專利名稱：用于生成分化祖細胞和譜系缺陷型胚胎干細胞的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及使桑椹胚細胞或胚泡內(nèi)細胞分化的方法。這些細胞可用于細胞療法和用于生成等基因、同種異體、和/或異種移植用的細胞和器官。本發(fā)明還涉及生成譜系缺陷型胚胎干細胞，它們不會分化成特定分化譜系，諸如中胚層、內(nèi)胚層、或外胚層。
相關(guān)技術(shù)的描述用于在體外由早期前植入小鼠胚胎衍生胚胎干(ES)細胞系的方法是眾所周知的(參閱例如Evans等人，Nature，29154-156，1981；Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，787634-7638，1981)。若存在成纖維細胞飼養(yǎng)層(Evans等人，同上)或分化抑制源(Smith等人，Dev.Biol.，1211-9，1987)，則能夠?qū)S細胞以未分化狀態(tài)進行傳代。
先前已經(jīng)報導(dǎo)了ES細胞具有許多應(yīng)用。例如，已經(jīng)報導(dǎo)了ES細胞可作為分化的體外模型，尤其是用于研究涉及調(diào)控早期發(fā)育的基因。在導(dǎo)入前植入小鼠胚胎后，小鼠ES細胞能夠引起種系嵌合體，由此證明它們的多能性(Bradley等人，Nature，309255-256，1984)。
考慮到它們將它們的基因組轉(zhuǎn)移給下一代的能力，通過使用含或不含期望遺傳修飾的ES細胞，ES細胞具有家畜動物種系操作的潛在效用。此外，在家畜動物(如有蹄類)的情況中，來自像前植入家畜胚胎的細胞核支持去核卵母細胞發(fā)育至分娩期(Smith等人，Biol.Reprod.，401027-1035，1989；Keefer等人，Biol.Reprod.，50935-939，1994)。這與來自超過八細胞階段的小鼠胚胎的細胞核相反，據(jù)報導(dǎo)后者在移植后不支持去核卵母細胞的發(fā)育(Cheong等人，Biol.Reprod.，48958，1993)。因此，來自家畜動物的ES細胞非常有價值，因為它們可以為核移植流程提供全能供體細胞核的潛在來源(可以經(jīng)過或未經(jīng)過遺傳修飾)。
有些研究小組已經(jīng)報導(dǎo)了據(jù)說多能的胚性細胞系的分離。例如，Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.，43255-260，1991報導(dǎo)了由豬和綿羊胚泡建立據(jù)說穩(wěn)定且多能的細胞系，它們展示的一些形態(tài)學(xué)和生長特征與通過免疫手術(shù)由綿羊胚泡分離的內(nèi)細胞團的原代培養(yǎng)細胞相似。同樣，Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.，4151-56，1990公開了來自豬胚泡的推定多能的胚細胞系在培養(yǎng)中的維持和分化。Gerfen等人，Anim.Biotech.，6(1)1-14，1995公開了由豬胚泡分離胚細胞系。在小鼠胚成纖維細胞飼養(yǎng)層中可穩(wěn)定維持這些細胞而不使用條件培養(yǎng)基，而且據(jù)報導(dǎo)在培養(yǎng)過程中分化成幾種不同的細胞類型。
此外，Saito等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.，201134-141，1992報導(dǎo)了存活3代但在第4代后喪失的培養(yǎng)牛胚胎干細胞樣細胞系。Handyside等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.，196185-190，1987公開了通過免疫手術(shù)分離的綿羊胚胎內(nèi)細胞團在能夠分離由小鼠內(nèi)細胞團衍生的小鼠ES細胞系的條件下培養(yǎng)。Handyside等人報導(dǎo)了在這種條件下，綿羊內(nèi)細胞團貼壁、擴展、并發(fā)展ES細胞樣細胞和內(nèi)胚層樣細胞兩種區(qū)域，但是在延長培養(yǎng)后只有內(nèi)胚層樣細胞是明顯的。
最近，Cherny等人，Theriogenology，41175，1994報導(dǎo)了在長期培養(yǎng)中維持的據(jù)說多能的牛原始生殖細胞衍生細胞系。這些細胞在培養(yǎng)大約7天后生成ES樣集落，堿性磷酸酶(AP)染色陽性，展示形成胚狀體的能力，并自發(fā)分化成至少兩種不同的細胞類型。據(jù)報導(dǎo)這些細胞還表達轉(zhuǎn)錄因子OCT4、OCT6、和HES1的mRNA，這是認為唯獨由ES細胞表達的同源異型框基因模式。
同樣在最近，Campbell等人，Nature，38064-68，1996報導(dǎo)了在對培養(yǎng)胚盤(ED)細胞(來自在促進在小鼠中分離ES細胞系的條件下培養(yǎng)9天的綿羊胚胎)進行核移植之后生成了活的小羊。作者得出結(jié)論，來自第9天的綿羊胚胎的ED細胞通過核移植實現(xiàn)全能，而且全能性在培養(yǎng)中得到維持。
Van Stekelenburg-Hamers等人，Mol.Reprod.Dev，40444-454，1995報導(dǎo)了來自牛胚泡內(nèi)細胞團細胞的據(jù)說永久的細胞系的分離和鑒定。作者在不同條件下由第8或9天的牛胚泡分離并培養(yǎng)內(nèi)細胞團，以確定哪種飼養(yǎng)細胞和培養(yǎng)培養(yǎng)基對支持牛內(nèi)細胞團細胞的貼壁和擴展最有效。他們得出結(jié)論，培養(yǎng)內(nèi)細胞團細胞的貼壁和擴展通過STO(小鼠成纖維細胞)飼養(yǎng)細胞(代替牛子宮上皮細胞)的使用和通過在培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加經(jīng)木炭吸收過的血清(而非普通血清)而得到增強。然而，Van Stekelenburg等人報導(dǎo)了他們的細胞系更像上皮細胞而非多能內(nèi)細胞團細胞。
Smith等人，WO94/24274，發(fā)表于1994年10月27日；Evans等人，WO90/03432，發(fā)表于1990年4月5日；和Wheeler等人，WO94/26889，發(fā)表于1994年11月24日，報導(dǎo)了據(jù)說可用于獲得轉(zhuǎn)基因動物的動物干細胞的分離、選擇、和增殖。Evans等人還報導(dǎo)了由豬和牛物種衍生的據(jù)說多能的胚胎干細胞，據(jù)說可用于生成轉(zhuǎn)基因動物。另外，Wheeler等人，WO94/26884，發(fā)表于1994年11月24日，公開了據(jù)說可用于生成嵌合和轉(zhuǎn)基因有蹄類的胚胎干細胞。
因而，根據(jù)上文，例如由于ES細胞系在生成克隆或轉(zhuǎn)基因胚胎中和在核移植中的潛在應(yīng)用，顯然許多小組已經(jīng)試圖生成ES細胞系。
還已經(jīng)有報導(dǎo)了將有蹄類內(nèi)細胞團(ICM)細胞用于核移植的應(yīng)用。例如，Collas等人，Mol.Reprod.Dev.，38264-267，1994公開了將經(jīng)裂解供體細胞顯微注射到去核成熟卵母細胞中而進行的牛ICM核移植。Collas等人公開了將胚胎在體外培養(yǎng)7天而生成15個胚泡，在將其移植到牛受體中后導(dǎo)致4次懷孕和2次出生。同樣，Keefer等人，Biol.Reprod.，50935-939，1994公開了牛ICM細胞在核移植流程中作為供體細胞核用于生成胚泡的應(yīng)用，在將胚泡移植到牛受體中后生成數(shù)個活的子代。此外，Sims等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906143-6147，1993公開了將細胞核由短期體外培養(yǎng)的牛ICM細胞移植到去核成熟卵母細胞中而生成小牛。
還已經(jīng)報導(dǎo)了在對培養(yǎng)胚盤細胞進行核移植后生成活的小羊(Campbell等人，Nature，38064-68，1996)。還有，已經(jīng)報導(dǎo)了牛多能胚性細胞在核移植和生成嵌合胎兒中的應(yīng)用(Stice等人，Biol.Reprod.，54100-110，1996；Collas等人，Mol.Reprod.Dev.，38264-267，1994)。Collas等人證明了顆粒細胞(成熟細胞)可用于?？寺×鞒桃陨膳咛?。然而，沒有證明發(fā)育超過了早期胚胎階段(胚泡階段)。同樣，顆粒細胞不容易培養(yǎng)，而且只能由雌獸獲得。Collas等人沒有嘗試在培養(yǎng)物中增殖顆粒細胞或者遺傳修飾那些細胞。
Thomson，美國專利號5,843,780，1998年12月1日頒發(fā)，報導(dǎo)了靈長類胚胎干細胞的純化。據(jù)報導(dǎo)，在這些細胞中，細胞表面標記SSEA-1呈陰性，細胞表面標記SSEA-3、SSEA-4、TRA-I-60、TRA-I-81、和堿性磷酸酶呈陽性，而且能夠分化成由所有3種胚胎胚層(內(nèi)胚層、中胚層、和外胚層)衍生的所有組織。Thomson等人，Science，2821145-1147，1998描述了由人胚泡衍生的多能胚胎干細胞系。
另外，Stice等人，美國專利號5,905,042，頒布于1999年5月18日，描述了由有蹄類衍生的培養(yǎng)內(nèi)細胞團細胞和細胞系。這些培養(yǎng)內(nèi)細胞團細胞在長期培養(yǎng)期間，具有與未分化、發(fā)育中胚胎的內(nèi)細胞團相似的形態(tài)學(xué)，而且表達與其相同或基本相似的細胞標記。
胚胎干細胞的潛在應(yīng)用是將那些細胞作為用于生成用于細胞療法和用于生成移植用的組織和器官的分化細胞的來源。然而，尚沒有穩(wěn)定的胚胎干細胞系和用于將那些細胞擴增成分化細胞/組織/器官的可靠方法。因此，不管文獻中先前已經(jīng)報導(dǎo)了什么，仍然需要用于細胞療法和用于生成移植用的組織和器官的改進細胞來源。
發(fā)明目的和概述本發(fā)明的一個目的是提供用于生成哺乳動物細胞的新的且改進的方法，所述細胞可作為用于細胞療法和用于生成移植用的組織和器官的細胞來源。
本發(fā)明的一個更具體目的是提供用于誘導(dǎo)內(nèi)細胞團細胞分化成祖細胞的新方法，所述祖細胞可用于細胞療法或用于生成移植用的組織和器官。
本發(fā)明的一個目的是提供用于生成經(jīng)遺傳工程改造的哺乳動物祖細胞的改進方法，所述祖細胞可作為用于細胞療法和用于生成移植用的組織和器官的細胞的來源。
本發(fā)明的一個更具體目的是提供用于誘導(dǎo)經(jīng)遺傳工程改造的內(nèi)細胞團細胞分化成祖細胞的方法，所述祖細胞可用于細胞療法或用于生成移植用的組織和器官，其中在經(jīng)遺傳工程改造的內(nèi)細胞團細胞中插入、消除、或修飾了期望基因。
本發(fā)明的一個目的是提供用于由經(jīng)遺傳工程改造的內(nèi)細胞團衍生祖細胞并將經(jīng)遺傳工程改造的細胞作為用于細胞療法和用于生成移植用的組織和器官的細胞來源的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于生成分化祖細胞的新方法，包括使用分化細胞作為細胞核供體用于形成核移植(NT)單位，由核移植單位生成桑椹胚或胚泡，并誘導(dǎo)桑椹胚的細胞或胚泡的內(nèi)細胞團細胞分化成祖細胞，所述祖細胞可作為用于細胞療法和用于生成移植用的組織和器官的細胞來源。
本發(fā)明的另一個目的是提供如下生成的分化祖細胞使用分化的細胞作為細胞核供體用于形成核移植單位，由核移植單位生成桑椹胚或胚泡，并誘導(dǎo)桑椹胚的細胞或胚泡的內(nèi)細胞團細胞分化成祖細胞。
本發(fā)明的另一個目的是提供如下生成的分化人祖細胞使用分化的人細胞作為細胞核供體用于形成核移植單位，由核移植單位生成桑椹胚或胚泡，并誘導(dǎo)桑椹胚的細胞或胚泡的內(nèi)細胞團細胞分化成祖細胞。
本發(fā)明的另一個目的是培養(yǎng)桑椹胚細胞或內(nèi)細胞團細胞，從而預(yù)防胚胎干細胞的生長同時促進分化祖細胞的生長。
本發(fā)明的另一個目的是將這些分化祖細胞用于治療或診斷。
本發(fā)明的一個具體目的是將這些分化祖細胞(包括分化的人和有蹄類祖細胞)用于其中細胞、組織、或器官移植在治療或診斷上有益的任何疾病的治療或診斷。分化祖細胞可用于相同物種或不同物種。
本發(fā)明的另一個目的是將由NT胚胎衍生的細胞(包括人和有蹄類細胞)用于其中細胞、組織、或器官移植在治療或診斷上有益的任何疾病的治療或診斷。組織可用于相同物種或不同物種。
本發(fā)明的另一個具體目的是將依照本發(fā)明在體外生成的分化細胞用于例如細胞分化研究和檢驗?zāi)康?如用于藥物研究)。
本發(fā)明的另一個目的是提供移植療法的改進方法，包括使用由依照本發(fā)明生成的分化細胞生成的等基因或同源細胞、組織、或器官。這些療法包括例如治療下列疾病和損傷帕金森氏病、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓損傷、多發(fā)性硬化癥、肌肉營養(yǎng)不良癥、糖尿病、肝病、心臟病、軟骨代換(cartilage replacement)、燒傷、血管疾病、泌尿道疾病，以及用于治療免疫缺陷、骨髓移植、癌癥、其它疾病。
本發(fā)明的另一個目的是將依照本發(fā)明生成的轉(zhuǎn)基因或經(jīng)遺傳工程改造的分化細胞用于基因療法，特別是用于治療和/或預(yù)防上文確定的疾病和損傷。
本發(fā)明的另一個目的是將依照本發(fā)明生成的分化細胞或依照本發(fā)明生成的轉(zhuǎn)基因或經(jīng)遺傳工程改造的分化細胞作為核移植的細胞核供體。
因而，一方面，本發(fā)明提供了用于生成分化祖細胞的方法，包括(I)獲得桑椹胚的細胞或胚泡的內(nèi)細胞團細胞；并(II)誘導(dǎo)桑椹胚細胞或內(nèi)細胞團細胞分化以產(chǎn)生分化祖細胞。
分化祖細胞可用于衍生可有利的用于細胞、組織、和/或器官移植領(lǐng)域的細胞、組織、和/或器官。
另一方面，本發(fā)明提供了用于生成遺傳改變的分化祖細胞的方法，由此在用于生成核移植單位的細胞中插入、消除、或修飾期望基因，以用于生成桑椹胚獲得桑椹胚細胞或用于生成胚泡獲得內(nèi)細胞團細胞。
還有一個方面，本發(fā)明提供了用于生成譜系缺陷型人胚胎干細胞的方法，包括(I)遺傳修飾人體細胞，使得所述體細胞不能分化成預(yù)先確定的細胞譜系；(II)使用經(jīng)遺傳修飾的人體細胞或細胞核作為細胞核供體，生成核移植單位；(III)激活產(chǎn)生的核移植單位；(IV)培養(yǎng)所述激活的核移植單位直至超過二細胞發(fā)育階段；并(V)在適合于形成譜系缺陷型人胚胎干細胞的條件下，培養(yǎng)由所述培養(yǎng)的核移植單位獲得的細胞，所述干細胞不能分化成特定分化譜系，諸如至少一種胚胎胚層。
借助本發(fā)明的上述和其它目的以及將在下文中變得清晰的優(yōu)勢、和特征，通過參考下文中本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細描述和所附權(quán)利要求，可以更清除的理解本發(fā)明的本質(zhì)。
優(yōu)選實施方案的詳述本發(fā)明提供了用于生成分化祖細胞的改進流程，所述祖細胞可用于例如細胞療法或者作為提供移植用的組織和器官的細胞來源。更具體的說，誘導(dǎo)桑椹胚衍生細胞或由胚泡衍生的內(nèi)細胞團細胞分化成分化祖細胞，并將那些分化細胞用于細胞療法或作為提供移植用的組織和器官的細胞來源。
過去通過長期培養(yǎng)內(nèi)細胞團細胞來生成胚胎干細胞。隨后對胚胎干細胞進行培養(yǎng)、遺傳修飾、和誘導(dǎo)分化，從而生成用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的細胞或用于治療的細胞。通過本發(fā)明規(guī)避了胚胎干細胞的生成，即誘導(dǎo)桑椹胚衍生細胞或內(nèi)細胞團細胞直接分化成分化祖細胞，然后將分化祖細胞用于細胞療法和用于生成移植用的組織和器官。如果需要，可以在進行核移植以生成桑椹胚或胚泡之前，將遺傳修飾導(dǎo)入體細胞例如。因而，本發(fā)明的分化祖細胞不是多能的，而是本質(zhì)上是組織特異干細胞。分化祖細胞可生成來自所有3種胚胎胚層(即內(nèi)胚層、中胚層、和外胚層)的細胞。例如，分化祖細胞可分化成骨、軟骨、平滑肌、橫紋肌、和造血細胞(中胚層)；肝、原始消化管、和呼吸道上皮(內(nèi)胚層)；或神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、毛囊、和牙蕾(外胚層)。
此外，對于本發(fā)明的分化祖細胞，不必需是永生的，或者表達在胚胎干細胞上發(fā)現(xiàn)的細胞表面標記，諸如靈長類胚胎干細胞的特征性細胞表面標記SSEA-3、SSEA-4、TRA-I-60、TRA-I-81、堿性磷酸酶活性呈陽性，而SSEA-1呈陰性。此外，本發(fā)明的分化祖細胞不同于胚狀體，即胚狀體衍生自胚胎干細胞，而本發(fā)明的分化干細胞衍生自桑椹胚衍生細胞或內(nèi)細胞團細胞。
優(yōu)選的是，本發(fā)明的分化祖細胞是通過在不存在未分化胚胎干細胞培養(yǎng)物的情況中培養(yǎng)桑椹胚衍生細胞或內(nèi)細胞團細胞而生成的?？梢栽诖嬖诜只T導(dǎo)劑的情況中培養(yǎng)桑椹胚衍生細胞或內(nèi)細胞團細胞，或者將能夠預(yù)防胚胎干細胞生長的遺傳修飾導(dǎo)入細胞，由此預(yù)防未分化胚胎干細胞的生長。
任何胚泡都可以作為內(nèi)細胞團來源，包括通過體外受精生成的胚泡和由核移植單位衍生的胚泡。對于通過核移植單位來生成胚泡的方法，參閱授予Stice等人的美國專利號5,945,577，將它的內(nèi)容收入本文作為參考。
胚泡可以來自任何哺乳動物物種，包括人。當胚泡衍生自核移植單位時，核移植單位可以是“相同物種”移植，如將細胞核由人分化細胞移植到人去核卵母細胞中，或“不同物種”移植，如將細胞核由人分化細胞移植到牛去核卵母細胞中。對于通過不同物種移植來生成核移植單位，參閱例如WO98/07841，將它的內(nèi)容收入本文作為參考。
來自分化細胞或胚性細胞的細胞核都可用于生成核移植單位。分化哺乳動物細胞指那些發(fā)育經(jīng)過早期胚胎階段的細胞。更具體的說，分化細胞指那些來自至少經(jīng)過胚盤階段(牛胚胎發(fā)生第10天)的細胞。
用于由胚泡分離內(nèi)細胞團細胞的方法對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是眾所周知的。參閱例如授予Stice等人的美國專利號5,905,042和授予Thomson的美國專利號5,843,780，將它們的內(nèi)容收入本文作為參考。依照本發(fā)明，可以使用來自早期胚泡階段的內(nèi)細胞團細胞，或者可以使用來自胚泡發(fā)育晚期的部分分化內(nèi)細胞團細胞。
在缺乏或存在細胞因子、生長因子、胞外基質(zhì)成份、和其它因子的情況中，通過適當方法，誘導(dǎo)分離內(nèi)細胞團細胞的分化。例如，可以在平坦、粘性環(huán)境中(液態(tài))或者在三維粘性環(huán)境中(如1％膠原凝膠)中誘導(dǎo)內(nèi)細胞團細胞的分化。微重力環(huán)境也可用于誘導(dǎo)內(nèi)細胞團細胞的分化(Ingram等人，In Vitro Cell Dev Biol Anim，33(6)459-466，1997)。用于誘導(dǎo)內(nèi)細胞團細胞分化的另一種方法是通過在免疫缺陷的小鼠(Thomson等人，Science，282(5391)1145-1147，1998)或其它動物中生成畸胎瘤。也可以通過將內(nèi)細胞團細胞包裹并使之在合適宿主中形成畸胎瘤來誘導(dǎo)分化。例如，可以將人內(nèi)細胞團細胞包裹，并置于與衍生內(nèi)細胞團細胞相同(等基因)或不同的人(異源)體內(nèi)。目前有許多系統(tǒng)能夠通過合成的選擇性通透膜將細胞從身體的免疫系統(tǒng)中分離出來。這種膜允許血液或血漿與包裹細胞之間營養(yǎng)、氧氣、和生物治療物質(zhì)的自由交換。這些系統(tǒng)還可根據(jù)膜和基質(zhì)支持物的化學(xué)特征來調(diào)控抗原、細胞因子、和其它免疫學(xué)物質(zhì)的雙向擴散(Lanza等人，Nat Biotechnol，14(9)1107-1111，1996)。對于涉及在動物或人體中植入內(nèi)細胞團的系統(tǒng)，可以在單個動物或人體中植入個別以及多個內(nèi)細胞團。
優(yōu)選的是，使用篩選測試來檢測可誘導(dǎo)桑椹胚衍生細胞或內(nèi)細胞團細胞分化成期望分化細胞類型的試劑。構(gòu)建了多種分化劑組合的文庫。分化劑文庫包括例如生長因子、細胞因子、胞外基質(zhì)成份、激素和激素拮抗劑、和針對上述物質(zhì)的中和抗體。然后對分化劑文庫測試誘導(dǎo)桑椹胚衍生細胞或內(nèi)細胞團細胞分化的能力?？梢允褂蒙衔挠懻摰挠糜谡T導(dǎo)細胞分化的任何方法。例如，可以在組織培養(yǎng)孔中培養(yǎng)細胞，其中每個孔含分化因子的獨特組合。也可以以裸露DNA的形式涂布編碼這些因子的核酸或cDNA，或者通過轉(zhuǎn)染或通過病毒來制備構(gòu)建物以攜帶這些核酸。通過分化特異抗體、形態(tài)學(xué)、使用分化特異引物的PCR、或用于鑒定特定類型的分化細胞的任何其它可用技術(shù)來鑒定分化細胞。
可依照本發(fā)明使用的分化劑包括細胞因子，諸如干擾素-αA、干擾素-αA/D、干擾素-β、干擾素-γ、干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白-10、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-15、白介素-17、角質(zhì)細胞生長因子、leptin、白血病抑制因子、巨噬細胞集落刺激因子、和巨噬細胞炎性蛋白-1α。
依照本發(fā)明的分化劑還包括生長因子，諸如6Ckine(重組體)、活化素A、干擾素-αA、干擾素-α、雙調(diào)蛋白、血管生成素、內(nèi)皮細胞生長因子-β、動物纖維素-β、干擾素-β、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、C10(重組體)、促心臟激素-1(cardiotrophin-1)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子誘導(dǎo)嗜中性化學(xué)引誘物-1、內(nèi)皮細胞生長補充物、eotaxin、表皮生長因子、上皮嗜中性激活肽-78、促紅細胞生成素、雌激素受體-α、雌激素受體-β、成纖維細胞生長因子(酸性/堿性、肝素穩(wěn)定的、重組體)、FLT-3/FLK-2配體(FLT-3配體)、干擾素-γ、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、Gly-His-Lys、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、GRO-α/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC-1、肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子、肝細胞生長因子、heregulin-α(EGF結(jié)構(gòu)域)、胰島素生長因子結(jié)合蛋白-1、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1/IGF-1復(fù)合物、胰島素樣生長因子、胰島素樣生長因子II、2.5S神經(jīng)生長因子(NGF)、7S-NGF、巨噬細胞炎性蛋白-1β、巨噬細胞炎性蛋白-2、巨噬細胞炎性蛋白-3α、巨噬細胞炎性蛋白-3β、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4、NGF-B(人或大鼠重組體)、制瘤素M(人或小鼠重組體)、垂體提取物、胎盤生長因子、血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、pleiotrophin、rantes、干細胞因子、基質(zhì)細胞衍生因子1B/前B細胞生長刺激因子、血小板生成素、轉(zhuǎn)化生長因子-α、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、轉(zhuǎn)化生長因子β2、轉(zhuǎn)化生長因子β3、轉(zhuǎn)化生長因子β5、腫瘤壞死因子(α和β)、和血管內(nèi)皮生長因子。
依照本發(fā)明的分化劑還包括激素和激素拮抗劑，諸如17B-雌二醇、促腎上腺皮質(zhì)激素、腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin)、黑素細胞刺激激素-α、絨毛膜促性腺激素、皮質(zhì)類固醇結(jié)合球蛋白、皮質(zhì)酮、地塞米松、雌三醇、促卵泡激素、胃泌素-1、胰高血糖素、促性腺激素、氫化可的松、胰島素、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、L-3，3’，5’-三碘甲狀腺原氨酸、L-3，3’，5-三碘甲狀腺原氨酸、leptin、促黃體生成激素、L-甲狀腺素、褪黑激素、MZ-4、催產(chǎn)素、甲狀旁腺激素、PEC-60、垂體生長激素、孕酮、促乳素、胰泌素、性激素結(jié)合球蛋白、促甲狀腺素、促甲狀腺素釋放因子、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、和加壓素。
依照本發(fā)明的分化劑還包括胞外基質(zhì)成份，諸如纖連蛋白、纖連蛋白的蛋白水解片段、層粘連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、聚集蛋白聚糖、和多配體蛋白聚糖。
依照本發(fā)明的分化劑還包括針對各種因子的抗體，諸如抗低密度脂蛋白受體抗體、抗孕酮受體、內(nèi)在抗體、抗α干擾素受體鏈2抗體、抗c-c趨化因子受體1抗體、抗CD118受體、抗CD119抗體、抗集落刺激因子-1抗體、抗CSF-1受體/c-fms抗體、抗表皮生長因子(AB-3)抗體、抗表皮生長因子受體抗體、抗表皮生長因子受體、磷特異抗體、抗表皮生長因子(AB-1)抗體、抗促紅細胞生成素受體抗體、抗雌激素受體抗體、抗雌激素受體C端抗體、抗雌激素受體-β抗體、抗成纖維細胞生長因子受體抗體、抗堿性成纖維細胞生長因子抗體、抗γ干擾素受體鏈1抗體、抗γ干擾素人重組體抗體、抗GFRα1C端抗體、抗GFRα2C端抗體、抗粒細胞集落刺激因子(AB-1)抗體、抗粒細胞集落刺激因子受體抗體、抗胰島素受體抗體、抗胰島素樣生長因子-1受體抗體、抗白介素-6人重組體抗體、抗白介素-1人重組體抗體、抗白介素-2人重組體抗體、抗leptin小鼠重組體抗體、抗神經(jīng)生長因子受體抗體、抗p60雞抗體、抗甲狀旁腺激素樣蛋白抗體、抗血小板衍生生長因子受體抗體、抗血小板衍生生長因子受體-β抗體、抗血小板衍生生長因子-α抗體、抗孕酮受體抗體、抗視黃酸受體-α抗體、抗甲狀腺激素核受體抗體、抗甲狀腺激素核受體-α1/Bi抗體、抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體/CD71抗體、抗轉(zhuǎn)化生長因子-α抗體、抗轉(zhuǎn)化生長因子-β3抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體、和抗血管內(nèi)皮生長因子抗體。
一旦進行分化方案，則可以通過常規(guī)技術(shù)由分化內(nèi)細胞團衍生物分離來自特定胚性譜系的原始細胞。如果需要，可以擴增分離的分化祖細胞，例如通過細胞培養(yǎng)或其它適當方法。通過本發(fā)明由分化內(nèi)細胞團細胞獲得了分化祖細胞而不必生成胚胎干細胞。
還可以轉(zhuǎn)染分化祖細胞?？梢栽谏煞只婕毎倪^程中在任何合適階段進行轉(zhuǎn)染。例如，可以在形成胚泡之前轉(zhuǎn)染作為細胞核供體用于形成核移植單位的分化細胞。另一種可能性是在分離了分化祖細胞之后再轉(zhuǎn)染它們，如轉(zhuǎn)染造血系統(tǒng)的CD34+、CD38-細胞。
可以將在哺乳動物細胞中插入、刪除、或修飾期望基因的任何已知方法用于生成經(jīng)轉(zhuǎn)染分化祖細胞。這些流程可除去整個或部分基因，而且基因可以是異源的。包括同源重組技術(shù)，這種技術(shù)能夠在細胞基因組的特定位點插入、刪除、或修飾基因。
逆轉(zhuǎn)錄病毒高通量篩選流程也可用于鑒定涉及胚胎干細胞中譜系決定的基因。然后可以在用于生成分化祖細胞的桑椹胚衍生細胞或內(nèi)細胞團細胞中插入和/或誘導(dǎo)那些譜系決定基因。由逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的篩選的范例如下A.逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫的構(gòu)建由分化組織(如神經(jīng)元、心肌細胞、造血干細胞(CD34+細胞)、或其它分化細胞)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒cDNA文庫?？梢允褂萌魏位贛oloney的載體系統(tǒng)來構(gòu)建這些文庫。商品化的范例是pBabe和pLIB載體(Clontech)。也可以由商業(yè)來源(Clontech)獲取早已由肌肉、肝、和腦構(gòu)建的文庫。此外，可以容易的實現(xiàn)特化文庫的構(gòu)建。
B.ES細胞中功能篩選的發(fā)展用報告基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)染靈長類或哺乳動物ES細胞，所述構(gòu)建物包含組織特異基因的啟動子，例如連接GFP蛋白的CD34啟動子。然后將該啟動子報告基因構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到ES細胞中。選擇具有最小背景活性的克隆，并將陽性對照細胞系(KG-1)用于確認啟動子構(gòu)建物的表達。
C.逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫的包裝隨后將逆轉(zhuǎn)錄病毒cDNA文庫有效(＞80％頻率)轉(zhuǎn)染到基于293的EcoPack或AmphoPack細胞系(Clontech)中。這些細胞系表達有效包裝所需要的Gag-pol和包膜蛋白。在這些細胞系中高滴度(＞106)的病毒生成使之對于文庫展示是理想的。在出現(xiàn)與這些細胞系有關(guān)的問題的情況中，可以通過將Gag-pol和Env基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到293細胞中來構(gòu)建候選系統(tǒng)。
D.篩選隨后用包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒以感染復(fù)數(shù)1(MOI＝1)感染ES-Rep(報告基因)細胞。感染后，使ES-Rep細胞恢復(fù)并分裂。然后對這些細胞進行熒光激活細胞分揀(Fluorescent Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS)，并選擇GFP+細胞，再次培養(yǎng)，并使之恢復(fù)。由這些細胞制備基因組DNA，并使用擴增逆轉(zhuǎn)錄病毒cDNA插入片段的引物進行PCR擴增。然后將這些插入片段個別測序，并測試在ES-Rep細胞中上調(diào)GFP的能力?；蛘撸梢宰鳛榧蟻砘厥誧DNA，然后感染到未處理型ES-Rep細胞中以富集目的事件(GFP+)。然后對單個cDNA克隆進一步鑒定引發(fā)期望表型的能力，即將ES細胞轉(zhuǎn)變成神經(jīng)元、肌肉、或其它期望譜系的能力。參閱L.P.Deiss等人，Genes Dev，915，1995；I.Whitehead等人，MCB，15704，1995；J.R.Rayner等人，同上，14880，1994；M.Goldfarb等人，Nature，296404，1982；A.V.Gudkov等人，PNAS，903231，1993；和L.P.Deiss和A.Kimchi，Science，252117，1991；將它們的內(nèi)容收入本文作為參考。
已知移植的胚胎干細胞不僅能夠形成良性畸胎瘤，而且能夠形成惡性腫瘤。為了在本發(fā)明的方法中消除患良性和惡性腫瘤二者的風(fēng)險，在細胞(如作為核移植的細胞核供體的細胞)中導(dǎo)入或刪除可預(yù)防未分化胚性細胞在培養(yǎng)中生長的基因是有用的。例如，可以將誘導(dǎo)型啟動子諸如MMTV啟動子導(dǎo)入細胞，隨后導(dǎo)入地塞米松來誘導(dǎo)可阻斷未分化細胞生長或誘導(dǎo)它們分化的基因的表達。另一種可能性是導(dǎo)入生殖系特異基因的啟動子來驅(qū)動細胞周期阻斷物或凋亡基因的表達?；蛘?，可以鑒定并消除未分化胚胎干細胞。
用于生成分化祖細胞的優(yōu)選方法包括通過體外受精或通過核移植獲得人胚胎，在G1.2/G2.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎直至胚泡階段。通過鏈霉蛋白酶的溫和消化，由胚胎除去透明帶。通過免疫手術(shù)，由胚胎除去滋養(yǎng)層細胞。使用或不用細胞因子，通過下列方式，誘導(dǎo)內(nèi)細胞團細胞的分化a)平坦、粘性環(huán)境；b)三維粘性環(huán)境；c)微重力；d)在免疫缺陷小鼠中生成畸胎瘤；或e)在同基因或異基因人體中由包裹內(nèi)細胞團細胞形成畸胎瘤。然后由分化內(nèi)細胞團衍生物分離特定胚性譜系的分化祖細胞。
產(chǎn)生的本發(fā)明的分化祖細胞，優(yōu)選人分化祖細胞，具有許多治療和診斷應(yīng)用。最特別的是，這些分化祖細胞可用于細胞移植療法。人分化祖細胞可用于治療許多疾病狀況。
本發(fā)明的分化祖細胞可用于獲得任何期望的分化細胞類型。這些分化人細胞的治療性用途是空前的。例如，人造血干細胞可用于需要骨髓移植的醫(yī)學(xué)治療。這些流程可用于治療許多疾病，如晚期癌癥(諸如卵巢癌和白血病)以及損害免疫系統(tǒng)的疾病(諸如AIDS)。例如可以如下獲得造血干細胞將癌癥或AIDS患者的成熟體細胞(如上皮細胞或淋巴細胞)與去核卵母細胞融合，如上所述獲得內(nèi)細胞團細胞，并在促使分化的條件下培養(yǎng)這些細胞，直至獲得造血干細胞。這些造血細胞可用于治療包括癌癥和AIDS在內(nèi)的疾病。
或者，可以將來自神經(jīng)學(xué)紊亂患者的成熟體細胞與去核卵母細胞融合，由其中獲得人內(nèi)細胞團細胞，并在分化條件下培養(yǎng)這些細胞以生成神經(jīng)細胞系?？梢酝ㄟ^移植這樣的人神經(jīng)細胞來治療的具體疾病包括例如帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、ALS和腦性癱瘓等。在帕金森氏病的具體情況中，已經(jīng)證明移植的胎腦神經(jīng)細胞建立了與周圍細胞的正確聯(lián)系并可生成多巴胺。這能夠?qū)е屡两鹕喜【C合癥的長期逆轉(zhuǎn)。
本發(fā)明的主要優(yōu)勢是可以提供實質(zhì)上無限的等基因或同源人細胞適合于移植。因此，它將消除與當前移植方法有關(guān)的重大問題，即由于宿主對移植物或移植物對宿主的排斥而可能發(fā)生的移植組織排斥。常規(guī)的是，通過施用抗排斥藥物諸如環(huán)孢菌素來預(yù)防或降低排斥。然而，這些藥物具有顯著的不利副作用，如免疫遏制、致癌特性、以及非常昂貴。本發(fā)明應(yīng)當消除或者至少大大降低對抗排斥藥物的需要。
可以通過等基因細胞療法來治療的其它疾病和狀況包括例如脊髓損傷、多發(fā)性硬化癥、肌肉營養(yǎng)不良癥、糖尿病、肝病(即高膽固醇血癥)、心臟病、軟骨代換、燒傷、腳部潰瘍、胃腸疾病、血管疾病、腎病、泌尿道疾病、和與衰老有關(guān)的疾病和狀況。
這種方法學(xué)可用于取代缺陷基因(如缺陷的免疫系統(tǒng)基因、囊性纖維化基因)，或者用于導(dǎo)入導(dǎo)致治療有利蛋白(轉(zhuǎn)染生長因子、淋巴因子、細胞因子、酶等)表達的基因。例如，可以將編碼由腦衍生的生長因子的基因?qū)肴藘?nèi)細胞團細胞，使細胞分化成神經(jīng)細胞，并將細胞移植到帕金森氏病患者體內(nèi)，從而延遲這種疾病過程中神經(jīng)細胞的損失。
以前，用BDNF轉(zhuǎn)染的細胞類型可以是原代細胞或永生化細胞，或是神經(jīng)衍生細胞或是非神經(jīng)(成肌細胞和成纖維細胞)衍生細胞。例如，已經(jīng)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用BDNF基因轉(zhuǎn)染了星形膠質(zhì)細胞，并將細胞移植到帕金森氏病的大鼠模型中(Yoshimoto等人，BrainResearch，69125-36，1995)。
移植后32天，這種離體療法將大鼠中帕金森氏病樣綜合癥降低了高達45％。同樣，已經(jīng)將酪氨酸羥化酶基因置于星形膠質(zhì)細胞中而獲得相似結(jié)果(Lundberg等人，Develop.Neurol.，13939-53，1996及其引用的參考文獻)。
然而，這些離體系統(tǒng)有問題。具體而言，目前使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體內(nèi)被下調(diào)，而轉(zhuǎn)基因只是瞬時表達(回顧見Mulligan，Science，260926-932，1993)。同樣，這些研究使用壽命有限且復(fù)制緩慢的原代細胞，星形膠質(zhì)細胞。這些特性對轉(zhuǎn)染率有不利影響，且阻止對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的選擇。此外，幾乎不可能增殖大群基因打靶的原代細胞用于同源重組技術(shù)。相比之下，通過使用分化祖細胞應(yīng)當能夠消除與逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)有關(guān)的困難。
可導(dǎo)入本發(fā)明分化祖細胞的基因包括例如表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)性生長因子、胰島素樣生長因子(I和II)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4/5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、AFT-1、細胞因子基因(白介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子(α和β)等)、編碼治療酶的基因等。
除了人分化祖細胞在細胞、組織、和器官移植中的用途以外，本發(fā)明還包括非人細胞在人類疾病治療中的用途。因而，任何物種的分化祖細胞都可用于治療批準進行細胞、組織、或器官移植的人類疾病狀況。一般而言，本發(fā)明的分化祖細胞可用于相同物種(自體、同基因、同種異體移植)或不同物種(異種移植)。
同樣，本發(fā)明的分化祖細胞，優(yōu)選人細胞，可用作分化的體外模型，特別是用于研究涉及早期發(fā)育調(diào)控的基因。
同樣，使用本發(fā)明分化祖細胞生成的分化細胞、組織、和器官也可用于藥物研究。
本發(fā)明還提供了生成譜系缺陷型人胚胎干細胞的方法。這些細胞是由通過核移植生成的人胚前期衍生的。若假設(shè)將這種胚胎移植到女性子宮內(nèi)，則它絕不會發(fā)育成人。
為了生成譜系缺陷型胚胎干細胞，優(yōu)選譜系缺陷型人胚胎干細胞，可通過基因工程改造體細胞使之不能分化成特定細胞譜系。這些遺傳修飾包括敲除所選擇的基因，或者表達合適的反義核酸或核酶。敲除基因或不許表達的基因的范例是血清應(yīng)答因子(SRF)(Arsenian等人，EMBO J，17(21)6289-6299，1998)、MESP-1(Saga，Mech Dev，75(1-2)53-66，1998)、HNF-4(Chen等人，Genes Dev，8(20)2466-2477，1994)、整聯(lián)蛋白-β1(Rohwedel等人，Dev Biol，201(2)167-184，1998)、和MSD(Holdener等人，Development，120(5)1335-1346，1994)，用于中胚層；GATA-6(Morrisey等人，Genes Dev，12(22)3579-3590，1998)和GATA-4(Soudais等人，Development，121(11)3877-3888，1995)，用于內(nèi)胚層；和RNA解旋酶A(Lee等人，Proc Natl Acad Sci USA，95(23)13709-13713，1998)和Hβ58(Radice等人，Development，111(3)801-811，1991)，用于外胚層。本發(fā)明還涵蓋導(dǎo)入一種或多種可預(yù)防特定細胞譜系分化(如神經(jīng)細胞)的遺傳修飾。用于進行基因敲除的方法和載體是許多專利的主題，包括美國專利號5,110,735、6,074,853、5,998,144、5,948,653、5,945,339、5,925,544、5,869,718、5,830,698、5,780,296、5,614,396、5,612,205、5,468,629、5,093,257，將所有這些完整收入本文作為參考。
特定細胞譜系中涉及的可以刪除或滅活的其它基因包括例如ICSBP、hedgehog、Cbfal、VASA、HESXI、轉(zhuǎn)錄因子、以及許多其它基因。最近，Sato等人，Mol Reprod Devel，56(1)34-44，2000報導(dǎo)了使用Cre-LoxP系統(tǒng)來鑒定涉及特定細胞譜系的基因的遺傳方法，將其完整收入本文作為參考。
然后將經(jīng)遺傳工程改造的細胞作為細胞核供體用于生成核移植單位。人卵母細胞或任何其它哺乳動物(如牛)卵細胞可用作細胞核供體的受體。如上所述使核移植單位發(fā)育成胚泡，并由其衍生譜系缺陷型人胚胎干細胞。對于涉及生成人胚胎干細胞的方法參閱例如Thomson等人，Science，2821145-1147，1998和美國專利號5,843,780。在誘導(dǎo)分化后，譜系缺陷型人胚胎干細胞不會分化成至少一種胚胎胚層(中胚層、內(nèi)胚層、或外胚層)。如果需要，也可以將譜系缺陷型人胚胎干細胞改造成“必死的”，例如通過表達反義或核酶端粒酶基因。
雖然上文已經(jīng)針對譜系缺陷型人胚胎干細胞描述了本發(fā)明，本發(fā)明還包括任何哺乳動物物種的譜系缺陷型胚胎干細胞。
實施例為了更清楚的描述本發(fā)明而提供下列實施例。這些實施例是為了例示絕非限制而提供的。
B.組織的解離和培養(yǎng)1)由錐形管中取出樣品，并置于裝有新鮮溫熱溶液1的100mm培養(yǎng)皿中；2)使用無菌鑷和剪修整任何毛發(fā)，并轉(zhuǎn)移到裝有溶液1的另一個皿中；3)使用無菌鑷和解剖刀小心的切出非常薄的組織切片。切片越薄，產(chǎn)生的細胞越多；4)將切片平坦的置于組織培養(yǎng)皿的底部中央，并覆蓋無菌載玻片；5)用約10ml普通培養(yǎng)基注滿盤，并置于5％CO2、37℃恒溫箱中；6)將外植體樣品培養(yǎng)10天，更換一次培養(yǎng)基；7)除去培養(yǎng)基，用DPBS漂洗，加入5ml胰蛋白酶溶液(0.08％胰蛋白酶和0.02％EDTA)；
8)置于加熱板上直至細胞松開；9)由盤中除去溶液，并置于裝有等量溫熱培養(yǎng)基(10％FBS)的50ml錐形管中；10)旋轉(zhuǎn)沉降細胞；11)除去上清液，并將細胞重懸于普通培養(yǎng)基中；12)培養(yǎng)。溶液1DPBS(Biowhittaket，04-479Y) 200ml環(huán)丙沙星IICL(Mediatech，61-277) 2.33mg兩性霉素(Gibco，15295-017) 1.5ml牛卵母細胞的體外成熟在屠宰場收集卵巢，置于溫熱的PBS(34℃)中，并在8小時內(nèi)運送至實驗室。在無菌條件下用18G針頭抽吸直徑超過2mm的每個濾泡。在修改后的Tyrode氏培養(yǎng)基(TL Hepes)中挑選卵母細胞。將具有均相細胞質(zhì)、相當大的卵周隙、和完整卵丘細胞的卵母細胞置于成熟培養(yǎng)基M199(Gibco)和10％FCS、5μl/ml bFSH(Nobl)、5μl/ml bLH(Nobl)、和10μl/ml Penstrep(Sigma)中，于38.5℃、5％CO2保溫22小時。核移植成熟18小時后，將卵母細胞置于礦物油(Sigma)下的一滴100μlTL HECM Hepes中。使用直徑25μm的斜面玻璃移液管進行卵母細胞去核(抽取染色體)。通過將事先在含1μg/ml bisBENZIMIDE(Hoechst33342，Sigma)的TL HECM-Hepes中培養(yǎng)15分鐘的各個卵母細胞在UV燈下暴露來進行去核評價。成熟23小時后，將供體細胞置于卵周隙中并與卵的細胞質(zhì)融合。胚胎培養(yǎng)受精后的前3天，在500μl孔板中培養(yǎng)胚胎，飼養(yǎng)層是小鼠胚胎成纖維細胞(MF)，培養(yǎng)基是含10％胎牛血清的ACM。第4天，將胚胎轉(zhuǎn)移至裝有小鼠胚胎成纖維細胞(MF)飼養(yǎng)層和新鮮ACM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)的500μl孔板中直至胚泡階段。ES樣細胞培養(yǎng)物將胚泡置于裝有有絲分裂滅活MF飼養(yǎng)層和ES培養(yǎng)基(DMEM-高葡萄糖，15％胎牛血清、4μl/ml抗生素-抗霉菌素、2.8μl/ml 2-巰基乙醇、0.3mg/ml L-谷氨酰胺、10μl/ml非必需氨基酸、和1μl/ml泰洛星酒石酸鹽)(提前1天于38.5℃、5％CO2平衡)的32mm板(Nunc)中。使用22G針頭，機械的除去胚泡的透明帶和滋養(yǎng)細胞。將剩余內(nèi)細胞團(ICM)置于MF的上面。培養(yǎng)1-2周后，將ES樣細胞傳代至新鮮的有絲分裂滅活MF的上面。MF的滅活是通過將它們暴露于伽馬照射(2956rad)來進行的。使用拉過的巴斯德移液管，切下一小片集落(50-100個細胞)并將其置于MF飼養(yǎng)層的上面，由此對ES樣細胞進行傳代。
通過上述流程，由轉(zhuǎn)基因成熟體細胞重建了41個牛胚胎。當在上述條件下培養(yǎng)內(nèi)細胞團細胞時，在那41個胚胎中，15個(或37％)生成胚胎干細胞樣細胞。然而，26個胚胎不能生成胚胎干細胞樣細胞，盡管是在干細胞生成的理想條件下培養(yǎng)內(nèi)細胞團細胞。
尚不清楚胚胎發(fā)育的時間安排、各胚胎的內(nèi)在差異、或具體的培養(yǎng)條件(如存在或缺乏各種生長因子)是否對只有一部分內(nèi)細胞團發(fā)育成胚胎干細胞樣細胞負有責任。盡管如此，這些結(jié)果指出，存在不能或不發(fā)育成胚胎干細胞的多能內(nèi)細胞團細胞。這些不發(fā)育成胚胎干細胞的內(nèi)細胞團細胞也應(yīng)當具有治療價值。應(yīng)當注意，Thompson等人，Science，2821145-1147，1998報告了人胚胎干細胞的生成，其中14個內(nèi)細胞團細胞中只有5個(或36％)發(fā)育成ES細胞系。因而，存在不發(fā)育成胚胎干細胞的內(nèi)細胞團細胞這一現(xiàn)象似乎是哺乳動物物種中的普遍現(xiàn)象。實施例2由Thomas Morris公司(馬里蘭)購買了3頭大約8-10月齡的成年Hostein牛(體重大約500-1000磅)，并運送至馬薩諸塞大學(xué)(Amherst)的South Deerfield農(nóng)場。為了獲得用于核移植的成纖維細胞，使用耳科鉗由每只動物采集皮膚活組織。將表達編碼增強型綠色熒光蛋白(eGFP)的報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中，并使用新霉素選擇經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞。如先前Nature Biotechnol.，16642-646，1998(收入本文作為參考)中所述，將通過PCR和/或FISH分析的純化細胞用于核移植。
然后將由牛胚泡生成的分離內(nèi)細胞團細胞注射到供體牛的腰旁筋膜中(在每只動物中，3個位點用來自3個10日胚胎的內(nèi)細胞團，3個位點用來自3個12日胚胎的內(nèi)細胞團，3個位點用來自3個14日胚胎的內(nèi)細胞團)。內(nèi)細胞團衍生自注射的相同動物，因而內(nèi)細胞團對于牛是免疫相容的。2個月后，對肌肉檢查畸胎瘤形成。切下任何經(jīng)鑒定腫瘤用于組織學(xué)分析。
對直立動物進行流程，在尾部靜脈進行靜脈內(nèi)施用20mg甲苯噻嗪/8mg酒石酸環(huán)丁羥嗎喃。夾住腰旁筋膜區(qū)，并進行手術(shù)準備，作為腰旁小塊施用100ml 2％利多卡因作為局部麻醉劑。手術(shù)后3天內(nèi)應(yīng)當給動物以抗生素作為預(yù)防性措施(50mg/cc Ceftlofur HCl，1cc/100磅)。手術(shù)后立即給予一次氟胺煙酸葡胺注射(1cc/100磅)以控制疼痛和手術(shù)部位的腫大。若腰旁筋膜沒有發(fā)生畸胎瘤形成，則可以分析其它部位，即皮下。
預(yù)計在畸胎瘤中將觀察到來自所有3種胚層(即外胚層、中胚層、和內(nèi)胚層)的細胞。
在詳細的且通過具體實施方案描述了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將領(lǐng)會到可以對本發(fā)明進行多種變動和更改而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.用于生成分化祖細胞的方法，包括(I)獲得桑椹胚衍生細胞或胚泡的內(nèi)細胞團細胞；并(II)誘導(dǎo)桑椹胚衍生細胞或內(nèi)細胞團細胞分化成分化祖細胞。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括分離所述分化祖細胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中誘導(dǎo)所述桑椹胚衍生細胞或內(nèi)細胞團細胞的分化而不存在未分化胚胎干細胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述胚泡是通過體外受精生成的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述胚泡是人的胚泡。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述胚泡是由核移植單位生成的。
7.權(quán)利要求6的方法，其中在所述核移植單位中插入、消除、或修飾期望DNA，由此生成遺傳改變的分化祖細胞。
8.權(quán)利要求1的方法，其中在平坦、粘性環(huán)境中誘導(dǎo)所述內(nèi)細胞團細胞分化。
9.權(quán)利要求1的方法，其中在三維粘性環(huán)境中誘導(dǎo)所述內(nèi)細胞團細胞分化。
10.權(quán)利要求1的方法，其中在微重力下誘導(dǎo)所述內(nèi)細胞團細胞分化。
11.權(quán)利要求1的方法，其中通過在免疫缺陷小鼠中生成畸胎瘤來誘導(dǎo)所述內(nèi)細胞團細胞分化。
12.權(quán)利要求1的方法，其中通過將所述內(nèi)細胞團細胞包裹在等基因人患者內(nèi)并由所述包裹細胞生成畸胎瘤來誘導(dǎo)所述內(nèi)細胞團細胞分化。
13.權(quán)利要求1的方法，其中通過將所述內(nèi)細胞團細胞包裹在異基因人患者內(nèi)并由所述包裹細胞生成畸胎瘤來誘導(dǎo)所述內(nèi)細胞團細胞分化。
14.權(quán)利要求1的方法，其中分化祖細胞衍生自中胚層。
15.權(quán)利要求1的方法，其中分化祖細胞衍生自外胚層。
16.權(quán)利要求1的方法，其中分化祖細胞衍生自內(nèi)胚層。
17.依照權(quán)利要求2的方法獲得的分化祖細胞。
18.權(quán)利要求17的分化祖細胞，其是人的分化祖細胞。
19.依照權(quán)利要求7獲得的轉(zhuǎn)基因分化祖細胞。
20.權(quán)利要求19的轉(zhuǎn)基因分化祖細胞，其是人的轉(zhuǎn)基因分化祖細胞。
21.治療方法，包括對需要細胞移植療法的患者施用權(quán)利要求18的等基因分化細胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述細胞移植療法用于治療選自下組的疾病或狀況帕金森氏病、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化癥、肌肉營養(yǎng)不良癥、囊性纖維化、肝病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、腳部潰瘍、血管疾病、泌尿道疾病、AIDS、和癌癥。
23.權(quán)利要求21的方法，其中分化人細胞是造血細胞或神經(jīng)細胞。
24.權(quán)利要求21的方法，其中該療法用于治療帕金森氏病，而且分化細胞是神經(jīng)細胞。
25.權(quán)利要求21的方法，其中該療法用于治療癌癥，而且分化細胞是造血細胞。
26.治療方法，包括對需要細胞移植療法的人患者施用權(quán)利要求17的異種分化細胞。
27.權(quán)利要求23的方法，其中異種分化細胞是牛細胞。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述細胞移植療法用于治療選自下組的疾病或狀況帕金森氏病、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化癥、肌肉營養(yǎng)不良癥、囊性纖維化、肝病、糖尿病、心臟病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、腳部潰瘍、血管疾病、泌尿道疾病、AIDS、和癌癥。
29.用于生成譜系缺陷型胚胎干細胞的方法，包括(I)遺傳修飾體細胞，使得所述體細胞不能分化成預(yù)定的細胞譜系；(II)使用經(jīng)遺傳修飾的體細胞或細胞核作為細胞核供體，生成核移植單位；(III)激活產(chǎn)生的核移植單位；(IV)培養(yǎng)所述激活的核移植單位直至超過二細胞發(fā)育階段；并(V)在適合于形成譜系缺陷型胚胎干細胞的條件下，培養(yǎng)由所述培養(yǎng)的核移植單位獲得的細胞，所述干細胞不能分化成至少一種胚胎胚層。
30.權(quán)利要求29的方法，其中生成所述核移植單位包括在適合于形成核移植單位的條件下將經(jīng)遺傳修飾的人體細胞或細胞核插入去核哺乳動物卵母細胞中。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述譜系缺陷型人胚胎干細胞不能分化成中胚層。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述譜系缺陷型人胚胎干細胞不能分化成內(nèi)胚層。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述譜系缺陷型人胚胎干細胞不能分化成外胚層。
34.依照權(quán)利要求29的方法生成的譜系缺陷型人胚胎干細胞。
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述譜系缺陷型胚胎干細胞是人的。
全文摘要
用于生成分化祖細胞的改進方法，包括由胚泡獲得內(nèi)細胞團細胞，并誘導(dǎo)內(nèi)細胞團細胞分化產(chǎn)生分化祖細胞?？梢赞D(zhuǎn)染分化祖細胞，從而添加、刪除、或改變期望基因。分化祖細胞可用于細胞療法和作為生成移植用的組織和器官的細胞來源。還提供了用于生成譜系缺陷型人胚胎干細胞的方法。
文檔編號A61P31/00GK1413250SQ00817477
公開日2003年4月23日 申請日期2000年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月15日
發(fā)明者J·西貝里, M·D·維斯特, R·P·蘭扎 申請人:先進細胞技術(shù)公司