專利名稱：人參皂甙Rg的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥有效成分醫(yī)藥新用途領(lǐng)域。人參皂甙Rg2(Ginsengnoside Rg2)最早是從人參根中分離出的化合物，因其含量甚低，分離困難，至今未被醫(yī)藥界所應(yīng)用。根據(jù)報導(dǎo)(1)，紅參的離體強(qiáng)心作用強(qiáng)于生曬參，而紅參中人參皂甙Rg2的含量明顯高于生曬參。故切步認(rèn)為人參皂甙Rg2為人參強(qiáng)心作用的主要成分。按傳統(tǒng)方法分離出人參皂甙Rg2以后。我們又進(jìn)行了離體初試，結(jié)果該化合物對正常離體心臟無明顯影響，而對戊巴比妥鈉造衰的離體心臟有增加心肌收縮幅度的作用(2)。上述矛盾的實驗結(jié)果難以證實人參皂甙Rg2對心、腦血管疾病的治療作用。故此本發(fā)明采用整體動物、離體乳頭肌以及培養(yǎng)心肌細(xì)胞等多種模型，系統(tǒng)地研究和證明了人參皂甙Rg2對心、腦血管疾病的治療和預(yù)防價值實驗證明，人參皂甙Rg2對在體心衰心臟、離體乳頭肌(低鈣條件下)以及培養(yǎng)心肌細(xì)胞(缺氧缺糖條件下)均有正性肌力作用，其作用方式與強(qiáng)心甙不同。人參皂甙Rg2的上述作用主要與心肌肌原纖維對Ca2+敏感性增加有關(guān)。實驗還證明，該化合物對犬失血性休克、心源性休克、家免中毒性休克均有明顯的治療和預(yù)防作用。此外，人參皂甙Rg2對化學(xué)法和冠脈結(jié)扎法所致的心肌缺血及心心肌細(xì)胞凋亡有明顯的治療和預(yù)防作用。該化合物對頸總動脈結(jié)扎性腦細(xì)胞凋亡和體外顆粒神經(jīng)元凋亡有明顯的保護(hù)作用。該化合物還能明顯減少動物斷頭腦缺血和頸總動脈結(jié)扎性腦缺血腦組織中CK、LDH的含量本發(fā)明證實了人參皂甙Rg2作為中藥一類新藥治療休克、心衰、冠心痛、腦梗塞及老年性癡呆的應(yīng)用價值，上述研究均按中藥一類新藥申報要求進(jìn)行，即將開發(fā)成中藥一類新藥。人參皂甙Rg2特征如下1．分子式C42H72O132．分子量7843．結(jié)構(gòu)式 4．分離路線人參莖葉→煎煮→溶媒提取及分離→人參皂甙Rg25．人參皂甙Rg2抗休克、抗心衰、抗心肌缺血及抗腦缺血活性抗休克實驗依據(jù)(1)人參皂甙Rg2對急性缺血性心源性休克的影響取健康雜種犬30只，均分6組，用戊巴比妥鈉麻醉，分離氣管、頸動脈、股動脈及股靜脈，分別連接人工呼吸機(jī)和RM-6000型多導(dǎo)生理記錄儀，并分離主動脈根部，按放電磁流量計卡式探頭。于冠狀動脈前降支(LAD)根部、中部、末梢結(jié)扎后，分別記錄BP、LVSP、LVEDP、±dt/dpmax、HR、呼吸率、CO，并由動靜脈取血測AST、CK、LDH活性。觀察iv不同劑量受試藥物在不同時間內(nèi)作用。各給藥組數(shù)據(jù)與溶媒對照組進(jìn)行組間t檢驗，用X±SD表示實測平均值±標(biāo)準(zhǔn)差及變化百分率(％)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，見表1。
a、對HR的影響人參皂甙Rg21.0mg·kg-1組給藥后10～30min心率明顯增快，與對照組比較P＜0.05，生脈對心率無明顯影響。
b、對MAP的影響人參皂甙Rg21.0mg·kg-1組給藥后10～120minMAP明顯升高，人參皂甙Rg20.5mg·kg-1組給藥后20～120minMAP明顯升高。生脈組僅給藥后30minMAP明顯升高，其作用緩慢。
c、對LVSP的影響人參皂甙Rg2各劑量組對LVSP均有明顯升高作用，維持時間久，均達(dá)到120min，生脈給藥后10～60min明顯升高LVSP。
d、對±dp/dtmax的影響人參皂甙Rg2各劑量組給藥后10min即升高+dp/dtmax，且維持120min，生脈組30～60min明顯升高+dp/dt max。
人參皂甙Rg2各劑量組均明顯升高-dp/dt max，維持時間30～60min，而生脈對-dp/dtmax無明顯影響。
綜上所述，人參皂甙Rg2對急性缺血性心源性休克犬有明顯的治療作用，其血流動力學(xué)指標(biāo)等與對照組比較均有明顯的改善。人參皂甙Rg2與生脈比較起效稍快，維持時間也比生脈長。
(2)人參皂甙Rg2對內(nèi)毒素休克的影響a、人參皂甙Rg2對家兔心功能的影響取健康家兔42只，均分7組，除假手術(shù)組外均iv 1.0mg·kg-1大腸桿菌內(nèi)毒素，10h后，按上述方法連接RM-6000型多導(dǎo)生理記錄儀，按表2所示劑量iv受試藥物，假手術(shù)組及模型組均iv等體積溶媒。記錄給藥前后不同時間MAP、HR、LVSP、LVEDP、IP(等容收縮壓)、±dp/dt max、VPm(最大心肌收縮速度)以MAP＜10KPa，作為休克指標(biāo)，觀察所試藥物對心功能的影響。
由表2所示，受試藥物對內(nèi)毒素家兔心功能影響如下①對MAP、LVSP的影響人參皂甙Rg2各劑量組在給藥后15～120min，對MAP、LVSP明顯的增加作用，參麥組在給藥后30～60min對MAP、LVSP有明顯的增加作用。
②對±dp/dt max的影響人參皂甙Rg2各劑量組在給藥后15～120min內(nèi)對±dp/dt max均有明顯增加作用，參麥組儀在給藥后60min時對±dp/dt max有明顯的增加作用。
③對VPm、的影響人參皂甙Rg2各劑量組對VPm均有明顯的增加作用，Rg2于4.0mg·kg-1組此作用持續(xù)時間15～120min，Rg22.0、mg·kg-1組此作用持續(xù)時間30～120min。參麥對VPm也有增加作用，參麥組僅在60min時有明顯增加作用。
④對LVEDP的影響人參皂甙Rg2各劑量組對LVEDP均有明顯的降低作用，且作用起效時間和作用強(qiáng)度隨劑量的增大而增快和增強(qiáng)，此作用持續(xù)時間均維持至120min。參麥組也有降低LVEDP的作用，但持續(xù)時間為30～60min。
以上結(jié)果表明，人參皂甙Rg2對內(nèi)毒素引起的休克家兔心功能有明顯的改善作用。參麥注射液與Rg2比較起效慢，持續(xù)時間短。
b、對內(nèi)毒素引起家兔微循環(huán)障礙的影響取日本大耳白兔29只，按表3均分5組，實驗前用脫毛劑脫去兩側(cè)耳毛。局麻下插入股動脈和股靜脈導(dǎo)管，用以觀察動脈血壓和iv藥物。按表3所示劑量iv受試藥物，對照組iv等體積溶媒，同時各組均iv內(nèi)毒素5mg·kg-1，觀察兔耳微動脈管徑和流態(tài)變化，結(jié)果見表3。
結(jié)果，iv內(nèi)毒素后2～3min，溶媒組動物有71.4％出現(xiàn)Ⅰ相血壓下降，而參脈組有50％出現(xiàn)Ⅰ相血壓下降，人參皂甙Rg20.85、1.7mg·kg-1分別有16.7％、37.5％出現(xiàn)Ⅰ相血壓下降。iv內(nèi)毒素后20min各組動物耳緣動脈血管管徑均有明顯改變，模型組先擴(kuò)張，后持續(xù)收縮，直至一些動物微動脈收縮成線狀，無血細(xì)胞通過。而給藥組均能抑制內(nèi)毒素所致微動脈收縮，并對血液流態(tài)有一定的改善作用。
總之，人參皂甙Rg2對內(nèi)毒素所致動物微循環(huán)障礙有明顯的改善作用，且其作用隨劑量的增大而增強(qiáng)。
(3人參皂甙Rg2對失血性休克犬血流動力學(xué)的影響取健康犬、麻醉、連接RM-6000型多導(dǎo)生理記錄儀。放血至MAP降到5.3KPa以下，穩(wěn)定10分鐘，按表4所示劑量分別iv受試藥物，對照組iv等體積溶媒，分別記錄MAP、LVSP、LVEDP、±dp/dt max、HR、呼吸率。于給藥后4.5h取血，測LDO和SOD。記錄給藥后6h犬存活數(shù)。
表4表明
①對MAP的影響人參皂甙Rg2各劑量組給藥后10～120min可明顯升高M(jìn)AP，參麥組給藥后5～10min也明顯升高M(jìn)AP。
②對LVSP的影響人參皂甙Rg2各劑量組給藥后均有升高LVSP的作用，除60min時0.5、1.0mg·kg-1和120min時0.5mg·kg-1組與對照組比較P＜0.05外，其余均有升高趨勢。
③對±dp/dt max的影向人參皂甙Rg2各劑量組給藥后10～120min可明顯升高+dp/dt max，對-dp/dt max除5min時0.5mg·kg-1和120min時1.0mg·kg-1與對照組比較P＜0.05外，其余有升高趨勢。
表5、6表明人參皂甙Rg2有明顯降低失血性休克犬血清LPO含量、增強(qiáng)SOD活性、延長存活時間及提高存活率的作用。
以上表明，人參皂甙Rg2對犬失血性休克有明顯保護(hù)作用，升高M(jìn)AP、LVSP、±dp/dtmax，其作用緩慢持久。此外人參皂甙Rg2能減慢呼吸頻率，減少LPO含量，增強(qiáng)SOD活性，減少動物死亡率，延長存活時間。
抗心衰實驗依據(jù)(1)人參皂甙Rg2對戊巴比妥鈉所致心衰血流動力學(xué)的影響取健康雜種犬30只，均分6組，麻醉、開胸，按觀察指標(biāo)插管，連接RM-6000型多導(dǎo)生理記錄儀，分別記錄平均動脈壓(MAP)，左心室內(nèi)壓(LVSP)、舒張期末壓(LVEDP)、心肌收縮最大速率(±dp/dt max)，心率(HR)等指標(biāo)。由股動脈恒速輸入戊巴比妥鈉致心衰及休克，以±dp/dt max下降80％、平均動脈壓及心輸出量下降至40％，為心衰指標(biāo)，由靜脈推注受試藥物，分別記錄給藥前、給藥后不同時間的血流動力學(xué)指標(biāo)。以給藥前(心衰)為100％，計算給藥后各指標(biāo)變化百分率。
由表7可見，由戊巴比妥鈉引起犬急性心力衰竭，其血流動力學(xué)指指標(biāo)發(fā)明顯變化，CO下降率59.17±14.96％，MAP下降率為69.93±9.854％等，表明此模型成功。穩(wěn)定后iv受試藥物，以各項指標(biāo)的影響如下①對MAP的影響人參皂甙0.5mg·kg-1和Rg21.0mg·kg-1在給藥后20～60min可明顯增加MAP，參麥1g生藥·kg-1組也可明顯增加MAP，但與人參皂甙Rg2比較，參麥起效慢。
②對LVSP、LVEDP的影響人參皂甙Rg2各劑量組均能明顯升高LVSP，明顯降低LVEDP，與參麥比較起效快。
③對±dp/dt max的影響人參皂甙Rg2各劑量組均能明顯升高±dp/dt max，在給藥后5～60min內(nèi)作用強(qiáng)度持續(xù)增加，參麥也有升高±dp/dt max的作用，但與Rg2比較，參麥起效慢。
④對HR、CO的影響人參皂甙Rg20.5mg·kg-1組給藥后5～60min即可明顯增加HR，人參皂甙Rg2各劑量組給藥后10～60min均能明顯增加CO，參麥也有增加HR、CO的作用。
以上結(jié)果表明，人參皂甙Rg2對由戊巴比妥鈉誘發(fā)的犬急性心力衰竭有明顯的保護(hù)作用，可增加MAP、LVSP、±dp/dt max、HR、CO，降低LVEDP，從而增強(qiáng)心功能。與參麥比較起效快。
(2)人參皂甙Rg2對豚鼠離體乳頭肌作用的影響取豚鼠用木棒猛擊頭部，迅速取出心臟，用KH液洗去血液，取出乳頭肌，將其底部固定于刺激電極上，腱索端用蛙心夾夾住迅速放入浴溫控制在36℃20ml盛有KH液的浴槽中，通以95％O2、5％CO2混合氣體，再將蛙心夾通過換能器連接于二導(dǎo)生理記錄儀上，穩(wěn)定30～60min后開始進(jìn)行試驗。每次加藥后待收縮幅度恒定后(4～5min)，直至收縮幅度不再增大甚至縮小或出現(xiàn)自動節(jié)律性為止，再加第二個濃度。
溶媒組、哇巴因組及人參皂甙Rg2正常KH液組(以下稱正常人參皂甙Rg2組)，待乳頭肌收縮穩(wěn)定后，向浴槽內(nèi)分別加入用KH液配制的同體積，不同濃度的哇巴因，人參皂甙及溶媒。
人參皂甙Rg2低鈣KH液組(以下簡稱低鈣人參皂甙Rg2組)，待乳頭肌在正常KH液中穩(wěn)定后，換低鈣KH液，此時收縮幅度逐漸縮小，穩(wěn)定后向浴槽內(nèi)加入用低鈣KH液配制的同體積，不同濃度的人參皂甙Rg2，按以下公式計算張力增加百分率張率增加百分率=給藥后收縮幅度/給藥前收縮幅度×100％從表8，

圖1可以看出，人參皂甙Rg2對正常KH液中豚鼠乳頭肌的收縮幅度有一定的增強(qiáng)作用，Rg2濃度在2.11×10-3mmol·L-1時作用最強(qiáng)，之后便不再增加。人參皂甙Rg2能明顯增加低鈣KH液中豚鼠乳頭肌的收縮幅度，且與濃度增加呈較好的量效關(guān)系。低鈣人參皂甙Rg2的回歸曲線方程為Y=32.32X+134.902，求得ΔFC=(50％濃度)2.37×10-3mmol·L-1，從圖1讀得ΔFc max=188.7±55.1％。溶媒組有降低收縮幅度的趨勢。
從表9、圖2可以看出，哇巴因能明顯增強(qiáng)豚鼠乳頭肌收縮力，其收縮幅度隨藥物濃度的增加而增大，哇巴因的回歸曲線方程為Y=106.09X+762.679，求得ΔFC=(50％濃度)1.91×10-7mmol·L-1，從圖2讀得ΔFc max=235.7±57.6％。
結(jié)果表明，在正常KH液中，哇巴因?qū)θ轭^肌的作用強(qiáng)度超過人參皂甙Rg2；在低鈣KH液中，人參皂甙Rg2對乳頭肌收縮幅度有明顯的增加作用。
(3)人參皂甙Rg2對培養(yǎng)心肌細(xì)胞搏動幅度的影響實驗參照Harary等建立的方法培養(yǎng)心肌細(xì)胞，取出生后2～4天大白鼠乳鼠，分離心室肌，用胰蛋白酶消化、分離心肌細(xì)胞，用Eagle培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2天，待細(xì)胞出現(xiàn)同步化搏動時進(jìn)行實驗。
本實驗心肌細(xì)胞缺氧缺糖模型，采用無糖Hank’s液培養(yǎng)基氮?dú)怙柡头ǎ茉囁幬餄舛确謩e為人參皂甙Rg20.05、0.025、0.0125mmol·L-1；哇巴因1mmol·L-1；參麥注射液0.4g生藥·L-1正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞與藥物溫孵時間4h，缺氧缺糖心肌細(xì)胞與藥物溫孵時間6h，已錄給藥前后搏動幅度變化百分率(％)。
結(jié)果人參皂甙Rg2在所用濃度下對正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞搏動幅度均無明顯影響，而參麥注射液增加19.3％，哇巴因增加30.4％；但人參皂甙Rg2對缺氧缺糖心肌細(xì)胞有明顯增加搏動幅度的作用，分別為72.8％、48.2％、32.4％，而參麥和哇巴因分別增加18.1％和32.4％。
以上結(jié)果表明，人參皂甙Rg2僅對缺氧缺糖的心肌細(xì)胞有增加搏動幅度的作用，而對正常心肌作用不明顯，這點(diǎn)與哇巴因有所不同。
(4)人參皂甙Rg2對去膜心肌肌原纖維Ca2+敏感性的影響去膜心肌肌原纖維制備及Ca2+·Mg2+-ATP酶活性測定參照Alous(1988)和Pagen(1984)等建立的方法，取犬心臟，勻漿，離心，取沉淀物加入Buffer溶液，反復(fù)離心，最終取沉淀物，用Buffer液調(diào)整蛋白含量為5mg·L-1。取制備好的肌原纖維蛋白液加入反應(yīng)液和受試藥物，30℃下溫育10min，加入4mM的ATP啟動反應(yīng)，10min后加入1ml 15％的TAC終止反應(yīng)。離心，取上清液用Bonting法測釋放的無機(jī)磷(Pi)含量。單位以umol Pi·mg-1·h-1表示。
圖3所示，人參皂甙Rg20.1mmol·L-1能使去膜心肌肌原纖維活性升高，使酶活性-pCa曲線向左上方移位，即認(rèn)為該藥有Ca2+增敏作用。
預(yù)防和治療心肌缺血實驗依據(jù)(1)人參皂甙Rg2冠脈結(jié)扎犬心外膜電位、血清心肌三酶及心肌梗塞面積的影響實驗方法請見“對心源性休克犬血流動力學(xué)的影響”一項，冠脈結(jié)扎手術(shù)完畢后，放置多點(diǎn)電極，記錄心外膜電位(EECG)，同時測定血流動力學(xué)各指標(biāo)，并由動、靜脈取血測AST(谷草轉(zhuǎn)氨酶)、CK(肌酸激酶)、LDH(乳酸脫氫酶)活性。實驗6 h剖取心臟，按NBT染色法測定心肌梗塞而積，以心外膜電位ST段升高總mv數(shù)(∑-ST)和ST段抬高)2mv電極數(shù)(N-ST)為心肌缺血程度和范圍。觀察iv受試藥物在不同時間的作用。
表10所示，人參皂甙Rg2及生脈注射液均能明顯減小N-ST和減輕∑-ST。由表11可見，人參皂甙Rg2對心肌三酶和梗塞面積有明顯的降低和減小作用，但生脈注射液的作用強(qiáng)度不及Rg2。
(2)人參皂甙Rg2對異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血的影響取大鼠，按表12所示劑量iv受試藥物，對照組iv等體積溶媒，同時各組均ip異丙緊上腺素2mg·kg-1，每日1次，連續(xù)3次，分別測給藥前及末次給藥后不同時間心電圖，并部取心臟，檢查其壞死面積，以J點(diǎn)偏移和心肌壞死面積作為心肌缺血指標(biāo)，觀察所試藥物的作用，結(jié)果見表12。
結(jié)果表明，人參皂甙Rg2能明顯改善異丙腎上腺素所致的心電異常，能明顯縮小心肌壞死面積。
(3)人參皂甙Rg2對垂體后葉素所致大鼠心肌缺血的影響取大鼠，連接11導(dǎo)聯(lián)心電機(jī)，按表13所示劑量iv受試藥物，對照組iv等體積溶媒，10分鐘后各組均iv垂體后葉素0.5u·kg-1，記錄給藥前、給約后不同時間心電圖，以J點(diǎn)偏移作為心肌缺血指標(biāo)，結(jié)果見表13。
結(jié)果人參皂甙Rg2能明顯改善由垂體后葉素所致心電圖異常，表明該化合物有明顯的抗冠狀動脈痙攣性心肌缺血的作用。(4)參皂甙Rg2對大鼠冠脈結(jié)扎誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。
取SD雄性大鼠25只，均分5組①假手術(shù)組(左冠狀動脈穿線不結(jié)扎)、②溶媒對照組(左冠狀動脈結(jié)扎前3h iv 1m·kg-1溶媒)，③缺血再灌組(結(jié)扎前3h iv 1ml·kg-1溶媒，結(jié)扎后30min后松開結(jié)扎線，恢復(fù)血流20min)，④人參皂甙Rg21.0mg·kg-1、2.0mg·kg-1(結(jié)扎前3 h分別iv Rg21.0mg·kg-1、2.0mg·g-1其余同③)。實驗結(jié)束后迅速取出心臟，采用TUNEL檢測，流式細(xì)胞檢測和DNA瓊脂糖電泳法觀察受試藥物對心肌細(xì)胞調(diào)亡的保護(hù)作用。
TUNEL檢測結(jié)果表明，假手術(shù)組和溶媒對照組凋亡細(xì)胞數(shù)為6％左右，而缺血再灌組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，達(dá)21％左右，人參皂甙Rg21.0mg·kg-1組和2.0mg·kg-1組凋亡細(xì)胞分別為15％和8％，與缺血再灌組比較差異顯著，見圖4。
流式細(xì)胞檢測表明，缺血再灌2h后，缺血再灌組在DNA直方圖上呈典型的凋亡峰(AP峰)占41.5％，假手術(shù)組AP峰僅占9.2％，見圖5。
瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，缺血再灌2h，缺血再灌組可見明顯的DNA梯度條帶(相當(dāng)于180～200Dp的整數(shù)倍)，提示有DNA斷裂和細(xì)胞凋亡，而假手術(shù)組僅在點(diǎn)樣處出現(xiàn)基因組條帶，人參皂甙Rg2 1.0mg·kg-1和2.0mg·kg-1組梯度茶帶明顯減弱，見圖6。
總之，人參皂甙Rg2對缺血再灌注時心肌細(xì)胞凋亡、DNA斷裂均有明顯的保護(hù)作用。
治療腦梗塞實驗依據(jù)(1)人參皂甙Rg2對小鼠全腦缺血的影響①人參皂甙Rg2對小鼠斷頭張口喘氣時間的影響取昆明種小鼠50只，均分5組，按表14所示劑量iv受試藥物，10min后斷頭，立即按秒表記錄小鼠斷頭至張口喘氣停止時間，以該時間長短作為腦缺血指標(biāo)，結(jié)果見表14。
結(jié)果表明，人參皂甙Rg2能明顯延長小鼠斷頭張口喘氣時間。
②人參皂甙Rg2對小鼠斷頭腦組織CK、LDH的影響取昆明種小鼠60只，均分5組，按表15所示劑量給iv受試藥組，10min后斷頭，斷頭后15Sec立即取腦，迅速稱重，以10倍量的冷生理鹽水勻漿，3000Pr/min離心5min，取上清液，按肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH-L)試劑盒說明書方法用荷蘭Ⅱ型半自動生化分析儀測CK及LDH含量，結(jié)果見表15。
結(jié)果，對缺血腦組織肌酸激酶(CK)含量有明顯的降低作用，而對乳酸脫氫酶(LDH)含量僅Rg22.0mg·kg-1有降低作用，表明，人參皂甙Rg2對小鼠全腦缺血有明顯的保護(hù)作用。
(2)人參皂甙Rg2對缺血性腦損傷的影響取體重250～270g的SD雄性大鼠66只，均分以下11組正常對照組，溶媒加缺血3h、4h、5h、6h等4組，Rg22.0mg·kg-1加缺血3h、4h、5h、6h等4組，缺血6h加Rg21.0mg·kg-1和缺血6h加Rg22.5mg·kg-1組。溶媒及Rg2均于腦缺血前3h預(yù)先靜脈給藥。
除正常對照組外，其余大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，切開頸部止中線，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)，將制備好的3-0號栓線(U.S.A)自ECA殘端插入，經(jīng)ICA進(jìn)入大腦前動脈，以阻塞大腦中動脈血流。術(shù)后以出現(xiàn)典型Honer征(動脈軀體左轉(zhuǎn)，左前肢偏癱)為模型成功的標(biāo)志。實驗結(jié)束后迅速取腦，分別做如下處理采用TTC染色觀察腦梗塞面積，結(jié)果見圖7，圖8。
采用DNA瓊脂糖電泳觀察DNA裂解，結(jié)果見圖9。
采用流式細(xì)胞檢測(FCM)觀察凋亡峰(AP峰)，結(jié)果見圖10。
結(jié)果，大鼠腦缺血6h經(jīng)TTC染色顯示正常腦組織為紅色，而右側(cè)大腦中動脈梗塞6h后腦組織為蒼白色，見圖7。
不同時間腦缺血(3h、4h、5h、6h)梗塞面積隨時間的延長而增大，如果預(yù)先ivRg22.0mg·kg-1，則上述梗塞面積明顯縮小，見圖8A。不同劑量Rg2(1.0、2.0、2.5mg·k-1)可以明顯減小缺血6h誘發(fā)的腦梗塞面積，并隨Rg2劑量的增加，梗塞面積減小，見圖8B。
瓊脂糖電泳結(jié)果顯示腦缺血6h凋亡梯度條帶明顯，預(yù)先ivRg2(1.0、2.0mg·kg-1)后，凋亡梯度條帶消失，見圖9。
流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示腦缺血6h后，凋亡(AP)峰明顯，預(yù)先Rg2(1.0、2.0mg·kg-1)后AP峰明顯減弱，結(jié)果見圖10。
(3)人參皂甙Rg2對體外培養(yǎng)小腦顆粒神經(jīng)元的保護(hù)作用①小腦顆粒神經(jīng)元培養(yǎng)及凋亡模型取新生7天的SD大鼠乳鼠，無菌斷頭取小腦，鏡下除去血管和腦膜，剪成小塊，用0.06％胰酶消化15min，加入胰酶抑制劑和血清終止消化，收集細(xì)胞懸液，離心(1500rpm,5min)棄上清液，沉淀加入BME和Eegle′s培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度106個·ml-1，種植在預(yù)先鋪有多聚賴氨酸的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h后加入Ara-C抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，7d后用于實驗。
缺氧缺糖誘發(fā)凋亡模型取培養(yǎng)7d的神經(jīng)細(xì)胞，培養(yǎng)液換用無糖Eagle培養(yǎng)基，放置含95％N2+5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)6h后作為凋亡模型用于實驗。
低鉀誘導(dǎo)凋亡模型取培養(yǎng)7d神經(jīng)細(xì)胞(25mM Kcl)，丟培養(yǎng)液，加入含5mM KCl的DME/F12培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)16h后，做為紙鉀誘發(fā)凋亡模型用于實驗。
Hoechest 33258熒光染色參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行，Hoechest 33258(8μg/ml)，具體方法略。
DNA瓊脂糖電泳方法略結(jié)果光鏡和相差顯微鏡下顯示正常神經(jīng)元胞體橢圓，突起清晰缺氧缺糖6h后胞體縮小，軸突斷裂或消失，給予人參皂甙Rg220μg和40μg預(yù)處理后細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，結(jié)果見圖11、12。
Hoechast 33258熒光染色顯示缺氧缺糖6h后可見大量凋亡小體，核裂群，給予不同濃度人參皂甙Rg2后調(diào)亡小體(白色)明顯減少，并且此作用與劑量呈正比，結(jié)果見Hoechest33258染色圖13.14。
DNA電泳結(jié)果顯示不同濃度的人參皂甙Rg2可明顯減少氧缺糖6h誘發(fā)的DNA裂群，給藥后凋亡梯度條帶消失。結(jié)果見圖15、16。
在低鉀誘導(dǎo)神經(jīng)凋亡模型中必現(xiàn)不同濃度的人參皂甙Rg2尚可拮抗低鉀誘發(fā)的神經(jīng)元損傷，結(jié)果見熒光染色和DNA電泳。
溶血試驗將人參皂甙Rg2配成0.5％溶液，按藥典方法配制紅細(xì)胞懸液，加樣，37℃恒浴，結(jié)果3h內(nèi)各管均無溶血。
急性毒性試驗取小鼠60只，18～20g，雌雄各半，禁食不禁水12h，室溫15～18℃,iv人參皂甙Rg2，觀察7日內(nèi)動物死亡數(shù)，按Biss法計算LD50，結(jié)果人參皂甙Rg2小鼠LD50為330.06±19.17mg·kg-1。
圖1為人參皂甙Rg2及溶媒對豚鼠離體乳頭肌收縮幅度的影響圖。
圖2為哇巴因?qū)﹄嗍箅x體乳頭肌收縮幅度的影響圖。
圖3為人參皂甙Rg2對pCa和鈣、鎂-ATP酶活性反應(yīng)曲線的影響圖。
圖4為人參皂甙Rg2對大鼠冠脈結(jié)扎誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，采用TUNEL檢測法的檢測圖。
圖5、為人參皂甙Rg2對大鼠冠脈結(jié)扎誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，采用流式細(xì)胞檢測法的檢測圖。
圖6為人參皂甙Rg2對大鼠冠脈結(jié)扎誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，采用DNA瓊脂糖電泳檢測法的檢測圖。
圖7為TTC染色腦梗塞模型圖。
圖8為人參皂甙Rg2對腦梗塞面積的影響圖。
圖9為人參皂甙Rg2對缺血性腦損傷的影響，采用DNA瓊脂糖電泳法的檢測圖。
圖10為人參皂甙Rg2對缺血性腦損傷的影響。采用流式細(xì)胞檢測法的檢測圖。
圖11為人參皂甙Rg2對體外培養(yǎng)小腦顆料神經(jīng)元的保護(hù)作用，采用相差顯微鏡檢測法的檢測圖。
圖12為人參皂甙Rg2對體外培養(yǎng)小腦顆料神經(jīng)元的保護(hù)作用，采用光顯微鏡檢測法的檢測圖。
圖13、14為人參皂甙Rg2對體外培養(yǎng)小腦顆料神經(jīng)元的保護(hù)作用，采用Hoechest33258熒光染色檢測法的檢測圖。
圖15、16為人參皂甙Rg2對體外培養(yǎng)小腦顆料神經(jīng)元的保護(hù)作用，采用DNA瓊脂糖電泳檢測法的檢測圖。
6、本發(fā)明實施方法人參皂甙Rg2可與相應(yīng)藥用載體結(jié)合制備成各種劑用于休克、心肌缺血及腦缺血治療。其實施方法如下表
表1 人參皂甙Rg2對急性缺血性心源性休克犬血流動力學(xué)的影響(n=5,X±SD)
與對照組比較 * P＜0.05,* * P＜0.01,* * * P＜0.001
表2 人參皂甙Rg2對內(nèi)毒素休克家兔心功能的影響(n=6,X±SD)
與溶媒組比較 * P＜0.05,* * P＜0.01
表3 人參皂甙Rg2對內(nèi)毒素所致家兔微循環(huán)障礙的影響
與對照組比較* P＜0.05* * P＜0.01
表4 人參皂甙Rg2對失血性休克犬血流動力學(xué)的影響(n=5,X±SD)
與對照組比較*P＜0.05 * * P＜0.01 * * * P＜0.001
表5．人參皂甙Rg2對失血性休克犬血清LPO、SOD的影響(n=5,X±SD)
注與對照組比較* P＜0.05 * * P＜0.01 * * * P＜0.001
表6．人參皂甙Rg2對失血性休克犬存活率和總放血量的影響
注與對照組比較 * P＜0.05 * * P＜0.01
表7 人參皂甙Rg2對戊巴比妥鈉所致心力衰竭及休克犬血流動力學(xué)的影響(n=5,X±SD)
與對照組比較 * P＜0.05,* * P＜0.01,* * * P＜0.001
表8 人參皂甙Rg2及溶媒對豚鼠離體乳頭肌收縮幅度的影響(n=10) 表9 哇巴因?qū)﹄嗍箅x體乳頭肌收縮幅度的影響(n=10,X±SD)
表10 人參皂甙Rg2對急性心肌缺血犬心外膜電流的影響(n=5,X±SD)
與對照組比較 * P＜0.05,* * P＜0.01 * * * P＜0.001
表11人參皂甙Rg2對急性缺血犬血清心肌三酶及梗塞面積的影響(n=5,X±SD)
與對照組比較 * P＜0.05,* * P＜0.01,* * * P＜0.001
表12．人參皂甙Rg2對異丙腎上腺素致大鼠心肌缺血的影響(X±SD)
注與對照組比較* P＜0.05,* * P＜0.01,* * * P＜0.001
表13．人參皂甙Rg2對垂體后葉素所致大鼠心肌缺血的影響(X±SD)
注與對照組比較 * P＜0.05 * * * P＜0.01 * * * P＜0.001
表14人參皂甙Rg2對小鼠斷頭張口喘氣時間的影響(X±SD)
與對照組比較 * P＜0.05,* * P＜0.01
表15 人參皂甙Rg2對小鼠斷頭腦組織CK、LDH的影響
與對照組比較 * P＜0.05,* * P＜0.01,* * * P＜0.00權(quán)利要求
1.用人參皂甙Rg2(包括混合或單一構(gòu)型)制備抗體克、抗心衰、抗心肌缺血、抗腦缺血(厥脫、胸痹、中風(fēng))及抗老年性癡呆的新藥(包括中西藥復(fù)方制劑)，
2.根據(jù)權(quán)力要求書1、藥物的制型是注射劑(粉針劑和溶液注射劑)、片劑(糖衣片和薄膜衣片)、膠囊劑(普通和微型膠囊)、氣霧劑、栓劑(肛門和陰道栓)、口粘膜貼劑、口嚼片、糖漿劑及其他口服液等各種劑型。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥有效成分醫(yī)藥新用途。人參皂甙Rg
文檔編號A61K31/7042GK1309969SQ0110211
公開日2001年8月29日 申請日期2001年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月31日
發(fā)明者李龍云, 田建明, 金毅 申請人:吉林省中醫(yī)中藥研究院, 吉林省復(fù)生藥業(yè)有限公司