。這些疾病主要是由T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥、IgE介導(dǎo)的炎癥所致，或者由二者聯(lián)合介導(dǎo)所致。
移植相關(guān)疾病，包括移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)，是T淋巴細(xì)胞-依賴性的；抑制T淋巴細(xì)胞功能使疾病緩解。
干預(yù)免疫和/或炎癥反應(yīng)得以受益的其他疾病，包括但不限于病毒感染(包括但不限于AIDS，A、B、C、D、E型肝炎和皰疹)、細(xì)菌性感染、真菌感染和原蟲及寄生蟲感染(刺激MLR的分子(或衍生物/激動(dòng)劑)可治療性地用于增強(qiáng)對感染劑的免疫應(yīng)答)、免疫缺陷疾病(刺激MLR的分子/衍生物/激動(dòng)劑可治療性地用于增強(qiáng)對遺傳性、獲得性、感染(如HIV感染)導(dǎo)致的病癥的免疫應(yīng)答)，或醫(yī)原性(即由于化療所致)免疫缺陷，和瘤形成。
業(yè)已證實(shí)，某些人類癌癥患者產(chǎn)生針對腫瘤細(xì)胞上的抗原的抗體和/或T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。在腫瘤形成動(dòng)物模型中也已證實(shí)增強(qiáng)免疫應(yīng)答可導(dǎo)致排斥腫瘤或特別是腫瘤消退。在MLR中增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的分子，在體內(nèi)可用于增強(qiáng)抗瘤形成的免疫應(yīng)答。在MLR中增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的分子(或小分子激動(dòng)劑或以激動(dòng)方式作用于同一受體的抗體)，可治療性地用于治療癌癥。在MLR中抑制淋巴細(xì)胞反應(yīng)分子，在體內(nèi)也發(fā)揮作用，它是在抑制針對腫瘤的免疫應(yīng)答的瘤形成期間發(fā)揮作用；該分子或者由腫瘤細(xì)胞自身表達(dá)，或者由腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)其在其細(xì)胞它表達(dá)。此類抑制性分子的拮抗作用(或者通過抗體、小分子拮抗劑，或者通過其他手段)增強(qiáng)免疫-介導(dǎo)的腫瘤排斥。
此外，抑制具有原炎癥(proinflammatory)性質(zhì)的分子，有益于下述疾病的治療再灌注損傷；中風(fēng)；心肌梗塞；動(dòng)脈粥樣硬化；急性肺損傷；出血性休克；燒傷；敗血癥/膿毒性休克；急性腎小管壞死；子宮內(nèi)膜異位；退行性關(guān)節(jié)疾病和胰腺炎。
按照已知方法，如經(jīng)靜脈內(nèi)快速濃注或連續(xù)輸注一段時(shí)間，或者經(jīng)肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、腦脊柱內(nèi)注射(intracerobrospinal)、皮下注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射、滑膜腔內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、口服、局部施用或吸入(鼻內(nèi)吸入，肺內(nèi)吸入)途徑給藥，將本發(fā)明化合物如多肽或抗體施用于哺乳動(dòng)物，特別是人，多肽和抗體的靜脈或吸入給藥為優(yōu)選。
在免疫佐劑治療中，其它治療方案，如施用抗癌劑，可與本發(fā)明蛋白質(zhì)、抗體或化合物聯(lián)合給藥。例如，接受本發(fā)明免疫佐劑治療的患者，也可接受抗癌劑(化療劑)治療或放射治療。此類化療劑的配制和給藥方案，按照制造商的指示進(jìn)行或者由熟練的臨床醫(yī)師根據(jù)經(jīng)驗(yàn)決定。化療劑的配制和給藥方案在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)中也有描述?；焺┛梢栽诿庖咦魟┲盎蛑蠼o藥，或者二者同時(shí)給藥。此外，抗-雌激素化合物如他莫昔芬或抗-孕激素如奧那司酮(見EP 616812)，可按其已知用量給藥。
也期望施用抗其它免疫疾病相關(guān)或腫瘤相關(guān)的抗原的抗體，如將結(jié)合CD20、Cdlla、CD18、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4或血管內(nèi)皮因子(VEGF)的抗體?；蛘?，或另外，本文公開的結(jié)合同一個(gè)或二個(gè)或多個(gè)不同抗原的二個(gè)或多個(gè)抗體，可聯(lián)合施用于患者。有時(shí)，將一種或多種細(xì)胞因子也施用于患者是是非常有益的。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽與生長抑制劑聯(lián)合給藥。例如，首先施用生長抑制劑，接下來施用本發(fā)明多肽。然而，也考慮了同時(shí)施用或首先施用本發(fā)明多肽。生長抑制劑的適宜劑量是目前所用劑量，同時(shí)由于生長抑制劑和本發(fā)明多肽的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)而可以降低用量。
為了治療免疫相關(guān)疾病或減輕其嚴(yán)重程度，本發(fā)明化合物的適宜劑量取決于所治疾病的類型(如上所述)、疾病的嚴(yán)重程度和病程(無論給藥目的是預(yù)防還是治療)、先前的治療、患者的臨床病史和對化合物的應(yīng)答以及主治醫(yī)生的判斷?；衔镞m宜于一次性地或在一系列治療中施用于患者。
例如，取決于受治疾病的類型和嚴(yán)重程度，抗體施用于患者的抗體的初始候選劑量是1μg/kg～15mg/kg(如0.1-20mg/kg)，無論是例如通過一次或分多次給藥，還是通過連續(xù)輸注給藥。依據(jù)上述因素，代表性的每日劑量為約1μg/kg～100mg/kg或更多。重復(fù)給藥數(shù)天或更長時(shí)間時(shí)，視具體情況而將治療持續(xù)至出現(xiàn)對疾病癥狀的所需抑制為止。然而，其它劑量方案也可能是有用的。治療的進(jìn)展很容易通過常規(guī)技術(shù)和試驗(yàn)分析加以監(jiān)測。
12.制品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含有用于治療上述疾病的物質(zhì)的制品。所述制品包括一個(gè)容器、一個(gè)標(biāo)簽和一張包裝插頁。適當(dāng)?shù)娜萜靼ㄆ孔?，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器內(nèi)盛放能有效診斷或治療病癥的組合物，并具有無菌存取口(例如，該容器可以是靜脈注射袋或帶有能通過皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。組合物中的活性劑是本發(fā)明多肽或抗體。容器上的或附帶的標(biāo)簽說明該組合物用于診斷或治療所選出的病癥。制品還包括第二個(gè)容器，其中含可藥用的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖鹽液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。制品還可進(jìn)一步包括具有商業(yè)需要以及符合用戶需要的其它材料，如其它緩沖液、稀釋劑，濾器，針頭和注射器。
13.免疫相關(guān)疾病的診斷和預(yù)后細(xì)胞表面蛋白，如在一定免疫相關(guān)疾病中過度表達(dá)的蛋白質(zhì)，是候選藥物或疾病治療的良好的靶。相同蛋白質(zhì)與由免疫相關(guān)疾病中增強(qiáng)的(amplified)基因編碼的分泌蛋白質(zhì)一起，表明它們在這些疾病的診斷和預(yù)后中的另一用途。譬如，直接針對在多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或其它免疫相關(guān)疾病中增強(qiáng)的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體，可用作診斷劑或預(yù)后劑。
舉例來說，抗體(包括抗體片段)，可用于定性或定量測定由增強(qiáng)或過度表達(dá)基因(″標(biāo)記基因產(chǎn)物″)編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)?？贵w優(yōu)選連接有可檢測標(biāo)記物，例如熒光素標(biāo)記，并且可用光學(xué)顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光測定儀或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)監(jiān)測抗體結(jié)合。如果過度表達(dá)基因編碼細(xì)胞表面蛋白，那么這些技術(shù)是特別適合的。此結(jié)合分析基本上按照前面的描述進(jìn)行。
可通過例如免疫熒光或免疫電子顯微鏡檢查法，完成在原位檢測抗體與標(biāo)志基因產(chǎn)物的結(jié)合。為此目的，自患者采出組織學(xué)樣品，將標(biāo)記抗體用在樣品上，優(yōu)選將抗體覆蓋在生物樣品上。此過程也可以測定標(biāo)志基因產(chǎn)物在被測組織的分布。關(guān)于原位檢測，大量的各種組織學(xué)方法是可以利用的，此點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
下述實(shí)施例只是為了描述的目的而提供，并非旨在以任何方式限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本說明書中引證的所有專利和參考文獻(xiàn)，以其全部在此引入作為參考。
實(shí)施例除非另外指出，否則實(shí)施例中所提到的可商購試劑，按照制造商的說明使用。在下述實(shí)施例和整個(gè)說明書中用ATCC登記號定義的細(xì)胞的來源是在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA進(jìn)行保藏的。除非另外聲明，否則本發(fā)明使用重組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)操作，如前面和在下列教科書中描述的那些Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress N.Y.，1989；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenPublishing Associates和Wiley Interscience，N.Y.，1989；Innis等，PCRProtocolsA Cuide to Methods and Applications，Academic Press，inc.，N.Y.，1990；Harlow等，AntibodyA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，1988；Gait，M.J.，Oligonucleotide Synthesis，IRL Press，Oxford，1984；R.I.Freshney，Animal cell Culture，1987；Coligan等，CurrentProtocols in Immunology，1991。
實(shí)施例1 TCCR的分離與克隆用細(xì)胞因子受體和/或以WS(G)XWS結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣鞯氖荏w檢索公共EST數(shù)據(jù)庫，結(jié)果分離出hTCCR(SEQ ID NO1)和mTCCR(mTCCR)。
或者，圖4(SEQ ID NO2)描述的鼠TCCR已在1996年5月23日申請的WO97/44455中公開，還以登記號7710109公開在GenBank中。該現(xiàn)有技術(shù)分子也描述在Sprecher等，Biochem.Biophys，Res.Commun.246(1)82-90(1998)中。在圖4(SEQ ID NO2)中，已經(jīng)鑒定出信號肽在氨基酸殘基1-約24處，跨膜結(jié)構(gòu)域在氨基酸殘基約514-約532，N-糖基化位點(diǎn)在殘基約46-49、296-299、305-308、360-361、368-371和461-464，酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)在殘基約10-13、93-96、130-133、172-175、184-187、235-238、271-274、272-275、323-326、606-609和615-618，酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)在殘基約202-209，N-肉豆蔻酰化(myristoylation)位點(diǎn)在殘基約43-48、102-107、295-300、321-326、330-335、367-342、393-398、525-530和527-532，酰胺化位點(diǎn)在殘基約240-243，原核膜脂蛋白脂類附著在殘基約516-526處，而生長因子和細(xì)胞因子受體家族識別標(biāo)志I則位于殘基約36-49處。(1)與人紅細(xì)胞生成素存在顯著同源性的區(qū)域在殘基約14-51處，(2)與鼠白介素-5受體存在顯著同源性的區(qū)域在殘基211-219處。
在1996年5月23日提交的WO 97/44455中，公開了與圖3(SEQ ID NO1)所示人TCCR高度同源的多肽，也可以登記號4759327而從GenBank中得到。該現(xiàn)有技術(shù)分子也描述在Sprecher等，Biochem.Biophys，Res.Commun.246(1)82-90(1998)中。在圖3(SEQ ID NO1)中，已經(jīng)鑒定出信號肽位于氨基酸殘基1-約32，跨膜結(jié)構(gòu)域在氨基酸殘基約517-約538，N-糖基化位點(diǎn)在殘基約51-54、76-79、302-305、311-314、374-377、382-385、467-470、563-566、N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)在殘基約107-112、240-245、244-249、281-286、292-297、373-378、400-405、459-464、470-475、531-536和533-538處，原核膜脂蛋白脂附著位點(diǎn)在殘基約522-532處，而生長因子和細(xì)胞因子受體家族識別標(biāo)志1在殘基約41-54處。與人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)受體的第二個(gè)亞單位具有顯著同源性的區(qū)域在殘基183-191處。
人TCCR(SEQ ID NO1)和鼠TCCR(SEQ ID NO2)序列比較示于圖5。該比較顯示人和鼠序列之間具有約62％的序列同源性。
實(shí)施例2 TCCR″基因敲除″鼠1.制備靶向載體(targeting vector)術(shù)語″靶向載體″，是為了基因切除而構(gòu)建的核酸序列的術(shù)語。圖9A描述了用于本實(shí)施例中分離的TCCR分子的靶向載體。更具體而言，使用含有最開始的兩個(gè)外顯子的2.4kb XhoI-HindIII片段和含有外顯子9-14的6.0kb Eco RI-Bam HI片段構(gòu)建靶向載體。所分離的特定TCCR基因含有14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子。在該靶向載體中，已經(jīng)用賦予慶大霉素抗性的pGK-neo基因取代了外顯子3-8，而保持外顯子1和2完整無損。單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)編碼區(qū)域已經(jīng)取代了外顯子1的5′端，使得可用更昔洛韋進(jìn)行選擇。此類藥物選擇性標(biāo)志，如更昔洛韋，使得能夠選擇含有所述靶向載體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，并且還允許制備聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物，所述引物將擴(kuò)增靶向構(gòu)建體中能使其有別于內(nèi)源性基因的獨(dú)一無二的核酸片段。將該構(gòu)建體插入載體pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)并轉(zhuǎn)化到DH10B細(xì)菌中。收獲單菌落，用于制備更大量的靶向載體。
2.制奮TCCR-/-干細(xì)胞靶向載體經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶NotI消化而線性化，并轉(zhuǎn)染入胚胎干(ES)細(xì)胞。之所以選擇ES細(xì)胞，是因?yàn)樗鼈兡軌蛘系桨l(fā)育期的胚胎干系中，以便于將靶向載體傳遞至子代。優(yōu)選的ES系是ESGS系，但是也可使用D3系(ATCC CRL-1934)。通過使用重懸浮在0.8ml PBS中的ES細(xì)胞，而完成電穿孔。把線性化靶向載體(20ug)加入到細(xì)胞中，這發(fā)生在無菌電穿孔小杯(0.4cm Bio-Rad，Hercules，CA)中。使用設(shè)定為500μF、240伏特的Bio-Rad電穿孔裝置完成電穿孔。將小杯中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到410ml ES培養(yǎng)基中。ES培養(yǎng)基的構(gòu)成高葡萄糖DMEM(Gibco 11960-010)，10％FBS(ES細(xì)胞testedGibco 16141-061)和1000單位/ml ESGRO鼠LIF(Gibco 13275-0290)。然后將這些細(xì)胞等分到20個(gè)96孔板中。轉(zhuǎn)染靶向載體后，使用致死濃度的前面提到的藥物來篩選ES細(xì)胞。G418的使用濃度為400μg/ml。只有攜帶靶向載體的那些ES細(xì)胞具有存活所必需的抗生素抗性標(biāo)志。然后，通過Southern印跡法(圖10A)、PCR(圖10B)、內(nèi)源性靶基因mRNA表達(dá)的缺乏(圖10C)從選出的ES細(xì)胞菌落中甄別具有正確整合載體的菌落。接著，把符合上述標(biāo)準(zhǔn)的ES克隆顯微注射到胚胎中。
3.注射和篩選TCCR-/-小鼠使用本領(lǐng)域任何適宜技術(shù)，優(yōu)選顯微注射，把上一步驟篩選和甄別出的ES細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)移到發(fā)育期胚胎中。適宜的顯微注射技術(shù)描述在Hogan等，Manipulating the mouse embryoA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1986中。盡管只要事后能被識別，就可以使用任何胚胎，但是優(yōu)選用于顯微注射的胚胎是雄性并具有與含有靶向載體的ES細(xì)胞的基因所編碼的毛色相對立的毛色的胚胎。例如，得自白色皮毛動(dòng)物的ES細(xì)胞注射到將發(fā)育成棕色/黑色皮毛動(dòng)物的胚胎中。以這種方式成功進(jìn)行顯微注射的胚胎，根據(jù)馬賽克式的皮毛而選擇出其成熟成年動(dòng)物。得到的馬賽克式動(dòng)物(創(chuàng)立者)是TCCR-/+，然后使之回交(與其它TCCR-/+子代配偶)以產(chǎn)生TCCR-/-鼠。
為了證實(shí)TCCR-/-基因型，從尾部剪取物中提取DNA，所述DNA是通過于60℃在0.5ml裂解緩沖液中孵育尾組織過夜而獲得的。裂解緩沖液的構(gòu)成0.5％SDS，100mM NaCl，50mM Tric-HCL(pH8.0)，7.5mM EDTA(pH8.0)和1mg/ml蛋白酶K(Boehringer-Mannheim)。過夜孵育后，室溫下離心75μl 8M醋酸鉀、600ml CHCl3的完全反應(yīng)混合物的等份試樣10分鐘。移出水相層并置于另一eppendorf管中，向該管中加入600ml 100％乙醇，離心5分鐘使DNA沉淀。用70％乙醇洗滌DNA沉淀小團(tuán)，進(jìn)行空氣干燥。去除殘留的乙醇后，在150-200μl水中重新懸浮DNA小團(tuán)。接著，可將該DNA用于Southern印跡和PCR分析。在Southern印跡時(shí)，可用neo基因作探針；PCR時(shí)，使用篩選ES細(xì)胞時(shí)所用的引物。
結(jié)果見圖10A、10B和10C，表明成功地切除了TCCR基因。TCCR-缺陷小鼠能夠生長發(fā)育、繁殖，未表現(xiàn)出明顯異常。詳細(xì)的組織學(xué)檢驗(yàn)未顯示出任何明顯缺陷。取自多個(gè)野生型和基因敲除鼠胸腺、脾、淋巴結(jié)和派伊爾氏淋巴集結(jié)(peyer′s patches)的細(xì)胞用CD3、CD4、CD8、CD25、CD19、B220、CD40、NK1.1、DX5、F4/80、CD14、CD16、MHCII和CD45抗體染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，未顯示這兩種基因型之間有明顯差異。
實(shí)施例3 TCCR-/-鼠過敏性氣道炎癥的增加哮喘是眾多引發(fā)支氣管梗阻和炎癥的變應(yīng)性和非-變應(yīng)原因子相互作用所致復(fù)雜疾病。氣道炎癥的一個(gè)關(guān)鍵方面是氣道壁被Th2細(xì)胞浸潤。由于本文制備的TCCR-/-鼠具有更大的Th2反應(yīng)，所以這些TCCR-/-鼠是研究過敏性氣道炎癥的非常有用的模型。
動(dòng)物12只TCCR-/-鼠和11只野生型同窩鼠(WT)隨機(jī)分為下列四組組1-非-致敏的TCCR-/-；組2-非致敏的TCCR WT(n＝4)；組3一致敏的TCCR-/-(n＝8)；組4-致敏的TCCR WT(n＝7)。
致敏在第0天，給15只小鼠(雄性和雌性)腹腔注射體積為0.1ml的吸附在1mg/ml明礬中的300單位/ml塵螨抗原(Bayer Pharmaceutical)，使小鼠致敏。非致敏對照小鼠(n＝8)接受腹腔注射0.1ml 0.9％NaCl和1mg/ml明礬。在第7天，如上述這兩組鼠腹腔注射抗原(致敏組)或NaCl(非致敏組)，予以強(qiáng)化。
吸入攻擊致敏并強(qiáng)化后，于第16天開始進(jìn)行4次DMA吸入攻擊。為了形成氣霧劑，將塵螨用Dulbecco′s PBS和0.1％Tween-20稀釋，使其在噴霧器中的終濃度為6000單位/ml。所有吸入攻擊都在Plexiglaspie暴露室，開始用PARIIS-2噴霧器將DMA氣化20分鐘，然后10分鐘內(nèi)向暴露室中再注入1.5ml。肺的總沉積劑量為約6.5AU的DMA。
AHR(使麻醉)在第24天，最后一次DMA氣霧劑攻擊的約18小時(shí)后，用戊巴比妥(25mg/kg)和烏拉坦(1.8g/kg)的混合物麻醉小鼠，在右側(cè)頸靜脈上制造1cm切口并進(jìn)行插管。游離、切開頸靜脈，插入導(dǎo)管(PE-10連接到PE-50)并固定好。另外，切開小鼠的氣管(1cm頸部切口，游離、切開氣管，插入套管并固定好)。然后將小鼠裝入Plexiglas流動(dòng)體積描記器中，以測量胸廓擴(kuò)脹和氣道壓力。以170bpm的頻率給小鼠通入100％氧氣，Vt等于9μl/gm。用電腦化(Buxco Electronics)數(shù)據(jù)捕獲程序連續(xù)監(jiān)測呼吸力學(xué)(肺阻力和動(dòng)力順應(yīng)性)。測量基線后，小鼠接受一次性10秒量的乙酰甲膽鹼(MCH劑量為500μg/kg)，使用原液濃度為200μg/ml的MCH。
處死氣道反應(yīng)性的測量完成后，用EDTA管收集經(jīng)眼眶后靜脈竇采集的血液，以便分離得到血清。剖開腹部，切斷降主動(dòng)脈，切開橫隔。使動(dòng)物放血一段時(shí)間后流血而死，進(jìn)行細(xì)支氣管肺泡(bronchioalveolar)灌洗(BAL)。通過前述插入的氣管套管，用相同的無菌生理鹽水(30μg/g鼠重)快速水流(bolus)灌洗肺3次。快速水流充入肺中至總肺容量的約70％。以1000xg和4℃離心BAL樣品(回流平均80％)10分鐘。輕輕倒出上清液并立即冷凍于-80℃。細(xì)胞小團(tuán)重新懸浮于250ml含2％BSA(Sigman，St.Louis，MO)的PBS中，然后用自動(dòng)計(jì)數(shù)儀(Baker Instruments，Allentown，PA)計(jì)數(shù)，記錄為總BAL細(xì)胞數(shù)/μl。接著，將細(xì)胞懸浮液調(diào)整至200細(xì)胞/μl，取100ml在包被的Superfrost Plus顯微鏡載玻片(Baxter Diagnostics，Deerfield，IL)上使用cytospin(Shandon，Inc.，Pittsburgh，PA)以800xg離心10分鐘。風(fēng)干載玻片，在100％甲醇中固定1分鐘，用Diff-Quik(Baxter Health Care，Miami，F(xiàn)ol)染色。每一玻片上至少分析200個(gè)細(xì)胞，以得到示差(differentral)白細(xì)胞計(jì)數(shù)。
BAL之后，取出右肺、脾和氣管支氣管淋巴結(jié)在液氮中冷凍，以備mRNA分析(并且，然后放置到干冰中)。取鼠尾剪切物并冷凍于干冰中，以便于日后進(jìn)行基因型測定。取出小鼠剩下的左肺，以評價(jià)和比較實(shí)驗(yàn)各組之間肺部病理學(xué)變化的嚴(yán)重程度和特征。此目的如下實(shí)現(xiàn)在10％中性-緩沖的福爾馬林中初步固定肺組織，石蠟包埋，用蘇木精和伊紅染色3μm切片。沿著初級支氣管切出肺切片，盲性評價(jià)整個(gè)切片并基于氣道和血管周圍炎癥的嚴(yán)重程度予以評分。使用0(無炎癥和氣道改變)至4級(明顯的炎癥和氣道改變)來描述氣道上皮細(xì)胞肥大程度。
IgE ELISA在總IgE夾心ELISA中，使用不稀釋或者在ELISA緩沖劑中以1∶2～1∶20(BAL)和1∶25～1∶200(血清)稀釋的BAL液或血清樣品。捕獲抗體是兔抗-小鼠IgE(2μg/ml PBS)，板于4℃包被24-48小時(shí)。標(biāo)準(zhǔn)品是鼠IgE(PharMingen，San Diego，CA)，按照1∶2進(jìn)行系列稀釋，起始濃度為100ng/ml。使用1∶2000稀釋的生物素化FcεRI-IgG作為檢測抗體作用1-1.5小時(shí)。HRP-SA和酶顯色步驟與細(xì)胞因子分析所用相同。
結(jié)果證實(shí)TCCR-/-鼠中淋巴細(xì)胞浸潤較野生型鼠顯著增加(圖11)。
實(shí)施例4 TCCR在大腸桿菌中的表達(dá)該實(shí)施例描述通過在大腸桿菌中的重組表達(dá)制備非糖基化形式的TCCR。使用選擇的PCR引物，將編碼TCCR的DNA序列進(jìn)行初步擴(kuò)增。引物應(yīng)當(dāng)含有對應(yīng)于所選表達(dá)載體中限制性酶切位點(diǎn)的限制性酶切位點(diǎn)。可使用各種表達(dá)載體。適宜載體的一個(gè)實(shí)例是pBR322(得自大腸桿菌；見Bolivar等，Gene，295(1977))，它含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗藥性基因。該載體用限制性內(nèi)切酶消化并去磷酸化。然后把PCR擴(kuò)增的序列連接到該載體中。載體優(yōu)選包括編碼抗生素抗性基因的序列、trp啟動(dòng)子、聚組氨酸前導(dǎo)序列(包括最初6個(gè)STII密碼子、聚組氨酸序列和腸激酶裂解位點(diǎn))、TCCR編碼區(qū)、λ轉(zhuǎn)錄終止子和argU基因。
接著，使用Sambrook等在出處同上中描述的方法，用上述連接混合物轉(zhuǎn)染所選大腸桿菌株。通過在LB平板上的生長能力來鑒定轉(zhuǎn)化體，然后選擇抗生素抗性菌落?？煞蛛x質(zhì)粒DNA，并用限制性分析和DNA測序加以確認(rèn)。
選出的克隆可在液體培養(yǎng)基(如添加了抗生素的LB肉湯)中生長過夜。過夜培養(yǎng)物隨后用于接種更大規(guī)模的培養(yǎng)基。然后細(xì)胞生長至所需光密度，在此期間表達(dá)啟動(dòng)子被打開。
繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)小時(shí)后，離心收獲細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的各種試劑可以溶解離心所得細(xì)胞小團(tuán)，然后，使用金屬螫合柱在允許緊密結(jié)合已溶的TCCR蛋白的條件下純化該蛋白。TCCR也可經(jīng)下述操作在大腸桿菌中以聚組氨酸標(biāo)記形式表達(dá)。使用選擇的PCR引物初步擴(kuò)增編碼TCCR的DNA。引物含有對應(yīng)于所選表達(dá)載體中限制性酶切位點(diǎn)的限制性酶切位點(diǎn)和其它對于提供有效、可靠翻譯起始、在金屬螯合柱上快速純化、和被腸激酶水解去除都有用的序列。接下來，將PCR擴(kuò)增的聚組氨酸標(biāo)記序列連接到表達(dá)載體中，后者用于轉(zhuǎn)化基于菌株52(W3110 fuhA(tonA)Ion galE rpoHts(htpRts)clpP(lacIq)的大腸桿菌宿主。轉(zhuǎn)化體首先于30℃在含有50mg/ml羧芐青霉素的LB中振蕩培養(yǎng)，直至O.D.600達(dá)到3-5。接著，把培養(yǎng)物用CRAP培養(yǎng)基(在500mL水中混合3.57g(NH4)2SO4，0.71g檸檬酸鈉·2H2O，1.07g KCl，5.36g Difco酵母提取物，5.36g Sheffield hycase SF，以及110mMMPOS、pH7.3、0.55％(w/v)葡萄糖和7mM MgSO4而制得)稀釋50-100倍，于30℃振蕩培養(yǎng)約20-30小時(shí)。移出樣品，用SDS-PAGE分析證實(shí)表達(dá)，把大批量培養(yǎng)物離心成細(xì)胞團(tuán)。冷凍細(xì)胞團(tuán)直至純化和重折疊(refolding)。
在10倍體積(w/v)的7M胍、20mM Tris、pH8緩沖劑中，重新懸浮得自0.5～1L發(fā)酵物(6-10g小團(tuán))的大腸桿菌糊狀物。加入固體亞硫酸鈉和連四硫酸鈉使終濃度分別為0.1M和0.02M，在4℃攪拌該溶液過夜。該步驟產(chǎn)生變性蛋白質(zhì)，其中所有半胱氨酸殘基被亞硫酸化(sulfitolization)封閉。在Beckman Ultracentifuge上40000rpm離心該溶液30分鐘。上清液用3-5倍體積的金屬螯合柱緩沖液(6M胍，20mM Tris，pH7.4)稀釋，并通過0.22微米濾器過濾以使澄清。將已澄清的提取液裝載到已用金屬螯合柱緩沖液平衡的5ml Qiagen Ni-NTA金屬螯合柱上。用另一含有50mM咪唑(Calbiochem，Utrol grade)的pH7.4緩沖液洗滌金屬螯合柱。用含250mM咪唑的緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。收集合有所需蛋白質(zhì)的級分并于4℃貯存。利用基于蛋白質(zhì)氨基酸序列計(jì)算出的消光系數(shù)，通過280nm處的吸收度估算蛋白質(zhì)濃度。
將樣品緩慢倒入新鮮配制的重折疊緩沖液中進(jìn)行稀釋，從而將蛋白質(zhì)重折疊，所述重折疊緩沖液的構(gòu)成是pH8.6 20mM Tris、0.3M NaCl、2.5M尿素、5mM半胱氨酸、20mM甘氨酸和1mM EDTA。選擇重折疊液的體積以使蛋白質(zhì)終濃度為50～100微克/ml。于4℃輕輕攪拌重折疊液12-36小時(shí)。加入TFA至終濃度為0.4％(pH約為3)來淬滅重折疊液。進(jìn)一步純化白質(zhì)之前，溶液通過0.22微米濾器過濾，加入乙腈至終濃度為2-10％。在PorosR1/H反相柱上對重折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行層析分析，使用的流動(dòng)相緩沖液為0.1％TFA，用10～80％乙腈梯度洗脫。在SDS聚丙烯酰胺凝膠上分析那些有A280吸收的級分的等份試樣，收集合有均相重折疊的蛋白質(zhì)級分。通常，大多數(shù)蛋白的正確重折疊類別在最低乙腈濃度時(shí)洗脫下來，這是由于這些類別的蛋白質(zhì)具有阻隔其與反相樹脂相互作用的疏水內(nèi)部因而是最緊密的。聚集類別的蛋白通常在較高乙腈濃度時(shí)洗脫下來。除了從所需形式蛋白質(zhì)中消除錯(cuò)誤折疊形式的蛋白質(zhì)外，該反相步驟也從樣品中去除內(nèi)毒素。
分別收集含有所需折疊型TCCR蛋白的級分，用氮?dú)饬髦苯虞p吹溶液而去除乙腈。經(jīng)透析或通過用已在配制緩沖液中平衡的G25 Superfine(Pharmacia)樹脂進(jìn)行凝膠過濾，而將蛋白質(zhì)配制成pH6.8 20mM Hepes的溶液，其中含0.14M氯化鈉和4％甘露醇，并進(jìn)行無菌過濾。
實(shí)施例5 TCCR在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)該實(shí)施例描述通過在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的重組表達(dá)來制備高度糖基化形式的TCCR。
載體pRK5(見EP 307247，
公開日為1989年3月15日)用作表達(dá)載體。任選地，使用諸如Sambrook等在出處同上中描述的連接方法，將TCCR DNA連接至帶有所選擇限制酶以便插入TCCR DNA的pRK5中。由此產(chǎn)生的載體稱為pRK5-TCCR。
在一實(shí)施方案中，所選宿主細(xì)胞是293細(xì)胞。人293細(xì)胞(ATCC CCL1573)在組織培養(yǎng)板上生長融合，所述培養(yǎng)基如添加了胎牛血清和任選的營養(yǎng)成分和/或抗生素的DMEM。約10μg pRK5-TCCR DNA與約1μg編碼VA RNA基因[Thimmappaya等，Cell，31543(1982)]的DNA混合，溶于500μl 1mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaCl2中。向該混合物中滴加500μl 50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCI、1.5mM NaPO4，25℃10分鐘使形成沉淀。懸浮該沉淀物，加入293細(xì)胞，使在37℃沉降約4小時(shí)。吸出培養(yǎng)基，用30秒種時(shí)間加入20％甘油的PBS溶液2ml。然后用不含血清的培養(yǎng)基洗滌293細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)約5天。
轉(zhuǎn)染的約24小時(shí)后，棄除培養(yǎng)基，代之以培養(yǎng)基(單獨(dú))或含有200μCi/ml35S-半胱氨酸和200μCi/ml35S-蛋氨酸的培養(yǎng)基。培養(yǎng)12小時(shí)后，收集條件培養(yǎng)液，在旋轉(zhuǎn)濾器上濃縮，裝載到15％SDS凝膠上。完成電泳后使凝膠干燥，并于膠片上曝光一段時(shí)間，從而揭示TCCR多肽的存在?？蛇M(jìn)一步培養(yǎng)含有轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)物(在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng))，在選定的生物鑒定法中檢測培養(yǎng)物。
在另一技術(shù)中，使用Somparyrac等在Proc.Natl.Acad.Sci.，127575(1981)中描述的葡聚糖硫酸酯方法，可將TCCR瞬時(shí)引入293細(xì)胞。293細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)燒瓶中生長至最大密度，加入700μg pRK5-TCCR DNA。首先通過離心從旋轉(zhuǎn)燒瓶中濃縮細(xì)胞，用PBS洗滌。在細(xì)胞小團(tuán)上培養(yǎng)DNA-葡聚糖沉淀物4小時(shí)。用20％甘油處理細(xì)胞90秒，用組織培養(yǎng)基洗滌，再次裝入含有5μg/ml牛胰島素和0.1μg/ml牛轉(zhuǎn)鐵蛋白的組織培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)燒瓶中。約4天后，離心條件培養(yǎng)基，過濾去除細(xì)胞和碎片。然后，用任何選定方法，如透析和/或柱層析來濃縮和純化含有表達(dá)的TCCR的樣品。
在另一實(shí)施方案中，可在CHO細(xì)胞中表達(dá)TCCR。使用已知試劑如CaPO4或DEAE葡聚糖，可將pRK5-TCCR轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞。如上所述，培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物，用培養(yǎng)基(單獨(dú)的)或含有放射標(biāo)記物如35S-蛋氨酸的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。測定了TCCR的存在后，可用不含血清的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。優(yōu)選地，培養(yǎng)物培養(yǎng)約6天后，收獲條件培養(yǎng)基。接著，用任何選定方法濃縮并純化該含有表達(dá)的TCCR的培養(yǎng)基。
也可在宿主CHO細(xì)胞中表達(dá)表位-標(biāo)記的TCCR。TCCR可以從pRK5載體亞克隆出來?？蓪υ搧喛寺〔迦胛镞M(jìn)行PCR，以與所選定表位標(biāo)記物如聚組氨酸-標(biāo)記物融合在桿狀病毒表達(dá)載體中的一個(gè)閱讀框架內(nèi)。接著，可將聚組氨酸標(biāo)記的TCCR插入物亞克隆入含有選擇標(biāo)志(如用于選擇穩(wěn)定克隆的DHFR)的SV40驅(qū)動(dòng)載體中。最后，用SV40驅(qū)動(dòng)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞(如上所述)?？砂瓷鲜鲞M(jìn)行標(biāo)記，以證實(shí)表達(dá)。然后，用任何選定方法，如用Ni2+-蝥合親和層析法，可以濃縮并純化含有表達(dá)的聚組氨酸標(biāo)記型TCCR的培養(yǎng)基。
還可通過瞬時(shí)表達(dá)方法在CHO和/或COS細(xì)胞中表達(dá)TCCR，或通過另一穩(wěn)定表達(dá)方法而在CHO細(xì)胞中表達(dá)TCCR。
使用下述操作，可完成在CHO細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。蛋白質(zhì)可表達(dá)為，例如(1)IgG構(gòu)建體(免疫粘附)，其中編碼每種蛋白的可溶形式(例如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)的序列分別與包括鉸鏈CH2結(jié)構(gòu)域的IgG恒定區(qū)序列融合，和/或(2)聚組氨酸標(biāo)記形式。
PCR擴(kuò)增后，使用Ausubel等在Current Protocols of Molecular Biology.Unit 3.16，John Wiley和Sons(1997)中所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，分別將每個(gè)DNA亞克隆入CHO表達(dá)載體中。構(gòu)建CHO表達(dá)載體，使其在目標(biāo)DNA的5′和3′端具有相容的限制性酶切位點(diǎn)，以便于cDNA的往返穿梭。CHO細(xì)胞中表達(dá)所用載體在Lucas等，Nucl.Acids Res.249(1774-1779(1996)中有描述，并且使用SV40早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子來驅(qū)動(dòng)目標(biāo)cDNA和二氫葉酸還原酶(DHFR)的表達(dá)。DHFR表達(dá)允許選擇轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定維持的質(zhì)粒。
使用商購轉(zhuǎn)染試劑Superfect(Quiagen)、Dosper或Fugene(Boehringer Mannheim)，將12微克所需質(zhì)粒DNA引入約1千萬個(gè)CHO細(xì)胞中。按Lucas等在出處同上中所述方法，使細(xì)胞生長。為使細(xì)胞如下所述進(jìn)一步生長和增殖，在每一安瓿中冷凍約3×107個(gè)細(xì)胞。
把含有質(zhì)粒DNA的安瓿放入水浴中解凍并渦旋混合。用移液管將內(nèi)容物移入盛有10mL培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5分鐘。吸出上清液，用10mL選擇培養(yǎng)基(0.2μm過濾的PS20和5％0.2μm滲濾的(diafiltered)胎牛血清)懸浮細(xì)胞。然后將細(xì)胞等分至含有90mL選擇培養(yǎng)基的100mL旋轉(zhuǎn)器中。1-2天后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至盛有150mL選擇生長培養(yǎng)基的250mL旋轉(zhuǎn)器中，并于37℃孵育。再過2-3天，在250mL、500mL和2000mL旋轉(zhuǎn)器中接種3×105細(xì)胞/mL。離心后用新鮮培養(yǎng)基替換細(xì)胞培養(yǎng)基，在生產(chǎn)培養(yǎng)基中重懸浮。盡管可以使用任何適宜的CHO培養(yǎng)基，但是實(shí)際使用的是1992年6月16日頒布的美國專利5122469中所述生產(chǎn)培養(yǎng)基。3L生產(chǎn)旋轉(zhuǎn)器中接種1.2×106細(xì)胞/mL。在0天，測定細(xì)胞數(shù)pH。第1天，從旋轉(zhuǎn)器取樣，并開始用過濾的空氣噴霧。第2天，從旋轉(zhuǎn)器中取樣，溫度調(diào)至33℃，取500g/L葡萄糖30mL和10％止泡劑0.6mL(例如35％聚二甲基硅氧烷乳液，Dow Coming 365 Medical Grade Emulsion)。整個(gè)生產(chǎn)過程中，必要時(shí)調(diào)整pH使之保持在7.2左右。10天后，或直至活力降至70％時(shí)，離心收獲細(xì)胞并通過0.22μm濾膜過濾。濾出液要么貯于4℃，要么立即上柱純化。
對于聚組氨酸標(biāo)記的構(gòu)建體，使用Ni-NTA柱(Qiagen)純化蛋白質(zhì)。純化前，向條件培養(yǎng)基中加入咪唑至濃度為5mM。于4℃，將該條件培養(yǎng)基以4-5ml/min速度泵到6ml Ni-NTA柱上，該柱己用含0.3M NaCI和5mM咪唑的20mM Hepes、pH7.4緩沖液平衡。上樣后，再用平衡緩沖液洗柱，用含有0.25M咪唑的平衡緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。隨后，用25ml G25 Superfine(Pharmacia)柱，將高度純化的蛋白質(zhì)在pH6.8含有10mM Hepes、0.14MNaCl和4％甘露醇的貯藏緩沖液中脫鹽，并貯于-80℃。
按照下述步驟，從條件培養(yǎng)基中純化免疫粘附素(含有Fc)構(gòu)建體。條件培養(yǎng)基泵入5ml蛋白A柱(Pharmacia)，后者已經(jīng)用pH6.8 20mM磷酸鈉緩沖液平衡。上樣后，在用pH3.5 100mM檸檬酸洗脫前，先用平衡液徹底洗柱。通過收集1ml級分至含有275μL pH9 1M Tris緩沖液的試管中，而將洗脫的蛋白質(zhì)立即中和。接著，按照前述使聚組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)脫鹽的方法在貯存緩沖液中使高度純化的蛋白質(zhì)脫鹽。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和用Edman降解技術(shù)進(jìn)行N末端氨基酸序列分析，來測定同質(zhì)性。
實(shí)施例6 TCCR在酵母中的表達(dá)下述方法描述TCCR在酵母中的重組表達(dá)。
首先，構(gòu)建酵母表達(dá)載體，以使在細(xì)胞內(nèi)自ADH2/GAPDH啟動(dòng)子產(chǎn)生或分泌TCCR。將編碼TCCR的DNA和所述啟動(dòng)子插入到所選質(zhì)粒的適宜限制性酶切位點(diǎn)中，以引導(dǎo)TCCR的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。為了分泌，可將編碼TCCR的DNA，與編碼ADH2/GAPDH啟動(dòng)子的DNA、天然TCCR信號肽或其它哺乳動(dòng)物信號肽、或者例如酵母α-因子或轉(zhuǎn)化酶分泌信號/前導(dǎo)序列以及連接序列(如果需要)一起克隆入所選質(zhì)粒中以便表達(dá)TCCR。
然后，可用上述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞如酵母株AB 110，并在選擇的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過10％三氯醋酸沉淀和用SDS-PAGE分離，接著用考馬斯藍(lán)染色凝膠，可以檢測轉(zhuǎn)化的酵母上清液。
隨后，經(jīng)離心而從發(fā)酵培養(yǎng)基中除去酵母細(xì)胞，接著使用選擇的筒式過濾器濃縮培養(yǎng)基，由此而分離和純化重組的TCCR。使用選擇的柱層析樹脂，可以進(jìn)一步純化含TCCR的濃縮物。
實(shí)施例7 TCCR在桿狀病毒-感染的昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)下述方法描述重組TCCR在桿狀病毒-感染的昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。
將TCCR的編碼序列融合在桿狀病毒表達(dá)載體所含的表位標(biāo)記物的上游。這些表位標(biāo)記物包括聚組氨酸標(biāo)記物和免疫球蛋白標(biāo)記物(如IgG的Fc區(qū))?？墒褂酶鞣N質(zhì)粒，包括商購質(zhì)粒如pVL1393(Novagen)。簡言之，使用與5′和3′區(qū)互補(bǔ)的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增TCCR的編碼序列或TCCR編碼序列的所需部分，如編碼跨膜蛋白質(zhì)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的序列或，如果蛋白質(zhì)是胞外蛋白質(zhì)時(shí)編碼成熟蛋白質(zhì)的序列。5′引物可整合入(選擇的)限制性酶切位點(diǎn)的側(cè)面。然后用那些選擇的限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)物并亞克隆入表達(dá)載體中。
重組桿狀病毒是這樣產(chǎn)生的使用Lipofectin(購自GIBCO-BRL)，將上述質(zhì)粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)共-轉(zhuǎn)染入草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(″Sf9″)細(xì)胞(ATCC CRL 1711)中。28℃孵育4-5天后，收獲釋放出的病毒，并將病毒進(jìn)一步擴(kuò)增。病毒感染和蛋白質(zhì)表達(dá)按照O′Reilley等在Baculovirus Express VectorsA Laboratory Manual，OxfordOxford University Press(1994)中的描述進(jìn)行。
接下來，可通過如下Ni2+-螯合親和層析純化所表達(dá)的聚組氨酸標(biāo)記的TCCR。重組病毒-感染的Sf9細(xì)胞的提取物的制備按照Rupert等在Nature，362175-179(1993)中所述方法進(jìn)行。簡要講，洗滌Sf9細(xì)胞，在超聲處理的緩沖液(25mL Hepes，pH7.9；12.5mM MgCl2；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4M KCl)中重懸浮，冰浴中超聲2次，各20秒鐘。離心澄清超聲后的產(chǎn)物，用上樣緩沖液(50mM磷酸鹽，300mM NaCl，10％甘油，pH7.8)50倍稀釋上清液，經(jīng)0.45μm濾器過濾。制備Ni2+-NTA瓊脂糖柱(購自Qiagen)，床體積5mL，用25mL水洗滌，25mL上樣緩沖液平衡。以每分鐘0.5mL的速度將過濾后的細(xì)胞提取液上柱，用上樣緩沖液洗柱至A280基線，在此點(diǎn)開始收集級分。接著，用第二洗滌緩沖液(50mM磷酸鹽；300mM NaCl，10％甘油，pH6.0)洗柱，此過程洗脫出非特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。重又達(dá)到A280基線后，用第二洗滌緩沖液中0～500mM的咪唑梯度洗柱。收集1mL級分，通過SDS-PAGE和銀染色或通過用堿性磷酸酶(Qiagen)偶聯(lián)型Ni2+-NTA經(jīng)Western印跡法進(jìn)行分析。匯總含洗脫的組氨酸10-標(biāo)記型TCCR的級分，用上樣緩沖液透析。
或者，使用已知層析技術(shù)，包括例如蛋白A或蛋白G柱層析法，對IgG標(biāo)記(或Fc標(biāo)記)的TCCR進(jìn)行純化。
另外，也可利用Hi-5細(xì)胞經(jīng)改良的桿狀病毒操作來表達(dá)本發(fā)明的TCCR分子。在該操作中，編碼所需序列的DNA用適宜系統(tǒng)如Pfu(Stratagene)擴(kuò)增，或者與包含在桿狀病毒表達(dá)載體中的表位標(biāo)記物的上游(5′-端)融合。此類表位標(biāo)記物包括聚組氨酸標(biāo)記物和免疫球蛋白標(biāo)記物(如IgG的Fc區(qū))?？墒褂酶鞣N質(zhì)粒，包括商購得到的質(zhì)粒如pIE-1(Novagen)。pIEI-1和pIEl-2載體被設(shè)計(jì)成能在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞中由桿狀病毒iel啟動(dòng)子對重組蛋白進(jìn)行重組表達(dá)。該質(zhì)粒僅在多克隆位點(diǎn)的定向上不同，并且含有已知對于ie 1-介導(dǎo)的在未感染型昆蟲細(xì)胞中的基因表達(dá)而言重要的所有啟動(dòng)子序列以及hr5增強(qiáng)子元件。pIEI-I和pIEI-2包括iel翻譯起始位點(diǎn)，并可用于生產(chǎn)融合蛋白。簡要講，用與5′和3′區(qū)互補(bǔ)的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增所需序列或序列的所需部分(如編碼跨膜蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的序列)。5′引物可整合入(所選擇的)限制性酶切位點(diǎn)的側(cè)面。然后，用那些選擇的限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)物，并亞克隆入表達(dá)載體。例如，pIEl-1的衍生物可包括人IgG的Fc區(qū)(pb.PH.IgG)或所需序列下游(3′-端)的8個(gè)組氨酸(pb.PH.His)標(biāo)記物。優(yōu)選地，對載體構(gòu)建體進(jìn)行測序從而加以確認(rèn)。
Hi5細(xì)胞在27℃、沒有CO2、沒有青霉素/鏈霉素(pen/strep)的條件下生長至50％融合。對于每一個(gè)150mm平皿，含有所述序列的30μg基于pIE的載體與1ml Ex-Cell培養(yǎng)基(MediaEx-Cell 401+1/100 L-Glu JRHBiosciences #14401-78P(注意該培養(yǎng)基是光敏的))混合。單獨(dú)地，100μl細(xì)胞Fectin(Cell-FECTIN，Gibco BRL+10362-010，預(yù)渦旋的)與1mlEx-Cell培養(yǎng)基混合。合并兩種溶液并在室溫下孵育15分鐘。8ml Ex-Cell培養(yǎng)基加入到2ml DNA/Cell-FECTIN混合物中，將其鋪至已經(jīng)用Ex-Cell培養(yǎng)基洗滌過一次的Hi5細(xì)胞的上層。然后，室溫避光孵育該平皿1小時(shí)。接著，吸出DNA/Cell-FECTIN混合物，用Ex-Cell培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，以除去過量的CellFECTIN。加入30ml新鮮Ex-Cell培養(yǎng)基，于28℃孵育細(xì)胞3天。收集上清液，如下測定桿狀病毒表達(dá)載體中所述序列的表達(dá)分批將1ml上清液與25ml用于組氨酸標(biāo)記型蛋白的Ni-NTA珠(QIAGEN)或用于IgG標(biāo)記型蛋白的蛋白-A瓊脂糖CL-4B珠(Pharmacia)結(jié)合，之后進(jìn)行SDS-PAGE分析，通過考馬斯藍(lán)染色與已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。
通過離心除去細(xì)胞而從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中收獲條件培養(yǎng)基(0.5-3L)，并經(jīng)0.22微米濾器過濾。對于聚組氨酸標(biāo)記的構(gòu)建體，使用Ni-NTA柱(Qiagen)純化含有所述序列的蛋白質(zhì)。純化前，于48℃保持咪唑的流速為4-5ml/min。上樣后，再用平衡緩沖液洗柱，用含有0.25M咪唑的平衡緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。隨后，用25ml G25 Superfine(Pharmacia)柱使高度純化的蛋白質(zhì)在pH6.8含有10mM Hepes、0.14M NaCl和4％甘露醇的貯藏緩沖液中除去鹽分，并貯于-80℃。
按照下述步驟，從條件培養(yǎng)基中純化免疫粘附(含有Fc)構(gòu)建體。條件培養(yǎng)基泵入5ml蛋白A柱(Pharmacia)，后者事先已經(jīng)用pH6.8 20mM磷酸鈉緩沖液平衡過。上樣后，在用pH3.5 100mM檸檬酸洗脫之前，先用平衡液徹底洗柱。通過按1ml級分收集在含有275μl pH9 1M Tris緩沖液的試管中，而將洗脫的蛋白質(zhì)立即中和。接著，按照前述使聚組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)脫去鹽分的方法使高度純化的蛋白質(zhì)脫鹽至貯存緩沖液中。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和用Edman降解技術(shù)進(jìn)行N末端氨基酸序列分析，來測定同質(zhì)性。
實(shí)施例8 制備結(jié)合TCCR的抗體該實(shí)施例描述能夠與TCCR特異結(jié)合的單克隆抗體的制備。
生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，例如在Goding，出處同上中有描述?？梢允褂玫拿庖咴兓腡CCR、含有TCCR的融合蛋白，和在細(xì)胞表面表達(dá)重組TCCR的細(xì)胞。無需繁瑣實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員就可對免疫原作出選擇。
皮下或腹腔內(nèi)(intraperitoneal)注射1-100微克在完全Freund′s佐劑中乳化的TCCR免疫原，來免疫小鼠如Balb/c。或者，免疫原在MPL-TDM佐劑(Ribi Immunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化，并注射入動(dòng)物的后足墊。10～12天后，再次用在所選佐劑中乳化的免疫原對免疫小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。此后數(shù)周，還可增加免疫注射而對小鼠加強(qiáng)免疫。經(jīng)后-眼眶放血方式定期采集小鼠血清樣品，進(jìn)行ELISA分析，以檢測抗-TCCR的抗體。
檢測到適宜的抗體后，對抗體“陽性”動(dòng)物最后一次靜脈注射TCCR。3或4天后，處死小鼠，取其脾細(xì)胞。然后將脾細(xì)胞與所選鼠骨髓瘤細(xì)胞系(如P3×63AgU.1，得自ATCC CRL 1597)融合(使用35％聚乙二醇)。
接著，將融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞接種到96孔組織培養(yǎng)板上，所述培養(yǎng)板上含有HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)培養(yǎng)基以抑制非-融合細(xì)胞、骨髓瘤雜合體和脾細(xì)胞雜合體的增殖。
根據(jù)ELISA中針對TCCR的反應(yīng)性來篩選雜交瘤細(xì)胞。對那些能分泌所需抗TCCR單克隆抗體的“陽性”雜交瘤細(xì)胞的測定是本領(lǐng)域常識。
可給同系Balb/c小鼠腹腔注射陽性雜交瘤細(xì)胞，以產(chǎn)生含有抗-TCCR單克隆抗體的腹水?；蛘撸闺s交瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)燒瓶或滾瓶中生長。使用硫酸銨沉淀，繼之用凝膠排阻層析法，可以完成對腹水中產(chǎn)生的單克隆抗體的純化。或者，使用基于抗體與蛋白A或蛋白G的結(jié)合的親和層析法。
實(shí)施例9 使用特異抗體純化TCCR多肽使用蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域的各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可進(jìn)行天然或重組TCCR多肽的純化。譬如，使用目標(biāo)TCCR多肽的特異性抗體經(jīng)免疫親和層析法純化原-TCCR多肽、成熟TCCR多肽或前-TCCR多肽。總體上講，免疫親和柱是通過將抗-TCCR多肽抗體與活化的層析樹脂共價(jià)偶聯(lián)而構(gòu)建的。
通過硫酸銨沉淀或者通過在固相化蛋白A(Pharmacia LKBBiotechnology，Piscataway，N.J.)上的純化法，可以從免疫血清制備多克隆免疫球蛋白。同樣地，用硫酸銨沉淀或通過固相化蛋白A層析法，可從小鼠腹水中制備單克隆抗體。使部分純化的免疫球蛋白共價(jià)附著于層析樹脂如CnBr-活化的SEPHAROSETM(Pharmacia LKB Biotechnology)?？贵w與樹脂共價(jià)偶聯(lián)，封閉樹脂，按照制造商的指示洗脫該衍生化樹脂。
通過從細(xì)胞中制備含有可溶型TCCR多肽的級分，可在TCCR多肽的純化中使用此免疫親和柱。通過溶解整個(gè)細(xì)胞或溶解經(jīng)加入去污劑差異離心或使用本領(lǐng)域公知方法獲得的亞細(xì)胞部分，而完成所述制備?；蛘?，含有信號序列的可溶型TCCR多肽可以以有效量分泌到細(xì)胞生長所在的培養(yǎng)基中。
使含有可溶性TCCR多肽的制劑流經(jīng)免疫親和柱，在使得優(yōu)先吸附TCCR多肽的條件下(例如，存在去污劑時(shí)的高離子強(qiáng)度緩沖液)洗柱。然后，在使抗體/TCCR多肽結(jié)合被破壞的條件下(例如，低pH緩沖液如pH約2-3，或高濃度離液劑如尿素或硫氰酸鹽離子)洗脫柱，并收集TCCR多肽。
實(shí)施例10 藥物篩選可使用那些能在任何藥物篩選技術(shù)中通過利用TCCR多肽或其結(jié)合片段而篩選化合物的特別有用的方法。本實(shí)驗(yàn)所用TCCR多肽或其片段可以是溶液中的游離形式，也可以是固定在固體載體上、產(chǎn)生于細(xì)胞表面或位于細(xì)胞內(nèi)。藥物篩選方法之一，是利用用表達(dá)TCCR多肽或片段的重組核酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化了的真核或原核宿主細(xì)胞。在競爭性結(jié)合試驗(yàn)中篩選抗此轉(zhuǎn)化細(xì)胞的藥物?；罴?xì)胞形式或者固定形式的此類細(xì)胞，可用于標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合試驗(yàn)?？梢詼y定例如TCCR多肽或其片段與被測試劑之間復(fù)合物的形成?；蛘?，可以檢驗(yàn)由被測試劑造成的TCCR多肽與其靶細(xì)胞或靶受體之間復(fù)合物形成的減少。
因此，本發(fā)明提供篩選藥物或任何其它可影響TCCR多肽-相關(guān)疾病或病癥的試劑的方法。這些方法包括將這類試劑與TCCR多肽或其片段接觸，并使用本領(lǐng)域熟知方法分析(I)該試劑與TCCR多肽或片段的復(fù)合物的存在，或(ii)TCCR多肽或片段與細(xì)胞的復(fù)合物的存在。在此類競爭性結(jié)合試驗(yàn)中，TCCR多肽或片段通常是標(biāo)記的。適宜孵育之后，游離TCCR多肽或片段與結(jié)合形式的TCCR多肽或片段分開，游離或未形成復(fù)合物的標(biāo)記物的量，可以衡量受測特定試劑與TCCR多肽的結(jié)合能力或者對TCCR多肽/細(xì)胞復(fù)合的阻礙能力。
用于藥物篩選的另一技術(shù)提供高效率篩選具有與多肽的適宜結(jié)合親和力的化合物，詳細(xì)描述見1984年9月13日公開的WO 84/03564中。簡要講，在固體基底(如塑料釘或其它表面)上合成大量不同的小肽測試化合物。如用于TCCR多肽的那樣，將肽測試化合物與TCCR多肽反應(yīng)并洗滌。用本領(lǐng)域熟知方法檢測結(jié)合的TCCR多肽。也可將純化的TCCR多肽直接包埋在前述藥物篩選技術(shù)所用的板上。此外，非-中和抗體可用于捕獲肽并將肽固定在固體載體上。
本發(fā)明也考慮了使用競爭性藥物篩選試驗(yàn)，在所述試驗(yàn)中，能夠與TCCR多肽特異性結(jié)合的中和抗體與被測化合物競爭性地同TCCR多肽或其片段特異性結(jié)合。以這種方式，抗體可用于檢測與TCCR多肽具有一個(gè)或多個(gè)相同表位的任何肽的存在。
實(shí)施例11 合理的藥物設(shè)計(jì)合理藥物設(shè)計(jì)的目標(biāo)是生產(chǎn)目標(biāo)生物活性多肽(即TCCR多肽)的結(jié)構(gòu)類似物或與多肽相互作用的小分子例如激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑。其中任何實(shí)例可用于形成藥物，所述藥物是更具活性或更穩(wěn)定形式的TCCR多肽，或者藥物增強(qiáng)或干擾TCCR多肽的體內(nèi)功能(c.f.，Hodgson，Bio/Technologv，919-21(1991))。
在一種方法中，用x-射線晶體照相術(shù)、計(jì)算機(jī)模型設(shè)計(jì)或者最通常這二者的結(jié)合，來測定TCCR多肽或TCCR多肽-抑制劑復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。為描述結(jié)構(gòu)和測定分子的活性位點(diǎn)，必須確定TCCR多肽的形狀和電荷。不常用的方法是，通過基于同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的模型，來獲取關(guān)于TCCR多肽結(jié)構(gòu)的有用信息。兩種情況均使用相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息來設(shè)計(jì)類似的TCCR多肽樣分子或用于鑒定有效抑制劑。合理藥物設(shè)計(jì)的有用實(shí)例，包括Braxton和Wells，Biochemistry，317796-7801(1992)所證實(shí)的具有改進(jìn)活性或穩(wěn)定性的分子，或者Athauda等，J.Biochem.，113742-746(1993)所述作為天然肽的抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑的分子。
還有一種可能是分離靶特異抗體，通過如上所述的功能分析進(jìn)行篩選，然后解決其晶體結(jié)構(gòu)。大體而言，這種途徑產(chǎn)生藥物母核(pharmacore)，可基于該母核設(shè)計(jì)藥物。通過產(chǎn)生針對功能性、藥理活性抗體的抗-獨(dú)特型抗體(抗-獨(dú)特型)，可完全繞開蛋白晶體構(gòu)象。作為鏡象的鏡象，預(yù)計(jì)抗-獨(dú)特型抗體的結(jié)合位點(diǎn)是原始受體的類似物。因此，抗-獨(dú)特型抗體可用于從化學(xué)或生物學(xué)產(chǎn)生的肽庫中鑒定和分離肽。隨后，分離的肽可用作藥物母核。
本發(fā)明可提供足夠量的TCCR多肽來完成諸如X-線晶體照相術(shù)等分析研究。另外，本文提供的TCCR多肽氨基酸序列的信息，將對那些使用計(jì)算機(jī)模型技術(shù)代替x-射線晶體照相術(shù)或除使用x-射線晶體照相術(shù)之外還使用計(jì)算機(jī)模型技術(shù)的人員提供指導(dǎo)。
表2(A-D)顯示使用ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序，用下述方法測定氨基酸序列同一性％(表2(A-B))和核酸序列同一性％(表2(C-D))的假設(shè)的例證，其中″PRO″表示本發(fā)明假設(shè)的目標(biāo)多肽的氨基酸序列，″對照蛋白質(zhì)″表示使目標(biāo)″PRO″多肽與其進(jìn)行比較的多肽的氨基酸序列，″PRO-DNA″表示編碼目標(biāo)核酸序列的假設(shè)的″PRO″，″對照DNA″表示使目標(biāo)核酸分子″PRO-DNA″與其進(jìn)行比較的核酸分子的核苷酸序列，″X″、Y″和″Z″各自代表不同的假定氨基酸殘基，而″N″、″L″和″V″各自代表不同的假定核苷酸。
實(shí)施例12 TCCR在免疫應(yīng)答的產(chǎn)生中的作用T細(xì)胞應(yīng)答為了進(jìn)行抗-KLH應(yīng)答，用100μg KLH的鹽水溶液與CFA的1∶1乳液(Difco Laboratories，Detroit，MI)對小鼠后足墊進(jìn)行免疫，所述乳液中含有1mg/ml結(jié)核分枝桿菌H37Ra。9天后，取出胭窩淋巴結(jié)，制備細(xì)胞懸浮液。在添加了5％FCS的DMEM基中，于各種濃度KLH下培養(yǎng)淋巴結(jié)細(xì)胞(每個(gè)孔5×105個(gè)細(xì)胞)。培養(yǎng)5天，在最后18小時(shí)加入1μCi[3H]-胸苷(ICN，Irvine，CA)來測定增殖，并通過液閃計(jì)數(shù)儀分析放射活性的摻入。將5×105個(gè)來自KLH-致敏的野生型或TCCR-缺陷型小鼠的引流淋巴結(jié)細(xì)胞，在指示量KLH存在的條件下，于96孔板上200ml的終體積中培養(yǎng)，以此分析由T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。培養(yǎng)96小時(shí)后，從每個(gè)孔中取出150μl培養(yǎng)上清液，使用購自Pharmingen(San Diego，CA)的抗體，在推薦條件下用ELISA測定細(xì)胞因子水平。
體外誘導(dǎo)T細(xì)胞分化用抗-CD4磁珠(MACS)純化取自野生型或TCCR-缺陷型同窩鼠的脾和淋巴結(jié)的CD4+T細(xì)胞。在經(jīng)照射(3000rad)的同系野生型或基因敲除APC(106/ml)和ConA(2.5μg/ml，Bochringer，Mannheim，Germany)存在的條件下，激活純化的T細(xì)胞(106細(xì)胞/ml)，或者通過鋪板到已用5μg/ml抗-CD3和1μg/ml抗-CD28抗體包被的板上而激活。培養(yǎng)基中添加IL-2(20U/ml)、IL-12(3.5ng/ml，R & D Systems)和500ng/ml抗-IL-4抗體(Pharmingen)以備Th1分化，并添加IL-2(20U/ml)、IL-4(103U/ml，R & DSystems)和500ng/ml抗-IFN抗體(Phamingen)以備Th2分化。3天后，裂解細(xì)胞提取RNA，或者徹底洗滌、計(jì)數(shù)并在ConA(2.5μg/ml)存在的條件下或者在包被了5μg/ml抗-CD3抗體的板上再次激活密度為106細(xì)胞/ml的細(xì)胞。24小時(shí)后，收集上清液并分析細(xì)胞因子的存在。
總免疫球蛋白和OVA-特異性免疫球蛋白水平給12周齡或更大些的未免疫小鼠放血，ELISA分析血清中各種免疫球蛋白同種型的存在。對于抗-OVA特異抗體，用100μg在完全Freund′s佐劑中的OVA(i.p.)免疫6周齡野生型或TCCR-缺陷小鼠，21天后，用100μg在不完全Freund′s佐劑中的OVA(i.p.)攻擊。攻擊的7天后，給小鼠放血并分析血清中OVA-特異性抗體的存在。
實(shí)時(shí)PCR分析經(jīng)FACS而將鼠脾細(xì)胞區(qū)分出T輔助細(xì)胞(CD4陽性，F(xiàn)4/80陰性，97％純)、B細(xì)胞(CD19陽性，97％純)、自然殺傷細(xì)胞(NK1.1陽性，99％純)和巨噬細(xì)胞(F4/80陽性，＞95％純)，經(jīng)MACS區(qū)分出細(xì)胞毒T細(xì)胞(CD8陽性，85％純)。Qiagen RNeasy柱提取總RNA，并用DNA酶I消化以除去污染的DNA。使用Taqman 18探測TCCR RNA。所有反應(yīng)均作平行雙份，并參照rp119這種核蛋白體管家基因而標(biāo)準(zhǔn)化。包括一個(gè)沒有RT對照的反應(yīng)，該反應(yīng)顯示所有樣品均未被DNA污染。所有引物和探針的序列示于圖19。
用匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)免疫野生型和TCCR-缺陷小鼠，9天后，收獲引流淋巴結(jié)，評價(jià)在體外用KLH刺激后細(xì)胞因子的產(chǎn)生(圖16A和B)。用KLH攻擊時(shí)，TCCR-缺陷細(xì)胞產(chǎn)生IFN的能力顯著削弱，而IL-4的產(chǎn)生明顯增加。IL-5的產(chǎn)生和抗原誘導(dǎo)的TCCR-缺陷小鼠致敏淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖是正常的(圖16C和16D)。測得LPS刺激后TCCR-缺陷小鼠的IFN產(chǎn)生水平正常，表明這些小鼠的IFN產(chǎn)生似乎沒有本質(zhì)的缺陷。這些結(jié)果指出，TCCR-缺陷小鼠在增加Th1反應(yīng)方面的能力受損。Th1反應(yīng)的損失伴隨著Th2反應(yīng)的增強(qiáng)，此與在Th1細(xì)胞因子如IL-12缺陷的小鼠中所觀察到的情況相似(Magram，J.等，1996，Immunity，4471-81；Wu，C.等，1997，J.Immunol.，1591658-65)。
除調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用外，IFN也參與免疫球蛋白(Ig)同種型的調(diào)節(jié)。特別是，已知IFN增強(qiáng)IgG2a抗體的產(chǎn)生，以及較小程度的IgG3抗體的產(chǎn)生(Snapper，C.M.，& Paul，W.E.，1987，Science，236944-7；Huang，S.，等，1993，Science，2591742-5)。與Th1細(xì)胞IFN的產(chǎn)生減少一致的是，TCCR-缺陷小鼠總血清IgG2a濃度降低而所有其它免疫球蛋白同種型的水平是正常的(圖17A)。而且，用卵白蛋白(OVA)體內(nèi)攻擊后，TCCR-缺陷小鼠OVA-特異性IgG2a的滴度急劇下降(約為對照的20％；圖17B)。
Th1反應(yīng)在針對細(xì)胞內(nèi)病原體如單核細(xì)胞增多性李斯特桿菌(L.monocytogenes)的防御中是至關(guān)重要的。為了進(jìn)一步確定TCCR在體內(nèi)控制Th1反應(yīng)中的作用，用亞致死量(3×104菌落形成單位(CFU))的單核細(xì)胞增多性李斯特桿菌感染TCCR-缺陷小鼠和對照同窩鼠。感染的3天或9天后測定細(xì)菌滴度，發(fā)現(xiàn)TCCR-缺陷小鼠肝臟中的細(xì)菌滴度最多高出106-倍(圖17C)。
之后，研究了TCCR在介導(dǎo)體外Th1反應(yīng)分化方面的作用。在適宜Th1或Th2細(xì)胞發(fā)育的條件下，在有經(jīng)照射的APC存在時(shí)，取自野生型和TCCR-缺陷小鼠的CD4+T細(xì)胞在體外分化。培養(yǎng)3-4天后，洗滌細(xì)胞，并ConA再刺激，24小時(shí)后，分析上清液中細(xì)胞因子的存在。當(dāng)分化為Th1細(xì)胞時(shí)，TCCR-缺陷型淋巴細(xì)胞較其野生型同窩鼠淋巴細(xì)胞的IFN-產(chǎn)生量減少80％(圖18A)。相反地，在IL-4和抗-IFN-抗體存在的條件下生長的TCCR-缺陷型淋巴細(xì)胞產(chǎn)生略多的IL-4。使用CD4+CD45Rbhigh天然完整細(xì)胞得到類似結(jié)果。該效應(yīng)對于T細(xì)胞是固有的，其原因有2個(gè)首先，在APC存在時(shí)，得自野生型或TCCR-缺陷小鼠的T細(xì)胞的分化結(jié)果相似。第二，使用板-固相化抗-CD3/CD28，在不含APC的系統(tǒng)中進(jìn)行T細(xì)胞分化，可重現(xiàn)該效應(yīng)(圖18B)。用細(xì)胞內(nèi)FACS染色測定發(fā)現(xiàn)，IFN產(chǎn)生的減少也與IFN產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)量的減少有關(guān)。由于受體的兩個(gè)亞單位在活化的T-細(xì)胞上正常表達(dá)，所以觀察到的Th1缺乏并不是IL-12受體缺陷的結(jié)果。既然IL-12仍能夠促進(jìn)ConA刺激的野生型和TCCR-缺陷小鼠T細(xì)胞的增殖，看來這些小鼠的IL-12信號通路沒有缺陷(圖18C和18D)。
表3(A-Q)提供ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序的完整源代碼。它可常規(guī)應(yīng)用于UNIX操作系統(tǒng)以便提供ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序。
表2APROXXXXXXXXXXXXXXX(長度＝15個(gè)氨基酸)對照蛋白質(zhì) XXXXXYYYYYYY(長度＝12個(gè)氨基酸)氨基酸序列同源性％＝(用ALIGN-2測定對比兩個(gè)多肽序列之間相同氨基酸殘基的數(shù)量)除以(PRO多肽氨基酸殘基的總數(shù))＝5除以15＝33.3％。
表2BPRO XXXXXXXXXX(長度＝10個(gè)氨基酸)對照蛋白質(zhì)XXXXXYYYYYYZZYZ(長度＝15個(gè)氨基酸)氨基酸序列同源性％＝(用ALIGN-2測定對比兩個(gè)多肽序列之間相同氨基酸殘基的數(shù)量)除以(PRO多肽氨基酸殘基的總數(shù))＝5除以10＝50％。
表2CPRO-DNANNNNNNNNNNNNNN(長度＝14個(gè)核苷酸)對照DNANNNNNNLLLLLLLLLL(長度＝16個(gè)核苷酸)核酸序列同源性％＝(用ALIGN-2測定對比兩個(gè)核酸序列之間相同核苷酸的數(shù)量)除以(PRO-DNA核酸序列)＝6除以14＝42.9％。
表2DPRO-DNANNNNNNNNNNNN(長度＝12個(gè)核苷酸)對照DNANNNNLLLVV(長度＝9個(gè)核苷酸)核酸序列同源性％＝(用ALIGN-2測定對比兩個(gè)核酸序列之間相同核苷酸的數(shù)量)除以(PRO-DNA核酸序列)＝4除以12＝33.3％。
表3A<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[/* * * C-C increased from 12 to 15 * Z is average of EQ * B is average of ND * match with stop is_M;stop-stop=0;J(joker)match=0 */#define _M -8 /* value of a match with a stop */int _day[26][26]={/* A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z*//* A */ {2,0,-2,0,0,-4,1,-1,-1,0,-1,-2,-1,0,_M,1,0,-2,1,1,0,0,-6,0,-3,0},/* B */ {0,3,-4,3,2,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,2,_M,-1,1,0,0,0,0,-2,-5,0,-3,1},/* C */ {-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2,0,-5,-6,-5,-4,_M,-3,-5,-4,0,-2,0,-2,-8,0,0,-5},/* D */ {0,3,-5,4,3,-6,1,1,-2,0,0,-4,-3,2,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,2},/* E */ {0,2,-5,3,4,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,1,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,3},/* F */ {-4,-5,-4,-6,-5,9,-5,-2,1,0,-5,2,0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3,0,-1,0,0,7,-5},/* G */ {1,0,-3,1,0,-5,5,-2,-3,0,-2,-4,-3,0,_M,-1,-1,-3,1,0, 0,-1,-7,0,-5,0},/* H */ {-1,1,-3,1,1,-2,-2,6,-2,0,0,-2,-2,2,_M,0,3,2,-1,-1,0,-2,-3,0,0,2},/* I */ {-1,-2,-2,-2,-2,1,-3,-2,5,0,-2,2,2,-2,_M,-2,-2,-2,-1,0,0,4,-5,0,-1,-2},/* J */ { 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},/* K */ {-1,0,-5,0,0,-5,-2,0,-2,0,5,-3,0,1,_M,-1,1,3,0,0,0,-2,-3,0,-4,0},/* L */ {-2,-3,-6,-4,-3,2,-4,-2,2,0,-3,6,4,-3,_M,-3,-2,-3,-3,-1,0,2,-2,0,-1,-2},/* M */ {-1,-2,-5,-3,-2,0,-3,-2,2,0,0,4,6,-2,_M,-2,-1,0,-2,-1,0,2,-4,0,-2,-1},/* N */ {0,2,-4,2,1,-4,0,2,-2,0,1,-3,-2,2,_M,-1,1,0,1,0,0,-2,-4,0,-2,1},/* O */ {_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,0,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M},/* P */ {1,-1,-3,-1,-1,-5,-1,0,-2,0,-1,-3,-2,-1,_M,6,0,0,1,0,0,-1,-6,0,-5,0},/* Q */ {0,1,-5,2,2,-5,-1,3,-2,0,1,-2,-1,1,_M,0,4,1,_1,-1,0,-2,-5,0,-4,3},/* R */ {-2,0,-4,-1,-1,-4,-3,2,-2,0,3,-3,0,0,_M,0,1,6,0,-1,0,-2,2,0,-4,0},/* S */ {1,0,0,0,0,-3,1,-1,-1,0,0,-3,-2,1,_M,1,-1,0,2,1,0,-1,-2,0,-3,0},/* T */ {1,0,-2,0,0,-3,0,-1,0,0,0,-1,-1,0,_M,0,-1,-1,1,3,0,0,-5,0,-3,0},/* U */ {0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},/* V */ {0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2,4,0,-2,2,2,-2,_M,-1,-2,-2,-1,0,0,4,-6,0,-2,-2},/* W */ {-6,-5,-8,-7,-7,0,-7,-3,-5,0,-3,-2,-4,-4,_M,-6,-5,2,-2,-5,0,-6,17,0,0,-6},/* X */ {0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},/* Y */ {-3,-3,0,-4,-4,7,-5,0,-1,0,-4,-1,-2,-2,_M,-5,-4,-4,-3,-3,0,-2,0,0,10,-4},/* Z */ {0,1,-5,2,3,-5,0,2,-2,0,0,-2,-1,1,_M,0,3,0,0,0,0,-2,-6,0,-4,4}}; Page 1 of day.h]]></pre>
表3B<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[/* */#include＜stdio.h＞#include＜ctype.h＞#define MAXJMP 16 /* max jumps in a diag */#define MAXGAP 24 /* don't continue to penalize gaps larger than this */#define JMPS1024/* max jmps in an path */#define MX 4 /* save if there's at least MX-1 bases since last jmp */#define DMAT3 /* value of matching bases */#define DMIS0 /* penalty for mismatched bases */#define DINS0 8 /* penalty for a gap */#define DINS1 1 /* penalty per base */#define PINS0 8 /* penalty for a gap */#define PINS1 4 /* penalty per residue */struct jmp{ short n[MAXJMP]; /* size of jmp(neg for dely) */ unsigned short x[MAXJMP]; /* base no.of jmp in seq x */}; /* limits seq to 2^16-1*/struct diag{ int score; /* score at last jmp */ longoffset; /* offset of prev block */ short ijmp; /* current jmp index */ struct jmp jp; /* list of jmps */};struct path{ int spc;/* number of leading spaees */ shortn[JMPS];/* size of jmp (gap) */ int x[JMPS];/* loc of jmp(last elem before gap)*/};char *ofile; /* output file name */char *namex{2];/* seq names getseqs() */char *prog;/* prog name for err msgs */char *seqx[2]; /* seqs:getscqs() */int dmax; /* best diag:nw() */int dmax(); /* final diag */int dna; /* set if dna:main() */int endgaps; /* set if penalizing end gaps */int gapx,gapy;/* total gaps in seqs */int len0,len1;/* seq lens */int ngapx,ngapy; /* total size of gaps */int smax; /* max score:nw() */int *xbm; /* bitmap for matching */long offset; /* currenl offset in jmp file */struct diag *dx; /* holds diagonals */struct path pp[2];/* holds path for seqs */char *calloc(),*malloc(),*index(),*strepy();char *getseq(),*g_calloc(); Page 1 of nw.h]]></pre>
表3C<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[/* Needleman-Wunsch alignment program * * usage:progs filel file2 * where file1 and file2 are two dna or two protein sequences. * The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity * Any lines beginning with ';', '＞' or '＜' are ignored * Max file length is 65535(limited by unsigned short x in the jmp struct) * A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA * Output is in thc file ″align.out″ * * The program may create a tmp file in/tmp to hold info about traceback. * Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650 */#include ″nw.h″#include ″day.h″static _dbval[26]={ 1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0};static _pbval[26]={ 1,21(1＜＜('D'-'A'))1(1＜＜('N'-'A')),4,8,16,32,64, 128,256,0xFFFFFFF,1＜＜10,1＜＜11,1＜＜12,1＜＜13,1＜＜14, 1＜＜15,1＜＜16,1＜＜17,1＜＜18,1＜＜19,1＜＜20,＜＜21,1＜＜22, 1＜＜23,1＜＜24,1＜＜251(1＜＜('E'-'A'))1(1＜＜('Q'-'A'))main(ac,av) main int ac; char *av[];{ prog=av
; if(ac!=3){ fprintf(stdcrr,″usage:%s file1 file2\n″,prog); fprintf(stderr,″wherc file1 and file2 are two dna or two protein sequences.\n″); fprintf(stderr,″The sequences can be in upper- or lower-case\n″); fprintf(stderr,″Any lines beginning with ';' or'＜' are ignored\n″); fprintf(stderr,″Output is in the file \″align.out\″\n″); exit(1); } namex
=ay[1]; namex[1]=av[2]; seqx
=gatseq(namex
,&amp;len0); seqx[1]=getseq(namex[1],&amp;len1); xbm=(dna) _dbval:_pbval; endgaps=0; /* 1 to penalize endgaps */ ofile= ″align.out″; /* output file */ nw(); /* fill in the matrix,gct the possible jmps */ readjmps(); /* get the actual jmps */ print(); /* print stats,alignment */ clcanup(0); /* unlink any tmp files */} Page 1 of nw.c]]></pre>
表3D<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[/*do the alignment,retum best score:main() * dna:values in Fitch and Smith,PNAS,80,1382-1386,1983 * pro:PAM 250 values * When scores are equal,we prefer mismatches to any gap,prefer * a new gap to extending an ongoing gap,and prefer a gap in seqx * to a gap in seq y. */nw() nw{char *px,*py; /* seqs and ptrs */int *ndely,*dely; /* keep track of dely */int ndelx,delx;/* keep track of delx */int *tmp; /* for swapping row0,row1 */int mis; /* score for each type */int ins0,ins1; /* insertion penalties */register id;/* diagonal index */register ij;/* jmp index */register *col0,*col1; /* score for curr,last row */register xx,yy; /* index into seqs */dx=(struct diag *)g_calloc(″to get diags″,lcn0+len1+1,sizeof(struct diag));ndely=(int *)g_calloc(″to get ndely″,len1+1,sizeof(int));dely=(int *)g_calloc(″to get dely″,len1+1,sizeof(int));col0=(int *)g_calloc(″to get col0″,len1+1,sizeof(int));col1=(int *)g_calloc(″to get col1″,len1+1,sizeof(int));ins0=(dna) DINS0:PINS0;ins1=(dna) DINS1:PINS1;smax=-10000;if(endgaps){for(col0
=dely
=-ins0,yy=1;yy＜=len1;yy++){col0[yy]=dely{yy]=col0[yy-1]-ins1;ndely[yy]=yy; }col0
=0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */ }elsefor(yy=1;yy＜=len1;yy4+)dely[yy]=-ins0;/* fill in match matrix */for(px=seqx
,xx=1;xx＜=len0;px++,xx++){/* initialize first entry in col */if(endgaps){ if(xx==1) col1
=delx=-(ins0+ins1); else col1
=delx=col0
-ins1; ndelx=xx; } elsc{ col1
=0; delx=-ins0; ndelx=0; } Page 2 of nw.c]]></pre>
表3E<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[ ...nwfor(py=seqx[1],yy=1;yy＜=len1;py++,yy++){mis=col0[yy-1];if(dna) mis+=(xbm[*px-'A']&amp;xbm[*py-'A']) DMAT:DMIS;else mis+=_day[*px-'A'][*py-'A'];/* update penalty for del in x seq; * favor new del over ongong del * ignore MAXGAP if weighting endgaps */if(endgaps‖ndely[yy]＜MAXGAP){ if(col0[yy]-ins0＞=dely[yy]){dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1);ndely[yy]=1; }else{dely[yy]-=ins1;ndely[yy]++; } }else{ if(col0[yy]-(ins0+ins1)＞=dely[yy]){dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1);ndely[yy]=1; }elsendely[yy]++; } /* update penalty for del in y seq; * favor new del over ongong del */ if(endgaps‖ndelx＜MAXGAP){ if(col1[yy-1]-ins0＞=delx){ delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1); ndelx=1; }else{ delx-=ins1; ndelx++; } }else{ if(col1[yy-1]-(ins0+ins1)＞=delx){ delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1); ndelx=1; }else ndelx++; } /* pick the maximum score;we're favoring * mis over any del and delx over dely */ Page 3 of nw.c]]></pre>
表3F<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[ id=xx-yy+len1-1: if(mis＞=delx &amp;&amp; mis＞=dely[yy])col1[yy]=mis; else if(delx＞=dely[yy]){col1[yy]=delx;ij=dx[id].ijmp;if(dx[id].jp.n
&amp;&amp;(!dna‖(ndclx＞=MAXJMP&amp;&amp; xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)‖mis＞dx[id].score+DINSO)){ dx[id].ijmp++; if(++ij＞=MAXJMP){ writejmps(id); ij=dx[id].ijmp=0; dx[id].offset=offset; offset+=sizeof(struct jmp)+sizeof(offset); } } dx[id].jp.n[ij]=ndelx; dx[id[.jp.x[ij]=xx: dx[id].score=delx;} else{ col1[yy]=dely[yy]; ij=dx[id].ijmp; if(dx[id].jp.n
&amp;&amp;(!dna ‖(ndely[yy]＞=MAXJMP &amp;&amp; xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)‖mis＞dx[id].score+DINS0)){ dx[id].ijmp++; if(++ij＞=MAXJMP){writejmps(id);ij=dx[id].ijmp=0;dx[id].offset=offset;offset+=sizeof(struct jmp)+sizeof(offset); } }dx[id]-jp.n[ij]=-ndely[yy];dx[id].jp.x[ij]=xx;dx[id].score=dely[yy]; } if(xx=len0 &amp;&amp; yy＜len1){/* last col */if(endgaps)col1[yy]-=ins0+ins1 *(len1-yy);if(col1[yy]＞smax){smax=col1[yy];dmax=id; } }}if(endgaps &amp;&amp; xx＜len0)col1[yy-1]-=ins0+ins1*(len0-xx);if(col1[yy-1]＞smax){smax=col1[yy-1];dmax=id; }tmp=col0;col0=col1;col1=tmp; } (void)free((char *)ndcly); (void)free((char *)dcly); (void)free((char *)col0); (void)free((char *)col1);} Page 4 of nw.c]]></pre>
表3G<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[/* * * print()--only routine visible outside this module * static: * getmat()--trace back best path,count matches:print() * pr_align()--print alignment of described in array p[]:print() * dumpblock()--dump a block of lines with numbers,stars:pr_align() * nums()--put out a number line:dumpblock() * putline()--put out a line(name,[num],seq,[num]):dumpblock() * stars()--put a line of stars:dumpblock() * stripname()--strip any path and prefix from a seqname */#inelude ″nw.h″#define SPC3#define P_LINE 256 /* maximum output line */#define P_SPC 3/* space between name or num and seq */extern _day[26][26];int olen; /* set output line length */FILE *fx; /* output file */print() print{ int 1x,1y,firstgap,lastgap; /* overlap */ if((fx=fopen(ofile,″w″))=0){ fprintf(stderr,″%s:can't write %s\n″,prog,ofile); cleanup(1); } fprintf(fx,″＜first sequence:%s(length=%d)\n″,namex
,len0); fprintf(fx,″＜second sequence:%s(length=%d)\n″,namex[1],len1); olen=60; 1x=len0; 1y=len1; firstgap=lastgap=0; if(dmax＜len1-1){ /* leading gap in x */ pp
.spc=firstgap=len1-dmax-1; 1y-=pp
.spc; } else if(dmax＞len1-1){ /* leading gap in y */ pp[1].spc=firstgap=dmax-(len1-1); 1x-=pp[1].spc; } if(dmax0＜len0-1){ /* trailing gap in x */ lastgap=len0-dmax0-1; 1x-=lastgap; } else if(dmax0＞len0-1){/* trailing gap in y */ lastgap=dmax0-(len0-1); 1y-=lastgap; } getmat(1x,1y,firstgap,lastgap); pr_align();} Page 1 of nwprint.c]]></pre>
表3H<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[/* * trace back the best path,count matches */statiegetmat(1x,1y,firstgap,lastgap) getmat int 1x,1y; /* ″core″(minus endgaps) */ int firstgap,lastgap; /* leading trailing overlap */{ int nm,i0,i1,siz0, siz1; charoutx[32]; double pct; registern0,n1; register char *p0,*p1; /* get total matches,score */ i0=i1=siz0=siz1=0; p0=seqx
+pp[1].spc; p1=seqx[1]+pp
.spe; n0=pp[1].spc+1; n1=pp
.spc+1; nm=0; while(*p0 &amp;&amp; *p1){ if(siz0){ p1++; h1++; siz0--;} else if(siz1){ p0++; n0++; siz1--;} else{ if(xbm[*p0-'A']&amp;xbm[*p1 -'A']) nm++; if(n0++==pp
.x[i0]) siz0=pp
.n[i0++]; if(n1++==pp[1].x[i1]) sizl=pp[1].n[i1++]; p0++; pt++; } } /* pet homology: * if penalizing endgaps,base is the shorter seq * else,knock off overhangs and take shorter core */ if(endgaps) 1x=(len0＜len1) len0:len1; else 1x=(1x＜1y) 1x:1y; pet=100.*(double)nm/(double)1x; fprintf(fx,″\n″); fprintf(fx,″＜%d match%s in an overlap of %d:%.2f percent similarity\n″, nm,(nm==1) ″″:″e(cuò)s″,1x,pct); Page 2 of nwprint.c]]></pre>
表3I<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[ fprintf(fx,″＜gaps in first sequence:%d″,gapx); ...getmat if(gapx){ (void)sprintf(outx,″(%d %s %s)″,ngapx,(dna) ″basc″:″residue″,(ngapx==1) ″″:″s″);fprintf(fx,″%s″,outx); fprintf(fx,″,gaps in second sequence:%d″,gapy); if(gapy){(void)sprintf(outx,″(%d %s %s)″,ngapy,(dna) ″base″:″residue″,(ngapy==1) ″″:″s″);fprinff(fx,″%s″,outx); } if(dna)fprintf(fx,″\n＜score:%d(match=%d,mismatch=%d,gap penalty=%d+%d per base)\n″,smax,DMAT,DMIS,DINS0,DINS1); elsefprintf(fx,″\n＜score;%d(Dayhoff PAM 250 matrix,gap penalty=%d+%d per residue)\n″,smax,PINS0,PINS1);if(endgaps)fprintf(fx,″＜endgaps penalized.left endgap:%d %s %s,right endgap:%d %s%s\n″,firstgap,(dna) ″base″:″residue″,(firstgap==1) ″″:″s″,lastgap,(dna) ″base″:″residue″,(lastgap==1) ″″:″s″);elsefprintf(fx,″＜endgaps not penalized\n″);}static nm; /* matches in core--for checking */static lnax; /* lengths of stripped file names */static ij[2]; /* jmp index for a path */static nc[2]; /* number at start of current line */static ni[2]; /* current clem number--tor gapping */static siz[2];static char *ps[2]; /* ptr to current element */static char *po[2]; /* ptr to next output char slot */static char out[2][P_LINE]; /* output line */static char star[P_LINE]; /* set by stars() *//* * print alignment of described in struct path pp[] */staticpr_align() pr_align{int nn;/* char count */int more;register i;for(i=0,lmax=0;i＜2;i++){nn=stripname(namex[i]);if(nn＞lmax) lmax=nn;nc[i]=1;ni[i]=1;siz[i]=ij[i]=0;ps[i]=seqx[i];po[i]=out[i];}Page 3 of nwprint.c]]></pre>
表3J<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[ for(nn=nm=0,more=1;more;){...pr_align for(i=more=0;i＜2;i++){ /** do we have more of this scquence */ if(!*ps[i]) continue; more++; if(pp[i].spc){ /* lcading space */ *po[i]++=″; pp[i].spc--; } else if (siz[i]){ /* in a gap */ *po[i]++= '-'; siz[i]--; } else{ /* we're putting a seq clement */ *po[i]=*ps[i]; if(islower(*ps[i])) *ps[i]=toupper(*ps[1]); po[i]++; ps[i]++; /* * are we at next gap for this seq */ if(ni[i]=pp[i].x[ij[i]]){ /* * we need to merge all gaps * at this location */ siz[i]=pp[i].n[ij[i]++]; while (ni[i]==pp[i].x[ij[i]])siz[i]+=pp[i].n[ij[i]++]; } no[i]++,} } it(++nn==olen‖!more &amp;&amp; nn){dumpblock();for(i=0;i＜2;i++) po[i]=out[i];nn=0; } }/* * dump a block of lines,including numbers,stars:pr_align() */staticdumpblock() dumpblock{ register i; for(i=0;i＜2;i++) *po[i]--=\0'; Page 4 of nwprint.c]]></pre>
表3K<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[ ...dumpblock(void)putc(\n', fx);for(i=0;i＜2;i++){ if(*out[i]&amp;&amp;(*out[i]!=″‖*(po[i])!=″)) { if(i==0)nums(i); if(i==0 &amp;&amp; *out[1])stars(); putline(i); if(i==0 &amp;&amp; *out[1])fprintf(fx,star); if(i==1)nums(i);} }/* * put out a number line:dumpblock() */staticnums(ix) numsint ix; /* index in out[]holding seq line */{ char nline[P_LINE];register i,j;register char*pn,*px,*py;for(pn=nline,i=0;i＜1max+P_SPC;i++,pn++) *pn=″;for(i=nc[ix],py=out[ix];*py;py++,pn++){ if(*py==″‖ *py=='-') *pn=″; else{ if(i％10=0‖(i=1 &amp;&amp; nc[ix]!=1)){ j=(i＜0) -i:i; for(px=pn;j;j/=10,px--) *px=j％10+'0'; if(i＜0) *px='-';} else *pn=″; i++;}}*pn=\0';nc[ix]=i;for(pn=nline;*pn;pn++)(void)putc(*pn,fx);(void)putc(\n',fx);}/* * put out a line(name,[num],seq,[num]):dumpblock() */staticputline(ix) putlineint ix;{ Page 5 of nwprint.c]]></pre>
表3L<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[...putlinc int i; register char *px; for(px=namex[ix],i=0;*px &amp;&amp; *px!=':';px++,i++) (void)putc(*px,fx); for(;i＜1max+P_SPC;i++) (void)putc(″,fx); /* these count from 1:* ni[]is curent element(from 1)* nc[]is number at start of current line*/ for(px=out[ix];*px;px++) (void)putc(*px&amp;0x7F,fx); (void)putc(\n',fx);}/* * put a linc of stars(seqs always in out
,out[1]):dumpblock() */staticstars() stars{ int i; register char *p0,*p1,cx.*px; if(!*out
‖(*out
==″&amp;&amp; *(po
)==″)‖ !*out[1]‖(*out[1]==″&amp;&amp; *(po[1])==″))return;px=star;for(i=lmax+P_SPC;i;i--)*px++=”;for(p0=out
,p1=out[1];*p0 &amp;&amp; *p1;p0++,p1++) {if(isalpha(*p0) &amp;&amp; isalpha(*p1)){ if(xbm[*p0-'A']&amp;xbm[*p1-'A']){ cx='*' nm++; } else if(!dna &amp;&amp; _day[*p0-'A'][*p1-'A']＞0) cx='.'; else cx=''; } else cx=''；*px++=cx;}*px++=\n';*px=\0';} Page 6 of nwprint.c]]></pre>
表3M<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[/** strip path or prefix from pn,return len:pr_align()*/staticstripname(pn) stripnamechar *pn; /* file name(may be path) */{register char *px,*py;py=0;for(px=pn;*px;px++) if(*px=='/') py=px+1; if(py) (void)strcpy(pn,py);return(strlen(pn));}Page 7 of nwprint.c]]></pre>
表3N<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[/* * cleanup()--cleanup any trap file * getseq()--read in seq,scet dna,len,maxlen * g_calloc()--calloc()with error checkin * readjmps()--get the good imps,from tmp file if necessary * writejmps()--write a filled array ofjmps to a trap file;nw() */#include ″nw.h″#include＜sys/filc.h＞char *jname=″/tmp/homgXXXXXX″; /* tmp file for jmps */FILE *fj;int cleanup(); /* cleanup imp file */long Iseek();/* * remove any tmp file if we blow */cleanup(i) cleanup int i;{ if(fj) (void) unlink(jname); exit(i);}/* * read,return ptr to seq,set dna,len,maxlen * skip lines starting with ';', '＜', or'>' * seq in upper or lower case */char *getseq(file,len) getseq char *file; /* file name */ iht *Ien;/* seq len */ { char line, *pseq; register char *px,*py; int natgc,tlen; FILE *fp; if((fp=fopen(file,″r″))==O){ fprintf(stderr,″%s:can't read %s\n″,prog,file); exit(1); } tlen=natgc=0; while(fgets(line,1024.fp)){ if(*line ==';'‖*line=='＜'‖*line =='>') continue; for(px=line;*px!=\n';px++) if(isupper(*px)‖islower(*px)) tlen++; } if((pseq=malloc((unsigned)(tlen+6)))==0){ fprintf(stderr,″%s:malloc()failed to get %d bytes for %s\n″,prog,tlen+6,file); exit(1); } pseq
=pseq[1]=pseq[2]=pseq[3]=\0'; Page 1 of nwsubr.c]]></pre>
表3O<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[...getseq py=pseq+4; *len=tlen; rewind(fp); while(fgets(linc,1024,fp)){if(*linc==';' ||*linc== '＜' ||*line=='>') continue:for(px=line;*px!=\n';px++){ if(isupped*px)) *py++=*px; else if(islower(*px)) *py++=toupper(*px); if(index(″ATGCU″,*(py-1))) natgc++;} } *py++=\0'; *py=\0'; (void)fclose(fp); dna=natgc＞(tlen/3); return(pseq+4);}char *g_calloc(msg,nx,sz) g_calloc char *msg; /* program,calling routine */ int nx,sz; /* number and size of elements */{ char *px,*calloc(); if((px=calloc((unsigned)nx,(unsigned)sz))==0){if(*msg){ fprintf(stderr,″%s:g_calloc()failed %s(n=%d,sz=%d)\n″,prog,msg,nx,sz); exit(I);} } return(px);}/* * get final jmps from dx[] or tmp file.set pp[],rcset dmax:main() */readjmps()readjmps{ int fd=-1; int siz,i0,i1; register i,j,xx; if(fj){ (void)fclose(fj); if{(fd=open(jname,O_RDONLY,0))＜0){ fprintf(stderr,″%s:can't open() %s\n″,prog,jname); cleanup(1);} } for(i=i0=i1=0,dmax0=dmax,xx=len0;;i++){ while(1){ for(j=dx[dmax].ijmp;j＞=0 &amp;&amp; dx[dmax].jp.x[j]＞=xx;j--); Page 2 of nwsubr.c]]></pre>
表3P<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[ ...readjnps if(j＜0&amp;&amp;dx[dmax].offset &amp;&amp; fj){ (void)lseek(fd,dx[dmax].offset,0); (void)read(fd,(char *)&amp;dx[dmax].jp,sizeof(struct jmp)); (void)read(fd,(char *)&amp;dx[dmax].offset,sizeof(dx[dmax].offset)); dx[dmax].ijmp=MAXJMP-1; } else break; } if(i＞=JMPS){ fprintf(stderr,″%s:too many gaps in alignment\n″,prog); cleanup(1); } if(j＞=0){ siz=dx[dmax].jp.n[j]; xx=dx[dmax].jp.x[j]; dmax+=siz; if(siz＜0){ /* gap in second seq */ pp[1].n[i1]=-siz; xx+=siz; /*id=xx-yy+len1-1 */ pp[1].x[i1]=xx-dmax+lcn1-1; gapy++; ngapy-=siz;/*ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz=(-siz＜MAXGAP‖endgaps) -siz:MAXGAP; i1++; } else if(siz＞0){ /* gap in first seq */ pp
.n[i0]=siz; pp
.x[i0]=xx; gapx++; ngapx+=siz;/*ignorc MAXGAP when doing endgaps */ siz=(siz＜MAXGAP‖endgaps) sizMAXGAP; i0++; } } else break; } /*reverse the order of jmps */ for(j=0,i0--;j＜i0;j++,i0-){ i=pp
.n[j];pp
.n[j]=pP
.n[i0];pp
.n[i0]=i; i=pp
.x[j];pp
.x[j]=pp
.x[i0];pp
.x[i0]=i;} for(j=0,i1--;j＜i1;j++,i1--){ i=pp[1].n[j];pp[1].n[j]=pp[1].n[i1];pp[1].n[i1]=i; i=pp[1].x[j];pp[1].x[j]=pp[1].x[i1];pp[1].x[i1]=i;} if(fd＞=0) (void)close(fd); if(fj){ (void)unlink(jname); fj=0; offset=0;}} Page 3 of nwsubr.c]]></pre>
表3Q<pre listing-type="program-listing"><![CDATA[/* * write a filled jmp struct offset of the prev one(if any):nw() */writejmps(ix)writejmps int ix;{ char *mktemp(); if(!fj){ if(mktemp(jname)＜0){fprintf(stderr,″s:can't mktemp()%s\n″,prog,jname);cleanup(I); } if((fj=fopen(jname,″w″))==0){fprintf(stderr,″%s:can't write %s\n″,prog,jname);exit(1); } } (void)fwrite((ehar *)&amp;dx[ix].jp,sizeof(struet imp),1,fj); (void)fwrite((char *)&amp;dx[ix].offset,sizeof(dx[ix].offset),1,fj);}]]></pre>
序列表序列表&lt;110&gt;杰南技術(shù)公司(Genentech，Inc.)弗雷德里克.J.德索韋格(De Sauvage，F(xiàn)rederic)伊奎貝爾.格雷沃爾(Grewal，Iqbal)奧斯汀.L.格尼(Gurney，Austin L.)&lt;120&gt;I型細(xì)胞因子受體TCCR&lt;130&gt;P1748R1PCT&lt;140&gt;PCT/US00/28827&lt;141&gt;2000-10-18&lt;150&gt;US 60/160,542&lt;151&gt;1999-10-20&lt;160&gt;16&lt;210&gt;1&lt;211&gt;636&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;人(Homo sapiens)&lt;400&gt;1Met Arg Gly Gly Arg Gly Ala Pro Phe Trp Leu Trp Pro Leu Pro1 5 10 15Lys Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Trp Val Leu Phe Gln Arg Thr20 25 30Arg Pro Gln Gly Ser Ala Gly Pro Leu Gln Cys Tyr Gly Val Gly35 40 45Pro Leu Gly Asp Leu Asn Cys Ser Trp Glu Pro Leu Gly Asp Leu50 55 60Gly Ala Pro Ser Glu Leu His Leu Gln Ser Gln Lys Tyr Arg Ser65 70 75Asn Lys Thr Gln Thr Val Ala Val Ala Ala Gly Arg Ser Trp Val80 85 90Ala lle Pro Arg Glu Gln Leu Thr Met Ser Asp Lys Leu Leu Val95 100 105Trp Gly Thr Lys Ala Gly Gln Pro Leu Trp Pro Pro Val Phe Val110 115 120Asn Leu Glu Thr Gln Met Lys Pro Asn Ala Pro Arg Leu Gly Pro125 130 135Asp Val Asp Phe Ser Glu Asp Asp Pro Leu Glu Ala Thr Val His140 145 150Trp Ala Pro Pro Thr Trp Pro Ser His Lys Val Leu Ile Cys Gln155 160 165Phe His Tyr Arg Arg Cys Gln Glu Ala Ala Trp Thr Leu Leu Glu170 175 180Pro Glu Leu Lys Thr Ile Pro Leu Thr Pro Val Glu Ile Gln Asp185 190 195Leu Glu Leu Ala Thr Gly Tyr Lys Val Tyr Gly Arg Cys Arg Met200 205 210Glu Lys Glu Glu Asp Leu Trp Gly Glu Trp Ser Pro Ile Leu Ser215 220 225Phe Gln Thr Pro Pro Ser Ala Pro Lys Asp Val Trp Val Ser Gly230 235 240Asn Leu Cys Gly Thr Pro Gly Gly Glu Glu Pro Leu Leu Leu Trp245 250 255Lys Ala Pro Gly Pro Cys Val Gln Val Ser Tyr Lys Val Trp Phe260 265 270Trp Val Gly Gly Arg Glu Leu Ser Pro Glu Gly Ile Thr Cys Cys275 280 285Cys Ser Leu Ile Pro Ser Gly Ala Glu Trp Ala Arg Val Ser Ala290 295 300Val Asn Ala Thr Ser Trp Glu Pro Leu Thr Asn Leu Ser Leu Val305 310 315Cys Leu Asp Ser Ala Ser Ala Pro Arg Ser Val Ala Val Ser Ser320 325 330Ile Ala Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val Thr Trp Gln Pro Gly Pro335 340 345Gly Glu Pro Leu Glu His Val Val Asp Trp Ala Arg Asp Gly Asp350 355 360Pro Leu Glu Lys Leu Asn Trp Val Arg Leu Pro Pro Gly Asn Leu365 370 375Ser Ala Leu Leu Pro Gly Asn Phe Thr Val Gly Val Pro Tyr Arg380 385 390Ile Thr Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Gly Leu Ala Ser Ala Ser395 400 405Ser Val Trp Gly Phe Arg Glu Glu Leu Ala Pro Leu Val Gly Pro410 415 420Thr Leu Trp Arg Leu Gln Asp Ala Pro Pro Gly Thr Pro Ala Ile425 430 435Ala Trp Gly Glu Val Pro Arg His Gln Leu Arg Gly His Leu Thr440 445 450His Tyr Thr Leu Cys Ala Gln Ser Gly Thr Ser Pro Ser Val Cys455 460 465Met Asn Val Ser Gly Asn Thr Gln Ser Val Thr Leu Pro Asp Leu470 475 480Pro Trp Gly Pro Cys Glu Leu Trp Val Thr Ala Ser Thr Ile Ala485 490 495Gly Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ile Leu Arg Leu His Leu Pro Asp500 505 510Asn Thr Leu Arg Trp Lys Val Leu Pro Gly Ile Leu Phe Leu Trp515 520 525Gly Leu Phe Leu Leu Gly Cys Gly Leu Ser Leu Ala Thr Ser Gly530 535 540Arg Cys Tyr His Leu Arg His Lys Val Leu Pro Arg Trp Val Trp545 550 555Glu Lys Val Pro Asp Pro Ala Asn Ser Ser Ser Gly Gln Pro His560 565 570Met Glu Gln Val Pro Glu Ala Gln Pro Leu Gly Asp Leu Pro Ile575 580 585Leu Glu Val Glu Glu Met Glu Pro Pro Pro Val Met Glu Ser Ser590 595 600Gln Pro Ala Gln Ala Thr Ala Pro Leu Asp Ser Gly Tyr Glu Lys605 610 615His Phe Leu Pro Thr Pro Glu Glu Leu Gly Leu Leu Gly Pro Pro620 625 630Arg Pro Gln Val Leu Ala635&lt;210&gt;2&lt;211&gt;623&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;2Met Asn Arg Leu Arg Val Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Leu Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Met Ser Leu Leu Leu Gly Thr Arg Pro His Gly Ser20 25 30Pro Gly Pro Leu Gln Cys Tyr Ser Val Gly Pro Leu Gly Ile Leu35 40 45Asn Cys Ser Trp Glu Pro Leu Gly Asp Leu Glu Thr Pro Pro Val50 55 60Leu Tyr His Gln Ser Gln Lys Tyr His Pro Asn Arg Val Trp Glu65 70 75Val Lys Val Pro Ser Lys Gln Ser Trp Val Thr Ile Pro Arg Glu80 85 90Gln Phe Thr Met Ala Asp Lys Leu Leu Ile Trp Gly Thr Gln Lys95 100 105Gly Arg Pro Leu Trp Ser Ser Val Ser Val Asn Leu Glu Thr Gln110 115 120Met Lys Pro Asp Thr Pro Gln Ile Phe Ser Gln Val Asp Ile Ser125 130 135Glu Glu Ala Thr Leu Glu Ala Thr Val Gln Trp Ala Pro Pro Val140 145 150Trp Pro Pro Gln Lys Ala Leu Thr Cys Gln Phe Arg Tyr Lys Glu155 160 165Cys Gln Ala Glu Ala Trp Thr Arg Leu Glu Pro Gln Leu Lys Thr170 175 180Asp Gly Leu Thr Pro Val Glu Met Gln Asn Leu Glu Pro Gly Thr185 190 195Cys Tyr Gln Val Ser Gly Arg Cys Gln Val Glu Asn Gly Tyr Pro200 205 210Trp Gly Glu Trp Ser Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr Pro Phe Leu215 220 225Asp Pro Glu Asp Val Trp Val Ser Gly Thr Val Cys Glu Thr Ser230 235 240Gly Lys Arg Ala Ala Leu Leu Val Trp Lys Asp Pro Arg Pro Cys245 250 255Val Gln Val Thr Tyr Thr Val Trp Phe Gly Ala Gly Asp Ile Thr260 265 270Thr Thr Gln Glu Glu Val Pro Cys Cys Lys Ser Pro Val Pro Ala275 280 285Trp Met Glu Trp Ala Val Val Ser Pro Gly Asn Ser Thr Ser Trp290 295 300Val Pro Pro Thr Asn Leu Ser Leu Val Cys Leu Ala Pro Glu Ser305 310 315Ala Pro Cys Asp Val Gly Val Ser Ser Ala Asp Gly Ser Pro Gly320 325 330Ile Lys Val Thr Trp Lys Gln Gly Thr Arg Lys Pro Leu Glu Tyr335 340 345Val Val Asp Trp Ala Gln Asp Gly Asp Ser Leu Asp Lys Leu Asn350 355 360Trp Thr Arg Leu Pro Pro Gly Asn Leu Ser Thr Leu Leu Pro Gly365 370 375Glu Phe Lys Gly Gly Val Pro Tyr Arg Ile Thr Val Thr Ala Val380 385 390Tyr Ser Gly Gly Leu Ala Ala Ala Pro Ser Val Trp Gly Phe Arg395 400 405Glu Glu Leu Val Pro Leu Ala Gly Pro Ala Val Trp Arg Leu Pro410 415 420Asp Asp Pro Pro Gly Thr Pro Val Val Ala Trp Gly Glu Val Pro425 430 435Arg His Gln Leu Arg Gly Gln Ala Thr His Tyr Thr Phe Cys Ile440 445 450Gln Ser Arg Gly Leu Ser Thr Val Cys Arg Asn Val Ser Ser Gln455 460 465Thr Gln Thr Ala Thr Leu Pro Asn Leu His Ser Gly Ser Phe Lys470 475 480Leu Trp Val Thr Val Ser Thr Val Ala Gly Gln Gly Pro Pro Gly485 490 495Pro Asp Leu Ser Leu His Leu Pro Asp Asn Arg Ile Arg Trp Lys500 505 510Ala Leu Pro Trp Phe Leu Ser Leu Trp Gly Leu Leu Leu Met Gly515 520 525Cys Gly Leu Ser Leu Ala Ser Thr Arg Cys Leu Gln Ala Arg Cys530 535 540Leu His Trp Arg His Lys Leu Leu Pro Gln Trp Ile Trp Glu Arg545 550 555Val Pro Asp Pro Ala Asn Ser Asn Ser Gly Gln Pro Tyr Ile Lys560 565 570Glu Val Ser Leu Pro Gln Pro Pro Lys Asp Gly Pro Ile Leu Glu575 580 585Val Glu Glu Val Glu Leu Gln Pro Val Val Glu Ser Pro Lys Ala590 595 600Ser Ala Pro Ile Tyr Ser Gly Tyr Glu Lys His Phe Leu Pro Thr605 610 615Pro Glu Glu Leu Gly Leu Leu Val620&lt;210&gt;3&lt;211&gt;2646&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人(Homo sapiens)&lt;220&gt;&lt;221&gt;不確定&lt;222&gt;2433&lt;223&gt;未知堿基&lt;400&gt;3gtgggttcgg cttcccgttg cgcctcgggg gctgtaccca gagctcgaag 50aggagcagcg cggcccgcac ccggcaaggc tgggccggac tcggggctcc 100cgagggacgc catgcgggga ggcaggggcg cccctttctg gctgtggccg 150ctgcccaagc tggcgctgct gcctctgttg tgggtgcttt tccagcggac 200gcgtccccag ggcagcgccg ggccactgca gtgctacgga gttggaccct 250tgggcgactt gaactgctcg tgggagcctc ttggggacct gggagccccc 300tccgagttac acctccagag ccaaaagtac cgttccaaca aaacccagac 350tgtggcagtg gcagccggac ggagctgggt ggccattcct cgggaacagc 400tcaccatgtc tgacaaactc cttgtctggg gcactaaggc aggccagcct 450ctctggcccc ccgtcttcgt gaacctagaa acccaaatga agccaaacgc 500cccccggctg ggccctgacg tggacttttc cgaggatgac cccctggagg 550ccactgtcca ttgggcccca cctacatggc catctcataa agttctgatc 600tgccagttcc actaccgaag atgtcaggag gcggcctgga ccctgctgga 650accggagctg aagaccatac ccctgacccc tgttgagatc caagatttgg 700agctagccac tggctacaaa gtgtatggcc gctgccggat ggagaaagaa 750gaggatttgt ggggcgagtg gagccccatt ttgtccttcc agacaccgcc 800ttctgctcca aaagatgtgt gggtatcagg gaacctctgt gggacgcctg 850gaggagagga acctttgctt ctatggaagg ccccagggcc ctgtgtgcag 900gtgagctaca aagtctggtt ctgggttgga ggtcgtgagc tgagtccaga 950aggaattacc tgctgctgct ccctaattcc cagtggggcg gagtgggcca 1000gggtgtccgc tgtcaacgcc acaagctggg agcctctcac caacctctct 1050ttggtctgct tggattcagc ctctgccccc cgtagcgtgg cagtcagcag 1100catcgctggg agcacggagc tactggtgac ctggcaaccg gggcctgggg 1150aaccactgga gcatgtagtg gactgggctc gagatgggga ccccctggag 1200aaactcaact gggtccggct tccccctggg aacctcagtg ctctgttacc 1250agggaatttc actgtcgggg tcccctatcg aatcactgtg accgcagtct 1300ctgcttcagg cttggcctct gcatcctccg tctgggggtt cagggaggaa 1350ttagcacccc tagtggggcc aacgctttgg cgactccaag atgcccctcc 1400agggaccccc gccatagcgt ggggagaggt cccaaggcac cagcttcgag 1450gccacctcac ccactacacc ttgtgtgcac agagtggaac cagcccctcc 1500gtctgcatga atgtgagtgg caacacacag agtgtcaccc tgcctgacct 1550tccttggggt ccctgtgagc tgtgggtgac agcatctacc atcgctggac 1600agggccctcc tggtcccatc ctccggcttc atctaccaga taacaccctg 1650aggtggaaag ttctgccggg catcctattc ttgtggggct tgttcctgtt 1700ggggtgtggc ctgagcctgg ccacctctgg aaggtgctac cacctaaggc 1750acaaagtgct gccccgctgg gtctgggaga aagttcctga tcctgccaac 1800agcagttcag gccagcccca catggagcaa gtacctgagg cccagcccct 1850tggggacttg cccatcctgg aagtggagga gatggagccc ccgccggtta 1900tggagtcctc ccagcccgcc caggccaccg ccccgcttga ctctgggtat 1950gagaagcact tcctgcccac acctgaggag ctgggccttc tggggccccc 2000caggccacag gttctggcct gaaccacacg tctggctggg ggctgccagc 2050caggctagag ggatgctcat gcaggttgca ccccagtcct ggattagccc 2100tcttgatgga tgaagacact gaggactcag agaggctgag tcacttacct 2150gaggacaccc agccaggcag agctgggatt gaaggacccc tatagagaag 2200ggcttggccc ccatggggaa gacacggatg gaaggtggag caaaggaaaa 2250tacatgaaat tgagagtggc agctgcctgc caaaatctgt tccgctgtaa 2300cagaactgaa tttggacccc agcacagtgg ctcacgcctg taatcccagc 2350actttggcag gccaaggtgg aaggatcact tagagctagg agtttgagac 2400cagcctgggc aatatagcaa gacccctcac tanaaaaata aaacatcaaa 2450aacaaaaaca attagctggg catgatggca cacacctgta gtccgagcca 2500cttgggaggc tgaggtggga ggatcggttg agcccaggag ttcgaagctg 2550cagggacctc tgattgcacc actgcactcc aggctgggta acagaatgag 2600accttatctc aaaaataaac aaactaataa aaaaaaaaaa aaaaaa 2646&lt;210&gt;4&lt;211&gt;2005&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;4tcggttctat cgatggggcc atgaaccggc tccgggttgc acgcctcacg 50ccgttggagc ttctgctgtc gctgatgtcg ctgctgctcg ggacgcggcc 100ccacggcagt ccaggcccac tgcagtgcta cagcgtcggt cccctgggaa 150tcctgaactg ctcctgggaa cctttgggcg acctggagac tccacctgtg 200ctgtatcacc agagtcagaa ataccatccc aatagagtct gggaggtgaa 250ggtgccttcc aaacaaagtt gggtgaccat tccccgggaa cagttcacca 300tggctgacaa actcctcatc tgggggacac aaaagggacg gcctctgtgg 350tcctctgtct ctgtgaacct ggagacccaa atgaagccag acacacctca 400gatcttctct caagtggata tttctgagga agcaaccctg gaggccactg 450tgcagtgggc gccgcccgtg tggccaccgc agaaagctct cacctgtcag 500ttccggtaca aggaatgcca ggctgaagca tggacccggc tggagcccca 550gctgaagaca gatgggctga ctcctgttga gatgcagaac ctggaacctg 600gcacctgcta ccaggtgtct ggccgctgcc aggtggagaa cggatatcca 650tggggcgagt ggagttcgcc cctgtccttc cagacgccat tcttagatcc 700tgaagatgtg tgggtatcgg ggaccgtctg tgaaacttct ggcaaacggg 750cagccctgct tgtctggaag gacccaagac cttgtgtgca ggtgacttac 800acagtctggt ttggggctgg agatattact acaactcaag aagaggtccc 850gtgctgcaag tcccctgtcc ctgcatggat ggagtgggct gtggtctctc 900ctggcaacag caccagctgg gtgcctccca ccaacctgtc tctggtgtgc 950ttggctccag aatctgcccc ctgtgacgtg ggagtgagca gtgctgatgg 1000gagcccaggg ataaaggtga cctggaaaca agggaccagg aaaccattgg 1050agtatgtggt ggactgggct caagatggtg acagcctgga caagctcaac 1100tggacccgtc tcccccctgg aaacctcagc acattgttac caggggagtt 1150caaaggaggg gtcccctatc gaattacagt gactgcagta tactctggag 1200gattagctgc tgcaccctca gtttggggat tcagagagga gttagtaccc 1250cttgctgggc cagcagtttg gcgacttcca gatgaccccc cagggacacc 1300tgttgtagcc tggggagaag taccaagaca ccagctcaga ggccaggcta 1350ctcactacac cttctgcata cagagcagag gcctctccac tgtctgcagg 1400aacgtgagca gtcaaaccca gactgccact ctgcccaacc ttcactcggg 1450ttccttcaag ctgtgggtga cggtgtccac cgttgcagga cagggcccac 1500ctggtcccga cctttcactt cacctaccag ataataggat caggtggaaa 1550gctctgccct ggtttctgtc cctgtggggt ttgcttctga tgggctgtgg 1600cctgagcctg gccagtacca ggtgcctaca ggccaggtgc ttacactggc 1650gacacaagtt gcttccccag tggatctggg agagggttcc tgatcctgcc 1700aacagcaatt ctgggcaacc ttacatcaag gaggtgagcc tgccccaacc 1750gcccaaggac ggacccatcc tggaggtgga ggaagtggag ctacagcctg 1800ttgtggagtc ccctaaagcc tctgccccga tttactctgg gtatgagaaa 1850cacttcctgc ccacaccaga ggagctgggc cttctagtct gatctgctta 1900cggctagggg ctgtacccct atcttgggct agacgttcta gagtcgaccg 1950cagaagcttg gccgccatgg cccaacttgt ttattgcagc ttataatgtt 2000aaata 2005&lt;210&gt;5&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;5tggtctctcc tggcaacagc 20&lt;210&gt;6&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;6agccaagcac accagagaca 20&lt;210&gt;7&lt;211&gt;21&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;7cagctgggtg cctcccacca a 21&lt;210&gt;8&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;8atccgcaagc ctgtgactgt 20&lt;210&gt;9&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;9tcgggccagg gtgttttt 18&lt;210&gt;10&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;10ttcccgggct cgttgccg 18&lt;210&gt;11&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;11tcgcgtctct gggaagct 18&lt;210&gt;12&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;12tttaagccaa tgtatccgag actg 24&lt;210&gt;13&lt;211&gt;20&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;13cgccagcgtc ctcctcgtgg 20&lt;210&gt;14&lt;211&gt;21&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;14caagcatttg catcgctatc a 21&lt;210&gt;15&lt;211&gt;19&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;15aatgcctttt gccggaagt 19&lt;210&gt;16&lt;211&gt;24&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小鼠(Mus musculus)&lt;400&gt;16acgaattgag aacgtgccca ccgt 2權(quán)利要求
1.增強(qiáng)、刺激或加強(qiáng)T-細(xì)胞分化為Th2亞型而非Th1亞型的方法，包括將所述T-細(xì)胞與有效量的TCCR拮抗劑接觸。
2.權(quán)利要求1所述方法，其中增強(qiáng)、刺激或加強(qiáng)作用發(fā)生在哺乳動(dòng)物中且有效量是治療有效量。
3.治療哺乳動(dòng)物中Th1-介導(dǎo)的疾病的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的TCCR多肽拮抗劑。
4.權(quán)利要求3所述方法，其中Th1-介導(dǎo)的疾病選自下組疾病自身免疫性炎性疾病和同種異體移植排斥。
5.權(quán)利要求4所述方法，其中自身免疫性炎性疾病選自下組疾病過敏性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化、胰島素依賴型糖尿病、自身免疫性眼色素層視網(wǎng)膜炎、炎性腸道疾病和自身免疫性甲狀腺疾病。
6.權(quán)利要求3所述方法，其中拮抗劑是小分子。
7.權(quán)利要求3所述方法，其中拮抗劑是反義寡核苷酸。
8.權(quán)利要求7所述方法，其中寡核苷酸是RNA。
9.權(quán)利要求7所述方法，其中寡核苷酸是DNA。
10.權(quán)利要求3所述方法，其中拮抗劑是沒有生物活性的TCCR變體。
11.權(quán)利要求3所述方法，其中拮抗劑是單克隆抗體。
12.權(quán)利要求11所述方法，其中抗體具有非人互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基和人框架區(qū)(FR)殘基。
13.權(quán)利要求3所述方法，其中拮抗劑是抗體片段或單鏈抗體。
14.權(quán)利要求3所述方法，其中拮抗劑是TCCR配體。
15.阻止、抑制或減弱T-細(xì)胞分化為Th2亞型的方法，包括施用有效量的TCCR多肽或其激動(dòng)劑。
16.權(quán)利要求15所述方法，其中阻止、抑制或減弱作用發(fā)生在哺乳動(dòng)物中且有效量是治療有效量。
17.治療哺乳動(dòng)物中Th2-介導(dǎo)的疾病的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的TCCR多肽或其激動(dòng)劑。
18.權(quán)利要求17所述方法，其中Th2-介導(dǎo)的疾病選自傳染性疾病和過敏性病癥。
19.權(quán)利要求18所述方法，其中傳染性疾病選自下組疾病碩大利什曼原蟲、麻風(fēng)分枝桿菌、白色念珠菌、鼠弓漿蟲、呼吸道合胞病毒和人類免疫缺陷病毒所致疾病。
20.權(quán)利要求18所述方法，其中過敏性病癥選自哮喘、變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎和春季結(jié)膜炎。
21.權(quán)利要求15所述方法，其中激動(dòng)劑是小分子。
22.權(quán)利要求15所述方法，其中激動(dòng)劑是具有生物活性的TCCR變體。
23.權(quán)利要求15所述方法，其中激動(dòng)劑是單克隆抗體。
24.權(quán)利要求23所述方法，其中抗體具有非人互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基和人框架區(qū)(FR)殘基。
25.權(quán)利要求15所述方法，其中激動(dòng)劑是抗體片段或單鏈抗體。
26.權(quán)利要求15所述方法，其中激動(dòng)劑是穩(wěn)定的TCCR ECD。
27.測定細(xì)胞中TCCR多肽的存在的方法，包括將細(xì)胞暴露于抗-TCCR抗體并檢測抗體與細(xì)胞的結(jié)合，其中抗體與細(xì)胞結(jié)合則表明存在TCCR多肽。
28.診斷哺乳動(dòng)物中Th1-介導(dǎo)的或Th2-介導(dǎo)的疾病的方法，包括檢測編碼TCCR多肽的基因在(a)取自哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞的待測樣品中，和在(b)相同細(xì)胞類型的已知正常組織細(xì)胞的對照樣品中的表達(dá)水平，如果待測樣品中的表達(dá)水平低于對照樣品的，則表明存在Th2-介導(dǎo)的病癥，如果待測樣品中的表達(dá)水平高于對照樣品的，則表明存在Th1-介導(dǎo)的病癥。
29.鑒定能夠抑制TCCR多肽表達(dá)的化合物的方法，包括使候選化合物與所述多肽在足以使這兩種組分相互作用的條件下和時(shí)間內(nèi)進(jìn)行接觸。
30.權(quán)利要求29所述方法，其中候選化合物固定在固體載體上。
31.權(quán)利要求30所述方法，其中非-固定組分?jǐn)y帶可檢測標(biāo)記物。
32.鑒定能夠抑制TCCR多肽生物活性的化合物的方法，包括使候選化合物與所述多肽在足以使這兩種組分相互作用的條件下和時(shí)間內(nèi)進(jìn)行接觸。
33.權(quán)利要求32所述方法，其中候選化合物固定在固體載體上。
34.權(quán)利要求33所述方法，其中非-固定組分?jǐn)y帶可檢測標(biāo)記物。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療和診斷免疫相關(guān)疾病的方法，所述疾病包括主要由Th1或Th2細(xì)胞因應(yīng)答抗原刺激而釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo)的那些疾病。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于TCCR基因相對表達(dá)水平以及TCCR激動(dòng)劑或拮抗劑而使T－細(xì)胞偏置分化為Th1亞型或Th2亞型的方法。本發(fā)明還涉及診斷Th1－和Th2－介導(dǎo)的疾病的方法。
文檔編號A61K31/711GK1409726SQ00817176
公開日2003年4月9日 申請日期2000年10月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月20日
發(fā)明者弗雷德里克·J·德索韋格, 伊奎貝爾·格雷沃爾, 奧斯汀·L·格尼 申請人:杰南技術(shù)公司