專利名稱：一種甲狀旁腺激素類似物及其重組制備的制作方法
本專利涉及一種甲狀旁腺激素類似物的蛋白質(zhì)氨基酸序列、重組制備以及用途。
甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)是體內(nèi)最重要的調(diào)鈣激素，通過(guò)骨骼、腎臟和小腸三個(gè)主要靶器官調(diào)節(jié)血鈣平衡，直接或間接影響鈣離子在細(xì)胞內(nèi)外及細(xì)胞器與胞漿之間的流動(dòng)，從而發(fā)揮鈣在各種細(xì)胞功能和代謝活動(dòng)中的重要作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)PTH具有成骨作用，尤其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中發(fā)現(xiàn)PTH可有效恢復(fù)骨質(zhì)疏松患者所失去的無(wú)機(jī)骨質(zhì)。
PTH在體內(nèi)最初合成時(shí)，是一個(gè)含115個(gè)氨基酸的前體前甲狀旁腺激素原(PreproPTH)，其N末端25個(gè)氨基酸的引導(dǎo)肽(Pre部分)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被立即水解，形成90個(gè)氨基酸的無(wú)活性激素原(ProPTH)，后者又在高爾基體內(nèi)切去N端6肽(Pro部分)，最終形成成熟的PTH。成熟的PTH為含84個(gè)氨基酸的單股多肽鏈，分子量9600道爾頓。在低鈣條件下，PTH從甲狀旁腺釋放。血中的PTH主要以三種形式存在完整PTH(iPTH)、N端1-34肽段[PTH(1-34)]及C端56-84肽段(cPTH)。iPTH和PTH(1-34)均有通過(guò)骨骼和腎臟等靶器官調(diào)節(jié)機(jī)體血鈣濃度的完全生物活性，主要受體結(jié)合位點(diǎn)在N端1-6肽段，切除后會(huì)導(dǎo)致全部活性的喪失。cPTH占循環(huán)PTH的80％左右，半衰期較長(zhǎng)，但沒(méi)有生物活性。
構(gòu)效關(guān)系研究表明，PTH(1-34)包含了在各種測(cè)定系統(tǒng)中表現(xiàn)全部生物活性的所有必需結(jié)構(gòu)，N端氨基酸為活性所必需，將其去除后PTH的生物活性明顯下降甚至完全喪失。如3-34肽段雖不表現(xiàn)活性，但含有與受體結(jié)合的必要結(jié)構(gòu)并攜帶由代謝酶所識(shí)別的信息。同時(shí)，由于PTH(1-34)較短，體內(nèi)代謝較iPTH快，符合天然激素作用特性。因此，PTH(1-34)在一定程度上可以完全取代iPTH而成為醫(yī)用甲狀旁腺激素的選擇PTH在醫(yī)藥市場(chǎng)上有巨大的價(jià)值，用于治療多種原因引起的骨質(zhì)疏松及甲狀旁腺功能減少等疾病。美國(guó)的NPS公司用大腸桿菌表達(dá)并生產(chǎn)的iPTH[即PTH(1-84)]已經(jīng)進(jìn)入三期臨床試驗(yàn)，其結(jié)果證明了該藥明確的安全性和有效性。國(guó)內(nèi)外已有多家研制單位應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)開(kāi)發(fā)PTH(1-34)，以美國(guó)、日本和英國(guó)為主的臨床研究結(jié)果表明，PTH(1-34)在治療骨質(zhì)疏松和甲狀旁腺機(jī)能減退癥療效方面顯示出與iPTH同樣的作用。
由于PTH(1-34)為短肽類激素，未見(jiàn)用酵母體系進(jìn)行重組制備的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，目前的研制單位均用大腸桿菌融合表達(dá)體系進(jìn)行。融合表達(dá)的重組蛋白必須經(jīng)過(guò)相應(yīng)的蛋白酶酶切后才能得到目的蛋白。文獻(xiàn)中用于大腸桿菌融合表達(dá)PTH(1-34)的蛋白酶主要有Thrombin、Factor Xa、KEX2、DDP等，通過(guò)一定特異性識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行有效的酶切而獲得重組PTH(1-34)，但在其N末端不可避免地留下1到2個(gè)多余的氨基酸，從而造成結(jié)構(gòu)的變化和生物活性的下降。由于基因工程產(chǎn)品的特點(diǎn)，特別是在進(jìn)行融合表達(dá)目的蛋白時(shí)，需要考慮融合蛋白的特性、工程菌對(duì)融合蛋白的適應(yīng)能力、最后純化時(shí)所選擇蛋白酶的可能范圍以及蛋白酶酶切后對(duì)目的蛋白氨基酸序列的影響等。本發(fā)明的目的在于建立一種氨基酸數(shù)量和結(jié)構(gòu)、生物活性和產(chǎn)率穩(wěn)定的重組PTH類似物制備方法。通過(guò)對(duì)氨基酸的序列和結(jié)構(gòu)分析，對(duì)PTH(1-34)N末端第1位氨基酸Ser進(jìn)行包括Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Thr在內(nèi)的中性氨基酸同源替代，第26位替代成Gln、Asn，使其在工程菌中的穩(wěn)定性和產(chǎn)量得到明顯的提高，同時(shí)在選用特殊的融合表達(dá)體系時(shí)更有利于操作控制。
在本發(fā)明的實(shí)例中有對(duì)PTH(1-34)N末端第1位和第26位氨基酸分別改造為Gly1、Gln26的具體說(shuō)明。由于EK酶的識(shí)別位點(diǎn)為Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓，TEV酶的識(shí)別位點(diǎn)為Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-↓Gly(↓為酶切位點(diǎn))，這兩種酶作用后均可在目的蛋白的N末端留下Gly，便于表達(dá)后目的蛋白的獲得且不影響其生物活性，終產(chǎn)物重組PTHa的N末端與理論設(shè)計(jì)完全一致，不含有多余的氨基酸。天然型PTH第25、26、27位氨基酸分別為Arg25-Lys26-Lys27，該序列在表達(dá)PTHa的宿主菌中被其體內(nèi)的yscF蛋白酶識(shí)別并在Lys26-Lys27間切割(酵母表達(dá)系統(tǒng)更加明顯)，使PTH的穩(wěn)定性及含量顯著下降，回收率低。因此，本專利將天然型PTH第26位氨基酸替換為Gln或Asn，有效地避開(kāi)蛋白酶的切割。經(jīng)過(guò)生物活性、免疫印跡、蛋白含量和分子量測(cè)定證明，改造后的1-34PTH(Gly1Gln26)融合表達(dá)體系可按照設(shè)計(jì)通過(guò)EK酶和TEV酶酶切后純化，生物活性與天然PTH(1-34)完全一致。實(shí)例一甲狀旁腺激素類似物PTHa[1-34PTH(Gly1Gln26)]基因的獲得1-34PTH(Gly1Gln26)(以下簡(jiǎn)稱PTHa)的氨基酸序列如下Seq 1(PTHa蛋白質(zhì)的氨基酸序列)Gly-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-AsnSer-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Gln-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe。
在合成基因序列時(shí)根據(jù)氨基酸的密碼子簡(jiǎn)并原則和大腸桿菌偏愛(ài)型密碼子原則，設(shè)計(jì)的模板單鏈如下(102bp)Seq 2(PTHa基因單鏈模板序列)5’GGT GTT TCC GAA ATC CAG TTG ATG CAT AAC TTG GGT AAA CAT TTG AACTCC ATG GAG AGA GTT GAA TGG TTG AGA CAA AAG TTG CAG GAT GTT CACAAT TTT3’。
可根據(jù)不同的融合表達(dá)需要設(shè)計(jì)引物1.用于煙草蝕刻病毒蛋白酶(TEV)酶切的DsbA融合表達(dá)PTHa的PCR引物設(shè)計(jì)Seq 3(正向引物的核苷酸序列，65bp)5’TA GGA TCC TTA GGC ATT GAC ACA ACC GAA AAC CTG TAC TTT CAAGGT GGT GTT TCC GAA ATC CAG 3’(引入BamH I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，TEV蛋白酶的Spacer和酶切位點(diǎn))。
Seq 4(反向引物的核苷酸序列，38bp)5’AT GAA TTC TAA TAG AAA ATT GTG AAC ATC CTG CAA CTT 3’(引入EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和2個(gè)終止密碼子)2.用于腸激酶(EK)酶切的GST融合表達(dá)PTHa的PCR引物設(shè)計(jì)Seq 5(正向引物的核苷酸序列，41bp)5’TA GGA TCC GAC GAT GAC GAT AAG GGT GTT TCC GAA ATC CAG 3’(引入BamH I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和EK蛋白酶酶切位點(diǎn))。
Seq 6(反向引物的核苷酸序列，38bp)5’AT GAA TTC TAA TAG AAA ATT GTG AAC ATC CTG CAA CTT 3’(引入EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和2個(gè)終止密碼子)以上2對(duì)引物分別和單鏈模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)5％的變性PAGE電泳檢驗(yàn)，得到一條150bp左右含相應(yīng)蛋白酶切位點(diǎn)的PTHa基因片段。實(shí)例二重組PTHa融合表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)1.用于TEV酶切的DsbA融合表達(dá)PTHa載體的構(gòu)建及工程菌的獲得用Seq3和Seq4引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用BamHI和EcoRI雙酶切后，與BamHI和EcoR I雙酶切后的pFG925質(zhì)粒用在14℃用T4連接酶進(jìn)行連接，重組質(zhì)粒命名為pFG925-PTHa(

圖1)。然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，涂布在含有50ug/ml氨芐青霉素和35ug/ml氯霉素的SOB平板，挑選陽(yáng)性菌落在SOB中培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)加入IPTG 1.0mM誘導(dǎo)3-4小時(shí)離心收集菌體，8M尿素破菌后10％SDS-PAGE電泳時(shí)出現(xiàn)一條52KD左右的蛋白帶，表達(dá)量為45-50％。經(jīng)天然型PTH(1-34)的單克隆抗體(DSL產(chǎn)品，美國(guó))免疫印跡檢定，顯示陽(yáng)性反應(yīng)。所獲得的高效表達(dá)PTHa的工程菌命名為BL-PTHa。2.用于EK酶切的GS融合表達(dá)PTHa載體的構(gòu)建及工程菌的獲得用Seq5和Seq6引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用BamHI和EcoRI雙酶切后，與BamHI和EcoR I雙酶切后的pGEX-4T-1質(zhì)粒用在14℃用T4連接酶進(jìn)行連接，重組質(zhì)粒命名為pGEX-PTHa(圖2)。然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂布在含有100ug/ml氨芐青霉素的LA平板，挑選陽(yáng)性菌落在LA中培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)加入IPTG 0.5mM誘導(dǎo)3-4小時(shí)離心收集菌體，超聲破菌后10％SDS-PAGE電泳時(shí)出現(xiàn)一條32KD左右的蛋白帶，表達(dá)量為20-25％。經(jīng)天然型PTH(1-34)的單克隆抗體(DSL產(chǎn)品，美國(guó))免疫印跡檢定，顯示陽(yáng)性反應(yīng)。所獲得高效表達(dá)PTHa的工程菌命名為JM-PTHa。實(shí)例三重組PTHa的純化1.DsbA融合表達(dá)PTHa的純化重組PTHa蛋白表達(dá)是采用本公司構(gòu)建的BL-PTHa工程菌來(lái)完成。20LM9CA發(fā)酵后收集菌體，超聲破菌并用6M尿素溶解離心后50mM Tris-HCl(pH8.0)稀釋4倍。樣品通過(guò)Ni+螯合親和層析柱Chelating Sepharose Fast Flow后再用50mM-200mM Imidazone梯度洗脫收集融合蛋白，純度達(dá)90％，經(jīng)TEV酶(GIBCO公司產(chǎn)品)30℃酶切1hr，再通過(guò)Chelating Sepharose Fast Flow除去DsbA蛋白，切下的重組PTHa經(jīng)C8反相層析獲得純度大于95％的重組PTHa。
2.GST融合表達(dá)PTHa的純化重組PTHa蛋白表達(dá)由JM109-PTHa工程菌來(lái)完成。發(fā)酵后發(fā)酵液離心收集菌體，壓力勻漿破菌，收集上清上Glutathione Sepharose層析柱，用還原型谷胱甘肽(GSH)洗下融合蛋白，加入EK酶(Invitrogen I公司產(chǎn)品，美國(guó))37℃酶切2小時(shí)，然后通過(guò)Glutathione Sepharose除去GST蛋白，切下的重組PTHa經(jīng)C8反相層析獲得純度大于95％的重組PTHa。實(shí)例四重組PTHa的生物特性檢測(cè)1.N末端氨基酸序列檢測(cè)以上實(shí)例中的兩種表達(dá)體系及相應(yīng)蛋白酶酶切后經(jīng)純化得到的重組PTHa，N末端15個(gè)氨基酸的測(cè)序結(jié)果均為Gly-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu，與設(shè)計(jì)值一致。2.分子量和純度15％Tricine電泳顯示以上兩種方法所得的重組人PTHa經(jīng)純化后為4K D左右的單一蛋白條帶。用高效液相(HPLC)C18反相柱檢測(cè)分析，本發(fā)明獲得的重組人PTHa純度大于95％。
3.生物活性采用體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定培養(yǎng)的wistar新生大鼠成骨細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶含量確定PTHa的生物活性。取出生24小時(shí)內(nèi)的Wistar大鼠顱骨，去除骨膜及軟組織后用0.05％胰酶和1M膠原酶II在37℃消化2小時(shí)，經(jīng)140目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，1000rpm離心10min，收集細(xì)胞并重懸于含10％胎牛血清的DMEM中，調(diào)整計(jì)數(shù)1×105/ml至細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底。消化1代末細(xì)胞，按4×103/ml加入24孔板，細(xì)胞貼壁后換含10％去類固醇胎牛血清的DMEM，平衡12h后在1、6、12、24、48h加入PTHa，共8個(gè)循環(huán)。之后各孔加50mM二乙醇胺200ul和2.5mM對(duì)硝基酚磷酸鈉100ul，37℃反應(yīng)30min+用0.1M的NaOH100ul終止反應(yīng)。405nm處比色。標(biāo)準(zhǔn)曲線為分別加入0-50ul對(duì)硝基苯酚。
經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明中兩種方法所得的重組PTHa[即1-34PTH(Gly1Gln26)]與Sigma公司PTH(1-34)生物活性相同。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明中甲狀旁腺激素類似物的氨基酸序列是X1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-X2-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe其特征是X1位氨基酸為中性氨基酸，第X2位氨基酸為酰胺類氨基酸。其通式為(1-34)PTH(X11X226)。
2.權(quán)利要求1中甲狀旁腺激素類似物氨基酸序列中X1指Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Thr6個(gè)氨基酸，X2指Gln、Asn。
3.權(quán)利要求1、2中X1主要指Gly，X2主要指Gln。
4.權(quán)利要求1、2、3中的重組甲狀旁腺激素類似物由基因工程重組表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)化、發(fā)酵和純化而制得。
5.權(quán)利要求4中重組載體的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1中的甲狀旁腺激素類似物的臨床應(yīng)用包括骨質(zhì)疏松和甲狀旁腺機(jī)能減退疾病的治療。
全文摘要
甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)在體內(nèi)由甲狀旁腺分泌,是由84個(gè)氨基酸組成的多肽激素,為調(diào)節(jié)機(jī)體血鈣濃度的主要因子。本發(fā)明為一種甲狀旁腺激素的類似物,含有34個(gè)氨基酸,其特征是N末端第1位氨基酸為中性氨基酸,第26位氨基酸為酰胺類氨基酸。本發(fā)明中的重組甲狀旁腺激素類似物(PTHa)由人工合成相對(duì)應(yīng)的基因序列,構(gòu)建重組表達(dá)載體,經(jīng)發(fā)酵和純化而制得,具有與甲狀旁腺激素相同的生物活性。
文檔編號(hào)A61P5/00GK1365984SQ0110291
公開(kāi)日2002年8月28日 申請(qǐng)日期2001年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月19日
發(fā)明者范開(kāi), 黃洪濤, 田峰, 馬素永, 聶李亞 申請(qǐng)人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司