專利名稱：柿葉多糖及其生物活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物多糖提取及它的生物活性，更具體地說(shuō)是柿樹多糖及它的降血糖作用。
諸如肝素之類的多糖在血液系統(tǒng)中具有抗凝血作用是較早被發(fā)現(xiàn)的，它已作為藥物應(yīng)用于臨床。五十年代以后隨著對(duì)糖功能認(rèn)識(shí)的深入，逐步發(fā)現(xiàn)一定結(jié)構(gòu)的多糖對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)有顯著的作用如抗腫瘤作用，抗病毒作用特別是抗艾滋病作用，抗炎作用和抗輻射作用。這些多糖也已有三種作為藥物在國(guó)內(nèi)外臨床上正式使用(非正式使用的還有數(shù)種)。當(dāng)然還發(fā)現(xiàn)某些結(jié)構(gòu)的多糖對(duì)消化道系統(tǒng)也有作用如抗嘔吐、抗?jié)兊?。所有作為藥物而?yīng)用于臨床的多糖最大特點(diǎn)是毒副作用小。另外也有一些多糖具有降血糖活性的報(bào)導(dǎo)，但效果不顯著。由于糖尿病已成為一種常見(jiàn)病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至生命，所以尋找高效低毒的降血糖藥物具有重要的社會(huì)意義及應(yīng)用價(jià)值。
柿樹廣泛分布在我國(guó)河南等北方省份其果實(shí)、柿子是家喻戶曉的，而其樹葉大多作為燃料白白浪費(fèi)掉，本發(fā)明從柿葉中提取多糖并進(jìn)行各種藥理試驗(yàn)表明它具有顯著的降血糖作用和免疫促進(jìn)作用。
本發(fā)明目的是提供一種從植物中提取有效成份對(duì)降血糖具有明顯作用的具副作用小的多糖藥物或保健品。
本發(fā)明是這樣實(shí)施的新鮮的或干燥的柿樹葉子在乙醇中浸泡72小時(shí)以上，取出風(fēng)干，稱取干燥后的柿葉，加10-15倍(w/w)去離子水加熱于沸騰情況下3-8小時(shí)，過(guò)瀘殘?jiān)?，再?-10倍(w/w)去離子水如上法再提取一次，合并二次瀘液，減壓濃縮至原體積的1/15-/20，加入3-5倍乙醇攪拌沉淀，沉淀物經(jīng)離心，真空干燥，得到多糖的粗制品，該粗制品即可作為保健品而應(yīng)用。粗制品經(jīng)水溶解后，對(duì)水透析2天，未透過(guò)液減壓濃縮至原體積的1/10加入3倍乙醇沉淀，取沉淀物溶于水中通過(guò)DEAE-纖維素柱、水及0.2M NaCl分步洗脫，流出液經(jīng)硫酸苯酚法檢測(cè)，取陽(yáng)性部份，合并透析，冷凍干燥，冷凍干燥物溶于水中，上樣于Sephacrgl S-300凝膠柱，0.1M NaCl展層，示差檢測(cè)儀檢測(cè)，合并主峰部分，透析，冷凍干燥。該樣品經(jīng)HPLC檢測(cè)，結(jié)果為一單一對(duì)稱峰，證明該多糖為純品(即均一部分)，該純品可作為藥物而應(yīng)用。
采用多糖分離方法，我們?cè)趪?guó)內(nèi)首先從柿葉中獲得多糖的粗制品(作保健應(yīng)用)及純品(作藥物應(yīng)用)。該多糖不但具有免疫促進(jìn)作用，更重要的是具顯著的降血糖活性，粗品可作為糖尿病患者的保健品，其純品即可作為糖尿病患者的治療藥品。
在生物活性試驗(yàn)中，將PTP1B表達(dá)純化，得到的酶以GST融合蛋白的形式存在。PTP1B水解底物PNPP的磷脂鍵，得到的產(chǎn)物在410nm處有很強(qiáng)的光吸收。因此可以直接檢測(cè)410nm處光吸收的變化以觀察酶的活性變化以及化合物對(duì)其的抑制情況(Zhang，ZY.，Dixon，JE.(1994)Adv.Enzymol.681-36)。標(biāo)準(zhǔn)測(cè)活體系如下10mM Tris.Cl，pH 7.6，10mM PNPP，2％DMSO，200nM PTP1B。結(jié)果分別在濃度為100μg/m(粗品)及10μg/m(純品)對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶PTPIB抑制率達(dá)95％以上，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶PTPIB能夠使磷酸化的胰島素受體發(fā)生去磷酸化，從而在體內(nèi)對(duì)胰島素的作用起到調(diào)節(jié)作用，因此，對(duì)II型糖尿病和肥胖具有治療作用。
免疫活性試驗(yàn)淋巴細(xì)胞在有絲分裂原如PHA，ConA，LPS等的刺激下，細(xì)胞的形態(tài)和代謝可發(fā)生一系列的變化，轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞，并分化增殖。以MTT法定量測(cè)定細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)加入LPS(脂多糖)10μg/ml誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示濃度分別為0.01mg/ml(粗品)及0.01mg/ml(純品)其對(duì)B淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)的均屬顯著(P＜0.01)，上述多糖粗品及純品經(jīng)小鼠LD50試驗(yàn)其小鼠口服最大耐受量均大于8g/kg，由此結(jié)論，粗品及純品不但均具顯著生物活性，而且無(wú)毒副作用，可以單獨(dú)或者復(fù)合作保健品，或進(jìn)一步作為藥物應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.柿葉來(lái)源廣泛，變廢為寶，由原來(lái)丟棄或作燃料變?yōu)楸＝∑坊蛩幬铩?br> 2.提取工藝簡(jiǎn)便，成本低廉。
實(shí)施例新鮮柿葉在乙醇中浸泡72小時(shí)，取出，自然通風(fēng)干燥，稱取1Kg干燥之柿葉，加入10l去離子水，加熱沸騰4小時(shí)，過(guò)濾得瀘液，瀘渣再加10l去離子水，加熱沸騰4小時(shí)過(guò)瀘得第二次瀘液，合并二次瀘液，減壓濃縮到800ml，在攪拌下，徐徐加入3倍量90％7醇，獲得沉淀，沉淀物經(jīng)離心，于真空干燥箱內(nèi)(＜60℃)干燥24小時(shí)，取出，粉碎即得到可作保健品應(yīng)用的多糖28g。
取上述粗制品多糖10g溶于去離子水(100ml)中，對(duì)去離子水透析2天，取出透析袋內(nèi)未透過(guò)液，濃縮至100ml上，DEAE-纖維素柱層析，0.2MNaCl洗脫，取流出液糖反應(yīng)陽(yáng)性部分，合并，對(duì)蒸留水透析二天，未透過(guò)液濃縮至10ml上Sephacrgl S-300柱，0.1M NaCl展層，合并有效部位，透析2天減壓濃縮，然后冷凍干燥，得純品254mg。降血糖試驗(yàn)取上述粗制品及純品分別溶于水中，使成濃度為100μg/ml及10μg/ml，觀察其對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯的抑制率結(jié)果發(fā)現(xiàn)其抑制率分別為99％及95％，該實(shí)驗(yàn)所用的磷酸酯PTPIB是從大腸桿菌中表達(dá)并純化，實(shí)驗(yàn)中采用陽(yáng)性參照藥物為2μM的正釩酸鈉。
權(quán)利要求
1.一種由柿葉提取的多糖，其特征在于由柿葉在乙醇中浸泡，然后風(fēng)干，加入去離子水，加熱至沸騰3-8小時(shí)，過(guò)濾、殘?jiān)儆萌ルx子水提取一次，合并濾液，減壓濃縮到小體積，加入3-5倍乙醇攪拌、沉淀，沉淀物離心，再溶于水中對(duì)水透析48小時(shí)，未透過(guò)液減壓濃縮至原體積的1/10，再加入乙醇沉淀，沉淀物溶于水中通過(guò)DEAE-纖維素柱，用水及稀NaCl分步洗脫，流處液經(jīng)硫酸苯酚法檢測(cè)，取陽(yáng)性部分，合并透析液冷凍干燥。冷凍干燥物溶于水中，上樣于Sephacrgl凝膠柱，用稀NaCl展層，示差檢測(cè)儀檢測(cè)，合并主峰部分，透析，冷凍干燥，樣品HPLC檢測(cè)，取單一對(duì)稱峰的多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述由柿葉提取的多糖，其特征在于沉淀物通過(guò)DEAE-纖維素柱用水及0.1-0.3M NaCl分步洗脫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述由柿葉提取的多糖，其特征在于冷凍干燥物上樣于Sephacrgl凝膠柱，展開劑為0.1-0.3M NaCl溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述由柿葉提取的多糖，其特征在于由HPLC檢測(cè)樣品取單一對(duì)稱峰的多糖。
5.一種柿葉提取的多糖，其特征在于它對(duì)治療II型糖尿病藥物中應(yīng)用。
6.一種柿葉提取的多糖，其特征在于它對(duì)肥胖病的治療中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種采用由柿葉提取多糖及它的提取方法,該多糖具有免疫促進(jìn)作用對(duì)II糖尿病人具有降糖作用。
文檔編號(hào)A61K31/715GK1371920SQ0110548
公開日2002年10月2日 申請(qǐng)日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月28日
發(fā)明者方積年, 陳林祥 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所