專利名稱：對(duì)hiv免疫應(yīng)答的改進(jìn)或與其相關(guān)的改進(jìn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫原，該免疫原被設(shè)計(jì)為在人類受試者中引發(fā)抗HIV免疫應(yīng)答(特別是細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)，一種編碼該免疫原的核酸分子，包含所述免疫原和/或所述核酸分子的組合物，以及在人類受試者中誘導(dǎo)抗HIV免疫應(yīng)答(特別是細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)的方法。
背景技術(shù)：
開發(fā)有效的人類免疫缺陷病毒(HIV)疫苗是當(dāng)前對(duì)獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)進(jìn)行研究的主要目的之一。盡管HIV感染的預(yù)防和強(qiáng)效藥物結(jié)合治療取得了進(jìn)展，但估計(jì)每天仍有16,000人受到感染。90％以上的新感染發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，在這些國(guó)家還無(wú)法獲得或負(fù)擔(dān)最新的醫(yī)學(xué)進(jìn)展。這些國(guó)家的最大希望是開發(fā)有效的，可獲得的HIV疫苗。目前科學(xué)家們對(duì)開發(fā)AIDS疫苗的可能性越來(lái)越樂(lè)觀(McMichael和Hanke 1999 Nat.Med.5，612-614；Gold 1999 IAVI Report 4，pp1-2，8-9，15-16&18)。
一種理想的疫苗應(yīng)該誘導(dǎo)無(wú)病原體的免疫，因此在暴露后，病毒應(yīng)該在體內(nèi)檢測(cè)不到。然而，這可能是一個(gè)不實(shí)際的目標(biāo)。而一個(gè)能達(dá)到的目標(biāo)可能是導(dǎo)致有限和短暫病毒復(fù)制的疫苗誘導(dǎo)的免疫，此后病毒不能被檢測(cè)到，不產(chǎn)生疾病癥狀和傳播到其它個(gè)體。替代地，一種有可能成功的疫苗可以誘導(dǎo)至少使被檢測(cè)病毒保持低水平的免疫應(yīng)答，從而完全或基本預(yù)防進(jìn)展為AIDS和傳播。
為了誘導(dǎo)無(wú)病原體的免疫，可能需要用預(yù)防性疫苗來(lái)引發(fā)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。由于HIV被分離和測(cè)序，已經(jīng)付出了相當(dāng)多的努力來(lái)開發(fā)誘導(dǎo)中和性抗體(nAb)的基于被膜的疫苗。然而，已經(jīng)證明這是極端困難的(Heilman和Baltimore 1998 Nat.Med.4(4Suppl.)532-534)。盡管有人報(bào)道在誘導(dǎo)抗實(shí)驗(yàn)室HIV株的nAb上取得了一些成功(Berman等，1990 Nature 345，622-625；Fultz等，1992 Science 256，1687-1690)，但中和初級(jí)分離物極為困難(Trkola等，1998 J.Virol.72，1876-1885；Haynes 1996 Lancet34，933-937)。核心gp120的晶體結(jié)構(gòu)為最初15年的相對(duì)失敗提供了解釋，它揭示了HIV防止有效誘導(dǎo)nAb的多種機(jī)制(Wyatt等，1998Nature 393，705-711；Kwong等，1998 Nature 393，638-659)。由于這些困難，許多疫苗設(shè)計(jì)者的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，這是(主要)由細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的。
細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)通常是CD8+細(xì)胞，并且以至少兩種不同的方式參與生物體的防御它們殺滅感染病毒的細(xì)胞；而且它們分泌各種直接或間接參與抑制病毒復(fù)制的細(xì)胞因子和趨化因子。接種后的CTL介導(dǎo)的保護(hù)可能取決于循環(huán)中的CTL水平，并可能特異性針對(duì)復(fù)制循環(huán)中早期表達(dá)(調(diào)節(jié)蛋白)而不是晚期表達(dá)(結(jié)構(gòu)蛋白)的蛋白。
CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)和維持需要CD4+T淋巴細(xì)胞(輔助T細(xì)胞)提供的“輔助”。在一些HIV感染的個(gè)體中，檢測(cè)到了高水平的HIV特異性輔助應(yīng)答。
誘導(dǎo)強(qiáng)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法的鑒定將提供研究它們?cè)谟绊慔IV感染過(guò)程中的作用的工具，并可能刺激研究有效HIV疫苗的進(jìn)展。以前曾經(jīng)將原型的HIV疫苗構(gòu)建為一串部分重疊的可以被鼠、獼猴和人CTL識(shí)別的表位，它是通過(guò)對(duì)人類為安全和可接受的疫苗載體而遞送的，即DNA載體和修飾的痘苗病毒Ankara(MVA)載體(Hanke等，1998Vaccine 16，426-435；Hanke等，1998J.Gen.Virol.79，83-90)。在小鼠中，發(fā)現(xiàn)最有效的CTL誘導(dǎo)方案是用DNA激發(fā)，然后用MVA加強(qiáng)(Hanke等，1998 Vaccine 16，439-445；Schneider等，1998 Nat Med.4，397-402)，即用編碼相關(guān)多肽的核酸激發(fā)小鼠，然后通過(guò)接種表達(dá)相關(guān)表位的修飾痘苗病毒Ankara(“MVA”)載體而加強(qiáng)。
WO 98/56919公開了一種“激發(fā)-加強(qiáng)”接種策略，包括(i)用包含靶抗原的一種或更多T細(xì)胞表位來(lái)源和可藥用載體的組合物激發(fā)，和(ii)用包含靶抗原的一種或更多T細(xì)胞表位來(lái)源的組合物加強(qiáng)，該組合物中包括至少一種與激發(fā)組合物中的T細(xì)胞表位相同的T細(xì)胞表位。
本發(fā)明的目的包括，但不限于，提供可以用于引發(fā)人類HIV特異性應(yīng)答的免疫原。在此引入說(shuō)明書中提到的所有文件和公開文獻(xiàn)作為參考。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面提供了以適于給予人類受試者的無(wú)病原體形式存在的免疫原，該免疫原包含至少一部分HIV的gag蛋白，所述gag蛋白來(lái)源于HIV分化體或與一種或更多HIV分化體具有共有序列，并至少包含部分p17和p24；以及包含多個(gè)氨基酸序列的合成多肽，每個(gè)序列包含一種HIV蛋白的人CTL表位，并且其中許多HIV蛋白表現(xiàn)為合成多肽形式，所述CTL表位的選擇是為了刺激對(duì)感興趣的一種或更多HIV分化體的免疫應(yīng)答。
這里提到的“無(wú)病原體的”是指一般不存在病毒、細(xì)菌、真菌、酵母、衣原體、支原體和前述微生物的孢子(尤其是在人類中致病的微生物)。然而，免疫原可以包含一種或更多用于在人類受試者中表達(dá)gag蛋白和/或合成多肽的特異性已知微生物(如病毒或細(xì)菌)載體。這些載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并包括，例如，腺病毒和痘病毒等在人類中本身不致病或者經(jīng)遺傳操作或其它修飾使其在人類中不致病的病毒。特別優(yōu)選的是痘苗病毒，尤其是修飾的痘苗病毒Ankara(MVA)。其它特別優(yōu)選的病毒載體包括Semliki Forest病毒(SFV)和Sindbis病毒(見(jiàn)Smerdon和Liljestrom 2000，Gene Ther.Regul.1，1-31)。合適的細(xì)菌載體包括BCG，以及沙門氏菌的減毒株(特別是開發(fā)為腹瀉疾病疫苗的沙門氏菌“雙aro”突變體)，和志賀氏菌(見(jiàn)Shata等，2000 Mol.Med.Today 6，66-71)。
其它可以用于產(chǎn)生免疫原的表達(dá)系統(tǒng)包括煙草花葉病毒(TMV)表達(dá)載體(Palmer等，1999 Arch.Virol.144，1345-60)和藍(lán)舌病毒的NS1小管(Adler等，1998 Med.Microbiol.Immunol.(Berl.)187，91-96)。
這里用到的名詞“合成的”是指其整體不存在于天然存在的HIV分離物中的多肽。名詞“合成的”不準(zhǔn)備指必須由固相肽合成的常規(guī)化學(xué)技術(shù)合成的多肽。盡管這代表一種可能性，多肽一般優(yōu)選通過(guò)編碼合成多肽的適當(dāng)核酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而合成。一些合成方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，不構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
gag蛋白(或其部分)和合成多肽優(yōu)選以一定的方式連接為單個(gè)整體。例如，病毒載體可以將gag蛋白和合成多肽表達(dá)為免疫原中分開的成分。替代地，免疫原的這兩種成分可以彼此共價(jià)偶聯(lián)或結(jié)合，或與共同的載體實(shí)體(如脂質(zhì)體、ISCOM或分子)共價(jià)偶聯(lián)或結(jié)合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫原的gag蛋白和合成多肽成分存在于單個(gè)多肽或融合蛋白。在這種融合蛋白中，gag蛋白和合成多肽可以基本是存在的僅有成分。替代地，融合蛋白可以包含可以與其它HIV抗原(或其部分)相關(guān)或來(lái)自于其它來(lái)源的其它成分。這樣，在一些實(shí)施方案中，多肽可以包含基本鄰接于(即小于10個(gè)間插氨基酸殘基)合成多肽的gag蛋白的一部分。在其它實(shí)施方案中，gag蛋白部分和合成多肽可以由一種或更多間插成分(即有10個(gè)或更多間插氨基酸殘基)分開，間插成分一般包括一種或更多其它HIV抗原。
免疫原一般也優(yōu)選不包含完整gag蛋白氨基酸序列。一般存在55％-95％的gag蛋白，優(yōu)選65％-85％，最優(yōu)選約75％。
已知野生型HIV gag蛋白由三個(gè)部分，即p17，p24和p15組成。這些部分在感染細(xì)胞中合成為單個(gè)多蛋白，p17在N端。一般地，在HIV感染的細(xì)胞中，p17的N端是豆蔻?；?。
理想的狀況是免疫原的gag部分至少包含部分p17和p24，但一般優(yōu)選p17成分將以一定的方式被修飾，以便預(yù)防豆蔻?；?。通過(guò)反轉(zhuǎn)免疫原中p17和p24的順序可以方便地達(dá)到這一目的，這樣p17不再處于游離N端并且因此不能被豆蔻?；?。本發(fā)明者確信這可以改進(jìn)向受試者免疫系統(tǒng)呈遞來(lái)自于免疫原的肽的效率。
免疫原的gag蛋白成分一般包含至少一個(gè)T輔助細(xì)胞的II類HLA限制性肽表位，并優(yōu)選包含多個(gè)這樣的表位(優(yōu)選使許多不同的II類HLA限制性等位基因表現(xiàn)在gag成分中)。gag蛋白成分一般也將包含一種或更多CTL I類HLA限制性肽表位。
免疫原的合成多肽成分將方便地采用一串CTL表位的形式，每一個(gè)分別表現(xiàn)為約8-12個(gè)氨基酸的序列，或含有約8-12個(gè)氨基酸的序列。理想的情況是至少一些(優(yōu)選大多數(shù))表位將部分重疊(使一種表位的一個(gè)或更多氨基酸也包含在鄰接表位的序列中)。一些“非表位”氨基酸序列可以出現(xiàn)在鄰近表位之間，但一般要避免這種情況。
鄰近表位之間的非表位氨基酸優(yōu)選少于20個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選少于10個(gè)殘基，最優(yōu)選1-5個(gè)氨基酸殘基。很明顯這些非表位氨基酸序列可以包含優(yōu)化合成多肽表達(dá)水平或優(yōu)化其免疫原性的接頭、間隔區(qū)等。
因此在一種極端的實(shí)施方案中，合成多肽中的所有人CTL表位都可以重疊。在另一個(gè)極端，每一個(gè)表位都可以由至少一些非表位氨基酸將其與鄰近表位隔開。一般優(yōu)選至少50％的人CTL表位是重疊的。
除了重疊表位，合成多肽可以至少包含一些“鄰接表位”。鄰接表位是指不重疊但不由間插非表位氨基酸序列分開的表位。
因此在優(yōu)選實(shí)施方案中，合成多肽包含不同HIV蛋白的小片段(一般約10-20個(gè)氨基酸殘基)一起拼湊成的嵌合型，這些片段一般將包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)已知鄰接和/或重疊的人CTL表位。合成多肽中存在相同HIV蛋白的許多片段，這些片段一般選自蛋白的不連續(xù)部分，因此合成肽一般不會(huì)包含對(duì)應(yīng)于特定HIV蛋白的超過(guò)20-25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的序列。通常合成肽的設(shè)計(jì)基本省略了已知不含人CTL表位的HIV蛋白部分。
許多不同的HIV蛋白優(yōu)選表現(xiàn)為合成肽。合成肽可以包含存在于任何HIV抗原的表位，但優(yōu)選包含至少一種存在于下列一種或多種蛋白的表位p25；pol；gp41；gp120和nef。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，合成多肽包含至少一種存在于前面提到的每一種HIV蛋白的CTL表位。合成多肽可以額外包含至少一種存在于每一種下列HIV蛋白的CTL表位vpr，vpu，vif(特別是)tat和rev。
應(yīng)該理解這里用到的術(shù)語(yǔ)“人CTL表位”不是指得到的表位的蛋白的來(lái)源，而是指由至少一部分人群的CTL識(shí)別并應(yīng)答的表位。一般地說(shuō)，人CTL表位將由世界人口的至少0.01％、優(yōu)選0.1％以及更優(yōu)選至少1％識(shí)別。
在一種特定實(shí)施方案中，免疫原特別排除了來(lái)自于一般由人免疫系統(tǒng)識(shí)別的env蛋白的任何表位。大多數(shù)當(dāng)前使用的診斷實(shí)驗(yàn)是基于HIV env特異性免疫應(yīng)答的檢測(cè)，因此通過(guò)將env成分排除在免疫原外，可以區(qū)分由病毒感染和接種免疫原導(dǎo)致的免疫應(yīng)答。
在一種實(shí)施方案中，存在于合成多肽中的CTL表位的選擇將導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)HIV分化體A的免疫應(yīng)答。然而合成肽優(yōu)選足夠大，并適當(dāng)選擇CTL表位，從而刺激對(duì)不同HIV分化體的交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答。這可以通過(guò)引入一種或更多不同HIV分化體中的保守CTL表位而方便地達(dá)到。一些這樣的表位是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(見(jiàn)下面的表1)。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫原包含至少一個(gè)由一種或多種實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)哺乳動(dòng)物(如小鼠和/或猴)識(shí)別的表位(方便為CTL表位)。這種表位可以容易插入合成多肽。引入此類表位允許在使用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)哺乳動(dòng)物(如小鼠或獼猴)進(jìn)行的效力測(cè)定中測(cè)定不同批免疫原的質(zhì)量、再生性和/或穩(wěn)定性。這種表位的例子包括氨基酸序列ACTPYDINQML(Seq.ID No.1；含有來(lái)自于猿免疫缺陷病毒SIV，gagp27的顯性表位，由獼猴CTLs識(shí)別)和RGPGRAFVTI((Seq.ID No.2；一種來(lái)自于HIV env蛋白的H-2Dd限制性CTL小鼠表位)。
一系列共23個(gè)適于引入合成多肽的人CTL表位見(jiàn)表1。該列表不是完全的。優(yōu)選的免疫原將包含至少10個(gè)這種人CTL表位，更優(yōu)選至少15個(gè)，最優(yōu)選至少20個(gè)。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，列于表1中的23個(gè)人CTL表位的每一種將以合成多肽的形式出現(xiàn)，可選擇與同樣列于表1的獼猴和鼠表位一起。
理想的免疫原可以額外包含小分子標(biāo)志或標(biāo)記。這種標(biāo)志或標(biāo)記應(yīng)盡可能小，從而盡量減小存在于免疫原中的外源物質(zhì)量。方便的標(biāo)志或標(biāo)記允許檢驗(yàn)免疫原表達(dá)的檢驗(yàn)和/或免疫原的定量。適當(dāng)?shù)臉?biāo)志包括由單克隆抗體Pk識(shí)別的表位(Hanke等，1992 J.Gen.Virol.73，653-660)。
本發(fā)明的免疫原將方便地與其它物質(zhì)混合，從而提供疫苗組合物。例如，疫苗組合物可以額外包含一種或更多下列成分佐劑(如明礬)、脂質(zhì)體、或免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)。疫苗一般包含無(wú)病原體稀釋液、賦形劑或載體，如生理可接受的液體(如鹽水或磷酸緩沖液)。疫苗可以以液體或更優(yōu)選以凍干固體存在，在給藥前凍干固體懸浮或溶解于生理可接受的液體。
將免疫原給予人類受試者的方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很明確的。具體地說(shuō)，這些方法包括肌內(nèi)注射、皮下注射、或通過(guò)無(wú)針頭注射設(shè)備經(jīng)皮膚遞送。另外，也可通過(guò)口服、鼻內(nèi)或任何其它的適當(dāng)途徑給予疫苗(特別是包含細(xì)菌載體如減毒沙門氏菌或志賀氏菌載體)。適當(dāng)?shù)拿庖咴瓌┝恳话憧梢允?-500mg，一般10-100mg，取決于免疫原的大小和接受者的體重等。如果需要，適當(dāng)?shù)膭┝靠梢酝ㄟ^(guò)接受不同劑量免疫原的不同受試者組的常規(guī)試驗(yàn)和誤差確定，以及測(cè)定受試者對(duì)免疫原的免疫應(yīng)答以判斷最優(yōu)劑量大小。受試者的免疫應(yīng)答可以通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)測(cè)定(如鉻釋放測(cè)定，使用從受試者血樣中獲得的外周血淋巴細(xì)胞，作用于肽脈沖激發(fā)的或病毒感染的鉻標(biāo)記靶細(xì)胞)第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼融合蛋白的核酸分子，該融合蛋白包含本發(fā)明第一方面的免疫原。
核酸分子優(yōu)選為分離的無(wú)病原體形式，適于給予人類受試者。核酸分子優(yōu)選為“人源化的”，即使用經(jīng)常用于高度表達(dá)的人基因中的密碼子來(lái)編碼特定氨基酸(Andre等，1998 J.Virol.72 1497-1503)，而不是由HIV使用的密碼子。
理想狀況是將核酸分子包含在載體中，編碼免疫原的序列與人細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子序列可操作性連接。便利的條件是啟動(dòng)子為強(qiáng)病毒啟動(dòng)子，如人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。載體優(yōu)選也包括在人細(xì)胞中起作用的增強(qiáng)子和聚腺苷酸信號(hào)。理想地，為了最大的安全性，載體不應(yīng)該含有在人細(xì)胞中有功能的復(fù)制起點(diǎn)，以便預(yù)防不希望的載體復(fù)制。
載體可以以分離物形式給予受試者，可以作為基本“裸露”的核酸(優(yōu)選DNA)，或可以裝配在病毒、細(xì)菌、脂質(zhì)體或金包被的顆粒等遞送設(shè)備中。一種合適的遞送設(shè)備為修飾的痘苗病毒Ankara(MVA)免疫原基因或開放讀碼框架(ORF)可以插入MVA，例如，在胸腺嘧啶激酶位點(diǎn)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，載體可以包含編碼免疫原的核酸(此核酸因此符合本發(fā)明的第二方面)，載體也可以在其表面或內(nèi)部具有本發(fā)明第一方面的多肽免疫原。
不論是作為裸核酸還是裝配在遞送設(shè)備中給藥，至少一些給予的核酸進(jìn)入了受試者細(xì)胞并被轉(zhuǎn)錄(如果需要)或翻譯，導(dǎo)致受試者中免疫原的原位合成，受試者然后產(chǎn)生對(duì)免疫原的免疫應(yīng)答。
對(duì)于免疫原制劑本身，可以通過(guò)皮下或肌內(nèi)注射、口服遞送或通過(guò)無(wú)針頭注射器的方式經(jīng)皮膚給藥等許多已知的途徑給予人類受試者編碼免疫原的核酸。通過(guò)無(wú)針頭注射設(shè)備給藥的具體實(shí)施例公開于WO97/34652和WO 97/48485。核酸的合適劑量可以是10μg-10mg，一般為100μg-1mg，取決于核酸分子大小、給藥途徑、接受者體重等。同樣，常規(guī)試驗(yàn)和誤差(具有本教導(dǎo)的益處)將使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以判斷核酸的最優(yōu)劑量。
已經(jīng)用以下方法成功將DNA遞送到動(dòng)物組織，陽(yáng)離子脂質(zhì)體[Watanabe等，Mol.Reprod.Dev.38268-274(1994)；Sharkey等，WO 96/20013]，直接注射裸DNA至動(dòng)物肌肉組織[Robinson等，Vacc.11957-960(1993)；Hoffman等，Vacc.121529-1533；(1994)；Xiang等，Virol.199132-140(1994)；Webster等，Vacc.121495-1498(1994)；Davis等，Vacc.121503-1509(1994)；以及Davis等，Hum.Molec.Gen.21847-1851(1993)]和胚胎[Naito等，Mol.Reprod.Dev.39153-161(1994)；和Burdon等，Mol.Reprod.Dev.33436-442(1992)]，或用“基因槍”技術(shù)皮內(nèi)注射DNA[Johnston等，Meth.Cell Biol.43353-365(1994)]。
對(duì)于基于DNA的疫苗，通過(guò)注射裸質(zhì)粒DNA而遞送已經(jīng)在小鼠模型表現(xiàn)出誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的潛能。然而，在更大的動(dòng)物中，已經(jīng)證明利用DNA遞送而接種受到了阻礙，因?yàn)檫@需要大量DNA，或者會(huì)誘導(dǎo)抗原的持續(xù)表達(dá)，從而有可能發(fā)展為對(duì)抗原耐受。Berglund報(bào)道了通過(guò)用含有甲病毒DNA表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA注射給小鼠而誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的策略，該載體在真核表達(dá)盒中具有重組SemlikiForest病毒(SFV)復(fù)制子[Berglund等，Nature Biotechnol.16562-565(1998)]。該真核表達(dá)盒控制SFV復(fù)制子的初級(jí)核酸轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。將這種編碼異源抗原的SFV復(fù)制子轉(zhuǎn)錄物運(yùn)送到胞漿中并通過(guò)自我編碼的SFV復(fù)制酶復(fù)合物擴(kuò)增。擴(kuò)增的RNA復(fù)制子導(dǎo)致高水平產(chǎn)生編碼異源抗原的mRNA。相似的結(jié)果由Polo和他的研究小組描述過(guò)[Polo等，Nature Biotechnol.16517-518(1998)；Hariharan等，J.Virol.72950-958(1998)]。兩組都發(fā)現(xiàn)可以用小量注入質(zhì)粒DNA誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答。
另外，一種克服了常規(guī)遞送方法的缺點(diǎn)而向動(dòng)物遞送DNA的方法是給予減毒的、含有細(xì)菌DNA載體的侵襲性細(xì)菌，該載體具有編碼所表達(dá)基因的真核表達(dá)盒。例如，授權(quán)于Powell等的美國(guó)專利5,877,159描述了可以侵入動(dòng)物細(xì)胞而不建立復(fù)制性感染或?qū)е录膊〉幕罴?xì)菌，從而引入了編碼可以由動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的抗原的真核表達(dá)盒。
本發(fā)明的第三方面提供了一種刺激人受試者的抗HIV免疫應(yīng)答的方法，該方法包含制備本發(fā)明第一方面的免疫原，或本發(fā)明第二方面的核酸分子；以及給予受試者所述免疫原或核酸分子。
方便地，該方法既包含給予免疫原，也包含給予核酸分子。具體地說(shuō)，該方法優(yōu)選包含一次或多次給予核酸分子(“激發(fā)”)，然后經(jīng)過(guò)一段適當(dāng)?shù)拈g隔(如1周至4個(gè)月)，再一次或多次給予免疫原(“加強(qiáng)”)?？梢酝ㄟ^(guò)例如給予包含免疫原和/或編碼抗原的核酸分子的有能力復(fù)制的(即減毒病毒或細(xì)菌)或不復(fù)制載體而進(jìn)行加強(qiáng)。加強(qiáng)優(yōu)選通過(guò)給予作為MVA病毒顆粒一部分的免疫原而完成，該顆粒可以有利地包含編碼免疫原的核酸。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法的進(jìn)行將導(dǎo)致在受試者中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，因此當(dāng)受試者其后暴露于HIV感染時(shí)，受試者不會(huì)產(chǎn)生與HIV感染相關(guān)的AIDS癥狀。
本發(fā)明的第四方面提供了本發(fā)明第一方面的免疫原和/或本發(fā)明第二方面的核酸在制備預(yù)防或治療人類受試者HIV感染的藥物中的用途。
第五方面，本發(fā)明提供了一種編碼圖8A所示氨基酸序列的核酸序列。方便地，核酸序列包含或基本由圖8B所示核苷酸序列組成。
第六方面，本發(fā)明提供了一種包含圖8A所示氨基酸序列的多肽。
第五方面的核酸和/或第六方面的多肽可以用于所描述的與本發(fā)明其它方面相關(guān)的免疫原/疫苗組合物，因此這些免疫原和疫苗也考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且可以包含前面所述的載體等(特別是MVA)。本發(fā)明在第七方面進(jìn)一步提供了一種刺激人類受試者中抗HIV免疫應(yīng)答的方法，該方法包含給予受試者本發(fā)明第五方面的核酸和/或本發(fā)明第六方面的多肽。最后，本發(fā)明提供了本發(fā)明第五方面的核酸和/或本發(fā)明第六方面的多肽在制備預(yù)防或治療人類受試者HIV感染的藥物中的用途。
下面將通過(guò)說(shuō)明性的實(shí)施例并參考附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，在附圖中

圖1A是本發(fā)明的免疫原HIVA，HIVTA和HIV AeT；以及免疫原PPA的示意圖；圖1B表示HIVA免疫原的氨基酸序列(Seq.ID No.26)；圖2A表示編碼HIV A免疫原的核酸(稱作“HIVA基因”)的核苷酸序列(Seq.ID No.27)；圖2B是用于構(gòu)建HIVA基因的方法的示意圖；圖3是本發(fā)明的DNA載體分子(pTHr.HIVA)以及其構(gòu)建方法的示意圖；圖4是表示pTHr.HIVA轉(zhuǎn)染后的小鼠細(xì)胞表達(dá)的HIVA的免疫熒光檢測(cè)的顯微照片。
圖5A，B和C表示使用從接種本發(fā)明的DNA分子或免疫原的小鼠獲得的脾細(xì)胞進(jìn)行的鉻釋放測(cè)定的結(jié)果。
圖6A表示HIV TA免疫原的氨基酸序列(Seq.ID No.28)；圖6B表示編碼HIV TA免疫原的核酸分子的核苷酸序列(Seq.IDNo.29)；圖7A表示存在于HIV AeT免疫原中的tat多肽的氨基酸序列(Seq.ID No.30)；圖7B表示編碼HIV AeT免疫原的核酸分子的核苷酸序列(Seq.IDNo.31)；圖8A表示本發(fā)明第六方面的PPA免疫原的氨基酸序列(Seq.IDNo.32)；圖8B表示編碼PPA免疫原的核酸分子(符合本發(fā)明的第五方面)的核苷酸序列(Seq.ID No.33)。
實(shí)施例實(shí)施例1本實(shí)施例涉及一種用于疫苗的免疫原，該疫苗主要用于誘導(dǎo)由CD4+輔助T淋巴細(xì)胞和CD8+效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的協(xié)同作用介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。已經(jīng)設(shè)計(jì)將命名為HIVA(Hanke & McMichael Nat.Med.6，951-955)的免疫原用于在肯尼亞內(nèi)羅畢進(jìn)行的一項(xiàng)III期有效性臨床試驗(yàn)。圖1A是包括HIVA的一些免疫原的示意圖。HIVA來(lái)源于HIV-1分化體A的序列，該分化體是內(nèi)羅畢地區(qū)的最主要HIV分化體并且由大約73％的gag蛋白與一串25個(gè)部分重疊的CTL表位融合組成。HIVA的gag結(jié)構(gòu)域含有p24和p17，與病毒gag p17-p24-p15多蛋白的順序相反。這種重排防止p17 N端的豆蔻?；?，p17 N端的豆蔻酰化可以將重組蛋白導(dǎo)向到細(xì)胞膜，因此防止有效降解為I類主要組織相容復(fù)合物(MHC)呈遞所必需的肽。
圖1B表示HIVA免疫原的氨基酸序列(Seq.ID No.26)。對(duì)應(yīng)于用于裝配基因的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的氨基酸表示為粗體(GS對(duì)應(yīng)于Bam HI，GT對(duì)應(yīng)于kpnI，EF對(duì)應(yīng)于EcoRI)。
gag結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列來(lái)源于HIV-1分化體A的共有序列蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Korber等，″Human retroviruses and AIDS；a compilationand analysis of nucleicacid and aminoacid sequences″1997)。當(dāng)沒(méi)有肯尼亞株序列時(shí)，沒(méi)有強(qiáng)氨基酸分化體A的區(qū)域優(yōu)選偏向于烏干達(dá)分離體。HIV-1 gag蛋白不僅含有重要的I類MHC，也含有刺激CD4+T輔助細(xì)胞的II類限制性表位。
HIVA蛋白的C端命名為多CTL表位合成多肽。包括在HIVA中的CTL表位被感染在肯尼亞流行的HIV分化體A株的患者的CTL識(shí)別，該表位為8-10個(gè)氨基酸長(zhǎng)，來(lái)源于gag，pol，nef或env蛋白(Rowland-Jones等，1998 J.Clin.Invest.102，1758-1765；Dorrell等，1999 J.Virol.73，1708-1714)。這些表位中的許多是優(yōu)勢(shì)免疫表位，并且在其它HIV-1分化體中相對(duì)保守(表1)(因此應(yīng)該可以引發(fā)與分化體A以外的其它HIV病毒分化體交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答)。它們由17種不同的HLA等位基因呈現(xiàn)，包括常見(jiàn)非洲等位基因和在大多數(shù)種族人群中常見(jiàn)的等位基因。據(jù)估計(jì)由9種最常見(jiàn)的HLA等位基因呈現(xiàn)的優(yōu)選表位應(yīng)該覆蓋普通人群，而不考慮種族血統(tǒng)(Sydney等，1996 Immunol.Today17，261-266)。因此，只要大多數(shù)HIV感染的供體對(duì)gag p17/p24產(chǎn)生良好的CTL應(yīng)答，每種疫苗應(yīng)該具有應(yīng)答于至少兩種或三種存在于HIVA蛋白中的CTL表位的潛能。
HIVA合成多肽也包含分別由獼猴和鼠CTL識(shí)別的SIV gag和HIVenv表位，因此容易在小鼠(如果需要也可以是獼猴)效力測(cè)定中評(píng)估臨床應(yīng)用的批量產(chǎn)品的質(zhì)量、再生性和穩(wěn)定性。為便于檢測(cè)全長(zhǎng)蛋白和估計(jì)表達(dá)水平，將單克隆抗體表位Pk(Hanke et al，1992 J.Gen.Virol.73，653-660)添加到HIVA的C端。沒(méi)有理由相信三種非HLA表位會(huì)對(duì)接種個(gè)體產(chǎn)生健康威脅。
表1.包括在HIVA合成多肽多表位區(qū)的CD8+細(xì)胞表位
a-按出現(xiàn)在多表位中的順序列出各表位(Seq.ID Nos.3-25，1，2)。b-存在于約50％(小寫字母)或90％(大寫字母)被測(cè)序的HIV分化體分離物中的特定表位序列。c-“＝”表示該表位存在于分化體A gag結(jié)構(gòu)域N端。d-一種來(lái)源于SIV gag27的顯性表位，其側(cè)翼分別為N端的Ala和C端的Leu，由獼猴CTL識(shí)別，可以用于在獼猴中進(jìn)行的效力研究。E-由I類鼠MHC呈遞的CTL表位，用于小鼠中的效力測(cè)定。
由于準(zhǔn)備采納“激發(fā)/加強(qiáng)”方案，其中激發(fā)通過(guò)給予核酸而完成，因此需要設(shè)計(jì)編碼HIVA免疫原的核酸序列，以便增加HIVA在人細(xì)胞中的表達(dá)。首先，為保證有效起始從第一個(gè)甲硫氨酸密碼子開始的翻譯，在HIVA開放讀碼框架(ORF)前引入12個(gè)核苷酸長(zhǎng)的Kozak共有序列(Kozak 1987 Nucl.Acids res.15，8125-8148)。其次，通過(guò)用高度表達(dá)的人類基因中常用的密碼子替代大多數(shù)HIV-1來(lái)源的密碼子而優(yōu)化產(chǎn)生的mRNA的翻譯(Andre等，1998，前面已經(jīng)引用)。HIVA ORF是1608個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)的雙鏈DNA HindIII-XbaI片段中的一部分。(圖2A表示含有HIVA ORF的HindIII-XbaI插入序列的核苷酸序列；Seq.ID No.27)。在圖2A中，包括了用于裝配部分PCR產(chǎn)物的核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(核苷酸1-6＝HindIII；319-324＝BamHI；712-717＝KpnI；1135-1140＝EcoRI；和1603-1608＝XbaI)。
質(zhì)粒DNA是用標(biāo)準(zhǔn)方案(Sambrook等，″Molecular Cloning.ALaboratory Manual″2nd Edition；Cold Spring Harbor)制備和處理的。在體外將HIVA基因構(gòu)建為四部分(如圖2B所示)。每一部分通過(guò)70-90個(gè)堿基長(zhǎng)的重疊正鏈和負(fù)鏈寡脫氧核苷酸的裝配而制備。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明用EconoPureTM試劑盒(Perkin Elmer)純化合成的寡脫氧核苷酸，退火并連接，然后進(jìn)行PCR裝配。在每個(gè)步驟后凝膠純化PCR產(chǎn)物，直到獲得具有期望的、唯一的末端限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的片段?？寺〔y(cè)序這四個(gè)產(chǎn)物，將其連接在一起而產(chǎn)生完整的HIVA基因。然后將HIVA基因插入下面所述的pTHr構(gòu)建體和MVA疫苗載體。
PTHr載體。設(shè)計(jì)了一種用于直接基因轉(zhuǎn)移的pTHr載體，其目的是盡量減小功能元件的數(shù)目，從而盡量減小需要給予的DNA量。
以前已經(jīng)描述過(guò)pTH的構(gòu)建(Hanke等，1998 Vaccine16，426-435)。它包含人巨細(xì)胞病毒(hCMV)AD169株基因組的有效的表達(dá)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子/內(nèi)含子盒(Whittle等，1987 Protein Eng.1，499-505；Bebbington 1991 Methods 2，136-145)。啟動(dòng)子區(qū)后為pRc/CMV(Invitrogen)來(lái)源的多接頭和牛生長(zhǎng)激素基因的聚腺苷酸化信號(hào)。賦予被轉(zhuǎn)化細(xì)菌氨芐青霉素抗性的β內(nèi)酰胺酶基因和雙鏈DNA原核復(fù)制起點(diǎn)ColE1均來(lái)自質(zhì)粒pUC19。pTH不含哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)制起點(diǎn)。在將HIVA DNA插入pTH多接頭后，去除MluI和DraI位點(diǎn)間的β內(nèi)酰胺酶基因片段，產(chǎn)生的構(gòu)建體pTHr.HIVA(圖3)在細(xì)菌中利用Cobra制藥有限公司(Keele，UK)開發(fā)的阻抑物-滴定系統(tǒng)繁殖，該系統(tǒng)選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌，而不需要在質(zhì)粒上存在抗生素抗性基因(Williams等，1998 Nucl.Acids Res.26，2120-2124)。所以，DNA接種不將大量抗生素抗性基因拷貝引入人類。pTHr.HIVA的構(gòu)建如圖3所示(CMV e/p/i＝人CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子/內(nèi)含子A盒；BGHpA＝牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)；ColE1＝細(xì)菌中dsDNA復(fù)制起點(diǎn)；箭頭符號(hào)表示阻抑物結(jié)合序列)。
在補(bǔ)充了10％胎牛血清(FBS；Gibco)、2nM L-谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM；Gibco)中維持293T細(xì)胞和雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)。在濕化的孵育器中，5％CO2和37℃的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。利用DEAE-右旋糖苷一氯奎法(Hanke等，1998Vaccine 16，426-435)用pTHr.HIVA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，在6孔組織培養(yǎng)板中的蓋玻片上使2.5×105個(gè)293T細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)夜。第二天，用每孔5g DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48小時(shí)后，固定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，透化處理它們的細(xì)胞膜，用SV5-P-k mAb并隨后用抗鼠FITC結(jié)合的抗體檢測(cè)所表達(dá)的重組蛋白。
說(shuō)明該標(biāo)本的顯微照片見(jiàn)圖4。該圖表示三個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和一個(gè)作為本底的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(左上)。
通過(guò)給予表達(dá)HIVA免疫原的MVA載體而完成加強(qiáng)。MVA是用于臨床應(yīng)用的安全減毒痘苗病毒，幾乎失去其在人類細(xì)胞中復(fù)制的能力(Mayr等，1975 Infection 105，6-14)。已經(jīng)廣泛描述過(guò)MVA作為疫苗載體的用途以及使其成為在減毒痘病毒載體中成為一種引起人們興趣的選擇的特征(見(jiàn)如Sutter等，1994 Vaccine12，1032-1040；和Moss等，1996 Adv.Exp.Med.Biol.397，7-13)。
將HIVA基因連接到質(zhì)粒pSC11中，該質(zhì)粒將基因定位到親代MVA胸腺嘧啶激酶位點(diǎn)(Carroll和Moss1995 Biotechniques19，352-256)。在從特定不含病原體的禽類卵中獲得的初級(jí)CEF上培養(yǎng)大量重組MVA原種。在Beckman SW28轉(zhuǎn)子上以13,500rpm的轉(zhuǎn)速將經(jīng)過(guò)36％(W/V)的蔗糖緩沖液提取的胞漿提取物離心80分鐘以便純化MVA。利用共同插入的β半乳糖苷酶基因，在用適當(dāng)?shù)孜锓跤腥镜募?xì)胞單層后從藍(lán)斑的數(shù)目判斷病毒原種滴度。
疫苗效力測(cè)定。利用H-2Dd限制性表位的存在，在幾組Balb/c小鼠中檢測(cè)DNA和MVA載體的效力(Takahashi等，1993Int.Immunol.5，849-857)。對(duì)于pTHr.HIVA疫苗，小鼠可以用針頭肌內(nèi)注射100μgDNA或使用PowderJect疫苗公司(Madison，WI，USA)的皮膚XR基因遞送設(shè)備，將總共2μgDNA隔3周進(jìn)行兩次皮內(nèi)免疫。在最后一次免疫后10或21天處死小鼠。去除免疫小鼠的脾，用2ml注射器橡皮柱塞逐個(gè)按壓其通過(guò)細(xì)胞粗濾器(Falcon)。洗滌脾細(xì)胞并將其分成兩半，一半凍冷用于四聚物分析，另一半懸于5ml淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中(R10，20mM HEPES和15mMβ巰基乙醇)并通過(guò)在5％CO2，37℃下的濕化孵育器中用2μg/ml RGPGRAFVTI(Seq.ID No.2)肽孵育5天而進(jìn)行體外重新刺激。
在U型底加樣孔(96孔板；Costar)中2倍稀釋效應(yīng)細(xì)胞，起始效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例為100∶1。然后將沒(méi)有補(bǔ)充或補(bǔ)充10-6M肽的培養(yǎng)基中的5000個(gè)鉻標(biāo)記的P815靶細(xì)胞加入效應(yīng)細(xì)胞并在37℃下孵育5小時(shí)。計(jì)算孔中的自發(fā)和總鉻釋放，其中分別將靶細(xì)胞單獨(dú)或與5％的Triton X-100一起放置在培養(yǎng)基中。特異性裂解的百分比計(jì)算為[(樣品釋放-自發(fā)釋放)/(總釋放-自發(fā)釋放)]×100。自發(fā)釋放低于總c.p.m的5％。
典型測(cè)定的結(jié)果見(jiàn)圖5A-C，5A-C為特異性裂解百分比與效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比例關(guān)系的圖示。圖5A表示從用100μg pTHr.HIVA DNA免疫一次的小鼠中獲得的脾細(xì)胞的結(jié)果。圖5B表示從用pTHr.HIVA DNA皮內(nèi)免疫兩次的小鼠得到的結(jié)果。圖5C表示從用107pfu的MVA.HIVA肌內(nèi)免疫的小鼠得到的結(jié)果。在圖5A到5C中，每條線代表一個(gè)小鼠。肽脈沖激發(fā)靶細(xì)胞的裂解由涂黑的符號(hào)表示，未脈沖激發(fā)的靶細(xì)胞由空心符號(hào)表示。
兩種pTHr.HIVA載體遞送方式都是高免疫原性的，并且在所有被免疫動(dòng)物中誘導(dǎo)高細(xì)胞裂解活性(見(jiàn)圖5A和B)。同樣，單次肌內(nèi)注射107個(gè)MVA.HIVA的斑形成單位在所有疫苗中都引發(fā)強(qiáng)效肽特異性裂解活性，這是在培養(yǎng)物再刺激后測(cè)得的(圖5C)。實(shí)施例2制備編碼基于HIVA的多蛋白免疫原的其它核酸構(gòu)建體。這些其它的構(gòu)建體和由它們編碼的免疫原被稱作HIVTA和HIVAeT，如圖1A所示。圖中也表示了稱作PPA的構(gòu)建體/免疫原。相關(guān)的DNA/氨基酸序列分別如圖6A/B-8A/B所示，盡管圖7A僅表示HIVAeT中氨基酸序列的一部分(可歸于tat)，即HIVTA中序列的額外部分。(注意DNA序列的5’和3’端的HindIII和XbaI位點(diǎn)的序列沒(méi)有表示于圖6B，7B和8B)。該構(gòu)建體是通過(guò)與前面所描述的構(gòu)建HIVA的方法相似的方法制備的。
HIVTA和HIVAeT的設(shè)計(jì)原理與HIVA相同，但額外包括了HIV-1分化體A tat序列，該序列表達(dá)為與gag和多表位合成多肽融合的蛋白的一部分(在HIVTA中，tat序列在gag和合成多肽之間)，或存在于同樣的構(gòu)建體，但表達(dá)為分開的多肽(在HIVAeT中)，這是由于引入了內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。
每一種核酸分子都可以用于免疫受試者，其方法類似于上述與HIVA DNA相關(guān)的方法。同樣，這些分子可以被引入適當(dāng)?shù)妮d體，特別是MVA，如實(shí)施例1中所描述，并將得到的載體用于免疫受試者。
個(gè)體HIV分離體中遺傳多樣性的意義和它對(duì)于疫苗設(shè)計(jì)的啟示已經(jīng)有長(zhǎng)期的爭(zhēng)論。HIV-1分化體在歐洲占大多數(shù)，而在美國(guó)，占大多數(shù)并且研究最多的是分化體B。在中非和東非，占大多數(shù)的流行HIV-1株是分化體A，而分化體C在南非、印度和中國(guó)占大多數(shù)。一般說(shuō)來(lái)，相對(duì)于CTL，分化體特異性疫苗設(shè)計(jì)要求更細(xì)心考慮nAb的誘導(dǎo)。盡管在CTL表位中有一些重要的分化體間差異，許多表位在各種分化體中是保守的，這部分是由于結(jié)構(gòu)/功能限制。然而，為促進(jìn)效力研究的解釋，應(yīng)該試圖使疫苗與在試驗(yàn)人群中占大多數(shù)的地區(qū)流行株相匹配，其目的在于如果沒(méi)有達(dá)到交叉保護(hù)，可以使任何成功的方法適于其它分化體。
序列表<110>醫(yī)療研究局國(guó)際艾滋病疫苗行動(dòng)組織內(nèi)羅畢大學(xué)<120>對(duì)HIV免疫應(yīng)答的改進(jìn)或與其相關(guān)的改進(jìn)<130>MJL/C1248′1/M<140><141><160>33<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>11<212>PRT<213>猿免疫缺陷病毒<400>1Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu1 5 10<210>2<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>2Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile1 5 10<210>3<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>3Ala Leu Lys His Arg Ala Tyr Glu Leu1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>4Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>5Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile1 5<210>6<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>6Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys1 5 10<210>7<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>7Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys1 5 10<210>8<211>11<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>8Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu1 5 10<210>9<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>9Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>10Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>11Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>12Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu1 5<210>13<211>8<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>13Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu1 5<210>14<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>14Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys1 5 10<210>15<211>11<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>15Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr1 5 10<210>16<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>16Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys1 5 10<210>17<211>8<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>17Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr1 5<210>18<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>18Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys1 5<210>19<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>19Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys1 5<210>20<211>8<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>20Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu1 5<210>21<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>21Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val1 5<210>22<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>22Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr1 5 10<210>23<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>23His Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr1 5<210>24<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>24Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu1 5<210>25<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>25Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu1 5 10<210>26<211>527<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明嵌合多肽<400>26Met Pro Ile Val Gln Asn Ala Gln Gly Gln Met His Gln Ala Leu Ser1 5 10 15Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala Phe20 25 30Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr35 40 45Pro Gln Asp Leu Asn Met Met Leu Asn Ile Val Gly Gly His Gln Ala50 55 60Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp65 70 75 80Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Pro Pro Gly Gln Met85 90 95Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln100 105 110Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Asp115 120 125Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met130 135 140Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro145 150 155 160Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln165 170 175Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln180 185 190Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Ser Ile Leu Arg Ala Leu Gly Pro Gly195 200 205Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro210 215 220Gly His Lys Ala Arg Val Leu Gly Thr Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu225 230 235 240Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly245 250 255Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu260 265 270Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro Ser Leu Leu Glu Thr Ala Glu Gly275 280 285Cys Gln Gln Ile Met Glu Gln Leu Gln Ser Ala Leu Lys Thr Ser Glu290 295 300Glu Leu Lys Ser Leu Phe Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His305 310 315 320Gln Arg Ile Asp Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu325 330 335Glu Ile Gln Asn Lys Ser Lys Gln Lys Thr Gln Gln Ala Ala Ala Asp340 345 350Thr Gln Ser Ser Ser Lys Val Ser Gln Asn Tyr Ala Leu Lys His Arg355 360 365Ala Tyr Glu Leu Glu Phe Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys370 375 380Arg Trp Ile Ile Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu385 390 395 400Arg Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Thr Leu Trp Gln Arg405 410 415Pro Leu Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Thr Val Tyr420 425 430Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met435 440 445Thr Tyr Lys Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly450 455 460Leu Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr His Pro Asp Ile Val465 470 475 480Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr485 490 495Pro Leu Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Arg Gly Pro500 505 510Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp515 520 525<210>27<211>1608<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明嵌合多肽<400>27aagcttcccg ccgccaccat gcccatcgtg cagaacgccc agggccagat gcaccaggcc 60ctgtcccccc gcaccctgaa cgcctgggtg aaggtgatcg aggagaaggc cttctccccc 120gaggtgatcc ccatgttctc cgccctgtcc gagggcgcca ccccccagga cctgaacatg 180atgctgaaca tcgtgggcgg ccaccaggcc gccatgcaga tgctgaagga caccatcaac 240gaggaggccg ccgagtggga ccgcctgcac cccgtgcacg ccggccccat cccccccggc 300cagatgcgcg agccccgcgg atccgacatc gccggcacca cctccaccct gcaggagcag 360atcggctgga tgacctccaa cccccccatc cccgtgggcg acatctacaa gcgctggatc 420atcctgggcc tgaacaagat cgtacgcatg tactcccccg tgtccatcct ggacatccgc 480cagggcccca aggagccctt ccgcgactac gtggaccgct tcttcaagac cctgcgcgcc 540gagcaggcca cccaggaggt gaagaactgg atgaccgaga ccctgctggt gcagaacgcc 600aaccccgact gcaagtccat cctgcgcgcc ctgggccccg gcgccaccct ggaggagatg 660atgaccgcct gccagggcgt gggcggcccc ggccacaagg cccgcgtgct gggtaccggc 720gcccgcgcct ccgtgctgtc cggcggcaag ctggacgcct gggagaagat ccgcctgcgc 780cccggcggca agaagaagta ccgcctgaag cacctggtgt gggcctcccg cgagctggag 840cgcttcgccc tgaacccctc cctgctggag accgccgagg gctgccagca gatcatggag 900cagctgcagt ccgccctgaa gacctccgag gagctgaagt ccctgttcaa caccgtggcc 960accctgtact gcgtgcacca gcgcatcgac gtgaaggaca ccaaggaggc cctggacaag 1020atcgaggaga tccagaacaa gtccaagcag aagacccagc aggccgccgc cgacacccag 1080tcctcctcca aggtgtccca gaactacgcc ctgaagcacc gcgcctacga gctggaattc 1140cctccaattc ctgtcgggga gatttataaa cggtggatca tttttaggga ttatgtcgat 1200aggttttata aaacgctcag ggccatcttc cagtcctcca tgaccaagat caccctgtgg 1260cagcgccccc tggtggagcg ctacctgaag gaccagcagc tgctgaccgt gtactacggc 1320gtgcccgtgt ggaagcgccc ccaggtgccc ctgcgcccca tgacctacaa ggccgtggac 1380ctgtcccact tcctgaagga gaagggcggc ctgatcctga aggagcccgt gcacggcgtg 1440taccaccccg acatcgtgat ctaccagtac atggacgacc tgacccccgg ccccggcgtg 1500cgctaccccc tggcctgcac cccctacgac atcaaccaga tgctgcgcgg ccccggccgc 1560gccttcgtga ccatccccaa ccccctgctg ggcctggact gatctaga 1608<210>28<211>633<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明嵌合多肽<400>28Met Pro Ile Val Gln Asn Ala Gln Gly Gln Met His Gln Ala Leu Ser1 5 10 15Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala Phe20 25 30Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr35 40 45Pro Gln Asp Leu Asn Met Met Leu Asn Ile Val Gly Gly His Gln Ala50 55 60Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp65 70 75 80Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Pro Pro Gly Gln Met85 90 95Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln100 105 110Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Asp115 120 125Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met130 135 140Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro145 150 155 160Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln165 170 175Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln180 185 190Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Ser Ile Leu Arg Ala Leu Gly Pro Gly195 200 205Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro210 215 220Gly His Lys Ala Arg Val Leu Gly Thr Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu225 230 235 240Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly245 250 255Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu260 265 270Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro Ser Leu Leu Glu Thr Ala Glu Gly275 280 285Cys Gln Gln Ile Met Glu Gln Leu Gln Ser Ala Leu Lys Thr Ser Glu290 295 300Glu Leu Lys Ser Leu Phe Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His305 310 315 320Gln Arg Ile Asp Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu325 330 335Glu Ile Gln Asn Lys Ser Lys Gln Lys Thr Gln Gln Ala Ala Ala Asp340 345 350Thr Gln Ser Ser Ser Lys Val Ser Gln Asn Tyr Ala Leu Lys His Arg355 360 365Ala Tyr Glu Leu Glu Phe Met Ala Thr Thr Met Asp Pro Val Asp Pro370 375 380Asn Leu Glu Pro Trp Asn His Pro Gly Ser Gln Pro Thr Thr Pro Gly385 390 395 400Ser Lys Cys Tyr Cys Lys Val Cys Cys Tyr His Cys Pro Val Cys Phe405 410 415Leu Asn Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln420 425 430Arg Arg Gly Thr Pro Gln Ser Asn Lys Asp His Gln Asn Pro Ile Pro435 440 445Lys Gln Pro Ile Pro Gln Thr Gln Gly Ile Ser Thr Gly Pro Lys Glu450 455 460Ser Lys Lys Lys Val Glu Ser Lys Thr Glu Thr Asp Pro Glu Glu Phe465 470 475 480Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Phe Arg485 490 495Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Ile Phe Gln Ser500 505 510Ser Met Thr Lys Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Glu Arg Tyr515 520 525Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp530 535 540Lys Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Ala Val Asp545 550 555 560Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Ile Leu Lys Glu Pro565 570 575Val His Gly Val Tyr His Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp580 585 590Asp Leu Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Ala Cys Thr Pro595 600 605Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr610 615 620Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp625 630<210>29<211>1914<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明嵌合多肽<400>29cccgccgcca ccatgcccat cgtgcagaac gcccagggcc agatgcacca ggccctgtcc 60ccccgcaccc tgaacgcctg ggtgaaggtg atcgaggaga aggccttctc ccccgaggtg 120atccccatgt tctccgccct gtccgagggc gccacccccc aggacctgaa catgatgctg 180aacatcgtgg gcggccacca ggccgccatg cagatgctga aggacaccat caacgaggag 240gccgccgagt gggaccgcct gcaccccgtg cacgccggcc ccatcccccc cggccagatg 300cgcgagcccc gcggatccga catcgccggc accacctcca ccctgcagga gcagatcggc 360tggatgacct ccaacccccc catccccgtg ggcgacatct acaagcgctg gatcatcctg 420ggcctgaaca agatcgtgcg catgtactcc cccgtgtcca tcctggacat ccgccagggc 480cccaaggagc ccttccgcga ctacgtggac cgcttcttca agaccctgcg cgccgagcag 540gccacccagg aggtgaagaa ctggatgacc gagaccctgc tggtgcagaa cgccaacccc 600gactgcaagt ccatcctgcg cgccctgggc cccggcgcca ccctggagga gatgatgacc 660gcctgccagg gcgtgggcgg ccccggccac aaggcccgcg tgctgggtac cggcgcccgc 720gcctccgtgc tgtccggcgg caagctggac gcctgggaga agatccgcct gcgccccggc 780ggcaagaaga agtaccgcct gaagcacctg gtgtgggcct cccgcgagct ggagcgcttc 840gccctgaacc cctccctgct ggagaccgcc gagggctgcc agcagatcat ggagcagctg 900cagtccgccc tgaagacctc cgaggagctg aagtccctgt tcaacaccgt ggccaccctg 960tactgcgtgc accagcgcat cgacgtgaag gacaccaagg aggccctgga caagatcgag 1020gagatccaga acaagtccaa gcagaagacc cagcaggccg ccgccgacac ccagtcctcc 1080tccaaggtgt cccagaacta cgccctgaag caccgcgcct acgagctgga attcatggcc 1140acaaccatgg accccgtgga ccccaacctg gagccctgga accaccccgg ctcccagccc 1200accacccccg gctccaagtg ctactgcaag gtgtgctgct accactgccc cgtgtgcttc 1260ctgaacaagg gcctgggcat ctcctacggc cgcaagaagc gccgccagcg ccgcggcacc 1320ccccagtcca acaaggacca ccagaacccc atccccaagc agcccatccc ccagacccag 1380ggcatctcca ccggtcccaa ggagtccaag aagaaggtgg agtccaagac cgagaccgac 1440cccgaggaat tccctccaat tcctgtcggg gagatttata aacggtggat catttttagg 1500gattatgtcg ataggtttta taaaacgctc agggccatct tccagtcctc catgaccaag 1560atcaccctgt ggcagcgccc cctggtggag cgctacctga aggaccagca gctgctgacc 1620gtgtactacg gcgtgcccgt gtggaagcgc ccccaggtgc ccctgcgccc catgacctac 1680aaggccgtgg acctgtccca cttcctgaag gagaagggcg gcctgatcct gaaggagccc 1740gtgcacggcg tgtaccaccc cgacatcgtg atctaccagt acatggacga cctgaccccc 1800ggccccggcg tgcgctaccc cctggcctgc accccctacg acatcaacca gatgctgcgc 1860ggccccggcc gcgccttcgt gaccatcccc aaccccctgc tgggcctgga ctga 1914<210>30<211>104<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明嵌合多肽<400>30Met Ala Thr Thr Met Asp Pro Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Asn1 5 10 15His Pro Gly Ser Gln Pro Thr Thr Pro Gly Ser Lys Cys Tyr Cys Lys20 25 30Val Cys Cys Tyr His Cys Pro Val Cys Phe Leu Asn Lys Gly Leu Gly35 40 45Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Gly Thr Pro Gln50 55 60Ser Asn Lys Asp His Gln Asn Pro Ile Pro Lys Gln Pro Ile Pro Gln65 70 75 80Thr Gln Gly Ile Ser Thr Gly Pro Lys Glu Ser Lys Lys Lys Val Glu85 90 95Ser Lys Thr Glu Thr Asp Pro Glu100<210>31<211>2493<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明嵌合多肽<400>31cccgccgcca ccatgcccat cgtgcagaac gcccagggcc agatgcacca ggccctgtcc 60ccccgcaccc tgaacgcctg ggtgaaggtg atcgaggaga aggccttctc ccccgaggtg 120atccccatgt tctccgccct gtccgagggc gccacccccc aggacctgaa catgatgctg 180aacatcgtgg gcggccacca ggccgccatg cagatgctga aggacaccat caacgaggag 240gccgccgagt gggaccgcct gcaccccgtg cacgccggcc ccatcccccc cggccagatg 300cgcgagcccc gcggatccga catcgccggc accacctcca ccctgcagga 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tcagggccat cttccagtcc tccatgacca agatcaccct gtggcagcgc 1260cccctggtgg agcgctacct gaaggaccag cagctgctga ccgtgtacta cggcgtgccc 1320gtgtggaagc gcccccaggt gcccctgcgc cccatgacct acaaggccgt ggacctgtcc 1380cacttcctga aggagaaggg cggcctgatc ctgaaggagc ccgtgcacgg cgtgtaccac 1440cccgacatcg tgatctacca gtacatggac gacctgaccc ccggccccgg cgtgcgctac 1500cccctggcct gcacccccta cgacatcaac cagatgctgc gcggccccgg ccgcgccttc 1560gtgaccatcc ccaaccccct gctgggcctg gactgagcgg ccgcccctct ccctcccccc 1620cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt 1680tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct 1740tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga 1800atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga 1860ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac 1920gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag 1980ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc 2040agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg 2100tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt 2160gaaaaacacg atgataatat ggccacaacc atggaccccg tggaccccaa cctggagccc 2220tggaaccacc ccggctccca gcccaccacc cccggctcca agtgctactg caaggtgtgc 2280tgctaccact gccccgtgtg cttcctgaac aagggcctgg gcatctccta cggccgcaag 2340aagcgccgcc agcgccgcgg caccccccag tccaacaagg accaccagaa ccccatcccc 2400aagcagccca tcccccagac ccagggcatc tccaccggcc ccaaggagtc caagaagaag 2460gtggagtcca agaccgagac cgaccccgag taa 2493<210>32<211>1445<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明嵌合多肽<400>32Met Pro Ile Val Gln Asn Ala Gln Gly Gln Met His Gln Ala Leu Ser1 5 10 15Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala Phe20 25 30Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr35 40 45Pro Gln Asp Leu Asn Met Met Leu Asn Ile Val Gly Gly His Gln Ala50 55 60Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp65 70 75 80Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Pro Pro Gly Gln Met85 90 95Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln100 105 110Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Asp115 120 125Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met130 135 140Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro145 150 155 160Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln165 170 175Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln180 185 190Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Ser Ile Leu Arg Ala Leu Gly Pro Gly195 200 205Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro210 215 220Gly His Lys Ala Arg Val Leu Gly Thr Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu225 230 235 240Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly245 250 255Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu260 265 270Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro Ser Leu Leu Glu Thr Ala Glu Gly275 280 285Cys Gln Gln Ile Met Glu Gln Leu Gln Ser Ala Leu Lys Thr Ser Glu290 295 300Glu Leu Lys Ser Leu Phe 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catcttccag tcctccatga ccaagatcct ggagcccttc 3960cgctccaaga accccgacat cgtgatctac cagtacatgg acgacctgta cgtgggctcc 4020gacctggaga tcggccagca ccgcaccaag atcgaggagc tgcgcgccca cctgctgtcc 4080tggggcttca tcacccccga caagaagcac cagaaggagc cccccttcct gtggatgggc 4140tacgagctgc accccgacaa gtggaccgtg cagcccatcg agctgcccga gaaggactcc 4200tggaccgtga acgacatcca gaagctggtg ggcaagctga actgggcctc ccaaatctac 4260gcctgcaccc cctacgacat caaccagatg ctgcgcggcc ccggccgcgc cttcgtgacc 4320atccccaacc ccctgctggg cctggactag 4350
權(quán)利要求
1.一種適于給予人類受試者的無(wú)病原體形式的免疫原，該免疫原包含至少一部分HIV的gag蛋白，所述gag蛋白來(lái)源于一種HIV分化體或與一種或更多HIV分化體具有共有序列，并至少包含部分p17和p24；以及包含多個(gè)氨基酸序列的合成多肽，每個(gè)序列包含一種HIV蛋白的人CTL表位，并且其中許多HIV蛋白表現(xiàn)為合成多肽形式，所述CTL表位的選擇是為了刺激對(duì)一種或更多感興趣的HIV分化體的免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的免疫原，其中所述至少一部分gag蛋白和合成多肽作為融合蛋白存在。
3.權(quán)利要求1或2的免疫原，其中g(shù)ag蛋白55-95％的氨基酸序列存在于gag的所述部分。
4.權(quán)利要求1、2或3的任意一項(xiàng)的免疫原，其中g(shù)ag蛋白65-85％的氨基酸序列存在于gag的所述部分。
5.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，其中修飾了所述至少部分p17以防止N端豆蔻酰化。
6.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，其中至少一些存在于合成多肽中的人CTL表位是重疊的。
7.權(quán)利要求6的免疫原，其中至少50％存在于合成多肽中的人CTL表位是重疊的。
8.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，其中至少一些存在于合成多肽中的人CTL表位是鄰接的。
9.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，其中至少一些人CTL表位是由非表位氨基酸序列分開的。
10.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，包含至少一個(gè)由一種或更多實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)哺乳動(dòng)物識(shí)別的表位。
11.權(quán)利要求10的免疫原，其中所述由一種或更多實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)哺乳動(dòng)物識(shí)別的表位是CTL表位。
12.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，其中合成多肽包含至少10個(gè)表1所指出的人CTL表位。
13.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，其中合成多肽包含至少15個(gè)表1所指出的人CTL表位。
14.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，其中合成多肽包含至少20個(gè)表1所指出的人CTL表位。
15.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，其中合成多肽包含所有23個(gè)表1所指出的人CTL表位。
16.一種用于人類受試者的HIV免疫原，該免疫原包含至少一部分gag蛋白，所述gag蛋白來(lái)源于一種感興趣的HIV分化體或與一種感興趣的HIV分化體具有共有序列，其中所述部分至少包含部分p17和p24，并且經(jīng)修飾而防止N端豆蔻?；?；以及包含來(lái)自于多種不同HIV蛋白的多個(gè)人CTL表位的合成多肽，每個(gè)CTL表位具有8-12個(gè)氨基酸，所述CTL表位的選擇是為了刺激對(duì)感興趣的分化體的免疫應(yīng)答。
17.一種用于人類受試者的HIV免疫原，該免疫原包含至少一部分gag蛋白，所述gag蛋白來(lái)源于一種感興趣的HIV分化體或與一種感興趣的HIV分化體具有共有序列，其中所述部分至少包含部分p17和p24，并且經(jīng)修飾而防止N端豆蔻?；灰约鞍瑏?lái)自于多種不同HIV蛋白的多個(gè)人CTL表位的合成多肽，每個(gè)CTL表位具有8-12個(gè)氨基酸，所述CTL表位的選擇是為了刺激對(duì)所述感興趣的分化體的免疫應(yīng)答；并且所述合成多肽可選擇具有至少一個(gè)由實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物識(shí)別的免疫原性表位。
18.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，包含圖1B所示的氨基酸序列。
19.權(quán)利要求18的免疫原，基本由圖1B所示的氨基酸序列組成。
20.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，其中所述感興趣的分化體選自HIV分化體A，B，C，D，E，F(xiàn)，G和H。
21.權(quán)利要求20的免疫原，其中所述感興趣的分化體為HIV分化體A。
22.權(quán)利要求20的免疫原，其中所述感興趣的分化體為HIV分化體B。
23.權(quán)利要求20的免疫原，其中所述感興趣的分化體為HIV分化體C。
24.前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原，其中所述人CTL表位包括至少一種來(lái)自于HIV蛋白nef，p24，p17，pol，gp41和gp120的每一種的表位。
25.權(quán)利要求24的免疫原，其中所述人CTL表位包括至少一種來(lái)自于HIV蛋白nef，p24，p17，pol，gp41，gp120，tat和rev的每一種的表位。
26.權(quán)利要求24的免疫原，其中所述人CTL表位包括至少一種來(lái)自于HIV蛋白nef，p24，p17，pol，gp41，gp120，tat，rev，vpr，vpu和vif的每一種的表位。
27.編碼前面任意一項(xiàng)權(quán)利要求的免疫原的核酸分子。
28.權(quán)利要求27的核酸分子，其中將免疫原編碼為融合蛋白。
29.權(quán)利要求27或28的核酸分子，包含圖2A所示核苷酸序列。
30.包含權(quán)利要求27、28或29的任意一項(xiàng)的核酸分子的載體。
31.權(quán)利要求30的一種特殊載體，進(jìn)一步包含權(quán)利要求1-26的任意一項(xiàng)的免疫原。
32.一種刺激人類受試者中抗HIV免疫應(yīng)答的方法，該方法包括以下步驟制備權(quán)利要求1-26的任意一項(xiàng)的免疫原和/或權(quán)利要求27-29的任意一項(xiàng)的核酸分子；并將該免疫原和/或該核酸分子給予受試者。
33.權(quán)利要求32的方法，其中通過(guò)一次或多次給予該核酸分子激發(fā)受試者；并隨后通過(guò)一次或多次給予免疫原而加強(qiáng)。
34.權(quán)利要求1-26的任意一項(xiàng)的免疫原和/或權(quán)利要求27-29的任意一項(xiàng)的核酸分子在制備預(yù)防或治療人類受試者中HIV感染的藥物中的用途。
35.一種刺激人類受試者中抗HIV免疫應(yīng)答的方法，包括一次或多次以足夠激發(fā)對(duì)所述免疫原的免疫應(yīng)答的含量給予所述受試者編碼權(quán)利要求1-26的任意一項(xiàng)的免疫原的核酸分子，并一次或多次以足夠加強(qiáng)對(duì)所述免疫原常見(jiàn)部分的免疫應(yīng)答的含量給予所述受試者編碼和/或含有權(quán)利要求1-26的任意一項(xiàng)的免疫原的修飾痘苗病毒Ankara(MYA)顆粒。
36.一種細(xì)菌，含有權(quán)利要求1-26的任意一項(xiàng)的免疫原，或含有權(quán)利要求27-29的任意一項(xiàng)的核酸分子。
37.權(quán)利要求36的細(xì)菌，該細(xì)菌為減毒病原體，適于給予人類受試者。
38.一種編碼包含圖8A所示氨基酸序列的多肽的核酸分子。
39.一種編碼基本由圖8A所示氨基酸序列組成的多肽的核酸分子。
40.權(quán)利要求38或39的核酸分子，包含圖8B所示核苷酸序列。
41.一種包含圖8A所示氨基酸序列的多肽。
42.一種基本由圖8A所示氨基酸序列組成的多肽。
43.一種特殊的載體，包含權(quán)利要求38或39的核酸序列和/或權(quán)利要求41或42的多肽。
44.一種刺激人類受試者中抗HIV免疫應(yīng)答的方法，該方法包括以下步驟制備權(quán)利要求38或39的核酸分子和/或權(quán)利要求41或42的多肽，并將該核酸分子和/或該多肽給予受試者。
45.權(quán)利要求38或39的核酸分子和/或權(quán)利要求41或42的多肽在制備預(yù)防或治療人類受試者中HIV感染的藥物中的用途。
46.一種基本如此前所描述并參考附圖的免疫原。
47.一種基本如此前所描述并參考附圖的刺激人類受試者中抗HIV免疫應(yīng)答的方法。
全文摘要
公開了一種無(wú)病原體形式的適于給予人類受試者的免疫原，該免疫原包含至少一部分HIV的gag蛋白，所述gag蛋白來(lái)源于一種HIV分化體或與一種或多種HIV分化體具有共有序列，并至少包含部分p17和p24；以及包含多個(gè)氨基酸序列的合成多肽，每個(gè)序列包含一種HIV蛋白的人CTL表位，并且其中許多HIV蛋白表現(xiàn)為合成多肽形式，所述CTL表位的選擇是為了刺激對(duì)一種或更多感興趣的HIV分化體的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1434831SQ0081767
公開日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2000年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月23日
發(fā)明者T·翰克, A·J·麥克邁克爾 申請(qǐng)人:醫(yī)療研究局, 國(guó)際艾滋病疫苗行動(dòng)組織, 內(nèi)羅畢大學(xué)