專利名稱：包含trp基因破壞的轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、與基因功能鑒定相關(guān)的組合物和方法。
背景技術(shù)：
在人類基因組中已經(jīng)鑒定出許多多態(tài)三核苷酸重復(fù)。這些突變由可遺傳的不穩(wěn)定DNA產(chǎn)生，被稱為“動(dòng)態(tài)突變”，因?yàn)樵谑来g遺傳的重復(fù)單位的數(shù)目是變化的(Koshy等，Brain Pathol，7927-42(1997))。雖然這些重復(fù)是高度多態(tài)性的，但其數(shù)量在正常個(gè)體中通常不超過(guò)40個(gè)重復(fù)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM(TM).Johns Hopkins University，Baltimore，MD.MIM Number603279jlewis7/14/1999；World Wide Web URLhttp//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim；Koshy等(1997))。
相比之下，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)異常擴(kuò)增的三核苷酸重復(fù)引起疾病(OMIM603279)。致病的擴(kuò)增通常含有超過(guò)40個(gè)三核苷酸重復(fù)，已經(jīng)報(bào)道了200個(gè)或更多重復(fù)的序列段(OMIM 603279；Slegtenhorst-Eegdeman等，Endocrinology，139156-62(1998))。已經(jīng)鑒定出四種類型的三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增(1)兩種脆性X染色體綜合征(FRAXA和FRAXE)中的長(zhǎng)胞嘧啶-鳥嘌呤-鳥嘌呤(CGG)重復(fù)，(2)肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良中的長(zhǎng)胞嘧啶-胸腺嘧啶-鳥嘌呤(CTG)重復(fù)擴(kuò)增，(3)Friedreich共濟(jì)失調(diào)中的長(zhǎng)鳥嘌呤-腺嘌呤-腺嘌呤重復(fù)擴(kuò)增，和(4)涉及神經(jīng)變性性疾病的短胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤重復(fù)擴(kuò)增(CAG)。(Koshy等(1997))。
分類為1型和2型疾病的至少12種疾病由三核苷酸擴(kuò)增突變所致，大多數(shù)具有神經(jīng)精神特征(Margolis等，Hum Genet.，100114-122(1997))。1型疾病由可讀框中的(CAG)n擴(kuò)增引起，產(chǎn)生擴(kuò)增的谷氨酰胺重復(fù)。1型疾病包括1型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(SCAl，Orr等，NatGenet，4221-6(1993))、SCA2(Imbert等，Nat Genet，14285-91(1996)；Pulst等，Nat Genet，14269-76(1996)；Sanpei等，Nat Genet，14277-84(1996))、Machado-Joseph病(MJD或SCA3，Kawaguchi等，Nat Genet，8221-8(1994))、SCA6(Zhuchenko等，Nat Genet，1562-9(1997))、dentatutorubral pallidoluysioan atrophy(DRPLA，Koide等，Nat Genet，69-13(1994))、亨廷頓舞蹈病(HD，Huntington’s Disease CollaborativeResearch Group，Cell，72971-83(1993))和脊髓延髓性肌萎縮(SBMA，LaSpada，Nature，35277-9(1991))。2型疾病可以由5’非翻譯區(qū)中的擴(kuò)增(Jacobsen綜合征，Jones等，Nature，376145-9(1995)；脆性X染色體綜合征，F(xiàn)u等，Science，1992 2551256-8(1992))、3’非翻譯區(qū)中的擴(kuò)增(肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良，Brook等，Cell，68799-808(1992)；Philips等，Science，280737-41(1998))和內(nèi)含子區(qū)中的擴(kuò)增(Fredreich共濟(jì)失調(diào)，Campuzano等，Science，2711423-7(1996))引起。然而，對(duì)于擴(kuò)增事件的機(jī)理和發(fā)生時(shí)間知之甚少(Bates等，Hum Mol Genet.，61633-7(1997))。
由三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增引起的疾病表現(xiàn)出稱為早現(xiàn)遺傳的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象不能用傳統(tǒng)的孟德爾遺傳學(xué)來(lái)解釋(Koshy等(1997))。早現(xiàn)遺傳的定義是在連續(xù)世代中疾病的嚴(yán)重程度增加并且癥狀出現(xiàn)的年齡更早。早現(xiàn)遺傳通常受遺傳親代性別的影響，對(duì)于大多數(shù)CAG重復(fù)性疾病而言，當(dāng)為母性遺傳時(shí)這種疾病更為嚴(yán)重。該病的嚴(yán)重程度和發(fā)病年齡與重復(fù)序列的大小有關(guān)(Koshy等(1997))。較大的擴(kuò)增導(dǎo)致更早發(fā)病和臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重。早現(xiàn)遺傳的現(xiàn)象已經(jīng)使人們懷疑，所述擴(kuò)增重復(fù)的不穩(wěn)定性是特定疾病的基礎(chǔ)(OMIM 603279)。
帶有擴(kuò)增的三核苷酸重復(fù)序列段的蛋白質(zhì)是不相關(guān)的，并且廣泛表達(dá)，而且表達(dá)模式廣泛重疊(Bates等(1997))。大多數(shù)蛋白是新的，但雄激素受體和電壓門控αlA鈣通道例外，它們?cè)诩顾柩铀栊约∥s和6型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)中有突變。有趣的是，CAG重復(fù)蛋白在周圍神經(jīng)組織和中樞神經(jīng)組織中均廣泛表達(dá)，但在每種神經(jīng)病中，僅一個(gè)選定的神經(jīng)細(xì)胞群體由于所述擴(kuò)增的重復(fù)而成為變性的靶(Koshy等(1997))。
尚不了解擴(kuò)增導(dǎo)致神經(jīng)元機(jī)能障礙和細(xì)胞死亡的機(jī)理(Bates等(1997))。目前的看法是，重復(fù)序列段的存在使所涉及的基因、信使或蛋白質(zhì)獲得功能。例如，已假定肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良基因(MD)轉(zhuǎn)錄物的擴(kuò)增CUG重復(fù)區(qū)與CUG結(jié)合蛋白的不當(dāng)相互作用逐漸演變出(titrate-out)通常構(gòu)成(comprise)不均一核內(nèi)核糖核蛋白顆粒的蛋白質(zhì)(Bhagwati等，Biochim Biophys Acta，1317155-7(1996)；Philips等(1998))。也已經(jīng)提出，產(chǎn)生新型蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或異常的蛋白質(zhì)折疊以及側(cè)翼基因表達(dá)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變是三核苷酸擴(kuò)增可能致病的機(jī)理(Thomton等，Nat.Genet.，16407-9(1997))。
三核苷酸重復(fù)性疾病的小鼠模型對(duì)于揭示這些疾病的分子基礎(chǔ)和開發(fā)治療干涉而言有很大潛力和前景。轉(zhuǎn)基因小鼠再現(xiàn)了人類疾病的許多特征，因而是研究體內(nèi)疾病發(fā)展的優(yōu)良模型系統(tǒng)。應(yīng)用這種小鼠，將有可能在所述小鼠中對(duì)致病機(jī)理和三核苷酸重復(fù)的不穩(wěn)定性進(jìn)行建模(Bates等(1997))。
發(fā)明概要本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以及與基因功能鑒定相關(guān)的組合物和方法，更具體地講，本發(fā)明涉及編碼三核苷酸重復(fù)蛋白(TRP)的基因，例如基因T243。
本發(fā)明提供在編碼TRP的靶DNA序列中包含破壞的細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞，更優(yōu)選胚胎干(ES)細(xì)胞。最好是，所述靶DNA序列是T243。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞是鼠類ES細(xì)胞。按照一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)獲得與所述靶DNA序列同源的序列，并將所述序列插入打靶構(gòu)建體中，產(chǎn)生所述破壞。然后將打靶構(gòu)建體導(dǎo)入所述干細(xì)胞中，構(gòu)建在所述靶DNA序列中產(chǎn)生破壞的同源重組體。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用不依賴連接作用的克隆，將所述同源序列的兩種不同片段插入具有第二多核苷酸序列(最好是編碼正選擇標(biāo)記的基因)的載體中，使得所述第二多核苷酸序列定位于所述構(gòu)建體中的所述兩種不同的同源序列片段之間，構(gòu)建所述打靶構(gòu)建體。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，所述同源序列可以通過(guò)以下方法獲得產(chǎn)生與所述靶互補(bǔ)的兩種引物；使所述引物退火到小鼠基因組DNA文庫(kù)中含有所述靶區(qū)域的互補(bǔ)序列上；并且擴(kuò)增與所述靶區(qū)域同源的序列。然后分離出具有由所述引物形成的終點(diǎn)的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。最好是通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，更優(yōu)選通過(guò)長(zhǎng)距離PCR(long-range PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。在另一實(shí)施方案中，所述載體還包含編碼篩選標(biāo)記的基因。在再一實(shí)施方案中，所述載體也包括鄰接所述正選擇標(biāo)記的重組酶位點(diǎn)。
本發(fā)明還提供在編碼TRP的基因中帶有破壞的脊椎動(dòng)物，最好是小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種敲除小鼠，所述小鼠具有正常編碼并表達(dá)功能性TRP的基因的非功能性等位基因。本發(fā)明包括一種敲除小鼠，所述敲除小鼠具有兩個(gè)正常編碼并表達(dá)功能性TRP的基因的非功能性等位基因，因而不能產(chǎn)生野生型TRP。最好是，通過(guò)將包含本文所述任一種或者本領(lǐng)域可得到的編碼TRP的破壞的基因的干細(xì)胞，注射或者其它方法導(dǎo)入胚泡中，產(chǎn)生所述小鼠。然后將所得的胚泡注射到假孕小鼠體內(nèi)，隨后讓其分娩出在其種系中帶有編碼所述TRP的受破壞基因的嵌合小鼠。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以繁育所述嵌合小鼠，以產(chǎn)生在編碼所述TRP的基因中帶有雜合破壞和帶有純合破壞的兩種小鼠。
按照一個(gè)實(shí)施方案，所述破壞改變了TRP基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或剪接位點(diǎn)中的至少一個(gè)，致使所述小鼠不表達(dá)功能性TRP蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述破壞是插入突變、錯(cuò)義突變、移碼突變或缺失突變。然后可以觀察這類敲除小鼠的表型。
本發(fā)明的一個(gè)方面是表型包括相對(duì)于普通正常野生型成年小鼠體重降低的敲除小鼠。通常，敲除小鼠的體重降低至少約15％。另一方面是表型包括相對(duì)于普通正常野生型成年小鼠身長(zhǎng)降低的敲除小鼠。通常，身長(zhǎng)至少降低約10％。本發(fā)明的再一方面是表型包括相對(duì)于正常野生型成年小鼠體重與身長(zhǎng)之比降低的敲除小鼠。一般而言，觀察到至少約20％的降低。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，敲除小鼠的表型包括軟骨病。通常存在異常軟骨，并且軟骨生成減少。
本發(fā)明的另一方面是表型包括骨病的小鼠。通常，所述骨病包括骨異常和骨生成減少。在一個(gè)實(shí)施方案中，敲除小鼠表型的特征是軟骨發(fā)育不良。
在本發(fā)明的再一實(shí)施方案中，敲除小鼠的表型包括腎病。通常觀察到腎畸形。在一個(gè)實(shí)施方案中，敲除小鼠的表型包括腎發(fā)育不良。
本發(fā)明也提供能夠影響敲除小鼠表型的因子的鑒定方法。按照該方法，將推定的因子給予敲除小鼠。然后測(cè)定敲除小鼠對(duì)所述推定因子的反應(yīng)，并將其與“正常”或野生型小鼠的反應(yīng)比較。本發(fā)明還提供按照這類方法鑒定的因子。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供其中編碼TRP的靶DNA序列已被破壞的敲除細(xì)胞。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述破壞抑制野生型TRP的產(chǎn)生?？梢詮那贸杉?xì)胞、組織或動(dòng)物得到細(xì)胞或細(xì)胞系。在又一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明也提供包含編碼TRP的核酸序列的細(xì)胞系。這類細(xì)胞系可以借助于與在所述細(xì)胞系中有功能的啟動(dòng)子有效連接，能夠表達(dá)這類序列。最好是，編碼所述TRP的序列的表達(dá)處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下。
本發(fā)明還提供新型的先前未鑒定過(guò)的編碼TRP的核酸序列。也提供鑒定與TRP相互作用的因子的方法，所述方法包括使所述TRP與一種因子接觸并且檢測(cè)因子/TRP復(fù)合物的步驟。
本發(fā)明也提供治療骨病的方法，所述方法包括將能夠影響敲除小鼠表型的因子給予合適的受治療者。合適的受治療者包括但不限于哺乳動(dòng)物，包括人類。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述骨病是軟骨發(fā)育不良。本發(fā)明也提供緩解骨病癥狀的方法，所述骨病癥狀例如骨縮短、生長(zhǎng)板異常和椎骨變小。在可以給予的因子中有T243蛋白、其片段以及T243的天然和合成類似物。
也提供用于治療軟骨病的方法，所述方法包括將能夠影響敲除小鼠表型的因子給予受治療者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述軟骨病是軟骨發(fā)育不良。也提供緩解軟骨病癥狀的方法，所述軟骨病癥狀包括軟骨島大、不規(guī)則、軟骨細(xì)胞柱(chondrocyte column)短以及軟骨薄而不規(guī)則。
治療腎病的方法也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。按照該方法，將有效量的因子例如T243蛋白、T243蛋白片段或T243的天然或合成類似物給予受治療者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腎病是腎發(fā)育不良。本發(fā)明也包括緩解與腎病相關(guān)的癥狀的方法，所述癥狀例如小的異常生成的腎。
本發(fā)明也提供確定TRP中三核苷酸重復(fù)的擴(kuò)增是否引起表型改變的方法。按照該方法，使其中正選擇標(biāo)記側(cè)翼為重組酶位點(diǎn)的敲除干細(xì)胞與一種合成核酸接觸。所述合成核酸包括側(cè)翼為重組酶靶位點(diǎn)的三核苷酸重復(fù)。在識(shí)別所述重組酶靶位點(diǎn)的重組酶存在下，在所述合成核酸中的重組酶位點(diǎn)與鄰接所述正選擇標(biāo)記的重組酶位點(diǎn)之間，通過(guò)酶輔助位點(diǎn)專一性發(fā)生重組，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞。然后可以將所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞的表型與正常的野生型干細(xì)胞比較，以確定三核苷酸擴(kuò)增是否產(chǎn)生表型改變。最好是，所述合成核酸包括至少約20個(gè)三核苷酸重復(fù)。所述酶輔助位點(diǎn)專一性可以例如是Cre重組酶-lox靶系統(tǒng)、或FLP重組酶-FRT靶系統(tǒng)。
本發(fā)明也提供編碼TRP的基因有三核苷酸擴(kuò)增的脊椎動(dòng)物、最好是小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠的產(chǎn)生是通過(guò)將含有擴(kuò)增型TRP基因的轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞導(dǎo)入胚泡中來(lái)進(jìn)行的。然后將所產(chǎn)生的胚泡植入假孕小鼠中，隨后讓其分娩出在其種系中含有所述擴(kuò)增型三核苷酸重復(fù)基因的嵌合小鼠。然后可以繁育所述嵌合小鼠，以產(chǎn)生在編碼所述TRP的基因中帶有或者雜合或者純合破壞的小鼠。
本發(fā)明還提供新的擴(kuò)增型TRP基因以及由這些基因編碼的蛋白質(zhì)。也提供一種鑒定與擴(kuò)增型TRP相互作用的因子的方法，所述方法包括以下步驟使所述擴(kuò)增型TRP與一種因子接觸，并且測(cè)定因子/擴(kuò)增型TRP復(fù)合物，從而鑒定與所述擴(kuò)增型TRP相互作用的因子。
本發(fā)明也提供細(xì)胞系，所述細(xì)胞系包含編碼擴(kuò)增型TRP的核酸序列，能夠通過(guò)與在所述細(xì)胞系中有功能的啟動(dòng)子有效連接而表達(dá)這類序列。最好是，編碼所述擴(kuò)增型TRP的序列的表達(dá)，處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下。
本文所用的“基因打靶”是當(dāng)將基因組DNA的片段導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中、所述片段定位并且與內(nèi)源同源序列重組時(shí)發(fā)生的一種類型的同源重組。
在基因組DNA的片段定位并與內(nèi)源同源序列重組，致使正常野生型基因產(chǎn)物的產(chǎn)生受到抑制時(shí)，發(fā)生靶基因的“破壞”。破壞的非限制性實(shí)例包括插入突變、錯(cuò)義突變、移碼突變和缺失突變?；虼虬幸部梢愿淖儼谢虻膯?dòng)子、增強(qiáng)子或剪接位點(diǎn)，而引起破壞，也可以包括啟動(dòng)子被外源啟動(dòng)子例如下述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子取代。
本文所用的“敲除小鼠”是在其基因組中含有已經(jīng)用基因打靶方法破壞或失活的特定基因的小鼠。敲除小鼠既包括雜合子小鼠(即一個(gè)缺陷型等位基因和一個(gè)野生型等位基因)，也包括純合突變體(即兩個(gè)缺陷型等位基因)。半合子小鼠也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。人們會(huì)理解，在正常的野生型動(dòng)物中，某些基因例如雄性中的性連鎖基因僅存在一個(gè)拷貝(即在正常野生型動(dòng)物中是半合子)。正常為半合子的基因被破壞的敲除小鼠，將具有一個(gè)該基因的缺陷型等位基因。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸分子”可互換使用，是指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可以含有脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物。核苷酸可以具有任何三維結(jié)構(gòu)，可以執(zhí)行任何已知或未知的功能。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括單鏈分子、雙鏈分子和三股螺旋分子。
“寡核苷酸”是指具有5個(gè)和約100個(gè)核苷酸之間的單鏈或雙鏈DNA的多核苷酸。寡核苷酸也稱為寡聚物或oligo，可以從基因中分離出，或用本領(lǐng)域已知的方法化學(xué)合成。“引物”是指通常為單鏈的寡核苷酸，它為酶介導(dǎo)的核酸合成的起始提供3’-羥基末端。
以下是多核苷酸的非限制性實(shí)施方案基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、質(zhì)粒、載體、具任何序列的分離的DNA、具任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。核酸分子也可以包括經(jīng)修飾的核酸分子，例如甲基化核酸分子和核酸分子類似物。嘌呤和嘧啶的類似物是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于氮丙啶基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、5-戊炔基尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。在脫氧核糖核酸中用尿嘧啶作為胸腺嘧啶的取代基，也被認(rèn)為是嘧啶的類似物形式。
多核苷酸的“片段”是由編碼序列或非編碼序列的至少9個(gè)連續(xù)核苷酸組成的多核苷酸，所述至少9個(gè)連續(xù)核苷酸包括10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)或14個(gè)連續(xù)核苷酸，優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，更優(yōu)選至少45個(gè)核苷酸，也包括至少60個(gè)核苷酸。
本文使用的“堿基對(duì)”也稱為“bp”，是指互補(bǔ)的核酸分子。在DNA中有四種“類型”的堿基嘌呤堿基腺嘌呤(A)與嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)形成氫鍵，而嘌呤堿基鳥嘌呤(G)與嘧啶堿基胞嘧啶(C)形成氫鍵。每個(gè)形成氫鍵的堿基對(duì)設(shè)置也被稱為Watson-Crick堿基對(duì)。一千個(gè)堿基對(duì)通常稱為一個(gè)千堿基對(duì)或kb?！皦A基對(duì)錯(cuò)配”是指核酸分子中堿基不是互補(bǔ)的Watson-Crick堿基對(duì)的位置。短語(yǔ)“在任何位置都不包括至少一種類型的堿基”是指在任何位置都不具有四種堿基中的一種的核苷酸序列。例如，缺乏一種核苷酸(即缺乏一種類型的堿基)的序列可以由A、G、T堿基對(duì)組成，而不含C殘基。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建體”是指待轉(zhuǎn)移到靶組織、細(xì)胞系或動(dòng)物(包括人類)中的人工裝配的DNA區(qū)段。通常，所述構(gòu)建體將包括特定的目的(interest)基因或序列、標(biāo)記基因和合適的控制序列。術(shù)語(yǔ)“質(zhì)粒”是指自主自我復(fù)制型染色體外DNA分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的質(zhì)粒構(gòu)建體含有一個(gè)位于目的基因兩個(gè)側(cè)翼區(qū)之間的正選擇標(biāo)記。可任選的是，所述構(gòu)建體也可以含有一種篩選標(biāo)記，例如綠色熒光蛋白(GFP)。如果存在的話，所述篩選標(biāo)記位于所述側(cè)翼區(qū)之外并與之距一定距離。
術(shù)語(yǔ)“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“PCR”是指用熱穩(wěn)定聚合酶(例如Taq聚合酶)和兩種寡核苷酸引物擴(kuò)增DNA堿基序列的方法；其中一種引物與待擴(kuò)增序列一個(gè)末端的(+)鏈互補(bǔ)，而另一種引物與另一末端的(-)鏈互補(bǔ)。因?yàn)樾潞铣傻腄NA鏈隨后可以用作相同引物序列的額外模板，所以連續(xù)多輪的引物退火、鏈延伸和解離，導(dǎo)致所需序列以指數(shù)高度特異性地?cái)U(kuò)增。PCR也可以用來(lái)檢測(cè)DNA樣品中特定序列的存在?！伴L(zhǎng)距離”是指允許擴(kuò)增大的核苷酸序列段(例如大于1kb)的PCR條件。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“正選擇標(biāo)記”是指這樣一種基因，所述基因編碼一種致使在某些條件下僅攜帶該基因的細(xì)胞存活和/生長(zhǎng)的產(chǎn)物。例如，表達(dá)所導(dǎo)入的新霉素抗性(Neor)基因的植物和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)化合物G418具有抗性。不帶有Neor基因標(biāo)記的細(xì)胞被G418殺死。其它正選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
“正-負(fù)選擇”是指選擇攜帶在特定打靶位置整合的DNA插入片段的細(xì)胞(正選擇)以及選擇除去攜帶在染色體的非打靶位點(diǎn)整合的DNA插入片段的細(xì)胞(負(fù)選擇)的過(guò)程。負(fù)選擇插入片段的非限制性實(shí)例包括編碼胸苷激酶(tk)的基因。適合于正-負(fù)選擇的基因是本領(lǐng)域已知的，參見例如美國(guó)專利5,464,764。
“篩選標(biāo)記”或“報(bào)道基因”是指所編碼的產(chǎn)物可容易地分析的基因。例如，報(bào)道基因可以用來(lái)確定特定DNA構(gòu)建體是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入細(xì)胞、器官或組織中。篩選標(biāo)記的非限制性實(shí)例包括編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因或者編碼經(jīng)修飾的熒光蛋白的基因?！柏?fù)篩選標(biāo)記”不應(yīng)被解釋為負(fù)選擇標(biāo)記；負(fù)選擇標(biāo)記通常殺死表達(dá)該標(biāo)記的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“載體”是指可以攜帶所插入DNA并且可以在宿主細(xì)胞中保持的DNA分子。載體也被稱為克隆載體(cloning vector)、克隆載體(cloning vehicle)或載體(vehicle)。該術(shù)語(yǔ)包括主要用來(lái)將核酸分子插入細(xì)胞的載體、主要用來(lái)復(fù)制核酸的復(fù)制型載體以及用來(lái)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯所述DNA或RNA的表達(dá)載體。也包括提供不止一種上述功能的載體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體含有可用于本文所述方法的位點(diǎn)，例如本文描述的載體“pDG2”或“pDG4”。
“宿主細(xì)胞”包括可以成為或已經(jīng)是載體受體或摻入核酸分子和/或蛋白的受體的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的子代，所述子代由于天然突變、意外突變或有意的突變，可能不一定與原始親代完全相同(在形態(tài)學(xué)方面或總DNA互補(bǔ)序列方面)。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“基因組文庫(kù)”是指由一組代表一種生物的基因組、隨機(jī)產(chǎn)生的重疊DNA片段所構(gòu)成的克隆的集合體?！癱DNA文庫(kù)”(互補(bǔ)DNA文庫(kù))是將細(xì)胞、組織或生物中存在的mRNA分子用反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA分子、然后插入載體(在加入外源DNA后可以繼續(xù)復(fù)制的其它DNA分子)中得到的集合體。供文庫(kù)用的示范性載體包括噬菌體(bacteriophage)(也稱為“噬菌體(phage))”，它們是感染細(xì)菌的病毒，例如λ噬菌體。然后在所述文庫(kù)中探測(cè)所述特定的目的cDNA(以及從而探測(cè)mRNA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將噬菌體載體系統(tǒng)的高效率與質(zhì)粒系統(tǒng)的便利性相結(jié)合的文庫(kù)系統(tǒng)(例如ZAP系統(tǒng)，得自Stratagene，La，Jolla，CA)用于實(shí)施本發(fā)明。
術(shù)語(yǔ)“同源重組”是指兩種DNA分子或染色質(zhì)之間在具同源核苷酸序列(即優(yōu)選具有約70％序列同一性、通常至少約85％同一性、優(yōu)選至少約90％同一性、或者至少約95-98％同一性的那些序列)的位點(diǎn)進(jìn)行DNA片段的交換。用“BLASTN”算法，例如在http//www.ncbi.nlm.nih.gov80/BLAST/(Basic，Advanced或PSI)可在線得到、并且在以下任一文獻(xiàn)中描述的BLAST(基本局部比對(duì)搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))2.0，可以測(cè)定同源性和/或同一性百分比，所述文獻(xiàn)是ALtschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D.J.(1990)“基本局部比對(duì)搜索工具”J.Mol.Biol.215403-410.(Medline)；Gish，W.和States，D.J.(1993)“通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)相似性搜索鑒定蛋白質(zhì)編碼區(qū)”Nature Genet.3266-272.(Medline)；Madden，T.L.，Tatusov，R.L.和Zhang，J.(1996)“網(wǎng)絡(luò)BLAST服務(wù)器的應(yīng)用”Meth.Enzymol.266131-141.(Medline)；Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.和Lipman，D.J.(1997)“包括空位的BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序”Nucleic AcidsRes.253389-3402.(Medline)；以及Zhang，J.和Madden，T.L.(1997)“PowerBLAST交互或自動(dòng)序列分析和注釋的一個(gè)新的網(wǎng)絡(luò)BLAST應(yīng)用”Genome Res.7649-656.(Medline)。不言而喻，同源序列可以在所述核苷酸序列中包括插入、缺失和取代。因此，即使某些核苷酸殘基不完全對(duì)應(yīng)或比對(duì)，核苷酸的線性序列也可以是基本上相同的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“不依賴連接作用的克隆”以常規(guī)含義使用，是指無(wú)需激酶或連接酶而將DNA分子摻入到載體或染色體中。例如在Aslanidis和de Jong，Nucleic Acids Res.，186069-74和順序號(hào)為07/847,298(1991)的美國(guó)專利申請(qǐng)中，描述了不依賴連接作用的克隆技術(shù)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“靶序列”(或者稱為“靶基因序列”或“靶DNA序列”)是指具有在整個(gè)群體中其序列與任何疾病或可分辨表型都不相關(guān)的任何多核苷酸的核酸分子。注意到，在整個(gè)群體中，野生型基因可能包括多種優(yōu)勢(shì)形式，所述優(yōu)勢(shì)形式相互之間在序列中含有改變，尚不引起可分辨的病理學(xué)效應(yīng)。這些變異被稱為“多態(tài)性”或“等位基因變異”。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述靶DNA序列包含所述個(gè)體基因組DNA中特定基因或基因座的一部分。最好是，所述靶DNA序列編碼一種TRP，最好是具有編碼亮氨酸的CTG的三核苷酸重復(fù)。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述靶DNA包含基因產(chǎn)物功能未知的特定基因或基因座的一部分，所述基因例如為用部分cDNA序列(例如EST)鑒定的基因。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述靶TRP基因是T243。最好是，所述靶DNA序列包含SEQ ID NO47(鼠類)或SEQ ID NO57(人類)或其天然存在的等位基因變異體。
術(shù)語(yǔ)“外切核酸酶”是指從線性核酸底物的游離末端順序切割核苷酸的酶。外切核酸酶對(duì)雙鏈或單鏈核苷酸是專一性的和/或定向的，例如3’-5’和/或5’-3’。某些外切核酸酶顯示出其它酶活性，例如T4DNA聚合酶既是聚合酶，又是活性3’-5’外切核酸酶。其它示范性外切核酸酶包括外切核酸酶III，該酶從不具有磷酸化3’末端的雙鏈DNA的5’末端一次除去一個(gè)核苷酸；外切核酸酶VI，該酶通過(guò)切去單鏈DNA兩端的核苷酸而制備寡核苷酸；以及外切核酸酶λ，該酶從連接有5’-磷酸基團(tuán)的雙鏈DNA的5’末端切除核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“重組酶”包括誘導(dǎo)、介導(dǎo)或促進(jìn)重組的酶；引起、介導(dǎo)或促進(jìn)核酸序列重排或在第二核酸序列切除或插入第一核酸序列的其它核酸修飾酶。重組酶的“靶位點(diǎn)”是所述重組酶所識(shí)別(例如與其特異性地結(jié)合)和/或作用(切除、切割或誘導(dǎo)重組)的核酸序列或區(qū)域。本文所用的表述“酶指導(dǎo)的位點(diǎn)專一性重組”將包括以下三種事件
1.缺失重組酶靶位點(diǎn)所鄰接的預(yù)選定的DNA區(qū)段；2.將重組酶靶位點(diǎn)所鄰接的預(yù)選定DNA區(qū)段的核苷酸序列倒位；3.將位于不同DNA分子上鄰近重組酶靶位點(diǎn)的DNA區(qū)段相互交換。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是一幅簡(jiǎn)圖，描述一種構(gòu)建本發(fā)明打靶載體的方法。該質(zhì)粒PCR法在實(shí)施例9和實(shí)施例10中有描述。
圖2A是一幅簡(jiǎn)圖，描述pDG2載體。該載體含有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)新霉素(Neor)基因。在Neor基因的兩側(cè)有兩個(gè)供不依賴連接作用的克隆用的位點(diǎn)以及限制性酶切位點(diǎn)。pDG2的序列示于圖2B和SEQ ID NO1中。
圖3A是一幅簡(jiǎn)圖，描述pDG4載體。該載體含有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因、一個(gè)新霉素(Neor)基因和一個(gè)綠色熒光蛋白(GFP)基因。在Neor基因的兩側(cè)有兩個(gè)供不依賴連接作用的克隆用的位點(diǎn)以及限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。pDG4的序列示于圖3B和SEQ ID NO2中。
圖4(SEQ ID NO3-SEQ ID NO10)顯示了經(jīng)PCR擴(kuò)增的基因組DNA末端所含有的退火位點(diǎn)1-4在用T4 DNA聚合酶處理之前和之后的核酸序列。
圖5(SEQ ID NO11-SEQ ID NO18)顯示了pDG2載體中所含有的退火位點(diǎn)1-4在用T4 DNA聚合酶處理之前和之后的核酸序列。
圖6顯示了在退火反應(yīng)期間5’和3’側(cè)翼DNA相對(duì)于pDG2載體內(nèi)的退火位點(diǎn)1、2、3和4的重排。
圖7顯示了在退火反應(yīng)期間5’和3’側(cè)翼DNA相對(duì)于pDG4載體內(nèi)的退火位點(diǎn)1、2、3和4以及GFP篩選標(biāo)記的重排。
圖8顯示了用于實(shí)施例4-10中的寡核苷酸引物的序列(SEQ IDNO19-SEQ ID NO44)。小寫序列是克隆位點(diǎn)(例如不依賴連接作用的克隆序列)。
圖9顯示了兩只雜合T243敲除小鼠之間交配編號(hào)1799的子代的身長(zhǎng)、體重和體重/身長(zhǎng)之比。
圖10顯示了兩只雜合T243敲除小鼠之間交配編號(hào)1808的子代的身長(zhǎng)、體重和體重/身長(zhǎng)之比。
圖11顯示了編碼鼠類TRP(SEQ ID NO52)(具體地說(shuō)，是T243的表達(dá)產(chǎn)物)的核酸序列(SEQ ID NO47)；和編碼人類TRP(SEQ IDNO58)的核酸序列(SEQ ID NO57)。
圖12顯示了鼠類TRP的氨基酸序列(SEQ ID NO52)和人類TRP的氨基酸序列(SEQ ID NO58)。
圖13顯示了用于PCR擴(kuò)增與靶基因T243同源的序列的寡核苷酸引物的核酸序列(SEQ ID NO45；SEQ ID NO46)。還顯示了具有克隆位點(diǎn)的所述引物(SEQ ID NO48；SEQ ID NO49)和用于鑒定靶基因T243中含有的文庫(kù)部分的引物的核酸序列(SEQ ID NO55；SEQ IDNO56)。
圖14顯示了通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的、與靶基因T243同源的序列的核酸序列(SEQ ID NO50；SEQ ID NO51)。
圖15顯示了用包含同源序列(SEQ ID NO50；SEQ ID NO51)的構(gòu)建體產(chǎn)生的靶基因T243的缺失型基因片段的核酸序列(SEQ IDNO59)。還顯示了擴(kuò)增型T243基因的核酸序列(SEQ ID NO53)以及相應(yīng)表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列(SEQ ID NO54)。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于對(duì)于基因的表達(dá)和作用以及基因表達(dá)產(chǎn)物、主要是與三核苷酸重復(fù)蛋白相關(guān)的那些基因產(chǎn)物的評(píng)估。尤其是，這使得可以確定疾病途徑(disease pathway)和鑒定該途徑中在診斷和治療方面有用的靶。例如，在病癥狀況下突變的或被負(fù)調(diào)節(jié)的基因，可能參與引起該病癥或使其惡化。目標(biāo)在于正調(diào)節(jié)這類基因活性的治療或涉及替代途徑的治療，可能緩解所述病癥。
本文所用的“基因”是指(a)含有本文所公開的DNA序列中至少一種的基因；(b)編碼由本文公開的DNA序列所編碼的氨基酸序列的任何DNA序列；和/或(c)與本文公開的編碼序列的互補(bǔ)序列雜交的任何DNA序列。最好是，該術(shù)語(yǔ)包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)，最好包括正常基因表達(dá)所必需的所有序列，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它調(diào)節(jié)序列。
本發(fā)明也包括與前一段落中的DNA序列(a)-(c)雜交、并因此是所述DNA序列(a)-(c)的互補(bǔ)序列的核酸分子，最好是DNA分子。這種體外雜交條件可以是高度嚴(yán)格性的，或嚴(yán)格性不太高。高度嚴(yán)格性條件例如包括在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中于65℃與結(jié)合于濾膜的DNA雜交，并且在0.1×SSC/0.1％SDS于68℃洗滌(參見Ausubel F.M.等編著，1989，Current Protocols inMolecular Biology，第I卷，Green Publishing Associates，Inc.，和JohnWiley & Sons，Inc.，New York，第2.10.3頁(yè)；Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，第2卷，Cold Springs Harbor Laboratory，Cold Springs，N.Y.，第8.46-8.47頁(yè)(1995)，這兩個(gè)參考文獻(xiàn)均通過(guò)引用結(jié)合到本文中)，而嚴(yán)格性不太高的條件諸如中等嚴(yán)格性條件，例如在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃洗滌(Ausubel等，1989，參見上文；Sambrook等，1989，參見上文)。
在核酸分子是脫氧寡核苷酸(“oligo”)的情況下，高度嚴(yán)格性條件可以是指例如在6×SSC/0.05％焦磷酸鈉中于37℃(對(duì)于14個(gè)堿基的oligo)、48℃(對(duì)于17個(gè)堿基的oligo)、55℃(對(duì)于20個(gè)堿基的oligo)和60℃(對(duì)于23個(gè)堿基的oligos)洗滌。這些核酸分子在體內(nèi)可以用作在例如靶基因的調(diào)節(jié)有用的靶基因反義分子和/或用作靶基因核酸序列擴(kuò)增反應(yīng)中的反義引物。此外，這類序列可以用作核酶序列和/或三股螺旋序列的一部分，也可用于靶基因的調(diào)節(jié)。再者，這類分子可以用作診斷方法中的組分，從而可以檢測(cè)致病等位基因的存在。
本發(fā)明也包括(a)含有任一前述編碼序列和/或其互補(bǔ)序列(即反義序列)中的DNA載體；(b)含有與指導(dǎo)任一前述編碼序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件有效連接的所述編碼序列的DNA表達(dá)載體；和(c)含有與指導(dǎo)任一前述編碼序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)元件有效連接的所述編碼序列的基因工程宿主細(xì)胞。本文所用的調(diào)節(jié)元件包括但不限于誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱基因和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的驅(qū)動(dòng)和調(diào)節(jié)表達(dá)的其它元件。本發(fā)明包括任一本文公開的DNA序列的片段。
除上述基因序列外，采用本領(lǐng)域眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)，無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)，就可以鑒定這類序列的同源物，例如可能存在于其它物種的同源物，并且可以容易地將其分離出。此外，在基因組中的其它基因座可能存在編碼與這類基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域具有廣泛同源性的蛋白質(zhì)的基因。這些基因也可以用相似的技術(shù)來(lái)鑒定。
例如，可以對(duì)經(jīng)分離的差異表達(dá)的基因序列或其部分進(jìn)行標(biāo)記，并用來(lái)篩選由得自目的生物的mRNA構(gòu)建的cDNA文庫(kù)。當(dāng)從與所述標(biāo)記序列所來(lái)源的生物類型不同的生物中得到cDNA文庫(kù)時(shí)，雜交條件的嚴(yán)格性要低些。另一方面，采用適宜的嚴(yán)格性條件，又可以用標(biāo)記片段來(lái)篩選由目的生物制備的基因組文庫(kù)。這種低嚴(yán)格性條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，可以預(yù)測(cè)，根據(jù)所述文庫(kù)和標(biāo)記序列所來(lái)源的具體生物，這種低嚴(yán)格性條件會(huì)有所改變。有關(guān)這類條件的指南，參見例如Sambrook等，1989，Ausubel等，1989。
在所鑒定的基因是正常的或野生型基因的情況下，該基因可以用來(lái)分離所述基因的突變型等位基因。就已知有或懷疑有遺傳基礎(chǔ)的過(guò)程和疾病而論，這樣一種分離是優(yōu)選的?？梢詮幕蛘咭阎谢驊岩捎袑?dǎo)致病癥的基因型的個(gè)體，分離出突變型等位基因。然后可以將突變型等位基因和突變型等位基因產(chǎn)物用于治療和診斷分析系統(tǒng)中。
可以例如采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)-PCR，分離突變型基因的cDNA。在這種情況下，通過(guò)使寡聚dT寡核苷酸與從組織中分離的并且已知或懷疑在推定攜帶所述突變型等位基因的個(gè)體中表達(dá)的mRNA雜交，并且通過(guò)用反轉(zhuǎn)錄酶延伸所述新鏈，可以合成第一條cDNA鏈。然后，用與正常基因5’端特異性雜交的寡核苷酸，合成所述cDNA的第二條鏈。然后用這兩種引物通過(guò)PCR擴(kuò)增所述產(chǎn)物，將所述產(chǎn)物克隆到合適的載體中，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行DNA序列分析。通過(guò)比較突變型基因和正常基因的DNA序列，可以確定導(dǎo)致所述突變型基因產(chǎn)物功能喪失或改變的突變。
或者，可以構(gòu)建基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)，并且分別用從已知或懷疑在懷疑或已知攜帶所述突變型等位基因的個(gè)體中表達(dá)目的基因的組織中得到的DNA或RNA進(jìn)行篩選。然后可以標(biāo)記所述正?；蚧蚱淙魏魏线m的片段，將其用作探針，鑒定所述文庫(kù)中相應(yīng)的突變型等位基因?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中常規(guī)使用的方法，純化含有該基因的克隆，并且對(duì)其進(jìn)行序列分析。
任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)都可以用來(lái)將靶基因轉(zhuǎn)基因?qū)雱?dòng)物中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的建立者系。這類技術(shù)包括但不限于原核微注射(美國(guó)專利第4,873,191號(hào))；反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到種系中(Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，826148-6152(1985))；胚胎干細(xì)胞中的基因打靶(Thompson等，Cell，56313-321(1989))；胚胎電穿孔(Lo，Mol Cell.Biol.，31803-1814(1983))；和精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等，Cell，57717-723(1989))等。有關(guān)這類技術(shù)的綜述，參見Gordon，Transgenic Animals，Intl.Rev.Cytol.，115171-229(1989)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，采用同源重組來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的敲除小鼠。最好是，以兩步產(chǎn)生所述構(gòu)建體，即(1)擴(kuò)增(例如使用長(zhǎng)距離PCR)與靶序列同源的序列，和(2)將另一種多核苷酸(例如一種選擇標(biāo)記)插入所述PCR產(chǎn)物中，使得其側(cè)翼為所述同源序列。通常，所述載體是來(lái)自質(zhì)粒基因組文庫(kù)的質(zhì)粒。構(gòu)建好的構(gòu)建體也常常是環(huán)狀質(zhì)粒。因此，如圖1所示，采用長(zhǎng)距離PCR和“向外(outwardly pointing)”寡核苷酸，產(chǎn)生其中可以容易插入選擇標(biāo)記、最好是通過(guò)不依賴連接作用的克隆插入選擇標(biāo)記的載體。然后將所述構(gòu)建體導(dǎo)入ES細(xì)胞，在此它可以破壞所述同源靶序列的功能。
同源重組也可以用來(lái)敲除干細(xì)胞和不是全能胚胎干細(xì)胞的其它細(xì)胞類型中的基因。作為實(shí)例，干細(xì)胞可以是骨髓細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞或前體細(xì)胞。這類敲除細(xì)胞可能在研究個(gè)體發(fā)育途徑中靶基因的功能方面特別有用。干細(xì)胞可以來(lái)源于任何脊椎動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、狗、貓、豬、兔、人類、非人類靈長(zhǎng)類等。
在非全能的細(xì)胞中，可能最好是用本領(lǐng)域已知的方法敲除所述靶的兩個(gè)拷貝。例如，對(duì)包含靶基因座的同源重組的細(xì)胞，根據(jù)正選擇標(biāo)記(例如Neor)的表達(dá)進(jìn)行選擇，并且根據(jù)非隨機(jī)整合進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)選擇和篩選的所述細(xì)胞可以通過(guò)暴露于提高水平的選擇劑(例如G418)，進(jìn)一步選擇具有多拷貝所述選擇標(biāo)記的細(xì)胞。然后，分析所述細(xì)胞在靶基因座的純合性?；蛘?，可以在所述兩個(gè)同源序列之間插入一個(gè)不同的正選擇標(biāo)記，產(chǎn)生第二構(gòu)建體?？梢詫⑦@兩種構(gòu)建體或者順序?qū)爰?xì)胞，或者同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞，然后根據(jù)每種正選擇標(biāo)記基因進(jìn)行合適的選擇。根據(jù)所述靶的兩種等位基因的同源重組，對(duì)最終的細(xì)胞進(jìn)行篩選。
另一方面，擴(kuò)增目的克隆的兩個(gè)分開的片段，采用不依賴連接作用的克隆技術(shù)將它們插入到含有正選擇標(biāo)記的載體中。在該實(shí)施方案中，目的克隆一般來(lái)自噬菌體文庫(kù)，并且用PCR技術(shù)鑒定和分離?？梢杂脙蓚€(gè)步驟或用一個(gè)步驟進(jìn)行不依賴連接作用的克隆。
按照一個(gè)優(yōu)選方法，使用具有多個(gè)可以產(chǎn)生5’-3’單鏈區(qū)的位點(diǎn)的構(gòu)建體。這些構(gòu)建體，最好是質(zhì)粒，包括能夠進(jìn)行定向的四向(four-way)不依賴連接作用的克隆的載體。
所述構(gòu)建體通常包含一個(gè)編碼正選擇標(biāo)記的序列(例如編碼新霉素抗性的基因)；在所述正選擇標(biāo)記任一側(cè)的一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)；和鄰接所述限制性酶切位點(diǎn)、不含4個(gè)堿基對(duì)之一的序列。這種構(gòu)型使得可以通過(guò)用合適的限制性酶消化所述構(gòu)建體，并且用具有外切核酸酶活性的化合物(例如T4 DNA聚合酶)處理所述片段，在所述序列中產(chǎn)生單鏈末端。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，適用于將定向突變導(dǎo)入ES細(xì)胞的構(gòu)建體最好直接由質(zhì)?；蚪M文庫(kù)制備。采用長(zhǎng)距離PCR與特異性引物，以一個(gè)步驟從所述質(zhì)粒文庫(kù)中鑒定并分離出目的序列。在分離該序列之后，可以容易地把要破壞所述靶序列的第二多核苷酸插入編碼所述目的序列的兩個(gè)區(qū)之間。采用這種直接方法，可以在少至72小時(shí)內(nèi)構(gòu)建定向構(gòu)建體。在另一實(shí)施方案中，如下所述，在噬菌體基因組文庫(kù)中鑒定目的克隆之后，制備定向構(gòu)建體。
本文所述的方法消除了雜交分離、限制性作圖和多克隆步驟的需要。而且，采用這些方法可以測(cè)定任何基因的功能。例如，可以用短序列(例如EST)來(lái)設(shè)計(jì)寡核苷酸探針。這些探針可以用于直接擴(kuò)增程序中，以構(gòu)建構(gòu)建體；或者可以用來(lái)篩選基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中較長(zhǎng)的全長(zhǎng)基因。因此，考慮了，可以快速有效地制備任何基因，以供用于ES細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，直接從質(zhì)?；蚪M文庫(kù)制備構(gòu)建體?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法制備所述文庫(kù)。最好是，從小鼠ES細(xì)胞分離DNA，用限制性內(nèi)切核酸酶處理，將所述DNA切割為片段。然后將所述DNA片段插入載體中，例如插入噬菌體或噬菌粒(例如λZAPTM，Stratagene，La Jolla，CA)系統(tǒng)中。當(dāng)在ZAPTM系統(tǒng)中構(gòu)建該文庫(kù)時(shí)，所述DNA片段最好在約5千堿基和約20千堿基之間。
最好是，用于制備文庫(kù)的生物沒(méi)有可分辨的疾病或表型效應(yīng)。所述文庫(kù)最好是小鼠文庫(kù)。該DNA可以從任何細(xì)胞來(lái)源或體液獲得?？捎糜谂R床實(shí)踐的細(xì)胞來(lái)源的非限制性實(shí)例包括ES細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、血細(xì)胞、口頰細(xì)胞(buccal cells)、宮頸陰道細(xì)胞、得自尿的上皮細(xì)胞、胎兒細(xì)胞或在通過(guò)活組織檢查獲得的組織中存在的任何細(xì)胞。體液包括尿、血液、腦脊液(CSF)和感染或炎癥部位的組織滲出液。用本領(lǐng)域已知的任何方法，從所述細(xì)胞或體液提取DNA。最好是，通過(guò)將5ml裂解緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM EDTA(pH8.0)、10mMNaCl、0.5％SDS和1mg/ml蛋白酶K)加入含有匯合的胚胎干細(xì)胞的100mm平板中，提取所述DNA。然后將細(xì)胞于約60℃孵育數(shù)小時(shí)或直至完全裂解。通過(guò)數(shù)輪溫和的苯酚氯仿抽提、然后乙醇沉淀，從裂解的細(xì)胞中純化基因組DNA。為了方便起見，將基因組文庫(kù)布置成多個(gè)庫(kù)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用寡核苷酸引物和長(zhǎng)距離PCR，從所述質(zhì)粒文庫(kù)中鑒定目的序列。通常，引物是根據(jù)從部分基因序列獲得的序列信息(例如cDNA或EST序列)設(shè)計(jì)的向外引物。例如圖1中所示，所述產(chǎn)物將是不包括位于每種引物之間的區(qū)域的線性片段。
被認(rèn)為合適的PCR條件在以下實(shí)施例中描述。人們會(huì)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定最適PCR條件。(參見例如PCR 2APractical Approach(1995)M.J.McPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor編著，IRL Press，Oxford；Yu等，Methods Mol.Bio.，58335-9(1996)；Munroe等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.，USA，922209-13(1995))。對(duì)文庫(kù)進(jìn)行PCR篩選，消除了與常規(guī)雜交篩選相關(guān)的許多問(wèn)題和時(shí)間的延遲，在所述常規(guī)雜交中，必須將文庫(kù)鋪平板、制備濾膜、制備放射性探針和建立雜交條件。PCR篩選僅需要目的序列(基因)的寡核苷酸引物。可以采用幾種方法，包括但不限于微量過(guò)濾、透析、凝膠電泳等，來(lái)純化PCR產(chǎn)物?？赡茏詈檬浅ビ糜赑CR中的聚合酶，使得不能夠發(fā)生新的DNA合成。合適的熱穩(wěn)定DNA聚合酶是可在市場(chǎng)上獲得，例如VentTMDNA聚合酶(New England Biolabs)、Deep VentTMDNA聚合酶(New England Biolabs)、HotTubTMDNA聚合酶(Amersham)、ThermoSequenaseTM(Amersham)、rBstTMDNA聚合酶(Epicenter)、PfuTMDNA聚合酶(Stratagene)、Amplitaq GoldTM(Perkin Elmer)和ExpandTM(Boehringer Mannheim)。
為了產(chǎn)生構(gòu)建好的構(gòu)建體，把會(huì)破壞所述靶序列的序列插入所述PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物中。例如，如本文所述，直接方法包括將長(zhǎng)距離PCR產(chǎn)物(即載體)和一種片段(即編碼選擇標(biāo)記的基因)連接在一起。如上所論述，所述載體含有與所述靶DNA序列同源的兩個(gè)不同的序列區(qū)。最好是，所述載體也含有編碼選擇標(biāo)記(例如氨芐青霉素)的序列。所述載體和片段的設(shè)計(jì)使得當(dāng)對(duì)其進(jìn)行處理而形成單鏈末端時(shí)，它們將退火，使得所述片段定位于與所述靶基因基本同源的兩個(gè)不同區(qū)之間。
雖然任何克隆方法都是適用的，但最好是用不依賴連接作用的克隆策略，來(lái)裝配包含鄰接選擇標(biāo)記的兩個(gè)不同同源區(qū)的構(gòu)建體。不依賴連接作用的克隆(LIC)是一種無(wú)需使用激酶或連接酶而定向克隆多核苷酸的策略。(參見例如Aslanidis等，Nucleic Acids Res.，186069-74(1990)；Rashtchian，Current Opin.Biotech.，630-36(1995))。通常通過(guò)用T4 DNA聚合酶在僅存在一種dNTP的情況下處理所述載體(在經(jīng)消化的限制性酶切位點(diǎn))，在LIC載體中產(chǎn)生單鏈尾(也稱為克隆位點(diǎn)或退火序列)。T4 DNA聚合酶的3’-5’外切核酸酶活性除去核苷酸，直至它遇到對(duì)應(yīng)于反應(yīng)混合物中存在的所述單一dNTP的殘基。這時(shí)，該酶的5’-3’聚合酶活性抵消了外切核酸酶活性，阻止進(jìn)一步切割。所述載體的設(shè)計(jì)，使得所產(chǎn)生的單鏈尾是非互補(bǔ)的。例如，在pDG2載體中，所述4個(gè)退火位點(diǎn)的單鏈尾相互之間都不互補(bǔ)。通過(guò)使5’適當(dāng)?shù)匮由斓焦押塑账嵋镏?，產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。純化PCR產(chǎn)物，以除去dNTP(如果將原始質(zhì)粒用作模板，也除去原始質(zhì)粒)，然后用在存在合適的dNTP的情況下用T4 DNA聚合酶處理，產(chǎn)生特異性的載體匹配的突出端。通過(guò)使匹配的尾退火而發(fā)生克隆。例如用化學(xué)法或酶法，在所述克隆片段末端產(chǎn)生單鏈尾。在所述載體上產(chǎn)生互補(bǔ)尾；然而為了防止無(wú)插入片段的載體退火，所述載體尾相互之間不互補(bǔ)。尾的長(zhǎng)度至少約5個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少約12個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選至少約20個(gè)核苷酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將重疊的載體和片段置于同一反應(yīng)中，足以使其退火?；蛘撸瑢⒒パa(bǔ)序列混合，加熱并讓其緩慢冷卻。加熱步驟優(yōu)選在約60℃和約100℃之間進(jìn)行，更優(yōu)選在約60℃和80℃之間進(jìn)行，甚至更優(yōu)選在60℃和70℃之間進(jìn)行。然后，讓加熱反應(yīng)物冷卻。一般而言，冷卻的發(fā)生相當(dāng)緩慢，例如，在約室溫，所述反應(yīng)一般在約1小時(shí)后發(fā)生。冷卻必須足夠緩慢，以便讓其退火。退火的片段/載體可以直接使用，或于-20℃凍存待用。
此外，通過(guò)調(diào)節(jié)鹽和溫度而達(dá)到合適的條件，可以進(jìn)行退火。在范圍在約10mM NaCl至約600mM NaCl的溶液中，于范圍為約37℃至約65℃的溫度下，進(jìn)行雜交反應(yīng)。人們會(huì)理解，雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性由鹽濃度和溫度兩者決定。例如，在10mM鹽中37℃進(jìn)行雜交，其嚴(yán)格性與在500mM鹽中65℃的嚴(yán)格性相似。對(duì)于本發(fā)明，可以使用在同源互補(bǔ)序列之間形成雜交體的任何雜交條件。
如圖1所示，在一個(gè)實(shí)施方案中，在應(yīng)用這些退火方法中的任一種后制備構(gòu)建體，其中所述載體部分含有與靶基因(用長(zhǎng)距離PCR從質(zhì)粒文庫(kù)中擴(kuò)增的)基本同源的兩個(gè)不同區(qū)，而所述片段是編碼選擇標(biāo)記的基因。
在退火后，用本領(lǐng)域已知的方法，將所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(例如DH5-α細(xì)胞)中，擴(kuò)增所述構(gòu)建體。分離的構(gòu)建體隨時(shí)可用于導(dǎo)入ES細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，在匯集的基因組文庫(kù)中，用PCR鑒定目的克隆。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述PCR條件使得編碼選擇標(biāo)記的基因可以直接插入到鑒定為陽(yáng)性的克隆中。所述標(biāo)記定位于與靶DNA具有基本同源性的兩個(gè)不同序列之間。
可以采用本領(lǐng)域已知的和實(shí)施例中描述的任何方法，制備基因組噬菌體文庫(kù)。最好是，通過(guò)將基因組DNA切割成長(zhǎng)度約20千堿基的片段，用λ噬菌體制備小鼠胚胎干細(xì)胞文庫(kù)。然后，將所述片段插入到任何合適的λ克隆載體例如λFix II或λDash II(Stratagene，La Jolla，Ca)中。
為了從文庫(kù)中快速而有效地篩選大量克隆，可以構(gòu)建具有多個(gè)平板接種文庫(kù)的庫(kù)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)基因組λ噬菌體文庫(kù)以每個(gè)平板約1,000克隆(噬斑)的密度鋪平板。產(chǎn)生足夠的平板，以在數(shù)次鋪平板后可代表所述生物的整個(gè)基因組。例如，約1×106克隆(1000個(gè)平板)將產(chǎn)生約8個(gè)基因組相當(dāng)物。然后，例如通過(guò)用緩沖液覆蓋所述平板，將平板保溫，再收集緩沖液，來(lái)收集噬斑。緩沖液的用量將根據(jù)平板大小而變，一般而言，一個(gè)100mm直徑的平板應(yīng)用約4ml緩沖液覆蓋，然后收集約2ml。
人們會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以在該程序期間的任何時(shí)候?qū)蝹€(gè)平板的裂解液合并，可以將它們以任何組合合并。然而，為了隨后易于鑒定單個(gè)克隆，最好是分開保持每個(gè)平板的裂解液，然后制備一個(gè)庫(kù)。例如，可以將每個(gè)2ml的裂解液置于96孔深孔平板中。然后通過(guò)從每個(gè)孔中取一定量，例如約100μl，并將其在一個(gè)新平板的孔中混合，形成一個(gè)庫(kù)。最好是，在一個(gè)孔中混合12個(gè)100μl的單個(gè)平板裂解液，形成一個(gè)代表12,000個(gè)該文庫(kù)克隆的1.2ml的庫(kù)。
然后，用已知擴(kuò)增所述靶基因的一組PCR引物，對(duì)每個(gè)庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。靶基因可以是已知的全長(zhǎng)基因，或更優(yōu)選是從公眾可得的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(例如GenBank或EMBL)獲得的部分cDNA序列。這些數(shù)據(jù)庫(kù)包括稱為已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)的部分cDNA序列?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法，從任何生物中分離出寡核苷酸PCR引物，或者最好用化學(xué)法合成寡核苷酸PCR引物。
一旦在基因組文庫(kù)中鑒定出靶基因的陽(yáng)性克隆，則必須產(chǎn)生編碼所述靶基因不同部分的兩種片段。換句話說(shuō)，產(chǎn)生所述靶的小的已知區(qū)(例如EST)的側(cè)翼區(qū)。雖然，每個(gè)側(cè)翼區(qū)的大小并不是關(guān)鍵性的，但其范圍可以是從小至100個(gè)堿基對(duì)至多達(dá)100kb，最好是每種側(cè)翼片段的長(zhǎng)度大于約1kb，更優(yōu)選在約1kb和約10kb之間，甚至更優(yōu)選在約1kb和約5kb之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，雖然較大的片段可以增加ES細(xì)胞中同源重組事件的次數(shù)，但較大的片段也將更加難以克隆。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用來(lái)擴(kuò)增側(cè)翼片段的寡核苷酸PCR引物之一對(duì)于文庫(kù)克隆載體(例如λ噬菌體)是特異性的。因此，如果該文庫(kù)是λ噬菌體文庫(kù)，那么對(duì)λ噬菌體臂特異性的引物可以與對(duì)所述陽(yáng)性克隆特異性的引物結(jié)合使用，以產(chǎn)生長(zhǎng)的側(cè)翼片段?？梢栽O(shè)置多重PCR反應(yīng)，以測(cè)試不同的引物組合。最好是，所用引物將產(chǎn)生長(zhǎng)度約2kb和約6kb之間的側(cè)翼序列。
最好是，根據(jù)與所述片段待克隆進(jìn)的載體互補(bǔ)的5’序列，設(shè)計(jì)所述寡核苷酸引物。另外，所述引物的設(shè)計(jì)，也使得當(dāng)裝配所述構(gòu)建體時(shí)，所述側(cè)翼片段將相對(duì)于所述載體以及相互之間以適宜的3’-5’定向。當(dāng)靶基因是T243時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述引物之一包含SEQID NO48，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，另一引物包含SEQ ID NO49。
因此，采用基于PCR的方法，例如，可以根據(jù)在電泳凝膠上顯現(xiàn)出一條帶，鑒定出陽(yáng)性克隆。
一方面，所述克隆涉及一種載體和兩種片段。所述載體含有正選擇標(biāo)記(最好是Neor)和位于所述正選擇標(biāo)記兩側(cè)的用于所述靶基因的兩種不同區(qū)的克隆位點(diǎn)?？扇芜x的是，所述載體也含有編碼篩選標(biāo)記的序列(報(bào)道基因)，所述序列最好是與所述正選擇標(biāo)記的定位相反。所述篩選標(biāo)記將位于同源序列的側(cè)翼區(qū)之外。圖3A顯示了所述載體的一個(gè)實(shí)施方案，篩選標(biāo)記GFP位于所述載體的一側(cè)。然而，所述篩選標(biāo)記可以位于與正選擇標(biāo)記Neor相反一側(cè)的Not I和位點(diǎn)4之間的任何位置。
合適載體的一個(gè)實(shí)例是圖2所示的具有SEQ ID NO1序列的質(zhì)粒載體。本文也顯示了圖1標(biāo)記為“位點(diǎn)1、2、3或4”的特異性核酸不依賴連接作用的克隆位點(diǎn)(也稱為退火位點(diǎn))。一般而言，所述克隆位點(diǎn)缺乏至少一種類型的堿基，例如胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)。因此，使所述載體與既作為聚合酶又作為外切核酸酶的酶在僅存在所述一種缺少的核苷酸的情況下進(jìn)行反應(yīng)，將產(chǎn)生突出端。例如，T4 DNA聚合酶既作為3’-5’外切核酸酶起作用，又作為聚合酶起作用。因此，當(dāng)聚合酶活性可利用的核苷酸不足時(shí)，T4將作為外切核酸酶起作用。因此，通過(guò)使pDG2載體與T4 DNA聚合酶在僅存在dTTP的情況下反應(yīng)，可以產(chǎn)生特異性突出端?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的其它酶是本領(lǐng)域已知的，例如尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)(參見例如WO 93/18175)。本文例舉的載體具有24個(gè)核苷酸的突出端。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道，成功的不依賴連接作用的克隆需要少至5個(gè)核苷酸。
在另一實(shí)施方案中，用兩步克隆方案裝配構(gòu)建體。第一步，將每個(gè)同源性的克隆區(qū)分別克隆到所述載體的兩個(gè)退火位點(diǎn)中。例如，將同源性的“上游”區(qū)克隆到退火位點(diǎn)1和2中，而在一次單獨(dú)的克隆中，將同源性的“下游”區(qū)克隆到退火位點(diǎn)3和4中。一旦鑒定出含有同源性的每個(gè)單一區(qū)的克隆，則可以通過(guò)用多種限制性酶消化每個(gè)克隆，其中一種酶在退火位點(diǎn)1之外(例如圖2A中的Not I)消化，而另一種酶在正選擇標(biāo)記和退火位點(diǎn)3之間(例如圖2A中的Sal I)消化，來(lái)構(gòu)建含有這兩個(gè)同源性區(qū)的打靶構(gòu)建體。純化(通過(guò)通過(guò)凝膠電泳)含有來(lái)自每種構(gòu)建體的側(cè)翼同源性區(qū)的片段，用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)進(jìn)行將其混合，產(chǎn)生所得的打靶構(gòu)建體。
在再一實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的一個(gè)方面構(gòu)建體可以用一步四向連接法構(gòu)成。如上所述處理所述載體和片段。簡(jiǎn)而言之，處理所述載體，以形成兩個(gè)片段，每個(gè)片段在每一端具有一個(gè)特異性序列的單鏈尾。同樣，也處理PCR擴(kuò)增的側(cè)翼片段，以形成與所述載體片段的單鏈尾互補(bǔ)的單鏈尾。如上所述將經(jīng)處理的載體片段和所述側(cè)翼片段混合，并且讓其退火。因?yàn)樗鰡捂溛簿哂刑禺愋裕宰罱K的構(gòu)建體將含有被正選擇標(biāo)記分開的正確定向的所述片段。
在細(xì)菌中擴(kuò)增最終的質(zhì)粒構(gòu)建體，將其純化，然后可以將其導(dǎo)入ES細(xì)胞中，或于-20℃凍存待用。當(dāng)需要時(shí)，將所述載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞系中(例如通過(guò)電穿孔)，選擇其中所導(dǎo)入的DNA與所述內(nèi)源DNA發(fā)生了同源重組的細(xì)胞(參見例如Li等，Cell，6991526(1992))。然后將所選細(xì)胞注射到動(dòng)物(例如小鼠)的胚泡(或適用于產(chǎn)生有活力動(dòng)物的其它發(fā)育階段，例如桑椹胚)中，形成嵌合體(參見例如Bradley，A.Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson編著，IRL，Oxford，第113-152頁(yè)(1987))?；蛘?，可以讓所選ES細(xì)胞與分離的小鼠胚胎細(xì)胞聚集，形成團(tuán)聚嵌合體。然后可以將嵌合胚胎植入合適的假孕代母動(dòng)物體內(nèi)，讓胚胎生長(zhǎng)至足月。在其生殖細(xì)胞中帶有同源重組的DNA的嵌合子代，可以用來(lái)繁育出其所有的細(xì)胞均含有所述同源重組的DNA的動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合子代小鼠用來(lái)產(chǎn)生在靶基因中帶有雜合破壞的小鼠。可以讓雜合敲除小鼠交配。本領(lǐng)域眾所周知，通常這種交配的1/4子代將在靶基因中具有純合破壞。
然后將雜合敲除小鼠以及純合敲除小鼠與正常的野生型小鼠比較，以確定所述靶基因的破壞是否引起表型改變，尤其是病理學(xué)改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶DNA序列是T243，與普通正常野生型成年小鼠相比，純合敲除小鼠的體重降低。體重通常降低至少約15％，更常見降低約30-90％，甚至更通常較低約40-80％；最常見降低約60-70％。
在另一實(shí)施方案中，與普通正常野生型成年小鼠相比，純合敲除小鼠的身長(zhǎng)降低。身長(zhǎng)通常降低至少約10％，常常降低15-50％；更常見降低約20-40％，最常見降低約25-35％。
與正常野生型成年小鼠相比，體重與身長(zhǎng)之比也可以降低。通常，體重與身長(zhǎng)之比降低至少約20％，更常見降低約25-75％，更常見降低約30-65％，最常見降低約40-55％。
也觀察到表型包括身長(zhǎng)和體重均降低的小鼠。這類小鼠也可以表現(xiàn)出體重與身長(zhǎng)之比降低。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述敲除小鼠的表型包括軟骨病和/或骨病。通常，在該實(shí)施方案中，有軟骨異常并且骨生成普遍減少。
本文所用的“疾病”是指機(jī)體狀態(tài)或機(jī)體某些器官的任何改變，中斷或擾亂了生活機(jī)能的執(zhí)行、以及引起疼痛或虛弱或有疼痛或虛弱的危險(xiǎn)。疾病也可以被認(rèn)為包括機(jī)體任何部分、器官或系統(tǒng)(或其組合)的正常結(jié)構(gòu)或功能的任何偏差或中斷，其表現(xiàn)為特征性的一種或一組癥狀和/或體征，其病因?qū)W、病理學(xué)和/或預(yù)后可以是已知或未知的。
通常觀察到的病理學(xué)病癥包括中軸骨骼和附肢骨骼都縮短。四肢的近端和遠(yuǎn)端骨按比例縮短。關(guān)節(jié)軟骨缺乏愛茜藍(lán)染色。該實(shí)施方案的其它方面包括股骨遠(yuǎn)端的生長(zhǎng)板薄以及骺軟骨薄至缺乏。所述疾病也可能有微小骨折，提示生長(zhǎng)板脆性。在該實(shí)施方案中，在長(zhǎng)骨體生長(zhǎng)部?jī)?nèi)增殖區(qū)和肥大區(qū)中的軟骨細(xì)胞柱短。干骺端內(nèi)軟骨性針狀體(spicule)短并且間隔寬；偶爾出現(xiàn)的針狀體偶然定向。成骨細(xì)胞豐富并且常常沿軟骨性針狀體堆積。骺軟骨薄并且常常被纖維性結(jié)締組織所取代。骺表面的愛茜藍(lán)染色也減弱。骨骺/長(zhǎng)骨體生長(zhǎng)部連接處的軟骨略微向外張開，有伸出在長(zhǎng)骨體生長(zhǎng)部之上的不規(guī)則的凸出邊緣。該實(shí)施方案中也包括胸骨板不規(guī)則；生長(zhǎng)板或者缺乏或者不連續(xù)。大的不規(guī)則的軟骨島延伸到胸骨板體中，偶然有第二骨化中心。軟骨邊緣也可能向外張開。另一方面包括不定骨化的椎體，所述椎體可能小并且主要是軟骨性的。這些主要是軟骨性的椎體的生長(zhǎng)板不規(guī)則且薄，側(cè)突漸尖。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述疾病被鑒定為軟骨發(fā)育不良。
在本發(fā)明的再一方面，所述敲除小鼠的表型包括腎病。通常，所述腎小且缺乏正常的結(jié)構(gòu)。皮質(zhì)薄，并且某些腎小球可能在被膜下。被膜下的腎小球是小而皺縮的、多細(xì)胞的腎小球叢。皮質(zhì)髓質(zhì)區(qū)可能沒(méi)有放射狀弓形管和獨(dú)特的管形。皮質(zhì)髓質(zhì)連接處內(nèi)的腎小管上皮細(xì)胞隨機(jī)排列成片、堆和簇。某些腎小管上皮細(xì)胞小且嗜堿染色暗，顯示有再生。在兩個(gè)腎中通常存在發(fā)育異常性改變，最主要存在于皮質(zhì)髓質(zhì)連接處，在皮質(zhì)較之存在較少。按照本發(fā)明的一個(gè)方面，所述腎病被鑒定為腎發(fā)育不良。
也可以觀察到病理學(xué)狀態(tài)的其它病癥。
可以加入到本發(fā)明所述載體中的額外特征包括應(yīng)用重組酶靶位點(diǎn)。噬菌體P1 Cre重組酶和來(lái)自酵母質(zhì)粒的flp重組酶是位點(diǎn)專一性DNA重組酶的兩個(gè)非限制性實(shí)例，位點(diǎn)專一性DNA重組酶在特定的靶位點(diǎn)切割DNA(cre重組酶在lox P位點(diǎn)切割，而flp重組酶在frt位點(diǎn)切割)，并且催化該DNA連接至第二切割位點(diǎn)。已經(jīng)描述了許多合適的可供選擇的位點(diǎn)專一性重組酶，其基因可以按照本發(fā)明的方法應(yīng)用。這類重組酶包括噬菌體λ的Int重組酶(帶有或不帶有Xis)(Weisberg，R.等，Lambda II，(Hendrix，R.等編著)，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY，第211-50頁(yè)(1983)，通過(guò)引用結(jié)合到本文中)、TpnI和β-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)座子(Mercier等，J.Bacteriol.，1723745-57(1990))、Tn3解離酶(Flanagan和Fennewald J.Molec.Biol.，206295-304(1989)；Stark等，Cell，58779-90(1989))、酵母重組酶(Matsuzaki等，J.Bacteriol.，172610-18(1990))、枯草桿菌SpoIVC重組酶(Sato等，J.Bacteriol.，1721092-98(1990))、Flp重組酶(Schwartz和Sadowski，J.Molec.Biol.，205647-658(1989)；Parsons等，J.Biol.Chem.，2654527-33(1990)；Golic和Lindquist，Cell，59499-509(1989)；Amin等，J.Molec.Biol.，21455-72(1990))、Hin重組酶(Glasgow等，J.Biol.Chem.，26410072-82(1989))、免疫球蛋白重組酶(Malynn等，Cell 54453-460(1988))、和Cin重組酶(Haffter和Bickle，EMBO J.，73991-3996(1988)；Hubner等，J.Molec.Biol.，205493-500(1989))，所有這些文獻(xiàn)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。Echols(J.Biol.Chem.，26514697-14700(1990))、deVillartay(Nature，335170-74(1988))、Craig(Ann.Rev.Genet.，2277-105(1988))、Poyart-Salmeron等(EMBO J.82425-33(1989))、Hunger-Bertling等(Mol Cell.Biochem.，92107-16(1990))以及Cregg和Madden(Mol.Gen.Genet.，219320-23(1989))討論了這類系統(tǒng)，所有上述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
Cre已經(jīng)被純化至均質(zhì)，它與loxP位點(diǎn)的反應(yīng)已被廣泛地表征(Abremski和Hess J.Mol.Biol.2591509-14(1984)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。Cre蛋白的分子量為35,000，在市場(chǎng)上可以從NewEngland Nuclear/Du Pont獲得。cre基因(它編碼Cre蛋白)已被克隆和表達(dá)(Abremski等Cell 321301-11(1983)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。Cre蛋白介導(dǎo)兩個(gè)loxP序列之間的重組(Sternberg等Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.45297-309(1981))，所述loxP序列可以存在于相同或不同的DNA分子上。因?yàn)閘oxP位點(diǎn)的內(nèi)部間隔序列是不對(duì)稱的，所以兩個(gè)loxP位點(diǎn)可以表現(xiàn)出相互之間相對(duì)定向(Hoess和Abremski Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.811026-29(1984))。因此，當(dāng)同一DNA分子上的兩個(gè)位點(diǎn)為同向重復(fù)定向時(shí)，Cre將切割所述位點(diǎn)之間的DNA(Abremski等Cell 321301-11(1983))。然而，如果所述位點(diǎn)相互之間相對(duì)倒位，則所述位點(diǎn)之間的DNA在重組后不被切割，而僅僅是倒位。因此，具有兩個(gè)同向loxP位點(diǎn)的環(huán)狀DNA分子將重組產(chǎn)生兩個(gè)較小的環(huán)，而具有反向的兩個(gè)loxP位點(diǎn)的環(huán)狀分子僅僅將側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的DNA序列倒位。另外，當(dāng)在不同的DNA分子上存在靶時(shí)，重組酶的作用可以導(dǎo)致遠(yuǎn)離所述靶位點(diǎn)的區(qū)域相互交換。
對(duì)于在敲除模型中鑒定基因功能而言，重組酶具有重要的應(yīng)用。當(dāng)本文所述的構(gòu)建體用來(lái)破壞靶基因時(shí)，當(dāng)所述正選擇標(biāo)記的插入發(fā)生在靶基因翻譯起始位點(diǎn)下游(3’)時(shí)，可以產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄物。所述融合轉(zhuǎn)錄物可能產(chǎn)生某一水平的蛋白表達(dá)，其后果是未知的。已經(jīng)提出，正選擇標(biāo)記的插入可以影響附近基因的表達(dá)。這些影響可能使得難以確定敲除事件之后的基因功能，因?yàn)椴豢赡鼙鎰e給定表型是與基因的失活有關(guān)，還是與附近基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。這兩種潛在的問(wèn)題都可以通過(guò)利用重組酶活性來(lái)解決。當(dāng)正選擇標(biāo)記的側(cè)翼為同向的重組酶位點(diǎn)時(shí)，添加相應(yīng)的重組酶將導(dǎo)致除去所述正選擇標(biāo)記。因而避開了由正選擇標(biāo)記或融合轉(zhuǎn)錄物表達(dá)引起的影響。
對(duì)于鑒定與TRP靶基因相關(guān)的疾病而言，功能喪失或無(wú)效突變模型可能是不合適的。許多已發(fā)表的報(bào)道提出，TRP中三核苷酸重復(fù)區(qū)的擴(kuò)增使得所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不利地獲得功能。這類功能的獲得可能涉及新型的或增強(qiáng)的與其它蛋白質(zhì)的相互作用、增強(qiáng)對(duì)蛋白酶降解的抗性、蛋白質(zhì)折疊異常和/或大的不溶性蛋白形式的毒性積累。因此，模擬TRP中三核苷酸重復(fù)的擴(kuò)增以確定擴(kuò)增是否引起可能與功能獲得相關(guān)的表型改變，可能具有很大價(jià)值。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案將涉及應(yīng)用重組酶以引起合成的三核苷酸重復(fù)在靶基因破壞位點(diǎn)的酶輔助位點(diǎn)專一性整合。該實(shí)施方案將涉及重組酶催化遠(yuǎn)離存在于不同分子上的兩個(gè)靶位點(diǎn)的DNA交換的重組酶系統(tǒng)的相互交換能力。當(dāng)用來(lái)產(chǎn)生敲除干細(xì)胞的打靶構(gòu)建體包含鄰接正選擇標(biāo)記的一個(gè)重組酶靶位點(diǎn)時(shí)，在重組酶存在下，在該位點(diǎn)和合成核酸上存在的第二位點(diǎn)之間可以發(fā)生重組。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，會(huì)容易地合成所述合成核酸，以使其包含所述重組酶靶位點(diǎn)和任何所需序列重復(fù)的三核苷酸。例如，所述合成核酸序列可以包括編碼亮氨酸的CTG重復(fù)、或編碼谷氨酰胺的CAG重復(fù)。所述合成核酸優(yōu)選具有至少約20個(gè)三核苷酸重復(fù)；更優(yōu)選具有至少約40個(gè)三核苷酸重復(fù)；最優(yōu)選具有至少約100個(gè)三核苷酸重復(fù)。
技術(shù)人員也會(huì)認(rèn)識(shí)到，采用用于導(dǎo)入DNA的任何標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法，包括但不限于轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔，可以使所述合成核酸與已破壞的基因接觸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)直接微注射，將純化的重組酶提供給所述細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，由其中重組酶基因與有功能的啟動(dòng)子有效連接的共轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體或載體，表達(dá)所述重組酶。該實(shí)施方案的另一方面是應(yīng)用組織特異性或誘導(dǎo)型重組酶構(gòu)建體，這使得可以選擇何時(shí)何地發(fā)生重組。用于實(shí)施誘導(dǎo)型形式的重組酶介導(dǎo)的重組的一種方法，涉及利用誘導(dǎo)型或組織特異性啟動(dòng)子或其它基因調(diào)節(jié)元件表達(dá)所需重組酶活性的載體的應(yīng)用。最好將誘導(dǎo)型表達(dá)元件有效定位，以允許誘導(dǎo)型地控制或激活所需重組酶活性的表達(dá)。這類誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其他基因調(diào)節(jié)元件的實(shí)例包括但不限于四環(huán)素效應(yīng)啟動(dòng)子、金屬硫蛋白效應(yīng)啟動(dòng)子、蛻皮激素效應(yīng)啟動(dòng)子和其它類固醇效應(yīng)啟動(dòng)子、雷帕霉素效應(yīng)啟動(dòng)子等(No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，933346-51(1996)；Furth等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，919302-6(1994))。可以使用的其它控制元件包括需要特定轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子，例如病毒啟動(dòng)子。加入這類啟動(dòng)子的載體可以僅在表達(dá)所需轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞中表達(dá)重組酶活性。
所述TRP基因序列也可以用來(lái)產(chǎn)生TRP基因產(chǎn)物。TRP基因產(chǎn)物可以包括代表功能等同的基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。這種等同的基因產(chǎn)物可以在本文所述基因序列所編碼的氨基酸序列中含有氨基酸殘基缺失、添加或取代，但這些導(dǎo)致沉默改變，因此產(chǎn)生功能等同的TRP基因產(chǎn)物?？梢愿鶕?jù)所涉及殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)方面的相似性來(lái)進(jìn)行氨基酸取代。
例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正電性(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；而負(fù)電性(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本文所用的“功能等同物”是指能夠顯示出體內(nèi)活性與所述TRP基因序列所編碼的內(nèi)源基因產(chǎn)物基本相似的蛋白質(zhì)?；蛘?，當(dāng)用作測(cè)定的一部分時(shí)，“功能等同物”可以指能夠以與內(nèi)源基因產(chǎn)物的相應(yīng)部分作用方式相似的方式與其它細(xì)胞分子或胞外分子相互作用的肽。
按照本發(fā)明方法有用的其它TRP蛋白產(chǎn)物是用重組法或合成法產(chǎn)生的由TRP衍生或基于TRP的肽(TRP衍生肽)。
也可以產(chǎn)生其中例如通過(guò)定點(diǎn)誘變有意擴(kuò)增所述三核苷酸區(qū)的突變型TRP蛋白。也可以使用在干細(xì)胞中通過(guò)酶輔助位點(diǎn)專一性整合擴(kuò)增的TRP。
可以采用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生TRP和擴(kuò)增型TRP基因產(chǎn)物。因此，本文描述了通過(guò)表達(dá)編碼基因序列的核酸制備本發(fā)明的基因多肽和肽的方法?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，構(gòu)建含有基因蛋白編碼序列和合適轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)重組/遺傳重組(參見例如Sambrook等，1989，參見上文，和Ausubel等，1989，參見上文)?；蛘?，使用例如自動(dòng)合成儀，可以化學(xué)合成能夠編碼基因的蛋白序列的RNA(參見例如Oligonucleotide SynthesisA PracticalApproach，Gait，M.J.編著，IRL Press，Oxford(1984))。
可以利用各種各樣的宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)，來(lái)表達(dá)本發(fā)明的基因編碼序列。這類宿主-表達(dá)系統(tǒng)代表可以用來(lái)產(chǎn)生目的編碼序列并且隨后進(jìn)行純化的載體、但也代表當(dāng)用所述合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)可以原位表現(xiàn)出本發(fā)明的基因蛋白的細(xì)胞。這些包括但不限于用含有基因蛋白編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物例如細(xì)菌(例如大腸桿菌、枯草桿菌)；用含有所述基因蛋白編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia))；用含有所述基因蛋白編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用含有基因蛋白編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒CaMV；煙草花葉病毒，TMV)感染的或用含有基因蛋白編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或帶有含得自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或得自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如腺病毒晚期啟動(dòng)子；痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子)的重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，最好可以根據(jù)待表達(dá)基因蛋白的計(jì)劃的應(yīng)用，對(duì)多種表達(dá)載體進(jìn)行選擇。例如，當(dāng)要產(chǎn)生大量的這種蛋白質(zhì)以產(chǎn)生抗體或篩選肽文庫(kù)時(shí)，可能最好是例如指導(dǎo)高水平容易純化的融合蛋白產(chǎn)物表達(dá)的載體。這類載體包括但不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther和Muller-Hill，EMBO J.，21791-94(1983))，其中所述基因蛋白編碼序列可以單獨(dú)地與lac Z編碼區(qū)符合讀框地連接到所述載體中，使得產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye和Inouye，Nucleic Acids Res.，133101-09(1985)；Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.，2645503-9(1989))等。也可以用pGEX載體來(lái)表達(dá)作為與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合的融合蛋白的外源多肽。一般而言，這類融合蛋白是可溶性的，通過(guò)吸附至谷胱甘肽-瓊脂糖微珠、然后在游離谷胱甘肽存在下洗脫，可以容易地從裂解細(xì)胞中純化。設(shè)計(jì)pGEX載體，使其包括凝血酶或因子X(jué)a蛋白酶切割位點(diǎn)，使得所克隆的靶基因蛋白可以從GST部分釋放出來(lái)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，采用標(biāo)準(zhǔn)PCR法(Innis等(編著)PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications，Academic Press，SanDiego(1990))，在氨基末端與Bam HI位點(diǎn)以及在羧基末端與Eco RI位點(diǎn)符合讀框地加入全長(zhǎng)cDNA序列，并且連接到pGEX-2TK載體(Pharmacia，Uppsala，Sweden)中。所得的cDNA構(gòu)建體在氨基末端含有一個(gè)用于放射性標(biāo)記的激酶識(shí)別位點(diǎn)以及在羧基末端含有用于親和純化的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶序列(Nilsson等，EMBO J.，41075-80(1985)；Zabeau和Stanley，EMBO J.，11217-24(1982))。
在昆蟲系統(tǒng)中，用苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)作為表達(dá)外源基因的載體。該病毒在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞中生長(zhǎng)?？梢詫⑺龌蚓幋a序列單獨(dú)克隆到該病毒的非必需區(qū)(例如多角體蛋白基因)，并置于AcNPV啟動(dòng)子(例如多角體蛋白啟動(dòng)子)的控制之下。成功插入基因編碼序列，將導(dǎo)致多角體蛋白基因失活，并產(chǎn)生非包含體型重組病毒(即缺乏多角體蛋白基因編碼的蛋白性外殼)。然后，用這些重組病毒感染草地貪夜蛾細(xì)胞，在此表達(dá)所插入的基因(參見例如Smith等，J.Virol.46584-93(1983)；Smith，美國(guó)專利第4,745,051號(hào))。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以利用多種基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在用腺病毒作為表達(dá)載體的情況下，可以將目的基因編碼序列連接于腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體，例如晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。然后通過(guò)體外或體內(nèi)重組，將這種嵌合基因插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組的非必需區(qū)(例如E1區(qū)或E3區(qū))中，將產(chǎn)生有活力并且能夠在受感染宿主中表達(dá)基因蛋白的重組病毒(參見例如Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，813655-59(1984))。所插入的基因編碼序列的有效翻譯，也可能需要特定的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和鄰近的序列。在將包括自身起始密碼子和鄰近序列的完整基因插入合適表達(dá)載體的情況下，可能不需要額外的翻譯控制信號(hào)。然而，在僅插入所述基因編碼序列的一部分的情況下，必須提供外源翻譯控制信號(hào)，也許包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子必須與所需編碼序列符合讀框，以確保翻譯完整的插入片段。這些外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以具有多種來(lái)源，可以是天然的和合成的。通過(guò)包括合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等，可以增強(qiáng)表達(dá)效率(參見Bitter等，Methods in Enzymol.，153516-44(1987))。
另外，可以選擇調(diào)節(jié)所插入序列的表達(dá)、或以特定所需方式修飾和加工所述基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白產(chǎn)物的這類修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)對(duì)于所述蛋白的功能可能是重要的。不同的宿主細(xì)胞具有蛋白的翻譯后加工和修飾的特征性和特定的機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保正確的修飾和加工所表達(dá)的外源蛋白。為此，可以使用具有初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的正確加工、所述基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。這類哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38等。
對(duì)于重組蛋白的長(zhǎng)期高產(chǎn)的生產(chǎn)，最好是穩(wěn)定的表達(dá)。例如，對(duì)穩(wěn)定表達(dá)所述基因蛋白的細(xì)胞系進(jìn)行工程改造。不用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，而是用由合適表達(dá)控制元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等)控制的DNA和選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在導(dǎo)入外源DNA后，可以讓工程細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)換到選擇培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)記提供對(duì)所述選擇的抗性，使得在染色體中穩(wěn)定整合所述質(zhì)粒的細(xì)胞可以生長(zhǎng)，形成轉(zhuǎn)化灶，進(jìn)而將所述轉(zhuǎn)化灶克隆并發(fā)展為細(xì)胞系。這種方法可以有利地用來(lái)工程改變表達(dá)所述基因蛋白的細(xì)胞系。這類工程細(xì)胞系在影響所述基因蛋白內(nèi)源活性的化合物的篩選和評(píng)估方面尤其有用。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述重組蛋白的表達(dá)時(shí)間和/或表達(dá)量的控制可以采用誘導(dǎo)型表達(dá)構(gòu)建體來(lái)控制。誘導(dǎo)型構(gòu)建體和用于誘導(dǎo)型表達(dá)重組蛋白的系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。這類誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其它基因調(diào)節(jié)元件的實(shí)例包括但不限于四環(huán)素效應(yīng)啟動(dòng)子、金屬硫蛋白效應(yīng)啟動(dòng)子、蛻皮激素效應(yīng)啟動(dòng)子和其它類固醇效應(yīng)啟動(dòng)子、雷帕霉素效應(yīng)啟動(dòng)子等(No等，Proc.Natl.Acad Sci.USA，933346-51(1996)；Furth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，919302-6(1994))。可以使用的其它控制元件包括需要特定轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子，例如病毒啟動(dòng)子，特別是HIV啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用Tet誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)。(Gossen和Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895547-51(1992)；Gossen等，Science，2681766-69(1995))。Tet表達(dá)系統(tǒng)基于得自大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子的四環(huán)素抗性操縱子的兩個(gè)調(diào)節(jié)元件-四環(huán)素阻抑蛋白(TetR)和TetR結(jié)合的四環(huán)素操縱基因序列(tetO)。使用這種系統(tǒng)，可以將所述重組蛋白的表達(dá)置于tetO操縱基因序列的控制之下，將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。在共轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的TetR存在下，由于TetR蛋白與tetO調(diào)節(jié)元件結(jié)合，因此所述重組蛋白的表達(dá)受到阻抑。然后，對(duì)不同濃度的與tetO元件競(jìng)爭(zhēng)與TetR結(jié)合的四環(huán)素(Tc)或Tc衍生物(例如強(qiáng)力霉素(Dox))應(yīng)答，可以誘導(dǎo)出高水平的受調(diào)節(jié)的基因表達(dá)。用于tet誘導(dǎo)型基因表達(dá)的構(gòu)建體和材料在市場(chǎng)上可得自CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo，Alto，CA。
當(dāng)用作測(cè)定系統(tǒng)的組分時(shí)，可以將所述基因蛋白或者直接或者間接地標(biāo)記，以便于檢測(cè)所述基因蛋白和試驗(yàn)物質(zhì)之間形成的復(fù)合物?？梢允褂枚喾N合適標(biāo)記系統(tǒng)中的任一種，包括但不限于放射性同位素例如125I；當(dāng)暴露于底物時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)比色(calorimetric)信號(hào)或光的酶標(biāo)記系統(tǒng)；和熒光標(biāo)記。
在使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生用于這類測(cè)定系統(tǒng)的基因蛋白的情況下，可能最好是對(duì)融合蛋白進(jìn)行工程改造，這可以便于標(biāo)記、固定化和/或檢測(cè)。
間接標(biāo)記涉及應(yīng)用與任一基因產(chǎn)物特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，例如標(biāo)記的抗體。這類抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段。
本文描述了用于生產(chǎn)能夠特異性地識(shí)別一種或多種基因表位的抗體的方法。這類抗體可能包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體和任一種上述抗體的表位結(jié)合片段。這類抗體可以用來(lái)例如檢測(cè)生物樣品中的靶TRP基因，或者用作抑制異常靶基因活性的方法。因此，這類抗體可以用作疾病治療方法的一部分，和/或可以用作檢驗(yàn)患者異常靶TRP基因蛋白水平或異常形式的這類蛋白存在的診斷技術(shù)的一部分。
關(guān)于針對(duì)基因的抗體的生產(chǎn)，可以通過(guò)注射TRP蛋白或其部分，免疫各種宿主動(dòng)物。這類宿主動(dòng)物可以包括但不限于兔、小鼠和大鼠，這僅例舉了幾個(gè)實(shí)例。根據(jù)宿主的物種，可以使用各種佐劑來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述佐劑包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、礦物凝膠例如氫氧化鋁、表面活性劑例如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyol)、聚陰離子、肽類、油乳液、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚和潛在有用的人用佐劑，例如BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)。
多克隆抗體是從用抗原(例如靶基因產(chǎn)物)或其抗原性功能衍生物免疫的動(dòng)物血清獲得的不均一的抗體分子群體。對(duì)于多克隆抗體的生產(chǎn)，可以通過(guò)注射補(bǔ)充有如上所述的佐劑的基因產(chǎn)物免疫宿主動(dòng)物，例如如上所述的動(dòng)物。
作為抗特定抗原的均一抗體群體的單克隆抗體，可以采用用于在培養(yǎng)物中由連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)獲得。這些技術(shù)包括但不限于Khler和Milstein(Nature，256495-7(1975)和美國(guó)專利第4,376,110號(hào))的雜交瘤技術(shù)；人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，Immunology Today，472(1983)；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，802026-30(1983))；和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，Monoclohal AntibodiesAnd Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，New York，第77-96頁(yè)(1985))。這類抗體可以屬于任何類別的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亞類。生產(chǎn)本發(fā)明mAb的雜交瘤可以在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。在體內(nèi)產(chǎn)生高效價(jià)的mAb構(gòu)成了本發(fā)明優(yōu)選的生產(chǎn)方法。
另外，可以使用開發(fā)用于產(chǎn)生“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855(1984)；Tekeda等，Nature，314452-54(1985))，該技術(shù)通過(guò)將來(lái)自具合適抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與來(lái)自具合適生物活性的人類抗體分子的基因剪接在一起，產(chǎn)生“嵌合抗體”。嵌合抗體是其中不同的部分來(lái)源于不同動(dòng)物物種的分子，例如具有來(lái)源于鼠類mAb的可變區(qū)和人類免疫球蛋白的恒定區(qū)的分子。
或者，可以采用描述的產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利第4,946,778號(hào)；Bird，Science 242423-36(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-83(1988)；和Ward等，Nature，334544-46(1989))，來(lái)生產(chǎn)基因-單鏈抗體。單鏈抗體是通過(guò)將Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段通過(guò)氨基酸橋連接產(chǎn)生單鏈多肽而形成的。
識(shí)別特定表位的抗體片段可以采用已知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，這類片段包括但不限于F(ab’)2片段，它通過(guò)用胃蛋白酶消化所述抗體分子而產(chǎn)生的；和Fab片段，它通過(guò)還原F(ab’)2片段的二硫橋而產(chǎn)生。或者，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(Huse等，Science，2461275-81(1989))，以便快速容易地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段。
本文描述了可以用作疾病模型的基于細(xì)胞和基于動(dòng)物的系統(tǒng)。包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、微型豬(micro-pig)、山羊和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如狒狒、猴子和黑猩猩)的任何物種的動(dòng)物，都可以用來(lái)產(chǎn)生疾病動(dòng)物模型。另外，可以使用得自人類的細(xì)胞。這些系統(tǒng)可以用于各種各樣的應(yīng)用中。例如，基于細(xì)胞和基于動(dòng)物的模型系統(tǒng)可以用來(lái)進(jìn)一步鑒定TRP基因。這類測(cè)定可以用作篩選策略的一部分，其中所述策略設(shè)計(jì)用來(lái)鑒定能夠緩解病癥的化合物。因此，可以用基于動(dòng)物和基于細(xì)胞的模型，來(lái)鑒定在治療疾病中有效的藥物、藥劑、療法和干涉。
含有并表達(dá)編碼TRP的靶基因序列、以及進(jìn)一步顯示出與疾病相關(guān)的細(xì)胞表型的細(xì)胞，可以用來(lái)鑒定顯示出抗病活性的化合物。
這類細(xì)胞可以包括非重組單核細(xì)胞細(xì)胞系，例如U937(ATCC#CRL-1593)、THP-1(ATCC#TIB-202)和P388D1(ATCC#TIB-63)；內(nèi)皮細(xì)胞，例如HUVEC和牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)；以及一般的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，例如HeLa細(xì)胞和COS細(xì)胞，例如COS-7(ATCC#CRL-1651)。此外，這類細(xì)胞可以包括重組、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。例如，本發(fā)明的敲除小鼠可以用來(lái)產(chǎn)生可以用作疾病的細(xì)胞培養(yǎng)物模型的細(xì)胞系，包括與疾病相關(guān)的一種或多種細(xì)胞類型。雖然可以利用來(lái)源于本發(fā)明的疾病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞、組織和原代培養(yǎng)物，但最好是產(chǎn)生連續(xù)細(xì)胞系。關(guān)于可以用來(lái)從所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物得到連續(xù)細(xì)胞系的技術(shù)的實(shí)例，參見Small等，Mol.Cell Biol.，5642-48(1985)。
可以將靶基因序列導(dǎo)入目的細(xì)胞的基因組中，或在所述基因組中過(guò)量表達(dá)，或者如果存在內(nèi)源靶基因序列，則可以或者使其過(guò)量表達(dá)，或者將其破壞，以使靶基因的表達(dá)表達(dá)不足或使其失活。
為了過(guò)量表達(dá)靶基因序列，可以將靶基因序列的編碼部分與能夠在目的細(xì)胞類型中驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列連接。這類調(diào)節(jié)區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，可以在不用過(guò)多實(shí)驗(yàn)的情況下利用。
為了使內(nèi)源靶基因序列表達(dá)不足，可以分離出這種序列并對(duì)其進(jìn)行工程改造，使得當(dāng)將其再導(dǎo)入目的細(xì)胞類型的基因組中時(shí)，所述內(nèi)源靶基因等位基因被失活。最好是，通過(guò)基因打靶導(dǎo)入工程靶基因序列，使得將所述工程靶基因序列整合到所述細(xì)胞的基因組中時(shí)，內(nèi)源靶基因序列被破壞。
可以檢查用靶基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的與疾病相關(guān)的表型。
經(jīng)分析鑒定的化合物可以用以例如詳細(xì)闡述靶基因產(chǎn)物的生物功能以及緩解疾病。在病癥的病因是靶基因表達(dá)和/或靶基因產(chǎn)物在細(xì)胞或組織中的總體水平較低的情況下，與所述靶基因產(chǎn)物相互作用的化合物可以包括增強(qiáng)或放大結(jié)合的靶基因蛋白活性的化合物。這類化合物可能導(dǎo)致有效提高靶基因產(chǎn)物的活性水平，因而緩解癥狀。
可以設(shè)計(jì)體外系統(tǒng)，以鑒定能夠結(jié)合靶TRP基因或擴(kuò)增型TRP基因的化合物。這類化合物可以包括但不限于由D-和/或L-構(gòu)型的氨基酸組成的肽(例如隨機(jī)肽文庫(kù)的形式；參見例如Lam等，Nature，35482-4(1991))、磷酸肽(例如為隨機(jī)或部分簡(jiǎn)并的定向磷酸肽文庫(kù)形式；參見例如Songyang等，Cell，72767-78(1993))、抗體和小的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子。經(jīng)鑒定的化合物可以用于例如調(diào)節(jié)靶基因蛋白的活性、最好是突變型靶基因蛋白的活性，可以用于詳細(xì)闡述靶基因蛋白的生物功能，可以用于鑒定破壞正常靶基因相互作用的化合物的篩選中，或其本身可以破壞這類相互作用。
用來(lái)鑒定與靶基因蛋白結(jié)合的化合物的測(cè)定的原理，包括制備靶基因蛋白或擴(kuò)增型靶基因蛋白和試驗(yàn)化合物在足以允許所述兩種組分相互作用和結(jié)合的條件和時(shí)間下的反應(yīng)混合物，由此在反應(yīng)混合物中形成可以被取出和/或檢測(cè)的復(fù)合物。這些測(cè)定可以以各種各樣的方式進(jìn)行。例如，進(jìn)行這種測(cè)定的一種方法涉及將所述靶基因蛋白或擴(kuò)增型靶基因蛋白或所述試驗(yàn)物質(zhì)錨定在固相上，并且在反應(yīng)結(jié)束時(shí)檢測(cè)錨定在固相上的靶基因蛋白或擴(kuò)增型靶基因蛋白/試驗(yàn)物質(zhì)復(fù)合物。在這種方法的一個(gè)實(shí)施方案中，可以將所述靶基因蛋白錨定在固體表面上，而將未錨定的所述試驗(yàn)化合物直接或間接標(biāo)記。
實(shí)際上，可方便地使用微量滴定板。被錨定的組分可以通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)連接而被固定化。非共價(jià)連接可以簡(jiǎn)單地通過(guò)用所述蛋白溶液包被所述固體表面并干燥來(lái)完成?；蛘撸梢杂脤?duì)所述蛋白特異性的固定化抗體、最好是單克隆抗體，將所述蛋白錨定到固體表面。所述表面可以預(yù)先制備和貯存。
為了進(jìn)行所述測(cè)定，將非固定化組分加入至含有錨定的組分的包被表面上。在反應(yīng)完成之后，在使得所形成的任何復(fù)合物保持固定化于固體表面的條件下，除去未反應(yīng)的組分(例如通過(guò)洗滌)。錨定于固體表面的復(fù)合物的檢測(cè)可以以多種方式完成。在對(duì)先前非固定化組分進(jìn)行預(yù)標(biāo)記的情況下，檢測(cè)到固定化于所述表面的標(biāo)記，指示形成了復(fù)合物。在對(duì)先前非固化組分不進(jìn)行預(yù)標(biāo)記的情況下，可以用間接標(biāo)記來(lái)檢測(cè)錨定于所述表面的復(fù)合物；例如采用對(duì)先前非固定化組分特異性的標(biāo)記抗體(可以進(jìn)而用標(biāo)記的抗Ig抗體對(duì)所述抗體直接或間接標(biāo)記)。
或者，可以在液相中進(jìn)行反應(yīng)，從未反應(yīng)組分中分離出反應(yīng)產(chǎn)物，檢測(cè)復(fù)合物；例如采用對(duì)靶基因產(chǎn)物或試驗(yàn)化合物特異性的固定化抗體來(lái)錨定溶液中形成的任何復(fù)合物，和用對(duì)可能的復(fù)合物的另一組分特異性的標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)錨定復(fù)合物。
可以對(duì)通過(guò)上述方法之一顯示出與特定靶基因產(chǎn)物結(jié)合的化合物，進(jìn)一步測(cè)試其從所述靶基因蛋白引發(fā)生化反應(yīng)的能力。
基于細(xì)胞的系統(tǒng)可以用來(lái)鑒定可以用來(lái)緩解病癥的化合物。例如，可以將這類細(xì)胞系統(tǒng)暴露于懷疑顯示出緩解病癥能力的化合物，所述化合物的濃度和暴露時(shí)間足以在經(jīng)暴露的細(xì)胞中引發(fā)這種病癥的緩解。在暴露之后，檢查細(xì)胞，以確定一種或多種所述疾病的細(xì)胞表型是否已經(jīng)改變?yōu)轭愃聘鼮檎；蚋咏吧偷姆羌膊”硇汀?br> 另外，基于動(dòng)物的疾病系統(tǒng)，例如本文所述的系統(tǒng)，可以用來(lái)鑒定能夠緩解病癥的化合物。這類動(dòng)物模型可以用作用于鑒定在治療所述動(dòng)物的疾病或其它特征性的表型方面有效的藥物、藥劑、療法和干涉的試驗(yàn)作用物。例如，可以將動(dòng)物模型暴露于懷疑顯示出緩解病癥能力的化合物或因子，所述化合物或因子的濃度和暴露時(shí)間足以在經(jīng)暴露的動(dòng)物中引發(fā)這種病癥的緩解?？梢酝ㄟ^(guò)評(píng)價(jià)與該疾病相關(guān)的病癥的逆轉(zhuǎn)，監(jiān)測(cè)所述動(dòng)物對(duì)該暴露的反應(yīng)。暴露可以包括在本文所述的模型動(dòng)物妊娠期間治療母畜，從而使胚胎或胎兒暴露于可以預(yù)防或緩解所述疾病或表型的化合物或因子。也可以對(duì)新生動(dòng)物、幼年動(dòng)物和成年動(dòng)物進(jìn)行暴露。
相似的病癥可能由多種病因所致。例如，軟骨發(fā)育不良包括一組寬范圍的骨畸形，其形成原因可能是生成缺陷型膠原蛋白、信號(hào)分子[胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)、Indianhedgehog(Ihh)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)]被破壞或者構(gòu)成軟骨基質(zhì)的蛋白聚糖(即聚集蛋白聚糖)異常。已描述的人類原發(fā)性骨病包括成骨不全(合成了缺陷型I型膠原蛋白)、粘多糖病(導(dǎo)致基質(zhì)異常的溶酶體貯積病)、Blomstrand軟骨發(fā)育不良(缺乏PTH/PTHrP激素和/或受體)、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良(缺陷型IX型膠原蛋白)和Schmid干骺端軟骨發(fā)育不良(合成缺陷型X型膠原蛋白)。因?yàn)橛腥毕菪蛙浌呛?或軟骨基質(zhì)，所以礦化作用和骨生成減少。術(shù)語(yǔ)骨質(zhì)疏松用來(lái)指骨質(zhì)量的總體減少，包括原發(fā)性病癥和繼發(fā)性病癥。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥包括特發(fā)性青少年骨質(zhì)疏松、特發(fā)性中年(middle adulthood)骨質(zhì)疏松、經(jīng)絕后骨質(zhì)疏松和老年骨質(zhì)疏松?？梢詫?dǎo)致骨質(zhì)疏松的繼發(fā)性病癥包括內(nèi)分泌性疾病(甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺機(jī)能減退、性腺機(jī)能減退、肢端肥大癥、庫(kù)欣病、I型糖尿病和艾迪生病)、胃腸病(吸收障礙、維生素C、D缺乏、營(yíng)養(yǎng)不良和肝功能不全)、慢性阻塞性肺病、戈謝病、貧血和高胱氨酸尿。除軟骨細(xì)胞外，成骨細(xì)胞在骨生成中也起重要作用。成骨細(xì)胞具有激素(PTH、維生素D、雌激素)、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的受體，并且分泌膠原性和非膠原性蛋白。非膠原性蛋白包括細(xì)胞粘著蛋白(骨橋蛋白、纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白)、鈣結(jié)合蛋白(骨粘連蛋白、骨涎蛋白)、參與礦化的蛋白(骨鈣蛋白)、酶(膠原酶和堿性磷酸酶)、生長(zhǎng)因子(IGF-1、TGF-B、PDGF)和細(xì)胞因子(前列腺素、IL-1、IL-6)。
此外，基質(zhì)的聚集蛋白聚糖(聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神經(jīng)蛋白聚糖和短蛋白聚糖)是胞外基質(zhì)的重要組分。目前已描述的聚集蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖的配體-fibulin-1(Aspberg等，J Biol Chem，27420444-9(1999))在發(fā)育中的軟骨和骨中強(qiáng)表達(dá)。
另一組癥狀-腎發(fā)育不良和發(fā)育不全，占兒童慢性腎衰竭的20％(Cotran等，Robbins Pathologic Basis of Disease，Saunders，Philadelphia(1994))。先天性腎病可以遺傳，但最常見的是妊娠期間產(chǎn)生的獲得性發(fā)育缺陷。在受影響的個(gè)體中，在小鼠中在妊娠8.5天至9天(相當(dāng)于人類的妊娠第22-24天)時(shí)尿生殖區(qū)別明顯。已經(jīng)假定，在發(fā)育期間，發(fā)育不良由異常的細(xì)胞分化所致，導(dǎo)致持續(xù)的細(xì)胞增殖和可能導(dǎo)致囊腫生成的跨上皮體液分泌(Grantham等(1993)Adv Intern Med 38409-20)或進(jìn)而影響上皮分化的胞外基質(zhì)缺陷(Calvet等，J Histochem Cytochem，411223-31(1993))。骨發(fā)育和腎發(fā)育共用的生長(zhǎng)因子包括胰島素樣生長(zhǎng)因子和BMP。然而，因?yàn)殁}/磷和酸/堿失調(diào)，所以慢性腎衰竭也可以影響骨生成。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，給定的因子可能有效緩解由不相干的病因引起的相似癥狀。因此，給定因子可以用于治療多種疾病。
在可能顯示出緩解病癥能力的因子中，有反義分子、核酶分子和三股螺旋分子。可以設(shè)計(jì)這類分子，以降低或抑制突變型靶基因活性。產(chǎn)生和使用這類分子的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
反義RNA和DNA分子的作用是通過(guò)與所靶向的mRNA雜交并阻止蛋白翻譯，而直接阻斷mRNA的翻譯。關(guān)于反義DNA，最好是源自翻譯起始位點(diǎn)即目的靶基因核苷酸序列的-10和+10區(qū)之間的寡脫氧核糖核苷酸。
核酶是能夠催化RNA特異性切割的酶性RNA分子。核酶的作用機(jī)理包括核酶分子與互補(bǔ)靶RNA的序列特異性雜交，然后進(jìn)行內(nèi)切核酸酶酶切。核酶分子的組成必須包括與靶基因mRNA互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)序列，并且必須包括負(fù)責(zé)mRNA切割的眾所周知的催化序列。關(guān)于這種序列，參見美國(guó)專利第5,093,246號(hào)，該專利通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。因此，特異性地有效催化編碼靶基因蛋白的RNA序列的內(nèi)切核酸酶切割的工程錘頭基序核酶分子屬于本發(fā)明的范圍。
通過(guò)掃描目的分子的核酶切割位點(diǎn)(所述核酶切割位點(diǎn)包括以下序列GUA、GUU和GUC)，可初步鑒定任何潛在RNA靶內(nèi)的特異性核酶切割位點(diǎn)。一旦鑒定出，根據(jù)可能使得所述寡核苷酸序列不合適的預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)特征，例如二級(jí)結(jié)構(gòu)，則可以對(duì)與含該切割位點(diǎn)的靶基因區(qū)相應(yīng)的15-20個(gè)核糖核苷酸的短RNA序列進(jìn)行評(píng)估。也可以通過(guò)用核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定，測(cè)試其與互補(bǔ)寡核苷酸雜交的可及性，評(píng)估候選序列的合適性。
待用于形成三股螺旋以抑制轉(zhuǎn)錄的核酸分子應(yīng)該是單鏈的，并且由脫氧核糖核苷酸組成。必須對(duì)這些寡核苷酸的堿基組成進(jìn)行設(shè)計(jì)，以通過(guò)Hoogsteen堿基配對(duì)原則促進(jìn)三股螺旋的形成，這一般需要在雙鏈體的一條鏈上存在相當(dāng)大的或者嘌呤或者嘧啶的序列段。核苷酸序列可以由嘧啶堿基組成的，這將產(chǎn)生跨越所產(chǎn)生的三股螺旋的三條相連鏈的TAT和CGC三聯(lián)體。富含嘧啶的分子提供與雙鏈體一條鏈的富含嘌呤區(qū)的平行方向的堿基互補(bǔ)性。另外，可以選擇富含嘌呤、例如含有G殘基序列段的核酸分子。這些分子將與富含GC對(duì)、其中大部分嘌呤殘基位于靶向的雙鏈體的一條鏈上的DNA雙鏈體形成三股螺旋，產(chǎn)生跨越所述三股螺旋的三條鏈的GGC三聯(lián)體。
或者，通過(guò)產(chǎn)生所謂的“之字形路線(switchback)”核酸分子，可以增加可以靶向形成三股螺旋的潛在序列。以交替的5’-3’、3’-5’方式合成之字形路線分子，使得它們首先與雙鏈體的一條鏈進(jìn)行堿基配對(duì)，然后與另一條鏈進(jìn)行堿基配對(duì)，消除了對(duì)于在雙鏈體的一條鏈上存在或者嘌呤或者嘧啶的相當(dāng)大的序列段的必要性。
本文所述的反義分子、核酶分子和/或三股螺旋分子有可能降低或抑制由正常和突變型兩種靶基因等位基因產(chǎn)生的mRNA的轉(zhuǎn)錄(三股螺旋)和/或翻譯(反義、核酶)。為了確保維持基本正常水平的靶基因活性，可以將編碼并表達(dá)顯示出正?；钚缘陌谢蚨嚯牡暮怂岱肿?，導(dǎo)入到不含對(duì)所利用的反義、核酶或三股螺旋的任一種處理敏感的序列的細(xì)胞中?；蛘?，可能最好是將正常的靶基因蛋白共同給予所述細(xì)胞或組織，以維持必需水平的細(xì)胞或組織靶基因活性。
本發(fā)明的反義RNA和DNA分子、核酶分子和三股螺旋分子可以采用本領(lǐng)域已知用于合成DNA和RNA分子的任何方法來(lái)制備。這些包括本領(lǐng)域眾所周知的用于化學(xué)合成寡脫氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技術(shù)，例如固相亞磷酰胺化學(xué)合成?；蛘?，可以通過(guò)體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄編碼所述反義RNA分子的DNA序列，產(chǎn)生RNA分子?？梢詫⑦@類DNA序列加入到各種各樣的加入了合適RNA聚合酶啟動(dòng)子例如T7或SP6聚合酶啟動(dòng)子的載體中?；蛘?，可以將根據(jù)所用的啟動(dòng)子組成型或誘導(dǎo)型合成反義RNA的反義cDNA構(gòu)建體，穩(wěn)定導(dǎo)入到細(xì)胞系中。
可以引入對(duì)所述DNA分子的各種熟知的修飾，作為增加胞內(nèi)穩(wěn)定性和半壽期的手段?？赡艿男揎棸ǖ幌抻趯?cè)翼核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸序列添加到所述分子的5’端和/或3’端，或在寡脫氧核糖核苷酸骨架中應(yīng)用硫代磷酸酯鍵合或2’O-甲基鍵合，而不是磷酸二酯鍵。
對(duì)靶基因蛋白具有特異性并且干擾其活性的抗體，可以用來(lái)抑制靶基因功能。對(duì)擴(kuò)增型靶基因蛋白特異性并且干擾該蛋白的特有相互作用(尤其是可歸因于新獲得與三核苷酸擴(kuò)增相關(guān)功能的功能)的抗體，也可以用來(lái)抑制擴(kuò)增型靶基因功能。尤其感興趣的是針對(duì)TRP的擴(kuò)增型三核苷酸區(qū)的抗體?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)，產(chǎn)生針對(duì)蛋白質(zhì)本身或針對(duì)對(duì)應(yīng)于所述蛋白部分的肽的這類抗體。這類抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、Fab片段、單鏈抗體、嵌合抗體等。
在所述靶基因蛋白是胞內(nèi)蛋白并且使用完整抗體的情況下，可以最好使用內(nèi)化抗體。然而，可以用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體將與靶基因表位結(jié)合的抗體或Fab區(qū)片段傳遞到細(xì)胞中。當(dāng)使用抗體片段時(shí)，最好使用與所述靶蛋白或擴(kuò)增型靶蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的最小的抑制性片段。例如，可以使用其氨基酸序列對(duì)應(yīng)于與靶基因蛋白結(jié)合的抗體可變區(qū)的結(jié)構(gòu)域的肽?？梢曰瘜W(xué)合成這類肽，或采用本領(lǐng)域眾所周知的方法通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生這類肽(參見例如Creighton，ProteinsStructures and Molecular Principles(1984)W.H.Freeman，New York 1983，參見上文；和Sambrook等，1989，參見上文)?；蛘?，也可以給予與胞內(nèi)靶基因表位結(jié)合的單鏈中和抗體。例如，可以采用例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907889-93(1993)中描述的技術(shù)，通過(guò)在靶細(xì)胞群體內(nèi)表達(dá)編碼單鏈抗體的核苷酸序列，給予這類單鏈抗體。
對(duì)所述TRP或擴(kuò)增型TRP的一個(gè)或多個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域特異性并且干擾其活性的抗體，在治療疾病方面尤其有用。這類抗體尤其有效，因?yàn)樗鼈兛梢灾苯訌难鹘咏霭薪Y(jié)構(gòu)域。下述的適用于肽給予的任何給藥技術(shù)，都可以用來(lái)有效地將抑制性靶基因抗體給予其作用部位。
可以直接給予表現(xiàn)出病癥的患者編碼靶基因蛋白的RNA序列，其給藥濃度足以產(chǎn)生使得病癥得以緩解的靶基因蛋白水平。
可以通過(guò)基因取代療法來(lái)治療患者。除將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的其它粒子(例如脂質(zhì)體)外，可以利用包括但不限于腺病毒、腺相關(guān)病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒的載體，將指導(dǎo)具有靶基因功能的正常靶基因蛋白產(chǎn)生的正常靶基因或所述基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝，插入到細(xì)胞中。另外，例如上述的技術(shù)可以用來(lái)將正常靶基因序列導(dǎo)入人類細(xì)胞中。
可以將含有正常靶基因表達(dá)基因序列的細(xì)胞，最好是自體細(xì)胞，在使得可以緩解病癥的部位導(dǎo)入或再導(dǎo)入所述患者體內(nèi)。
可以將已鑒定的抑制靶基因表達(dá)或擴(kuò)增型靶基因表達(dá)、合成和/或活性的化合物，以治療或緩解所述疾病的治療有效量給予患者。治療有效量是指足以導(dǎo)致病癥緩解的化合物的量。
可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法，在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體內(nèi)，測(cè)定這類化合物的毒性和治療功效，例如測(cè)定LD50(使所述群體的50％致死的劑量)和ED50(在所述群體的50％中治療有效的劑量)。毒性效應(yīng)和治療效應(yīng)之間的劑量比是治療指數(shù)，它可以以LD50/ED50之比來(lái)表示。優(yōu)選顯示出治療指數(shù)大的化合物。雖然可以使用顯示出毒性副作用化合物，但應(yīng)該小心設(shè)計(jì)將這類化合物靶向受影響組織的部位的傳遞系統(tǒng)，以便最大限度地減小對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損害，從而降低副作用。
由細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)，可以用來(lái)制定用于人類的劑量范圍。這類化合物的劑量最好在包括在ED50內(nèi)的毒性很小或無(wú)毒的循環(huán)濃度范圍。根據(jù)所用的劑型和所用的給藥途徑，該劑量可以在該范圍內(nèi)變動(dòng)。就用于本發(fā)明方法中所用的任何化合物而言，可以根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定，初步估計(jì)治療有效量。可以在動(dòng)物模型中確定劑量，以達(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定的IC50(即達(dá)到癥狀的半最大抑制的試驗(yàn)化合物的濃度)內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍。這種信息可以用來(lái)更為精確地確定在人體內(nèi)的有用劑量。例如可以通過(guò)高效液相色譜，測(cè)量血漿水平。
可以以常規(guī)方式，用一種或多種生理上可接受的載體或賦形劑，配制按照本發(fā)明使用的藥用組合物。因此，可以配制所述化合物及其生理上可接受的鹽和溶劑合物，用于吸入或吹入給藥(或者經(jīng)口或者通過(guò)經(jīng)鼻)或經(jīng)口、口腔含化、胃腸外、局部、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、胸膜內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或直腸給藥。也考慮了藥用組合物可以與增強(qiáng)所述化合物活性的其它制品一起給予，所述藥用組合物可任選地可以包括其它治療組分。
就口服而言，所述藥用組合物可以采用例如以常規(guī)方式用藥學(xué)上可接受的賦形劑制備的片劑或膠囊的形式，所述賦形劑例如為粘合劑(例如預(yù)膠凝化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)、填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化硅)、崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉甘醇酸鈉)、或潤(rùn)濕劑(例如十二烷基硫酸鈉)。片劑可以用本領(lǐng)域熟知的方法包衣。用于口服的液體制劑可以采用例如溶液劑、糖漿劑或懸浮劑的形式，或它們可以作為在使用之前用水或其它合適的溶媒重建的干制品?？梢杂贸Ｒ?guī)方法，用藥學(xué)上可接受的添加劑制備這類液體制劑，所述添加劑例如為懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)、乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯樹膠)、非水溶媒(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分級(jí)植物油)和防腐劑(例如對(duì)羥基苯甲酸或山梨酸甲酯或丙酯)。所述制劑合適時(shí)也可以含有緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。
可以適當(dāng)?shù)嘏渲朴糜诳诜闹苿?，以提供所述活性化合物的控釋?br> 對(duì)于口腔含化給藥，所述組合物可以采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。
對(duì)于吸入給藥，應(yīng)用合適的噴射劑，可方便地從加壓包裝或噴霧器以氣霧劑方式傳遞按照本發(fā)明使用的化合物，所述噴射劑例如為二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。就加壓氣霧劑而論，可以通過(guò)提供一個(gè)閥以傳遞一個(gè)計(jì)量量，測(cè)定劑量單位?？梢耘渲朴糜谖肫骰虼等肫鞯摹⒑兴龌衔锏姆勰┖蟿┖秃线m的粉末基質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的膠囊或藥筒。
可以配制所述化合物，用于通過(guò)注射(例如大劑量注射或連續(xù)輸注)胃腸外給藥。注射用制劑可以以單位劑型存在，例如存在于安瓿或多劑量容器中，并加有一種防腐劑。所述組合物可以采用諸如油性或水性溶媒中的懸浮劑、溶液劑或乳劑的形式，可以含有配制用藥劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。或者，有效成分可以為在使用之前用合適溶媒(例如無(wú)菌無(wú)熱原水)重建的粉末形式。
所述化合物也可以配制為直腸組合物，例如栓劑或保留灌腸劑(retention enemas)，例如含有常規(guī)栓劑基質(zhì)例如可可脂或其它甘油酯。經(jīng)口攝入可能是攝入任何藥物的最容易的方法。這種給藥途徑一般簡(jiǎn)單且直接，而且從患者的觀點(diǎn)來(lái)看，這通常是不便性或令人不愉快的程度最低的給藥途徑。然而，這涉及到讓所述物質(zhì)通過(guò)胃，而胃對(duì)于包括蛋白質(zhì)和其它生物活性組合物在內(nèi)的許多物質(zhì)而言是不利的環(huán)境。由于胃的酸性、水解和蛋白水解環(huán)境已經(jīng)有效地形成，將蛋白性物質(zhì)消化為氨基酸和寡肽以用于隨后的合成代謝，所以可以意料，非常少的或者各種各樣的生物活性蛋白性物質(zhì)中的任一種如果是單獨(dú)地經(jīng)口攝入，則機(jī)體將讓其通過(guò)胃以在小腸吸收。其結(jié)果是，許多蛋白性藥物必須通過(guò)另一種方法攝入，例如通過(guò)胃腸外攝入，通常通過(guò)皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。
藥用組合物也可以包括各種緩沖劑(例如Tris、乙酸鹽、磷酸鹽)、增溶劑(例如Tween、聚山梨醇酯)、載體(例如人血清白蛋白)、防腐劑(硫柳汞、苯甲醇)和抗氧化劑(例如抗壞血酸)，以便穩(wěn)定藥物活性。穩(wěn)定劑可以是去垢劑，例如吐溫-20、吐溫-80、NP-40或Triton X-100。也可以將EBP加入到特定的聚合化合物制劑中，以便在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)受控制地傳遞給患者。在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro編著，Mack Publishing，Easton，Pa.(1990)中，可找到對(duì)藥用組合物的組分更為廣泛的調(diào)查。
除前述制劑外，所述化合物也可以配制為緩釋型制劑。這類長(zhǎng)效制劑可以通過(guò)植入(例如皮下或肌內(nèi))或通過(guò)肌內(nèi)注射給藥。因此，例如，可以將所述化合物與合適的聚合物質(zhì)或疏水性物質(zhì)(例如作為可接受油中的乳劑)或離子交換樹脂一起配制，或配制為略溶性衍生物，例如配制為略溶性鹽。
如有必要，所述組合物可以存在于包裝或分配裝置(dispenserdevice)中，所述包裝或裝置可以含有含所述有效成分的一個(gè)或多個(gè)單位劑型。所述包裝可以例如包含金箔或塑料箔，例如泡罩片。所述包裝或分配裝置可以伴有給藥說(shuō)明。
可以用多種方法診斷與TRP相關(guān)的病癥。具體地說(shuō)，可以使用例如用于檢測(cè)靶基因突變存在或檢測(cè)靶基因mRNA或者過(guò)量表達(dá)或者表達(dá)不足的試劑。
可以例如通過(guò)利用包含至少一種本文所述的特定基因核酸或抗基因抗體試劑的預(yù)包裝診斷試劑盒，進(jìn)行本文所述方法，所述試劑盒可以例如在臨床環(huán)境中方便地用來(lái)診斷顯示出病癥或有疾病發(fā)生危險(xiǎn)的患者。
在下述的診斷中，可以利用其中表達(dá)所述基因的任何細(xì)胞類型或組織，最好是單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞。
得自待分析的細(xì)胞類型或組織的DNA或RNA可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，容易地分離出。也可以在從活組織檢查或切除術(shù)獲得的患者組織的組織切片(經(jīng)固定和/或冷凍的)上，原位直接進(jìn)行診斷程序，因此不必進(jìn)行核酸的純化。核酸試劑可以用作這種原位程序(參見例如Nuovo，PCR In Situ HybridizationProtocols andAppications，Raven Press，N.Y.(1992))的探針和/或引物。
基因的核苷酸序列，或者RNA或者DNA，可以例如用于生物樣品的雜交測(cè)定或擴(kuò)增測(cè)定中，以檢測(cè)疾病相關(guān)的基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)。這類測(cè)定可以包括但不限于DNA印跡分析或RNA印跡分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、原位雜交測(cè)定和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析。這類分析可以揭示出所述基因表達(dá)模式的定量方面以及所基因表達(dá)和/或基因組成的定性方面。也就是說(shuō)，這些方面可以包括例如點(diǎn)突變、插入、缺失、染色體重排和/或所述基因表達(dá)的激活或失活。
用于檢測(cè)基因特異性核酸分子的優(yōu)選診斷方法可以例如包括使得自所分析細(xì)胞類型或組織的核酸與一種或多種標(biāo)記的核酸試劑在適合于使這些試劑與目的核酸分子內(nèi)的其互補(bǔ)序列特異性退火的條件下接觸和保溫。最好是，這些核酸試劑的長(zhǎng)度至少為9-30個(gè)核苷酸。在保溫后，從所述核酸指紋分子雜交體中除去所有未退火的核酸。然后檢測(cè)來(lái)自所述指紋組織的已經(jīng)雜交的核酸的存在(如果任何這類分子存在的話)。采用這種檢測(cè)方案，可以將來(lái)自目的組織或細(xì)胞類型的核酸固定化至例如固相支持體例如膜或塑料表面，例如固定化至微量滴定板或聚苯乙烯微珠上。在這種情況下，在保溫后，可容易地除去非退火的標(biāo)記核酸試劑。用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，完成保留的、退火的、標(biāo)記的核酸試劑的檢測(cè)。
用于檢測(cè)基因特異性核酸分子的可供選擇的診斷方法可以包括其擴(kuò)增、例如通過(guò)PCR擴(kuò)增(在Mullis的美國(guó)專利第4,683,202號(hào)(1987)中敘述的實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88189-93(1991))；自身支持性序列擴(kuò)增(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871874-78(1990))；轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，861173-77(1989))、Q-β復(fù)制酶(Lizardi，P.M.等，Bio/Technology，61197(1988))，或任何其它的核酸擴(kuò)增法；然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增的分子。如果這類分子以非常少的量存在，則這些檢測(cè)方案對(duì)于核酸分子的檢測(cè)尤其有用。
在這種檢測(cè)方案的一個(gè)實(shí)施方案中，從目的RNA分子獲得cDNA分子(例如通過(guò)將所述RNA分子反轉(zhuǎn)錄為cDNA)。從中可以分離出這種RNA的細(xì)胞類型或組織，包括其中已知野生型指紋基因表達(dá)的任何組織，包括但不限于單核細(xì)胞、內(nèi)皮和/或平滑肌。然后，將所述cDNA內(nèi)的一段序列用作核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如PCR擴(kuò)增反應(yīng)等)的模板。在該方法的反轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增步驟中用作合成起始試劑(例如引物)的核酸試劑，可以從本文所述的基因核酸試劑中選擇。這類核酸試劑的優(yōu)選長(zhǎng)度至少是15-30個(gè)核苷酸。對(duì)于所擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，可以用放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增?；蛘?，可以制備足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物，使得所述產(chǎn)物可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的溴化乙錠染色或通過(guò)利用任何其它合適的核酸染色法來(lái)顯現(xiàn)。
針對(duì)野生型、突變型或擴(kuò)增型基因肽的抗體，也可以用作疾病診斷劑和預(yù)后劑。這類診斷方法可以用來(lái)檢測(cè)基因蛋白表達(dá)水平的異常或指紋基因蛋白的結(jié)構(gòu)和/或組織、細(xì)胞或亞細(xì)胞定位的異常。結(jié)構(gòu)差異可以包括例如相對(duì)于正常指紋基因蛋白而言所述突變型指紋基因蛋白大小、電負(fù)性或抗原性的差異。
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，包括但不限于蛋白質(zhì)印跡分析，可以容易地檢測(cè)或分離出來(lái)自待分析組織或細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)。有關(guān)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析的方法的詳細(xì)解釋，參見Sambrook等(1989)(參見上文)，第18章。本文所用的蛋白質(zhì)檢測(cè)和分離方法也可以是例如在例如Harlow和Lane(AntibodiesA LaboratoryManual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1988))中描述的那些方法。
用于檢測(cè)野生型、突變型或擴(kuò)增型基因肽分子的優(yōu)選診斷方法可以包括例如免疫測(cè)定，其中通過(guò)指紋基因肽與抗指紋基因特異性肽抗體的相互作用，來(lái)檢測(cè)指紋基因肽。
例如，可用于本發(fā)明的抗體或抗體片段，可以用來(lái)定量或定性檢測(cè)野生型、突變型或擴(kuò)增型基因肽的存在。這可以通過(guò)例如使用熒光標(biāo)記抗體(參見下文)與光學(xué)顯微鏡檢查、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)或熒光計(jì)檢測(cè)偶聯(lián)的免疫熒光技術(shù)來(lái)完成。如果所述指紋基因肽在細(xì)胞表面表達(dá)，則這類技術(shù)尤其有用。
另外，可用于本發(fā)明的抗體(或其片段)可以用于組織學(xué)檢測(cè)，如用于免疫熒光或免疫電子顯微鏡，用于原位檢測(cè)指紋基因肽。原位檢測(cè)可以通過(guò)從患者體內(nèi)取出組織學(xué)樣本、并在樣本上應(yīng)用本發(fā)明的標(biāo)記抗體來(lái)完成。所述抗體(或片段)最好是通過(guò)將標(biāo)記抗體(或片段)覆蓋在生物樣品上來(lái)應(yīng)用。通過(guò)采用這種方法，有可能不僅檢測(cè)所述指紋基因肽的存在，而且有可能檢測(cè)其在所檢查組織中的分布。應(yīng)用本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地意識(shí)到，可以對(duì)各種各樣的組織學(xué)方法中的任一種(例如染色法)進(jìn)行修改，以便完成這種原位檢測(cè)。
用于野生型、突變型或擴(kuò)增型指紋基因肽的免疫測(cè)定，通常包括將生物樣品(例如生物體液、組織提取物、新收獲的細(xì)胞或已經(jīng)在組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)的細(xì)胞)在能夠鑒定指紋基因肽的可檢測(cè)標(biāo)記的抗體存在下進(jìn)行保溫，并且通過(guò)多種本領(lǐng)域熟知的技術(shù)中的任一種檢測(cè)結(jié)合的抗體。
可以使所述生物樣品與固相支持體或載體(例如硝酸纖維素)或能夠?qū)⒓?xì)胞、細(xì)胞粒子或可溶性蛋白固定化的其它固相支持體接觸，并固定化至所述固相支持體或載體上。然后，可以用合適的緩沖液洗滌所述支持體，接著用可檢測(cè)標(biāo)記的基因特異性抗體處理。然后，可以再次用所述緩沖液洗滌固相支持體，以除去未結(jié)合的抗體。然后，用常規(guī)方法測(cè)定固相支持體上的結(jié)合標(biāo)記的量。
所謂“固相支持體或載體”是指能夠結(jié)合抗原或抗體的任何支持體。眾所周知的支持體或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和改性纖維素、聚丙烯酰胺、輝長(zhǎng)巖和磁鐵礦。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，載體的性質(zhì)可以或者在一定程度上是可溶的或是不溶性的。支持體的材料可以實(shí)際上具有任何可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，只要所偶聯(lián)的分子能夠與抗原或抗體結(jié)合即可。因此，所述支持體的結(jié)構(gòu)可以是球形的(就微珠而論)或圓柱形(如就試管的內(nèi)表面或棒的外表面而論)?；蛘?，所述表面可以是平坦的，例如片或試紙條等。優(yōu)選的支持體包括聚苯乙烯微珠。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道用于結(jié)合抗體或抗原的許多其它合適的載體，或者將能夠利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定所述載體。
給定的一批抗野生型、抗突變型或抗擴(kuò)增型指紋基因肽抗體的結(jié)合活性，可以按照熟知的方法來(lái)測(cè)定。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，將能夠確定操作的最適測(cè)定條件。
可以對(duì)所述基因肽特異性抗體進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記的方法之一是將所述抗體與酶連接，并且將其用于酶免疫測(cè)定(EIA)(Voller，Ric ClinLab，8289-98(1978)[“酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)”，DiagnosticHorizons 21-7，1978，Microbiological Associates Quarterly Publicaiotn，Walkersville，Md.]；Voller等，J.Clin.Pathol.，31507-20(1978)；Butler，Meth.Enzymol.，73482-523(1981)；Maggio(編著)，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)la.(1980)；Ishikawa等(編著)EnzymeImmunoassay，Igaku-Shoin，Tokyo(1981))。與所述抗體結(jié)合的酶將與合適的底物(最好是顯色底物)反應(yīng)，其反應(yīng)方式使得產(chǎn)生可以例如通過(guò)分光光度計(jì)、熒光計(jì)或肉眼檢測(cè)法檢測(cè)的化學(xué)部分?？梢杂脕?lái)可檢測(cè)標(biāo)記所述抗體的酶包括但不限于蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。可以通過(guò)利用所述酶的顯色底物的比色法，完成所述檢測(cè)。也可以通過(guò)將底物酶反應(yīng)的程度與同樣制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行肉眼比較，完成檢測(cè)。
也可以采用多種其它免疫測(cè)定中的任一種來(lái)完成檢測(cè)。例如，通過(guò)對(duì)所述抗體或抗體片段進(jìn)行放射性標(biāo)記，有可能通過(guò)利用放射免疫測(cè)定(RIA)(參見例如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，The EndocrineSociety，1986年3月)檢測(cè)指紋基因的野生型、突變型或擴(kuò)增型肽?？梢圆捎弥T如應(yīng)用γ計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或通過(guò)放射自顯影之類的方法，檢測(cè)所述放射性同位素。
也有可能用熒光化合物標(biāo)記所述抗體。當(dāng)將所述熒光標(biāo)記抗體暴露于合適波長(zhǎng)的光時(shí)，則由于熒光可以檢測(cè)到其存在。在最常用的熒光標(biāo)記化合物中，有異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。
也可以用發(fā)射熒光的金屬例如152Eu或鑭系的其它金屬，對(duì)所述抗體進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記?？梢杂眠@類金屬螯合基團(tuán)，例如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)，將這些金屬與所述抗體連接。
通過(guò)將所述抗體與化學(xué)發(fā)光化合物偶聯(lián)，也可以將其可檢測(cè)標(biāo)記。然后通過(guò)檢測(cè)在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的發(fā)光，檢測(cè)所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實(shí)例是魯米諾、異魯米諾、theromatic吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓鹽和草酸酯。
同樣，可以用生物發(fā)光化合物來(lái)標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種類型的化學(xué)發(fā)光，其中催化性蛋白提高了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。通過(guò)檢測(cè)發(fā)光的存在，測(cè)定生物發(fā)光蛋白的存在。對(duì)標(biāo)記來(lái)說(shuō)，重要的生物發(fā)光化合物是熒光素、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。
在本申請(qǐng)中，用標(biāo)記的文獻(xiàn)資料出處來(lái)表示各種出版物、專利和公布的專利申請(qǐng)。在本申請(qǐng)中提及的這些出版物、專利和公布的專利說(shuō)明書的公開內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本說(shuō)明書中，以更加全面地描述本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。
以下實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，決不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1從質(zhì)粒文庫(kù)直接構(gòu)建構(gòu)建體使用λZAPTM系統(tǒng)，如下制備基因組文庫(kù)。讓胚胎干細(xì)胞在100mm組織培養(yǎng)板中生長(zhǎng)。通過(guò)將5ml裂解緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM EDTA pH8.0、10mM NaCl、0.5％SDS和1mg/ml蛋白酶K)加至100mm平板內(nèi)匯合的胚胎干細(xì)胞中，從這些ES細(xì)胞中分離出高分子量基因組DNA。然后將細(xì)胞于60℃孵育數(shù)小時(shí)或直至完全裂解。通過(guò)數(shù)輪溫和的苯酚氯仿抽提和隨后乙醇沉淀，從裂解細(xì)胞中純化基因組DNA。
基因組DNA用限制性酶Sau 3AI部分消化，產(chǎn)生約5-20kb的片段。通過(guò)添加dATP和dGTP，在Klenow DNA聚合酶存在下將這些片段的末端部分補(bǔ)平，在基因組片段上產(chǎn)生不匹配的末端。然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(1xTAE，0.8％凝膠)，純化5-10kb大小的片段。然后用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)，從切下的瓊脂糖片中分離出所述DNA。
將基因組片段連接到已經(jīng)用Xho I切割并且用dTTP、dCTP和Klenow DNA聚合酶部分補(bǔ)平的λZapTMII載體(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)中。在連接之后，所述DNA用λ包裝混合物(Gigapack III gold，Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)包裝，并測(cè)定其滴度。
通過(guò)讓?duì)丝寺≡贛13輔助噬菌體ExAssist(Stratagene，Inc.)存在下，在合適的細(xì)菌菌株(XL-1 Blue MRF1，Stratagene，Inc.)上生長(zhǎng)，從所述λ文庫(kù)中得到環(huán)狀噬菌粒DNA。具體地說(shuō)，將約100,000個(gè)λ克隆與全都10-100倍過(guò)量的細(xì)菌和輔助噬菌體一起于37℃溫育20分鐘。將1ml LB培養(yǎng)基+10mM MgSO4加入到每種切割反應(yīng)物中，將其于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。通常，一次在一個(gè)96孔深孔板(block)中建立24-96個(gè)這些反應(yīng)物。第二天早晨，將板加熱至65℃達(dá)15分鐘，以殺死細(xì)菌和λ噬菌體。通過(guò)以約3000g離心15分鐘，除去細(xì)菌碎片。保留含有環(huán)狀噬菌粒DNA的上清液，將其直接用于質(zhì)粒PCR實(shí)驗(yàn)中(關(guān)于質(zhì)粒PCR實(shí)驗(yàn)，參見實(shí)施例9和10)。
采用長(zhǎng)距離PCR和根據(jù)已知序列(示于圖1中)如上所述選擇的“向外”oligo，在上述噬菌粒DNA庫(kù)中篩選特定的目的基因。所述PCR反應(yīng)物含有2μl的一個(gè)庫(kù)的噬菌粒DNA樣品、3μl 10×PCR緩沖液3(Boehringer Mannheim)、1.1μl 10mM dNTP、50nM引物、0.3μlEXPAND長(zhǎng)模板PCR酶混合物(Long Template PCR Enzyme Mix)(Boehringer-Mannheim)和30μl水。循環(huán)條件是94℃2分鐘(1個(gè)循環(huán))；94℃10秒、65℃30秒、68℃15秒(15個(gè)循環(huán))；94℃10秒、60℃30秒、68℃15秒以及于68℃每隔一個(gè)循環(huán)增加20秒(25個(gè)循環(huán))；68℃7分鐘(1個(gè)循環(huán))并且于4℃保持。
通過(guò)在含有1X TAE緩沖液的瓊脂糖凝膠上電泳，分離所述PCR反應(yīng)的產(chǎn)物，并且用溴化乙錠和紫外線顯現(xiàn)。從凝膠上切下指示成功的長(zhǎng)距離PCR的任何大片段，用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化。
為了免除對(duì)所述PCR片段作限制性圖譜的需要，使用以下不依賴連接作用的克隆策略。用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Inc.，SantaClarita，California)“純化”目的長(zhǎng)距離PCR片段。通過(guò)混合0.1-2μg所述片段、2μl NEB(New England BioLabs)緩沖液4、1μl 2mM dTTP、6單位T4 DNA聚合酶(NEB)、水至總體積為20μl，并且于25℃保溫30分鐘，產(chǎn)生所述PCR片段的單鏈末端。通過(guò)于75℃加熱20分鐘使所述聚合酶失活。用Sac I和Sac II在單一限制性位點(diǎn)消化質(zhì)粒載體pDG2(示于圖2A中的pDG2)，并且如上所述用T4 DNA聚合酶處理每種反應(yīng)物，也在Neor選擇標(biāo)記片段上產(chǎn)生單鏈末端。用與長(zhǎng)距離PCR片段末端互補(bǔ)的單鏈末端，制備圖1所示的載體。
然后，用或者兩步克隆策略或者四向一步方案，將所述載體和片段裝配為構(gòu)建體。簡(jiǎn)而言之，將含有10ng T4處理的Neor盒、1μl T4處理的PCR片段、0.2μl 0.5M EDTA、0.3μl 0.5M NaCl和水至4μl的反應(yīng)物加熱至65℃，并且在約45分鐘內(nèi)讓其冷卻至室溫。然后將所述混合物轉(zhuǎn)化到亞克隆效能(subcloning efficiency)DH5-α感受態(tài)細(xì)胞中。
實(shí)施例2從噬菌體文庫(kù)產(chǎn)生構(gòu)建體如下在λ噬菌體中制備小鼠胚胎干細(xì)胞文庫(kù)。通過(guò)在Sau 3AI位點(diǎn)部分切割DNA，產(chǎn)生長(zhǎng)度約20kb的基因組片段，從基因組DNA構(gòu)建基因組文庫(kù)。用Klenow酶，在dGTP和dATP存在下，將這些DNA片段的末端序列部分補(bǔ)平，用T4 DNA連接酶將所述片段連接到已經(jīng)用Klenow在dTTP和dCTP存在下部分補(bǔ)平的合適的λ克隆載體例如λFix II(Stratagene，Inc.，La Jolla，California)的Xho I位點(diǎn)中?；蛘?，用蔗糖梯度對(duì)所述部分消化的基因組DNA進(jìn)行大小選擇，并且選擇約20kb的序列。將經(jīng)富集的部分克隆到經(jīng)Bam HI切割的λ載體例如λDatsh II(Stratagene，Inc.，La Jolla，California)中。
將文庫(kù)平板接種到1,152個(gè)平板上，每個(gè)平板含有約1,000個(gè)克隆。因此，總共平板接種了1.1×106個(gè)克隆(相當(dāng)于8個(gè)基因組)。
通過(guò)加入4mlλ洗脫緩沖液(10mM MgCl2、10mM Tris-pH8.0)至每個(gè)平板，于室溫溫育3-5小時(shí)，從每個(gè)平板上洗脫下所述噬菌體。溫育后，從每個(gè)平板上收集2ml緩沖液，將其置于96深孔板(Costar，In.)的一個(gè)孔中。填充12個(gè)96孔板，將其稱為“亞庫(kù)文庫(kù)(sub-poollibrary)”。
使用該亞庫(kù)文庫(kù)，通過(guò)將100μl的12個(gè)不同的亞庫(kù)孔內(nèi)容物置于一個(gè)新的96孔板的一個(gè)孔中，制備“庫(kù)文庫(kù)(pool library)。將12個(gè)亞庫(kù)平板混合形成1個(gè)庫(kù)文庫(kù)平板。
使用已知經(jīng)PCR擴(kuò)增所述目的基因的一對(duì)寡核苷酸，擴(kuò)增來(lái)自“大庫(kù)文庫(kù)”的96個(gè)庫(kù)的上清液。在0.5單位的Amplitaq GoldTM(PerkinElmer)、每種寡核苷酸1μM、200μM dNTP、2μl 1-5倍稀釋的所述庫(kù)(或亞庫(kù))上清液、50mM KCl、100mM Tris-HCl(pH8.3)以及或者1.5mM或1.25mM MgCl2存在下，進(jìn)行PCR。循環(huán)條件是95℃8分鐘(1個(gè)循環(huán))；95℃30秒、60℃30秒、72℃45秒(55個(gè)循環(huán))；72℃7分鐘(1個(gè)循環(huán))，并且于4℃保持。根據(jù)所述基因，約3-12個(gè)庫(kù)產(chǎn)生如實(shí)施例1中所述在瓊脂糖凝膠上鑒定的陽(yáng)性信號(hào)。在需要進(jìn)一步純化(即在擴(kuò)增后沒(méi)有清晰信號(hào))的情況下，將12個(gè)亞庫(kù)構(gòu)成的所述庫(kù)，用相同的引物進(jìn)行擴(kuò)增，標(biāo)識(shí)為一個(gè)亞庫(kù)(1000個(gè)克隆)。
側(cè)翼片段的產(chǎn)生 如上所述，敲除構(gòu)建體含有與靶基因同源、鄰接正選擇標(biāo)記的兩個(gè)區(qū)段的DNA序列。由如上在實(shí)施例2中所述鑒定為陽(yáng)性的λ克隆的庫(kù)，進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR。用具有缺乏一種類型堿基的預(yù)先確定的序列并且與載體上的預(yù)先確定的序列互補(bǔ)的一對(duì)寡核苷酸，產(chǎn)生每種片段。所獲得的片段為1-5kb。也用合適的寡核苷酸產(chǎn)生大于5kb的第三片段。然后用這種第三片段獲得待敲除基因附近、但位于所述載體之外的DNA序列。
實(shí)施例3兩步克隆法-通用方法pDG2質(zhì)粒載體(圖2A)含有單一限制性位點(diǎn)Sac II和Sac I。通過(guò)用或者限制性酶Sac II或者Sac I消化pDG2載體，并且用T4 DNA聚合酶和dTTP如上所述處理每種反應(yīng)物，產(chǎn)生合適的單鏈退火位點(diǎn)。對(duì)于每種載體，在微量滴定板中建立4種反應(yīng)物所述反應(yīng)物含有1μl的或者(1)T4 DNA聚合酶處理的片段；(2)110稀釋的T4處理的片段反應(yīng)物；(3)1∶100稀釋的T4處理的片段或(4)水(無(wú)插入片段對(duì)照)。密封所述微量滴定板，將其置于加熱至65℃的兩個(gè)溫度塊(temperatureblock)之間，讓其緩慢冷卻至室溫達(dá)30-45分鐘。
然后，將微量滴定板置于冰上，向每孔中加入20-25μl亞克隆效能感受態(tài)細(xì)胞。將平板于冰上孵育20-30分鐘。然后將微量滴定板置于加熱至42℃的兩個(gè)溫度塊之間達(dá)2分鐘，然后在冰上放置2分鐘。向每孔中加入100μl LB，用parafilm覆蓋平板，于37℃溫育30-60分鐘。將每孔的全部?jī)?nèi)容物平板接種到一個(gè)LB-Amp平板上，并于37℃溫育過(guò)夜。
從所具有的菌落至少是無(wú)插入片段對(duì)照的2-4倍的平板上，挑出約12-24個(gè)菌落。讓所述菌落在深孔板上于37℃生長(zhǎng)過(guò)夜，然后用Qiagen小量制備試劑盒提取質(zhì)粒DNA。
用Not I和SalI酶消化質(zhì)粒DNA。如圖2A所示，Not I/SalI消化將產(chǎn)生一個(gè)含有克隆位點(diǎn)3和4的大片段和一個(gè)含有克隆位點(diǎn)1和2以及Neor基因的較小的片段。在消化后，將反應(yīng)物在含有0.2μg/ml溴化乙錠的0.8％瓊脂糖凝膠上電泳。對(duì)于無(wú)插入片段，存在2個(gè)條帶，一個(gè)為1975個(gè)堿基對(duì)，一個(gè)為2793個(gè)堿基對(duì)。當(dāng)存在插入片段時(shí)，這些條帶中的至少一個(gè)條帶將較大，因?yàn)樗鼤?huì)在退火位點(diǎn)1/2或退火位點(diǎn)3/4含有一個(gè)片段(插入片段1或2)。切下插入片段條帶，用QIAquick凝膠提取試劑盒處理。進(jìn)行第二個(gè)連接反應(yīng)，所述反應(yīng)物含有1μl 10X連接酶緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、10mM二硫蘇糖醇、1mM ATP、25μg/ml牛血清白蛋白)、1μl T4 DNA連接酶、1-2μl片段(位點(diǎn)3/4條帶)、5μl位點(diǎn)1/2條帶和水至10μl。也用水或者取代位點(diǎn)3/4片段或者取代位點(diǎn)1/2片段，建立對(duì)照。將反應(yīng)物于室溫溫育1-2小時(shí)，用25μl感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
以下描述適用于下述實(shí)施例。許多靶基因的序列是已知的，并且公眾可以得到，主要得自EST數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)這些序列制備用于PCR擴(kuò)增靶基因的寡核苷酸引物。這些實(shí)施例正文中的“側(cè)翼DNA”是指鄰接靶基因中待缺失或突變區(qū)域的基因組序列?！皞?cè)翼DNA”在上文中也被描述為與靶基因同源的DNA序列區(qū)段。R1基因組文庫(kù)是指由R1 ES細(xì)胞系制備的基因組文庫(kù)。這種文庫(kù)例如如實(shí)施例1中所述來(lái)制備。迄今為止，已經(jīng)在約200個(gè)已知的和新的靶基因中實(shí)施了本發(fā)明方法。
實(shí)施例4用于靶2(一種金屬蛋白酶基因)的打靶構(gòu)建體的雙向克隆靶2(一種金屬蛋白酶基因)側(cè)翼DNA的鑒定。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用Oligo#174(SEQ ID NO19)和#180(SEQ ID NO20)，經(jīng)PCR擴(kuò)增具有一個(gè)R1基因組文庫(kù)的各個(gè)庫(kù)，以便鑒定根據(jù)存在500bp條帶指示含有靶#2基因組DNA的各個(gè)孔。鑒定出分別含有約12,000個(gè)克隆的總共12個(gè)庫(kù)(庫(kù)A5、A7、C2、D2、E5、E10、F7、G1、G7、H2、H4、H7)。然后用oligo 454(SEQ ID NO21)和463(SEQ ID NO22)擴(kuò)增庫(kù)C2，產(chǎn)生一個(gè)2000bp的條帶，用oligo 464(SEQ ID NO23)和42(SEQID NO24)擴(kuò)增庫(kù)H2，產(chǎn)生一個(gè)2700bp的條帶。這兩個(gè)條帶含有靶2的側(cè)翼DNA。
打靶構(gòu)建體的構(gòu)建。從瓊脂糖凝膠中凝膠純化含有靶2側(cè)翼DNA的每個(gè)條帶，在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶分別處理所述末端，以便產(chǎn)生單鏈突出端。然后將這些條帶中的每個(gè)條帶單獨(dú)克隆到質(zhì)粒載體pDG2(示于圖2A中)中。通過(guò)不依賴連接作用的克隆，將C2條帶克隆到Sac II消化的、已經(jīng)用T4 DNA聚合酶在dATP存在下處理的pDG2中。在一個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中，通過(guò)不依賴連接作用的克隆，將H2條帶克隆到Sac I消化的、已經(jīng)用T4 DNA聚合酶在dATP存在下處理的pDG2中。
為了將兩個(gè)側(cè)翼臂移至一種打靶載體中，用Not I/Sal I消化上述每種載體，凝膠純化含有C2條帶的4kb片段和含有H2條帶的5kb片段。采用標(biāo)準(zhǔn)條件，用T4 DNA連接酶將這兩種片段連接在一起，鑒定含有這兩種側(cè)翼臂的重組體。在所檢查的12個(gè)菌落中，所有12個(gè)菌落都是正確的，即含有正確鄰接正選擇標(biāo)記Neor的兩個(gè)臂。
實(shí)施例5用于靶54(一種絲氨酸蛋白酶基因)的打靶構(gòu)建體的雙向克隆靶54側(cè)翼DNA的鑒定。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用Oligo #151(SEQ IDNO25)和#155(SEQ ID NO26)，經(jīng)PCR擴(kuò)增具有一個(gè)R1基因組文庫(kù)的各個(gè)庫(kù)，以便鑒定根據(jù)存在179bp條帶指示含有靶#54基因組DNA的各個(gè)孔。鑒定出分別含有約12,000個(gè)克隆的總共12個(gè)庫(kù)(庫(kù)A4、A10、B2、B9、C9、E1、E6、F8、G4、H6、H7和H9)。然后用oligo454(SEQ ID NO27)和465(SEQ ID NO28)擴(kuò)增庫(kù)G4，產(chǎn)生一個(gè)1400bp的條帶，用oligo 466(SEQ ID NO29)和42(SEQ ID NO24)擴(kuò)增庫(kù)H7，產(chǎn)生一個(gè)3000bp的條帶。這兩個(gè)條帶含有靶54的側(cè)翼DNA。
打靶構(gòu)建體的構(gòu)建。從瓊脂糖凝膠中凝膠純化每個(gè)條帶，在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶分別處理所述末端，以便產(chǎn)生單鏈突出端。然后將這些條帶中的每個(gè)條帶單獨(dú)克隆到pDG2中。通過(guò)不依賴連接作用的克隆，將G4條帶克隆到Sac II切割的、已經(jīng)用T4 DNA聚合酶在dATP存在下處理的pDG2中。在一個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中，通過(guò)不依賴連接作用的克隆，將H7條帶克隆到Sac I切割的、已經(jīng)用T4 DNA聚合酶在dATP存在下處理的pDG2中。
為了將兩個(gè)側(cè)翼臂移至一種打靶載體中，用Not I/SalI消化上述每種載體，凝膠純化含有G4條帶的6kb片段和含有H7條帶的8kb片段。采用標(biāo)準(zhǔn)條件，用T4 DNA連接酶將這兩種片段連接在一起，鑒定含有這兩種側(cè)翼臂的重組體。在所檢查的24個(gè)菌落中，14個(gè)菌落具有正確的插入片段。
實(shí)施例6一步(四向)克隆法-通用方法因?yàn)槊糠N單鏈退火位點(diǎn)都是獨(dú)一無(wú)二的，所以也使用四向連接策略，用一個(gè)步驟產(chǎn)生構(gòu)建體。如上所述建立退火反應(yīng)，只是每種反應(yīng)物含有用Sac I和Sac II兩者消化的載體，并且將兩種T4處理的片段都加入到這些反應(yīng)中。
實(shí)施例7用于靶43(一種G蛋白偶聯(lián)受體基因)的打靶構(gòu)建體的四向克隆靶43側(cè)翼DNA的鑒定。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用Oligo#1(SEQ ID NO30)和#2(SEQ ID NO31)，經(jīng)PCR擴(kuò)增具有一個(gè)R1基因組文庫(kù)的各個(gè)庫(kù)，以便鑒定根據(jù)存在414bp條帶指示含有靶#43基因組DNA的各個(gè)孔。鑒定出分別含有約12,000個(gè)克隆的總共11個(gè)庫(kù)(庫(kù)A32、A5、A9、B4、D4、D10、E1、E9、F9、G7和G8)。然后用oligo 41(SEQ ID NO32)和38(SEQ ID NO33)擴(kuò)增庫(kù)E1，產(chǎn)生一個(gè)1500bp的條帶，用oligo 40(SEQ ID NO34)和37(SEQ ID NO35)擴(kuò)增庫(kù)D10，產(chǎn)生一個(gè)3500bp的條帶。這兩個(gè)條帶含有靶43的側(cè)翼DNA。
打靶構(gòu)建體的構(gòu)建。從瓊脂糖凝膠中凝膠純化每個(gè)條帶，在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶分別處理所述末端，以便產(chǎn)生單鏈突出端。然后將這些插入片段與約50ng的已經(jīng)用Sac I和Sac II兩者消化、隨后用T4 DNA聚合酶在dATP存在下處理的pDG2混合。將DNA混合物加熱至65℃達(dá)2分鐘，然后在冰上孵育5分鐘。然后將退火的DNA轉(zhuǎn)化到DH5-α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)在氨芐青霉素瓊脂糖平板上進(jìn)行選擇，獲得重組分子。在于37℃溫育過(guò)夜后，挑出單個(gè)菌落，讓其生長(zhǎng)以用于分析。通過(guò)合適的限制性酶消化，鑒定重組分子。在所檢查的52個(gè)菌落中，35個(gè)菌落具有正確的預(yù)期產(chǎn)物的限制圖譜。
實(shí)施例8用于靶244(一種新基因)的打靶構(gòu)建體的四向克隆靶244側(cè)翼DNA的鑒定。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用Oligo#540(SEQ IDNO36)和#546(SEQ ID NO37)，經(jīng)PCR擴(kuò)增具有一個(gè)R1基因組文庫(kù)的各個(gè)庫(kù)，以便鑒定根據(jù)存在246bp條帶指示含有靶#244基因組DNA的各個(gè)孔。鑒定出分別含有約12,000個(gè)克隆的總共16個(gè)庫(kù)(庫(kù)A1、B1、A3、A5、A6、B6、A8、C9、D10、E1、F2、E5、E6、F10、G9和H8)。然后用oligo 445(SEQ ID NO38)和667(SEQ ID NO39)擴(kuò)增庫(kù)G9，產(chǎn)生一個(gè)1300bp的條帶，用oligo 668(SEQ ID NO40)和42(SEQ ID NO24)擴(kuò)增庫(kù)A6，產(chǎn)生一個(gè)1600bp的條帶。這兩個(gè)條帶含有靶244的側(cè)翼DNA。
打靶構(gòu)建體的構(gòu)建。從瓊脂糖凝膠中凝膠純化每個(gè)條帶，在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶分別處理所述末端，以便產(chǎn)生單鏈突出端。然后將這些插入片段與約50ng的已經(jīng)用Sac I和Sac II兩者消化、隨后用T4 DNA聚合酶在dATP存在下處理的pDG2混合。將DNA混合物加熱至65℃達(dá)2分鐘，然后在冰上孵育5分鐘。然后將退火的DNA轉(zhuǎn)化到DH5-α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)在氨芐青霉素瓊脂糖平板上進(jìn)行選擇，獲得重組分子。在于37℃溫育過(guò)夜后，挑出單個(gè)菌落，讓其生長(zhǎng)以用于分析。通過(guò)合適的限制性酶消化，鑒定重組分子。在所檢查的12個(gè)菌落中，2個(gè)菌落具有正確的預(yù)期產(chǎn)物的限制圖譜。
以下的實(shí)施例9和10提供質(zhì)粒PCR法(在圖1中圖示的)作為上述實(shí)施例中所述的雙向和四向策略的替代且優(yōu)選的方法。
實(shí)施例9克隆靶227(一種新基因)的打靶構(gòu)建體的質(zhì)粒PCR法基因組克隆的擴(kuò)增由R1 ES細(xì)胞，制備在λZap II中克隆并且隨后用M13輔助噬菌體介導(dǎo)的切除進(jìn)行切除的、一個(gè)質(zhì)粒PCR基因組文庫(kù)的各個(gè)庫(kù)，用oligo 907(SEQ ID NO41)和908(SEQ ID NO42)擴(kuò)增。這些oligo從所述文庫(kù)的庫(kù)6擴(kuò)增了一種約9kb的產(chǎn)物。從瓊脂糖凝膠中分離出這種含有靶227側(cè)翼臂以及質(zhì)粒pBluescript骨架的該片段。
打靶構(gòu)建體的構(gòu)建 在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶處理所分離的DNA片段，以便產(chǎn)生合適的單鏈末端。然后將該片段與由已經(jīng)用Sac I和Sac II兩者消化、隨后用T4 DNA聚合酶在dATP存在下處理的pDG2獲得的Neor基因片段一起退火(不依賴連接作用)。所述消化和聚合酶處理產(chǎn)生了具有特異性退火至靶277片段的末端的Neor基因?；旧先缟纤鼋⑼嘶鸱磻?yīng)，獲得靶227構(gòu)建體(14個(gè)克隆中有13個(gè)克隆是正確的)。
實(shí)施例10克隆靶125(一種核激素受體基因)的打靶構(gòu)建體的質(zhì)粒PCR法基因組克隆的擴(kuò)增 由R1 ES細(xì)胞，制備在λZap II中克隆并且隨后用M13輔助噬菌體介導(dǎo)的切除進(jìn)行切除的、一個(gè)質(zhì)粒PCR文庫(kù)的各個(gè)庫(kù)，用oligo 1157(SEQ ID NO43)和1158(SEQ ID NO44)擴(kuò)增。這些oligo從所述文庫(kù)的庫(kù)10擴(kuò)增了一種約10kb的產(chǎn)物。從瓊脂糖凝膠中分離出這種含有靶125側(cè)翼臂以及pBluescript骨架的該片段。
打靶構(gòu)建體的構(gòu)建 在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶處理所分離的DNA片段，以便產(chǎn)生合適的單鏈末端。然后將該片段與由已經(jīng)用Sac I和Sac II兩者消化、隨后用T4 DNA聚合酶在dATP存在下處理的pDG2獲得的Neor基因片段一起退火。這產(chǎn)生了具有特異性退火至靶125構(gòu)建體的末端的Neor基因，獲得靶125構(gòu)建體(18個(gè)克隆中有12個(gè)克隆是正確的)。
實(shí)施例11應(yīng)用GFP作為篩選標(biāo)記將GFP(綠色熒光蛋白)基因加入到與靶基因同源區(qū)之外，使得人們可以通過(guò)在熒光下篩選ES細(xì)胞集落，富集同源重組體(在打靶構(gòu)建體和ES細(xì)胞中的靶基因之間發(fā)生重組)。用胰蛋白酶處理快速生長(zhǎng)中的ES細(xì)胞，以制備單細(xì)胞懸浮液。相應(yīng)的打靶載體用限制性內(nèi)切核酸酶線性化，將20μg DNA加入到ES培養(yǎng)基{具有1,000單位/ml LIF(白血病抑制因子-Gibco 13275-029“ESGRO”)和12％胎牛血清的高葡萄糖DMEM(無(wú)L-谷氨酰胺或丙酮酸鈉)}中的10×106ES細(xì)胞中。將細(xì)胞置于2mm間距的樣品池中，在BTX電穿孔裝置上在400μF電阻和200伏下進(jìn)行電穿孔。在電穿孔后，立即將ES細(xì)胞以每個(gè)100mm凝膠化組織培養(yǎng)板1×106細(xì)胞接種。48小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為ES培養(yǎng)基+G418(200μg/ml)。在第4、6和8天，將培養(yǎng)基更換為ES培養(yǎng)基+G418(200μg/ml)。在第10-12天，將平板置于紫外線下，根據(jù)它們是否發(fā)熒光，對(duì)ES細(xì)胞集落進(jìn)行評(píng)價(jià)。該實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是發(fā)熒光的細(xì)胞已經(jīng)隨機(jī)整合了所述打靶載體，并且GFP基因是完整的。已經(jīng)經(jīng)歷了同源重組的細(xì)胞會(huì)缺失GFP基因，并且不發(fā)熒光；這些是目的克隆。
實(shí)施例12靶T243的敲除和純合敲除突變型小鼠的分析靶T243側(cè)翼DNA的鑒定 在標(biāo)準(zhǔn)條件下，用Oligo#426(SEQ IDNO55)和#432(SEQ ID NO56)，經(jīng)PCR擴(kuò)增具有一個(gè)R1基因組文庫(kù)的各個(gè)庫(kù)，以鑒定根據(jù)存在150bp條帶指示含有靶T243基因組DNA的各個(gè)孔。鑒定出分別含有約12,000個(gè)克隆的總共48個(gè)庫(kù)(庫(kù)A1、A2、A9、B4、B11、B12、C3、C8、C11、C12、D1、D3、E4、F3、G4、G5、G6、G12、H4、H5和H12)。然后用oligo #488(SEQ ID NO48)[具有單鏈尾序列的引物]和#454(參見圖8)擴(kuò)增庫(kù)H10，產(chǎn)生一個(gè)2700bp的條帶。然后用oligo#489(SEQ ID NO49)[具有單鏈尾序列的引物]和#42(參見圖8)擴(kuò)增庫(kù)A7，產(chǎn)生一個(gè)5200bp的條帶。這兩個(gè)條帶含有靶T243的側(cè)翼DNA，(SEQ ID NO50)和(SEQ ID NO51)。
打靶構(gòu)建體的構(gòu)建 從瓊脂糖凝膠中凝膠純化每個(gè)條帶，在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶分別處理所述末端，以便產(chǎn)生單鏈突出端。然后將這些插入片段與約50ng的已經(jīng)用Sac I和Sac II兩者消化、隨后用T4 DNA聚合酶在dATP存在下處理的pDG2混合。將DNA混合物加熱至65℃達(dá)2分鐘，然后在冰上孵育5分鐘。將退火的DNA轉(zhuǎn)化到DH5-α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)在氨芐青霉素瓊脂糖平板上進(jìn)行選擇，獲得重組分子。在于37℃溫育過(guò)夜后，挑出單個(gè)菌落，讓其生長(zhǎng)以用于分析。通過(guò)合適的限制性酶消化，鑒定重組分子。
將打靶構(gòu)建體導(dǎo)入ES細(xì)胞中和同源重組 用胰蛋白酶處理快速生長(zhǎng)中的ES細(xì)胞，以制備單細(xì)胞懸浮液。T243打靶載體用限制性內(nèi)切核酸酶線性化，將20μg DNA加入到ES培養(yǎng)基{具有1,00單位/mlLIF(白血病抑制因子-Gibco 13275-029“ESGRO”)和12％胎牛血清的高葡萄糖DMEM(無(wú)L-谷氨酰胺或丙酮酸鈉)}中的10×106ES細(xì)胞中。將細(xì)胞置于2mm間距的樣品池中，在BTX電穿孔裝置上在400μF電阻和200伏下進(jìn)行電穿孔。在電穿孔后，立即將ES細(xì)胞以每個(gè)100mm凝膠化組織培養(yǎng)板1×106細(xì)胞接種。48小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為ES培養(yǎng)基+G418(200mg/ml)。在第4、6和8天，將培養(yǎng)基更換為ES培養(yǎng)基+G418(200mg/ml)。
在第10-12天，挑出G418抗性菌落(平均192個(gè)菌落)，將其以復(fù)份置于96孔板中。在ES培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-5天后，將一個(gè)平板在50％FBS、40％DMEM和10％DMSO中冷凍。讓第二個(gè)平板過(guò)量生長(zhǎng)(overgrow)，再飼養(yǎng)8-10天，然后裂解制備供分析用的DNA(裂解緩沖液10mM Tris pH7.5、10mM EDTA pH8.0、10mM NaCl、0.5％Sarcosyl和1mg/ml蛋白酶K)。然后用2倍體積的乙醇沉淀DNA，將其重懸于適宜的緩沖液中。
在證實(shí)同源重組事件后，將來(lái)自復(fù)份平板的陽(yáng)性孔解凍，置于已經(jīng)接種絲裂霉素C處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(24小時(shí)之前)的24孔組織培養(yǎng)皿中。讓細(xì)胞生長(zhǎng)至足以供二倍體聚集(CD-1宿主細(xì)胞株)和額外的儲(chǔ)存小瓶冷凍用的水平。關(guān)于處理ES細(xì)胞和由ES細(xì)胞產(chǎn)生嵌合小鼠的一般方法，參見Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsAPractical Approach(E.J.Robertson編著，IRL Press，Oxford(1987))。將重團(tuán)聚胚泡植入假孕雌性CD-1小鼠體內(nèi)。然后繁育高度嵌合的小鼠，以產(chǎn)生突變型243基因的種系傳遞。
純合T243敲除小鼠的產(chǎn)生和突變表型的分析 繁育雜合T243敲除小鼠，比較純合敲除后代與正常及雜合的同窩小鼠明顯的表型差異。與正常同窩小鼠相比，純合子最初機(jī)能亢進(jìn)，并且皮膚非常干燥。到約15-17天時(shí)，純合敲除小鼠開始顯得越來(lái)越不穩(wěn)定并且嗜眠；到約19-21天時(shí)，純合子顯現(xiàn)出戰(zhàn)栗和瀕臨死亡的體征。在約23-25天，處死未死亡的純合敲除小鼠供進(jìn)一步分析(參見下文)。
圖9和圖10顯示了每日測(cè)量身長(zhǎng)和體重的結(jié)果、以及在兩只雜合243敲除小鼠之間兩次典型交配后代的體重/身長(zhǎng)之比的計(jì)算結(jié)果。在出生時(shí)，純合幼畜的大小與野生型同窩小鼠或雜合同窩小鼠大約相同或略小。然而，隨著年齡的增長(zhǎng)，在純合敲除幼畜中體重增加和縱向生長(zhǎng)(lengthwise gtowth)均顯著降低。到15-17天時(shí)，純合子開始體重減輕，這種體重減輕持續(xù)直至約3周時(shí)死亡。
對(duì)6只純合突變型小鼠(4只雌性，2只雄性)和3只對(duì)照小鼠(2只雌性，1只雄性)進(jìn)行尸體剖檢。在骨和腎組織中觀察到可歸因于243突變的顯著性差異。
骨 突變型小鼠的軟骨異常，骨生成普遍減少。具體地說(shuō)，觀察到中軸骨骼和附肢骨骼均縮短。四肢的近端骨和遠(yuǎn)端骨成比例縮短，關(guān)節(jié)軟骨缺乏愛茜藍(lán)染色。
股骨遠(yuǎn)端的生長(zhǎng)板薄以及骺軟骨薄至缺乏。單突變型小鼠有微小骨折，所述微小骨折從皮質(zhì)通過(guò)干骺端斜線延伸到長(zhǎng)骨體生長(zhǎng)部中(提示生長(zhǎng)板脆性)。在所有突變型小鼠的長(zhǎng)骨體生長(zhǎng)部?jī)?nèi)，在增殖和肥大區(qū)中的軟骨細(xì)胞柱短。干骺端內(nèi)軟骨性針狀體短并且間隔寬。偶爾出現(xiàn)的針狀體偶然定向。成骨細(xì)胞豐富并且常常沿軟骨性針狀體堆積。骺軟骨薄并且常常被纖維性結(jié)締組織所取代。骺表面的愛茜藍(lán)染色也減弱。骨骺/長(zhǎng)骨體生長(zhǎng)部連接處的軟骨略微向外張開，有伸出在長(zhǎng)骨體生長(zhǎng)部之上的不規(guī)則的凸出邊緣。
發(fā)現(xiàn)突變體的胸骨板不規(guī)則。生長(zhǎng)板或者缺乏或者不連續(xù)。大的不規(guī)則的軟骨島延伸到胸骨板體中，偶然有第二個(gè)骨化中心。軟骨邊緣向外張開。
根據(jù)愛茜藍(lán)染色，椎體不定地骨化。某些椎體小并且主要是軟骨性的，生長(zhǎng)板不規(guī)則且薄，顯示出側(cè)突漸尖。
腎 所有所述突變型小鼠的兩個(gè)腎都有發(fā)育不良改變，這些在皮質(zhì)髓質(zhì)連接處最為顯著，而在皮質(zhì)中程度較低。所述腎小且缺乏正常的結(jié)構(gòu)。皮質(zhì)薄，并且某些腎小球在被膜下。被膜下的腎小球是小而皺縮、多細(xì)胞的腎小球叢，顯示發(fā)育未全。皮質(zhì)髓質(zhì)區(qū)沒(méi)有放射狀弓形管和獨(dú)特的管形。皮質(zhì)髓質(zhì)連接處內(nèi)的腎小管上皮細(xì)胞隨機(jī)排列成片、堆和簇。某些腎小管上皮細(xì)胞小且嗜堿染色暗，因而顯示有再生。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)上述實(shí)施方案作各種修飾。這些修飾和變化在本發(fā)明范圍內(nèi)。
序列表<110>KLEIN，ROBERTMATTHEWS，WILLIAMMOORE，MARKALLEN，KEITH<120>含有TRP基因破壞的轉(zhuǎn)基因小鼠<130>3866-5<140>未指定<141>2000-10-26<150>US 60/161,488<151>1999-10-26<160>59<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4768<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述pDG2<400>1gttaactacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 60tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 120ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 180ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 240tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 300gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttctccaatg atgagcactt ttaaagttct 360gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 420acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 480tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 540caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 600gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 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gccaagcccg 60aggggcggga gggggcgggg cctgtgggaa gggtctgggc ctggcaggac ctgggctggg 120gtctccttgg ccctgctgtg tgctttgcgg caatgctggg tgctgtgact ctcggataac 180ctggagatcc ctgcttttgg gcgaatccgg gggtagttgc tcatcaagac tagaggtggg 240ggtggaggga aggcttcata caggaagcct gctgcgaaat gaagagttgg ccagggaaag 300catggcgtgc agaggaactc actccgcaga aaccacagaa acagaggcag atgaggacgc 360cctgccggcc370<210>52<211>276<212>PRT<213>鼠類TRP<400>52Met Glu Ser Met Ser Glu Leu Ala Pro Arg Cys Leu Leu Phe Pro Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Pro Ala Pro Lys Leu Gly Pro
20 25 30Ser Pro Ala Gly Ala Glu Glu Thr Asp Trp Val Arg Leu Pro Ser Lys35 40 45Cys Glu Val Cys Lys Tyr Val Ala Val Glu Leu Lys Ser Ala Phe Glu50 55 60Glu Thr Gly Lys Thr Lys Glu Val Ile Asp Thr Gly Tyr Gly Ile Leu65 70 75 80Asp Gly Lys Gly Ser Gly Val Lys Tyr Thr Lys Ser Asp Leu Arg Leu85 90 95Ile Glu Val Thr Glu Thr Ile Cys Lys Arg Leu Leu Asp Tyr Ser Leu100 105 110His Lys Glu Arg Thr Gly Ser Asn Arg Phe Ala Lys Gly Met Ser Glu115 120 125Thr Phe Glu Thr Leu His Asn Leu Val His Lys Gly Val Lys Val Val130 135 140Met Asp Ile Pro Tyr Glu Leu Trp Asn Glu Thr Ser Ala Glu Val Ala145 150 155 160Asp Leu Lys Lys Gln Cys Asp Val Leu Val Glu Glu Phe Glu Glu Val165 170 175Ile Glu Asp Trp Tyr Arg Asn His Gln Glu Glu Asp Leu Thr Glu Phe180 185 190Leu Cys Ala Asn His Val Leu Lys Gly Lys Asp Thr Ser Cys Leu Ala195 200 205Glu Arg Trp Ser Gly Lys Lys Gly Asp Ile Ala Ser Leu Gly Gly Lys210 215 220Lys Ser Lys Lys Lys Arg Ser Gly Val Lys Gly Ser Ser Ser Gly Ser225 230 235 240Ser Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Asp Ala Asn Ala245 250 255Glu Glu Glu Glu Gly Val Gln Lys Ala Ser Pro Leu Pro His Ser Pro260 265 270Pro Asp Glu Leu
275<210>53<211>1848<212>DNA<213>擴(kuò)增型T243<400>53ggcacgaggg aggaagcgcc gccgggtccg ctctgctctg ggtccggctg ggccatggag 60tccatgtctg agctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg 120ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg 180ctgctgctgc tgcgattgcc cagcaaatgc gaagtgtgca agtatgttgc tgtggagctg 240aagtcggctt ttgaggaaac gggaaagacc aaggaagtga ttgacaccgg ctatggcatc 300ctggacggga agggctctgg agtcaagtac accaagtcgg acttacggtt aattgaagtc 360actgagacca tttgcaagag gcttctggac tacagcctgc acaaggagag gactggcagc 420aaccggtttg ccaagggtat gtcggagacc tttgagacgc tgcacaacct agtccacaaa 480ggggtcaagg tggtgatgga tatcccctat gagctgtgga acgagacctc agcagaggtg 540gctgacctca agaagcagtg tgacgtgctg gtggaagagt ttgaagaggt gattgaggac 600tggtacagga accaccagga ggaagacctg actgaattcc tctgtgccaa ccacgtgctg 660aagggaaagg acacgagttg cctagcagag cggtggtctg gcaagaaggg ggacatagcc 720tccctgggag ggaagaaatc caagaagaag cgcagcggag tcaagggctc ctccagtggc 780agcagcaagc agaggaagga actggggggc ctgggggagg atgccaacgc cgaggaggag 840gagggtgtgc agaaggcatc gcccctccca cacagccccc ctgatgagct gtgagcccag 900cttagtgtcc ttgaatcaag acccctgact tcagagcttg ggacacgcac agcgcagcgc 960agcgcagctc cagcaaggac agctgctgtc cagcatcagg tctcctccct tggctgtgcc 1020cctttccttc ccttgaacaa cagcaagagg tggaaggatc tggggtgctg ggagacggca 1080ccccaaaggg aagaggagga ggagcagaag gcagctctct ttctacacag tccccctcac 1140gagctccggg gtccacccag catccccagg ctgagatcca ggctcctgac atggaagctg 1200aagagcatga ggcacataag atgctcacca gcgccccctt cagccaggaa ggactccgtg 1260cagcctcagc agccaggcct gcctcttcct tccaccaagc attctcttct gctggtcctt 1320gtcggatggt aaattcgaga acttccagga caaactcggg tgtggcacaa aggggctgga 1380cgccagagcc agagccacgc cagagactgc agagagggca cctgacctaa cccccctgga 1440aagccaatct gcagttcccg tgtccaccca ctcctcctga ggacgcctca tgctctgccc 1500agcccttctc ccagggctac cagagtaaac accttttggc ctttcggttt ggttcctggg 1560tcctcatcag cctccagagt gtcccctcat cgatcttttt tgcctttgtc ccccaatccc 1620aggggctgga aggccatcac catcattgga ggcttaacct gtcagttact aggaggtgct 1680gggagcgccc ggggttggtt tggggtaatc actcactggc tctcagcctt ctaacactgc 1740agccccttaa tacagttcct tctgttgtgg tgactcccac gcccccacac acacaccata 1800aaattatttc gatgctgttt cataactgta aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1848<210>54<211>279<212>PRT<213>擴(kuò)增型T243<400>54Met Glu Ser Met Ser Glu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu20 25 30Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu35 40 45Pro Ser Lys Cys Glu Val Cys Lys Tyr Val Ala Val Glu Leu Lys Ser50 55 60Ala Phe Glu Glu Thr Gly Lys Thr Lys Glu Val Ile Asp Thr Gly Tyr65 70 75 80Gly Ile Leu Asp Gly Lys Gly Ser Gly Val Lys Tyr Thr Lys Ser Asp85 90 95Leu Arg Leu Ile Glu Val Thr Glu Thr Ile Cys Lys Arg Leu Leu Asp100 105 110Tyr Ser Leu His Lys Glu Arg Thr Gly Ser Asn Arg Phe Ala Lys Gly115 120 125Met Ser Glu Thr Phe Glu Thr Leu His Asn Leu Val His Lys Gly Val130 135 140Lys Val Val Met Asp Ile Pro Tyr Glu Leu Trp Asn Glu Thr Ser Ala145 150 155 160Glu Val Ala Asp Leu Lys Lys Gln Cys Asp Val Leu Val Glu Glu Phe165 170 175Glu Glu Val Ile Glu Asp Trp Tyr Arg Asn His Gln Glu Glu Asp Leu180 185 190Thr Glu Phe Leu Cys Ala Asn His Val Leu Lys Gly Lys Asp Thr Ser195 200 205Cys Leu Ala Glu Arg Trp Ser Gly Lys Lys Gly Asp Ile Ala Ser Leu210 215 220Gly Gly Lys Lys Ser Lys Lys Lys Arg Ser Gly Val Lys Gly Ser Ser225 230 235 240Ser Gly Ser Ser Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Asp245 250 255Ala Asn Ala Glu Glu Glu Glu Gly Val Gln Lys Ala Ser Pro Leu Pro
260 265 270His Ser Pro Pro Asp Glu Leu275<210>55<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>55gggccatgga gtccatgtct gagct 25<210>56<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>56acttcgcatt tgctgggcaa tcgca 25<210>57<211>1362<212>DNA<213>人類TRP<400>57cgagccatgg attcaatgcc tgagcccgcg tcccgctgtc ttctgcttct tcccttgctg 60ctgctgctgc tgctgctgct gccggccccg gagctgggcc cgagccaggc cggagctgag 120gagaacgact gggttcgcct gcccagcaaa tgcgaagtgt gtaaatatgt tgctgtggag 180ctgaagtcag cctttgagga aaccggcaag accaaggagg tgattggcac gggctatggc 240atcctggacc agaaggcctc tggagtcaaa tacaccaagt cggacttgcg gttaatcgaa 300gtcactgaga ccatttgcaa gaggctcctg gattatagcc tgcacaagga gaggaccggc 360agcaatcgat ttgccaaggg catgtcagag acctttgaga cattacacaa cctggtacac 420aaaggggtca aggtggtgat ggacatcccc tatgagctgt ggaacgagac ttctgcagag 480gtggctgacc tcaagaagca gtgtgatgtg ctggtggaag agtttgagga ggtgatcgag 540gactggtaca ggaaccacca ggaggaagac ctgactgaat tcctctgcgc caaccacgtg 600ctgaagggaa aagacaccag ttgcctggca gagcagtggt ccggcaagaa gggagacaca 660gctgccctgg gagggaagaa gtccaagaag aagagcagca gggccaaggc agcaggcggc 720aggagtagca gcagcaaaca aaggaaggag ctgggtggcc ttgagggaga ccccagcccc 780gaggaggatg agggcatcca gaaggcatcc cctctcacac acagcccccc tgatgagctc 840tgagcccacc cagcatcctc tgtcctgaga cccctgattt tgaagctgag gagtcagggg 900catggctctg gcaggccggg atggccccgc agccttcagc ccctccttgc cttggctgtg 960ccctcttctg ccaaggaaag acacaagccc caggaagaac tcagagccgt catgggtagc 1020ccacgccgtc ctttcccctc cccaagtgtt tctctcctga cccagggttc aggcaggcct 1080tgtggtttca ggactgcaag gactccagtg tgaactcagg aggggcaggt gtcagaactg 1140ggcaccagga ctggagcccc ctccggagac caaactcacc atccctcagt cctccccaac 1200agggtactag gactgcagcc ccctgtagct cctctctgct tacccctcct gtggacacct 1260tgcactctgc ctggcccttc ccagagccca aagagtaaaa atgttctggt tctgaaaaaa 1320aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa1362<210>58<211>278<212>PRT<213>人類TRP<400>58Met Asp Ser Met Pro Glu Pro Ala Ser Arg Cys Leu Leu Leu Leu Pro1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Pro Glu Leu Gly Pro20 25 30Ser Gln Ala Gly Ala Glu Glu Asn Asp Trp Val Arg Leu Pro Ser Lys35 40 45Cys Glu Val Cys Lys Tyr Val Ala Val Glu Leu Lys Ser Ala Phe Glu50 55 60Glu Thr Gly Lys Thr Lys Glu Val Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ile Leu65 70 75 80Asp Gln Lys Ala Ser Gly Val Lys Tyr Thr Lys Ser Asp Leu Arg Leu85 90 95Ile Glu Val Thr Glu Thr Ile Cys Lys Arg Leu Leu Asp Tyr Ser Leu100 105 110His Lys Glu Arg Thr Gly Ser Asn Arg Phe Ala Lys Gly Met Ser Glu115 120 125Thr Phe Glu Thr Leu His Asn Leu Val His Lys Gly Val Lys Val Val130 135 140Met Asp Ile Pro Tyr Glu Leu Trp Asn Glu Thr Ser Ala Glu Val Ala145 150 155 160Asp Leu Lys Lys Gln Cys Asp Val Leu Val Glu Glu Phe Glu Glu Val165 170 175Ile Glu Asp Trp Tyr Arg Asn His Gln Glu Glu Asp Leu Thr Glu Phe180 185 190Leu Cys Ala Asn His Val Leu Lys Gly Lys Asp Thr Ser Cys Leu Ala195 200 205Glu Gln Trp Ser Gly Lys Lys Gly Asp Thr Ala Ala Leu Gly Gly Lys210 215 220Lys Ser Lys Lys Lys Ser Ser Arg Ala Lys Ala Ala Gly Gly Arg Ser225 230 235 240Ser Ser Ser Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gly Gly Leu Glu Gly Asp Pro245 250 255Ser Pro Glu Glu Asp Glu Gly Ile Gln Lys Ala Ser Pro Leu Thr His260 265 270Ser Pro Pro Asp Glu Leu275<210>59<211>107<212>DNA<213>通過(guò)敲除產(chǎn)生的缺失<400>59cgcgccccgc tgcctcttat ttcctttgct gctgctgctt ccgctgctgc tccttcctgc 60cccgaagcta ggcccgagtc ccgccggggc tgaggagacc gactggg 10權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞，所述細(xì)胞在編碼TRP的靶DNA序列中包含破壞。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述破壞用以下方法產(chǎn)生，所述方法包括(a)獲得與所述靶DNA序列的第一區(qū)同源的第一序列；(b)獲得與所述靶DNA序列的第二區(qū)同源的第二序列；(c)將所述第一序列和所述第二序列插入到打靶構(gòu)建體中；和(d)將所述打靶構(gòu)建體導(dǎo)入所述細(xì)胞中，產(chǎn)生在所述靶DNA序列中產(chǎn)生破壞的同源重組體。
3.權(quán)利要求2的細(xì)胞，其中所述方法還包括在步驟(b)之后；(i)提供一種載體，所述載體具有編碼正選擇標(biāo)記的基因；和(ii)利用不依賴連接作用的克隆，將所述第一序列和所述第二序列插入所述載體中，構(gòu)成所述構(gòu)建體；其中所述正選擇標(biāo)記位于所述構(gòu)建體中所述第一序列和所述第二序列之間。
4.權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中所述載體還包含一個(gè)編碼篩選標(biāo)記的基因。
5.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述靶DNA序列包含CTG三核苷酸重復(fù)。
6.權(quán)利要求5的細(xì)胞，其中所述CTG三核苷酸重復(fù)編碼亮氨酸殘基。
7.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述靶基因序列是T243或其天然存在的等位基因變異體。
8.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述靶DNA序列包含SEQ IDNO47。
9.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述靶DNA序列包含SEQ ID NO45和SEQ ID NO46。
10.權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中所述載體還包含鄰接所述正選擇標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)重組酶靶位點(diǎn)。
11.權(quán)利要求2的細(xì)胞，其中所述第一序列是SEQ ID NO50，而所述第二序列是SEQ ID NO51。
12.權(quán)利要求2的細(xì)胞，其中所述第一序列和所述第二序列用以下方法獲得，所述方法包括(a)獲得能夠與所述靶雜交的兩種引物，其中所述引物形成擴(kuò)增產(chǎn)物的終點(diǎn)；(b)提供含有所述靶序列的小鼠基因組DNA文庫(kù)；(c)使所述引物退火至所述文庫(kù)中的互補(bǔ)序列上；(d)擴(kuò)增所述第一序列和所述第二序列；和(e)分離所述擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物。
13.權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中所述第一引物是SEQ ID NO45。
14.權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中所述第二引物是SEQ ID NO46。
15.權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中所述擴(kuò)增包括PCR。
16.權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中所述擴(kuò)增還包括長(zhǎng)距離PCR。
17.權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中所述小鼠基因組文庫(kù)是一種質(zhì)粒文庫(kù)。
18.權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中所述小鼠基因組文庫(kù)是一種噬菌體文庫(kù)，所述方法還包括獲得能夠與噬菌體載體序列雜交的兩種引物，使得所述擴(kuò)增產(chǎn)物在一個(gè)末端以一種靶序列引物終止，而在另一個(gè)末端以一種載體引物終止。
19.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在所述靶DNA序列中包含純合破壞。
20.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是鼠類細(xì)胞。
21.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是人類細(xì)胞。
22.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是干細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
24.一種胚泡，所述胚泡含有權(quán)利要求23的胚胎干細(xì)胞。
25.打靶構(gòu)建體，所述打靶構(gòu)建體是在權(quán)利要求2的方法中使用的打靶構(gòu)建體。
26.一種非人類脊椎動(dòng)物，所述脊椎動(dòng)物在編碼TRP的基因中包含雜合破壞。
27.權(quán)利要求26的脊椎動(dòng)物，其中所述脊椎動(dòng)物是一種哺乳動(dòng)物。
28.權(quán)利要求26的脊椎動(dòng)物，其中所述哺乳動(dòng)物是小鼠。
29.權(quán)利要求28的小鼠，其中所述小鼠用以下方法產(chǎn)生，所述方法包括(a)將權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的干細(xì)胞引入胚泡中；(b)將所得的胚泡植入假孕小鼠體內(nèi)，其中所述假孕小鼠分娩出在其種系中含有被破壞的編碼所述TRP的基因的嵌合小鼠；和(c)繁育所述嵌合小鼠，以產(chǎn)生在編碼所述TRP的基因中包含雜合破壞的小鼠。
30.權(quán)利要求28的小鼠，其中所述小鼠用以下方法產(chǎn)生，所述方法包括(a)將權(quán)利要求3的干細(xì)胞引入胚泡中；(b)將所得的胚泡植入假孕小鼠體內(nèi)，其中所述假孕小鼠分娩出在其種系中含有被破壞的編碼所述TRP的基因的嵌合小鼠；和(c)繁育所述嵌合小鼠，以產(chǎn)生在編碼所述TRP的基因中包含雜合破壞的小鼠。
31.權(quán)利要求28的小鼠，其中所述TRP由T243或其天然存在的等位基因變異體編碼。
32.一種敲除小鼠，所述敲除小鼠在編碼TRP的基因中包含一個(gè)純合破壞，其中所述破壞抑制所述野生型TRP的產(chǎn)生，所述小鼠通過(guò)使權(quán)利要求28的兩只小鼠交配而產(chǎn)生。
33.權(quán)利要求32的敲除小鼠，其中所述破壞改變了TRP基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或剪接位點(diǎn)，使得所述小鼠不表達(dá)功能型TRP。
34.權(quán)利要求32的敲除小鼠，其中所述破壞是插入突變、錯(cuò)義突變、移碼突變或缺失突變。
35.權(quán)利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括相對(duì)于野生型成年小鼠而言體重降低。
36.權(quán)利要求35的敲除小鼠，其中所述表型還包括相對(duì)于野生型成年小鼠而言體重降低至少約15％。
37.權(quán)利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括相對(duì)于野生型成年小鼠而言身長(zhǎng)降低。
38.權(quán)利要求37的敲除小鼠，其中所述表型還包括相對(duì)于野生型成年小鼠而言身長(zhǎng)降低至少約10％。
39.權(quán)利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括相對(duì)于野生型成年小鼠而言體重與身長(zhǎng)之比降低。
40.權(quán)利要求39的敲除小鼠，其中所述表型還包括相對(duì)于正常的野生型成年小鼠而言體重與身長(zhǎng)之比降低至少約20％。
41.權(quán)利要求32的敲除小鼠，其中相對(duì)于野生型成年小鼠而言，所述成年小鼠的表型包括(a)體重降低；(b)身長(zhǎng)降低；和(c)體重與身長(zhǎng)之比降低。
42.權(quán)利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括與軟骨病相關(guān)的癥狀。
43.權(quán)利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括與骨病相關(guān)的癥狀。
44.權(quán)利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括與腎病相關(guān)的癥狀。
45.權(quán)利要求41的敲除小鼠，其中所述表型在出生時(shí)不明顯。
46.一種細(xì)胞或細(xì)胞系，所述細(xì)胞或細(xì)胞系來(lái)源于權(quán)利要求28或權(quán)利要求32的含有所述破壞的小鼠。
47.一種鑒定能夠影響敲除小鼠表型的因子的方法，所述方法包括(a)將推定的因子給予權(quán)利要求32的敲除小鼠；(b)測(cè)定所述敲除小鼠對(duì)所述推定因子的反應(yīng)；和(c)將所述反應(yīng)與野生型小鼠的反應(yīng)比較；(d)從而鑒定出能夠影響敲除小鼠表型的因子。
48.一種因子，所述因子是按照權(quán)利要求47的方法鑒定的。
49.一種確定編碼TRP的基因中所述三核苷酸重復(fù)的擴(kuò)增是否引起表型改變的方法，所述方法包括(a)提供權(quán)利要求10的敲除細(xì)胞和一種包含側(cè)翼為重組酶靶位點(diǎn)的三核苷酸重復(fù)的合成核酸；(b)使所述敲除干細(xì)胞與所述合成核酸在識(shí)別所述重組酶靶位點(diǎn)的重組酶存在下進(jìn)行接觸，使得在所述合成核酸之間發(fā)生重組，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；和(c)比較所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與野生型細(xì)胞的表型；從而確定三核苷酸擴(kuò)增是否引起表型改變。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述三核苷酸重復(fù)包括CTG。
51.權(quán)利要求49的方法，其中所述方法包括應(yīng)用Cre重組酶-lox靶系統(tǒng)。
52.權(quán)利要求49的方法，其中所述方法包括應(yīng)用FLP重組酶-FRT靶系統(tǒng)。
53.一種敲除細(xì)胞或細(xì)胞系，所述細(xì)胞或細(xì)胞系在編碼TRP的靶DNA序列中包含破壞。
54.權(quán)利要求53的敲除細(xì)胞或細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞來(lái)源于權(quán)利要求32的小鼠。
55.組織，所述組織得自權(quán)利要求28或權(quán)利要求32的小鼠。
56.權(quán)利要求53的敲除細(xì)胞，其中所述TRP由T243或其天然存在的等位基因變異體編碼。
57.一種鑒定能夠影響敲除細(xì)胞系表型的因子的方法，所述方法包括(a)將權(quán)利要求53的敲除細(xì)胞與推定的因子接觸；(b)測(cè)定所述細(xì)胞對(duì)所述推定因子的反應(yīng)；和(c)將所述反應(yīng)與野生型細(xì)胞的反應(yīng)比較；(d)從而鑒定出能夠影響敲除細(xì)胞表型的因子。
58.一種細(xì)胞系，所述細(xì)胞系包含一種與在所述細(xì)胞系中有功能的啟動(dòng)子有效連接的編碼TRP的核酸序列。
59.權(quán)利要求58的細(xì)胞系，其中所述TRP由T243或其天然存在的等位基因變異體編碼。
60.權(quán)利要求59的細(xì)胞系，其中所述TRP基本上由SEQ IDNO52的氨基酸序列或其天然存在的等位基因變異體組成。
61.三核苷酸重復(fù)蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)由T243或其天然存在的等位基因變異體編碼。
62.一種鼠類TRP，所述TRP基本上由SEQ ID NO52的序列或其天然存在的等位基因變異體組成。
63.一種人類TRP，所述TRP基本上由SEQ ID NO58的序列或其天然存在的等位基因變異體組成。
64.一種核酸序列，所述核酸序列編碼權(quán)利要求62的鼠類TRP，具有SEQ ID NO47或其天然存在的等位基因變異體的序列。
65.一種核酸序列，所述核酸序列編碼權(quán)利要求63的人類TRP，具有SEQ ID NO47或其天然存在的等位基因變異體的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、與基因功能鑒定相關(guān)的組合物和方法。
文檔編號(hào)A61P19/00GK1425023SQ00817735
公開日2003年6月18日 申請(qǐng)日期2000年10月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月26日
發(fā)明者R·克萊恩, W·馬休斯, M·莫雷, K·D·阿倫 申請(qǐng)人:德爾塔根公司