專利名稱：皮膚致病菌群的抗粘合試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及根據(jù)皮膚病原體抗粘合的性能選擇的細(xì)菌試劑用于制備用于化妝用、藥用或獸醫(yī)用并旨在穩(wěn)定和/或調(diào)節(jié)哺乳動物的皮膚生態(tài)系統(tǒng)的組合物中的用途，本發(fā)明還涉及含有這種試劑的組合物。
已知許多抗這些病原劑的治療方法。最常用的是使用抗生素或化學(xué)抗菌試劑。它們是例如以醛類和衍生物為基礎(chǔ)的組合物。
因此，公開的專利申請F(tuán)R 2740039描述了從醛類和雙官能化合物選擇的物質(zhì)，優(yōu)選戊二醛，用于抑制病原體菌株如金黃色葡萄球菌附著在角質(zhì)細(xì)胞和角膜細(xì)胞(cornéocyte)上的用途。
因此，已知六氯酚及其衍生物為抗菌物質(zhì)并且更具體地說是用于抵抗瘡皰丙酸桿菌。
這些治療通常昂貴且對身體和環(huán)境有害。
另外，現(xiàn)在還知道使用某些微生物菌株的抗真菌、殺菌或制菌性能的供選擇使用的無毒性治療。
因此，PCT申請WO 97/366603證實了干酪乳桿菌菌株(Lactobacillus casei)的抗真菌性能。
其它細(xì)菌試劑，例如芽孢桿菌(Bacillus)，也可用于皮膚或粘膜上。特別是，在申請WO 98/47374中，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus lacterosporus)和左旋乳酸芽孢桿菌(Bacilluslaevolacticus)的菌株都用于組合物中旨在預(yù)防細(xì)菌、病毒或真菌感染皮膚或粘膜。
本發(fā)明旨在發(fā)現(xiàn)一種能夠控制和調(diào)節(jié)皮膚生態(tài)系統(tǒng)的新型細(xì)菌試劑。
為此，本發(fā)明涉及細(xì)菌試劑用于制備化妝用、藥用或獸醫(yī)用并打算對人或動物施用以預(yù)防或治療皮膚系統(tǒng)的病原體誘導(dǎo)的病癥為目的的組合物中的用途，所述細(xì)菌試劑是乳酸細(xì)菌的提取物，或者是乳酸細(xì)菌，它是根據(jù)其與皮膚細(xì)胞的粘附性能和調(diào)節(jié)皮膚病原體結(jié)合的性能進(jìn)行選擇的，特別是通過抑制其粘合。
例如，所述細(xì)菌試劑可以選自乳桿菌屬、微球菌屬或雙歧桿菌屬的菌株，并且優(yōu)選選自約氏乳桿菌CNCM I-1225、變異微球菌CNCMI-1586、變異微球菌CNCM I-1587或乳雙歧桿菌ATCC 27536菌株。
所述細(xì)菌菌株可以活、失活或半活性形式使用。
所述細(xì)菌試劑可以凍干粉末形式使用，例如可以含有約10×108-10×1011cfu/g。
本發(fā)明還涉及用于化妝用、藥用或獸醫(yī)用且含有至少一種能夠穩(wěn)定和/或調(diào)節(jié)皮膚系統(tǒng)的病原菌叢的細(xì)菌試劑的組合物，所述細(xì)菌試劑是細(xì)菌提取物，或者是細(xì)菌，它是針對皮膚系統(tǒng)的病原體與皮膚細(xì)胞粘合的性能及其抗粘合性能進(jìn)行選擇的。
該組合物也可以用于眼科學(xué)或鼻方面的應(yīng)用。
例如，該組合物可以具體地是膏、洗劑、皮膚病清洗棒(paindermatologique)、香波或粉末的形式。發(fā)明詳述名詞“皮膚系統(tǒng)”不僅指所有皮膚細(xì)胞(即角質(zhì)細(xì)胞)，而且指角膜細(xì)胞。
本發(fā)明提供了一種細(xì)菌試劑，它是根據(jù)其與皮膚細(xì)胞粘合的性能以及穩(wěn)定和調(diào)節(jié)皮膚系統(tǒng)的病原細(xì)菌叢的性能，特別是通過抑制病原體如金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌或瘡皰丙酸桿菌的粘合而選擇的。
為此，測試了許多細(xì)菌菌株與人角質(zhì)細(xì)胞附著的性能(參見實施例1)。
從由此測試的各種細(xì)菌菌株，可以選擇乳桿菌屬、微球菌屬和雙歧桿菌屬的菌株，并且更具體地說是約氏乳桿菌菌株(NCC 533)、兩個變異微球菌菌株(NCC 1482，NCC 1520)和乳雙歧桿菌菌株(ATCC27536)。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，將約氏乳桿菌菌株(NCC 533)和變異微球菌菌株(NCC 1482和NCC 1520)保藏在Collection Nationalede Culturesde Microorganismes(CNCM)，Institut Pasteur(巴斯德研究所國家微生物培養(yǎng)收集處)，28rue du Docteur Roux，75724Paris Cedex15，法國，約氏乳桿菌的保藏日期是1992年6月30日，登記號為CNCMI-1225，變異微球菌NCC 1482和NCC 1520的保藏日期是1995年6月7日，登記號為CNCM I-1586和CNCM I-1587。
乳雙歧桿菌菌株(ATCC 27536)可以從漢森(Hansen)公司(Chr.Hansen A/S，10-12Boege Alle，P.O.Box407，DK-2970Hoersholm，丹麥)獲得。
下面給出了關(guān)于這些菌株的形態(tài)和常規(guī)性能的細(xì)節(jié)約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)CNCM I-1225形態(tài)學(xué)-非動性革蘭氏陽性微生物，不形成孢子。
-相當(dāng)短且粗的分離桿狀(btonnets)代謝-微需氧微生物，均勻發(fā)酵代謝產(chǎn)生L(+)和D(-)乳酸。
-其它特征過氧化氫酶(-)、產(chǎn)生CO2(-)、精氨酸水解(-)。
糖的發(fā)酵苦杏仁苷(+)、阿拉伯糖(-)、纖維二糖(+)、七葉苷(+)、果糖(+)、半乳糖(-)、葡萄糖(+)、乳糖(+)、麥芽糖(+/-)、甘露醇(-)、甘露糖(+)、蜜二糖(-)、蜜三糖(+)、核糖(-)、水楊苷(+)、蔗糖(+)、海藻糖(+)變異鏈球菌(Micrococcus varians)CNCM I-1586(NCC 1482)和CNCM I-1587(NCC 1520)形態(tài)學(xué)-革蘭氏陽性微生物，永遠(yuǎn)不運(yùn)動。
-球形，為不規(guī)則排列的四分體形式。
代謝-需氧微生物，過氧化氫酶(+)-其它特征在BHI培養(yǎng)基上為黃色。所述菌株的最佳生長溫度是25-37℃。
糖的發(fā)酵果糖(+)、葡萄糖(+)
將本發(fā)明的細(xì)菌用于制備打算預(yù)防或治療與皮膚系統(tǒng)的病原體，例如金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌或瘡皰丙酸桿菌，或者酵母菌有關(guān)病癥(désordres)的組合物。
這些皮膚病癥具體地可以是特應(yīng)性皮炎(在緩解期，作為維護(hù)治療)、痤瘡、念珠菌病、皮脂溢皮炎、花斑糠疹、膿皰疹、濕疹性二次感染。
皮膚系統(tǒng)的紊亂也可能與抗生素或抗霉菌劑對糖尿病(念珠菌病)、粘膜病狀(陰道念珠菌病)、慢性濕疹(內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡)、過敏性皮膚(早產(chǎn)嬰兒，兒童)或油性皮膚(與可能促進(jìn)細(xì)菌生長的激素調(diào)節(jié)障礙有關(guān))或頭皮屑(états pelliculaires)的治療有關(guān)。
本發(fā)明的細(xì)菌可以其活的或半活性形式，或者以失活形式使用。術(shù)語“半活性形式的細(xì)菌”是指生理活性低的細(xì)菌。例如，其活性可以通過較長的指數(shù)生長期或傳代時間、對環(huán)境的改變具有減慢的或不完全的生理反應(yīng)的代謝來測定。在某些極端情況下，由于細(xì)菌不再能忍受環(huán)境的變化，因此細(xì)菌數(shù)量可能降低。
也可以使用細(xì)菌培養(yǎng)上清液。
根據(jù)本發(fā)明的第一個實施方式，所述細(xì)菌試劑可以是細(xì)菌提取物、或者細(xì)菌，所述細(xì)菌是活的形式。然后細(xì)菌試劑優(yōu)選為凍干粉末狀，例如通過EP 818529中所述的方法獲得的。粉末可以含有10×108-10×1011cfu/g。
根據(jù)另一實施方式，細(xì)菌試劑可以為半活性形式的細(xì)菌提取物，或者細(xì)菌?？梢詭追N方式將菌株部分失活，特別是通過-冷凍干燥，由在液氮中冷凍/在37℃熔融的循環(huán)組成。然后可以獲得約1log的降低，-紫外線作用(在254nm下15-60分鐘，距離為20cm)降低2-3logs，-熱作用(70℃持續(xù)3小時)例如降低約3-4logs。
然后可以將細(xì)菌試劑以含有指數(shù)10×106cfu/g的粉末形式使用，并且優(yōu)選為干燥組合物，例如干香波或其它粉末組合物，它可以含有高達(dá)10％的細(xì)菌提取物。
最后，細(xì)菌試劑也可以是失活形式的細(xì)菌提取物，或者細(xì)菌。所述細(xì)菌優(yōu)選通過在約90℃下熱處理約2小時來失活。細(xì)菌試劑為含有10×108-10×1012cfu/g的凍干粉末形式。它也可以高達(dá)5％，優(yōu)選0.05-3％用于液體組合物并以高達(dá)10％用于粉狀組合物中。
本發(fā)明還涉及用于化妝用、藥用或獸醫(yī)用且含有具有上述性能的細(xì)菌試劑的組合物。
為了制備這種組合物，將至少一種活、半活性或失活形式的細(xì)菌菌株加入藥用或化妝用可接受的載體中，其加入量隨所需用途的功能而變化。相對組合物的總重量，細(xì)菌試劑可以高達(dá)約5％存在，并且針對粉末形式的組合物可以高達(dá)1O％存在，并且優(yōu)選0.5-2％。
本發(fā)明的組合物可以經(jīng)局部或眼路徑給藥。
經(jīng)過局部路徑，以本發(fā)明化合物為基礎(chǔ)的藥用組合物優(yōu)選用于治療皮膚和粘膜，并且可以是油膏、膏劑、乳劑、軟膏、粉末、浸濕藥簽、溶液、凝膠、噴霧劑、洗劑或懸液的形式。它們也可以是微球體或納米球體、或者脂質(zhì)體的或聚合物的囊、或聚合物碎片和水凝膠的形式，從而控制釋放。這些通過局部路徑給藥的組合物或者可以是無水形式或者可以是含水形式，這取決于臨床指征。
通過眼路徑，它們主要是洗眼劑。
在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明涉及一種在化妝用可接受的載體中含有至少一種如上所述細(xì)菌試劑的化妝用組合物。相對于組合物的總重量，所述化妝用組合物可以含有比例為至少O.O01％的細(xì)菌試劑，并優(yōu)選O.05-3％。
該化妝用組合物特別是打算用于身體和頭發(fā)衛(wèi)生。具體地它可以是膏劑、乳劑、洗劑、凝膠、微球體或納米球體、或脂質(zhì)體或聚合物囊、肥皂或香波的形式。
在本發(fā)明的組合物中，活或失活的洗劑試劑可以與類維生素A(rétino de)或皮質(zhì)類固醇組合，或者可以與抗自由基劑、與α-羥基或α-酮基酸或其衍生物、或者與離子通道阻斷劑混合。
本發(fā)明的藥用和化妝用組合物也可以含有惰性添加劑或者甚至藥效活性或化妝用活性添加劑、或者這些添加劑的組合，具體地說潤濕劑脫色素劑如氫醌、壬二酸、咖啡酸或曲酸；軟化劑；增濕劑如甘油、PEG-400、硫代嗎啉酮及其衍生物、或脲；抗皮脂溢劑或抗座瘡劑，例如S-羧基甲基半胱氨酸、S-苯甲基半胱胺、其鹽和其衍生物，或者過氧化苯甲酰；抗生素如紅霉素及其酯、新霉素、克林霉素及其酯；四環(huán)素類；抗真菌劑如酮康唑或4，5-聚亞甲基-3-異噻唑啉酮類；促進(jìn)頭發(fā)再生的試劑，例如Minoxidil(2，4-二氨基-6-哌啶基嘧啶-3-氧化物)及其衍生物、Diazoxide(7-氯-3-甲基-1，2，4-苯并噻二嗪-1，1-二氧化物)和Phényto n(5，4-二苯基咪唑啉-2，4-二酮)；非甾類消炎劑；類胡蘿卜素，特別是β-胡蘿卜素；抗牛皮癬藥如蒽林及其衍生物；和最后，二十碳-5，8，11，14-四炔酸(tétrayno que)和二十碳-5，8，11-三炔酸(tryno que)、其酯和酰胺。
本發(fā)明的組合物還可以含有防腐劑如對羥基苯甲酸酯類、穩(wěn)定劑、水分調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、滲透壓改進(jìn)劑、乳化劑、UV-A和UV-B防護(hù)劑、和抗氧化劑如α-生育酚、丁基羥基茴香醚或丁基羥基甲苯。
最后，本發(fā)明還涉及一種動物獸醫(yī)和化妝用的含有至少一種上面定義的細(xì)菌試劑的組合物。這種組合物例如可以是干香波或液體香波、粉末、泡沫體或洗劑的形式。它可以含有高達(dá)10％的所述細(xì)菌試劑。
本發(fā)明的組合物特別用于治療或預(yù)防健康的、過敏性的和/或病態(tài)的皮膚和/或粘膜，它們可能呈現(xiàn)皮膚系統(tǒng)病癥，例如特別是-傳染性并發(fā)癥如重復(fù)感染性特應(yīng)性皮炎、膿皰病基濕疹、潰瘍、創(chuàng)傷、燒傷、重復(fù)感染性炎癥性座瘡，-皮炎如膿皰病、表面毛囊炎-皮脂溢皮炎、花斑糠疹，-皮真菌病(頭癬、體癬、腳癬、黑布臘氏濕疹、環(huán)狀皰疹)-念珠菌病(陰道的，指間的，與危險職業(yè)或糖尿病有關(guān)的)-與抗生素或抗霉菌劑(anti-mycosique)治療有關(guān)的紊亂，-激素調(diào)節(jié)障礙引起的紊亂(油性皮膚)或頭皮屑(étatspelliculaires)-過敏性皮膚(早產(chǎn)嬰兒、兒童)所述獸醫(yī)用的組合物尤其用于治療或預(yù)防由于葡萄球菌感染(由于金黃色葡萄球菌、中間葡萄球菌(S.intermedians))、鏈球菌感染(由于釀膿鏈球菌)和霉菌感染(因白色念珠菌的含念珠菌病和因P.canis的pytirosporoses)引起的功能障礙。
通過以下實施方式的實施例的說明，本發(fā)明的其它特征將清晰可見，這些實施例是為了說明本發(fā)明而提供的，而不限制本發(fā)明范圍。
實施例實施例1細(xì)菌試劑的選擇在本發(fā)明范圍中，將12種不同細(xì)菌菌株粘附到皮膚細(xì)胞上，特別是粘附到培養(yǎng)物中HaCat人角質(zhì)細(xì)胞上，進(jìn)行研究。這些菌株屬于乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、微球菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和丙酸桿菌屬種。
將這些細(xì)菌培養(yǎng)物(1ml)于10ml培養(yǎng)基(參見表1)中過夜。為了這些粘合試驗，將這些細(xì)菌預(yù)培養(yǎng)直到獲得濃度5.0×108-109cfu/ml。該cfu是通過測定每種菌株的光密度來表征的(1.0×108cfu/ml下的DO參見表1)。
然后，測定這些細(xì)菌菌株的粘合特性。
表1細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件
NCC 533、NCC 90、NCC 536和NCC 585在厭氧條件下培養(yǎng)(Gaspack H2+CO2)。
人角質(zhì)細(xì)胞系針對3個角質(zhì)細(xì)胞系研究了細(xì)菌的粘合性能-SV40 T-Ag永生化細(xì)胞系如EP 780469中所述的DK2-NR和FK2-NR細(xì)胞，和-HPV(人乳突淋瘤病毒)E6/E7和SV40 T-Ag永生化細(xì)胞系如WO 99/02347中所述的DK7-NR細(xì)胞系。
這些細(xì)胞系的培養(yǎng)基DK7-NR、FK2-NRNR-2(Biofluids，Rockville，MD 20850)(EP780469)。
DK2-NRNR-M(Biofluids，Rockville，MD 20850)。
將這些角質(zhì)細(xì)胞系以5×105個角質(zhì)細(xì)胞/cm2的比例培養(yǎng)，接種于涂布6-孔簇(Becton Dickinson，lincoln Park，NJ)中。涂布液由補(bǔ)充有以下物質(zhì)的基本培養(yǎng)基組成10μm/ml人纖連蛋白(BectonDickinson)、31μg/ml牛膠原I(Vitrogen，Collagen Corporation，F(xiàn)remont，CA)和0.1mg/ml BSA(Biofluids，Rockville，MD 20850)。6-8天之后，這些細(xì)胞培養(yǎng)物形成單層(匯合)。接下來，使培養(yǎng)基中的Ca2+濃度升至1.5mM以誘導(dǎo)細(xì)胞分化。在沒有抗生素的情況下，將這些細(xì)胞在高鈣濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。針對這些粘合試驗，將這些細(xì)胞培養(yǎng)物用緩沖液(HBSS，Ca2+1.0mM)沖洗3次。
放射性標(biāo)記通過向培養(yǎng)基中加入100μCi/10ml的2-3H-腺嘌呤(Amersham，TRK.311)將這些細(xì)菌接種標(biāo)記過夜。將等分量的細(xì)菌在沒有3H-腺嘌呤的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將未標(biāo)記(冷的)上清液放置在一邊，以便調(diào)整粘合試驗的cfu/ml。
粘合試驗在4000rpm下將細(xì)菌懸液離心10分鐘。在調(diào)整光密度(DO)之前，將這些顆粒于HBSS中洗滌2次。測定每一菌株的DO，以便將細(xì)菌的最終濃度調(diào)整至1.0×106、1.0×107、1.0×108和1.0×109cfu/ml。這些粘合試驗的培養(yǎng)基是1∶1的角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)菌培養(yǎng)基的未標(biāo)記上清液的混合物。
為了分析細(xì)菌在沒有角質(zhì)細(xì)胞的底物上的粘合性能，將細(xì)菌懸液在塑料盤和涂布有細(xì)胞的塑料盤上培養(yǎng)。
分析培養(yǎng)物用HBSS(Ca2+，1.0mM)洗滌3次之后，室溫下將與角質(zhì)細(xì)胞結(jié)合的細(xì)菌于1N NaOH溶液中溶解30分鐘。用1ml芐索氫氧化銨(hydroxyde de benzethonium)(Sigma，St.Louis，USA)將溶液轉(zhuǎn)移到閃爍小瓶中。在60℃下1小時之后，通過液體閃爍計數(shù)(dpm)測定標(biāo)記細(xì)菌的3H活性。
粘合指數(shù)(AI)是以3H(dpm/孔)、以細(xì)菌懸液的總3H活性(dpm/ml)的％計算的。
結(jié)果粘合指數(shù)(AI)13種不同細(xì)菌菌株的粘合指數(shù)是通過測定放射性標(biāo)記微生物的3H-腺嘌呤活性來計算的。結(jié)果列于表2中。
表2FK2-NR角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)菌菌株的粘合指數(shù)
結(jié)果顯示，以下菌株獲得最高粘合指數(shù)乳雙歧桿菌ATCC 27536、約氏乳桿菌NCC 533(CNCM I-1225)菌株和變異微球菌NCC 1482(CNCMI-1586)、NCC 1520(CNCM I-1587)和NCC 1583菌株。
實施例2通過變異微球菌NCC 1482或約氏乳桿菌NCC 533抑制金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌粘合的體外試驗微生物和培養(yǎng)方法通過在斜面上(sur pente)由培養(yǎng)物傳代培養(yǎng)(repiquage)來將病原體金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌于肉湯(bouillon)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(表3)。以系列稀釋液為基礎(chǔ)并在瓊脂培養(yǎng)基中計數(shù)對每一測定的病菌建立DO/細(xì)菌密度對應(yīng)關(guān)系。
表3
培養(yǎng)基TCS(AES，Combourg，代號AEB 141502)BHI(UNIPATH SA，Dardilly，代號CM 225)轉(zhuǎn)化的人角質(zhì)細(xì)胞使用HaCaT系的永生化人角質(zhì)細(xì)胞(Boukamp P.等，J.Cell Biol.，106，761-771，1988)。將這些HaCaT細(xì)胞于補(bǔ)充有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中在37℃和5％ CO2下培養(yǎng)。
將6-孔簇(Becton Dickinson)以比例104個細(xì)胞/cm2接種。4-5天之后，細(xì)胞達(dá)到匯合。匯合之后進(jìn)行4-5天的粘合試驗。在這些試驗之前將這些單層用PBS洗滌3次。
放射性標(biāo)記將這些細(xì)菌用2-3H-腺嘌呤(Amersham，TRK 311)于比例為100μCi/10ml的肉湯培養(yǎng)基中標(biāo)記。將這些懸液洗滌3次，然后再次懸浮于PBS中。在該相同緩沖液中調(diào)整細(xì)胞密度。
角質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)物中的粘合試驗將1ml放射性標(biāo)記過的細(xì)菌懸液于35℃下培養(yǎng)1小時。單層用PBS緩沖液沖洗3次并通過加入1N NaOH于室溫下溶解30分鐘。將溶解物轉(zhuǎn)移到閃爍小瓶中并在60℃下用1ml的氫氧化季銨(hyamine)(Carlo Erba，代碼464951)培養(yǎng)1小時。該3H活性是在液體閃爍計數(shù)器中計數(shù)的。每一試驗重復(fù)三次。還用塑料載體進(jìn)行對照。
該粘合是通過粘合的放射活性與加入的放射活性之比再乘以100定義的。
粘合抑制試驗洗滌和再次懸浮于PBS中之后，將放射性標(biāo)記過的病原體和冷細(xì)菌菌株用該單層同時培養(yǎng)。將試驗重復(fù)3次以使細(xì)菌試劑密度占3log。
結(jié)果對金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌、約氏乳桿菌NCC 533和變異微球菌NCC 1482，測定它們在培養(yǎng)物中與HaCaTen角質(zhì)細(xì)胞的粘合。結(jié)果列于表4。
表4
結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌、約氏乳桿菌NCC 533和變異微球菌NCC 1482與培養(yǎng)物中的角質(zhì)細(xì)胞粘合。當(dāng)細(xì)菌試劑的密度增加時，病原體遞增地替換。
實施例3通過活或失活的約氏乳桿菌NCC 533抑制金黃色葡萄球菌的體外試驗體外粘合模型是以用單層永生化人角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT系)培養(yǎng)放射性標(biāo)記過且校準(zhǔn)過的皮膚病原微生物(金黃色葡萄球菌)懸液為基礎(chǔ)的(Boukamp P.等，J Cell Biol.，106，761-771，1988)。
通過測定留在單層上的放射性活性評價在單層上病原體和待測定化合物共培養(yǎng)時針對該粘合的細(xì)菌試劑(約氏乳桿菌NCC 533，活的或者失活的形式)的抑制活性。
角質(zhì)細(xì)胞為此，將HaCaT細(xì)胞于補(bǔ)充有10％胎牛血清的DMEM中于37℃和5％的CO2下培養(yǎng)。將它們以1.0×104個細(xì)胞/cm2的比例接種于6-孔蔟中。匯合之后進(jìn)行5天的粘合試驗。將這些單層用PBS洗滌3次，之后用微生物培養(yǎng)。
微生物金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)于TCS培養(yǎng)基中在有氧和35℃下培養(yǎng)。
約氏乳桿菌NCC 533于MRS培養(yǎng)基中在厭氧和37℃下培養(yǎng)。針對粘合抑制試驗，在PBS緩沖液中由48-小時培養(yǎng)物制備細(xì)菌的濃懸液。將該懸液調(diào)整至2×108cfu/ml(525nm下的DO＝1.5)。在PBS緩沖液中制備系列稀釋液，以便獲得2.0×107和2.0×106cfu/ml的懸液。將各種懸液在厭氧和37℃下培養(yǎng)的MRS瓊脂上計數(shù)。
失活形式的NCC 533是通過將乳桿菌經(jīng)過液氮下冷凍/室溫下熔融的幾次循環(huán)的濃稠懸液凍干獲得的。試驗的制品相當(dāng)于4.0×1010cfu/g的生物量。
放射性標(biāo)記金黃色葡萄球菌的放射性標(biāo)記是通過在TCS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時的過程中加入100μCi/10ml的3H腺嘌呤獲得的。然后在3000rpm下將懸液離心10分鐘并在PBS中洗滌3次。用PBS將細(xì)胞密度調(diào)整至約2.0×108cfu/ml(525nm下的DO＝0.5)。通過對100μl懸液閃爍計數(shù)來測定比放射性。
粘合抑制試驗每個孔的HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)物中同時加入1ml放射性標(biāo)記過的金黃色葡萄球菌和1ml NCC 533懸液。于37℃下培養(yǎng)1小時之后，將這些單層用PBS緩沖液洗滌3次并加入1ml的1N NaOH于室溫下溶解30分鐘。將溶菌產(chǎn)物(lysat)轉(zhuǎn)移到閃爍小瓶中并在60℃下用1ml芐索氫氧化銨培養(yǎng)。冷卻之后，加入10ml Hyonic熒光材料(fluor)閃爍液，并在液體閃爍計數(shù)器上計數(shù)該放射性。對照是通過加入1ml放射性標(biāo)記過的金黃色葡萄球菌懸液和1ml的PBS緩沖液獲得的，并且相當(dāng)于100％粘合。
結(jié)果列于表5。
表5金黃色葡萄球菌與HaCaT細(xì)胞的粘合受活性形式和失活形式的NCC 533的抑制
實施例4失活約氏乳桿菌抑制皮膚病原體粘合的體內(nèi)試驗材料和方法動物15只7-8周齡的SKH雌性小鼠，重量約30g，由C.River供應(yīng)。每組使用5只小鼠測定不同的局部涂敷。
微生物使用從人皮膚損傷處(腿潰瘍)分離的金黃色葡萄球菌菌株(命名菌株1)。該菌株對Methycilin敏感。
接種物的制備制備用于接種于小鼠中的細(xì)菌懸液。為此，將菌株1于固體培養(yǎng)基(AES，AEB 122 859)在35℃下用斜面(en pente)預(yù)培養(yǎng)18-24小時。培養(yǎng)之后，將細(xì)菌再次懸浮于10ml無菌生理鹽水溶液中，然后在3000rpm下離心10分鐘回收。然后除去上清液并將顆粒用10ml生理鹽水溶液吸收。將該步驟重復(fù)2次。通過將洗滌過的細(xì)菌再次懸浮于4ml無菌生理鹽水溶液中制備接種懸液。將525nm下的DO調(diào)整至約0.14。它含有約108cfu/ml。
接種小鼠將肋腹上的小鼠的皮膚用95乙醇(Mefck)脫脂。用微量吸移管將50μl含有50/50金黃色葡萄球菌接種物1.0×107cfu/ml和待測定產(chǎn)物的混合物的懸液慢慢涂敷到該脫脂區(qū)(6.25cm2)。接種位置通過無菌塑料敷料(Dermafilm 33×15，代碼38.3015，Vygon laboratory)閉合1小時來加以保護(hù)。
對損傷處活的細(xì)菌計數(shù)懸液涂敷4小時之后，在異氟醚(Abbott France)的麻醉下將小鼠殺死。將接種部位切除一塊(直徑12mm)。將除去的皮膚活組織粉碎并使用Polytron(PT 2100，Bioblock Scientific)(5rpm，5min)用2ml無菌鹽水溶液均質(zhì)。
將1ml均質(zhì)化組織樣品加入9ml無菌鹽水溶液，并使用10-倍稀釋法將0.1ml該混合物于110號葡萄球菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在35℃下培養(yǎng)48小時之后，計數(shù)所生長的菌落并測定CFU(菌落形成單位)。
結(jié)果結(jié)果列于表6。
表61％ NCC 533試驗
*比對照(SA/PBS)顯著，Student的T試驗(n＝5)NCC 533以1％存在能夠在接觸4小時之后發(fā)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量降低約1log。相對對照樣，差異顯然是顯著的(p＝0.098)。
在有戊二醛的情況下，相對對照，細(xì)菌數(shù)量降低更顯著，然而毫無疑問，該活性是由于其抗菌活性并且當(dāng)金黃色葡萄球菌一加入到混合物中就起作用；因此，4小時之后觀察到的活性不是由于抗粘合效果，而是產(chǎn)品的抗菌活性。
結(jié)果列于表7。
表7
相對對照樣的是顯著的*p＜0.05，***p＜0.001(SA/PBS)相對106cfu/ml和107cfu/ml的接種物，NCC 533以0.5％和1％存在發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的數(shù)量降低約11og。沒有觀察到106cfu/ml接種物或107cfu/ml接種物的劑量效果。
在有0.045％戊二醛的情況下，相對對照樣降低更大；它為約3log。
這些結(jié)果證實了0.5％和1％的失活NCC 533作為金黃色葡萄球菌粘合的抑制劑的活性。
實施例5身體洗劑制備具有以下組成的身體洗劑8.0％礦物油、5.0％棕櫚酸異丙酯、2.0％聚甘油基-3-二異硬脂酸酯、4.0％辛基十二烷醇、0.3％卡波姆(carbomère)、0.2％椰油基谷氨酸鈉、1.2％的10％氫氧化鈉、防腐劑、香精、0.5-3％的含10×108-10×1012cfu/g至少一種選自以下細(xì)菌菌株并在約90℃下熱處理約2小時使其失活的凍干物約氏乳桿菌(CNCMI-1225)、變異微球菌(CNCM I-1586或CNCM I-1587)或乳雙歧桿菌(ATCC 27536，Hansen)。該混合物用水使其達(dá)到100％。
由此獲得的身體洗劑由于其相對病原體的抗粘合性能，用于穩(wěn)定和/或調(diào)節(jié)皮膚病原菌群。
實施例6香波制備具有以下組成的香波7.0％十二烷基硫酸鈉、2.0％椰油酰氨基丙基甜菜堿、2.0％十二烷基磺基琥珀酸鈉、氯化鈉、防腐劑、香精和0.5-3％含108-1012cfu/g至少一種選自以下細(xì)菌菌株并在約90℃下熱處理約2小時使其失活的凍干物約氏乳桿菌(CNCM I-1225)、變異微球菌(CNCM I-1586或CNCM I-1587)或乳雙歧桿菌ATCC 27536。該混合物用水使其達(dá)到100％。
由此獲得的香波具有調(diào)節(jié)頭皮病原菌落的性能。尤其指出的是治療頭皮屑。
實施例7為了獲得具有調(diào)節(jié)皮膚病原菌落性能的藥用組合物，制備具有以下組成的脂相和水相。
實施例5中所述的約氏乳桿菌(CNCM I-1225) 1％脂相花生基二十二醇/花生基葡糖苷 3％異十六烷 7％甜扁桃油 3％牛油果油 2％B.H.T. 0.05％丙基POB 0.05％水相水 適量至100％甘油 5％甲基POB 0.1％將脂相和水相加熱至75℃。然后，通過將水相加入到脂相中用Rayneri在1000rpm下混合進(jìn)行乳化。乳化30分鐘之后，將混合物用polytron(4-5速)均質(zhì)1分鐘。
實施例8以與實施例7相同的方式制備具有以下組成的組合物實施例5中所述的約氏乳桿菌(CNCM I-1225) 1％脂相硬脂酸甘油酯和PEG100硬脂酸酯 5％異十六烷 8％牛油果油 5％B.H.T. 0.05％Dc1503 1％水相水 適量至100％甘油3％卡巴浦爾(Carbopol)981 0.2％Lubrajel5％苯氧乙醇1％碳酸鈉適量至pH6
由此制備的香波具有調(diào)節(jié)動物皮膚系統(tǒng)的病原菌群的性能。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌試劑在制備化妝用、藥用或獸醫(yī)用并旨在對人或動物施用以穩(wěn)定和/或調(diào)節(jié)皮膚系統(tǒng)的病原菌群的治療或預(yù)防為目的的組合物中的用途，所述細(xì)菌試劑是細(xì)菌提取物，或者是細(xì)菌，它是針對皮膚系統(tǒng)的病原體根據(jù)其與皮膚細(xì)胞的粘附性能及其抗粘附性能進(jìn)行選擇的。
2.如權(quán)利要求1的用途，其中所述細(xì)菌試劑選自乳桿菌屬(Lactobacillus)、微球菌屬(Micrococcus)或雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)。
3.如權(quán)利要求1和2之一的用途，其中所述細(xì)菌試劑選自約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)CNCM I-1225、變異微球菌(Micrococcus varians)CNCM I-1586、變異微球菌CNCM I-1587或乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)ATCC 27536菌株。
4.如權(quán)利要求1-3之一的用途，其中所述細(xì)菌是活、半活性或失活形式。
5.如權(quán)利要求4的用途，其中所述細(xì)菌是在90℃下熱處理2小時失活的。
6.如權(quán)利要求1-5之一的用途，特征在于所述細(xì)菌試劑以凍干形式含有1.0×108-1.0×1011cfu/g。
7.用于化妝用、藥用或獸醫(yī)用并含有至少一種能夠穩(wěn)定和/或調(diào)節(jié)皮膚系統(tǒng)的病原菌群的細(xì)菌試劑的組合物，所述細(xì)菌試劑是細(xì)菌提取物，或者是細(xì)菌，它是針對皮膚系統(tǒng)的病原體根據(jù)其與皮膚細(xì)胞的粘附性能及其抗粘附性能進(jìn)行選擇的。
8.如權(quán)利要求7的組合物，其中所述細(xì)菌試劑選自乳桿菌屬、微球菌屬或雙歧桿菌屬。
9.如權(quán)利要求7和8之一的組合物，其中所述細(xì)菌試劑選自約氏乳桿菌CNCM I-1225、變異微球菌CNCM I-1586、變異微球菌CNCMI-1587或乳雙歧桿菌ATCC 27536菌株。
10.如權(quán)利要求7-9之一的組合物，其中所述細(xì)菌是活、半活性或失活形式。
11.如權(quán)利要求10的組合物，其中所述細(xì)菌是在90℃下熱處理2小時失活的。
12.如權(quán)利要求7-11之一的組合物，相對組合物的總重量，含有高達(dá)10％wt的所述細(xì)菌試劑。
13.如權(quán)利要求7-12之一的組合物，相對組合物的總重量，含有約0.05-5％wt的所述細(xì)菌試劑。
14.如權(quán)利要求7-13之一的組合物，旨在用于治療或預(yù)防皮膚疾病，例如-傳染性并發(fā)癥如重復(fù)感染性特應(yīng)性皮炎、膿皰病基濕疹、潰瘍、創(chuàng)傷、燒傷、重復(fù)感染性炎癥性痤瘡，-皮炎如膿皰病、表面毛囊炎，-皮脂溢皮炎、花斑糠疹，-皮真菌病，-念珠菌病，-與抗生素或抗霉菌劑治療有關(guān)的病癥，-激素調(diào)節(jié)障礙引起的病癥或頭皮屑。
15.如權(quán)利要求7-14之一的組合物，用于對過敏性皮膚或油性皮膚施用。
16.如權(quán)利要求7-13之一的獸醫(yī)用的組合物，用于治療或預(yù)防動物中與葡萄球菌、鏈球菌和霉菌感染有關(guān)的功能障礙。
全文摘要
一種細(xì)菌試劑用于制備化妝用、藥用或獸醫(yī)用并旨在穩(wěn)定和/或調(diào)節(jié)哺乳動物的皮膚生態(tài)系統(tǒng)的組合物中的用途，所述細(xì)菌試劑是細(xì)菌提取物，或者是細(xì)菌，它是針對皮膚系統(tǒng)的病原體根據(jù)其與皮膚細(xì)胞的粘附性能及其抗粘附性能進(jìn)行選擇的；以及含有這種試劑的組合物。
文檔編號A61K8/96GK1434716SQ00819148
公開日2003年8月6日 申請日期2000年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月22日
發(fā)明者M·保爾, R·青克, I·奧贊諾, K·布法德 申請人:雀巢制品公司