專利名稱：帶官能化輔助支鏈的?；俣牡闹谱鞣椒?br> 引言
本發(fā)明涉及有關(guān)化學(xué)領(lǐng)域，更特別地涉及肽化學(xué)地領(lǐng)域。確切地，本發(fā)明涉及帶官能化輔助支鏈(bras auxiliaire)的酰化假二肽，該化合物可接枝或不接枝成綴合物(con jugués)形式，其輔助支鏈賦予該分子原始的生物活性及物理化學(xué)性質(zhì)。輔助支鏈的化學(xué)性質(zhì)通過微調(diào)其肽的原始性質(zhì)或賦予其新性質(zhì)，賦予酰化假二肽額外尺寸。這些帶有官能化輔助支鏈的分子可綴合接合到藥效團(tuán)、抗原或媒介物分子。生物綴合涉及偶合兩種或兩種以上的化學(xué)實(shí)體，以形成具有與單個組成性質(zhì)不同的新分子配合物。具有固有藥理性質(zhì)的天然或合成產(chǎn)物可彼此組合，得到具有原始化合物或比原始化合物改善的物理化學(xué)與藥理性質(zhì)的新實(shí)體。生物綴合作用的應(yīng)用涉及人的藥物、動物藥物以及診斷方法的各個領(lǐng)域。
曾經(jīng)敘述多種相同雙官能或異雙官能類偶合劑，其可用于接合各種分子，其分子包括氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、糖類、寡醣、多醣、核酸、寡核苷酸、多核苷、脂類，以及實(shí)際上每一種帶有一個可能形成鍵的官能團(tuán)的分子。近年來對由兩個帶有不同信息的分子組成的抗原構(gòu)建體的合成進(jìn)行過相當(dāng)多的研究。Good等人[(1987)，《Science》，2351059-1662]例如合成過含有同時被輔助T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞識別的抗原決定簇的肽。Bessler及Jung[(1992)《Res.Immunol》，5548-553]描述由肽以及免疫刺激劑組成的綴合物。Hoffmann等人[(1997)《FEMS Immunol.Med.Microbiol.Microbiology》，17225-234]描述了在脂肽與由峰毒肽衍生的合成肽之間形成的綴合物。Ulrich和Myers[(1995)《Vaccine Design》，Plenm出版，紐約，495-524]觀察到除非半抗原和MPL添加劑處在相同的脂類體內(nèi)(一磷?；怉)，否則免疫反應(yīng)無效。Ulrich及Myers提示MPL佐劑與半抗原間可能存在有共價鍵。事實(shí)上，證實(shí)半抗原-佐劑綴合物用作疫苗的佐劑是非常有效的。Ikeda等人[(1999)《Chem.Pharm.Bull》，47(4)，568-568]報告了脂類A的結(jié)構(gòu)類似物與具有肽性質(zhì)的腫瘤抗原之間的合成，且證實(shí)其具有體外致有絲分裂的活性。
這種綴合概念對于蛋白質(zhì)，甚至對于蛋白質(zhì)-多糖對都是有效的。的確，人們知道，單獨(dú)使用多糖作為疫苗對于5歲以下的兒童僅能產(chǎn)生微弱的免疫反應(yīng)，原因在于該反應(yīng)取決于T細(xì)胞。[Gotschlich等人，(1977)；《Antibodies in Human Diagnosis and Therapy》，Peltola等人，(1977)，《Pediatrics》60730-737]。相反地，與媒介蛋白質(zhì)連接的多糖類沒有給出特別強(qiáng)的免疫反應(yīng)。這種現(xiàn)象于1931年由Avery及Goebel發(fā)現(xiàn)[(1931)，《J.Exp.Med.》，54437-447]。這些年來開發(fā)的多種疫苗反映出在這個領(lǐng)域所取得的進(jìn)展。特別地應(yīng)提到為抗流行性感冒嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)以及不同血清型的肝炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的疫苗[Powell及Newman，(1995)，《Vaccine Design》，Plenum出版，紐約]。對于后者，己經(jīng)開發(fā)多效價疫苗[Sood及Fatton，(1998)，《Exp，Opin.Invest.Drugs》，7(3)，333-347]。
使用由與多糖-蛋白質(zhì)單元結(jié)合的佐劑組成的配合物產(chǎn)生了新前景?；瘜W(xué)合成生物綴合物的技術(shù)已獲得很好發(fā)展，今天能夠進(jìn)行多項(xiàng)幾年前認(rèn)為無法進(jìn)行的研究主題，同時可使用大量可利用的相同或異雙官能反應(yīng)劑，以及使用在大量參考文獻(xiàn)中描述的綴合方法[Hermanson，(1996)，《Bioconjugate Techniques》，Academic出版，紐約]。
例如，可以提及還原胺化方法[Roy等人，(1984)，《Canad.J.Biochem.Cell Biol.》62270-279，Hermansson，(1995)，472頁]，該方法允許載帶醛官能團(tuán)的分子，與在肽或蛋白質(zhì)分子上的伯胺，與肽-多糖綴合物或與藥效(基)團(tuán)綴合。這種反應(yīng)導(dǎo)致形成極為穩(wěn)定的二烷基胺。發(fā)明的描述
更確切地，本發(fā)明的目的是由官能化氨基酸得到的假二肽(pseudodipeptide)，其游離的胺基官能被脂肪酸酰胺化，假二肽的一端載有官能化輔助支鏈。
更明確地，本發(fā)明的目的是N-酰化假二肽，該假二肽的一端部帶有一個呈中性或帶電荷的酸基，其另一端部帶有一個官能化輔助支鏈，該化合物具有通式I
其中R1及R2各自表示由含有2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸得到的?；?，該?；幢蝗〈幕驇в幸换蚨鄠€選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、胺基、酰氨基、酰硫基以及(C1-C24)烷硫基的取代基。
下標(biāo)m、n為0至10的值，
下標(biāo)p及q為1至10的值。
Y表示O或NH，
X及Z表示官能化輔助支鏈或呈中性或帶電荷的酸基，其選自下述基團(tuán)
-羧基
-羧基[(C1-C5)烷氧基]
-羧基[(C1-C5)烷硫基]
-膦?；鵞(C1-C5)烷氧基]
-膦酰基[(C1-C5)烷硫基]
-二羥基磷酰氧基[(C1-C5)烷氧基]
-二羥基磷酰氧基[(C1-C5)烷硫基]
-二羥基磷酰氧基
-羥基磺酰氧基
-羥基磺?；鵞(C1-C5)烷氧基]
-羥基磺酰基[(C1-C5)烷硫基]
-羥基磺酰氧基[(C1-C5)烷氧基]
-羥基磺酰氧基[(C1-C5)烷硫基]
-[羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基
-[二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基
-[氨合(C1-C5)烷基]氨基羰基
-{羧基[氨基(C1-C5)烷基}氨基羰基
但限制條件為取代基X或Z中至少一個表示官能化輔助支鏈。
X或Z輔助基具有通式(II)
A-(CO)r-(CH2)s-W (II)式中A表示O、S或NH
下標(biāo)r為0或1的值，
下標(biāo)s為1至10的值。
W選自下述基團(tuán)
-甲?；?br> -乙?；?br> -氰基
-鹵素(鹵代)
-氨基
-溴-或碘-乙酰氨基
-?；０被?acylamido)
-二酰基亞胺基
-巰基
-烷硫基(alkylthio)
-羥基
-1，2-二羥基乙基
-烷氧基
-酰氧基
-乙烯基
-乙炔基
-游離羧基
-呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基，
-疊氮基
-氰硫基(thiocyano)。
本發(fā)明特別涉及新的N-酰化假二肽，該假二肽的一端部帶有一個呈中性或帶電荷的酸基，其另一端部帶有一個官能化輔助支鏈，該化合物具有通式I
其中R1及R2各自表示由含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸得到的?；?，其為未被取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基(acylamino)、酰硫基(acylthio)以及(C1-C24)烷硫基的取代基。
下標(biāo)m、n為0至10的值，
下標(biāo)p及q為1至10的值，
X及Z各自表示呈中性或帶電荷的酸基或官能化輔助支鏈，
但限制條件為取代基X或Z中至少一個表示官能化輔助支鏈。
Y表示O或NH，
酸基X或Y優(yōu)選地選自下述基團(tuán)
-羧基
-羧基[(C1-C5)烷氧基]
-羧基[(C1-C5)烷硫基]
-膦?；鵞(C1-C5)烷氧基]
-膦?；鵞(C1-C5)烷硫基]
-二羥基磷酰氧基[(C1-C5)烷氧基]
-二羥基磷酰氧基
-羥基磺酰氧基
-羥基磺?；鵞(C1-C5)烷氧基]
-羥基磺酰基[(C1-C5)烷硫基]
-羥基磺酰氧基[(C1-C5)烷氧基]
-羥基磺酰氧基[(C1-C5)烷硫基]
以及含X或Z的輔助基團(tuán)滿足通式II，但二羥基乙基除外。
若取代基X或Z表示呈中性酸基，涉及游離羧酸、磺酸、膦酸或磷酸。若酸基呈電荷形式，則涉及鹽化的羧酸、磺酸、膦酸或磷酸形式，特別地，通過添加無機(jī)或有機(jī)堿鹽化，優(yōu)選地治療上相容的無機(jī)或有機(jī)堿進(jìn)行鹽化。若這些堿不是治療上相容的，這些堿可按識別、純化及分離的方式使用。
在治療上相容的鹽化堿中，特別列舉例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰的堿金屬堿，銨鹽，堿土金屬堿，例如氫氧化鈣或氫氧化鍶，鎂鹽，亞鐵金屬鹽等，有機(jī)堿，例如由伯、仲、叔胺得到的堿，堿性反應(yīng)的氨基酸，例如賴氨酸或鳥氨酸或氨基糖。
治療上不可使用的堿例如是馬錢子堿、番木鱉堿、N-甲基葡萄糖胺或N-甲基嗎啉。如前述，由此衍生的鹽類將作為分離、鑒定或純化的手段。
當(dāng)m等于1，而n等于0時，該分子由絲胺酸或天冬氨酸得到。m等于2，而n等于0時，該分子特別地衍生自高絲氨酸或谷氨酸。
若Y＝NH、p＝3以及q＝1，則可能涉及瓜氨酸、鳥氨酸或粗氨酸衍生物。
若p等于4及q等于1，則特別地涉及高精氨酸或賴氨酸。
若取代基X或Z表示通式(III)的輔助基
O-CO-(CH2)s-W(III)
下標(biāo)s為1至10的值，但更特別等于4、5或6
W優(yōu)選地選自下列基團(tuán)
-甲酰基
-氨基
-羥基
-1，2-二羥基乙基
-羧基。
在本發(fā)明的目的假二肽中，特別值得注意的為實(shí)際優(yōu)選通式IV化合物
式中R1及R2各自分別表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或分支鏈羧酸的?；?，其酰基未被取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基及(C1-C24)烷硫基的取代基，
下標(biāo)m及n為0至10的值，
下標(biāo)p及q為1至10的值，
以及其中取代基X或Z中的一個為羧基或二羥基磷酰氧基或羧基[(C1-C5)烷氧基]或羧基[(C1-C5)烷硫基]或{羧基[(C1-C5)烷基]氨基羰基或[二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基或{羧基[氨基(C1-C5)烷基}-氨基羰基；以及其中另一個取代基為酰氧基，它選自6-氨基己酰氧基、6-氧代己酰氧基、6-羥基己酰氧基、6，7-二羥基庚酰氧基或3-羧基丙酰氧基。
R1及R2定義包括具有含2到24個碳原子的、相同或不同的、飽和或不飽和的、支鏈或直鏈的不同鏈長的?；苌?，其可帶有一個或多個選自烷基、氨基、酰氨基、羥基、烷氧基、酰氧基、酰硫基及烷硫基的取代基。在相關(guān)的?；鶊F(tuán)中，由月桂酸、2-羥基辛酸、3-羥基肉豆蔻酸、2-癸酰氧基辛酸、3-月桂氧基肉豆蔻酸、3-肉豆蔻氧基肉豆蔻酸以及3-棕櫚氧基肉豆蔻酸得到的?；鶊F(tuán)是目前優(yōu)選的?；鶊F(tuán)。
本發(fā)明特別涉及作為優(yōu)選化合物的在下表列出的假二肽
Z＝OR3 ouZ＝A-(CO)r-(CH2)s-W
本發(fā)明特別涉及下列實(shí)際優(yōu)選的化合物
-N-[[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽(實(shí)施例1.2)
-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇-1-二氫磷酸酯10-(6，7-二羥基庚酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽(實(shí)施例2.1)
-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇-1-二氫磷酸酯10(6-氧代己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽(實(shí)施例2.2)
-N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺5-O-(6，7-二羥基庚酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽(實(shí)施例2.3)
-N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺5-O-(6-氧代己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽(實(shí)施例2.4)
-(3RS，9R)，(3R，9R)及(3S，9R)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽(實(shí)施例2.6、2.7及2.8)
-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-癸-1，10-一醇1-二氫磷酸酯10-(6-羥基己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽(實(shí)施例2.9)
-2-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-(二羥基磷酰氧基)-丁酸{2-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-5-(6-氧代己基)氨基}戊酯及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽(實(shí)施例2.10)
-N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽(實(shí)施例2.16)
-N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-丁二酰氧基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基)}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽(實(shí)施例2.19)
-N-{(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽(實(shí)施例2.22)
-N-{(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽((實(shí)施例2.24)
這些化合物的區(qū)別在于原本令人感興趣的藥理性質(zhì)，主要有關(guān)免疫調(diào)理方面的藥理性質(zhì)。它們在制備混合配方的疫苗組合物，或作為與多肽或多糖性質(zhì)的抗原或與由與多糖綴合的多肽構(gòu)成的化合物形成的共價綴合物方面是特別有意義的。它們特別可以用于預(yù)防原蟲、微生物及病毒感染或用于治療某些自體免疫病。
這些化合物因其輔助支鏈具有或多或少的親水或疏水特性，通過它們形成非共價締合物的性質(zhì)而用作有意義的治療分子的載體。能使它們與有意義的治療分子偶合的化學(xué)性質(zhì)及其兩親特性，可促進(jìn)締合它們的分子配制及輸送至細(xì)胞膜受體以及輸送至細(xì)胞壁及胞質(zhì)。
本發(fā)明的化合物可單獨(dú)使用，或呈與治療有利的分子共價或非共價結(jié)合使用，可采用口服、腸胃外、直腸、局部、皮下或粘膜下用藥。
它們可單獨(dú)使用，或呈與治療有利的分子共價或非共價結(jié)合使用，可采用活體外與血細(xì)胞同時培育，以便促進(jìn)形成免疫合格的細(xì)胞，隨后通過腸胃道途徑將其細(xì)胞注回到活體內(nèi)。
這些分子具有類似的性質(zhì)，當(dāng)例如用于疫苗接種時，可作為免疫系統(tǒng)的佐劑，與適當(dāng)抗原共價或非共價結(jié)合，可用作抗病毒、寄生蟲、微生物或真菌來源的疾病。這些綴合或綴合的分子還可能用于治療某些自體免疫病。
相反地，若干本發(fā)明的化合物，在共價或非共價結(jié)合后，顯示出在它們誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞分裂素，或來自造血器官及淋巴器官的免疫活性干細(xì)胞成熟的能力方面具有不同的性質(zhì)。
若干本發(fā)明的化合物可在有或沒有適當(dāng)抗原存在下促進(jìn)單核細(xì)胞成熟且分化成為功能性樹狀細(xì)胞，且對增強(qiáng)體液及細(xì)胞的免疫力有作用。
若干本發(fā)明的化合物促進(jìn)屬于造血系統(tǒng)的一部份細(xì)胞，特別是骨髓內(nèi)部細(xì)胞的分化，并且能改善及校正某些免疫系統(tǒng)的病癥。它們特別顯示出抗病毒的性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的化合物由于毒性低故特別令人感興趣。它們與抗原呈共價或非共價結(jié)合使用，用于預(yù)防或治療人體及動物體傳染病，依據(jù)特定適應(yīng)癥以及個體體重，使用劑量為每單位劑量0.005毫克至100毫克，以及每日0.005毫克至200毫克。
本發(fā)明還有一個目的是一種N-?；俣牡闹苽浞椒?，該假二肽一端帶有一個呈中性或帶電荷的酸基，另一端帶有一個官能化輔助支鏈，該化合物具有通式I，該方法包括下列步驟借助正交保護(hù)劑(blocage orthogonaux)保護(hù)(bloque)于位置(q+1)的胺官能團(tuán)和于ω-官能化氨基酸的位置ω的YH，還包括使余下呈游離的羧酸官能團(tuán)與還原劑反應(yīng)而獲得對應(yīng)的醇，還包括釋放出位置(q+1)的胺官能團(tuán)，然后利用式R2OH(其中R2如前面所定義)的羧酸的官能衍生物進(jìn)行酰化，以及隨后釋放末端官能團(tuán)，而獲得通式V的官能化氨基醇
式中Y表示HO或優(yōu)選地NH2，
R2表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的酰基，該酰基為未經(jīng)取代的或帶有一個或多個如上定義的取代基，
p及q各自表示1至10的整數(shù)，
該氨基醇在肽縮合劑存在下于惰性溶劑中與通式VI的ω-官能化的氨基酸衍生物縮合
式中R1為衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；錇槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個如前面定義的取代基，
m及n為0至10的整數(shù)，
以及X為如上定義的可呈酯形式的酸基，
而獲得通式VII假二肽
式中取代基R1及R2以及下標(biāo)m、n、p及q如前面所定義，若有所需要，可使用通式VIII的取代、烷基化或?；脑噭┦乖撚坞x末端醇官能團(tuán)進(jìn)行取代、烷基化或?；?，
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII)式中A是離去基團(tuán)、OH、SH或NH2官能
下標(biāo)r優(yōu)選地等于1，但也可等于0。
下標(biāo)s優(yōu)選地為2至6，但一般可取1至10的值
W優(yōu)選地選自下列一個基團(tuán)-甲?；?、-乙?；?、-氰基、-鹵素、-氨基、-溴-或碘乙?；被?、-?；０被?acylamido)、-二?；鶃啺被?、-巰基、-烷硫基、-羥基、-1，2-二羥基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游離或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-疊氮基、-氰硫基或其前體。
若有所需，于偶合劑存在下，該產(chǎn)物進(jìn)行催化氫化或若干其它去保護(hù)處理，獲得通式I衍生物
式中取代基及下標(biāo)X、Y、Z、R1、R2、n、m、p及q具有前述相同定義。
本發(fā)明還涉及一種獲得通式IV的膦?；俣幕衔锏姆椒?
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸的酰基，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基(acylthio)以及(C1-C24)烷硫基(thio)的取代基，
下標(biāo)m、p及q為1至10的值，
下標(biāo)n為0至10的值，
X及Z各自表示呈中性或帶電荷的酸基或官能化輔助支鏈，
其特征在于使用通過酸解或氫解不穩(wěn)定的保護(hù)劑(blocage)，分別保護(hù)(bloque)式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH二氨基酸的于(q+1)位的胺官能團(tuán)以及于ω位的胺官能團(tuán)，將仍然呈游離的羧酸官能團(tuán)與還原劑反應(yīng)而獲得對應(yīng)的醇，使(q+1)位胺官能團(tuán)游離，然后利用式R2OH(其中R2已如前定義)羧酸的官能衍生物?；?，然后通過氫解釋放出末端胺官能團(tuán)而獲得通式IX的氨基醇
式中R2表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的羧酸的?；?，其酰基為未經(jīng)取代的或帶有一個或多個如前面定義的取代基，
p及q表示1至10的整數(shù)，
其特征還在于在肽縮合劑存在下，于惰性溶劑中與通式VI的ω-羥基化氨基酸衍生物縮合
式中R1為衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；?，其酰基為未經(jīng)取代的或帶有一個或多個如前面定義的取代基，
m為1至10的整數(shù)，
n為0至10的整數(shù)，
以及X為式
的二烷氧基-或二芳氧基-磷酰氧基基團(tuán)，以獲得通式X的假二肽
式中取代基R1、R2以及下標(biāo)m、n、p及q如前定義，以及R為氫解不穩(wěn)定基，若有所需，可使用通式VIII的取代、烷基化或?；噭匀〈?、烷基化或?；坞x末端醇官能團(tuán)
A-(CO)r-(CH2)s-W(VIII)
A為離去基，OH、SH或NH2官能團(tuán)
下標(biāo)r為優(yōu)選地等于1，也可取0值，
下標(biāo)s優(yōu)選地為2至6的值，也可取1至10的值，
W優(yōu)選地選自下列基團(tuán)-甲酰基、-乙?；?、-氰基、-鹵素、-氨基、-溴-或碘乙酰氨基、-?；０被?、-二?；鶃啺被?、-巰基、-烷硫基、-羥基、-1，2-二羥基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游離羧基，或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-疊氮基、-氰硫基或其前體，
若有所需，在偶合劑存在下，將該化合物進(jìn)行催化氫化或若干其它去保護(hù)處理，因而獲得通式XI衍生物
式中取代基W、R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q、r、s具有前述相同定義。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種獲得通式XII的磷酰基假二肽化合物的方法
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸的?；?，其酰基為未經(jīng)取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基以及(C1-C24)烷硫基的取代基，
下標(biāo)m、p及q為1至10的值，
下標(biāo)n為0至10的值，
以及式中X及Z各自表示酸基或官能化輔助支鏈，
該方法包括使用酸解或氫解不穩(wěn)定的保護(hù)劑，分別保護(hù)式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1CO-OH二氨基酸于(q+1)位的胺官能團(tuán)以及于ω位的胺官能團(tuán)，將仍然呈游離的羧酸官能團(tuán)與還原劑反應(yīng)而獲得對應(yīng)的醇，使(q+1)位胺官能團(tuán)游離，然后利用式R2OH(其中R2已如前定義)羧酸的官能衍生物?；?，然后通過氫解釋放出末端胺官能團(tuán)，然后通過ω官能化烷基反應(yīng)性(活性)酯，如三氟甲基磺酸酯，進(jìn)行胺官能團(tuán)的烷基化，而獲得通式XIII的氨基醇
式中R2表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；?，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個如前面定義的取代基，
p及q表示1至10的整數(shù)，
下標(biāo)s優(yōu)選地包括2至7，但可取1至10，
其中氨基醇在縮合劑存在下于惰性溶劑中與通式VI的ω-羥基化氨基酸衍生物縮合
式中R1衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；漉；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個如前面定義的取代基，
m為1至10的整數(shù)，
n為0至10的整數(shù)，
以及X為式
的二烷氧基-或二芳氧基-磷酰氧基基團(tuán)，獲得通式XIV的假二肽
式中取代基R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q及s定義如前，以及R為氫解不穩(wěn)定基團(tuán)，然后進(jìn)行催化氫化反應(yīng)或去保護(hù)處理，因而獲得通式XV衍生物
式中W、R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q、r及s如前面所定義。
W選自下列基團(tuán)-甲?；?乙?；?、-氰基、-鹵素、-氨基、-溴-或碘乙酰氨基、-?；０被?、-二酰基亞胺基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游離或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-疊氮基、-氰硫基或其前體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種制造通式IV的羧基假二肽的方法
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和直鏈或支鏈羧酸的酰基，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基以及(C1-C24)烷硫基的取代基，
下標(biāo)m、p及q為1至10的值，
下標(biāo)n為0至10的值，
以及其中X及Z各自表示酸基或官能化輔助支鏈，
其方法包括使用酸解或氫解不穩(wěn)定的保護(hù)劑，分別保護(hù)式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH二氨基酸于(q+1)位的胺官能團(tuán)以及于ω位的胺官能團(tuán)，將仍然呈游離的羧酸官能與還原劑反應(yīng)而獲得對應(yīng)的醇，使(q+1)位胺官能游離，然后利用式R2OH(其中R2已如前定義)羧酸的官能衍生物?；?，然后通過氫解釋放出末端胺官能團(tuán)而獲得通式IX的氨基醇
式中R2表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；?，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個如前面定義的取代基，
p及q表示1至10的整數(shù)，
其方法包括在肽縮合劑存在下于惰性溶劑中，氨基醇與通式VI的ω-羧基氨基酸官能衍生物縮合
式中R1為衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；?，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個如前面定義的取代基，
m為1至10的整數(shù)，
n為0至10的整數(shù)，
以及X為RO-CO-基
形成通式XVI的假二肽
式中取代基R1、R2以及下標(biāo)m、n、p及q定義如前，以及R為進(jìn)行氫解的不穩(wěn)定基團(tuán)，例如像芐基，
若有所需，使用通式VIII的取代、烷基化或酰化劑，使其游離末端醇官能取代、烷基化或?；?br> A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII)式中A為離去基團(tuán)，OH、SH或NH2官能，
下標(biāo)r優(yōu)選地等于1，但也可取0的值，
下標(biāo)s優(yōu)選地為2至6的值，但可取1至10的值，
W優(yōu)選地選自下列基團(tuán)-甲酰基、-乙酰基、-氰基、-鹵素、-氨基、-溴-或碘乙酰氨基、-?；０被?二?；鶃啺坊?巰基、-烷硫基、-羥基、-1，2-二羥基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游離或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-疊氮基、-氰硫基或其前體，
若有所需，在偶合劑存在下，將其進(jìn)行催化氫化或去保護(hù)處理而獲得通式XVII衍生物
其中取代基W、R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q、r及s如前面所定義。
本發(fā)明還涉及一種獲得通式IV的膦?；牡姆椒?
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸的?；?，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基以及(C1-C24)烷硫基的取代基，
下標(biāo)m、p及q為1至10的值，
下標(biāo)n為0至10的值，
以及式中X及Z各自表示酸基或官能化輔助支鏈，
該方法包括使用不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)通過酸解使通式XVI假二肽的游離羥基官能保護(hù)
式中取代基R1、R2以及下標(biāo)m、n、p及q定義如前，以及R為進(jìn)行氫解的不穩(wěn)定基團(tuán)，例如像芐基，
然后釋放呈酯形式存在的羧酸官能，將任選地呈活性形式的這種羧酸官能與還原劑反應(yīng)，生成相應(yīng)的伯醇，這種醇官能團(tuán)用磷?；瘎┨幚磙D(zhuǎn)化成磷酸酯，用酸處理釋放被保護(hù)的羥基官能團(tuán)，然后用通式VIII反應(yīng)劑進(jìn)行取代、?；蛲榛磻?yīng)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII)式中A為離去基、OH、SH或NH2官能，
下標(biāo)r優(yōu)選地等于1，但也可取0的值，
下標(biāo)s優(yōu)選地為2至6的值，但一般可取1-10的值，
W選自下列的基團(tuán)-甲?；?、-乙酰基、-氰基、-鹵素、-氨基、-溴-或碘-乙酰氨基、-酰基酰氨基、-二酰基亞胺基、-巰基、-烷硫基、-羥基、-1，2-二羥基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、-游離或呈酯或其它衍生物形式的羧基。
若有所需，在偶合劑存在下，例如通過氫解將生成的產(chǎn)物去保護(hù)，以獲得通式XI的產(chǎn)物
式中取代基W、R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q、r及s具有前面的意義。
本發(fā)明還涉及一種獲得通式IV的膦?；牡姆椒?
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸的?；?，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基以及(C1-C24)烷硫基的取代基，
下標(biāo)m、p及q為1至10的值，
下標(biāo)n為0至10的值，
以及式中X及Z各自表示酸基或官能化輔助支鏈，
該方法包括將通式XVI假二肽中以酯形式存在的羧酸官能去保護(hù)
式中取代基R1、R2以及下標(biāo)m、n、p及q定義如前，以及R是氫解時不穩(wěn)定的基團(tuán)，例如像苯甲基，
然后在肽偶合劑存在下，如此生成的酸與部分保護(hù)的二氨基鏈烷或氨基酸進(jìn)行肽偶合反應(yīng)，例如像3-苯甲氧基羰基氨基-1-氨基丙烷、天冬氨酸二苯甲酯或ε-N-苯甲氧基羰基-L-賴氨酸苯甲酯，然后，如果希望，偶合產(chǎn)物與通式VIII反應(yīng)劑進(jìn)行取代、?；蛲榛磻?yīng)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII)式中A為離去基團(tuán)、OH、SH或NH2官能團(tuán)，
下標(biāo)r優(yōu)選地等于1，但也可取0的值，
下標(biāo)s優(yōu)選地為2至6的值，但一般可取1-10的值，
W優(yōu)選地選自下列的基團(tuán)-甲?；?乙?；?、-氰基、-鹵素、-氨基、-溴-或碘-乙酰氨基、-?；０被?二?；鶃啺坊?、-巰基、-烷硫基、-羥基、-1，2-二羥基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、-游離或呈酯或其它衍生物形式的羧基。
若有所需，在活性劑存在下，例如通過氫解將如此生成的產(chǎn)物去保護(hù)，以獲得通式XVIII的產(chǎn)物
式中取代基W、R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q、r及s具有前面的意義，R3代表氨基烷基、羧基烷基、二羧基烷基或氨基羧基烷基。
有酰氨基的中心的立體化學(xué)是由最初使用的氨基酸的構(gòu)型決定的，而酰氨基的立體化學(xué)由最初使用的脂肪酸構(gòu)型決定?？蓮木哂蠰或D構(gòu)型的二氨基酸或外消旋混合物開始?？墒加贚，D構(gòu)型的羥基化氨基酸或其外消旋混合物。全部通式I或IV或XII或XVI化合物的立體異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體都是本發(fā)明的一部分。
通常本發(fā)明化合物的制備方法是將ω-官能化的含N-?；陌被岬乃峁倌芘c氨基醇(由還原單-N-?；被岬聂然玫?的胺官能團(tuán)偶合，接著O-?；?烷基化仍然呈游離的醇官能團(tuán)，以加入官能化輔助支鏈，它在聯(lián)結(jié)后可任選地進(jìn)行改性而釋放出反應(yīng)性的官能團(tuán)。最終產(chǎn)物去保護(hù)而釋放出酸官能團(tuán)。
本發(fā)明化合物的實(shí)際優(yōu)選地制備方法(

圖1)中，ω-官能化氨基酸是ω-羥基化的α-氨基酸，例如絲氨酸或高絲氨酸，其進(jìn)行一系列N-保護(hù)反應(yīng)(例如呈叔丁氧基羰基衍生物形式)，通過O-烷基化羧酸酯形成芐酯以及磷酸化OH官能團(tuán)，以引入保護(hù)的磷酸酯基。典型的磷酸酯保護(hù)基可以是苯基、芐基或鄰-二甲苯基。苯基是實(shí)際優(yōu)選的基團(tuán)。其次通過去除保護(hù)基(例如使用三氟乙酸處理叔丁氧基羰基衍生物)釋放出胺官能團(tuán)，然后用活化的脂肪酸衍生物進(jìn)行酰化，該衍生物優(yōu)選地為3-羥基十四酸衍生物，例如3-十二?；跏乃??；罨问娇墒酋；?、活性酯、混合酐或任何其它允許形成酰胺鍵的化學(xué)形式。然后，通過任選地氫解除去可能存在的芐酯，而獲得于α位置帶有一個?；０被约唉匚恢脦в幸粋€(RO)2P(O)O-基的羧酸。
根據(jù)在有機(jī)制備中[Organic Preparations and ProceduresInternational，23(1992)191-194]描述的方法，利用銅配合物，通過一系列在ω位胺官能團(tuán)的選擇性保護(hù)反應(yīng)，例如呈芐氧羰基衍生物形式，去除銅配合物，以及保護(hù)α位置的胺官能團(tuán)，例如呈叔丁氧基羰基衍生物形式，優(yōu)選地由α，ω-二氨基酸，例如鳥氨酸或賴氨酸獲得肽偶合反應(yīng)的對偶(partenaire)?？墒褂闷渌谋Ｗo(hù)基。根據(jù)在《四面體通訊》[Tetrahedron Letters，32(1991)928-926]中描述的方法，使用例如硼烷-二甲基硫化物配合物或通過用硼氫化鈉預(yù)制的混合酐處理，將游離羧酸官能團(tuán)還原轉(zhuǎn)成伯醇。α位置的胺官能在酸性介質(zhì)(例如經(jīng)由三氟乙酸處理)釋放，然后用活化脂肪酸衍生物，優(yōu)選地3-羥基十四酸衍生物，如3-芐氧基十四酸進(jìn)行N-?；Ｈ粲兴?，游離OH官能團(tuán)在這個階段例如呈芐氧基甲基醚形式保護(hù)。ω-氨基官能可通過用對存在的其它保護(hù)基為惰性的反應(yīng)劑處理而釋放，若保護(hù)基為芐氧基羰基，例如像在含三乙胺的羥基溶劑中進(jìn)行選擇性氫解反應(yīng)。
在實(shí)際優(yōu)選合成方法中，在IIDQ或其它肽偶合劑存在下，如此所得胺與如前述制備的α-酰胺化ω-磷?；人崤己?，獲得經(jīng)保護(hù)的假二肽化合物。在EDC1或其它酯化劑存在下，使用ω-官能化酸，例如6-庚烯酸，對該產(chǎn)物的仍為游離的羧基官能團(tuán)進(jìn)行O-?；?圖5)。該酯的烯基官能在催化量或立體化學(xué)計(jì)算量的四氧化鋨存在下進(jìn)行二羥基化反應(yīng)，然后任選地呈芐基醚形式存在的磷酸酯及羥基官能團(tuán)的保護(hù)基在適當(dāng)催化劑存在下通過氫解去除(實(shí)施例2.1)。在后述步驟，鄰二醇使用例如高碘酸進(jìn)行氧化反應(yīng)，產(chǎn)生反應(yīng)性醛官能(實(shí)施例2.2)。醛官能團(tuán)還原成為伯醇，結(jié)果獲得帶有ω-羥基?；鶊F(tuán)的衍生物(實(shí)施例2.9)。
在該方法的一種實(shí)施方案中，該肽偶合產(chǎn)物可使用ω-氨基鏈烷酸衍生物，例如6-芐氧基羰基氨基己酸進(jìn)行O-酰化(圖11)。如此所得產(chǎn)物在催化劑存在下通過氫解反應(yīng)進(jìn)行完全的去保護(hù)反應(yīng)，獲得帶有氨基鏈烷酰基輔助支鏈的假二肽(實(shí)施例2.6)。
在第二種優(yōu)選方法中，肽偶合反應(yīng)的酸對偶(配對)化合物為D-或L-天冬氨酸，或必要時D-或L-谷氨酸衍生物(圖2)。天冬氨酸衍生物可使用脂肪酸，優(yōu)選地3-羥基化脂肪酸衍生物，例如3-十二?；跏乃幔邗；瘎┐嬖谙拢稍摪被幡?芐酯的胺官能團(tuán)進(jìn)行N-?；磻?yīng)得到。此種產(chǎn)物與前述類型的氨基醇偶合，然后讓如此得到的假二肽在催化劑，例如在鈀/碳或在載體上的鉑存在下進(jìn)行氫解反應(yīng)，得到帶有羧酸官能團(tuán)的假二肽(實(shí)施例1.2)；或例如使用亞氨基磷酸鹽方法進(jìn)行磷酰化反應(yīng)，接著氫解反應(yīng)，獲得帶有一個羧酸官能團(tuán)以及一個磷酸官能團(tuán)的假二肽(實(shí)施例1.3)。
在一種實(shí)施方案中，先前獲得的假二肽的羥基官能團(tuán)(圖2)可使用ω官能化酸進(jìn)行酰化。優(yōu)選地，ω-官能化酸是ω-烯酸或ω-氨基烷酸。在庚烯酸的情況下(圖8)，假二肽得到O-庚?；苌铮潆S后在四氧化鋨存在下相繼地進(jìn)行二羥基化反應(yīng)，隨后去保護(hù)(實(shí)施例2.3)以及高碘酸氧化反應(yīng)(實(shí)施例2.4)；使用還原劑，例如像硼氫化鈉還原如此形成的醛官能團(tuán)，得到帶有ω-羥基鏈烷酰基官能團(tuán)的假二肽(實(shí)施例2.5)。在ω-氨基鏈烷酸，例如6-氨基己酸或甘氨酸的N-芐氧基羰基衍生物的情況下(圖24)，假二肽進(jìn)行?；磻?yīng)，獲得經(jīng)保護(hù)的O-氨基?；苌?，其隨后通過氫解進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)(實(shí)施例2.16及2.18)。
在第二個實(shí)施方案中(圖13)，圖2所述的中間假二肽進(jìn)行游離羥基官能的保護(hù)反應(yīng)，優(yōu)選地呈四氫吡喃基醚形式，然后以酯形式存在的羧基官能通過氫解或其它去保護(hù)方法去保護(hù)，然后優(yōu)選地呈混合酐形式活化后，使用還原劑，例如硼氫化鈉還原；如此生成的羥基官能團(tuán)進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，優(yōu)選地采用亞氨基磷酸鹽(Phosphoramidite)方法進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，然后在酸性介質(zhì)中水解四氫吡喃基醚，如此再生的羥基官能團(tuán)用ω-官能化羧酸進(jìn)行酰化反應(yīng)。優(yōu)選地ω-官能化酸為ω-烯酸或ω-氨基鏈烷酸。在6-芐氧基羰基氨基己酸的情況下，假二肽獲得經(jīng)保護(hù)的O-氨基?；苌?，其隨后進(jìn)行氫解反應(yīng)(實(shí)施例2.7，實(shí)施例2.8)。另外，前一節(jié)的單磷酸化中間體(圖15)可通過如下步驟得到天冬氨酸β-芐酯的N-?；苌锱c一種保護(hù)形式，例如呈芐氧基甲基醚、四氫吡喃基醚或由鳥氨酸得到的氨基醇硅甲基醚形式(圖1)的肽進(jìn)行偶合反應(yīng)(圖2)，接著釋放出呈芐酯形式的酸官能團(tuán)，將酸官能團(tuán)還原成伯醇，磷酸化這種官能團(tuán)，以及將呈芐氧基甲基醚、四氫吡喃基醚或甲硅烷基醚形式的被保護(hù)醇官能團(tuán)去保護(hù)。
在第三個實(shí)施方案中，圖2所示的中間假二肽使用二羧酸衍生物，優(yōu)選地丁二酸酐，且在堿或偶合劑存在下進(jìn)行O-?；磻?yīng)(圖27)，然后如此形成的新酯通過氫解進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)(實(shí)施例2.19)。使用丁二酸酐處理去保護(hù)的O-氨基?；苌铮@得帶有丁二?；坊；募俣?實(shí)施例2.17)。
在第三個優(yōu)選實(shí)施方案法中，由前述鳥氨酸或賴氨酸所得的氨基醇用ω-烯基三氟甲烷磺酸酯，如庚-6-烯基三氟甲烷磺酸酯進(jìn)行烷基化(圖17)。這種帶有仲胺的氨基醇與前述α-酰胺化ω-磷酸化酸于EDC1或其它?；瘎┐嬖谙路磻?yīng)獲得酯。然后烯基在四氧化鋨存在下進(jìn)行二羥基化反應(yīng)，然后保護(hù)基在適當(dāng)催化劑存在下通過氫解去除，鄰二醇官能團(tuán)通過高碘酸鈉氧化，得到反應(yīng)性醛官能團(tuán)(實(shí)施例2.10)。
在第四種優(yōu)選方法中(圖19)，根據(jù)Synthesis(1989)，36-37中描述方法制備的N-保護(hù)絲氨酸衍生物，例如對甲氧基芐氧基羰基衍生物，使用溴乙酸芐酯進(jìn)行O-烷基化。胺官能團(tuán)的保護(hù)基例如可使用在二氯甲烷中的三氟乙酸處理去除，胺官能團(tuán)優(yōu)選地使用3-羥基脂肪酸衍生物，例如3-十二?；跏乃?，在酰化劑存在下，或使用?；然蛑舅岬娜魏纹渌罨问竭M(jìn)行N-?；磻?yīng)。如此所得絲氨酸的N-?；疧-烷基化衍生物在肽偶合劑，如IIDQ存在下與前述氨基醇(圖1)偶合，游離的OH官能團(tuán)然后用ω-官能化鏈烷酸在活化反應(yīng)劑，例如碳化二亞胺存在下進(jìn)行?；?。優(yōu)選地，這種官能化酸為ω-烯酸或ω-氨基鏈鏈烷酸衍生物。例如，使用庚-6-烯酸，假二肽獲得O-(6-庚烯?；?衍生物，其循序地在四氧化鋨存在下進(jìn)行二氫化反應(yīng)，接著通過氫解以及高碘酸氧化反應(yīng)去保護(hù)(實(shí)施例2.11)。
在第五種實(shí)際優(yōu)選的方法中，起始氨基酸為半胱氨酸或高半胱氨酸(圖20)。例如，半胱胺使用溴乙酸對甲氧基芐酯進(jìn)行S-烷基化，然后優(yōu)選地，使用3-羥基化脂肪酸衍生物，如3-十四?；跏乃?，在?；瘎┐嬖谙?，或使用?；u或任何其它脂肪酸活化形式進(jìn)行N-?；?。如此所得半胱氨酸S-烷基化N-?；苌镌贗IDQ或其它肽偶合劑存在下與5-氨基-2-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊-1-醇偶合。游離的OH官能然后用ω-官能化鏈烷酸，其以活化酯，如O-苯并三唑基酯形式進(jìn)行O-?；?yōu)選地，這種酸為ω氨基鏈烷酸，如7-(對-甲氧芐氧基羰基氨基)庚酸。如此所得產(chǎn)物在含水酸性環(huán)境下進(jìn)行完全去保護(hù)反應(yīng)，如此獲得帶有7-氨基庚?；o助支鏈的假二肽(實(shí)施例2.12)。
在另一優(yōu)選方法(圖21)中，絲氨酸的N-對-甲氧基芐氧基羰基衍生物在強(qiáng)堿介質(zhì)中使用亞甲基丙二芐酯進(jìn)行O-烷基化。氨基保護(hù)基通過酸處理去除，然后如此釋放出的胺官能團(tuán)，優(yōu)選地在?；瘎┐嬖谙拢褂?-?；u基化脂肪酸，例如3-十二?；跏乃?，或使用脂肪酸官能衍生物，如?；?，或任何其它脂肪酸活化形式進(jìn)行N-酰化。如此所得絲氨酸的N-酰化O-烷基化衍生物在IIDQ或任何其它肽偶合劑存在下與前述氨基醇偶合(圖1)。然后假二肽的游離OH官能用ω-官能化鏈烷酸進(jìn)行O-酰化。優(yōu)選地，這種酸為ω-烯酸或ω-氨基鏈烷酸衍生物，例如庚-6-烯酸。如此假二肽獲得O-(6-庚烯?；?衍生物，其隨后在四氧化鋨存在下進(jìn)行二羥基化反應(yīng)，然后通過氫解及高碘酸氧化反應(yīng)進(jìn)行去保護(hù)，獲得帶有6-氧代己?；o助支鏈以及丙二?；难苌?實(shí)施例2.13)。
在另一個也是優(yōu)選的方法(圖22)中，前述6-氨基己?；苌?圖11)使用例如溴乙酸O-丁二酰亞氨基酯作為?；瘎?，使用溴乙酰氨基進(jìn)行N-?；?。這種反應(yīng)獲得帶有6-(溴乙酰氨基)己?；o助支鏈衍生物(實(shí)施例2.14)。
在第八個優(yōu)選方法(圖23)中，O-磷酸化的高絲氨酸芐酯(參考圖1)使用3-芐氧基十四酸進(jìn)行N-?；瑑?yōu)選地使用由3-芐氧基十四酸及氯甲酸異丁酯制備的混合酐進(jìn)行N-?；Ｈ缓笃S酯如前述進(jìn)行選擇性氫解。衍生自鳥氨酸的二氨基醇ω-N-芐氧基羰基衍生物(參考圖1)用3-十二?；跏乃嵩谂己蟿┐嬖谙禄蚴褂没罨セ蚱渌舅峄罨问竭M(jìn)行Nα-?；?，以及ω-氨基官能通過選擇性氫解釋放。這種胺在IIDQ或其它肽偶合劑存在下與高絲氨酸的N-(3-芐氧基十四酰基)O-(二苯基-氧磷?；?衍生物偶合。如此所得假二肽使用ω-官能化鏈烷酸，例如在碳化二亞胺存在下進(jìn)行O-?；?。優(yōu)選地，這種酸為ω-烯酸或ω-氨基鏈烷酸衍生物。例如，使用庚-6-烯酸，假二肽得到O-(6-庚烯?；?衍生物，其接著在四氧化鋨存在下進(jìn)行二羥基化反應(yīng)，然后在適當(dāng)催化劑存在下通過氫解進(jìn)行去保護(hù)以及高碘酸氧化反應(yīng)，最終獲得帶有6-氧代己?；o助基的衍生物。
在第九種優(yōu)選方法(圖29、31和34)中，圖2所述的中間假二肽進(jìn)行呈酯形式存在的羧基官能的去保護(hù)反應(yīng)，然后，這種羧基官能團(tuán)在偶合劑存在下與官能化氨基鏈烷偶合。優(yōu)選地，官能化氨基鏈烷是α，ω-二氨基鏈烷或氨基酸的衍生物。在1-氨基-3-芐氧基羰基氨基丙烷的情況(圖29)下，偶合反應(yīng)產(chǎn)物隨后進(jìn)行氫解反應(yīng)(實(shí)施例2.20)。在Nε-Z-賴氨酸芐酯(圖31)以及天冬氨酸α，β-二芐酯的情況下(圖34)，偶合反應(yīng)產(chǎn)物優(yōu)選地通過氫解進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)(實(shí)施例2.21及2.23)，或利用ω-官能化鏈烷酸，優(yōu)選地6-氨基己酸的N-芐氧基羰基衍生物進(jìn)行O-?；磻?yīng)。然后，如此所得的酯可通過氫解或采用其它的去保護(hù)方法進(jìn)行去保護(hù)(實(shí)施例2.22及2.24)。
本發(fā)明還涉及呈純對映異構(gòu)體和/或立體異構(gòu)體或立體異構(gòu)體混合物形式的通式V、VI、IX、XIII及XVI中間產(chǎn)物。
本發(fā)明還涉及含有至少一種呈中性或帶電形式的通式I化合物作為活性組分的藥物組合物，它與無毒的，在藥學(xué)上可接受的惰性賦形劑或載體結(jié)合或混合。
更特別地，本發(fā)明涉及藥物組合物，它含有至少一種通式I化合物的鹽作為活性成分，還有一種治療上相容的有機(jī)或無機(jī)堿。
本發(fā)明涉及以通式I化合物為主要成分的藥物組合物，它與藥學(xué)的賦形劑或載體結(jié)合或混合，呈純對映異構(gòu)體形式，或呈立體異構(gòu)體混合物形式。
在所要求的藥物形式中，可以列舉適合經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、局部、吸入、腸胃道外、消化道用藥方式，例如片劑、糖衣劑、膠囊、可注射溶液或懸液、氣霧劑、凝膠、膏劑或滲透液劑。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的化合物可接枝于抗原上，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，也可接枝在藥效基團(tuán)，改善治療效果或靶向作用(ciblage)，優(yōu)選地可采用注射途徑施用，例如呈含水溶液或含水懸浮液的綴合物形式，任選地使用胺或羥烷基胺中和的綴合物形式。作為實(shí)例，可以列舉H1N1抗原，Plasmodium的SYVPSAEQI九肽抗原以及藥效基團(tuán)，例如AZT，d4T以及抗生素，例如大環(huán)內(nèi)酯類(macrolides)以及具有作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(SNC)的物質(zhì)。
用圖1至86中列出的以下實(shí)施例將說明本發(fā)明，但不限制其范圍。實(shí)施例
第一系列實(shí)施例合成中間產(chǎn)物的制備
實(shí)施例1.1
1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧-十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-癸-10-醇(圖1)。
1.1.1 4-(二苯氧基磷酰氧基)-2-[(R)3-十二?；?十四?；被鵠丁酸
a.N-叔丁氧基羰基-DL-高絲氨酸
往高絲氨酸氫溴化物(2克；16.78毫摩爾)在水(20毫升)中的溶液，加入1M氫氧化鈉溶液(16.78毫升)，然后加入碳酸銫(3.01克，9.23毫摩爾)。攪拌5分鐘后，溶液于冰/水浴中冷卻。然后加入二噁烷(60毫升)及焦碳酸叔丁酯。反應(yīng)混合物于冰-冷水浴中維持?jǐn)嚢?小時，隨后于室溫維持?jǐn)嚢?小時。真空蒸去溶劑，無水殘余物直接用于下面步驟。
b.N-叔丁氧基羰基-DL-高絲氨酸芐酯
往前一步驟的殘余物內(nèi)加入二甲基甲酰胺(20毫升)，進(jìn)行蒸發(fā)至干。然后往反應(yīng)混合物內(nèi)加入二甲基甲酰胺(60毫升)及芐基溴(4.5毫升；20.13毫摩爾)。此時形成白色沉淀?；旌衔镉跀嚢柘戮S持16小時。然后真空去除溶劑，殘余物使用乙酸乙酯(2×20毫升)純化。有機(jī)相先用水(20毫升)，然后用鹽水(20毫升)洗滌。用硫酸鎂干燥后，蒸去溶劑，殘余物可用于下面步驟。
c.N-叔丁氧基羰基-O-(二苯氧基磷?；?-DL-高絲氨酸芐酯
往前一步驟無水殘余物在二氯甲烷(60毫升)中的溶液，加入4-(N，N-二甲基氨基)吡啶(DMAP)(4.11克；33.56毫摩爾)。反應(yīng)混合物攪拌10分鐘。然后加入吡啶(12毫升)及氯磷酸二苯酯(6.95毫升；33.56毫摩爾)。溶液于室溫攪拌18小時，然后先用1N鹽酸(5×20毫升)，然后用水(30毫升)，再用鹽水(30毫升)洗滌。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，在真空下蒸去溶劑。使用硅膠柱閃式色譜純化(使用己烷/乙酸乙酯混合物洗脫，4/1)，回收磷酸化產(chǎn)物(7.49克；82.4％)，呈結(jié)晶固體狀。熔點(diǎn)63.5-64.0℃。
d.O-(二苯氧基磷?；?-DL-高絲氨酸芐酯，三氟乙酸鹽
前一步驟磷酸化產(chǎn)物(7.88克；15.4毫摩爾)在三氟乙酸(15毫升)中的溶液，于室溫維持?jǐn)嚢?.5小時。然后在高真空下蒸去溶劑，采用硅膠柱閃式色譜純化(甲醇/二氯甲烷洗脫，10/1)，回收去保護(hù)胺的三氟乙酸鹽(7.17克；88.9％)，呈結(jié)晶固體。熔點(diǎn)＝73.0-73.5℃。
e.2-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-(二苯氧基磷酰氧基)丁酸芐酯
制備根據(jù)在[Bull.Chem.Soc.Jpn.，60(1987)，2205-2214]中描述的方法得到的(R)-3-十二?；跏乃?4.284克；10.07毫摩爾，1當(dāng)量)在四氫呋喃THF(30毫升)中的溶液，該溶液冷卻直到-15℃。然后加入N-甲基嗎啉(1.108毫升；10.07毫摩爾，1當(dāng)量)及氯甲酸異丁酯(1.31毫升；10.07毫摩爾，1當(dāng)量)。反應(yīng)混合物在-15℃維持?jǐn)嚢?0分鐘。然后加入O-(二苯氧基磷?；?-DL-高絲氨酸芐酯(5.724克；10.07毫摩爾；1當(dāng)量)在THF/Et3N混合物(30毫升/5毫升)中的溶液。于室溫攪拌18小時后，在真空下蒸去溶劑。殘余物用水(20毫升)稀釋，然后使用乙酸乙酯(2×30毫升)萃取。合并有機(jī)相，相繼地用水(20毫升)、鹽水(20毫升)洗滌，然后在蒸去溶劑前用硫酸鎂干燥。用硅膠柱閃式色譜純化(己烷/乙酸乙酯洗脫液，2/1)，回收期望的芐酯(7.455克；87％)，呈結(jié)晶固體狀。熔點(diǎn)(PF)＝31.0°-32.1℃.1H-RMN(CDCl3，250 MHz)，δ，ppm7.4-7,1(m，15H)；6.90(2d，1H，3J＝7.6 Hz，NH)；5.3-5.1(m，3H)；4.7(m，1H)；4.35(m，2H)；2.45(m，2H)；2.4-2.1(m，4H)；1.6(m，4H)；1.4-1.1(m，34H)；0.9(t，6H).13C-RMN(CDCl3，63MHz)，δ，ppm173.01；171.08；169.66；150.18(d，2JP，C＝7.1 Hz)；135.01；129.60；128.33；128.14；127.96；125.21；119.80(d，3JP，C＝5.0 Hz)；70.69；67.05；65.19(d，2JP，C＝5.6 Hz)；49.13；40.97；40.77(2 diast.)；34.20；33.98；33.82；31.70；29.42；29.34；29.14；28.94；25.01；24.77；22.47；13.91.
f.4-(二苯基氧磷酰氧基)-2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠丁酸
前一步驟所得芐酯(2.23克，26毫摩爾)在HPLC級甲醇MeOH(300毫升)中的溶液置于三頸圓底燒瓶中，在室溫及氫的大氣壓下，在10％碳載鈀(1克)存在下氫化1小時。然后過濾去除催化劑，濾液經(jīng)濃縮獲得無色液體。薄層層析及NMR時使其液體均化，未經(jīng)進(jìn)一步純化處理直接用于偶合步驟
Rf＝0.75(CH2Cl2/MeOH/Et3N10/1/0.5).1H-RMN(CDCl3，250 MHz)，δ，ppm7.4-7.1(m，10H)；6.85(d，1H，NH)；5.15(m，1H)；4.6(m，1H)；4.35(m，2H)；2.45(m，2H)；2.4-2.15(m，4H)；1.6(m，4H)；1.4-1.1(m，34H)；0.9(t，6H).13C-RMN(CDCl3，63 MHz)，δ，ppm173.35；173.30(2 diast.)；172.75；170.37；150.0(d，2JP，C＝7.5 Hz)；129.55；125.28；119.71(d，3JP，C＝4.4 Hz)；70.78；65.65(d，2JP，C＝5.9 Hz)；49.00；40.77；40.63(2 diast)；34.13；33.86；33.76；31.59；29.31；29.25；29.03；28.82；24.88；24.68；22.36；13.76.
1.1.2 (2R)-5-氨基-2-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]-戊-1-醇a.D-鳥氨酸銅鹽
往D-鳥氨酸(5.25克，30毫摩爾)在1N氫氧化鈉(30毫升)中的溶液，加入硫酸銅五水合物(3.814克，15.3毫摩爾)在水(50毫升)中的溶液。在室溫下攪拌2小時后，蒸去熔劑至干。這時，往殘余物加入甲醇(60毫升)，形成紫色固體，固體經(jīng)分離后，相繼地用二噁烷及甲醇洗滌，以便直接用于下面步驟。
b.(2R)-2-氨基-5-(芐基氧羰基氨基)戊酸銅
紫色固體溶解于1N氫氧化鈉(40毫升)及二噁烷(70毫升)。反應(yīng)混合物在冰冷水浴中冷卻，然后加入氯甲酸芐酯(5.14毫升，36毫摩爾)。在冰-冷水浴中攪拌3小時，然后在室溫下攪拌15小時后，紫色沉淀采用過濾回收，相繼地用95％乙醇(40毫升)、水(50毫升)及乙醇(60毫升)洗滌。沉淀物在烘箱中干燥(溫度小于45℃，于真空下)，二步驟的產(chǎn)率為8.27克，即93％理論產(chǎn)率。(參考文獻(xiàn)OrganicPreparations and Procedures International，23(1992)191-194)。
c.(2R)-5-(芐基氧羰基氨基)-2-(叔丁氧基羰基氨基)戊酸
前一步驟所得銅鹽溶解于2N鹽酸(400毫升)中，然后加入乙二胺四乙酸(EDTA)(8.15克，27.8毫摩爾)?；旌衔飻嚢?.5小時后，通過加入5N氫氧化鈉(約160毫升)，中和至pH 7。此時形成白色沉淀。然后混合物在冰-冷水浴中攪拌2.5小時。沉淀經(jīng)過濾，用冷水洗滌至流出液是無色的，然后在烘箱在60℃以下干燥。此固體溶解于1N氫氧化鈉(156毫升)，溶液在冰-冷水浴中冷卻。然后，往這種溶液加入在二噁烷(160毫升)的焦碳酸叔丁酯(7.7克，35.2毫摩爾)。反應(yīng)混合物于0℃攪拌45分鐘，隨后于室溫下攪拌16小時。蒸去有機(jī)溶劑，殘余物溶解于乙酸乙酯(70毫升)中。然后水相通過加入2N鹽酸酸化至pH約3，用乙酸乙酯(100毫升)洗滌。有機(jī)相合并，用水(30毫升)及鹽水(30毫升)洗滌，然后在真空下蒸發(fā)。采用硅膠柱閃式色譜純化(二氯甲烷/甲醇洗脫液，20/1)，可回收需要產(chǎn)物，呈無色油狀(二步驟產(chǎn)率8.42克，即理論產(chǎn)率的76.6％)(Rf＝0.19，CH2Cl2/MeOH，20/1)。
d.(2R)-5-(芐基氧羰基氨基)-2-(叔丁氧基羰基氨基)戊-1-醇
往前面所得二氨基戊酸衍生物(5.45克，14.8毫摩爾)在THF(60毫升)中的冷溶液(-15℃)，加入N-甲基嗎啉(1.65毫升，14.8毫摩爾)及氯甲酸異丁酯(9.6毫升，14.8毫摩爾)。反應(yīng)混合物于-15℃攪拌1分鐘，接著加入硼氫化鈉(5.1克，44.6毫摩爾)在10毫升水中的溶液。在-15℃攪拌10分鐘后，往混合物加水(400毫升)以終止反應(yīng)。溶液隨后用乙酸乙酯AcOEt(100毫升×2)洗滌。有機(jī)相合并，用水(50毫升)及鹽水(60毫升)洗滌，然后用硫酸鎂干燥。蒸去溶劑，殘余物在乙酸乙酯/己烷混合物中結(jié)晶，獲得預(yù)期的結(jié)晶產(chǎn)物(4.94克，94.9％產(chǎn)率)。熔點(diǎn)＝47.5-48℃。
e.(2R)-5-(芐基氧羰基氨基)-2-氨基-戊-1-醇，三氟乙酸鹽
制備前面獲得的(2R)-5-(芐基氧羰基氨基)-2-(叔丁氧基羰基氨基)戊-1-醇(6.32克，18毫摩爾)在三氟乙酸(25毫升)中的溶液，然后在室溫下攪拌2.5小時。隨后蒸去溶劑，殘余物用硅膠柱閃式色譜純化(甲醇/二氯甲烷洗脫液，10/1)，可以回收三氟乙酸鹽，呈油狀(5.45克，82.7％)。鹽酸鹽化合物在133.0-134.3℃熔化(由甲醇再結(jié)晶)。
f.(2R)-5-(芐基氧羰基氨基)-2-[(R)-3-芐基氧十四?；被鵠戊-1-醇
往(R)-3-芐基氧十四酸(5.27克，15.8毫摩爾)[Bull.Chem.Soc.Jpn.，60(1987)，2197-2204]在THF(30毫升)中冷卻至-15℃的溶液，加入N-甲基嗎啉(1.89毫升，15.8毫摩爾)及氯甲酸異丁酯(2.21毫升，15.8毫摩爾)。反應(yīng)混合物在-15℃攪拌30分鐘后，加入如前獲得的三氟乙酸鹽(15.25克，14.4毫摩爾)在THF/三乙胺混合物(30毫升，1.44毫摩爾)中的溶液。在室溫持續(xù)攪拌16小時，然后反應(yīng)混合物用水(30毫升)及乙酸乙酯(60毫升)稀釋。有機(jī)相經(jīng)分離后，水相用乙酸乙酯(60毫升)洗滌。有機(jī)相合并，用水(30毫升)及鹽水(30毫升)洗滌，然后在真空下蒸發(fā)溶劑前用硫酸鎂干燥。殘余物在乙酸乙酯/己烷混合物中再結(jié)晶，獲得預(yù)期產(chǎn)物呈結(jié)晶態(tài)(5.8克，71. 2％)，PF＝117.5°-118℃.Rf＝0.32，乙酸乙酯-石油醚3/1。
1H-RMN(CDCl3，250 MHz)，δ，ppm7.4-7.2(m，10H)；6.5(d，1H，NH)；5.1(s，2H)；4.9(m，1H，NH)；4.5(2d，AB，2H)；3.8(m，2H)；3.5(m，2H)；3.1(m，2H)；2.4(m，2H)；1.6-1.4(m，6H)；1.4-1.2(m，18H)；0.9(t，3H).13C-RMN(CDCl3，63 MHz)，δ，ppm172.24；156.49；138.06；136.53；128.46；128.04；127.87；76.76；71.39；66.60；65.44；51.54；41.43；40.65；33.76；31.87；29.61；29.30；28.01；26.47；25.05；22.65；14.09.
g.(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-芐基氧十四酰基氨基]戊-1-醇
在三頸瓶內(nèi)，催化劑(150毫克20％鈀/碳)添加到(2R)-5-(芐基氧羰基氨基)-2-[(R)-3-芐基氧十四酰基氨基]戊-1-醇(3.0克，5.27毫摩爾)在HPLC級乙醇(300毫升)/三乙胺(6毫升)混合物中。抽真空排放空氣，然后往瓶內(nèi)裝入氫氣。反應(yīng)混合物在室溫下氫化2小時，然后過濾去除催化劑，濾液經(jīng)濃縮得到預(yù)定產(chǎn)物，呈均質(zhì)白色固體。Rf＝0.2；CH2Cl2/MeOH/Et3N 5/1/0.5.PF＝47-48℃.1H-RMN(CDCl3，250 MHz)，δ，ppm7.4-7.2(m，5H)；6.75(d，1H，NH)；4.5(2d，AB，2H)；3.9(m，2H)；3.5(m，2H)；2.3-2.6(m，7H)；1.7-1.2(m，24H)；0.9(t，3H).13C-RMN(CDCl3，63 MHz)，δ，ppm171.86；138.13；128.37；127.87；127.75；76.81；71.50；64.57；51.38；41.51；41.17；33.89；31.82；29.26；28.57；28.03；25.07；22.60；14.04.
1.1.3. 1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧-十四?；?氨基]-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-癸-10-醇
IIDQ(2-異丁氧基-1-異丁氧基羰基-1，2-二氫喹啉)(364克，1.2毫摩爾，1.2當(dāng)量)添加到(2RS)-4-(二苯基氧磷酰氧基)-2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠丁酸(850克，1.0毫摩爾，1當(dāng)量)在無水二氯甲烷(20毫升)中的溶液，此添加步驟系在室溫及在氬氣流下進(jìn)行。反應(yīng)混合物攪拌15分鐘后，加入(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-芐基氧十四?；被鵠戊-1-醇(757克，1.0毫摩爾，1當(dāng)量)在無水二氯甲烷(10毫升)中的溶液。攪拌4小時之后，溶液蒸發(fā)至干。用硅膠柱閃式色譜純化(二氯甲烷/丙酮洗脫液，5/2)，能夠回收磷酸化假肽(620毫克，53％)，呈無定形固體狀(Rf＝0.49，在二氯甲烷-己醇-三乙胺，10/1/0.5中)。1H-RMN(CDCl3，250 MHz)，δ，ppm7.40-7.15(m，15H)，7.00(m，1H)，6.90及6.80(2d，2diast，1H)，6.65(d，1H)(3×NH)，5.15(m，1H)，4.50(m，3H)，4.30(m，2H)，3.85(m，2H)，3.45(m，2H)，3.15(m，2H)，2.41-2.14(m，8H)，1.6-1.4(m，8H)，1.4-1.1(m，54H)，0.9(t，9H，3CH3)，13C-RMN(CDCl3，63 MHz)，δ，ppm173.11，171.68，170.52(2diast.)，169.94(2 diast.)，150.0(d，2JP，C＝7.2 Hz)，138.20(2diast.)，129.58，127.99，127.49，127.26，125.24，119.73(t，3JP，C5.0 Hz)，76.48，71.12，70.71，65.86(élargi)，64.22，50.96，49.71(élargi)，41.46，41.05，39.07，34.13，34.00，32.70，31.61，29.34，29.06，28.87，27.98，25.25 24.92，24.72，22.38，13.80.
實(shí)例1.2
N-[(R)-3-十四?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-戊基}酰胺(＝OM-197-MC)(圖2)
1.2.1 N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，β-芐酯
往(R)-3-十二?；跏乃?3.35克，7.85毫摩爾)在-15℃無水THF(25毫升)中的溶液，在氬氣流下，相繼加入N-甲基嗎啉(0.86毫升，7.85毫摩爾，1當(dāng)量)及氯甲酸異丁酯(1.02毫升，7.85毫摩爾，1當(dāng)量)?？煽焖俚赜^察到N-甲基嗎啉鹽酸鹽沉淀。在-15℃攪拌30分鐘后，加入市售的H-D-Asp(OBn)-OH(Senn化學(xué)公司，CH-Dielsdolf)(175克，7.85毫摩爾，1當(dāng)量)在CH3CN/H2O，3.5/1混合物(85毫升)中的溶液，該溶液含有三乙胺(3.7毫升)。然后反應(yīng)混合物在室溫下攪拌一夜。然后蒸去有機(jī)溶劑，水相冷卻至0℃，用10％檸檬酸水溶液酸化至pH＝3，再用乙酸乙酯(2×)萃取。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。在硅膠柱閃式色譜純化(2/1，石油醚/乙酸乙酯洗脫液，含2％乙酸)，接著共蒸發(fā)甲苯，能夠回收N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-D-天冬氨酸β-苯酯(4.00克，81％)，呈白色結(jié)晶固體狀(Rf＝0.42，在1/1石油醚/乙酸乙酯中，含2％乙酸，磷鉬酸化合物及紫外光顯色劑)。PF＝67-69℃。
1.2.2 N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐基氧十四?；被鵠-戊基}酰胺β-芐酯(ASM-1)
往如上所得的β-芐酯(363毫克，0.57毫摩爾)及(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊-1-醇(1.1.2節(jié))(250毫克，0.57毫毫摩爾，10當(dāng)量)在無水二氯甲烷(6毫升)中的溶液，在0℃(冰/水浴)在氬氣流下相繼加入市售HOAt(1-羥基-7-氮雜苯并三唑)(94毫克，0.69毫摩爾，1.2當(dāng)量)，然后加入市售N，N’-二異丙基碳化二亞胺(109微升，0.69毫摩爾，1.2當(dāng)量)。反應(yīng)混合物在0℃攪拌1小時，隨后在室溫下攪拌一夜。反應(yīng)介質(zhì)隨后用水、1N鹽酸溶液及1飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，再分離相。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。經(jīng)用硅膠柱閃式色譜純化(二氯甲烷/丙酮洗脫液，3/1)，可以回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(436毫克，72％)，呈白色結(jié)晶固體狀(Rf＝0.27，在5/1二氯甲烷/丙酮中，磷鉬酸化合物及紫外光顯色劑)。
PF＝106-108℃；13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm173.66；172.09；171.73；170.33；170.12；138.23；135.28；128.53；128.37；128.13；127.81；127.71；125.81；76.71；71.40；71.16；66.77；65.01；51.36；49.39；41.66；39.25；34.40；33.98；31.85；29.58；29.47；29.29；29.11；28.00；25.57；25.17；25.08；24.94；22.62；14.05.
1.2.3 N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-戊基}酰胺(＝OM-197-MC)
N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸β-芐酯，αN-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊基}酰胺(417毫克，0.40毫摩爾)在1/1甲醇/乙酸乙酯混合物(36毫升)中的溶液，在10％鈀/碳(20毫克)存在下，在室溫及大氣壓氫氣下氫化3小時。過濾去除催化劑，用4/1二氯甲烷/甲醇混合物(50毫升)洗滌，濾液用蒸發(fā)至干，再用葉輪泵抽干，獲得游離酸(345毫克，100％)，呈白色結(jié)晶固體狀(Rf＝0.30，在含0.5％乙酸的9/1二氯甲烷/甲醇中，磷鉬酸化合物顯色劑)。PF＝135-137℃。ES/MSm/z 868.7[M+H]+，890.7[M+Na]+，868.7[M+K]+，912.7[M-H+2Na]+(圖3)。
1.2.4 N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-L-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-戊基}酰胺
同樣的反應(yīng)順序應(yīng)用到市售H-L-Asp(OBn)-OH(Fluka公司，Buchs，瑞士)，獲得L-天冬氨酸系列的差向異構(gòu)體產(chǎn)物。
實(shí)例1.3
N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-二羥基磷酰氧基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-戊基}酰胺(＝OM-197-MC-MP)(圖2)
1.3.1 N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-二芐氧基磷酰氧基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊基}酰胺-β芐酯
往如上所得的N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-芐酯(300毫克，0.29毫摩爾)及IH-四唑(60毫克，0.86毫摩爾)在無水THF(12毫升)中的溶液，在室溫及在氬氣流下加入85％二芐基二乙基亞氨基磷酸酯(231微升，0.66毫摩爾)?？焖儆^察到在反應(yīng)介質(zhì)中形成白色晶體。在攪拌30分鐘后，反應(yīng)混合物冷卻至-20℃，然后加入mCPBA(57-86％，183毫克，1.06毫摩爾)在二氯甲烷(8毫升)的溶液。注意晶體消失。在室溫下攪拌45分鐘后，加入硫代硫酸鈉飽和溶液，然后反應(yīng)混合物再度攪拌10分鐘。溶液用醚稀釋，然后有機(jī)相經(jīng)分離后，用飽和硫代硫酸鈉溶液(5次)、飽和碳酸氫鈉溶液(2次)及1M鹽酸溶液(1次)洗滌。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。用硅膠柱閃式色譜純化(5/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，能夠回收磷酸三酯(294毫克，79％)，呈白色固體狀(Rf＝0.27，在5/1二氯甲烷-丙酮中，磷鉬酸化合物及紫外光顯色劑)
13C-RMN(62,89 MHz，CDCl3)，δ，ppm173.26；171.37；171.01；170.60；170.03；138.22；135.50；135.40；135.28；128.40；128.33；128.16；128.08；127.94；127.82；127.76；127.53；127.41；76.43；71.03；70.90；69.28；66.47；49.09；48.37；41.62；41.35；41.24；39.02；38.88；25.05；24.94；24.82；22.48；13.90.
1.3.2. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-二羥基磷酰氧基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-戊基}酰胺(＝OM-197-MC-MP)
如上述制備的磷酸二芐酯(249毫克，190毫升)在HPLC級乙醇(12毫升)中的溶液，在10％鈀/碳(30毫克)存在下，在室溫及氫的大氣壓力下氫化4小時。采用微孔過濾除去催化劑，濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物使用葉輪泵脫水獲得粗制游離磷酸酯(180毫克，100％)。ES/MSm/z 850.7[M+H-P(O)(OH)3+]，948.5[M+H]+970.5[M+Na]+(圖4)。
實(shí)例1.4
確定合成中間物的差向異構(gòu)比率
采用原始氨基酸構(gòu)型確定帶有?；坊粚ΨQ中心的立體化學(xué)。但天冬氨酸或谷氨酸衍生物與由鳥氨酸或賴氨酸得到的氨基醇間進(jìn)行的肽偶合，在某些條件下可能導(dǎo)致偶合反應(yīng)的酸對偶在C-α出現(xiàn)差向異構(gòu)現(xiàn)象。為了說明該反應(yīng)的差向異構(gòu)率，下述方法應(yīng)用于由天冬氨酸得到的化合物。
試樣(30微克)蒸發(fā)入微管內(nèi)，然后再溶解在40微升6M鹽酸中。接著在110℃在氬氣下進(jìn)行水解24小時。然后試樣蒸發(fā)至干，隨后再度溶解在100微升0.1M四硼酸鹽緩沖液，pH 9.2中。隨后使用OPA-IBLC試劑(鄰-苯二甲醛-N-異丁炔基-L-半胱氨酸)用下述比例進(jìn)行預(yù)管柱(pré-colonne)衍生化
5微升0.1M四硼酸鈉緩沖液，pH 9.2
2微升170mM OPA，260mM IBLC甲醇溶液
2微升欲分析溶液
用Hypersil ODS柱(250×4.6毫米，5微米Supelco)的HPLC分析，能夠定量測定存在于起始試樣中的來自L及D型天冬氨酸兩種衍生物(Brückner等人，1995，J.Chromatogr.A 711，201-215)。HPLC操作條件如下
柱Hypersil ODS(250×4.6，5微米，Supelco)
移動相A23mM乙酸鈉，pH5.9
B甲醇-乙腈(12∶1)
注入 5微升
流速 1毫升/分鐘
洗脫 A∶B梯度25分鐘內(nèi)96∶4至80∶20
探測 紫外光338納米
在這些色譜條件下，觀察到L-及D-天冬氨酸衍生物的保留時間為16.1及17.2分鐘。
第2系列實(shí)施例帶有官能化附屬支鏈的假二肽的制備
實(shí)施例2.1
3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基胺基]-癸-1，10-二醇-1-二氫磷酸酯10-(6，7-二羥基庚酸酯)(＝OM-197-FV6)(圖5)
2.1.1. 1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-癸-10-醇(6-庚烯酸酯)
往1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]-10-醇(圖1.1)(875毫克，0.74毫摩爾)在無水二氯甲烷(25毫升)中的溶液，加入6-庚烯酸(141微升，1.04毫摩爾，1.4當(dāng)量)。溶液冷卻至0℃。然后加入EDCI(64毫克，0.33毫摩爾，1.4當(dāng)量)及DMAP(41毫克，0.33毫摩爾，0.14當(dāng)量)。反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，隨后在室溫下攪拌3小時。用二氯甲烷稀釋后，有機(jī)相相繼地用水，1N鹽酸溶液及水洗滌。然后，有機(jī)相用硫酸鎂干燥，在40℃真空下蒸發(fā)。用硅膠柱閃式色譜純化(1/1石油醚/乙酸乙酯洗脫液)，能夠回收1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-癸-10-醇6-庚烯酸酯(820毫克85％)，呈白色發(fā)泡體狀(Rf＝0.18，在1/1石油醚/乙酸乙酯中，磷鉬酸顯色劑)。13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm173.30；171.18；170.42；169.91；169.73；150.10；138.21；138.14；129.77；128.25；127.49；125.44；119.88；114.56；76.48；71.11；70.90；66.01；65.52；49.90；47.80；41.34；39.07；33.92；33.76；33.69；33.61；33.17；31.75；29.47；29.19；29.00；28.46；28.11；25.34；25.05；24.85；22.52；13.96.
2.1.2. 1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-10-醇(6，7-二羥基庚烯酸酯)
往在叔丁醇/水混合物(5毫升/5毫升)中含K3Fe(CN)6(373毫克，1.13毫摩爾，3當(dāng)量)，碳酸鉀(157毫克，1.13毫摩爾，3當(dāng)量)及1，4-二氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷(DABCO)(10.7毫克，0.095毫摩爾，0.25當(dāng)量)的溶液，加入如上所得化合物(486毫克，0.38毫摩爾)，然后加入四氧化鋨在25％叔丁醇(48微升，4.75毫摩爾，0.0125當(dāng)量)中的溶液。反應(yīng)混合物在室溫(27℃)強(qiáng)力攪拌16小時。加入硫代硫酸鈉(Na2S2O5，60毫克)，連續(xù)攪拌近1小時直到介質(zhì)顏色變成褐色，然后變成綠色或淡藍(lán)色為止。反應(yīng)混合物用醚稀釋，分離有機(jī)相。水相用醚徹底洗滌，有機(jī)相合并，用硫酸鎂干燥，然后在40℃真空下蒸發(fā)。如此獲得預(yù)期的粗制二醇呈綠色油狀。通過硅膠柱閃式色譜純化(5/2二氯甲烷/丙酮洗脫)，能夠回收純的1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氧雜-9-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-10-醇6，7-二羥庚烯酸酯(198毫克，40％)，呈無定形固體狀(Rf＝0.24，在5/2二氯甲烷/丙酮中，磷鉬酸顯色劑)。
13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm173.46；173.33；171.34；170.58；170.02；150.13；138.23；129.80；128.26；127.87；127.54；125.50；120.01；119.80；71.79；71.23；70.97；66.63；66.03；65.54；49.93；47.90；41.46；39.17；33.98；33.79；32.86；32.45；31.77；29.49；29.21；29.03；28.51；25.50；25.07；24.87；24.77；24.66；22.54；13.99.HPLC(210nm)TR＝32.535 min.ES/MSm/z 1343.0(M+Na+)；1321.0(M+H+)；1071.0(M+H+磷酸單苯酯)。
2.1.3. 1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-10-醇(6，7-二羥基庚烯酸酯)
前面得到的二醇(198毫克，0.15毫摩爾)在HPLC級乙醇(20毫升)/乙酸乙酯(1.4毫升)混合物中的溶液，在10％鈀/碳(70毫克)存在下，在室溫及氫的大氣壓力下氫化2.5小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物用葉輪泵抽干，獲得粗制去芐基化產(chǎn)物(168毫克，91％)，呈無定形固體狀。
13C-RMN(62.89MHz，CDCl3)，δ，ppm173.15；173.51；172.82；171.04；170.49；170.35；150.05；129.79；129.42；125.53；119.91；119.83；119.72；71.80；70.93；68.58；66.47；65.94；65.52；50.02；48.12；42.59；41.26；39.13；36.92；34.29；33.85；32.32；31.74；29.50；29.18；29.00；28.15；25.47；25.07；24.85；24.73；24.56；22.51；13.99.HPLC(210nm)TR＝30.7min.ES/MSm/z 1253.0[M+Na]+；1231.0[M+H]+.
2.1.4. 3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇-1-二氫磷酸酯10-(6，7-二羥基庚烯酸酯)(＝OM-197-FV6)
往氧化鉑PtO2(91毫克)(在氫氣氛下預(yù)先活化10分鐘獲得鉑黑)在HPLC級乙醇(1毫升)中的懸浮液，添加前面獲得的三醇(168毫克，0.14毫摩爾)在HPLC級乙醇(8毫升)/乙酸乙酯混合物(8毫升)中的溶液。溶液在室溫(27℃)在氫的大氣壓力下氫化24小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物用葉輪泵抽干，獲得粗制磷酸酯產(chǎn)物(130毫克，88％)。HPLC(210nm)TR＝23.6分鐘。ES/MSm/z1078.9[M+H]+，1100.8[M+Na]+，1116.8[M+K]+(圖6)。
實(shí)施例2.2.
3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氧代己酸酯)(＝OM-197-FV7)(圖5)
2.2.1. 3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氧代己酸酯)(＝OM-197-FV7)
將1.86毫升0.1M高碘酸鈉(39.62毫克，20當(dāng)量)加入在1∶1水/異丙醇混合物中的10毫升(9.28毫摩爾，1當(dāng)量)上述制備的去保護(hù)三醇，進(jìn)行高碘酸氧化反應(yīng)。采用LC/UV跟蹤反應(yīng)，2小時后表明二醇官能團(tuán)定量轉(zhuǎn)化成醛。在高碘酸氧化步驟(圖7)后對ES/MS光譜所觀察的分子離子m/z 1046.8證明了預(yù)期反應(yīng)。基于這種光譜，m/z1068([M+Na]+)鈉與m/z1084.8([M+K]+)鉀的加合物清晰可見，以及對應(yīng)于m/z948.8磷?；鶕p失的片段。加入1至2滴乙二醇結(jié)束該反應(yīng)。產(chǎn)物純化可用在C18載體上的SPE進(jìn)行，產(chǎn)率90％(5毫克二醇比例)。
實(shí)施例2.3.
N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-戊基}酰胺5-O-(6，7-二羥基庚烯酸酯)(＝OM-197-FV5)(圖8)
2.3.1. N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]-戊基}-酰胺-β-芐酯，5-O-(6-庚酸酯)
往N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]-戊基}-酰胺β-芐酯(1.2.2.節(jié))(122毫克，0.116毫摩爾)在無水二氯甲烷(5毫升)中的溶液，加入6-庚烯酸(22微升，0.160毫摩爾，1.4當(dāng)量)。溶液冷卻到0℃。然后，加入EDCl(49.3毫克，025毫摩爾，2.1當(dāng)量)及DMAP(5.6毫克，0.046毫摩爾，0.4當(dāng)量)。反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，然后在室溫下攪拌6小時。在用二氯甲烷稀釋后，有機(jī)相相繼地使用水、1N鹽酸(2×)、碳酸氫鈉(2×)及水(2×)洗滌。如此獲得純的預(yù)期庚烯酸酯(119克，89％)，呈白色固體狀(Rf＝0.62，在5/1二氯甲烷/丙酮混合物中，顯色劑磷鉬酸)。
13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm；173.63；173.38；171.72；171.11；170.08；138.14；135.28；128.46；128.34；128.24；128.05；127.64；127.53；114.62；76.49；71.14；71.02；66.66；65.49；49.17；47.79；41.69；41.35；39.09；35.46；34.33；33.80；33.65；33.21；31.79；29.52；29.23；29.06；28.46；28.16；22.56；14.00.HPLC(210nm)TR＝36.9min.ES/MSm/z1159.0[M+H]+；1176.0[M+NH4]+.PF＝81.5-84℃.[α]D20＝+7.3(CHCl3)
2.3.2. N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊基}-酰胺β-芐酯，5-O-(6，7-二羥庚酸酯)
往如上所得庚烯酸酯(60毫克，0.052毫摩爾)在水/丙酮混合物(5/3毫升)的溶液中，加入N-甲基嗎啉氧化物(9毫克，0.076毫摩爾，1.5當(dāng)量)，隨后滴加四氧化鋨在2.5％叔丁醇中的溶液(123微升，0.012毫摩爾，0.23當(dāng)量)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時。Na2S2O5(20毫克)添加到反應(yīng)混合物，隨后在室溫下攪拌1小時至2小時。然后溶液用醚萃取數(shù)次，有機(jī)相合并，用硫酸鎂干燥及濃縮。用硅膠柱閃式色譜純化(5/2二氯甲烷/丙酮洗脫液)，能夠回收純的預(yù)期二醇(35毫克，57％)，呈白色固體狀(Rf＝0.15，在5/1二氯甲烷/丙酮混合物中，顯色劑，磷鉬酸)。
13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm173.67；173.39；171.81；171.34；170.27；170.01；138.18；135.27；128.56；128.42；128.18；127.50；127.68；76.68；71.82；71.37；71.17；66.85；66.74；65.66；49.27；47.99；41.88；41.51；39.31；35.60；34.42；33.95；33.51；31.80；29.60；29.49；29.30；28.55；25.65；25.60；25.19；25.12；24.97；24.77；24.14；22.65；14.08.HPLC(210nm)TR＝34.16min.ES/MS；m/z 1193.0[M+H+]；1212.0[M+NH4]+.
2.3.3. N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-戊基}酰胺5-O-(6，7-二羥基庚酸酯)(＝OM-197-MC-FV5)
如上所得二醇(35毫克，0.029毫摩爾)在HPLC級甲醇(2毫升)/乙酸乙酯(2毫升)混合物中的溶液，在室溫與氫的大氣壓力下，在含10％鈀的鈀/碳(10毫克)存在下進(jìn)行氫化2.5小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物用葉輪泵抽干，獲得粗制N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺5-O-(6，7-二羥基庚酸酯)(26毫克，88％)，呈白色固體狀。HPLC(210nm)TR＝26.90分鐘。PF＝94-97℃。[α]D20＝+11.1℃(CHCl3/MeOH＝1∶0.1)。ES/MSm/z 1012.7[M+H]+，1034.7[M+Na]+，1050.7[M+K]+(圖9)。
實(shí)施例2.4.
N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-戊基}酰胺5-O-(6-氧代己酸酯)(＝OM-197-MC-FV7)(圖8)
2.4.1. N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-戊基)酰胺5-O-(6-氧代己酸酯)(＝OM-197-MC-FV6)
1.98毫升0.1M高碘酸鈉(42.25毫克，20當(dāng)量)添加到在1∶1異丙醇-水混合物中的10毫克(9.88微摩爾，1當(dāng)量)如上制備的去保護(hù)三醇(2.3.3.節(jié))。溶液在室溫下攪拌2小時。通過加入1至2滴乙二醇中止反應(yīng)。在這個高碘酸氧化步驟后，在ES/MS光譜(圖10)上觀察到m/z 980.6[M+H]+分子離子，證明存在醛官能團(tuán)。也可見到對應(yīng)于m/z 1002.8([M+Na]+)鈉及m/z 1018.6([M+K]+)鉀的加合物峰。通過在C18載體上SPE純化能夠回收OM-197-MC-FV6產(chǎn)物，產(chǎn)率90％。
實(shí)施例2.5.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；盷-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-戊基}酰胺5-O-(6-羥基己酸酯)(＝OM-197-MC-FV7)(圖8)
2.5.1.N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-戊基}酰胺5-O-(6-羥基己酸酯)(＝OM-197-MC-FV7)
往如上所得6-氧代己酸衍生物(4.5毫克，0.0043毫摩爾)在90％異丙醇(20毫升)中的溶液，加入硼氫化鈉在甲醇溶液(1毫克/毫升)(0.2毫升)中的溶液?；旌衔镌?5℃攪拌3分鐘，然后加入過量乙酸(0.2毫升)。采用C18柱制備HPLC純化能夠回收90％產(chǎn)物OM-197-MC-FV7(2.3毫克，51％)在異丙醇中的溶液。
實(shí)施例2.6.
(3RS，9R)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇]1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(＝OM-197-MP-AC-RS，R)(圖11)
2.6.1. 1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-十二酰基氧十四酰基氨基]-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-癸-10-醇(6-芐氧基羰基氨基己酸酯)
往1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基-十四?；被鵠-癸-10-醇(圖1)(230毫克；0.20毫摩爾)在無水二氯甲烷(8毫升)中的溶液，添加6-芐氧基羰基氨基己酸(88毫克，0.33毫摩爾，1.65當(dāng)量)。溶液冷卻至0℃。接著加入EDCl(200毫克，1.04毫摩爾，5.2當(dāng)量)及DMAP(13毫克，0.10毫摩爾，0.5當(dāng)量)。反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，隨后在室溫下攪拌4小時。使用二氯甲烷稀釋后，有機(jī)相經(jīng)分離，相繼地用水、1N鹽酸和水洗滌。然后，有機(jī)相用硫酸鎂干燥，在40℃真空下蒸發(fā)。通過硅膠柱閃式色譜純化(7/1.2二氯甲烷/丙酮洗脫液)，能夠回收純酯(115毫克，41％)，呈無定形固體狀(Rf＝0.77，在5/2二氯甲烷/丙酮中，磷鉬酸顯色劑)
13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm173.27；171.20；170.34；169.88；156.36；150.16；150.13；138.28；136.56；129.80；128.35；128.26；127.90；127.51；125.45；119.97；119.83；71.05；66.37；65.97；65.61；49.94；47.81；41.39；40.66；39.09；34.32；34.25；33.95；33.65；31.78；29.50；29.38；29.22；29.03；28.55；28.44；25.95；25.06；24.87；24.26；22.55；14.00.HPLC(210nm)TR＝33.497min.ES/MSm/z 1424.0[M+H]+；1174.0[M+H-(PhO)2OPOH]+.
2.6.2. 1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基-十四?；被鵠-癸-10-醇10(6-氨基己酸酯)
如上所得產(chǎn)物(115毫克；0.81微摩爾)在HPLC級乙醇(15毫升)/冰醋酸(0.4毫升)混合物中的溶液，在鈀(10％碳載鈀)(80毫克)存在下，在室溫及氫的大氣壓力下氫化4小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物用葉輪泵抽干，獲得去芐基化產(chǎn)物(90毫克，97％)，呈無定形固體狀。HPLC(210nm)TR＝29.185分鐘。ES/MSm/z1200.0[M+H]+；952.0[M+H-(PhO)2OPOH]+。
2.6.3. 3-[(R)-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-1，10-二醇-1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(＝OM-197-MP-AC)
往氧化鉑PtO2(30毫克)在(HPLC級)乙醇(1毫升)(預(yù)先在氫氣氛下活化10分鐘獲得鉑黑)中的溶液，加入如上所得氨基醇(90毫克，75毫摩爾)在HPLC級乙醇(5毫升)/1N鹽酸(0.1毫升)混合物中的溶液。溶液于室溫在氫的大氣壓力下氫化24小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物使用葉輪泵抽干，能夠獲得期望的氨基磷酸酯(60毫克，79％)。HPLC(210nm)TR-28.51分鐘。ES/MSm/z1047.5[M+H]+；106 9.6(M+Na)+，949.6[M+H-(HO)2OPOH]+(圖12)。
實(shí)施例2.7
(3R，9R)3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(＝OM-197-MP-AC-R，R)(圖13)
2.7.1.N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-[(4R)-5-(2-四氫吡喃基)氧-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊基}酰胺β-芐酯(ASM-1-O-THP)
往N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸β-芐酯，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]-戊基}酰胺(1.5克；1.43毫摩爾)在無水二氯甲烷(30毫升)中的溶液，在室溫及氬氣流下相繼地加入3，4-二氫-2H-吡喃(DHP)(327微升，3.58毫摩爾)，然后加入對甲苯磺酸吡啶鎓(PPTS)(108毫克，429毫摩爾)。在室溫下攪拌18小時后，再加入3，4-二氫-2H-吡喃(DHP)(130微升，1.43毫摩爾)。然后溶液又在室溫下攪拌9小時，然后用二氯甲烷稀釋，相繼地使用5％碳酸氫鈉溶液及水洗滌。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。通過硅膠柱閃式色譜純化(先6/1，然后7/1二氯甲烷/丙酮洗脫液洗脫)，能夠回收N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-[(4R)-5-(2-四氫吡喃基)氧-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺β-芐酯(1.45克；90％)，呈白色結(jié)晶固體狀(Rf＝0.57，在5/1二氯甲烷/丙酮中；磷鉬酸化合物及紫外光顯色劑)。
2.7.2 N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(2-四氫吡喃基)氧-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊基}酰胺
如上制備的化合物(250毫克；0.22毫摩爾)在含三乙基胺(0.4毫升)的1/1乙醇/乙酸乙酯混合物(16毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(10毫克)存在下，在室溫及氫的大氣壓力下氫化二小時。過濾去除催化劑，濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物用葉輪泵抽干，回收呈三乙基銨鹽形式的酸(250毫克)。
2.7.3. 3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-10-(2-四氫吡喃基)氧-癸-1-醇
往如上所制備的酸(約250毫克)在2/1二氯甲烷/無水THF混合物(3毫升)中的溶液，在0℃及氬氣流下加入N-甲基嗎啉(72微升；0.66毫摩爾；3當(dāng)量)，然后加入氯甲酸異丁酯(86微升；0.66毫摩爾；3當(dāng)量)。迅速觀察形成的N-甲基嗎啉鹽酸鹽沉淀。CCM監(jiān)視反應(yīng)的進(jìn)行(Rf＝0.90，在2/1二氯甲烷/丙酮中)。在室溫下攪拌30分鐘后，反應(yīng)混合物冷卻至0℃，然后快速加入硼氫化鈉(33毫克；0.88毫摩爾；4當(dāng)量)在水(1毫升)中的溶液。一旦氣體停止冒出(5分鐘)，溶液用水(1毫升)及THF(1毫升)稀釋，然后在室溫下攪拌5分鐘。溶液經(jīng)濃縮，使用二氯甲烷及水稀釋，接著分離各相。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。用硅膠柱閃式色譜純化(2/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，能夠回收醇(138毫克；61％二步驟)，呈白色結(jié)晶固體狀。(Rf＝0.33，在3/1二氯甲烷/丙酮中；磷鉬酸化合物及紫外光顯色劑)。
2.7.4. 3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-10-(2-四氫吡喃基)氧-癸-1-醇二芐基磷酸酯
往上述制備的醇(120毫克；0.12毫摩爾)及1H-四唑(25毫克；0.35毫摩爾；3當(dāng)量)在無水THF(5毫升)中的溶液，在室溫及氬氣流下，加入85％二芐基二乙基亞氨基磷酸酯(95微升；0.27毫摩爾；2.3當(dāng)量)。可見在反應(yīng)介質(zhì)中快速形成白色晶體。攪拌30分鐘后，反應(yīng)混合物冷卻至-20℃，然后加入mCPBA(57-86％；75毫克；0.43毫摩爾；3.7當(dāng)量)在二氯甲烷(3毫升)中的溶液。注意晶體消失。在室溫下攪拌45分鐘后，加入飽和Na2S2O3溶液(3毫升)，反應(yīng)混合物攪拌10分鐘。其次，溶液用醚稀釋，有機(jī)相經(jīng)分離后，用飽和硫代硫酸鈉溶液(5x)及飽和碳酸氫鈉溶液(2x)洗滌。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。用硅膠柱閃式色譜純化(先4/1，然后2/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，能夠回收磷酸二芐酯(126毫克；84％)，呈無定形固體狀(Rf＝0.53，在3/1二氯甲烷/丙酮中；磷鉬酸化合物及紫外光顯色劑)。
2.7.5. 3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-1，10-二醇1-(磷酸二芐酯)
往1％鹽酸在甲醇(25毫升)中的溶液，在0℃添加如上制備的化合物(700毫克，0.54毫摩爾)在二氯甲烷(2.5毫升)中的溶液。在0℃攪拌45分鐘后，反應(yīng)介質(zhì)用5％碳酸氫鈉溶液中和，用二氯甲烷稀釋，然后分離有機(jī)相。所得水相用二氯甲烷(3x)萃取，合并有機(jī)相。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)，獲得粗制醇(640毫克；98％)(Rf＝0.50，在3/1二氯甲烷/丙酮中；磷鉬酸化合物及紫外光顯色劑)。
2.7.6. 3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-(磷酸二芐酯)10-(6-芐氧基羰基氨基己酸酯)
往如上制備的化合物(640毫克，0.53毫摩爾)和6-(芐氧基羰基氨基)己酸(423毫克，1.60毫摩爾)在無水二氯甲烷(25毫升)中的溶液，在0℃及氫氣流下相繼地加入市售1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(306毫克，1.60毫摩爾)及4-二甲基氨基吡啶(20毫克，160毫摩爾)。然后反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，隨后在室溫下攪拌一夜。然后反應(yīng)介質(zhì)用水，再用1N鹽酸溶液洗滌，接著分離各相。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。采用硅膠閃式色譜純化(先4/1，然后2/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，可回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(537毫克；71％)。
13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm173.18；171.16；170.38；169.60；156.30；138.23；136.50；135.38；135.28；128.42；128.26；128.17；127.79；127.74；127.44；76.48；71.15；70.84；69.47；69.39；69.31；66.25；65.62；64.43；64.37；49.78；47.76；41.41；41.34；40.57；38.97；34.22；34.16；33.96；33.57；32.95；31.70；29.43；29.15；28.95；28.32；25.87；25.46；25.02；24.80；24.18；22.49；13.94.
2.7.7. 3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-胺基己酸酯)(＝OM-197-MP-AC-R，R)(圖13)
如上制備的化合物(500毫克，0.35毫摩爾)在含乙酸(10毫升)的5/2二氯甲烷/乙醇混合物(70毫升)中的溶液，在10％碳載鈀存在下，在室溫及氫大氣壓力下氫化12至24小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物使用葉輪泵抽干，獲得3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(368毫克，定量產(chǎn)率)。ES/MSm/z1047.9[M+H]+；1069.8(圖14)。
實(shí)施例2.8.
(3S，9R)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(＝OM-197-MP-AC-S，R)
應(yīng)用于N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-L-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-戊基)酰胺β-芐酯(1.2.4.節(jié))，同樣的反應(yīng)順序可得到實(shí)施例2.8的產(chǎn)物。
實(shí)施例2.9.
3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-羥己酸酯)(＝OM-197-FV8)(圖15)
2.9.1. (2R)-5-(氨基)-2-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊-1-醇芐氧基甲基醚
往(2R)-5-(芐氧基羰基氨基)-2-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊-1-醇(1.1.2.節(jié))(2.05克；3.60毫摩爾)在無水二氯甲烷(40毫升)中的溶液，在室溫及在氬氣流下相繼地加入BOMCl(芐基氯甲基醚)(工業(yè)級60％，1.25毫升；5.41毫摩爾；1.5當(dāng)量)及二異丙基乙基胺(942微升；5.41毫摩爾；1.5當(dāng)量)。然后，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌一夜，隨后蒸發(fā)至干。通過硅膠柱閃式色譜純化(2/1石油醚/乙酸乙酯洗脫液)，回收O-芐氧甲基衍生物(2.28克；92％)，呈白色結(jié)晶固體狀(Rf＝0.70，在1/3石油醚/乙酸乙酯混合物中，磷鉬酸及紫外光顯色劑)。PF＝97-100℃。此種產(chǎn)物(200克；2.90毫摩爾)在含三乙基胺(4毫升)的HPLC級乙醇(220毫升)中的溶液，在20％氫氧化鈀/碳(200毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化3小時時間。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物用葉輪泵抽干，能夠獲得游離胺(1.58克；98％)，呈無定形固體狀。
[α]D-1°(C＝1.20；CHCl3)；1H-RMN(250 MHz，CDCl3)，δ，ppm7.45-7.21(m，10H，Ar)，6.52(d，1H，NH)，4.80-4.45(m，6H，2×CH2-ph，O-CH2-O)，4.10(m，1H，H-3’)，3.83(m，1H，H-2)，3.62(dd，1H，H-1)，3.47(dd，1H，H-1)，2.65(t，2H，2×H-5)，2.40(m，2H，2×H-2’)，1.80-1.40(m，8H，2×H-4，2×H-3，2×H-4’，NH2)，1.40-1.20(m，18H，9×CH2)，0.88(t，3H，CH3)；13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm170.78；138.24；137.63；128.38；128.32；127.66；127.62；94.82；76.70；71.26；69.63；69.44；48.48；41.82；41.47；33.83；31.84；29.88；29.58；29.56；29.51；29.27；29.04；25.11；22.62；14.06.
2.9.2. N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-L-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(芐氧基甲氧基)-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]-戊基}酰胺β-芐酯
在IIDQ存在下，按照第1.2.2.節(jié)中描述的相同條件，如前述制備的胺與N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-L-天冬氨酸-β-芐酯(由L-天冬氨酸-β-芐酯制備，參見第1.2.1節(jié))偶合。用硅膠純化其產(chǎn)物(先2∶1然后1∶1石油醚/乙酸乙酯)能夠獲得相應(yīng)的酰胺，65％產(chǎn)率。ES/MSm/z 1169.7([M+H]+)。
2.9.3. (3S，9R)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二芐基磷酸酯
如上所得偶合反應(yīng)產(chǎn)物(1.05克；0.90毫摩爾)在含三乙基胺(1.5毫升)的1/1乙醇/乙酸乙酯混合物(65毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(50毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化1小時。過濾去除催化劑，濾液蒸發(fā)至干，然后用葉輪泵抽干。殘余物溶解在1∶1異丙醇/二氯甲烷混合物(50毫升)中，在室溫與Amberlite IR-120(H+)樹脂(3毫升)共同攪拌10分鐘。樹脂過濾除去，濾液蒸發(fā)至干，獲得游離酸(956毫克；99％)，呈白色結(jié)晶固體狀。
往如上所得的酸(855毫克；0.79毫摩爾)在無水THF(5毫升)中的溶液在0℃及氬氣流下，加入N-甲基嗎啉(87微升；0.79毫摩爾；1當(dāng)量)，然后加入氯甲酸異丁酯(103微升；0.79毫摩爾；1當(dāng)量)。迅速觀察到形成的N-甲基嗎啉鹽酸鹽沉淀。在室溫下攪拌30分鐘后，反應(yīng)混合物冷卻至0℃，然后快速加入硼氫化鈉(60毫克；1.58毫摩爾；2當(dāng)量)在水(2毫升)中的溶液。一旦停止放出氣體(5分鐘)，溶液用水(2毫升)及THF(2毫升)稀釋，然后在室溫下攪拌5分鐘。溶液經(jīng)濃縮后，用二氯甲烷及水稀釋。用1M鹽酸溶液中和，接著分離各相。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。通過硅膠柱閃式色譜純化(4/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，可回收還原產(chǎn)物(387毫克；46％)，呈白色結(jié)晶固體狀。
往此醇(313毫克；0.29毫摩爾)及1H-四唑(62毫克；0.88毫摩爾；3當(dāng)量)在無水THF(12毫升)中的溶液，在室溫及在氬氣流下加入85％二芐基二乙基亞氨基磷酸酯(267微升；0.67毫摩爾；2.3當(dāng)量)。迅速觀察到在反應(yīng)介質(zhì)中生成白色晶體。攪拌30分鐘后，反應(yīng)混合物冷卻至-20℃，然后加入mCPBA(57-85％；187毫克；1.08毫摩爾；3.7當(dāng)量)在二氯甲烷(8毫升)中的溶液。觀察到晶體消失。在室溫下攪拌45分鐘后，加入飽和Na2S2O3溶液(5毫升)，反應(yīng)混合物攪拌10分鐘。溶液再用醚稀釋，然后有機(jī)相經(jīng)分離，用飽和Na2S2O3溶液(5×)、飽和碳酸氫鈉溶液(2x)及1M鹽酸溶液(1x)洗滌。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾與蒸發(fā)。通過硅膠柱閃式色譜純化(先8/1，然后5/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，可以回收磷酸三酯(361毫克；93％)，呈無定形固體狀。
這種產(chǎn)物在THF-HCl含水介質(zhì)中進(jìn)行水解反應(yīng)，分裂去除芐氧基甲基縮醛，這樣得到(3S，9R)-3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二芐基磷酸酯。
2.9.4.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6，7-二羥庚酸酯)
在二氯甲烷中，在0℃與在DMAP存在下，在EDC1存在下使用庚-6-烯酸使上述得到的產(chǎn)物在10位進(jìn)行O-?；磻?yīng)(參見2.3.1.節(jié))。然后庚烯酸酯在(催化量)四氧化鋨及N-甲基嗎啉氧化物存在下進(jìn)行羥基化反應(yīng)(參見2.2.2.節(jié))，這樣獲得對應(yīng)的二醇(6，7-二羥基庚酸酯)。此種產(chǎn)物在乙醇中，在氫的大氣壓力下，在鈀/碳催化劑存在下通過氫解去保護(hù)(參見2.2.3.節(jié))。
2.9.5.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氧代己酸酯)
如上去保護(hù)的二醇在異丙醇-水混合物中進(jìn)行高碘酸氧化反應(yīng)(操作程序，參見2.2.1.節(jié))。
2.9.6.(3S，9R)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-羥基己酸酯)(＝OM-197-FV8)
往如上所得的6-氧代己酸衍生物(4.5毫克，0.0043毫摩爾)在90％異丙醇(20毫升)中的溶液，加入硼氫化鈉(0.2毫升)在甲醇(1毫克/毫升)中的溶液。混合物在25℃攪拌3分鐘，然后加入過量乙酸(0.2毫升)。使用C18柱制備HPLC純化，可回收90％產(chǎn)物OM-197-FV8(2毫克，44％)在異丙醇中的溶液。ES/MSm/z 1048.5[M+H]+；950.5[M+H-(HO)2OPOH]+(圖16)。
實(shí)施例2.10.
2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-(二羥磷酰氧)-丁酸-{2-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-5-(6-氧代己基)氨基}戊酯(＝OM-144-FP9)(圖17)
2.10.1. 三氟甲烷磺酸庚-6-烯酯
三氟甲烷磺酸酐Tf2O((CF3·SO2)2O，11毫升；6.67毫摩爾)在-15℃滴加到庚-6-烯-1-醇(515毫克；4.51毫摩爾)和三乙胺(627微升；4.51毫摩爾)在二氯甲烷(10毫升)中的溶液，混合物在-15℃攪拌30-45分鐘至無任何醇剩余為止?；氐绞覝睾?，介質(zhì)用二氯甲烷稀釋，相繼地用水、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌。如此得到的有機(jī)相用硫酸鎂干燥，真空濃縮獲得殘余物，殘余物溶解在(1/2)乙酸乙酯/石油醚混合物中，用硅膠過濾(去除反應(yīng)期間形成的三乙胺鹽)。蒸發(fā)濾液后，得到三氟甲烷磺酸鹽，產(chǎn)率87％(956毫克)，未經(jīng)進(jìn)一步純化可用于下面步驟。Rf＝0.8，在1/2乙酸乙酯/石油醚中。
1H-RMN(CDCl3，250 MHz)；δ，ppm5.7；5.0；4.45；2.0；1.8；1.4.13C-RMN(CDCl3，62.89 MHz)；δ，ppm138.21；114.95；77.68；33.40；29.13；28.10；24.53.
2.10.2.(2R)-2-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-5-(庚-6-烯基)氨基-戊-1-醇
將上述新制備的三氟甲烷磺酸鹽(956毫克；3.88毫摩爾)在二氯甲烷(10毫升)中的溶液，滴加到(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊-1-醇(1.1.2.節(jié))(1.69克；3.88毫摩爾)在二氯甲烷(10毫升)中的溶液，混合物在室溫在氬氣流下攪拌4小時。用二氯甲烷稀釋后，反應(yīng)介質(zhì)相繼地用飽和碳酸氫鈉水溶液及水洗滌。如此所得到的有機(jī)相用硫酸鎂干燥，真空濃縮。用硅膠柱閃式色譜純化(15/1二氯甲烷/甲醇洗脫液)，能夠回收期望的仲胺(862毫克；43％)。Rf＝0.3(8/1二氯甲烷/甲醇)。
ES/MSm/z532.0[M+H]+.RMN1H(CDCl3，250 MHz)；δ，ppm7.2-7.4；7.1；5.8；5.0；4.6；3.95；3.5；2.9；2.5；2.1；1.9-1.5；1.5-1.2；0.9.RMN13C(CDCl3，62.89 MHz)；δ，ppm172.17；138.28；138.21；128.39；127.96；127.71；114.82；76.80；71.40；63.81；50.87；48.30；47.75；41.57；34.10；33.39；31.89；29.66；29.62；29.33；28.19；28.03；25.21；26.11；25.78；22.82；22.66；14.10.RMN1H(CDCl3，250MHz)；δ，ppm7.2-7.4；6.75；5.8；5.0；4.5；3.9；3.5；2.5；2.0；2.1；1.7-1.2；0.9.RMN13C(CDCl3，62.89 MHz)；δ，ppm171.77；138.68；138.14；128.23；127.72；127.56；114.22；76.64；71.37；64.58；51.45；49.79；49.37；41.53；33.90；33.53；31.77；29.65；29.20；28.64；28.57；25.00；26.68；25.93；22.53；13.98(分別為銨鹽及游離堿光譜)。
2.10.3. 2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-(二苯氧基磷酰氧基)丁酸-{2-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]-5-(庚-6-烯基)-氨基}-戊酯
往上述得到的仲胺(163毫克；0.307毫摩爾；1當(dāng)量)和4-(二苯氧基磷酰氧基)-2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠丁酸(1.1.1.節(jié))(278毫克；0.368毫摩爾；1.2當(dāng)量)在二氯甲烷(25毫升)中的熔液，加入N，N-二異丙基乙基胺(DIEA)(54微升；1當(dāng)量)。介質(zhì)冷卻至0℃，然后加入EDCl(71毫克；1.2當(dāng)量)和1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)(41毫克；1當(dāng)量)。反應(yīng)混合物在0℃攪拌2小時，隨后在室溫下攪拌90小時。然后，該溶液用水洗滌，有機(jī)相用硫酸鎂干燥，隨后在40℃真空下蒸發(fā)。采用硅膠柱閃式色譜純化(15/1二氯甲烷/甲醇洗脫液)，能夠回收O-?；a(chǎn)物(126毫克；32％)。
2.10.4. 2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-(二苯氧基磷酰氧基)丁酸-{2-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]-5-(6，7-二羥基庚基)-氨基}-戊酯
新制備的2.5％四氧化鋨在吡啶(1.1毫升；1.9當(dāng)量)中的溶液，在25℃滴加到如上制備的O-?；磻?yīng)產(chǎn)物(70毫克；0.055毫摩爾)在無水吡啶(5毫升)中的溶液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?4至48小時，然后加入Na2S2O5處理，最終用二氯甲烷稀釋，相繼地用水、1N鹽酸水溶液和再次用水洗滌。所得有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾，蒸發(fā)，得到的殘余物用硅膠柱閃式色譜純化(15/1至10/1二氯甲烷/甲醇洗脫液)，這樣能夠回收期望的二醇(27毫克；38％)。HPLC(210nm)TR＝37.25分鐘。ES/MSm/z1307.0[M+H]+。
2.10.5. 2-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-(二羥基磷酰氧基)丁酸-{2-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-5-(6，7-二羥基庚基)-氨基}-戊酯(＝OM-144-FP8)
a.去芐基化反應(yīng)
往前面得到的二醇(50毫克；0.038毫摩爾)在HPLC級甲醇/乙醇混合物(5/0.2毫升)中的溶液，加入催化劑(10％Pd/C)(10毫克)。反應(yīng)混合物在氫氣(大氣壓)中在室溫下攪拌4小時。用微孔過濾器過濾去除催化劑，濾液蒸發(fā)得到去芐基化產(chǎn)物(46毫克；99％)，無需進(jìn)一步純化。HPLC(210nm)TR＝35.13及35.51分鐘(觀測到兩種非對映異構(gòu)體)。ES/MSm/z1217.0[M+H]+。
b.去苯基化反應(yīng)
催化劑(PtO2)(25毫克；3.8當(dāng)量)在HPLC級乙醇(0.5毫升)中的懸浮液，在氫氣下進(jìn)行10分鐘預(yù)活化。前面得到的去芐基化產(chǎn)物(35毫克，0.029毫摩爾)在HPLC級乙醇(2毫升)中的溶液(在氬氣下預(yù)脫氣)添加到催化劑懸浮液。然后，反應(yīng)混合物在氫氣下在室溫攪拌2小時。催化劑用微孔過濾器過濾，濾液蒸發(fā)得到期望的磷酸酯(26毫克；87％)，無需進(jìn)一步純化。HPLC(210nm)TR＝29.3及30.9分鐘(觀察到兩種非對映異構(gòu)體)。ES/MSm/z1064.8[M+H]+，1086.8[M+Na]+，1108.8[M-H+2Na]+(圖18)。
2.10.6. 2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-(二羥基磷酰氧基)-丁酸-{2-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-5-(6-氧代己基)-氨基}-戊酯(＝OM-144-FP9)
1.87毫升0.1M高碘酸鈉(40.17毫克，20當(dāng)量)添加到在異丙醇水混合物(1∶1)中的10毫克(9.39毫摩爾，1當(dāng)量)前面制備的去保護(hù)產(chǎn)物。溶液在室溫下攪拌2小時。通過加入1至2滴乙二醇中止反應(yīng)。TR＝30.0及31.5分鐘。(觀察到兩種非對映異構(gòu)體)。ES/MSm/z1032.8[M+H]+，1054.8[M+Na]+。
實(shí)施例2.11.
(2R，8R)-2-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-3-氧代-4-氮雜-8-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-壬-1，9二醇1-O-羧甲基醚9-O-(6-氧代己酸酯)(＝OM-112-FV7)(圖19)
D-絲氨酸被保護(hù)成N-(對-甲氧基芐氧基羰基)衍生物形式[參見Chen及Wang，Synthesis(1989)36-37]，然后，羥基官能團(tuán)在氫化鈉(2當(dāng)量)存在下，使用溴乙酸芐酯進(jìn)行烷基化。在二氯甲烷中用三氟乙酸處理釋放出胺基官能團(tuán)，然后在三乙基胺存在下，使用(R)-3-十二酰基氧十四烷酰氯進(jìn)行?；?。如此所得的絲氨酸衍生物在IIDQ存在下與(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊-1-醇胺(參見4.1.1.節(jié))偶合，獲得(2R，8R)-2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-3-氧代-4-氮雜-8-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-壬-1，9-二醇1-O-芐氧基羰基甲基醚。然后，該產(chǎn)物在EDCl存在下使用庚-6-烯酸進(jìn)行?；?。附屬酯的雙鍵使用四氧化鋨(催化量，在N-甲基嗎啉N-氧化物存在下)進(jìn)行羥基化，然后在乙醇溶液中，在鈀/碳存在下通過氫解使二醇去保護(hù)。在異丙醇-水混合物中，通過高碘酸鈉處理可得到OM-112-FV-7產(chǎn)物。C65H103N3O12。MM1010.45。
實(shí)施例2.12.
(2R，8R)-1-(羧甲基)-硫-2-[(R)-3-十四酰氧十四?；被鵠-3-氧代-4-氮雜-8-[(R)-3-羥基-十四?；被鵠-壬-9-醇9-O-(7-氨基庚酸酯)(＝OM-212-AHl)(圖20)
在THF-水介質(zhì)中，在碳酸鈉存在下，使用溴乙酸對-甲氧基芐酯使D-半胱胺酸進(jìn)行S-烷基化。如此得到的S-芐氧基羰基甲基半胱胺酸使用(R)-3-十四酰氧十四烷酰氯進(jìn)行N-酰化，然后在IIDQ存在下，S-烷基化-N-?；腄-半胱胺酸衍生物與(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-戊-1-醇胺{由氫解(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊-1-醇獲得(參見4.1.1.)}偶合。如此所得的產(chǎn)物選擇性地在第一位置，使用由丁醇與7-(對-甲氧基芐氧基羰基氨基)庚酸得到的酯進(jìn)行O-?；Ｈ缓笫褂萌宜崴芤禾幚碓擋?，可除去兩個對-甲氧基芐基基團(tuán)。C59H112N4O10S。MM1069.64。
實(shí)施例2.13.
(2R，8R)-2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-3-氧代-4-氮雜-8-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-壬烷-1，9-二醇1-O-(2，2-二羧乙基)醚9-O-(6-氧代己酸酯)(＝OM-312-FV7)(圖21)。
在氫化納存在下，使用亞甲基丙二酸二芐酯使D-絲胺酸的N-(對-甲氧基芐氧基羰基)衍生物進(jìn)行O-烷基化。在二氯甲烷中，通過三氟乙酸處理，釋放胺官能，然后在三乙基胺存在下，使用(R)-3-十二?；跏耐轷Ｂ冗M(jìn)行酰化。如此所得的絲氨酸衍生物在IIDQ存在下與(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊-1-醇胺(參見4.1.1.節(jié))偶合，得到(2R，8R)-2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-3-氧代-4-氮雜-8-[(R)-3-芐氧基十四?；坊鵠-壬烷-1，9-二醇1-O-[2，2-雙-(芐氧基羰基)乙基]醚。這種產(chǎn)物在EDCl存在下使用庚-6-烯酸進(jìn)行O-酰化，然后庚烯酰酯使用四氧化鋨進(jìn)行羥基化。在乙醇中，在鈀/碳存在下通過氫解除去芐基。在異丙醇-水混合物中，使用高碘酸鈉處理去芐基化產(chǎn)物獲得OM-312-FV-7產(chǎn)物。C58H105N3O14。MM1068.49。
實(shí)施例2.14.
3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-1，10-二醇-1-二氫磷酸酯10-(6-溴乙酰氨基己酸酯)(＝OM-412-BA7)(圖22)
3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-1，10-二醇-1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(參見4.2.3.3.節(jié))，在水-DMF介質(zhì)，在三乙胺存在下，使用溴乙酸丁二酰亞胺基氧基酯進(jìn)行溴乙?；磻?yīng)。最后產(chǎn)物采用HPLC純化。C57H108BrN4O13P。MM1168.4。
實(shí)施例2.15.
(3R，9R)-3-[(R)-羥基十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被?-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-O-(6-氧代己酸酯)(OM-512-FV7)(圖23)
2-[(R)-3-芐氧基十四?；被?-4-二苯氧基-磷酰氧基-丁酸[制備方法如下使用(R)-3-芐氧基十四酰氯使O-(二苯氧基磷?；?-DL-高絲氨酸芐酯三氟乙酸鹽進(jìn)行N-?；磻?yīng)，然后在乙醇中，在三乙胺及鈀/碳催化劑存在下，通過氫解分裂芐酯]，在IIDQ存在下偶合(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠戊-1-醇[制備方法如下使用(R)-3-十二酰基氧十四酰氯使(2R)-5-(芐氧基羰基氨基)-2-氨基-戊-1-醇的三氟乙酸鹽進(jìn)行N-?；磻?yīng)，然后在乙醇中，在三乙基胺及鈀/碳催化劑存在下，通過氫解將C5位的氨基去保護(hù)]。在EDCl存在下，使用6-庚烯酸，將如此生成的酰胺的游離態(tài)OH官能進(jìn)行O-酰化，得到相應(yīng)的酯。輔助酯的雙鍵使用四氧化鋨進(jìn)行羥基化反應(yīng)；然后使用鈀/碳催化劑，通過氫解去除芐基，通過在鉑黑氫解釋放磷酸酯。二醇官能團(tuán)進(jìn)行高碘酸氧化反應(yīng)，生成6-氧代己?；苌颫M-512-FV7。C55H104N3O13P。MM1046.42。
實(shí)施例2.16.
N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺(＝OM-197-MC-AC)(圖24)
2.16.1. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-芐氧基羰基氨基)己酰氧基]-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-芐酯
往N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-芐酯(400毫克，0.38毫摩爾)及6(芐氧基羰基氨基)己酸(220毫克，0.83毫摩爾)在無水二氯甲烷(15毫升)中的溶液，在0℃，在氬氣流下相繼地加入市售1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(162毫克，0.85毫摩爾)及4-二甲基氨基吡啶(12毫克，98微摩爾)。然后，反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘，隨后在室溫下攪拌一夜。反應(yīng)介質(zhì)用水及1N鹽酸溶液洗滌，然后相分離。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。通過硅膠柱閃式色譜純化(先9/1，然后4/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，能夠回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(395毫克；81％)，呈白色固體狀。
13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm 173.46；173.29；171.83；171.14；170.12；156.38；138.19；136.60；133.30；128.51；128.42；128.31；127.99；127.70；127.58；119.97；76.49；71.23；71.06；66.73；66.47；49.21；47.83；41.42；40.73；39.14；35.46；34.38；33.86；33.70；31.84；29.57；29.46；29.28；29.10；26.01；25.54；25.17；25.08；24.94；24.31；22.61；14.05.
2.16.2. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺
上述制備的化合物(340毫克，0.26毫摩爾)在含乙酸(2毫升)的5/1二氯甲烷/乙醇混合物(24毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(40毫克)存在下，在室溫與在氫的大氣壓力下氫化12至24小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物用葉輪泵抽干，獲得N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基)酰胺(238毫克，定量產(chǎn)率)。C55H104N4O10m/z/981.9([M+H]+)；(圖25)。
實(shí)施例2.17.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)5-(6-丁二酰氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠}戊基]酰胺(＝OM-197-MC-AC-Succ)(圖24)
往實(shí)施例2.16.的產(chǎn)物(2.16.2.節(jié))(50毫克；0.051毫摩爾)在吡啶(3毫升)中的溶液，相繼地加入丁二酐(11毫克，0.1毫摩爾)及4-N，N-二甲基胺基吡啶(7毫克；0.57毫摩爾)。在50℃在氬氣下攪拌6小時后，加入甲醇(2毫升)，反應(yīng)介質(zhì)再在室溫下攪拌15分鐘。蒸去溶劑，產(chǎn)物采用硅膠柱閃式色譜純化(先7∶1，然后5∶1二氯甲烷/甲醇洗脫液)；如此獲得的產(chǎn)物呈白色固體狀(42毫克；74％)。C59H108N4O13ES/MSm/z1082([M+H]+)，Rf＝0.1(4∶1二氯甲烷/甲醇)。
實(shí)施例2.18.
N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(甘氨酸氧基)-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺(＝OM-197-MC-Gly)(圖24)
2.18.1. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-芐氧羰基氨基乙酰氧基]-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-芐酯
往N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺β-芐酯(300毫克，0.29毫摩爾)及市售N-芐氧基羰基甘氨酸(101毫克，0.49毫摩爾)在干燥二氯甲烷(10毫升)中的溶液，在0℃及氬氣流下相繼地加入市售1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(93毫克，0.48毫摩爾)及4-二甲基氨基吡啶(6毫克，49微摩爾)。然后反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30分鐘，隨后在室溫下攪拌一夜。反應(yīng)介質(zhì)再用水及1N鹽酸溶液洗滌，接著相分離。有機(jī)相用硫酸鎂干燥。過濾及蒸發(fā)。通過硅膠柱閃式色譜純化(先8/1，然后6/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，能夠回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(313毫克；88％)，呈白色固體狀。
13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm 173.71；173.49；171.80；171.68；171.21；170.21；170.06；169.94；169.84；156.41；138.18；136.16；135.26；128.46；128.40；128.33；128.26；128.04；127.93；127.65；127.55；78.49；71.14；71.07；70.93；66.90；66.67；66.38；66.26；49.21；49.03；47.72；47.66；42.58；41.83；41.68；41.32；39.02；35.58；35.39；34.34；33.84；31.80；29.52；29.24；29.06；28.31；28.13；25.34；25.12；25.03；24.89；22.57；14.01.
2.18.2. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(甘胺酸氧)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺(＝OM-197-MC-Gly)(圖24)
上述制備的化合物(268毫克，0.22毫摩爾)在含乙酸(2毫升)的5/1二氯甲烷/乙醇混合物(12毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(30毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化12至24小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物用葉輪泵抽干，獲得N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(甘氨酸氧基)-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺(200毫克，定量產(chǎn)率)。C51H96N4O10ES/MS；m/z925.7([M+H]+)，947.8[M+Na]+；(圖26)。
實(shí)施例2.19.
N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(丁二酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺(＝OM-197-MC-Succ)(圖27)
2.19.1. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(丁二酰氧基)-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺β-芐酯
往丁二酐(25毫克，0.25毫摩爾)在無水二氯甲烷(2毫升)中的溶液，在三乙基胺(40微升，0.29毫摩爾)存在下，在0℃加入N-[(R)-3-十二?；跏孽；鶀-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺β-芐酯(1.2.2.節(jié))(150毫克，0.14毫摩爾)在二氯甲烷(5毫升)中的溶液。反應(yīng)混合物在0℃攪拌10分鐘，隨后在室溫下攪拌。然后反應(yīng)介質(zhì)用二氯甲烷稀釋，用1N鹽酸熔液洗滌，接著分離相。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。用硅膠柱閃式色譜純化(9/1二氯甲烷/丙酮洗脫液，含2％乙酸)，能夠回收酸產(chǎn)物(148毫克；90％)，呈白色固體狀。
13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm 175.03；173.55；173.35；171.92；171.72；171.36；170.97；170.60；170.46；170.41；138.05；135.24；128.85；128.76；128.41；128.27；128.20；128.03；127.59；76.48；71.31；70.77；66.67；65.08；49.20；48.11；41.48；41.31；39.02；35.80；34..26；34.13；33.84；31.77；29.50；29.21；29.03；25.05；24.99；24.83；22.54；13.98.
2.19.2. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-丁二酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺(＝OM-197-MC-Succ)(圖27)
上述制備的化合物(124毫克，0.11毫摩爾)的溶液溶解于含乙酸(1毫升)的熱(HPLC級)乙醇(12毫升)中，然后在10％碳載鈀(15毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化10小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物使用葉輪泵抽干，得到二酸產(chǎn)物(102毫克，97％)。C53H97N3O12ES/MS；m/z 968.6([M+H]+)，990.7([M+Na]+)；(圖28)。
實(shí)施例2.20.
N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-(3-氨基丙基)酰胺(＝OM-197-AP)(圖29)
2.20.1. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺
N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸-β-芐酯，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺(1.2.2.節(jié))(2.53克；2.4毫摩爾)在含三乙基胺(4毫升)的1/1乙醇/乙酸乙酯混合物(150毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(120毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化2小時。過濾去除催化劑，濾液蒸發(fā)至干，然后用葉輪泵抽干。然后殘余物溶解在1/1異丙醇/二氯甲烷混合物(100毫升)中，在室溫與Amberlite IR-120(H+)樹脂(5毫升)共同攪拌10分鐘。過濾去除樹脂，濾液蒸發(fā)至干，獲得游離酸(2.25克；97％)，呈白色結(jié)晶固體狀。(Rf＝0.45，在含1％乙酸的9/1二氯甲烷/甲醇中，磷鉬酸化合物及紫外光顯色劑)。PF＝115-117℃。
2.20.2. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-(3-芐氧基羰基氨基丙基)酰胺
將IIDQ(2-異丁氧基-1-異丁氧基羰基-1，2-二氫喹啉)(98克；0.32毫摩爾)在無水二氯甲烷(3毫升)中的溶液，在0℃及在氬氣流下添加到前面制備的化合物(250毫克，0.26毫摩爾)在無水二氯甲烷(15毫升)中的溶液。反應(yīng)混合物在0℃攪拌15分鐘，加入市售3-芐氧基羰基氨基-丙基胺鹽酸鹽(70毫克，0.29毫摩爾)在含三乙基胺(40微升，0.29毫摩爾)的無水二氯甲烷(7毫升)中的溶液。攪拌18小時后，溶液蒸發(fā)至干。采用硅膠柱閃式色譜純化(20/1二氯甲烷/甲醇洗脫液)，可回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(217毫克；78％)，呈白色固體狀。
2.20.3. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-(3-氨基丙基)酰胺(＝OM-197-AP)
上述制備的化合物(50毫克，44毫摩爾)在含乙酸(1毫升)的1/1-氯甲烷/異丙醇混合物(8毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(10毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化6至8小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，殘余物用葉輪泵抽干，獲得N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-(3-氨基丙基)酰胺(32毫克，80％)。C52H101N5O8ES/MS；m/z924.8([M+H]+)；1848.8([2M+H]+)；(圖30)。
實(shí)施例2.21。
N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(＝OM-197-Lys)(圖31)
2.21.1. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-芐氧基羰基-5-芐氧基羰基氨基戊基]酰胺
在室溫及在氬氣流下，IIDQ(2-異丁氧-1-異丁氧羰基-1，2-二氫喹啉)(114毫克；0.38毫摩爾)在無水二氯甲烷(5毫升)中的溶液，加到N-[(R)-3-十二?；跏孽；?-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺(2.20.1節(jié))(330毫克，0.31毫摩爾)在無水二氯甲烷(20毫升)中的溶液。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌15分鐘，然后加入市售ε-N-芐氧基羰基-L-賴氨酸芐酯鹽酸鹽(140毫克，0.31毫摩爾)在含三乙基胺(48微升，0.34毫摩爾)的無水二氯甲烷(5毫升)中的溶液。攪拌18小時后，溶液蒸發(fā)至干。通過硅膠柱閃式色譜純化(先30/1，然后20/1二氯甲烷/甲醇洗脫液)，可以回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(317毫克；77％)，呈白色固體狀。
13C-RMN(62,89 MHz，CDCl3)，δ，ppm173.68；172.35；171.92；170.74；170.62；170.54；156.75；156.52；138.31；136.54；135.12；128.54；128.40；128.28；128.21；127.96；127.577；127.59；76.67；71.40；71.18；67.20；67.09；66.48；64.67；52.30；51.19；41.64；40.34；39.24；37.58；34.40；34.10；31.83；29.58；29.27；29.09；25.16；25.11；24.93；22.60；14.04.
2.21.2. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(OM-197-Lys)
上述制備的化合物(93毫克；71微摩爾)在含冰醋酸(0.5毫升)的1/1二氯甲烷/乙醇混合物(20毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(17毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化12至24小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，殘余物用葉輪泵抽干，獲得N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基]酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(71毫克，定量產(chǎn)率)。C55H105N5O10ES/MSm/z996.9([M+H]+)；1018.9([M+Na]+)；(圖32)。
實(shí)施例2.22.
N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(＝OM-197-Lys-AC)(圖31)
2.22.1. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-芐氧基羰基氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}-酰胺β-N-[(1S)-1-芐氧基羰基-5-芐氧基羰基氨基戊基]酰胺
往N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-芐氧基羰基-5-芐氧基羰基氨基戊基]酰胺(2.21.1.節(jié))(317毫克，0.24毫摩爾)及6-(芐氧基羰基氨基)己酸(128毫克，0.48毫摩爾)在無水二氯甲烷(15毫升)中的溶液，在0℃及在氬氣流下相繼地加入市售的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(93毫克，0.48毫摩爾)和4-二甲基氨基吡啶(12毫克，0.98毫摩爾)。反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，隨后在室溫下攪拌一夜。然后反應(yīng)介質(zhì)先用水，然后用1N鹽酸溶液洗滌，接著分離相。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。用硅膠柱閃式色譜處理(2/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，可回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(266毫克；71％)呈白色固體狀。
2.22.2 N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}-酰胺-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(＝OM-197-Lys-AC)
如上制備的化合物(236毫克；151微摩爾)在含乙酸(1毫升)的1/1二氯甲烷/異丙醇混合物(20毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(100毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化12至24小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物用葉輪泵抽干，獲得N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺(140毫克，83％)。C61H116N6O11ES/MSm/z555.5([M+H]+2)；1110.0([M+H]+)；(圖33)。
實(shí)施例2.23.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}-酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺(＝OM-197-Asp)(圖34)
2.23.1. N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊基}-酰胺β-N-[(1S)-1，2-二(芐氧基羰基)乙基]酰胺
IIDQ(2-異丁氧-1-異丁氧羰基-12-二氫喹啉)(96克；0.32毫摩爾)在無水二氯甲烷(5毫升)中的溶液，在室溫及在氬氣流下添加到N-[(R)-3-十四?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊基}-酰胺(2.20.1節(jié))(252毫克，0.26毫摩爾)在無水二氯甲烷(20毫升)中的溶液。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌15分鐘，然后加入市售的L-天冬氨酸二芐酯的對甲苯磺酸鹽(141毫克，0.29毫摩爾)在含三乙基胺(40微升，0.29毫摩爾)的無水二氯甲烷(5毫升)中的溶液。攪拌18小時后，溶液蒸發(fā)至干。用硅膠柱閃式色譜純化(20/1二氯甲烷/甲醇洗脫液)，可回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(260毫克；78％)。
13C-RMN(62,89MHz，CDCl3)，δ，ppm173.68；171.92；171.17；170.60；170.46；170.37；170.18；170.06；138.31；138.19；135.20；135.12；134.87；128.48；128.26；128.18；127.75；127.63；127.56；76.66；71.40；71.19；70.98；68.79；67.59；66.85；65.14；64.73；51.25；50.17；48.78；48.67；41.70；39.37；39.21；37.50；35.94；34.48；34.38；34.10；31.81；29.54；29.25；29.08；27.93；25.56；25.14；25.09；24.91；22.58；14.02.
2.23.2. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}-酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺(＝OM-197-Asp)
上述制備的化合物(260毫克；207微摩爾)在1/1二氯甲烷/異丙醇混合物(20毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(50毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化4小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，殘余物用葉輪泵抽干，獲得二酸(108毫克，88％)。C53H98N4O12ES/MSm/z983.7([M+H]+)；1005.8([M+Na]+)；(圖35)。
實(shí)施例2.24.
N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺(＝OM-197-Asp-AC)(圖34)
2.24.1. N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-芐氧基羰基氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二(芐氧基羰基)乙基]酰胺
往N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二(芐氧基羰基)乙基]酰胺(2.23.1.節(jié))(158毫克，0.13毫摩爾)以及6-(芐氧基羰基氨基)己酸(84毫克，0.32毫摩爾)在干燥二氯甲烷(6毫升)中的溶液，在0℃及氬氣流下相繼加入市售1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(61毫克，0.32毫摩爾)和4-二甲基氨基吡啶(4毫克；33微摩爾)。然后，反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，隨后在室溫下攪拌一夜。然后，反應(yīng)介質(zhì)用水及1N鹽酸溶液洗滌，接著分離相。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。用硅膠柱閃式色譜純化(6/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，能夠回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(83毫克，44％)。
13C-RMN(62,89 MHz，CDCl3)，δ，ppm173.69，173.53，173.26，171.21，171.11，170.61，170.38，170.31，170.22，156.36，138.26，136.58，135.20，134.87，128.48，128.38，128.31，128.27，128.19，127.95，127.55，76.50，71.24，71.10，67.58，67.48，66.79，66.42，65.69，49.99，48.77，47.86，41.70，41.49，40.70，39.15，37.50，35.94，34.44，34.37，33.97，33.67，31.80，29.54，29.24，29.07，28.37，25.98，25.55，25.13，25.08，24.91，24.28，22.58，14.02.
2.24.2. N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-12-二羧基乙基]酰胺(＝OM-197-Asp-AC)
上述制備的化合物(80毫克；0.053毫摩爾)在含己酸(1毫升)的1/4二氯甲烷/乙醇混合物(10毫升)溶液，在10％碳載鈀(50毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化12至24小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物用葉輪泵抽干，獲得二酸(61毫克，定量產(chǎn)率)。質(zhì)譜(SM)C59H109N5O13之計(jì)算值1095.8；實(shí)測值m/z1097.0([M+H]+)(圖36)。
實(shí)施例2.25.
N-乙酰基-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺(＝OM-197-N’C2-AC)(圖37)
2.25.1. N-乙酰基-D-天冬氨酸，β-芐酯往乙酸酐(85微升，0.90毫摩爾)在乙腈(1亳升)中的溶液，加入市售H-D-Asp(OBn)-0H(Senn化學(xué)公司，CH-Dielsdorf)(200毫克，0.90毫摩爾)在CH3CN/H2O/Et3N(3.5/1.0/0.4毫升)混合物中的溶液。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時。蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，剩余水相冷卻至0℃，用10％檸檬酸水溶液酸化至pH＝3，再用乙酸乙酯(2×)萃取。有機(jī)相合并，用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。獲得N-乙?；?D-天冬氨酸芐酯，呈白色結(jié)晶固體狀(192毫克，81％)，未經(jīng)進(jìn)一步純化即可用在下面步驟(Rf＝0.30，在含2％乙酸的20/1二氯甲烷/甲醇中，磷鉬酸化合物及紫外光顯色劑)。
2.25.2. N-乙?；?D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺β-芐酯
IIDQ(2-異丁氧-1-異丁氧羰基-1，2-二氫喹啉)(254毫克；0.84毫摩爾；1.2當(dāng)量)在無水二氯甲烷(5毫升)中的溶液，在室溫及在氬氣流下，添加到上述制備的N-乙酰基-D-天冬氨酸-β-芐酯(185毫克，0.70毫摩爾)在無水二氯甲烷(15毫升)中的溶液。反應(yīng)混合物攪拌15分鐘，隨后加入(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊-1-醇(1.1.2.節(jié))(334毫克，0.77毫摩爾，1.1當(dāng)量)在無水二氯甲烷(10毫升)中的溶液。攪拌3小時后，溶液蒸發(fā)至干。殘余產(chǎn)物用硅膠柱閃式色譜純化(5/3二氯甲烷/丙酮，然后純丙酮洗脫液)，回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(369毫克；78％)(Rf＝0.22，在5/2二氯甲烷/丙酮中，磷鉬酸化合物及紫外光顯色劑)。
13C-RMN(62,89 MHz，CD3OD)，δ，ppm171,92；171,23；171,07；170,61；170,35；138,11；135,24；128,40；128,24；128,02；127,69；127,59；71,25；67,57；64,56；51,03；49,41；41,51；39,21；35,90；33,88；31,73；29,46；29,17；28,32；28,02；25,35；25,24；24,97；22,83；22,51；13,97；SMC39H59N3O7的計(jì)算值681,4；實(shí)測值m/z 682,5([M+H]+)，704,5([M+Na]+).
2.25.3. N-乙?；?D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-芐氧基羰基氨基)己酰氧基]-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺β-芐酯
往N-乙酰基-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠戊基}酰胺β-芐酯(200毫克；0.29毫摩爾)及6-(芐氧基羰基氨基)己酸(156毫克；0.59毫摩爾)在無水二氯甲烷(8毫升)中的溶液，在0℃及氬氣流下相繼加入市售1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(112毫克，0.59毫摩爾)和4-二甲基氨基吡啶(7毫克，59毫摩爾)。然后反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，隨后在室溫下攪拌一夜。然后反應(yīng)介質(zhì)相繼用水及1N鹽酸溶液洗滌，接著分離相。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。用硅膠柱閃式色譜純化(6/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(200毫克；73％呈白色固體狀。
13C-RMN(62.89 MHz，CDCl3)，δ，ppm 173.65，171.71，171.26，170.30，156.41，138.16，136.60，135.33，128.57，128.46，128.38，128.20，128.04，127.76，127.62，71.21，66.80，66.53，65.72，65.63，49.36，47.80，41.36，40.76，39.22，39.13，35.79，33.75，31.88，29.61，29.31，28.58，28.52，26.04，25.48，25.11，24.36，23.13，22.64，14.09.
2.25.4 N-乙?；?D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺(＝OM-197-N’C2-AC)
上述制備的化合物(200毫克；0.22毫摩爾)在含乙酸(2毫升)的1/1二氯甲烷/乙醇混合物(16毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(40毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化12至24小時。過濾去除催化劑，濾液蒸發(fā)至干，然后用葉輪泵抽干，獲得N-乙酰基-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺(132毫克，定量產(chǎn)率)。SMC31H58N4O8的計(jì)算值614.43；實(shí)測值m/z 615.5([M+H]+)；629.5([M+NH4]+)；637.5([M+Na]+)(圖38)。
實(shí)施例2.26.
N-(2-癸酰氧基辛?；?-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-戊基}酰胺(＝OM-197-N’(C10-20C8)-AC)(圖39)
2.26.1. 2-羥基辛酸芐酯
往市售外消旋2-羥基辛酸(1.00克，6.2毫摩爾)在HPLC級乙酸乙酯(30毫升)中的溶液，相繼加入芐基溴(2.22毫升；18.7毫摩爾)，三乙胺(2.6毫升，18.7毫摩爾)及四丁基碘化銨(1.15克；3.12毫摩爾)。溶液在室溫下攪拌18小時，隨后蒸去溶劑。殘留物溶于醚中，然后有機(jī)相以飽和碳酸鈉溶液及水(2×)洗滌。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)，獲得粗制2-羥基辛酸芐酯(Rf＝0.57，在3/1石油醚/乙酸乙酯混合物中；磷鉬酸化合物及紫外光顯色劑)。
2.26.2 2-癸酰氧基辛酸芐酯
上述制備的酯(780毫克；3.12毫摩爾)在無水二氯甲烷(15毫升)的溶液，在0℃中相繼滴加吡啶(0.9毫升)及癸酰氯(654毫克；3.43毫摩爾)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?0小時，然后反應(yīng)介質(zhì)倒入含(5％)碳酸氫鈉的冰冷水中。有機(jī)相經(jīng)分離，相繼用1N鹽酸溶液與水(2×)洗滌。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。用硅膠柱閃式色譜純化(30/1石油醚/乙酸乙酯洗脫液)，能夠回收純2-癸酰氧基辛酸芐酯。
2.26.3 2-癸酰氧基辛酸
如上制備的2-癸酰氧辛酸芐酯(515毫克；1.27毫摩爾)在HPLC級乙醇(40毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(100毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化2小時。在微孔膜上過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，然后殘余物用葉輪泵抽干，獲得2-癸酰氧基辛酸(定量產(chǎn)率)。
2.26.4. N-(2-癸酰氧基辛?；?-D-天冬氨酸，β-芐酯
往2-癸酰氧基辛酸(317毫克；1.01毫摩爾)在無水THF(2毫升)中的溶液，在-15℃及氬氣氣流下，相繼加入N-甲基嗎啉(111微升；1.01毫摩爾；1當(dāng)量)以及氯甲酸異丁酯(131微升；1.01毫摩爾；1當(dāng)量)。迅速觀察到生成的N-甲基嗎啉鹽酸鹽沉淀。在-15℃攪拌30分鐘后，加入市售H-D-Asp(OBn)-OH(CH-Dielsdorf，Senn化學(xué)公司)(225毫克；1.01毫摩爾；1當(dāng)量)在含三乙胺(0.4毫升)的3.5/1乙腈/水混合物(9毫升)中的溶液。然后，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌一夜。有機(jī)相蒸發(fā)，水相冷卻至0℃，用10％檸檬酸水溶液酸化至pH＝3，用乙酸乙酯(2×)萃取。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。用硅膠柱閃式色譜純化(含2％乙酸的2/1石油醚/乙酸乙酯洗脫液)，接著與甲苯共蒸發(fā)，能夠回收N-(2-癸酰氧基辛?；?-D-天冬氨酸，β-芐酯(140毫克；27％)。
2.26.5. N-(2-癸酰氧基辛?；?-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]-戊基}酰胺β-芐酯
在室溫及氬氣氣流下，IIDQ(98毫克；0.32毫摩爾；1.2當(dāng)量)添加到N-(2-癸酰氧基辛?；?-D-天冬氨酸β-芐酯(140克；0.27毫摩爾)在無水二氯甲烷(15毫升)中的溶液。反應(yīng)混合物攪拌15分鐘后，加入(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-芐氧基十四酰基氨基]戊-1-醇(1.1.2.節(jié))(129毫克；0.30毫摩爾；1.1當(dāng)量)在無水二氯甲烷(5毫升)中的溶液。攪拌18小時后，溶液蒸發(fā)至干。用硅膠柱閃式色譜純化(先5/1二氯甲烷/丙酮，后1/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，能夠回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(197毫克；78％)(Rf＝0.30，在5/1二氯甲烷/丙酮混合物中，磷鉬酸化合物以及紫外光顯色劑)。
2.26.6. N-(2-癸酰氧基辛?；?-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-[6-(芐氧基羰基氨基)己酰氧基]-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊基}酰胺β-芐酯
往N-(2-癸酰氧基辛?；?-D-天冬氨酸β-芐酯，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-芐氧基十四?；被鵠-戊基}酰胺(197毫克；0.21毫摩爾)以及6-(芐氧基羰基氨基)己酸(112毫克；0.42毫摩爾)在無水二氯甲烷(8毫升)中的溶液，在0℃及氬氣氣流下，相繼加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(81毫克，0.42毫摩爾)以及4-二甲基氨基吡啶(6毫克，42毫摩爾)。然后，反應(yīng)混合物在0℃攪拌30分鐘，隨后在室溫下攪拌一夜。然后，反應(yīng)介質(zhì)相繼用水及1N鹽酸溶液洗滌；接著分離各相。有機(jī)相用硫酸鎂干燥，過濾及蒸發(fā)。用硅膠柱閃式色譜純化(6/1二氯甲烷/丙酮洗脫液)，能夠回收偶合反應(yīng)產(chǎn)物(170毫克；68％)。
2.26.7 N-(2-癸酰氧基辛酰基)-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-戊基}酰胺
上述制備的化合物(150毫克；0.13毫摩爾)在含乙酸(2毫升)的1/1二氯甲烷/乙醇混合物(16毫升)中的溶液，在10％碳載鈀(40毫克)存在下，在室溫及在氫的大氣壓力下氫化12至24小時。過濾去除催化劑。濾液蒸發(fā)至干，殘余物用葉輪泵抽干，獲得N-(2-癸酰氧基辛?；?-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被?-戊基}酰胺(110毫克，定量產(chǎn)率)；SM(質(zhì)譜)C47H88N4O10的計(jì)算值868.65；實(shí)測值m/z比870.0([M+H)+，884.0([M+NH4]+)，891.5([M+Na]+)(圖40)。
實(shí)施例2.27.
本發(fā)明化合物的純化及分析
合成產(chǎn)物與帶有附屬官能化支鏈的?；娜苡谒?異丙醇混合物(1∶1體積/體積)中。然后添加必需量的2M碳酸氫銨，以達(dá)到50mM濃度。
2.27.1. 純化
在下述條件下，采用反相制備HPLC進(jìn)行純化
柱Bondapack C18 PrepPak，40×200毫米，15-20微米，
300埃，Waters公司
移動相A異丙醇-水(9∶1體積/體積)，50mM碳酸氫銨
B異丙醇-水(2∶8體積/體積)，50mM碳酸氫銨
流速 40毫升/分鐘
洗脫 在柱上恒溶劑組成吸附40％ B(60％A)，10分鐘
梯度A∶B在10分鐘內(nèi)40-80％ B
恒溶劑組成洗脫80％B，30分鐘
洗滌步驟100％B，10分鐘
檢測 紫外光，210毫微米
若觀察有任何芳族產(chǎn)物(不完全脫保護(hù)步驟)，則須進(jìn)行更精密的純化步驟。這種補(bǔ)充純化處理是根據(jù)下述條件進(jìn)行的
柱Kromasil C18，21×250毫米，5微米，100埃，
Macherey-Nagel公司。
移動相A異丙醇-水(9∶1體積/體積)，50mM碳酸氫銨
B異丙醇-水(2∶8體積/體積)，50mM碳酸氫銨
流速 5毫升/分鐘
洗脫 柱上恒溶劑組成吸附40％ B(60％ A)，10分鐘
恒溶劑組成洗脫84％ B，30分鐘
洗滌步驟100％ B，10分鐘
檢測紫外光，210毫微米
系統(tǒng)Waters 2000
含有呈銨鹽形式的相關(guān)化合物的洗脫部分合并，并通過在C18Bondapack相，15-20微米，300埃，waters公司吸附濃縮。然后反離子使用10克/升堿金屬鹽(例如氯化鈉或氯化鉀)在水-異丙醇混合物(9∶1體積/體積)中的水溶液洗滌交換。在柱通過5個水-異丙醇混合物(9∶1體積/體積)體積去除過量鹽后，化合物用純異丙醇洗脫。
2.27.2.純化過程監(jiān)視
在各個步驟后，洗脫部分可根據(jù)下述條件采用反相HPLC分析色譜進(jìn)行分析
柱 Supelcosil C18.3微米，4.6×150毫米，100埃，
Supelco公司
移動相 A水-乙腈(1∶1體積/體積)，5mM TBAP
B水-異丙醇(1∶9體積/體積)，5mM TBAP
TBAP四丁基磷酸銨
流速1毫升/分鐘
洗脫步驟A∶B梯度(75∶25至0∶100范圍)，37.5分鐘
檢測紫外光，210納米和254納米
色譜對于這些分析，使用不同的HPLC色譜(HP1050 Ti系
列，HP 1090系列M，LabChromshimadzu)。根據(jù)使用
的系統(tǒng)可以改變保留時間，對于一定化合物可能有約1
分鐘。
2.27.3. 最后產(chǎn)物的測定及純度分析
在上述色譜條件下，采用HPLC/UV對所得產(chǎn)物進(jìn)行測定和純度的控制。根據(jù)這些分析結(jié)果，所得到產(chǎn)物的純度是97至100％。為了證明含有在紫外光為無活性的雜質(zhì)，進(jìn)行LC/ES-MS分析(電噴灑型電離作用，正模式)。為了滿足電離的條件，使用下列色譜分析
柱 Vydac C4.5微米，4.6×150毫米，300埃
移動相 A水-乙腈(1∶1，體積/體積)，0.05％ TFA
B水-異丙醇(1∶9，體積/體積)，0.05％ TFA
流速1毫升/分鐘
洗脫A∶B梯度(80∶20-0∶100)，20分鐘
溫度40℃
2.27.4.光譜分析
質(zhì)譜
采用不同型號的質(zhì)譜儀(Finnigan LCQ，離子阱；MicromassQuattro II，三階段四極；Micromass Z-Bio-Q三階段四極)測量ES/MS光譜(正與負(fù)模式)。還進(jìn)行了MS/MS型的補(bǔ)充分析。
核磁共振
使用250.13及62.89MHz Bruker DPX型裝置測量了1H-RMN及13C-RMN光譜。
第3系列實(shí)施例綴合物(conjugués)的制備
實(shí)施例3.1
與FGFG肽的綴合物
如圖5、8、15、17、19、21及23中列出的合成流程圖所表明的，在帶有烯烴型輔助支鏈的酰化假二肽化合物進(jìn)行相鄰二羥基化反應(yīng)，導(dǎo)致生成穩(wěn)定二醇官能團(tuán)。然后進(jìn)行定期氧化反應(yīng)，在輔助支鏈上形成醛官能團(tuán)。然后，通過還原性胺化反應(yīng)，這種官能團(tuán)能夠例如偶合小尺寸肽，如FGGF(苯基丙氨酸-甘氨酸-苯基丙氨酸-甘氨酸，Sigma公司)。為了除去溶液中存在的鹽，醛的純化步驟是必不可少的。這種醛化合物純化可根據(jù)下述程序用C18 Bondapack相(waters公司)15-20及微米，300埃進(jìn)行
-稀釋在異丙醇-水混合物(1∶3)后吸收
-使用異丙醇-水混合物(1∶9)洗脫鹽
-使用最小體積的異丙醇洗脫醛。
通過還原性胺化的偶合反應(yīng)可在水溶液中進(jìn)行，同時醛官能(酰化假二肽的輔助支鏈)與待偶合肽或蛋白質(zhì)上可用胺官能團(tuán)之間滿足相等的化學(xué)計(jì)算量。
在GFGF肽實(shí)例中，2毫克純化的OM-197-FV7(1.86微摩爾，1當(dāng)量)添加到0.8毫克FGFG(1.86毫摩爾，1含量)溶于1毫升(1∶1)水-乙腈中的溶液。該溶液在室溫下攪拌30分鐘形成亞胺。隨后，通過加入92微升1M NaBH3CN(5.77毫克，50當(dāng)量)進(jìn)行還原步驟，形成高度穩(wěn)定的碳-氮鍵(圖41)。綴合物首先用VydacC4柱進(jìn)行純化，去除未反應(yīng)肽，隨后用Baondapack C18相(Waters公司)，獲得鈉鹽(參見本發(fā)明化合物純化與分析一節(jié))。然后，綴合物溶解于含有0.01％三乙醇胺(TEoA)的無菌水中，以滿足生物活性試驗(yàn)的需求。純化后記錄的ES/MS質(zhì)譜顯示在圖43中，證明了在1457.4m/z的[M+H]+分子離子，表明其期望的偶合作用。通過MS/MS分析鑒定出m/z 400與900間的可見離子為來自綴合肽分子峰的片段。未檢測出對應(yīng)于起始FGFC肽的離子(m/z 427.1[M+H]+，m/z 853.0[2M+H]+，圖42)。
實(shí)施例3.2.
與(NANP)6P2P30肽的綴合物
在圖5中列出的合成流程圖所得到的OM-197-FV7化合物例如可與藥學(xué)感興趣的肽偶合，例如(NANP)6P2P30[Valmori等人；1992，《J.Immunol.》149717-721]，它具有下述的序列
(NANP)6QYIKANSKFIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
(NANP)6P2P30肽具有四個可能的綴合位點(diǎn)(末端胺+三個賴氨酸)。5毫克純化的OM-197-FV7(4.64微摩爾，4當(dāng)量)添加到7.49毫克(NANP)6P2P30(1.16微摩爾，1當(dāng)量)溶于1毫升(1∶1)水-異丙醇混合物中的溶液。該溶液在室溫下攪拌30分鐘，隨后通過加入230微升1MNaBH3CN(14.43毫克，50當(dāng)量)進(jìn)行還原步驟。溶液在室溫下攪拌2小時。然后，反應(yīng)混合物對水滲析24小時(3.5Kd滲析盒，Slide-A-Lyzer，Pierce公司)。反應(yīng)混合物進(jìn)行LC/ES-MS分析證明存在有三種類型的分子，如圖44的色譜圖所表明的對應(yīng)于游離的肽(峰A)、單綴合的肽(峰B)以及雙綴合肽(峰C)的峰清楚可見。每個峰所記錄的離子云示于圖45、46及47，證明單綴合物和雙綴合物分別是與一個或二個OM-197-FV分子共價綴合。
圖45肽(NANP)6P2P30(游離肽)。PM6451。
在m/z 1076.2(A6)，1291.2(A5)，1613.7(A4)的離子
圖46單綴合物OM-197-FV7-(NANP)6P2P30。PM7481。
在m/z 1247.8(B6)，1497.4(B5)，1871.2(B4)的離子
圖47雙綴合物(OM-197-FV)2-(NANP)6P2P30。PM8511。
在m/z/1496.6(C6)，1703.3(C5)，2129.1(C4)離子
采用SDS-PAGE分析OM-197-PV7-(NANP)6P2P30綴合物能夠證明有不同的獨(dú)立帶，它們分別對應(yīng)于未反應(yīng)的肽、單綴合物及雙綴合物。在使用的電泳條件下(10-20％聚丙烯酰胺梯度，tris-tricin緩沖液，Bio-Rad公司，#161-1108)，現(xiàn)在的標(biāo)準(zhǔn)能評價相關(guān)帶間的差為1000uma，證明了OM-197-FV的一個或二個分子偶合在肽上。
實(shí)施例3.3.
與P2P30肽的綴合物
其它肽也可通過還原性胺化反應(yīng)與帶有醛型輔助支鏈的化合物偶合。例如OM-197-FV與P2O30肽偶合。后者對應(yīng)于破傷風(fēng)類毒素的T抗原決定簇部分，且具如下序列
KQYIKANSKFIGITEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
P2O30肽具有5個可能的綴合位點(diǎn)(末端胺+4個賴氨酸)，質(zhì)量4200uma。因此使用5當(dāng)量OM-197-FV7。應(yīng)用上述的反應(yīng)條件。在對水滲析(3.5Kd滲析盒Slide-A-lyZer，Pierce公司)后，所得綴合物的質(zhì)譜采用LC/ES-MS技術(shù)測量，且對游離肽P2O30記錄光譜比較，后者是多電荷離子，m/z 840.9(A5)1050.9(A4)及1401.0(A3)，它構(gòu)成了分子量4200uma肽的離子云(圖48)。OM-197-FV-P2P30單綴合物的ES/MS譜是多電荷離子的，m/z 872.8(A6)，1047.1(A5)，1308.6(A4)及1744.4(A3)(圖49)，它構(gòu)成了分子量5230uma綴合物的離子云，其對應(yīng)于通過還原性胺化反應(yīng)OM-197-FV分子接技在P2P30肽分子上。
同理，所得到的(OM-197-FV)2-P2P30雙綴合物質(zhì)譜證明每個肽單位有二個OM-197-FV分子。由離子m/z 1044.5(A6)，1253.1(A5)，1566.3(A4)及2088.4(A3)(圖50)構(gòu)成的離子云，通過轉(zhuǎn)換分析后證明雙綴合物的預(yù)期分子量(6261uma)。
實(shí)施例3.4.
與(NANP)3CS.T3肽的綴合物
對具有下述序列的(NANP)3CS.T3肽(TNO，PM3527uma)進(jìn)行類似偶合
NANPNANPNANPDIEKKIAKMEKASSVFNWNS
在對水滲析后，從ES/MS譜所觀察的離子表明分子量4557及5587uma，它們對應(yīng)于單綴合物及雙綴合物的預(yù)期值。
實(shí)施例3.5.
MR99B肽綴合物
采用圖8的合成流程圖所得OM-197-MC-FV6化合物，例如與藥物有利的肽如PyCS 245-253偶合。對應(yīng)于尤氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelli)的T抗原決定簇(épitope)部分的肽[Franke，E.D.等人，1997，J.Immunol.159，3432-3433]具下述序列
SYVPSAEQI(PyCS 245-253)
為了不在偶合期間修飾T抗原決定簇部分，添加SER氨基酸，形成稱做為MR99B具如下序列的肽
SERSYVPSAEQI(MR99B)
因該序列不含賴氨酸，故MR99B肽具獨(dú)特的還原性胺化綴合位點(diǎn)(在末端胺)。因此，2毫克純化的OM-197-MC-FV6(2.04微摩爾，1.4當(dāng)量)添加到2毫克MR99B(1.47微摩爾，1當(dāng)量)溶于1毫升1∶1水-異丙醇混合物中的溶液。溶液在室溫下攪拌30分鐘，然后通過加入29.4微升1M NaBH3CN(29.4微摩爾，20當(dāng)量)進(jìn)行還原步驟。溶液在室溫下攪拌2小時。反應(yīng)混合物進(jìn)行LC/ES-MS分析，證明形成了具有預(yù)期分子量(2330.4uma，圖51)的OM-197-MC-FV-MR99B，如同證明圖52(離子云)及53(轉(zhuǎn)化光譜)具有的譜。
OM-197-MC-FV-MR99B綴合物純化是根據(jù)下述條件采用C4相的半制備性液相色譜進(jìn)行的
柱 Vydac C4 250×10毫米，5微米，300埃(Vydac)
移動相 A(9∶1體積/體積)水-乙腈，0.05％ TFA
B (9∶1體積/體積)異丙醇-水，0.05％ TFA
流速 2.5毫升/分鐘
洗脫 恒溶劑組成洗脫65％ B，20分鐘
洗滌 100％ B，10分鐘
檢測 紫外光，210納米
系統(tǒng) HPLC 1050
為了驗(yàn)證肽抗原簇未被綴合改變，進(jìn)行了OM-197-MC-FV-MR99B的胰蛋白酶消化。0.5毫克綴合物與83微克胰蛋白酶(Roche，#109819)(基質(zhì)-酶比(6∶1)在1毫升50mM Tris-HCl緩沖液，2mM氯化鈣，pH 8中在25℃培養(yǎng)24小時。
在圖54列出反應(yīng)后LC/ES-MS分析結(jié)果，能夠證明在圖55及56示出的ES-MS光譜的二片段。第一片段具有在m/z比993.5([M+H]+)及1015.6([M+Na]+)的離子，對應(yīng)于CSPy 245-253肽(圖55)。第二片段具有在m/z比678.1([M+H]+)及1355.0([M+H]+)的離子，表明有OM-197-MC-FV-SER型結(jié)構(gòu)存在(圖56)。也可觀察到第三個峰。該峰對應(yīng)于SYVPS及AEQI兩個片段(在這些色譜條件下共洗脫液)。當(dāng)MR99B單獨(dú)消化時也觀察到這種反應(yīng)。
這些結(jié)果證明綴合未改變MR99B肽的T抗原決定簇部分，如圖51流程圖所示。
實(shí)施例3.6.
與MR99A肽的綴合物
為了提高肽的OM-197-MR-FV的綴合程度，以及提高佐劑/抗原比，還不改變T-抗原決定簇部分，KGG型序列可接枝在欲綴合的肽上。因此，KGGKGGK序列例如可接枝在MR99B肽上而獲得下述MR99A肽
KGGKGGKSERSYVPSAEQMR99A
這時，該肽有四個可能的綴合位點(diǎn)用于還原性胺化反應(yīng)(三個賴氨酸與末端胺)。因此，12毫克經(jīng)純化的OM-197-MC-FV6(12.2微摩爾，12當(dāng)量)添加到2毫克MR99A(1.01微摩爾，1當(dāng)量)溶解于1毫升1∶1水-異丙醇中的溶液。該溶液在室溫下攪拌30分鐘，然后加入242微升1M NaBH3CN(244微摩爾，242當(dāng)量)進(jìn)行還原步驟。溶液在室溫下攪拌2小時。反應(yīng)混合物的LC/ES-MS分析結(jié)果證明不同峰，它們對應(yīng)于OM-197-MC-FV分子與MR99A肽綴合的不同程度。對應(yīng)于(OM-197-MC-FV)3-MR99A三綴合物(4870amu)的質(zhì)譜示于圖57(離子云)及58(轉(zhuǎn)化光譜)，而圖59(離子云)及60(轉(zhuǎn)化光譜)的譜證明形成了四綴合物(OM-197-MC-FV)4-MR99A(5834uma)。同等觀察到對應(yīng)于五綴合物形式的離子。這個結(jié)果證明在某些反應(yīng)條件下(過量OM-197-MC-FV)，賴氨酸并非是唯一能通過還原性胺化反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)的氨基酸。
三-及四-綴合物(OM-197-MC-FV)3-4-MR99A的純化可根據(jù)下述條件采用C4相半制備性液相色譜術(shù)進(jìn)行
柱 Vydac C4，250×10毫米，5微米，300埃(Vydac)
移動相 A(9∶1，體積/體積)水-MeCN，0.05％ TFA
B(9∶1，體積/體積)異丙醇-水，0.05％ TFA
流速2.5毫升/分鐘
洗脫恒溶劑組成洗脫85％ B，20分鐘
洗滌100％ B，10分鐘
檢測紫外光，210納米
系統(tǒng)HPLC 1050
如同OM-197-MC-FV-MR99B單綴合物的情況，(OM-197-MC-FV)n-MR99A多綴合物進(jìn)行胰蛋白消化，以決定抗原簇(CSPy 245-253)是否受綴合影響。1毫克多綴合物與166微克胰蛋白酶(Roche，109819號)(基質(zhì)-酶比(6∶1))在1毫升50mM Tris HCl緩沖液，2mM氯化鈣，pH 8中在25℃共同培育24小時。
反應(yīng)后進(jìn)行的LC/ES-MS分析能夠證明許多片段，它們相應(yīng)于MR99A肽各個位點(diǎn)分裂產(chǎn)物。此這些產(chǎn)物中，揭示了具有在m/z993.5([M+H]+)及1015.6([M+H]+)的離子，并相應(yīng)于CSPy 245-253肽的片段。該肽的存在證明了即使在多重綴合反應(yīng)后，肽的T抗原決定簇部分的完整性。通過m/z 1621.4([M+H]3+)及1942.8([M+H]3+)的三倍電荷離子所現(xiàn)察的二個片段是特別令人感興趣的。實(shí)際上，這種片段分別對應(yīng)于片段(OM-197-MC-FV)4-KGGKGGKSER及(OM-197-MC-FV)5-KGGKGGKSER。觀察這些片段表明，不同的OM-197-MC-FV分子有效地接枝在添加到CSPy 245-253的序列上，即使在還原性胺化反應(yīng)步驟時，除賴氨酸以外的氨基酸也進(jìn)行反應(yīng)。還應(yīng)該強(qiáng)調(diào)指出，在肽上存在若干立體重要性的OM-197-MC-FV分子不影響蛋白酶的活性，如胰蛋白酶。例如在可分裂鍵選擇性分裂后能釋放出活性成分的prodrogue綴合的情況下，這些結(jié)果此時顯得特別重要。
實(shí)施例3.7.
與Ag85c肽的綴合物
帶有輔助甲酰基戊?；椭ф湹慕Y(jié)構(gòu)可以與多種藥學(xué)上有益的肽綴合。例如，我們提出例如OM-197-MC-FV分子通過還原性胺化反應(yīng)接枝在合成肽末端胺上，其肽序列衍生自結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的抗原蛋白的序列。最初使用肽如下
MR100 YLQVPSASMGR 1208.4uma
MR101 MVQIPRLVANNTRIWVYC 2176.6uma
LR72 PYAASLSGFLNPSEGWWPTLIGLAM2676.1uma
在與OM-197-MC-FV反應(yīng)后，通過LC/ES-MS分析觀察到下列綴合物例如OM-197-FV-MR100，其分子量2171.0uma(圖61及62)。另外也獲得OM-197-MC-FV-MR101(3140.0uma)及OM-197-MC-FV-LR72(3643.0uma)。
實(shí)施例3.8.
具有OM-197型結(jié)構(gòu)的二聚物
還原性胺化反應(yīng)也可以應(yīng)用于合成OM-197型結(jié)構(gòu)的二聚物。
例如，使用兩種帶有官能化輔助支鏈的化合物，例如OM-197-MC-FV及OM-197-MC-AC可以生成二聚物。因此，1毫克經(jīng)純化后的OM-197-MC-FV6(0.98微摩爾，1當(dāng)量)添加到1毫克OM-197-MC-AC(0.98微摩爾，1當(dāng)量)溶于1毫升(1∶9)水-異丙醇中的溶液中。溶液在室溫下攪拌1小時，然后通過加入19.6微升1M NaBH3CN(19.6微摩爾，20當(dāng)量)進(jìn)行還原步驟。隨后，溶液在室溫下攪拌12小時，反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行LC/ES-MS分析能夠證明形成具有預(yù)期分子量(1945.5uma)的OM-197-MC-FV-OM-197-MC-AC二聚物，如圖63所示的譜證明。因此，這種分子在帶酰基鏈的主鏈末端有兩個羧酸官能。
在圖63所示的結(jié)構(gòu)中，例如，在用OM-197-MP-FV或OM-197-MP-AC型化合物進(jìn)行前述合成時，可用磷酰基置換其中一個羧基。通過與前述帶有官能輔助支鏈的兩種化合物(OM-197-MP-FV及OM-197-MC-AC)間的還原性胺化反應(yīng)進(jìn)行類似反應(yīng)，可獲得OM-197-MP-FV-OM-197-MC-AC二聚物。圖64的ES/MS譜證明這種化合物的預(yù)期分子質(zhì)量(2011.9uma)
實(shí)施例3.9.
帶有氨基型附屬支鏈化合物的綴合
帶有氨基型附屬支鏈化合物也可通過還原性胺化反應(yīng)接合至肽抗原。事實(shí)上有可能利用待接合肽序列中存在的末端絲氨酸。在第一個步驟，肽進(jìn)行高碘酸氧化反應(yīng)，結(jié)果形成高度反應(yīng)性的乙醛酰基(-CO-CHO)。然后，這種基團(tuán)通過還原性胺化反應(yīng)與OM-197型化合物官能化輔助支鏈上的伯胺反應(yīng)。
例如，合成的肽MR99B可接合(綴合)到OM-197-MC-AC化合物，如圖65的合成流程圖所示。為此目的，147微升0.1M高碘酸納(14.6微摩爾，20當(dāng)量)添加到1毫克MR99B肽(0.73微摩爾，1當(dāng)量)溶于1毫升水的溶液中。溶液在室溫下攪拌2小時。因此，如此得到的醛用C18相純化，回收在1毫升(1∶1)異丙醇-水混合物中。然后，加入0.72毫克OM-197-MC-AC化合物(0.73微摩爾，1當(dāng)量)，以及1毫升0.2M硼酸鹽緩沖液，pH 9.2。在室溫下攪拌30分鐘后，加入14.6微升1MNaBH3CN(14.6微摩爾，20當(dāng)量)進(jìn)行還原步驟。溶液在室溫下攪拌24小時。
反應(yīng)混合物的LC/ES-MS分析證明了形成具有預(yù)期分子量(2299.1uma，圖65)的OM-197-MC-AC-MR99B綴合物，如圖66(離子云)以及67(轉(zhuǎn)化光譜)所示譜證明。
帶有氨基型輔助支鏈的其它化合物也可以類似方式接合。例如可列舉OM-197-MC-AP、OM-197-MP-AC、OM-212-AH1、OM-197-MC-Gly、OM-197-MC-Lys、OM-197-Lys-AC或OM-197-Asp-AC。
實(shí)施例3.10.
與卵白蛋白的綴合物
蛋白質(zhì)，例如像卵白蛋白，特別適合于采用還原性胺化反應(yīng)進(jìn)行偶合。對于帶有官能化輔助支鏈與醛官能的假二肽，其序列中有大量的賴氨酸(卵白蛋白有20個賴氨酸)是同樣的可能綴合位點(diǎn)。通過改變還原性胺化反應(yīng)的化學(xué)計(jì)算量(?；俣?蛋白質(zhì)的比)，可達(dá)到不同的接合程度。
1毫克經(jīng)純化后的OM-197-FV7(0.928微摩爾，10當(dāng)量)添加到4毫克卵白蛋白(0.09微摩爾，1當(dāng)量)溶于5毫升水中的溶液。該溶液在室溫下攪拌30分鐘，隨后，通過加入46微升1M NaBH3CN(2.89毫克，50當(dāng)量)進(jìn)行還原步驟。溶液在室溫下攪拌2小時。反應(yīng)混合物隨后對水滲析24小時(3.5Kd滲析盒，Slide-A-Lyzer，Pierce公司)。
根據(jù)卵白蛋白的大小以及特有的非同源特性，卵白蛋白構(gòu)成大量分析問題。因此，通過質(zhì)譜法表征OM-197-FV-卵白蛋白綴合物極為困難。為了證明發(fā)生接合(綴合)反應(yīng)，對不同批次的OM-197-FV-卵白蛋白綴合物進(jìn)行SDS-PAGE分析。如圖68(B)(4-20％聚丙烯酰胺梯度)表明其凝膠，觀察到，OM-197-FV-卵白蛋白綴合物(線3、4及5)的質(zhì)量超過初始卵白蛋白質(zhì)量達(dá)約3000uma(線2)。這種質(zhì)量差提示了每個卵白蛋白分子有許多OM-197-FV分子。采用C4相進(jìn)行的LC/UV分析證實(shí)這種結(jié)果。實(shí)際上，在這些條件下，初始卵白蛋白清楚地出現(xiàn)在RT＝11.3分鐘，而在接合反應(yīng)后，對應(yīng)于初始的卵白蛋白峰完全消失，這個事實(shí)證明了卵白蛋白的定量反應(yīng)。相反地，OM-197-FV-卵白蛋白綴合物未被洗脫出。這種色譜性能還表明在卵白蛋白上還存在多個OM-197-FV分子，因此妨礙了綴合物在這種條件下洗脫。
實(shí)施例3.11.
H1N1血液凝集素綴合物
H1N1血液凝集素蛋白也提供說明OM-197型分子與蛋白質(zhì)抗原間偶合的選擇范例。
1毫克經(jīng)純化的OM-197-FV7(0.928微摩爾，15當(dāng)量)添加到5毫克H1N1(血液凝集素A/Bei jig 262/95，Solvay Duphar公司，Weesp，NL)(0.06微摩爾，1當(dāng)量)溶于8毫升水中的溶液。溶液在室溫下攪拌30分鐘，然后通過加入46微升1M NaBH3CN(2.89毫克，50當(dāng)量)進(jìn)行還原反應(yīng)步驟。溶液在室溫下攪拌2小時，然后，反應(yīng)混合物對水滲析24小時(3.5Kd滲析盒)。
在OM-197-FV-卵白蛋白綴合物(4-20％驟丙烯酰胺梯度)使用的相同條件下，采用SDS-PAGE分析了OM-197-FV-H1N1綴合物。圖68(C)上有起始蛋白質(zhì)(線6)和電泳前后的綴合物(分別為線8及7)所得的電泳圖。H1N1蛋白質(zhì)出現(xiàn)三個帶，其中二個帶對應(yīng)于在參考文獻(xiàn)中描述的HA1及HA2亞單位(Swiss-Prot，瑞士生物電腦科學(xué)會，日內(nèi)瓦)。在OM-197-FV-H1N1綴合物的情況下，觀察到各帶的質(zhì)量差，證明OM-197-FV分子與H1N1蛋白質(zhì)的偶合。
實(shí)施例3.12.
與AZT的綴合物(圖69)
往AZT(200毫克；0.749毫摩爾)在吡啶(4毫升)中的溶液相繼加入丁二酸酐(150毫克；0.5毫摩爾)及4-二甲基氨基吡啶(50毫克；0.41毫摩爾)。任其在50℃放置12小時后，加入甲醇(2毫升)，反應(yīng)介質(zhì)又在室溫下攪拌15分鐘。然后，反應(yīng)介質(zhì)經(jīng)濃縮，產(chǎn)物用硅膠柱閃式色譜用如下洗脫液純化5/1二氯甲烷/甲醇。這時得到產(chǎn)物呈白色固體狀(266毫克；97％)。C14H17N5O7(M＝367克/摩爾)；Rf＝0.25(4/1二氯甲烷/甲醇)。
在0℃及氬氣氣流下，往如此得到的丁二?；?AZT衍生物(60毫克；0.163毫摩爾)在THF(3毫升)中的溶液，相繼加入三乙胺(24微升；0.172毫摩爾)及氯甲酸乙酯(14微升；0.172毫摩爾)。迅速觀察到形成三乙胺鹽酸鹽沉淀。攪拌40分鐘后，加入氨基己酰基衍生物(實(shí)施例2.16.)(160毫克；0.163毫摩爾)在含三乙胺(24微升；0.172毫摩爾)的9/1 DMF水混合物(10毫升)中的溶液。然后，反應(yīng)混合物在0℃攪拌拌15分鐘，隨后在室溫下攪拌一夜，然后在減壓下蒸發(fā)。粗產(chǎn)物溶于二氯甲烷(15毫升)及水(5毫升)中。有機(jī)相分離。水相用10％檸檬酸水溶液酸化，然后用二氯甲烷萃取(兩次)。這時，有機(jī)相合并，用硫酸鎂干燥，過濾及濃縮。用硅膠柱閃式色譜，用洗脫液(先9/1，后7/1二氯甲烷/甲醇)純化。回收AZT-綴合物(123毫克；57％)，呈白色固體狀。Rf＝0.2(4/1二氯甲烷/甲醇)；C69H119N9O16(M＝1329克/摩爾)；實(shí)測值m/z 1330.9([M+H]+)。
分析HPLC保留時間Tr＝24.437分鐘，C18 Supelcosil柱(15厘米×4.6毫米，3微米，100埃)；溶劑A＝50％ MeCN 5mM TBAP溶劑B＝90％ 2-丙醇，5mM TBAP。梯度25-100％B，37.5分鐘，在210毫微米紫外光檢測。
制備HPLCC18 Kromasil柱(25厘米×21毫米，5微米，100埃)，溶劑A＝-50％ MeCN，5mM TBAP；溶劑B＝90％ 2-丙醇，5mM TBAP。
產(chǎn)物使用80％B洗脫。
終相通過SPE以Na+鹽通過，C18 Bondapack相15微米，用90％2-丙醇洗脫。
與d4T的綴合物(圖69)
往d4T(200毫克；0.89毫摩爾)在吡啶(4毫升)中的溶液，相繼加入丁二酸酐(179毫克；0.786毫摩爾)及4-二甲基氨基吡啶(109毫克、0.89毫摩爾)。在室溫下攪拌12小時后，加入甲醇(2毫升)，反應(yīng)介質(zhì)又在室溫下攪拌15分鐘，然后蒸發(fā)。然后，粗產(chǎn)物用硅膠柱閃式色譜。如下洗脫液(5/1二氯甲烷/甲醇)純化。獲得產(chǎn)物呈白色固體狀(280毫克；97％)。C14H16N2O7(M＝324克/摩爾)；Rf＝0.25(4/1二氯甲烷/甲醇)。
往如此得到的d4T的丁二?；苌?60毫克；0.185毫摩爾)在THF(3毫升)中的溶液，在0℃及氬氣氣流中，相繼加入三乙胺(27微升；0.194毫摩爾)及氯甲酸乙酯(16微升；0.194毫摩爾)。迅速觀察到形成的三乙胺鹽酸鹽沉淀。攪拌40分鐘后，在0℃加入氨基己?；苌?實(shí)施例2.16.)(181毫克；0.185毫摩爾)在含三乙胺(27微升；0.194毫摩爾)的9/1 MDF/水混合物(10毫升)中的溶液。然后反應(yīng)混合物在0℃攪拌15分鐘，隨后在室溫下攪拌一夜，然后在減壓下蒸發(fā)。這時，粗產(chǎn)物溶于二氯甲烷(15毫升)及水(5毫升)中。有機(jī)相分離。水相用10％檸檬酸水溶液酸化，然后用二氯甲烷(2×)萃取。有機(jī)相合并，用硫酸鎂干燥，過濾及濃縮。用硅膠柱閃式色譜，用洗脫液(9/1然后7/1二氯甲烷/甲醇)進(jìn)行純化，回升d4T-綴合化合物(107毫克；45％)呈白色固體狀。Rf＝0.2(4/1二氯甲烷/甲醇)；C69H118N6O16(M＝1329克/摩爾)；實(shí)測值m/z 1288.9(MH+)；1310(Na)。
分析HPLC保留時間Tr＝24.455分鐘，C18 Supelcosil柱(15厘米×46毫米，3微米，100埃)；溶劑A＝50％ MeCN，5Mn TBAP溶劑B＝90％ 2-丙醇，5mM TBAP。梯度25-100％ B，37.5分鐘，在210毫微米做紫外光監(jiān)測。
制備HPLCC18 Kromasil柱(25厘米×21毫米，5微米，100埃)，熔劑A＝50％ MeCN，5mN TBAP；溶劑B＝90％ 2-丙醇，5mM TBAP。
產(chǎn)物使用80％ B洗脫。
終相用SPE Na+鹽通過，C18 Bondapack相15微米，用90％ 2-丙醇洗脫。
第4系列實(shí)施例本發(fā)明化合物的藥理研究(試管試驗(yàn))
實(shí)施例4.1.
內(nèi)毒性測定分析
采用動力學(xué)產(chǎn)色石蕊阿米巴細(xì)胞溶解產(chǎn)物試驗(yàn)(Charles RiverEndosafe，產(chǎn)品R1708K，批號EK2251E)測定內(nèi)毒性。
這個LAL試驗(yàn)用于本發(fā)明化合物的低內(nèi)毒性。
本試驗(yàn)的生物學(xué)原理是基于通過細(xì)菌內(nèi)毒素引發(fā)石蕊阿米巴細(xì)胞溶解產(chǎn)物(LAL)中存在的酶原，該酶活化絲氨酸-蛋白酶的串聯(lián)(cascade)。在無色基質(zhì)(與對硝基苯胺偶合的S-2834肽)存在下，產(chǎn)色基團(tuán)分裂導(dǎo)致釋放出對硝基苯胺(pNA)，出現(xiàn)黃色，可在405納米使用分光光度計(jì)監(jiān)視。1.2.
這種動力學(xué)產(chǎn)色試驗(yàn)是基于內(nèi)毒性的量與達(dá)到光密度(D.O.)0.2所需要的時間成反比。濃度是以0.005-50 EU/毫升范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比測定的。
使用0.1毫克/毫升產(chǎn)物溶液的稀釋溶液(5-，10-，50-，100-，500-或1000-倍)進(jìn)行產(chǎn)物試驗(yàn)。LAL結(jié)果對應(yīng)于不再抑制LPS過載回收的最低稀釋度。
結(jié)果是相對于國際標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液(EC-6)以EU(內(nèi)毒性單位)表示的。對于本系列測定，1EU表示0.08納克(ng)大腸桿菌(E.coli.)055B5 LPS。
帶有符合通式I官能化輔助支鏈的不同?；俣乃肔AL結(jié)果
全部受測試的假二肽都具有低內(nèi)毒性。對于多種產(chǎn)物，這種內(nèi)毒性甚至低于試驗(yàn)檢測限。內(nèi)毒性的定量測定由于需要稀釋恢復(fù)過載的試樣而受限制。即使在這個LAL試驗(yàn)中最活性化合物的內(nèi)毒性活性也比LP8低5000倍。
本發(fā)明的假二肽因其低的內(nèi)毒性和生物學(xué)活性而備受關(guān)注。
表
使用與卵白蛋白綴合產(chǎn)物進(jìn)行免疫
實(shí)驗(yàn)的不同產(chǎn)物的LAL結(jié)果
相信與卵白蛋白偶合的OM-197-FV可導(dǎo)致檢測的LAL活性升高。這種升高可歸因在有OM-197-FV分子的方式中的變化。其它卵白蛋白系列產(chǎn)物皆具有相等的LAL活性。LAL結(jié)果變化很大，各組間差3倍至4倍是不說明問題的。最大的LAL活性是對于偶合產(chǎn)物每次注射2.4納克當(dāng)量LPS(25微克/注射)，至于其它組，最大LAL活性是每次注射0.012納克當(dāng)量LPS。
表
使用與H1N1血液凝集素綴合產(chǎn)物的免疫
實(shí)驗(yàn)的不同產(chǎn)物的LAL結(jié)果
H1NI系列產(chǎn)物都具有相同的LAL活性。LAL結(jié)果變化很大，各組間差3倍至4倍是不說明問題的。偶合對LAL活性無影響。最大的LAL活性是每次注射0.008納克當(dāng)量LPS(5微克/注射)。
表
使用與(NANP)6P2P30肽綴合產(chǎn)物進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)的
不同產(chǎn)物的LAL結(jié)果*本試驗(yàn)不適合乳液樣品，故未測定LAL
(NANP)6P2P30系列產(chǎn)物皆具有相同的LAL活性。LAL結(jié)果變化很大，各組間差3倍至4倍是不說明問題的。偶合對LAL活性無影響。最大LAL活性是每次注射0.03納克當(dāng)量LPS(20微克/注射)。
實(shí)施例4.2.
使用本發(fā)明化合物刺激的小鼠骨髓干細(xì)胞增殖的測定
4.2.1.增殖實(shí)驗(yàn)
6-周齡雄性C57/BL6小鼠通過吸入二氧化碳而死亡。去除臀、股、脛及后腿骨。通過切開的端部注入杜別可氏(Dulbecco’s)改性Eagle(伊格爾)培養(yǎng)基(DH培養(yǎng)基)，從骨室中抽取出骨髓。干細(xì)胞經(jīng)洗滌，再次懸浮于補(bǔ)充20％胎牛血清(SVF)的DH培養(yǎng)基中。細(xì)胞濃度調(diào)整至500 000細(xì)胞/毫升。
產(chǎn)物在補(bǔ)充20％ SVF、氨基酸及抗生素的DH培養(yǎng)基中的溶液直接按系列稀釋在微量培養(yǎng)板中。產(chǎn)物重復(fù)三次測試，各微量培養(yǎng)板含有由只是培養(yǎng)基組成的負(fù)對照物。每個孔的最后容積為100微升。
將100微升細(xì)胞懸浮液添加到產(chǎn)物稀釋溶液，細(xì)胞在37℃培育器內(nèi)，在8％二氧化碳及飽和濕度環(huán)境下培育7天。通過測量在活細(xì)胞線粒體中產(chǎn)色基質(zhì)XTT(2，3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四唑鎓-5-羧苯胺(caboxanilide))氧化作用測定細(xì)胞的增殖。
培養(yǎng)結(jié)束時，50微升XTT基質(zhì)溶液(1毫克/毫升XTT+0.008毫克/毫升芬納井(phenazine)甲基硫酸鹽)添加到各孔。在飽和濕度培育器內(nèi)，在37℃與8％二氧化碳下培養(yǎng)8小時后，使用分光光度計(jì)，與參比試樣在690納米相比，在490納米讀取微量培養(yǎng)板。
結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，得到劑量-反應(yīng)曲線。由DH介質(zhì)組成的負(fù)對照值(平均±標(biāo)準(zhǔn)差)也以圖形表示。
由劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算出曲線的3個特定點(diǎn)
Max最大曲線幅度及其對應(yīng)的濃度
EC50對應(yīng)于50％最大幅度的濃度
Min最低濃度誘導(dǎo)顯著的增殖，它對應(yīng)于空白±3×標(biāo)準(zhǔn)差值。
對應(yīng)于EC50及Min的濃度值是用連接曲線不同點(diǎn)的直線線段決定的。
如果曲線沒有最大值，但曲線在最高試驗(yàn)濃度還繼續(xù)上升，則在Max及EC50值的前標(biāo)出[＞]記號。
如果曲線還未降低低于空白±3×標(biāo)準(zhǔn)差的限度，則最低濃度給出[＜]最低試驗(yàn)濃度。
4.2.2. 結(jié)果的表示
由帶有官能化輔助支鏈的?；俣恼T生的骨髓干細(xì)胞的增殖
圖70顯示不同?；俣牡幕钚?，表明官能化輔助支鏈對在小鼠體內(nèi)骨髓干細(xì)胞增殖的影響。
某些?；俣目烧T發(fā)的增殖高于由大腸桿菌LPS組成的正對照組?？烧T發(fā)顯著增殖的最低產(chǎn)物濃度高于正對照組施用的濃度。這種最低產(chǎn)物濃度大大受輔助支鏈官能度的影響。
圖71顯示與一種藥物偶合的?；俣呐己系幕钚?。這種活性證明了，盡管偶合，這些化合物仍保持其一部份活性。還無法區(qū)別固有的活性與通過胞內(nèi)酯酶由偶合酯鍵所得到的活性。這些產(chǎn)物的抗病毒活性傾向于表明酯鍵至少進(jìn)行部分分裂。無論機(jī)理如何，保持生物活性證明這種抗病毒活性與產(chǎn)物活性組合的十分重要的意義。
表
通過帶有滿足通式I的官能化輔助支鏈的?；俣?br> 所誘發(fā)的骨髓干細(xì)胞增殖結(jié)果nd＝未測定
除帶有短鏈的化合物外，本發(fā)明所有酰化假二肽都可誘發(fā)顯著的骨髓干細(xì)胞增殖。
實(shí)施例4.3.
通過使用本發(fā)明產(chǎn)物刺激鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生氧化氮的測定
4.3.1.產(chǎn)生氧化氮的實(shí)驗(yàn)
6周齡C57/BL6雄性小鼠通過吸入二氧化碳而死亡。去除臀、股、脛及后附屬骨。由切開的端部通過注入杜別可氏改性伊格爾培養(yǎng)基(DH培養(yǎng)基)，從骨室中萃取出骨髓。干細(xì)胞洗滌后，并再次懸浮于補(bǔ)充20％馬血清(SH)及30％L929細(xì)胞上清液的DH培養(yǎng)基(細(xì)胞濃度約4000細(xì)胞/毫升)中。L929為鼠纖維母細(xì)胞系，其上清液富含巨噬細(xì)胞生長因子(H-CSF)。細(xì)胞培養(yǎng)液分配在培養(yǎng)皿里，它飽和濕度的培育器中，在37℃與8％二氧化碳下培育8天。
8天后，干細(xì)胞分化成為成熟巨噬細(xì)胞。通過冷卻刮下巨噬細(xì)胞，經(jīng)洗滌，再懸浮于補(bǔ)充5％胎牛血清(FCS)、氨基酸及抗生素的DH培養(yǎng)基中。細(xì)胞濃度調(diào)整為700000細(xì)胞/毫升。
在補(bǔ)充5％ SVF、氨基酸及抗生素的DH培養(yǎng)基的產(chǎn)物溶液系列地直接稀釋在微量培養(yǎng)板中。產(chǎn)物重復(fù)三次試驗(yàn)，每個微量培養(yǎng)板含有由只是培養(yǎng)基組成的負(fù)對照物。每個孔的最后體積為100微升。
100微升細(xì)胞懸浮液添加到產(chǎn)物稀釋溶液，細(xì)胞在飽和濕度的培育器中，在37℃與在8％二氧化碳下培育22小時。在有產(chǎn)物的培育結(jié)束后，抽取出100微升升上清液，通過格利斯(Griess)反應(yīng)測定亞硝酸鹽濃度。在2.5％磷酸水溶液中100微升格利斯試劑(5毫克/毫升對氨基苯磺酰胺+0.5毫克/毫升N-(1-萘基亞乙基二胺鹽酸鹽)添加到每個孔。使用分光光度計(jì)，相對在690納米的參考試樣，在562納米讀取微量培養(yǎng)板。亞硝酸鹽濃度與產(chǎn)生的氧化氮濃度成比例。亞硝酸鹽濃度是與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較測定的。
結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，得到劑量-反應(yīng)曲線。
由劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算出曲線的3個特定點(diǎn)
Max最大曲線幅度及其對應(yīng)的濃度
EC50對應(yīng)于50％最大幅度的濃度
Min最低濃度誘導(dǎo)顯著的增殖，它對應(yīng)于空白±3×標(biāo)準(zhǔn)差值。
對應(yīng)于EC50及Min的濃度值是用連接曲線不同點(diǎn)的直線線段決定的。
如果曲線沒有最大值，但曲線在最高試驗(yàn)濃度還繼續(xù)上升，則在Max及EC50值的前標(biāo)出[＞]記號。
如果曲線還未降低低于空白±3×標(biāo)準(zhǔn)差限，則最低濃度給出[＜]最低試驗(yàn)濃度。
4.3.2. 結(jié)果表示
通過帶有官能化輔助支鏈的酰化假二肽誘發(fā)鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生氧化氮
圖72顯示不同的?；俣牡幕钚裕C明官能化輔助支鏈對誘發(fā)鼠骨髓干細(xì)胞增殖的能力的影響。
OM-197-MP-AC(R/S，R)能夠誘發(fā)增殖高于由大腸桿菌LPS組成的正對照物所誘發(fā)的增殖。能夠誘發(fā)顯著增殖的最低產(chǎn)物濃度遠(yuǎn)低于正對照物的濃度。使用?；俣拇碳さ氖缶奘杉?xì)胞產(chǎn)生的氧化氮大大受輔助支鏈的影響。
圖73顯示與藥物偶合的?；俣牡幕钚?。這種活性證明了，盡管偶合，這些化合物仍保持其一部份活性。無法區(qū)別固有活性與通過胞內(nèi)酯酶偶合酯鍵所得到的活性。這些產(chǎn)物的抗病毒活性傾向于表明酯鍵至少進(jìn)行部分分裂。無論機(jī)理如何，保持生物活性證明這種抗病毒活性與產(chǎn)物活性組合的十分重要的意義。
表
使用符合通式I的帶有官能化輔助支鏈?；?br> 假二肽誘發(fā)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生氧化氮的結(jié)果nd-未測定
除了含短鏈化合物(OM-197-N’(C10-20C8)-MC-AC小量產(chǎn)生)外，全部本發(fā)明的酰基假二肽都可誘發(fā)鼠巨噬細(xì)胞大量產(chǎn)生氧化氮。
實(shí)施例4.4.
樹狀細(xì)胞分化試驗(yàn)
評估本發(fā)明產(chǎn)物誘發(fā)前樹狀細(xì)胞成熟成為樹狀細(xì)胞的能力。測量下列參數(shù)葡聚糖(Dextran)-FITC的加入以及CD83，CD86表面分子的表達(dá)。
4.4.1.實(shí)驗(yàn)程序
周圍血液單核細(xì)胞是由健康捐贈者的“血塊黃層(buffy coats)”分離出來的。通過粘著純化的單核細(xì)胞在含10％胎牛血清(SVF)、GM-CSF及IL-4(10納克/毫升)的RPMI-1640培養(yǎng)基中制成懸浮液，其濃度為1×106細(xì)胞/毫升。細(xì)胞分配在培養(yǎng)皿(每個培養(yǎng)皿10×106細(xì)胞)，培養(yǎng)6天，3天后更換培養(yǎng)基。這樣所得的細(xì)胞稱作前樹狀細(xì)胞(DC-6)。使用稀釋產(chǎn)物溶液或LPS(正對照)再培育3天(參見產(chǎn)物一節(jié))，可將前樹狀細(xì)胞培養(yǎng)成熟為成熟的樹狀細(xì)胞。第9天(DC-9)，收獲細(xì)胞，分析樹狀細(xì)胞成熟的不同表示性參數(shù)評估CD83、CD86表面分子的表達(dá)及摻入葡聚糖-FITC的能力。所有這些參數(shù)都采用FACEEPICS-XL-MCL(庫特(Coulter)免疫公司，芬蘭海雷)分析。
表面分子的表達(dá)是以用LPS活化細(xì)胞(正對照)的平均螢光百分?jǐn)?shù)表示；葡聚糖-FITC摻入率是以保持在培養(yǎng)基中的細(xì)胞摻入率計(jì)算的，且以百分比表示。
產(chǎn)物在添加0.1％三乙胺的0.9％氯化鈉/水中，制備0.5毫克/毫升OM-197-MC，OM-197-FV6及OM-197-MP-AC(R/S，R)的備用溶液。溶液在37℃培養(yǎng)20分鐘，進(jìn)行激烈攪拌3分鐘，然后在RPMI-1640培養(yǎng)基中稀釋至100微克/毫升，且以10微克/毫升至0.03微克/毫升的濃度范圍稀釋使用。
參比產(chǎn)物大腸桿菌脂多醣(LPS，DIFCO，美國密蘇里州底特律)，5毫克/毫升在PBS中備用溶液，100微克/毫升中間物溶液是用RPMI1640培養(yǎng)基制備的。試驗(yàn)濃度是1微克/毫升至0.03微克/毫升的稀溶液。
另一系列實(shí)驗(yàn)中，全部?；俣亩冀?jīng)過冷凍干燥，再直接溶于非致熱原的水中。不同產(chǎn)物及LPS對照在10微克/毫升濃度進(jìn)行了試驗(yàn)。對于葡聚糖細(xì)胞吞噬作用或CD86表面標(biāo)記表達(dá)，這些結(jié)果以樹狀細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和平均螢光值表示。這些結(jié)果是這些產(chǎn)物的2至6次實(shí)驗(yàn)的平均值。
4.4.2.結(jié)果分析
通過GM-CSF與IL-4綴合作用由單核細(xì)胞分化所得的未成熟樹狀細(xì)胞(DC-6)是能夠摻合葡聚糖-FITC的。在成熟過程中，細(xì)胞喪失其摻合葡聚糖-FITC的能力。到達(dá)DC-9分化階段時進(jìn)行這些分析。
這些結(jié)果(圖74)是在僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)的未刺激的細(xì)胞中以所觀察的葡聚糖-FITC摻合百分?jǐn)?shù)表示。這些使用LPS或OM-197-MP-AC(R/S，R)處理的細(xì)胞分別僅保持15％及22％吞噬能力。應(yīng)該注意至少需要1微克/毫升OM-197-MP-AC(R/S，R)，才誘發(fā)最大降低摻合葡聚糖，而0.1微克/毫升LPS則可誘發(fā)同樣的降低。需要10微克/毫升OM-197-MC，可誘發(fā)降低22％細(xì)胞吞噬。此外，濃度低于3微克/毫升，OM-197-MC對吞噬沒有任何作用。OM-197-FV6對樹狀細(xì)胞的成熟顯然沒有什么影響。
共刺激表面分子的表達(dá)是DC成熟的另一個標(biāo)準(zhǔn)。曾試驗(yàn)CD83和CD86(分別為圖75&76)表達(dá)增加。這些結(jié)果是以LPS-誘發(fā)這些標(biāo)記表達(dá)為基的以平均螢光的百分?jǐn)?shù)表示。這些結(jié)果全然符合由細(xì)胞吞噬研究所得到的結(jié)果。OM-197-MP-AC(R/S，R)從0.1微克/毫升開始表面分子的表達(dá)增加，而OM-197-MC應(yīng)該至少需要1微克/毫升才能誘使增加CD83及CD86的表達(dá)。OM-197-FV6對樹狀細(xì)胞特征性表面分子表達(dá)沒有什么影響。
這些結(jié)果表明，?；俣碾S其附屬支鏈而其性能有顯著的差異。OM-197-MP-AC(R/S，R)表明，從0.1微克/毫升起就具有誘發(fā)DC-6細(xì)胞分化成為DC-9細(xì)胞的絕佳能力，而OM-197-MC的濃度高于1微克毫升才開始誘發(fā)這種分化，OM-197-FV6全然沒有這種活性。
通過符合通式I的帶官能化輔助支鏈的?；俣拇碳で皹錉罴?xì)胞(CD6)后，熒光素標(biāo)記葡聚糖細(xì)胞吞噬作用和CD86的表達(dá)前樹狀細(xì)胞分化成成熟樹狀細(xì)胞
在10微克/毫升濃度，許多?；俣目烧T發(fā)前樹狀細(xì)胞分化成為樹狀細(xì)胞。附屬支鏈所帶的官能可調(diào)節(jié)這種活化前樹狀細(xì)胞的能力。
與藥物偶合的?；俣腛M-197-MC-AC-Succ-AZT具有顯著誘發(fā)分化成為樹狀細(xì)胞的能力。?；俣呐浞阶饔脤ζ湔T發(fā)前樹狀細(xì)胞分化成為樹狀細(xì)胞的能力是特別重要的。某些產(chǎn)物的活性依據(jù)它們在有或無0.1％TEOA存在下溶解情況而有極大的差別。
實(shí)施例4.5.
在樹狀細(xì)胞中誘發(fā)MxA蛋白質(zhì)的分析
曾評價本發(fā)明的產(chǎn)物通過前樹狀細(xì)胞誘發(fā)產(chǎn)生抗病毒蛋白質(zhì)MxA的能力。由這些細(xì)胞產(chǎn)生的MxA在電泳分離SDS-PAGE后采用蛋白印跡法(western blotting)。
4.5.1.實(shí)驗(yàn)程序
如上述制備得到的DC-6階段樹狀細(xì)胞，使用或沒有使用α-IFN(500單位/毫升)，LPS(1微克/毫升)，TRANCE(100納克/毫升)，CD40L(1微克/毫升)，OM-197-MC-AC(1微克/毫升)或OM-197-FV6(1微克/毫升)活化48小時。蛋白質(zhì)的提取及分析進(jìn)行如下收集細(xì)胞，然后使用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌3次，再使用100mM Tris-HCl緩沖液，150mM氯化鈉，5mM EDTA，1％崔頓(Triton)-100，其中含有1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)及1微克/毫升抑胃肽(pepstatin)作為蛋白酶抑制劑進(jìn)行分解。按照每100微升(5x)緩沖液106細(xì)胞進(jìn)行分解，緩沖液含有60mM Tris-HCl(pH 6.8)，10％甘油，2％SDS，14.4mM 2-巰基乙醇及0.1％溴酚。試樣在密封伊本朵夫(Ependorf)試管內(nèi)加熱至95℃達(dá)5分鐘。使用與相同細(xì)胞數(shù)等效的試樣量，在10厘米×10厘米12％丙烯酰胺迷你凝膠(minigel)上進(jìn)行電泳。使用下述緩沖液進(jìn)行遷移25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％ SDS，pH 8.3。
轉(zhuǎn)移到膜上蛋白質(zhì)由SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜(轉(zhuǎn)移緩沖液25mM Tris，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH 8.3)
與抗體培養(yǎng)使用龐索紅(Ponceau Red)染色證明膜轉(zhuǎn)移。用5％在TBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.4)中的脫脂乳保護(hù)膜上無特定的位點(diǎn)，在室溫放置1小時。膜在稀釋于TBS-乳(1∶100，體積/體積)中的抗-MxA單克隆抗體(克隆143)溶液中進(jìn)行培養(yǎng)。使用TBS-0.1％吐溫(Tween)20洗3次。膜與稀釋千倍(體積/體積)的與過氧化酶偶合的第二種抗小鼠抗體(HRP，Sigma公司)共同培育。膜用TBS-吐溫洗3次。膜與化學(xué)發(fā)光劑(ECL，阿莫杉法瑪西亞公司(Amersham Pharmacia))共同培養(yǎng)后，使含MxA的條帶顯色。在本系統(tǒng)中，HRP催化基于盧迷諾(luminol)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可在膠片上檢測這種反應(yīng)。
4.5.2.結(jié)果
按照如下活化DC-6細(xì)胞達(dá)0、2小時、4小時、24小時(圖77)或48小時(圖78)
圖77及78中的蛋白印跡法說明隨時間推移產(chǎn)生MxA在24小時后(圖77)以及48小時后(圖78)，通過產(chǎn)物OM-197-AC5及OM-197-FV6分別誘發(fā)MxA蛋白質(zhì)顯著升高。這種MxA的產(chǎn)量與通過LLPS正對照或α-TNF誘發(fā)的產(chǎn)量是相當(dāng)?shù)模贿@種產(chǎn)量高于分別通過負(fù)對照、通過TRANCE(α-TNF組細(xì)胞分裂素，它也誘發(fā)樹狀細(xì)胞成熟)或通過CD40L(另一種可促進(jìn)樹狀細(xì)胞成熟的化學(xué)劑)誘發(fā)的產(chǎn)量。
本發(fā)明化合物OM-197-MP-AC及OM-197-FV6證明了因其誘發(fā)MxA蛋白質(zhì)的能力而具有抗病毒的性質(zhì)。
實(shí)施例4.6.
測定本發(fā)明化合物通過人類周圍血液單核細(xì)胞活化產(chǎn)生α-TNF的能力
4.6.1.程序
周圍血液單核細(xì)胞系由健康捐贈者的“血塊黃層”分離的。“血塊黃層”細(xì)胞再懸浮，在菲可巴克(Ficoll-Paque)梯度(阿莫杉法瑪西亞公司)離心分離單核細(xì)胞。純化后的單核細(xì)胞再懸浮于補(bǔ)充10％SFV、抗生素、巰基乙醇及L-谷氨酸的RPMI-1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞濃度調(diào)整至2×106活細(xì)胞/毫升。
100微升各個帶有官能化輔助支鏈的?；俣脑赗PMI 1640培養(yǎng)基中的溶液，該溶液稀釋到100、10或1微克/毫升，它們分配在微量培養(yǎng)板。試樣重復(fù)3次試驗(yàn)，各個微量培養(yǎng)板含有僅由培養(yǎng)基組成的負(fù)對照組。大腸桿菌LPS的稀釋液(1至0.00001微克/毫升的范圍)用作為正對照。
100微升細(xì)胞懸浮液添加到含產(chǎn)物稀溶液或?qū)φ盏母骺字小＿@些細(xì)胞與產(chǎn)物在37℃、5％二氧化碳及飽和濕度的培育器(恒溫箱)中培養(yǎng)18小時。
培養(yǎng)結(jié)束后，微量培養(yǎng)板經(jīng)離心，收集上清液，以等分試樣在-80℃冷凍，直到ELISA測定。
由單核細(xì)胞產(chǎn)生的α-TNF濃度采用化學(xué)發(fā)光ELISA(廣堤果(QuantiGlo)#QTA00 R&D套件組)測定。稀釋4倍的上清液分配到至微量培養(yǎng)板各孔，其中連接人的抗α-TNF抗體。微量培養(yǎng)板在室溫培養(yǎng)4小時。洗滌后加入與過氧化酶綴合的人的抗-αTNF抗體。培養(yǎng)2小時并徹底洗滌后，加入化學(xué)發(fā)光基質(zhì)，20分鐘后讀取發(fā)光。上清液中含有的α-TNF濃度是與7000至0.7微微克(pg)/毫升標(biāo)準(zhǔn)曲線相比測定的。
結(jié)果以產(chǎn)生的α-TNF微微克/毫升表示。列出的這些結(jié)果是從?；俣幕钚缘拇硇詫?shí)驗(yàn)得到的。
4.6.2.結(jié)果
由通式I帶一個官能化輔助支鏈的?；俣脑谥車簡魏思?xì)胞誘發(fā)α-TNF的產(chǎn)量。
負(fù)對照是由誘發(fā)基本的α-TNF產(chǎn)量在檢測限0.7微微克/毫升以下的RPMI培養(yǎng)基組成的。
通過大腸桿菌LPS在周圍血液單核細(xì)胞誘發(fā)α-TNF的產(chǎn)量。
由大腸桿菌LPS組成的正對照，即使在最低的試驗(yàn)濃度也誘發(fā)出α-TNF的高產(chǎn)量。
最大部份?；俣恼T發(fā)很高的α-TNF產(chǎn)量，即使這個產(chǎn)量低于由正對照誘發(fā)的這個產(chǎn)量。為了誘發(fā)大量產(chǎn)生α-TNF，這些濃度也應(yīng)該比LPS的濃度高。
某些化合物，OM-197-MC和OM-197-MC-MP唯有在100微克/毫升濃度才誘發(fā)很高的產(chǎn)量。
胺官能度對誘發(fā)產(chǎn)生α-TNF特別受到關(guān)注，一方面提高誘發(fā)大量反應(yīng)所必需的幅度，以及降低誘發(fā)大量反應(yīng)所必需的最低產(chǎn)物濃度。
短鏈?；俣腛M-197-N’C2-MC-AC及OM-197-N’(C10-2OC8)-MC-AC即使在100微克/毫升濃度也未誘發(fā)出產(chǎn)生任何的α-TNF。
實(shí)施例4.7.
測定本發(fā)明化合物抑制由大腸桿菌脂多醣(LPS)誘發(fā)的由人類周圍血液單核細(xì)胞產(chǎn)生的α-TNF的能力
4.7.1.程序
周圍血液單核細(xì)胞是從健康捐贈者的“血塊黃層”分離出來的?！把獕K黃層”細(xì)胞制懸浮液，采用菲可巴克(Ficoll-Paque)梯度(阿莫杉法瑪西亞公司)離心分離單核細(xì)胞。純化的單核細(xì)胞再懸浮在補(bǔ)充10％ SFV、抗生素、巰基乙醇及L-谷氨酸的RPMI-1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞濃度調(diào)整至2×106活細(xì)胞/毫升。
通過產(chǎn)物與單核細(xì)胞預(yù)先培養(yǎng)，1小時后加入系列誘發(fā)產(chǎn)生α-TNF的LPS稀溶液，測定這些產(chǎn)物所起的抑制作用。不同的帶官能化輔助支鏈的?；俣牡囊种茲舛仁?0微克/毫升。大腸桿菌的LPS系列稀釋(10倍稀釋)1至0.00001微克/毫升。
50微升用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋到10微克/毫升的產(chǎn)物溶液分配在微量培養(yǎng)板中。每個條件(10微克/毫升產(chǎn)物+稀釋的大腸桿菌LPS)試驗(yàn)重復(fù)三次，每個微量培養(yǎng)板包括由只是培養(yǎng)基組成的負(fù)對照樣。添加用RPMI培養(yǎng)基稀釋大腸桿菌LPS的稀釋液時，可測定由只是LPS(無抑制作用)誘發(fā)產(chǎn)生的α-TNF。
100微升細(xì)胞懸浮液添加到裝有產(chǎn)物稀釋液或?qū)φ瘴锏拿總€孔中。細(xì)胞與產(chǎn)物在37℃，在5％二氧化碳及濕度飽和的恒溫箱中培養(yǎng)1小時。
前培養(yǎng)期結(jié)束時，加入50微升系列大腸桿菌LPS稀釋液。單核細(xì)胞與產(chǎn)物及LPS接著培養(yǎng)18小時。細(xì)胞活化期結(jié)束時，離心微量培養(yǎng)板，收集上清液，以等分試樣在-80℃冷凍，直到采用ELISA測定。
單核細(xì)胞分泌的α-TNF濃度可采用化學(xué)發(fā)光的ELISA(廣堤果#QTA00R&D套件組)測定。稀釋4倍上清液放到微量培養(yǎng)板的每個孔中，該孔內(nèi)結(jié)合人的抗α-TNF抗體。微量培養(yǎng)板在室溫培養(yǎng)4小時。洗滌后加入與過氧化酶綴合的人的抗α-TNF抗體。2小時培養(yǎng)及徹底洗滌后，加入化學(xué)發(fā)光基質(zhì)，20分鐘后讀取發(fā)光。上清液含有的α-TNF濃度可相對于7000至0.7微微克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定。
與僅用RPMI培育的對照物相比，使用大腸桿菌LPS與這些產(chǎn)物共同培養(yǎng)誘發(fā)產(chǎn)生50％α-TNF的LPS濃度來表征抑制作用。這種濃度增加得越高，產(chǎn)物抑制活性越高。使用α-TNF產(chǎn)量抑制值＝100-(該產(chǎn)物和LPS誘發(fā)的α-TNF產(chǎn)量)/(只是LPS誘發(fā)的α-TNF產(chǎn)量)×100可計(jì)算出這個濃度。用這些抑制數(shù)據(jù)，將在50％抑制效果附近的兩個LPS稀釋液的線段可外推出這個濃度。
產(chǎn)物誘發(fā)抑制LPS產(chǎn)生α-TNF的能力也可用最大抑制作用表征。對應(yīng)于這個最大抑制作用(抑制＞95％)的LPS也表示了產(chǎn)物的抑制能力。這些結(jié)果可用有全部產(chǎn)物的代表性實(shí)驗(yàn)計(jì)算得到。
4.7.2.結(jié)果
通過符合通式I的帶官能化輔助支鏈的?；俣囊种圃谌祟悊魏思?xì)胞上由LPS誘發(fā)產(chǎn)生的α-TNF
由RPMI培養(yǎng)基組成的負(fù)對照物可誘發(fā)產(chǎn)生基本的α-TNF低于0.7毫克/毫升檢測限。
所有酰化假二肽都能誘發(fā)抑制大腸桿菌LPS誘發(fā)的α-TNF。達(dá)到這種抑制效果需要的產(chǎn)物濃度是隨輔助支鏈官能度以及脂肪酸鏈長度而改變的。甚至通過酯鍵與藥物偶合的?；俣囊材苷T發(fā)這種抑制作用。
實(shí)施例4.8.
本發(fā)明化合物對抗K562細(xì)胞系靶細(xì)胞的NK細(xì)胞毒性活化能力的測定
4.8.1.程序
PBMC是根據(jù)前面實(shí)施例4.6所述程序從“血塊黃層”分離出來的。簡言之，在菲可(Ficoll)離心及3次洗滌后，PBMC按照在3毫升含10％FCS的RPMI培養(yǎng)基中3×106細(xì)胞/毫升分配在6孔板中，或只是用培養(yǎng)基培養(yǎng)，或使用γ-IFN(1000單位(U)/毫升)，LPS(1微克/毫升)，OM-197-AC5(1微克/毫升)或OM-197-FV6(1微克/毫升)刺激培育。細(xì)胞在這種條件下培養(yǎng)24小時。K562細(xì)胞(人類白血病細(xì)胞系，ATCC#CCL243，20110-2209瑪奈薩(維吉尼亞州)美國)使用含10％FCS的RPMI培養(yǎng)基保持培養(yǎng)，且每周進(jìn)行兩次傳代培養(yǎng)。
為了測量細(xì)胞毒性，PBMC及K562細(xì)胞用HBSS洗滌兩次，并再懸浮于含5％FCS的不含酚紅的RPMI培養(yǎng)基。PBMC分配在圓底96孔平板中，達(dá)到在50微升容積中PBMC/靶比為20/1、10/1及5/1。每個孔添加在50微升不含酚紅的RPMI中5000個K562細(xì)胞(靶細(xì)胞)。最后容積為100微升。平板經(jīng)過離心促進(jìn)接觸，然后在37℃培育4小時。
根據(jù)供應(yīng)商的方案，使用基于測量細(xì)胞溶解期間釋放LPH的非放射性塞托拓(CytoTox)96工具套盒(盒號#G1780，批號#124100，波米加(Promega)公司，威斯康辛州馬理森)測定細(xì)胞毒性。
細(xì)胞毒性的百分?jǐn)?shù)系根據(jù)下式計(jì)算
4.8.2.結(jié)果
化合物OM-197-AC5及OM-197-FV6誘發(fā)NK活性，與由在相同濃度(1微克/毫升)下試驗(yàn)LPS誘發(fā)的活性相近或略微低差。
實(shí)施例4.9.
測定本發(fā)明化合物誘發(fā)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的能力
4.9.1.實(shí)驗(yàn)描述
匯集得自一組4只純CBA小鼠的脾細(xì)胞，在沒有或有OM-197-MP-AC佐劑(0.1至10微克/毫升)下培養(yǎng)四次。培養(yǎng)1或2天后，通過測量氚標(biāo)記胸腺核苷(3H-TdR)摻合評價這些細(xì)胞的增殖反應(yīng)。表中報告值表示4次培養(yǎng)的算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
佐劑OM-197-MP-AC母液是用0.9毫克/毫升在加0.1％三乙醇胺的注射用水制備的。
結(jié)果
OM-197-MP-AC產(chǎn)物刺激體外試驗(yàn)的脾細(xì)胞增殖。這種作用在培養(yǎng)1天后最大，這種作用在1微克/毫升濃度時胸腺核苷摻合提高5倍，而在10微克/毫升濃度時胸腺核苷摻合提高12倍。培養(yǎng)1天后，1微克/毫升的OM-197-MP-AC產(chǎn)物具有很強(qiáng)的有絲分裂效果，與5微克/毫升伴刀豆球蛋白A相當(dāng)(參見表1)。
表1
鼠脾細(xì)胞對OM-197-MP-AC佐劑的增殖性反應(yīng)的測定
上表列出的值表示4次培育摻合測量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用(5微克/毫升)伴刀豆球蛋白A作為正對照，在培育1天后獲得胸腺核苷摻合為37.5±6.2×103CPM的值。
實(shí)施例4.10.
本發(fā)明化合物與AZT及d4T綴合物作為前藥的抗病毒活性的測定。
4.10.1.程序
用HTLV(一種引起白血病形態(tài)的病毒)感染不死的(永生化)TMT-4淋巴細(xì)胞，可用來試驗(yàn)分別與AZT-及d4T-綴合的本發(fā)明化合物抗病毒活性(抗VIH(HIV，英文))。這種細(xì)胞具有受到VIH感染后無法存活的性質(zhì)。試驗(yàn)基于保護(hù)該產(chǎn)物(如AZT)不會受到這種病毒性毀滅效果。
這些產(chǎn)物是在96孔平板用一系列稀釋溶液進(jìn)行的。微量培養(yǎng)板的上半部中，試驗(yàn)了各種濃度的產(chǎn)物與細(xì)胞及病毒(重復(fù)3次)，這樣能夠測定保護(hù)細(xì)胞免受病毒毀滅性作用的產(chǎn)物濃度。我們觀察到活細(xì)胞數(shù)減少50％時的濃度是產(chǎn)物的IC50。存活細(xì)胞計(jì)數(shù)是使用MTT進(jìn)行的，MTT是一種黃色四唑鎓化合物，它可以酶還原(在存活細(xì)胞的粒線體中)成為紫色甲_化合物。含活細(xì)胞的孔為紫色，細(xì)胞死亡則持續(xù)為黃色。測量光密度(O.D.)可定量這種作用。
在平板的下半部以同樣方式評價產(chǎn)物的細(xì)胞毒性，在平板下半部用產(chǎn)物與無病毒細(xì)胞共同培養(yǎng)的稀釋液進(jìn)行了試驗(yàn)，這樣能夠測定產(chǎn)物對細(xì)胞的毒性作用。其毒性以CC50表示，CC50表示50％細(xì)胞因產(chǎn)物毒性死亡的濃度。產(chǎn)物的選擇性(選擇性指標(biāo)，SI)定義為CC50/IC50。這個參數(shù)是重要的，好的產(chǎn)物具有很高的選擇性指標(biāo)。
4.10.2.結(jié)果
與AZT(OM-197-LC-Succ-AZT)或d4T綴合的本發(fā)明產(chǎn)物具有抗HIV I IIIB及HIV2 ROD的抗病毒活性。對MT-4細(xì)胞進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)(重復(fù)三次)結(jié)果列舉如下
與AZT或d4T-綴合的本發(fā)明化合物表明在這種MT-4細(xì)胞模式中抗病毒活性。這些前藥的其中一個優(yōu)點(diǎn)在于綴合物的脂質(zhì)性質(zhì)，這種性質(zhì)一方面使得該化合物對感染細(xì)胞的靶向作用，同時釋放抗病毒物質(zhì)至病毒儲存位點(diǎn)，另一方面，能夠調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的免疫活性。
實(shí)施例4.11.
本發(fā)明化合物將前樹狀細(xì)胞活化成熟成為樹狀細(xì)胞能力的測定
4.11.1.程序
樹狀細(xì)胞的獲得從(C57BI/6，6至8周齡)小鼠的股骨及脛骨抽骨髓。骨髓懸浮液經(jīng)70微米細(xì)胞篩過篩而獲得單一細(xì)胞懸浮液。骨髓細(xì)胞再懸浮于補(bǔ)充10％熱失活胎牛血清(SVFi)和抗生素的伊斯科(Iscove)改性杜別可(Dulbecco)培養(yǎng)基(IMDM)中。細(xì)胞在37℃、二氧化碳下及飽和濕度6孔微量培養(yǎng)板中培養(yǎng)。第二天(第0天)收集及洗滌未粘著的細(xì)胞。采用崔邦藍(lán)(blue de trypan)染料排除法補(bǔ)充存活細(xì)胞。細(xì)胞濃度在含有20納克/毫升鼠重組GM-CSF(rmGM-CDF)和20納克/毫升鼠重組IL-4(rmIL-4)的IMDM中調(diào)整到2×105細(xì)胞/毫升，進(jìn)一步培養(yǎng)。在第3天添加濃度10納克/毫升的新rmGM-CSF及rmIL-4。在第6天收集未附著的細(xì)胞，經(jīng)洗滌，并采用崔邦藍(lán)(bleu detrypan)染料排除法補(bǔ)充。細(xì)胞濃度在含10納克/毫升rmGM-CSF及rmIL-4的IMDM中調(diào)整到2×105細(xì)胞/毫升，再進(jìn)行培養(yǎng)。第8天收集由成熟及未成熟樹狀細(xì)胞(CD-DM)組成的非粘著細(xì)胞，且用于與產(chǎn)物共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
與本發(fā)明產(chǎn)物一起培養(yǎng)濃度5×105細(xì)胞/毫升的CD-DM在24孔微量培養(yǎng)板中在如下活化劑存在下進(jìn)行培養(yǎng)100納克/毫升大腸桿菌0111B4的LPS正對照，IMDM負(fù)對照；以及2種本發(fā)明化合物OM-197-MC-FV5及OM-197-MP-AC濃度分別為0.1、1及10微克/毫升。經(jīng)48小時培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，儲存供流量細(xì)胞計(jì)分析之用。
使用流量細(xì)胞計(jì)分析CD-DM使用含2％SVFi和0.01％疊氮化鈉(FACS緩沖液)的PBS洗滌。然后細(xì)胞在冰上與最佳濃度的抗CD86、抗CD40、與FITC綴合的抗MHCII以及與過氧化酶綴合的抗CD80一起培養(yǎng)30分鐘。然后細(xì)胞洗滌3次，細(xì)胞在冰上與過氧化酶綴合的鼠的免疫球蛋白共同培養(yǎng)30分鐘，標(biāo)記抗CD86和抗CD40。培養(yǎng)后，細(xì)胞洗滌，再懸浮于FACS緩沖液中。采用FACScanTM流量細(xì)胞計(jì)測量螢光。每個試樣分析15000脈沖。曾經(jīng)只是與綴合物培養(yǎng)的細(xì)胞用作為負(fù)對照。
4.11.2.結(jié)果
細(xì)胞表達(dá)MFI平均螢光強(qiáng)度
本發(fā)明產(chǎn)物能誘發(fā)前樹狀細(xì)胞成熟成為樹狀細(xì)胞。這些體外得到的結(jié)果與小鼠活體試驗(yàn)所得的結(jié)果是一致的。
在活體試驗(yàn)中，每只小鼠靜脈及皮下用藥20微克和5微克OM-197-MP-AC，誘發(fā)樹狀細(xì)胞成熟且遷移入脾臟內(nèi)，由邊緣區(qū)段(位于紅髓與白髓間)遷移至T細(xì)胞出現(xiàn)的白髓。使用本發(fā)明產(chǎn)物處理的動物脾臟組織切片的免疫染色，揭示了成熟樹狀細(xì)胞與T細(xì)胞同局限于白髓，如用LPS處理一樣；而未處理動物則未觀察到遷移及成熟。
第5系列實(shí)施例本發(fā)明化合物的藥理研究(活體試驗(yàn))
實(shí)施例5.1.
在鼠的免疫模式中，與(NANP)6P2P30混合或偶合的帶官能化輔助支鏈的假二肽性質(zhì)的評價。
5.1.1.實(shí)驗(yàn)程序
抗原(NANP)6P2P30肽包含惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的重復(fù)序列(NANP)和兩個破傷風(fēng)毒素序列(P2830-843及P30947-967)。該肽已知是T輔助細(xì)胞的抗原決定簇，顯示其在常見的佐劑存在下誘發(fā)高而長期的免疫反應(yīng)。根據(jù)參考文獻(xiàn)(Valmori等人，1992年，《免疫學(xué)雜志》，149717-721)中描述的方法通過合成可以獲得這種肽。0.4毫克/毫升抗原母液是用pH 8.0的0.9％氯化鈉水溶液制備的。
佐劑1毫克/毫升酰化的假二肽(OM-197-MP，OM-197-FV6及OM-197-MC)母液是用添加0.1％三乙醇胺的0.9％氯化鈉水溶液制備的。正對照由不完全弗隆氏(Freund)佐劑(IFA得自迪弗可(Difco)公司，美國密蘇里州底特律)組成，負(fù)對照為0.9％氯化鈉/水溶液。
整個實(shí)驗(yàn)過程中，抗原及佐劑配制成如前述的混合物或綴合物形式。試驗(yàn)了二種類型的綴合物(OM-197-FV)n-(NANP)6P2P30。相應(yīng)于不同綴合程度的綴合物，每個肽分子有1、2或3個OM-197-FV分子(分別為單-、二-及三綴合物混合物，n＝1、2及3)，亦即每一個肽分子有一分子OM-197-FV(單綴合物，n＝1)。
免疫作用使6周齡BALB/c雌性小鼠(每組6只小鼠)免疫兩次，含0.1毫升皮下注射在尾底部。用藥量是第一次注射時為20微克抗原和50微克佐劑，第二次注射為10微克抗原和50微克佐劑。在綴合物的情況下，計(jì)算注射劑量時，抗原部分是決定性的。
實(shí)驗(yàn)組表
免疫與取樣方案
采血樣
血清制備于第0及第5周采血樣。讓血液于37℃放置60分鐘然后于4℃維持一夜。隨后于-80℃冷凍血清，直到測量抗體。
5.1.2.抗(NANP)6P2P30IgG抗體的測定
對(NANP)6P2P30抗原特異性的IgG抗體的測定是采用ELISA進(jìn)行的。固定抗原是在96孔微量培養(yǎng)板(Maxisorp F96，Nunc公司，丹麥)進(jìn)行的，在潮濕的室內(nèi)于4℃培養(yǎng)一夜，每個孔有0.1毫升PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)，其中含有0.001毫克/毫升(NANP)6P2P30抗原。微量培養(yǎng)板使用含1％牛血清白蛋白(BSA，福陸卡公司，瑞士)的PBS飽和。這些平板使用含0.05％吐溫20的PBS(希格瑪公司，美國蒙大拿州圣路易)洗滌。在5周時抽取的血清用稀釋緩沖液(含2.5％脫脂乳粉和0.05％吐溫20的PBS)進(jìn)行一系列稀釋，然后移至微量培養(yǎng)板，讓其于室溫(TA)下放置1小時。然后平板用PBS洗滌。含有與堿性磷酸酶綴合的小鼠抗免疫球蛋白G多克隆抗體的稀釋溶液(希格瑪公司，美國蒙大拿州圣路易)分配到平板上，且在室溫(TA)下培育1小時。然后，平板用PBS洗滌，通過與堿性磷酸酶基質(zhì)，對硝基苯基磷酸酯(希格瑪公司，美國蒙大拿州圣路易)的比色反應(yīng)，證明特異性的抗體。使用微量培養(yǎng)板讀取器(Dynatech 25000 ELISA讀取器，亞煦弗得(Ashford)公司，英國米多賽斯)，讀取在405毫微米的吸光率。每個條件重復(fù)測量兩次。列出的這些結(jié)果是每組小鼠所得到于405納米測量的吸光率平均值。
5.1.3.結(jié)果特異性反應(yīng)
用圖形表示了接受兩次免疫的小鼠，采用ELISA測定的特異性產(chǎn)生的抗-(NANP)6P2P30 IgG抗體(圖79)。
兩次注射抗原+佐劑混合物(OM-197-FV6或OM-197-MC)，誘發(fā)生血清反應(yīng)，比單獨(dú)注射抗原時所觀察的高得多。使用OM-197-FV-(NANP)6P2P30單共軛物(綴合物)免疫誘發(fā)IgG反應(yīng)略高于抗原+OM-197-FV6混合物所得反應(yīng)。(OM-197-FV)1，2，3-(NANP)6P2P30較高共軛度(綴合度)并未改善對這種抗原的血清反應(yīng)。OM-197-MP佐劑和OM-197-FV-(NANP)6P2P30單綴合物的混合物顯著增加了對這種抗原的血清反應(yīng)，超過了由(NANP)6P2P30+IFA混合物組成的正對照物所達(dá)到的反應(yīng)。
當(dāng)使用(NANP)6P2P30NA肽作為抗原，采用ELISA捕獲抗體時，可得到類似的結(jié)果(圖80)。
實(shí)例5.2.
卵白蛋白免疫組在皮下用藥一次和二次后，測定在小鼠上產(chǎn)生的特異性抗體
5.2.1.實(shí)驗(yàn)的描述
本研究的目的是比較注射佐劑+抗原混合物(OM-197-MP+卵白蛋白)誘發(fā)的血清反應(yīng)與使用有這種相同抗原的綴合物(OM-197-FV-卵白蛋白)引出的血清反應(yīng)。為此，30只BALB/c小鼠(雌性，開始處理時為8周齡)分為下述三組
溶液
A組制備僅有抗原的母液(卵白蛋白，F(xiàn)luka AG，瑞士巴克)，該溶液濃度為在水+0.01％硫柳汞中125微克/毫升。
B組抗原+佐劑混合物母液(卵白蛋白+OM-197-MP)含有在水+0.01硫柳汞中125微克/毫升卵白蛋白和250微克/毫升OM-197-MP。
C組OM-197-FV-卵白蛋白綴合物的母液濃度是在水+0.01％硫柳汞中125微克/毫升蛋白質(zhì)。
注射液的準(zhǔn)備每個母液于37℃培育15分鐘，然后在每種情況下，往每種溶液添加適量的氯化鈉(14％)，以獲得等滲溶液(0.9％氯化鈉)。整體混合物渦旋3分鐘。
免疫作用于第0天及第14天注射。這些溶液采用皮下用藥(兩個不同部位各100微升，每只動物共接受200微升)。于第14天和第28天采血樣(后眼眶穿刺)。
抗卵白蛋白免疫球蛋白測定采用ELISA重復(fù)兩次測定下述卵白蛋白的血清免疫球蛋白IgGI、IgG2a及IgM。簡言之，微量培養(yǎng)板(NUNC免疫平板，羅斯克萊(Roskilde)公司，丹麥)使用100微升卵白蛋白(0.5微克)在碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)中于4℃培育(涂布一夜)。使用0.5％吐溫-20(默克侯朗(Merck Hohenbrunn)公司，丹麥)洗滌后，血清稀釋50、200及800倍[稀釋液磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)+1％牛血清白蛋白(BSA，希格瑪公司，美國蒙大拿州圣路易)+0.02％吐溫-20]。每個100微升稀血清試樣添加到各孔中。于37℃培養(yǎng)45分鐘。
在第二次洗滌后，卵白蛋白特效的IgG1、IgG2a及IgM與100微升與過氧化酶綴合抗-IgG1抗體(抗小鼠的大鼠抗體)(希洛泰克(Serotec)公司，英國牛津)、與過氧化酶綴合IgG2a的抗體(法明哲(Pharmingen)公司，美國加州圣地牙哥)及與生物素綴合IgM的抗體(法明哲公司，美國加州圣地牙哥)，它們預(yù)先稀釋在PBS/BSA/吐溫緩沖液(分別稀釋250、1000、500倍)，于37℃培養(yǎng)30分鐘。對于IgM，補(bǔ)充洗滌后，需要用1∶100與過氧化酶結(jié)合的鏈絲菌抗生素(達(dá)寇(Dako)公司，丹麥萬羅雀普)溶液進(jìn)行第三次培養(yǎng)(37℃，30分鐘)。
洗滌后，添加100微升1，2-亞苯基二胺溶液(OPD，默克公司，丹史達(dá)特，D)，檢測與抗IgG1二次抗體結(jié)合的過氧化酶，而對于IgG2a及IgM，使用的試劑是3’，3’，5’，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，希格瑪公司，美國蒙大拿州圣路易)。在室溫培育20分鐘后，通過加入100微升2N硫酸中止反應(yīng)。使用Bio Rad 3550模式平板讀取器于490納米讀取吸光值。
5.2.2.結(jié)果
每次在490納米讀取的結(jié)果是以每毫升的任意單位(u.a.)表示的。這就有可能將每個樣品與使用來自A組(單獨(dú)注射卵白蛋白動物)第28天所采集血樣的不同稀釋液制備的參比樣品進(jìn)行比較。根據(jù)定義，稀釋50倍的樣品濃度為1000u.a./毫升。然后，各個結(jié)果根據(jù)相應(yīng)的稀釋因數(shù)(50、200或800倍)進(jìn)行校正，這些結(jié)果示于圖81、82及83?？招膱A是對應(yīng)于14天的平均值，黑圈是對應(yīng)于28天的平均值；Ova表示卵白蛋白的縮寫。
這些結(jié)果表明，OM-197-FV-卵白蛋白綴合物在研究模式中是特別的免疫原，因?yàn)樵诘诙巫⑸浜罂娠@著提高小鼠產(chǎn)生的對卵白蛋白的特異性抗體，而與接受分析的免疫球蛋白類別(IgG1、IgG2a及IgM)無關(guān)。特別地，應(yīng)該揭示抗卵白蛋白IgG2a驚人的增高(圖84)，提示一種優(yōu)選地朝向TH1的免疫性。卵白蛋白+OM-197-MP非共價混合物產(chǎn)生比綴合物更低的IgG2a反應(yīng)。
實(shí)例5.3.
H1N1血液凝集素免疫組小鼠在皮下用藥1次和2次后產(chǎn)生的特異性抗體的測定
5.3.1.實(shí)驗(yàn)描述
這個研究的目的是佐劑+抗原混合物(OM-197+H1N1)所誘發(fā)的血清反應(yīng)，與使用具有相同抗原綴合物(OM-197-FV-H1N1)所產(chǎn)生的血清反應(yīng)加以比較。為此，30只BALB/C小鼠(雌性，處理開始時為8周齡)分為下述三組
5.3.2.注射液的準(zhǔn)備
A組H1N1母液(A/北京262/95血液凝集素，蘇維杜佛(SolvayDuphar)，威斯普，NL)制成在水中濃度25微克/毫升。
B組H1N1+OM-197-MP母液含有在水中25微克/毫升H1N1和500微克/毫升OM-197-MP。
C組OM-197-FV-H1N1(H1N1共價結(jié)合OM-197-FV)母液為25微克/毫升在水中的濃度。
每種母液于37℃培養(yǎng)15分鐘。然后往每種溶液各2毫升添加135微升(14％)氯化鈉。整體混合物渦旋3分鐘。
5.3.3.抗H1N1免疫球蛋白的注射與測定
在第0天及第14天安排注射。溶液經(jīng)皮下用藥(50微升用于兩個不同部位，每只動物共100微升)。在第14天采血樣(后眼眶穿刺)。
采用ELISA重復(fù)測定對H1N1特異性的IgM。簡言之，微量培養(yǎng)板(NUNC免疫平板，丹麥羅斯克萊公司)與100微升H1N1(0.5微克)在碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)中在4℃培養(yǎng)(涂布一夜)。使用0.5％吐溫-20(默克侯朗公司，丹麥)洗滌后，血清稀釋50、200及800倍[稀釋液磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)+1％牛血清白蛋白(BSA，希格瑪公司，美國蒙大拿州圣路易)+0.02％吐溫-2]。各100微升稀釋血清樣品加到各個孔中。于37℃培養(yǎng)45分鐘。
經(jīng)第二次洗滌后，對H1N1特異性的IgM在37℃與預(yù)先稀釋在吐溫緩沖液(稀釋500倍)中的100微升抗IgG1抗體(抗大鼠的小鼠抗體)-生物素綴合物(法明哲公司，美國加州圣地牙哥)共同培養(yǎng)。在補(bǔ)充洗滌后，與1∶100過氧化酶綴合的鏈絲菌抗生物素(達(dá)寇公司，丹麥葛羅雀普)稀釋溶液進(jìn)行第三次培養(yǎng)(于37℃，30分鐘)。
經(jīng)洗滌后，100微升3’，3’，5’，9-四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB，希格瑪公司，美國蒙大拿州圣路易)添加到與抗IgM二次抗體綴合的過氧化酶。在室溫培養(yǎng)20分鐘后，通過加入100微升2N硫酸中止反應(yīng)。使用Bio Rad 3550模式平板讀取器讀取于490毫微米的吸光率。
5.3.4.結(jié)果
每次測量的在490毫微米的結(jié)果是以每毫升任意單位(U.A.)表示的。這就有可能將每個樣品與使用由A組(單獨(dú)注射H1N1動物)于28天收集血清樣品的各種稀釋液制備的對比樣品加以比較。根據(jù)定義，稀釋50倍的樣品濃度為1000U.A./毫升。然后，各個結(jié)果可根據(jù)對應(yīng)的稀釋因數(shù)(50、200或800倍)進(jìn)行校正，且示于圖84實(shí)心圓對應(yīng)28天的平均值。
使用OM-197-FV-H1N1綴合物的免疫小鼠顯示出，抗-H1N1 IgM抗體效價高于由只是H1N1抗原構(gòu)成的對照樣品的效價，以及高于OM-197-MP+H1N1混合物組成的對照樣品的效價。
實(shí)例5.4.
在皮下使用利什曼原蟲(Leishmania)LmCPb抗原的小鼠免疫模式中，OM-197-MP-AC佐劑性質(zhì)的評價
5.4.1.實(shí)驗(yàn)描述
CBA小鼠經(jīng)尾部單次皮下注射(100微升)利什曼原蟲寄生蟲LmCPb抗原(每小鼠3微克)±佐劑。形成兩組，每組6只小鼠，接受下述的處理僅抗原(對照組)和抗原+50微克OM-197-MP-AC。
注射后11天，鼠腹股溝及主動脈周圍淋巴節(jié)細(xì)胞(2組，每組各3只小鼠)在純化的LmCPb抗原或寄生蟲(無鞭毛體)全部提取物存在下重復(fù)3次培養(yǎng)。在第4天取出上清液樣品，儲存于-20℃，以便測定IL-4及γ-IFN。最后，將氚化胸腺核(3H-TdR)添加到培養(yǎng)物，以測量其增殖。
采用夾層-ELISA測定細(xì)胞分裂素(γ-IFN及IL-4的OptEIA盒，BD，法明哲公司，瑞士貝梭)，通過測量胸腺核苷的摻合(3H-TdR)評價增殖反應(yīng)。用算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差以CPM表示的3H-TdR摻合測量結(jié)果(8個組各3只小鼠)，以及以微微克/毫升表示的IL-4濃度，對于每組各3只小鼠各自以兩次測量值的算術(shù)平均值給出的(測定細(xì)胞分裂素)。
抗原制備在PBS中濃度150微克/毫升的LmCPb母液
佐劑制備在水中濃度0.9毫克/毫升的OM-294-MP-母液，用于附加注射0.1％三乙醇胺。
抗原-佐劑混合物在就要注射前，在無菌PBS中預(yù)先調(diào)節(jié)到適當(dāng)最后濃度的佐劑制劑(4個體積)與抗原母液(1個體積)混合。
5.4.2.結(jié)果
使用利什曼原蟲LmCPb抗原免疫的CBA小鼠，單次劑量50微克OM-197-MP-AC，足以誘發(fā)提高淋巴節(jié)細(xì)胞增殖(2至6倍)，這種增殖是根據(jù)對純化抗原(0.6至15微克/毫升)的反應(yīng)或?qū)纳x無鞭毛體階段的全部提取物(2至50×10-6/毫升范圍)離體測量的。這些結(jié)果列于表1。此外，用OM-197-MC-AC處理表明使用寄生蟲抗原刺激的淋巴節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)上清液內(nèi)出現(xiàn)相當(dāng)量的IL-4(參考表2)，而未檢測到產(chǎn)生γ-IFN(＜100微微克/毫升)。
表1用LmCPb免疫的CBA小鼠離體試驗(yàn)的淋巴節(jié)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)僅OM-197-MC-AC佐劑或與CpG-DNA結(jié)合使用的效果
該1表列出的值是用兩組淋巴節(jié)(每組3只小鼠；每組重復(fù)培養(yǎng)三次)進(jìn)行摻合測量的算術(shù)平均±標(biāo)準(zhǔn)差。
表2體外使用由LmCPb免疫的CBA小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4僅OM-197-MP-AC佐劑或與CpG-DNA結(jié)合使用的影響
該表列出的值是對三次重復(fù)培養(yǎng)的兩組淋巴節(jié)細(xì)胞上清液(a和b；每組3只小鼠)中兩次細(xì)胞分裂素測量的算術(shù)平均。
結(jié)論
在使用LmCPb(在利什曼原蟲寄生蟲的無鞭毛體階段有豐富的蛋白酶)免疫的CBA小鼠內(nèi)，OM-294-MP-AC產(chǎn)物可增強(qiáng)，通過測量淋巴細(xì)胞增殖離體評價的特異性T反應(yīng)。此外，這種佐劑可促進(jìn)分泌相當(dāng)量IL-4的抗LmCPb淋巴細(xì)胞的發(fā)育。
實(shí)例5.5.
與尤氏瘧原蟲環(huán)境子孢子(circumsporozoite)蛋白質(zhì)的合成肽(PyCs-252-260)偶合或混合的，帶官能化輔助支鏈?；俣男再|(zhì)在鼠免疫模式中的評價
該實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃u價與尤氏瘧原蟲環(huán)境子孢子蛋白質(zhì)的合成肽(PyCs-252-260)接枝或混合的，帶輔助支鏈的酰化假二肽誘發(fā)特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的能力。
5.5.1.實(shí)驗(yàn)程序
抗原與佐劑的配制對應(yīng)于尤氏瘧原蟲環(huán)境子孢子蛋白質(zhì)T細(xì)胞抗原決定簇的合成肽PyCS-252-260具有SYVPSAEQI序列(表1)。肽2MR99B(SERSYVPSAEQI)是往N端增加SER氨基酸得到的，肽1MR99A(KGGKGGKSERSYVPSAEQI)是通過添加與MR99B肽的N端連接的賴氨酸-甘氨酸-甘氨酸氨基酸得到的。這些肽是使用購自巴肯芬卡蘭(Bachem Feinchemikallien)公司(瑞士巴登朵夫)、諾瓦拜肯(Novabiochem)公司(瑞士洛芙芬津)以及福陸卡公司(瑞士巴克)的試劑及溶劑，根據(jù)Merrifield及Atherton合成方法(Atherton等人，Bioorg Chem，8350-351，1979)，通過固相合成(F-moc)得到的。這些肽通過反相HPLC進(jìn)行純化。
如實(shí)施例3.6([OM-197-MC-FV]n-肽1)和實(shí)施例3.5(OM-197-MC-FV-肽2)中所描述的，可得到肽與帶輔助支鏈的?；俣?OM-197-MC-FV)4的單和多綴合物。最終綴合肽無菌溶液進(jìn)行冷凍干燥。
小鼠免疫作用抗原劑量相當(dāng)于每只小鼠每次注射20微克肽2(表2)。注射前，冷凍干燥制劑溶解于0.9％氯化鈉，攪拌3分鐘，在50℃下超音波處理10分鐘。一個體積的抗原(在PBS中14.5微克肽PyCS252-260加50微克P30(通用T細(xì)胞抗原決定簇))與一個體積的佐劑混合制備得到有IFA的配方。
4周齡BALB/c小鼠(哈蘭(Harlan)，吉斯特，NL)于尾部末端皮下注射。使用23號針注射最后體積50微升。動物于第5周開始接受第二次抗原劑量注射，第9周接受第三次注射。
表1.抗原
合成肽 序列 分子質(zhì)量 劑量/注射
(微克)
肽1KGGKGGKSERSYVPSAEQI 1978.2 29.0
肽2SERSYVPSAEQI 1365.5 20.0 PyCS 252-260 SYVPSAEQI993.114.5
表2.實(shí)驗(yàn)組，免疫及采樣表
采用肽免疫
淋巴器官及血液采樣
血清采樣于7及11周后全部小鼠都采血樣。血液放置在37℃達(dá)6分鐘，然后于4℃維持一夜。隨后，血清于-80℃冷凍直到測定抗體。
鼠腹股溝淋巴節(jié)及脾臟的回收每組兩只動物分別于7周及11周后殺死。采用外科手術(shù)取出鼠腹股溝淋巴節(jié)及脾臟，細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)而采用ELISPOT評價CTL活性(γ-干擾素反應(yīng))。
抗肽1抗體效價的測定
采用ELISA測定特別對肽1(KGGKGGKSERSYVPSAEQI)的特異性抗體?？乖潭ǚ绞绞窃?6孔微量培養(yǎng)板(麥希索普F96，弄克，丹麥)于潮濕室內(nèi)在4℃培育一夜，每個孔有0.05毫升含0.001毫克肽1的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)。平板用PBS-0.05％吐溫20(希格瑪公司，美國蒙大拿州圣路易)(PBS-T)洗滌，在室溫下使用5％脫脂乳于PBS-T中飽和平板1小時。在第9周及第11周抽取小鼠的單個血清樣品(A，B，C，D，E，F(xiàn)，G)用稀釋緩沖液(含2.5％脫脂乳粉及0.05％吐溫20的PBS)進(jìn)行一系列稀釋，然后移轉(zhuǎn)至微量培養(yǎng)板，任其在室溫下放置1小時。平板再用PBS洗滌，含有與堿性磷酸酶綴合的山羊杭小鼠免疫球蛋白多克隆抗體(希格瑪公司，美國蒙大拿州圣路易)的稀釋溶液添加到平板且，在室溫下培育1小時。平板用PBS洗滌，通過與堿性磷酸酶基質(zhì)、對硝基苯基磷酸酯(希格瑪公司，美國蒙大拿州圣路易)比色反應(yīng)證明這些特異性抗體。使用微量培養(yǎng)板讀取器(Dynatech 25000 ELISA讀取器，亞煦弗得公司，英國米多賽斯)，讀取于405毫微米的吸光率，兩次重復(fù)測量血清樣品。列出的這些結(jié)果是所得到的每組小鼠測量值的平均值?？贵w效價是用最后誘導(dǎo)高的正反應(yīng)的稀釋液決定的，即光密度高于附加背景噪音值±3標(biāo)準(zhǔn)偏差。
γ-干擾素-ELISPOT測定
在潮濕室內(nèi)，于ELISPOT微量培養(yǎng)板中，其孔底覆蓋硝基纖維素(密里波爾(Millipore)，法國摩爾森)，50微克/毫升抗體溶液在4℃培養(yǎng)一夜，固定鼠的抗-γ-干擾素的特異性抗體(O1E703B2)。添加含10％胎牛血清(FCS，法科拉(Fakola)，瑞士)的DMEM(生命技術(shù)公司，美國紐約州大島)于37℃放置2小時實(shí)施飽和步驟。由淋巴器官(鼠腹股溝淋巴節(jié)及脾臟)得到的細(xì)胞以200000或400000細(xì)胞/孔在微量培養(yǎng)板培養(yǎng)，然后在37℃與100000抗原呈現(xiàn)細(xì)胞[事先使用PyCS 252-260肽于37℃處理1小時，照射(10K rad)以及洗滌3次)共同培養(yǎng)24小時或于(伴)刀豆球蛋白A存在下培養(yǎng)作為對照。培育后，取出細(xì)胞，洗滌后，在2小時內(nèi)加入第二種生物素化的小鼠抗-γ-IFN抗體(ANI，2微克/毫升，在PBS中，含1％BSA)。加入稀釋1000倍的與堿性磷酸酶結(jié)合的鏈絲菌抗生物素(百靈佳曼漢公司，德國曼漢)，于37℃培養(yǎng)1小時，隨后使用含0.05％吐溫20的PBS洗滌三次，接著使用PBS洗滌三次?？?γ-IFN免疫復(fù)合物的存在可通過加入BCIP/NBT基質(zhì)(希格瑪公司，美國蒙大拿州圣路易)加以證明?？捎昧魉礈焱Ｖ乖摲磻?yīng)。這時可用Biosys GmbH自動讀取器(德國卡本)計(jì)數(shù)γ-IFN的正斑點(diǎn)。特異性斑點(diǎn)數(shù)相應(yīng)于在有肽的脈沖式細(xì)胞存在下計(jì)算的點(diǎn)數(shù)與無肽存在下計(jì)算點(diǎn)數(shù)的差。這些結(jié)果以每組小鼠得到值的平均值表示。以每百萬培養(yǎng)細(xì)胞的點(diǎn)數(shù)表示。
結(jié)果
在圖85(第2次注射后2周)與圖86(第3次注射后2周)示出體液反應(yīng)。兩次免疫后，第5組(動物使用通過具有4單位?；俣牡妮o助支鏈結(jié)合的肽1已進(jìn)行免疫)7只中有5只觀察得陽性反應(yīng)。本組中，由于小鼠B及D顯示有意義但低的抗體效價，故在注射第3針后有反應(yīng)的小鼠百分比提高了。使用與相同佐劑混合的相同肽免疫的第三組沒有顯示任何有意義的抗體效價。(使用游離態(tài)OM-197佐劑補(bǔ)充肽2單綴合的)第7組在3次免疫后觀察到出現(xiàn)反應(yīng)。其它各組接受短肽或沒有接受任何肽，沒有顯示出任何抗體反應(yīng)。
結(jié)果，OM-197-肽2四綴合物在全部接受免疫的小鼠中皆誘發(fā)低效價至中效價的抗體反應(yīng)。
通過CTL的頻率，它分泌對PyCS 252-260抗原決定簇特效的γ干擾素，可測定細(xì)胞活性。這些結(jié)果記錄于表3中。正對照用第2組表示，負(fù)對照單用佐劑表示(第1及8組)。用伴刀豆球蛋白A刺激細(xì)胞的對照組對全部小鼠皆呈陽性。
第5組(四綴合物)以及第7組(單綴合物+佐劑)顯示陽性CTL反應(yīng)。
結(jié)果，與4個?；俣姆肿咏雍系碾?OM-197-肽1)是有效的，而單綴合物(OM-197-肽2)未誘發(fā)CTL反應(yīng)。相反地，用游離OM-197補(bǔ)充的單綴合物誘發(fā)CTL反應(yīng)，而未誘發(fā)產(chǎn)生任何抗體，該項(xiàng)事實(shí)的原因可能在于肽2尺寸小(12個氨基酸)。
表3對PyCS 252-260肽的CTL反應(yīng)
實(shí)例5.6.
在兔模式中?；俣臒嵩缘脑u價
這個實(shí)驗(yàn)的目的是確定不會誘發(fā)靜脈注射兔體發(fā)燒的帶接枝輔助支鏈的?；俣淖罡邼舛?。
程序
15只新西蘭白兔分成下列各組
第1組1.0毫克/千克
第2組0.1毫克/千克
第3組0.01毫克/千克
第4組0.001毫克/千克
第5組注射水
試驗(yàn)當(dāng)天，兔子稱重，并在為此目的的備用箱中進(jìn)行免疫。溫度探頭插入直腸。
探頭插入后1小時記錄體溫(注射前)達(dá)90分鐘，求出平均溫度。
然后，每個兔通過邊緣(外側(cè))耳靜脈靜脈注射產(chǎn)品或?qū)φ瘴?無菌水，0.9％氯化鈉)。每30分鐘測量一次溫度，測量3小時。計(jì)算出出注射前平均體溫與最高體溫的差，且報告。
每組取3只兔，若3次反應(yīng)的和不超過1.15℃，則認(rèn)為試驗(yàn)產(chǎn)品不是致熱原的，若其和超過2.65℃，則認(rèn)為該產(chǎn)品是致熱原的。若所得結(jié)果介于兩者之間，則另外使用3只兔重復(fù)試驗(yàn)。
結(jié)果
OM-197-MC-MP及OM-197-MC-Asp化合物的致熱性試驗(yàn)結(jié)果列于后
本發(fā)明化合物與低于0.1毫克/千克劑量時非熱原性。
權(quán)利要求
1、新的N-?；俣?，該假二肽的一端部帶有一個呈中性或帶電荷的酸基，其另一端部帶有一個官能化輔助支鏈，該肽具有通式I
其中R1及R2各自表示由含有2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸得到的?；?，該?；幢蝗〈驇в幸粋€或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、胺基、酰氨基、酰硫代基以及(C1-C24)烷硫代基的取代基，
下標(biāo)m、n為0至10的值，
下標(biāo)p、q為1至10的值，
Y表示O或NH，
X及Z表示官能化輔助支鏈或呈中性或帶電荷的酸基，其選自下述基團(tuán)
-羧基
-羧基[(C1-C5)烷氧基]
-羧基[(C1-C5)烷硫代基]
-膦?；鵞(C1-C5)烷氧基]
-膦?；鵞(C1-C5)烷硫代基]
-二羥基磷酰氧基[(C1-C5)烷氧基]
-二羥基磷酰氧基[(C1-C5)烷硫代基]
-二羥基磷酰氧基
-羥基磺酰氧基
-羥基磺?；鵞(C1-C5)烷氧基]
-羥基磺酰基[(C1-C5)烷硫代基]
-羥基磺酰氧基[(C1-C5)烷氧基]
-羥基磺酰氧基[(C1-C5)烷硫代基]
-[羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基
-[二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基
-[氨合(C1-C5)烷基]氨基羰基
-{羧基[氨基(C1-C5)烷基}氨基羰基
但限制條件為取代基X或Z中至少一個表示官能化輔助支鏈。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中X或Z輔助基具有通式(II)
A-(CO)r-(CH2)s-W (II)式中A表示O、S或NH
下標(biāo)r為0或1的值，
下標(biāo)s為1至10的值，
W選自下述基團(tuán)
-甲酰基
-乙?；?br> -氰基
-鹵素
-氨基
-溴-或碘-乙酰氨基
-?；０被?acylamido)
-二酰基亞胺基
-巰基
-烷基硫代
-羥基
-1，2-二羥基乙基
-烷氧基
-酰氧基
-乙烯基
-乙炔基
-游離羧基
-呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基，
-疊氮基
-氰硫基。
3、新的N-酰化假二肽，該假二肽的一端部帶有一個呈中性或帶電荷的酸基，其另一端部帶有一個官能化輔助支鏈，該肽具有下述通式I
其中R1及R2各自表示由含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸得到的?；?，其未被取代或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫代基以及(C1-C24)烷基硫代基的取代基，
下標(biāo)m、n為0至10的值，
下標(biāo)p、q為1至10的值，
X及Z各自表示呈中性或帶電荷的酸基或官能化輔助支鏈，
但限制條件為取代基X或Z中至少一個表示官能化輔助支鏈，
Y表示O或NH，
酸基X或Y優(yōu)選地選自下述基團(tuán)
-羧基
-羧基[(C1-C5)烷氧基]
-羧基[(C1-C5)烷硫代基]
-膦?；鵞(C1-C5)烷氧基]
-膦?；鵞(C1-C5)烷硫代基]
-二羥基磷酰氧基[(C1-C5)烷氧基]
-二羥基磷酰氧基
-羥基磺酰氧基
-羥基磺?；鵞(C1-C5)烷氧基]
-羥基磺酰基[(C1-C5)烷硫代基]
-羥基磺酰氧基[(C1-C5)烷氧基]
-羥基磺酰氧基[(C1-C5)烷硫代基]
以及含X或Z的官能化輔助支鏈如前述所定義，但1，2-二羥基乙基除外。
4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中在取代基X或Z表示呈中性酸基的情況下，涉及這種酸的游離羧酸、磺酸、膦酸或磷酸形式。
5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物，其中在取代基X或Z是呈電荷形式的酸基的情況下，則涉及鹽化的羧酸、磺酸、膦酸或磷酸形式，特別地，通過添加無機(jī)或有機(jī)堿鹽化，優(yōu)選地用治療上相容的無機(jī)或有機(jī)堿所鹽化。
6、根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的化合物，其中在取代基X或Z表示通式(III)的輔助基的情況下，
O-CO-(CH2)s-W(III)下標(biāo)s為1至10的值，但更特別地為4、5或6以及
W優(yōu)選地選自下列基團(tuán)
-甲?；?br> -氨基
-羥基
-1，2-二羥基乙基和
-羧基。
7、根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的具有下述通式IV的化合物
式中R1及R2各自分別表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸的?；?，其?；幢蝗〈驇в幸粋€或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫代基及(C1-C24)烷硫代基的取代基，
下標(biāo)m及n為0至10的值，
下標(biāo)p及q為1至10的值，
以及其中取代基X或Z中的一個為酸官能團(tuán)，其選自羧基、二羥基磷酰氧基或羧基[(C1-C5)烷氧基、羧基[(C1-C5)烷硫代基]、[羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基、[二羧基(C1-C5)烷基]氨基羰基和{羧基[氨基(C1-C5)烷基}氨基羰基；以及其中另一個取代基為酰氧基，其選自6-氨基己酰氧基、6-氧代己酰氧基、6-羥基己酰氧基、6，7-二羥基庚酰氧基和3-羧基丙酰氧基。
8、根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的化合物，它選自
-N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇-1-二氫磷酸酯10-(6，7-二羥基庚酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10(6-氧代己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺5-O-(6，7-二羥基庚酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺5-O-(6-氧代己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺5-O-(6-羥基己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-(3RS，9R)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-(3R，9R)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-(3S，9R)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-羥基己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-(二羥基磷酰氧基)-丁酸{2-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-5-(6-氧代己基)氨基}戊酯及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-(2R，8R)-2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-3-氧代-4-氮雜-8-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-壬-1，9-二醇1-O-羧甲基醚9-O-(6-氧代己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-(2S，8R)-1-(羧甲基)硫代-2-[(R)-3-十四?；跏孽；被鵠-3-氧代-4-氮雜-8-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-壬-9-醇9-O-(7-氨基庚酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-(2R，8R)-2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-3-氧代-4-氮雜-8-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-壬-1，9-二醇1-O-(2，2-二羧基乙基)醚9-O-(6-氧代己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-1，10-二醇-1-二氫磷酸酯10-(6-溴乙酰氨基己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-(3RS，9R)-3-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-O-(6-氧代己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-丁二?；被?succinylamido)己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-甘氨酸氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-丁二酰氧基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基)}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-{(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-(3-氨基丙基)酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-{(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-{(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-{(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-{(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-乙酰基-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-(2-癸酰基氧辛?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽。
9、根據(jù)權(quán)利要求1-7中任-權(quán)利要求所述的具有通式I的化合物，它選自
-N-[[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇-1-二氫磷酸酯10-(6，7-二羥基庚酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-3-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氧代己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺5-O-(6，7-二羥基庚酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；被鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-羥基-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺5-O-(6-氧代己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-(3RS，9R)，(3R，9R)及(3S，9R)-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-3-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-癸-1，10-二醇1-二氫磷酸酯10-(6-羥基己酸酯)及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-2-[(R)-3-十二?；跏孽；被鵠-4-(二羥基磷酰氧基)-丁酸{2-[(R)-3-羥基氧十四?；被鵠-5-(6-氧代己基)氨基}戊酯及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-[(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-[(R)-3-十二酰基氧十四?；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-丁二酰氧基-4-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]戊基)}酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-{(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-1-羧基-5-氨基戊基]酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽
-N-{(R)-3-十二?；跏孽；鵠-D-天冬氨酸，α-N-{(4R)-5-(6-氨基己酰氧基)-4-[(R)-3-羥基十四?；被鵠戊基}酰胺β-N-[(1S)-1，2-二羧基乙基]酰胺及其與無機(jī)堿或有機(jī)堿的加成鹽。
10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的通式I的N-?；俣牡闹苽浞椒ǎ摷俣囊欢藥в幸粋€呈中性或帶電荷的酸基，另一端帶有一個官能化輔助支鏈，其符合通式I，該方法包括下列步驟藉助正交保護(hù)劑保護(hù)于位置(q+1)的胺官能團(tuán)和于ω-官能化氨基酸的位置ω的YH，還包括使余下呈游離的羧酸官能團(tuán)與還原劑反應(yīng)而獲得相應(yīng)的醇，還包括釋放出位置(q+1)的胺官能團(tuán)，然后利用式R2OH的羧酸的官能衍生物進(jìn)行酰化，其中R2如前面所定義，以及隨后釋放末端醇或氨基官能團(tuán)，而獲得通式V的官能化氨基醇
式中Y表示HO或NH2，
R2表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；?，該?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個如上定義的取代基，
p及q各自表示1至10的整數(shù)，
該氨基醇在肽縮合劑存在下于惰性溶劑中與通式VI的ω-官能化的氨基酸衍生物縮合
式中R1為衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；錇槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個如前面定義的取代基，
m及n為0至10的整數(shù)，
以及X為如上定義的可呈游離或酯形式的酸基，
而獲得下述通式VII的假二肽
式中取代基R1及R2以及下標(biāo)m、n、p及q如前面所定義，
如果需要，可使用通式VIII的取代、烷基化或?；脑噭┦蛊溆坞x末端醇官能團(tuán)進(jìn)行取代、烷基化或?；?，
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII)式中A是離去基團(tuán)、OH、SH或NH2官能團(tuán)
下標(biāo)r等于1或0
下標(biāo)s為1至10，優(yōu)選地2至6
W選自下列一個基團(tuán)-甲?；?、-乙?；?氰基、-鹵素、-氨基、-溴-或碘乙酰氨基、-?；０被?二?；鶃啺被?、-巰基、-烷硫代基(alkylthio)、-羥基、-1，2-二羥基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游離或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-疊氮基、-氰硫基或其前體，
如果需要，在偶合劑存在下，該產(chǎn)物進(jìn)行催化氫化或其它去保護(hù)處理，獲得通式I衍生物
式中取代基X、Y、Z、R1、R2、下標(biāo)n、m、p及q具有前述相同定義。
11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的具有下述通式IV的?；俣牡闹苽浞椒?br> 式中R1及R2各自表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸的酰基，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫代基以及(C1-C24)烷硫代基的取代基，
下標(biāo)m、p及q為1至10的值，
下標(biāo)n為0至10的值，
X及Z各自表示呈中性或帶電荷的酸基或官能化輔助支鏈，
其特征在于使用，通過酸解或氫解不穩(wěn)定的保護(hù)劑，分別保護(hù)式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH二氨基酸的于(q+1)位的胺官能團(tuán)以及于ω位的胺官能團(tuán)，將仍然呈游離的羧酸官能團(tuán)與還原劑反應(yīng)而獲得相應(yīng)的醇，使(q+1)位胺官能團(tuán)游離，然后利用式R2OH羧酸的官能衍生物酰化，其中R2已如前定義，然后通過氫解釋放出末端胺官能而獲得通式IX的氨基醇
式中R2表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的羧酸的?；漉；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個如前面定義的取代基，
p及q表示1至10的整數(shù)，
其特征還在于在肽縮合劑存在下，于惰性溶劑中與通式VI的ω-羥基化氨基酸衍生物縮合
式中R1為衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；漉；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個取代基，
m為1至10的整數(shù)，
n為0至10的整數(shù)，
以及X為式
的二烷氧基-或二芳氧基-磷酰氧基基團(tuán)，以獲得通式X的磷酸化假二肽
式中取代基R1、R2以及下標(biāo)m、n、p及q如前定義，以及R為進(jìn)行氫解的不穩(wěn)定基，
如果需要，可使用通式VIII的取代、烷基化或?；噭?，對游離末端醇官能團(tuán)進(jìn)行取代、烷基化或酰化
A-(CO)r-(CH2)s-W(VIII)
A為離去基團(tuán)，OH、SH或NH2官能團(tuán)
下標(biāo)r為0或1的值，
下標(biāo)s為1至10的值，優(yōu)選地2至6的值，
W優(yōu)選地選自下列基團(tuán)-甲?；?、-乙?；?氰基、-鹵素、-氨基、-溴-或碘乙酰氨基、-?；０被?、-二?；鶃啺被?、-巰基、-烷硫代基、-羥基、-1，2-二羥基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游離羧基或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-疊氮基、-氰硫基或它們的前體，
如果需要，在偶合劑存在下，將該化合物進(jìn)行催化氫化或其它去保護(hù)處理，以獲得通式XI衍生物
式中取代基W、R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q、r、s具有前述相同定義。
12、一種根據(jù)權(quán)利要求10所述的具有下述通式XII的假二肽化合物的制備方法
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸的酰基，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫代基以及(C1-C24)烷硫代基的取代基，
下標(biāo)m、p及q為1至10的值，
下標(biāo)n為0至10的值，
以及式中X及Z各自表示酸基或官能化輔助支鏈，
該方法包括使用通過酸解或氫解不穩(wěn)定的保護(hù)劑，分別保護(hù)式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH二氨基酸于(q+1)位的胺官能團(tuán)以及于ω位的胺官能團(tuán)，將仍然呈游離的羧酸官能團(tuán)與還原劑反應(yīng)而獲得相應(yīng)的醇，使(q+1)位胺官能團(tuán)釋放，然后利用式R2OH羧酸的官能衍生物進(jìn)行?；渲蠷2已如前定義，然后通過氫解釋放出末端胺官能團(tuán)，再用烷基化試劑使胺官能團(tuán)烷基化，以獲得通式XIII的氨基醇
式中R2表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；漉；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個如前面定義的取代基，
p及q表示1至10的整數(shù)，
下標(biāo)s包括1至10，優(yōu)選地2至7，
其中氨基醇在縮合劑存在下于惰性溶劑中與通式VI的ω-羥基化氨基酸衍生物縮合
式中R1衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；漉；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個取代基，
m為1至10的整數(shù)，
n為0至10的整數(shù)，
以及X為式
的二烷氧基-或二芳氧基-磷酰氧基基團(tuán)，獲得通式XIV的假二肽
式中取代基R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q及s定義如前，以及R為進(jìn)行氫解的不穩(wěn)定基團(tuán)，
然后進(jìn)行催化氫化反應(yīng)或去保護(hù)處理，因而獲得通式XV衍生物
式中W、R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q、r及s如前面所定義，
W選自下列基團(tuán)-甲?；?乙?；?氰基、-鹵素、-溴-或碘乙酰氨基、-?；０被?、-二酰基亞胺基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游離或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-疊氮基、-氰硫基或它們的前體。
13、根據(jù)權(quán)利要求10所述的具有通式IV的羧基假二肽的制備方法
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和直鏈或支鏈羧酸的?；漉；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫代基以及(C1-C24)烷硫代基的取代基，
下標(biāo)m、p及q為1至10的值，
下標(biāo)n為0至10的值，
以及其中X及Z各自表示酸基或官能化輔助支鏈，
其方法包括使用通過酸解或氫解不穩(wěn)定的保護(hù)劑，分別保護(hù)式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q-1COOH二氨基酸的于(q+1)位的胺官能團(tuán)以及于ω位的胺官能團(tuán)，將仍然呈游離的羧酸官能團(tuán)與還原劑反應(yīng)而獲得相應(yīng)的醇，使(q+1)位胺官能團(tuán)游離，然后利用式R2OH羧酸的官能衍生物進(jìn)行?；渲蠷2已如前定義，然后通過氫解釋放出末端胺官能團(tuán)而獲得通式IX的氨基醇
式中R2表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；?，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個如前面定義的取代基，
p及q表示1至10的整數(shù)，
其方法包括在肽縮合劑存在下于惰性溶劑中，氨基醇與通式VI的ω-氨基羧酸官能衍生物縮合
式中R1為衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和羧酸的?；?，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個取代基，
m為1至10的整數(shù)，
n為0至10的整數(shù)，
以及X為RO-CO-基，式中R是烷基，
形成通式XVI的假二肽
式中取代基R1、R2以及下標(biāo)m、n、p及q定義如前，以及R為進(jìn)行氫解的不穩(wěn)定基團(tuán)，
如果需要，使用通式VIII的取代、烷基化或?；噭?，使其游離末端醇官能團(tuán)進(jìn)行取代、烷基化或?；?br> A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII)式中A為離去基團(tuán)，OH、SH或NH2官能團(tuán)，
下標(biāo)r為0或1，
下標(biāo)s為1至10，優(yōu)選2至6，
W選自下列基團(tuán)-甲?；?、-乙酰基、-氰基、-鹵素、-氨基、-溴-或碘乙酰氨基、-酰基酰氨基、-二?；鶃啺坊?、-巰基、-烷硫代基、-羥基、-1，2-二羥基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、游離或呈酯、混合酐、酰胺或酰肼形式的羧基、-疊氮基、-氰硫基或其前體，
如果需要，在偶合劑存在下，將其進(jìn)行去保護(hù)處理，特別是進(jìn)行催化氫化處理而獲得通式XVII衍生物
其中取代基W、R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q、r及s如前面所定義。
14、根據(jù)權(quán)利要求10所述的具有下述通式IV的假二肽的制備方法
式中R1及R2各自表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸的酰基，其?；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫代基以及(C1-C24)烷硫代基的取代基，
下標(biāo)m、p及q為1至10的值，
下標(biāo)n為0至10的值，
以及式中X及Z各自表示酸基或官能化輔助支鏈，
該方法包括使用酸解不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)使通式XVI假二肽的游離羥基官能團(tuán)保護(hù)
式中取代基R1、R2以及下標(biāo)m、n、p及q定義如前，以及R為進(jìn)行氫解的不穩(wěn)定基團(tuán)，然后釋放呈酯形式存在的羧酸官能團(tuán)，將任選地呈活性形式的這種羧酸官能團(tuán)與還原劑反應(yīng)，生成相應(yīng)的伯醇，這種醇官能團(tuán)用磷?；瘎┨幚磙D(zhuǎn)化成磷酸酯，用酸處理釋放被保護(hù)的羥基官能團(tuán)，然后用通式VIII反應(yīng)劑進(jìn)行取代、?；蛲榛磻?yīng)
A-(CO)r-(CH2)s-W(VIII)式中A為離去基團(tuán)、OH、SH或NH2官能，
下標(biāo)r是1或0，
下標(biāo)s是1至10，優(yōu)選地是2至6，
W選自下列的基團(tuán)-甲?；?、-乙?；?、-氰基、-鹵素、-氨基、-溴-或碘-乙酰氨基、-?；０被?、-二?；鶃啺坊?、-巰基、-烷硫代基、-羥基、-1，2-二羥基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、-游離或呈酯或其它衍生物形式的羧基，
如果需要，在偶合劑存在下，通過氫解將生成的產(chǎn)物去保護(hù)，以獲得通式XI的產(chǎn)物
式中取代基W、R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q、r及s具有前面的含義。
15、根據(jù)權(quán)利要求10所述的具有下述通式IV的膦?；牡闹苽浞椒?br> 式中R1及R2各自表示衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸的?；漉；鶠槲唇?jīng)取代的或帶有一個或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫代基以及(C1-C24)烷硫代基的取代基，
下標(biāo)m、p及q為1至10的值，
下標(biāo)n為0至10的值，
以及式中X及Z各自表示酸基或官能化輔助基團(tuán)，
該方法包括將通式XVI假二肽中以酯形式存在的羧酸官能團(tuán)去保護(hù)
式中取代基R1、R2以及下標(biāo)m、n、p及q定義如前，以及R是氫解時不穩(wěn)定的基團(tuán)，例如苯甲基，
然后在肽偶合劑存在下，如此生成的酸與部分保護(hù)的二氨基鏈烷或氨基酸進(jìn)行肽偶合反應(yīng)，然后，如果需要，偶合產(chǎn)物與通式VIII反應(yīng)劑進(jìn)行取代、?；蛲榛磻?yīng)
A-(CO)r-(CH2)s-W (VIII)式中A為離去基團(tuán)、OH、SH或NH2官能，
下標(biāo)r是0或1，
下標(biāo)s是1-10，優(yōu)選地為2至6，
W優(yōu)選地選自下列的基團(tuán)-甲?；?乙?；?、-氰基、-鹵素、-氨基、-溴-或碘-乙酰氨基、-?；０被?、-二?；鶃啺坊?巰基、-烷硫代基、-羥基、-1，2-二羥基乙基、-酰氧基、-乙烯基、-乙炔基、-游離或呈酯或其它衍生物形式的羧基。
如果需要，在活性劑存在下，例如通過氫解將如此生成的產(chǎn)物去保護(hù)，以獲得通式XVIII的產(chǎn)物
式中取代基W、R1、R2以及下標(biāo)m、n、p、q、r及s具有前面的意義，R3代表氨基烷基、羧基烷基、二羧基烷基或氨基羧基烷基。
16、根據(jù)權(quán)利要求1所述的通式I的化合物、根據(jù)權(quán)利要求7所述的通式IV的化合物、根據(jù)權(quán)利要求11所述的通式XI的化合物、根據(jù)權(quán)利要求12所述的通式XII的化合物、根據(jù)權(quán)利要求13所述的通式XVI的化合物或根據(jù)權(quán)利要求15所述的通式XVIII的化合物的對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體。
17、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中在堿性介質(zhì)中酸官能團(tuán)與銅鹽首先反應(yīng)后，這種羧酸銅與氯甲酸芐酯反應(yīng)，并在酸性介質(zhì)中通過螯合銅釋放羧酸官能團(tuán)，接著α-N-叔丁氧羰基化反應(yīng)，通過N-芐氧基羰基化反應(yīng)保護(hù)在鳥氨酸或賴氨酸衍生物鏈的ω位置的胺官能團(tuán)，以獲得α-N-叔丁氧羰基衍生物以及ω-N-芐氧基羰基衍生物。
18、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中使用硼烷-二甲基硫配合物，或羧酸衍生物與氯甲酸烷酯進(jìn)行反應(yīng)生成混合酸酐，隨后利用堿金屬或堿土金屬硼氫化物還原混合酸酐，這樣使游離羧酸官能團(tuán)還原，以獲得具有伯醇官能團(tuán)的相應(yīng)羥基衍生物。
19.、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中在含有三乙胺的羥基溶劑中通過氫解除去芐氧基羰基基團(tuán)。
20、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中在肽偶合劑，特別是IIDQ存在下，游離胺與α-?；被?磷酰基化羧酸偶合，得到保護(hù)的磷?；俣?。
21、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中在酯化劑，特別是EDC1存在下，使用ω-官能化酸在醇官能上使假二肽?；?，以得到烯基化酯。
22、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中烯基酯的烯基官能團(tuán)用鄰位二醇(diol vicinal)進(jìn)行二羥基化反應(yīng)，然后在假二肽官能團(tuán)去保護(hù)后進(jìn)行高碘酸氧化反應(yīng)，以得到有醛官能團(tuán)的化合物。
23、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中使用ω-氨基鏈烷酸在醇官能團(tuán)上使假二肽?；?br> 24、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中在催化劑存在下，通過氫解進(jìn)行完全的去保護(hù)反應(yīng)，以得到帶輔助氨基烷?；ф湹募俣?。
25、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中為得到N-?；於彼峄蚬劝彼岬摩?芐酯，偶合反應(yīng)的酸對偶是天冬氨酸或谷氨酸衍生物，該衍生物是在?；瘎┐嬖谙?，用脂肪酸衍生物?；被幡?芐酯的胺官能團(tuán)得到的。
26、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中N-?；奶於彼峄蚬劝彼嵫苌锱c由鳥氨酸或賴氨酸衍生的α-N-酰化氨基醇偶合，然后讓如此得到的假二肽在催化劑存在下進(jìn)行氫解反應(yīng)，獲得帶羧基官能團(tuán)的假二肽。
27、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中該假二肽的羥基官能團(tuán)用ω-官能化酸通過烯基進(jìn)行?；?，其中烯基進(jìn)行二羥化反應(yīng)，接著去保護(hù)反應(yīng)和高碘酸氧化反應(yīng)而獲得通式XVII化合物。
28、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中假二肽的羥基官能團(tuán)用ω-氨基鏈烷酸進(jìn)行酰化，還在于該化合物進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)，以得到通式XVII化合物。
29、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中鳥氨酸或賴氨酸還原所得的氨基醇用ω-烯基三氟甲烷磺酸鹽進(jìn)行烷基化，在酰化劑，如EDC1存在下，它與α-酰基胺化ω-磷?；人徇M(jìn)行偶合，接著在四氧化鋨存在下，烯基進(jìn)行二羥基化反應(yīng)，去除保護(hù)基團(tuán)，以及用高碘酸鈉氧化鄰位二醇官能團(tuán)，獲得具有醛官能團(tuán)的化合物。
30、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中N-保護(hù)的絲氨酸衍生物進(jìn)行O-烷基化反應(yīng)，通過酸解除去胺官能團(tuán)的保護(hù)基，再在酰化劑存在下使用3-羥基化脂肪酸衍生物?；饭倌軋F(tuán)，獲得N-?；疧-烷基化的絲胺酸衍生物，該衍生物在肽偶合劑存在下與氨基醇偶合，然后使用ω-官能化鏈烷酸?；坞x羥基官能團(tuán)，獲得通式I的化合物，其中X是羧基烷氧基。
31、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中起始氨基酸是半胱胺酸或高半胱胺酸，它們通過溴乙酸對甲氧基芐酯進(jìn)行烷基化，然后使用3-羥基脂肪酸衍生物對氮原子進(jìn)行?；绱说玫降腟-烷基化和N-?；难苌?，在肽偶合劑存在下與5-氨基-2-[3-羥基十四?；被鵠戊-1-醇偶合，得到縮合產(chǎn)物，再使用ω-官能化鏈烷酸?；坞x伯醇官能團(tuán)，若需要，所得產(chǎn)物進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)，得到通式I的化合物，其中X為羧基烷硫代基。
32、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中絲胺酸對甲氧基芐氧基羰基化衍生物，在堿性介質(zhì)中使用亞甲基丙氨酸二芐酯進(jìn)行O-烷基化，通過酸處理釋放胺官能團(tuán)，然后在酰化劑存在下，使用3-羥基化脂肪酸?；坞x的胺官能團(tuán)，接著在肽偶合劑存在下，如此得到的N-?；?O-烷基化衍生物與氨基醇偶合生成假二肽，然后使用ω-官能化的鏈烷酸，通過烯基或氨基在游離OH官能團(tuán)上使假二肽?；?，烯基化衍生物進(jìn)行二羥基化反應(yīng)，然后通過氫解去保護(hù)，再進(jìn)行高碘酸氧化反應(yīng)，獲得通式I化合物，其中X為二羧基烷氧基。
33、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中使用O-磷酰基化高絲氨酸芐酯，用3-芐氧基十四烷酸進(jìn)行N-酰化反應(yīng)，其芐酯進(jìn)行選擇性氫解，這種酸在肽偶合劑存在下與鳥氨醇的α-N-十二酰基氧十四烷酸衍生物偶合，得到假二肽，在碳化二亞胺存在下，利用ω-官能化鏈烷酸通過烯基或氨基，在仍為游離的羥基官能團(tuán)上使該假二肽?；灰约霸谙┗苌锏那闆r下，將其進(jìn)行二羥化反應(yīng)，然后在催化劑存在下通過氫解進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)，接著高碘酸氧化而得到通式I化合物，其中R1是羥基烷?；?，R2為酰氧基烷?；?。
34、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中由天冬氨酸或谷氨酸得到的中間假二肽利用酸解敏感基團(tuán)進(jìn)行游離羥基官能團(tuán)的保護(hù)反應(yīng)，然后采用其他的去保護(hù)方法，特別是采用氫解方法使以酯形式存在的羧基官能團(tuán)去保護(hù)，再使用還原劑，例如堿金屬硼氫化物的還原該官能團(tuán)，優(yōu)選地在活化成為混合酐酸后還原該官能團(tuán)；如此生成的羥基官能團(tuán)進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，然后在酸性介質(zhì)中水解羥基保護(hù)基，如此再生的羥基官能團(tuán)用ω-官能化羧酸進(jìn)行?；磻?yīng)，接著進(jìn)行二羥化反應(yīng)，然后在催化劑存在下，通過氫解進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)，再進(jìn)行高碘酸氧化反應(yīng)，得到帶有醛官能的通式XI化合物。
35、根據(jù)權(quán)利要求10所述方法的實(shí)施方式，其中由天冬氨酸或谷氨酸得到的中間假二肽進(jìn)行以酯形式存在的羧基官能團(tuán)去保護(hù)反應(yīng)，然后在偶合劑存在下，這個羧基官能團(tuán)與部分保護(hù)的氨基鏈烷或氨基酸偶合，再讓這種偶合反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)，特別是通過氫解進(jìn)行該反應(yīng)，或者，使用ω-官能化鏈烷酸進(jìn)行?；磻?yīng)，在烯基衍生物的情況下，讓其進(jìn)行二羥化反應(yīng)，然后進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)，特別地通過氫解進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)，以及進(jìn)行高碘酸氧化反應(yīng)，得到通式I或通式XVIII的化合物。
36、作為新產(chǎn)物的通式IV化合物
式中R1及R2各自代表衍生自含2至24個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈羧酸的?；擋；鶠槲慈〈幕驇б粋€或多個選自羥基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫代基及(C1-C24)烷硫代基的取代基，
下標(biāo)m、p及q為1至10的值，
下標(biāo)n為0至10的值，
X及Z各自代表酸基或官能化間隔支鏈；
-通式XVI化合物
式中取代基R1、R2以及下標(biāo)m、n、p及q定義如前，以及R是氫解不穩(wěn)定的基團(tuán)，
-通式XVII化合物
式中A為氧原子，取代基W、R1、R2及下標(biāo)m、n、p、q、r及s定義如前，
這些化合物可呈純對映異構(gòu)體或立體異構(gòu)體混合物形式。
37、藥物組合物，該組合物含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的通式I化合物作為活性成分，該化合物可呈外消旋或光學(xué)活性形式、呈純的非對映異構(gòu)體或混合物形式、呈中性或帶電形式，呈與藥學(xué)上可接受的，無毒性的，惰性載體或賦形劑結(jié)合或混合的形式。
38、根據(jù)權(quán)利要求37所述的藥物組合物，該組合物含有至少一種通式I化合物與治療上相容的無機(jī)或有機(jī)堿的鹽作為活性成分。
39、根據(jù)權(quán)利要求37所述的藥物組合物，該組合物是基于與藥用載體或賦形劑結(jié)合或混合的，呈純的非對映異構(gòu)體或混合物形式的通式I化合物。
40、根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，它們接枝在抗原上以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，以及含有這樣一些綴合物的藥物組合物。
41、根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，它們接枝在藥效團(tuán)化合物上，以改善治療效果和/或其靶向作用，以及含有這樣一些化合物的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明特別涉及假二肽，它是由官能化氨基酸得到的，它由固定在酰胺形式的假二肽的胺官能團(tuán)上的脂肪酸鏈組成，所述假二肽的一端帶有官能化的輔助支鏈，另一端是中性或帶電荷的酸基團(tuán)。本發(fā)明的化合物作為佐劑使用時具有免疫調(diào)節(jié)的性質(zhì)。本發(fā)明的化合物也可以接枝在抗原上，以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，或接枝在藥效基團(tuán)上，以改善其治療作用，或其靶向作用。最后，本發(fā)明化合物因此可以用于人藥和獸藥，作為免疫劑和作為診斷工具。
文檔編號A61K38/04GK1434795SQ00819149
公開日2003年8月6日 申請日期2000年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月22日
發(fā)明者J·保爾, O·R·馬丁, S·羅德里格茲 申請人:歐姆藥品公司