專利名稱：一種來源于動物中藥的生物治療佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種來源于動物中藥的生物治療佐劑。
佐劑(adjuvant)，又叫免疫佐劑，是非特異性的免疫增強劑，佐劑單獨，與抗原一起或先注射入體內(nèi)時，能增強機體對該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答的類型。廣義的佐劑概念包括腫瘤瘤苗，微生物疫苗等，因此，佐劑也可以理解為生物治療制劑或生物應(yīng)答修飾劑。佐劑的種類包括(1)無機佐劑，如氫氧化鋁、明礬；有機佐劑，常用的如分桿菌、短小棒桿菌、百日咳桿菌、革蘭式陽性桿菌的脂多糖等微生物及其產(chǎn)物，從細菌中提取的胞壁酰二肽(MDP)亦屬此類；(2)合成佐劑，人工合成的佐劑如胞壁酰二肽、雙鏈多聚肌苷酸胞苷酸(poly IC)、雙鏈多聚腺苷酸尿苷酸(Poly AU)、脂質(zhì)體、異丙肌苷和左旋咪唑等。(3)混合油脂類佐劑，又分為弗式完全佐劑(CFA)或弗式不完全佐劑(IFA)。CFA由油劑(石蠟油或植物油)和乳化劑(羊毛脂或Tween 80)，再加上卡介苗(或死的分枝桿菌)，與抗原溶液一起制成油包水乳劑。IFA比CFA少卡介苗(或分枝桿菌)成分。(4)新型的佐劑，包括細胞因子如白細胞介素12等生物治療制劑。
佐劑的作用機理主要包括3個方面，首先是對抗原的作用，佐劑吸附抗原后，增加抗原的有效面積，改變抗原的物理性狀，增加抗原在體內(nèi)的滯留時間，維持注射部位抗原的濃度，使抗原與免疫系統(tǒng)能充分接觸。其次是對免疫細胞的作用，包括刺激局部炎癥反應(yīng)，使更多單核-巨噬細胞被激活，增強其攝取、處理和遞呈抗原的能力。佐劑能刺激機體釋放大量的細胞因子、增強機體的免疫功能。促進T、B細胞增殖，增強細胞免疫和抗體生產(chǎn)，產(chǎn)生或增強遲發(fā)型過敏反應(yīng)。再次，佐劑可以改變抗體產(chǎn)生的類型，如用雞卵白蛋白免疫豚鼠一般誘導(dǎo)IgG抗體，與佐劑一起免疫則誘導(dǎo)產(chǎn)生IgM抗體。再次，直接激活機體的免疫細胞，包括抗原提呈細胞，淋巴細胞等，非特異性地增強機體的免疫力。
近年來，佐劑的研究進展很快，佐劑研究的新發(fā)展之一是佐劑給藥系統(tǒng)的發(fā)展。脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)緩釋制劑等給藥系統(tǒng)都可以取得與佐劑相似的免疫增殖作用，但是其毒性較小，應(yīng)用方便。另一進展是細胞因子佐劑作用白細胞介素(interleukin，IL)類的IL-2、IL-1、干擾素g(IFNg)、IL-12、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)都可作為非常好的佐劑，細胞因子與抗原合用，可以更有效的激發(fā)機體的免疫功能，現(xiàn)在細胞因子佐劑已經(jīng)用于瘧原蟲、腫瘤疫苗等研究中。單獨用利什曼原蟲的抗原免疫小鼠，小鼠不能產(chǎn)生有效的保護性免疫，如果將IL-12與利什曼原蟲的抗原一起免疫BALB/c小鼠，結(jié)果小鼠可以產(chǎn)生顯著的保護性細胞免疫。細胞因子的佐劑作用還被廣泛用于腫瘤的基因治療中，將IL-2、GM-CSF、IFN等基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞中，可以大大提高腫瘤細胞的免疫原性，更有效地激發(fā)機體的抗腫瘤免疫，因此，細胞因子將會成為一類新型的、廣泛應(yīng)用的佐劑。
主動免疫一般發(fā)生在自然狀態(tài)下機體被感染復(fù)原之后，也可以利用人工的方法通過接種、食入、吸入經(jīng)改造的微生物或其他免疫原成分，使機體自己更生產(chǎn)生免疫力，稱為主動免疫。那些經(jīng)過改造減毒的微生物或其他具有免疫原性、能誘導(dǎo)機體發(fā)生免疫應(yīng)答的成分稱為疫苗。隨著人們對抗原、表位的本質(zhì)及作用的深入研究，人們可以制備疫苗用于各種感染性疾病、腫瘤的預(yù)防和治療中。機體在正常情況下細胞的分化、增殖和凋亡都在非常精細的調(diào)控和免疫監(jiān)督之下進行，一旦某些細胞逃逸這種調(diào)控和監(jiān)督，就可能生長為腫瘤細胞。此時的腫瘤細胞雖然有許多形態(tài)、理化性質(zhì)的改變，但機體的免疫系統(tǒng)仍然不能識別為″非我″。近百年來，不斷有學(xué)者試圖打破機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的耐受狀態(tài)，開始是卡介苗(BCG)的作用，BCG具有典型的佐劑作用，曾經(jīng)在一些膀胱癌、黑色素瘤病人身上發(fā)揮過一定的治療作用。后來，人們開始制備腫瘤疫苗，簡稱瘤苗，瘤苗是指能夠有效地誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮治療(非預(yù)防)效果的免疫原，不包括一般的生物應(yīng)答修飾劑(BRM)、治療性抗體或抗體靶向的生物導(dǎo)彈。很久以前人們就發(fā)現(xiàn)有些病人如黑色素瘤或腎癌病人，其腫瘤會由于免疫功能的增強而自然消失，因此人們開始意識到機體的免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生抗腫瘤作用。至今，瘤苗研究的發(fā)展十分迅速，有多種瘤苗都產(chǎn)生了非常明顯的臨床療效。人們對瘤苗的作用機理也有了更深入的研究[Pardoll DM.Cancer vaccines.ImmunolToday.1993；14310-5 Cohen J.Vaccines get a new twist.Science，1994；264503-510]。
瘤苗主要作為治療性疫苗應(yīng)用，作為治療性疫苗，進入機體后必須激活免疫系統(tǒng)，特別是細胞免疫[Rabinovich NR，Mclnnes P，Klein DL，Hall BF.Vaccine technologiesView to the future.Science，1994；2651401-1404]。激活的抗腫瘤成分包括(1)、殺傷性T細胞(CTL)CTL細胞可以直接殺傷腫瘤細胞，腫瘤細胞必須借助MHC-I類分子將腫瘤抗原加工提呈給CTL細胞，因為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的限制性，從一個體內(nèi)腫瘤細胞制備的瘤苗不能用于另一個人。(2)、輔助T細胞(Th細胞)單單將腫瘤抗原表位通過MHC-I類分子提呈給CTL細胞還不足以殺傷腫瘤細胞，還需要IL-2的刺激。只有抗原提呈細胞(APC)將抗原表位提呈給輔助T細胞，T細胞才能被激活，釋放IL-2等細胞因子。T輔助細胞極易對腫瘤抗原耐受，因此，還要提呈共刺激分子。Th細胞除了分泌細胞因子，參與腫瘤細胞的殺傷過程之外，本身也可以直接殺傷腫瘤細胞。(3)、細胞因子激活CTL細胞的細胞因子除了Th細胞分泌之外，也可以通過給予外源性細胞因子而達到激活CTL的目的。但是前者的作用是局部的，而全身應(yīng)用細胞因子除了能達到激活CTL的效果外，還可引起不良反應(yīng)，隨著基因治療的研究不斷發(fā)展，可以通過靶向釋放細胞因子的方法解決這個問題。(4)、NK細胞NK細胞具有明顯的抗腫瘤作用，體內(nèi)外可直接殺傷腫瘤細胞，在疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗腫瘤免疫應(yīng)答中，NK細胞具有十分重要的作用。(5)、免疫記憶要使機體在很長的時間內(nèi)對腫瘤保持免疫應(yīng)答、防止腫瘤的復(fù)發(fā)，記憶T細胞具有十分重要的作用。研究表明，只有反復(fù)經(jīng)免疫原如瘤苗刺激的T細胞才具有免疫記憶和殺傷作用。任何疫苗，要充分激活上述的5大成分幾乎是不可能，因為作為疫苗的抗原通常其抗原性特別弱，因此，需要佐劑的輔助。
目前治療腫瘤的疫苗(簡稱瘤苗)的主要類型有(1)、自體滅活瘤苗自體瘤苗一般取自腫瘤病人手術(shù)后切除的腫瘤組織，制成單細胞懸液后經(jīng)放射線或藥物處理，使其失去增殖能力保留免疫原性。自體瘤苗的優(yōu)點是其MHC與機體完全一致，可十分有效地誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答；但是其缺點也十分明顯，要為每個病人制備一份瘤苗，費時、費力，有時等體外把瘤苗制備好，病人早已病死或嚴重惡化。
(2)、用細胞株制備的瘤苗體外將一些腫瘤細胞株制成瘤苗，可以象藥物一樣直接注射到病人體內(nèi)，但是由于瘤苗作為一種異體異物，進入體內(nèi)可能會被機體排斥，抗腫瘤效果也沒有自體瘤苗好。
(3)、分子瘤苗所謂分子瘤苗，包括將提取的腫瘤抗原、合成的腫瘤抗原或重組的腫瘤抗原作為亞單位瘤苗與佐劑一起免疫機體；將編碼腫瘤抗原的DNA直接注射到體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達并發(fā)揮免疫作用；體外將腫瘤細胞進行基因修飾，將細胞因子、共刺激分子B7、MHC分子等基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞，使其致瘤性下降，免疫原性增加，成為新一代的瘤苗，其效果似有待于臨床進一步證明[Colombo MP，F(xiàn)orniG.Immunotherapy.ICytokine gene transfer strategies.Cancer Metastasis Rev1997；16421-432]。
(4)抗獨特抗體瘤苗對于B細胞淋巴瘤來說，瘤細胞表達的獨特型可被認為是其特異性腫瘤抗原，用此獨特型抗原作為瘤苗可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性免疫。象大多數(shù)亞單位抗原或合成多肽一樣，獨特型瘤苗必須與有強烈免疫原性的載體蛋白偶合、與免疫佐劑混合后方能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。將B細胞淋巴瘤獨特型與IL-2、IL-4、GM-CSF制成融合蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使該瘤苗的免疫原性顯著增強，該融合蛋白在不需要任何載體蛋白或佐劑的情況下就能誘導(dǎo)出具有抗腫瘤作用的抗體。以此獨特型抗體可變區(qū)(V region)基因為目地基因，構(gòu)建了表達質(zhì)粒，采用DNA直接注射的方法將此質(zhì)粒DNA經(jīng)肌肉注射免疫小鼠，小鼠體內(nèi)可檢測到抗IgM輕鏈V區(qū)的抗獨特型抗體[Watanabe A，Raz E，Kohsaka H，et al.Induction of antibodies to a V regionby gene immunization.J Immunol.1993；1512871-6]。與此相似，TCR獨特型的基因也可以作為疫苗，用來預(yù)防或治療T細胞淋巴瘤。
(5)、抗原提呈細胞制備的瘤苗抗原提呈細胞包括樹突狀細胞、巨噬細胞、郎罕氏細胞、B細胞等，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有十分重要的作用，其中樹突狀細胞可以直接刺激處女型T細胞增殖活化。近年來應(yīng)用抗原提呈細胞特別是樹突狀細胞和巨噬細胞制備的瘤苗研究發(fā)展迅速，主要有1).腫瘤抗原多肽或腫瘤提取物沖擊致敏的抗原提呈細胞回輸或接種到荷瘤宿主，以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生腫瘤抗原特異性的CTL，用于腫瘤治療。如果將抗原提呈細胞中預(yù)先轉(zhuǎn)入GM-CSF、淋巴細胞趨化因子(Ltn)等細胞因子基因，可以使此種瘤苗的治療效果大大提高[Hsu FJ，Benike C，F(xiàn)agnoni F，et al.Vaccination ofpatients with B-cell lymphoma using antilogous antigen-pulsed dendritic cells.NatMed 1996；252-58]。
2).腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)染的抗原提呈細胞作為瘤苗。因為抗原提呈細胞轉(zhuǎn)染了腫瘤抗原基因，可以省去抗原直接刺激的操作[Gong J，Chen L，Chen D et al.Induction of antigen-specific antitumor immunity with adenovirus-transduceddendritic cells.Gene Ther 1997；41023-1028]。
3).白血病細胞衍生的樹突狀細胞瘤苗。慢性粒細胞白血病細胞和急性早幼粒白血病細胞分別表達BCR-ABL和pml/RAR α融合蛋白抗原，白血病細胞經(jīng)過GM-CSF、IL-4和TNFa培養(yǎng)后可以分化成為攜帶白血病抗原的樹突狀細胞，以此細胞作為瘤苗可以用于腫瘤的免疫治療中[Choudhury A，Gajewski JL，Liang JC，et al.Use of leukemic dendritic cells for the generation of antileukemic cellularcytotoxicity against Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia.Blood 1997；891133-1142 Nieda M，Nicol A，Kikuchi A，et al.Dendritic cellsstimulate the expansion of bcr-abl specific CD8+T cells with cytotoxic activityagainst leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia.Blood1998；91977-983]。
中藥是中華民族的一大寶庫，是中國人民幾千年與疾病斗爭中獲得的巨大資產(chǎn)，隨著科學(xué)技術(shù)的進步，人們對中藥的認識越來越深刻，越來越科學(xué)。其中牛黃在我國應(yīng)用已有二千年的歷史，早在《神宵本草徑》中就視為上品，是著名中草藥如安宮牛黃丸，牛黃清心丸……等的主要原料。牛黃為牛膽囊、膽管或肝管中的結(jié)石，具有清心、化痰、開竅、鎮(zhèn)痛息風(fēng)、解毒等功能。主治熱病頭痛，中風(fēng)痰迷，驚癇抽搐，癲癇發(fā)狂，咽喉腫痛等癥，牛黃是一種稀珍而貴重的中藥材，比黃金更為昂貴，李時珍在《本草綱目》中記載牛黃″能安魂定魄，辟邪魅，卒中惡。″″凡中風(fēng)入臟者，風(fēng)中腑及血脈者必用之。″牛黃能″入骨髓，透肌膚，以引風(fēng)出″，″還能治心及肝膽之病″。″久服輕身延年，令人不忘″?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》就記述過″牛黃是百草之精華，為世神物，諸藥莫及?！蹇梢妼ε｜S的神奇藥用功效的發(fā)現(xiàn)可以追溯到夏商遠古。牛黃即牛的干燥膽結(jié)石。天然牛黃的產(chǎn)量極小，其價格也頗為昂貴，于宰牛時如發(fā)現(xiàn)牛黃，應(yīng)立即濾去膽汁，取出牛黃。除凈外部薄膜，先裹以燈芯草或通草絲，外面再包以白布或毛邊紙，置陰涼處陰干。取自膽囊的習(xí)稱″蛋黃″；取自膽管及肝管的習(xí)稱″管黃″。我們平時所說的牛黃是按牛黃的已知成份，用豬、牛、羊的苦膽提取的膽紅素、膽酸加淀粉配制而成的，即人工合成牛黃。
蛇膽歷來被認為是中醫(yī)中的上品，具有強大的抗炎癥作用，被用來止咳、抗炎等。如蛇膽川貝液就是典型的利用蛇膽的中藥。
目前在佐劑研究領(lǐng)域，還只有氫氧化鋁可以用于人體，其他是佐劑例如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑等因具有明顯的毒性，因此不能用于人體，而細胞因子類的佐劑例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，白細胞介素12等可以作為佐劑使用，但他們本身有更加重要的生物學(xué)活性，如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子可以刺激機體粒細胞和巨噬細胞的大量產(chǎn)生，因此，目前特別缺乏安全有效的佐劑。另一方面，佐劑又是目前各種疫苗，腫瘤主動免疫治療和感染免疫治療所急需的輔助成分，從中藥中尋求安全有效的佐劑無疑具有極其重要的意義，既解決了佐劑研究和需要的困難，同時促進了中藥現(xiàn)代化，科學(xué)化的進程，同時為了解中藥的治病機理提供了依據(jù)。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新型的疫苗，尤其是可用于人體的安全有效的佐劑。
本發(fā)明的目的就是提供一種可用于人體的安全有效的佐劑及其制備方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種佐劑，它是以動物的膽囊、膽汁、膽石、或人造膽石或者其混合物為原料制備的提取物，該提取物不含分子量大于10KD的蛋白質(zhì)，但含有小分子的多肽和氨基酸，并且在紫外掃描圖譜中在215nm處和280nm具有明顯的吸收峰。
較佳地，所述提取物原液用Pierce/硫酸銅試劑盒測定多肽和氨基酸的濃度在300-3000ug/ml。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備佐劑的方法，其特征在于，包括步驟(1)將粉碎的、粉末狀的或液體的原料與醇溶劑在60-90℃(較佳地75-85℃)下混合，其中原料選自下組動物的膽囊、膽汁、膽石、或人造膽石或者其組合，使混合物中醇溶劑終濃度為10-80％(較佳地20-70％)，并放置12小時-14天(較佳地1-7天)；(2)對步驟(1)中所述混合物進行離心，去除固體殘渣，并獲得上清液；(3)對步驟(2)中所述的上清液進行脫色、脫脂處理，經(jīng)萃取回收水相；(4)從步驟(3)中的所述水相去除有毒溶劑成分，從而獲得作為佐劑的提取物。
較佳地，該方法還包括步驟(5)在提取物中加入緩沖液。
在一優(yōu)選例中，所述的醇溶劑選自乙二醇、乙醇、丙三醇、或其組合。
在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明佐劑的用途，它被用于制造用于治療病毒感染、病毒性感冒、免疫缺陷性疾病、腫瘤的藥物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了含有一種藥物組合物，它包括本發(fā)明提取物和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。


圖1是對原料和提取物的SDS-PAGE電泳圖。各泳道是1分子量標準；2羊膽囊、膽汁，離心前(1∶1)；3；牛膽汁，離心前(1∶1)；4羊膽囊、膽汁，離心前(1∶2稀釋)；5牛膽汁，離心前(1∶2稀釋)；6實施例1的提取物；7實施例2的提取物；8實施例3的提取物(牛膽汁)；9實施例3的提取物(羊膽汁)。
圖2是實施例1提取物的紫外掃描圖譜。
圖3是實施例2提取物的紫外掃描圖譜。
圖4是實施例3提取物的紫外掃描圖譜。
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從動物中藥中尋求到一種安全有效的佐劑，可用于各種疫苗預(yù)防、腫瘤或病毒感染的治療或者輔助治療等。不僅解決了佐劑研究和需要的困難，同時促進了中藥現(xiàn)代化，科學(xué)化的進程，并為了解中藥的治病機理提供了依據(jù)。
本發(fā)明佐劑的原料可以來源于任何動物，例如羊、蛇、馬、豬、牛、狗等?？梢允莿游锏男迈r膽囊，膽汁，膽石或其混合物，也可以是經(jīng)過粗制的、曬干的膽囊，膽汁粉，人造膽石(如人工牛黃)或其混合物。
如本文所用，“提取物”指對上述原料經(jīng)與醇溶劑混合、離心除去固體殘渣，并經(jīng)脫色、脫脂處理后的物質(zhì)。其主要成分是多肽、氨基酸、糖類和少量無機鹽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種制備本發(fā)明佐劑的方法。該方法通常是對于上述原料，全部勻漿或打磨粉碎，加入適量的水，然后加入終濃度10％-80％(較佳地20-70％)的醇溶劑(如乙二醇、乙醇、丙三醇或其組合)，充分混合，離心收集上清液，棄沉淀。然后加入脫色劑脫色。同時可減壓回收醇以便重復(fù)利用。向水相加入脫脂溶劑(例如乙醚、乙酸乙脂、三氯甲烷或其他的非極性溶劑)進行脫脂處理，經(jīng)過萃取后收集水相。如果需要，可進一步純化，例如除去有毒的溶劑。為了便于保存，還可在在提取物中加入緩沖液，例如PBS緩沖液。
對提取物進行的理化性質(zhì)分析表明，提取物的主要成分是多肽，不含分子量大于10KD的蛋白質(zhì)，但含有小分子的多肽和氨基酸。此外，紫外掃描圖譜中在215nm處和280nm具有明顯的吸收峰。
此外，對于提取物原液用Pierce/硫酸銅試劑盒測定多肽和氨基酸的濃度通常在300-3000ug/ml。
對于獲得的提取物，進一步用常規(guī)方法與藥學(xué)上可接受的輔料或載體混合后，就制備成為口含片或注射劑等各種劑型。
在一優(yōu)選例中，因為本發(fā)明的提取物，內(nèi)含多肽，多糖等生物活性物質(zhì)，所以可以制成口含片(如舌下含片)，充分激活口腔局部粘膜的免疫組織，進而激活機體免疫系統(tǒng)，發(fā)揮抗病毒和抗腫瘤活性。
對于給藥途徑，沒有特別限制，例如皮下、肌肉、靜脈注射(對于注射劑)、或局部給藥、口腔給藥等。
本發(fā)明的提取物不僅可以理解為增加抗原作用的佐劑，更廣義地也可以理解為生物治療制劑或生物應(yīng)答修飾劑，它具有以下應(yīng)用(1)用于乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性感染及腫瘤的治療或防止復(fù)發(fā)的生物治療佐劑。
(2)用于病毒如各種肝炎病毒感染、病毒性感冒的的單一療法或者輔助治療或預(yù)防。
(3)用來治療免疫缺陷性疾病，增強免疫力。
(4)用于治療各種腫瘤，特別是惡性腫瘤，治療腫瘤可以作為單一療法，也可以與放療、化療、生物治療聯(lián)合應(yīng)用。
(5)在生物治療中，作為各種瘤苗的佐劑，增強抗腫瘤作用，誘導(dǎo)特異性和非特異性的抗腫瘤免疫力。
(6)作為各種疫苗，菌苗的佐劑，增加免疫力的誘導(dǎo)。
下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明。
實施例1新鮮的膽囊，先用絞肉機和組織勻漿器將膽囊打碎，加入終濃度20％-70％的、乙二醇、乙醇、丙三醇等，在溫度攝氏80度以下充分混合，然后放置1-7天，然后將膽汁與醇的混合液充分混合震蕩，離心15000轉(zhuǎn)/分，0.5-3小時，溫度4-25℃，收集上清液，棄沉淀。然后加入脫色劑脫色，減壓回收醇，水相加入0.5-2倍體積的乙醚、乙酸乙脂、三氯甲烷活其他的非極性溶劑進行脫脂處理，經(jīng)過萃取后收集水相，進一步除去有毒性的溶劑成分，加入緩沖液得到提取物。
對所述提取物進行紫外掃描，圖譜如圖2所示，在215nm處和280nm具有明顯的吸收峰。
實施例2膽結(jié)石如牛黃、曬干的膽囊，膽汁粉，先磨成粉狀，加水，加入終濃度20％-70％的乙二醇、乙醇、丙三醇等，在溫度70度以下充分混合，然后放置1-7天，然后將膽汁與醇的混合液充分混合震蕩，離心20,000轉(zhuǎn)/分，2-5小時，溫度25℃，收集上清液，棄沉淀。然后加入脫色劑脫色，減壓回收醇，水相加入0.5-2倍體積的乙醚、乙酸乙脂、三氯甲烷活其他的非極性溶劑進行脫脂處理，經(jīng)過萃取后收集水相，進一步除去有毒性的溶劑成分，加入緩沖液得到提取物。
對所述提取物進行紫外掃描，圖譜如圖3所示，在215nm處和280nm具有明顯的吸收峰。
實施例3新鮮的羊、馬、蛇或牛膽汁，可以直接加入終濃度30％-60％的乙二醇、乙醇、丙三醇等，在溫度82度以下充分混合，然后放置1-7天，然后將膽汁與醇的混合液充分混合震蕩，離心12000轉(zhuǎn)/分，0.5-3小時，溫度4-25℃，收集上清液，棄沉淀。然后加入脫色劑脫色，減壓回收醇，水相加入0.5-2倍體積的乙醚、乙酸乙脂、三氯甲烷活其他的非極性溶劑進行脫脂處理，經(jīng)過萃取后收集水相，加入緩沖液得到提取物。
對所述提取物進行紫外掃描，圖譜如圖4所示，在215nm處和280nm具有明顯的吸收峰。
實施例4口含片的制備口含片制備方法有多種可以采用將有效成分先凍干后與空白顆?；旌系姆椒?，先將有效成分與甘露醇(上海長征制藥廠)混合后凍干，將糊精、硬脂酸鎂、淀粉(上海亞東藥業(yè)公司)按一定的比例混合，制成空白顆粒，于50-80℃烘箱中烘干，采用倍比混合方法與有效成分凍干粉充分混合后直接壓片。另一種方法是將甘露醇、白蛋白、糊精、硬脂酸鎂、淀粉等按一定的比例混合，制成空白顆粒，于50-80℃烘箱中烘干，然后將液態(tài)有效成分以噴霧方式混入(噴霧機器為德國克利安公司產(chǎn)品)，烘干后壓片(壓片機為德國克利安公司產(chǎn)品)。也可以采用其他的方法例如用提取物作為溶劑制備顆粒，烘干壓片，可以將提取物加熱濃縮，然后進行下一步的處理。
實施例5按下列配方制備一種本發(fā)明的提取物含片羊膽囊提取物500ml甘露醇 100g淀粉400g硬脂酸鎂100g糊精100g共制成1000片此含片每天三次，每次一片，舌下含服，可用于治療慢性乙肝、丙肝等病毒感染，惡性腫瘤的輔助治療。
實施例6按下列配方，制備本發(fā)明的注射液豬、?；蜓蚰懼崛∥镌? 30-70％甘露醇1％SDS 0.01％磷酸緩沖液(pH7.0) 50mM注射用水配制到2000ml，分裝成2ml/支，皮下注射，可用于治療慢性乙肝、丙肝等病毒感染，惡性腫瘤的輔助治療。
實施例7按下列配方，制備本發(fā)明的注射液牛膽汁提取物原液 30-70％磷酸鹽緩沖液(pH7.0) 50mM注射用水配制到，分裝成5ml/支，皮下注射，可用于治療慢性乙肝、丙肝等病毒感染，惡性腫瘤的輔助治療。
實施例7對利用羊膽囊，膽汁混合物為原料制備的提取物，進行質(zhì)量檢測。質(zhì)量檢測結(jié)果如下OD6000.01pH值7.4茚三銅鑒別試驗陽性多肽與氨基酸含量Pierce/CuSO4法測定，1546ug/ml。
無菌試驗陰性(中國生物制品規(guī)程2000版)內(nèi)毒素0.2EU(中國藥典2000版)熱原性合格(中國藥典2000版)安全試驗合格(中國生物制品規(guī)程2000版)毒力試驗合格(中國生物制品規(guī)程2000版)澄明度合格(中國藥典2000版)實施例8安全試驗1.小鼠急性毒性試驗方法及材料用體重18-20克的小白鼠，分組尾靜脈給藥組、肌肉給藥組及靜脈、肌肉陰性對照組各20只，每組雌雄各半，每只肌肉注射羊膽汁粉提取物0.5ml(多肽800ug)或生理鹽水0.5ml，在給藥后連續(xù)觀察7天，所有存活動物在觀察期結(jié)束后用脫頸椎法處死，進行解剖檢查。
試驗結(jié)果給藥后動物反應(yīng)未見異常，在觀察期間未見死亡，小鼠被毛濃密而有光澤，食量和糞便均正常、動物精神狀況良好，活動自如、未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，解剖后主要臟器未見異常變化。給小鼠以最大濃度最大容量提取物，7天中動物無一死亡，小鼠尾靜脈注射、肌肉提取物的LD50均大于25ml/kg。相當于推薦臨床劑量的250倍(臨床推薦劑量為0.1ml/kg)。
2.豚鼠安全實驗用體重300-400克的豚鼠2只，每只腹側(cè)皮下注射豬膽汁與膽囊提取物0.5ml(多肽800ug)，觀察7天，動物健存，每只體重增加，故豚鼠試驗合格實施例9體內(nèi)抗腫瘤療效試驗動物C57BL/6及ICR小鼠(中英合資上海西普爾-必凱(SIPPR-BK)試驗動物有限公司)，性別雌性，體重18-22g試驗方法ICR小鼠右后腿外側(cè)按每只2×105/0.1ml接種處于對數(shù)生長期的S180肉瘤細胞。C57BL/6小鼠右后腿外側(cè)按每只2×105/0.1ml接種處于對數(shù)生長期的B16F10黑色素瘤細胞。荷瘤后24小時將小鼠隨機分為6組，每組10只，分別注射生理鹽水、注射用環(huán)磷酰胺100mg/kg、豬膽囊與膽汁提取物0.1/kg，0.3ml/kg，1ml/kg。除環(huán)磷酰胺為單次沖擊量治療外，其余4組治療連續(xù)10天，每天一次。給藥途徑為肌肉注射，給藥體積為0.1ml(用生理鹽水配制)。試驗前測定小鼠體重，荷瘤后14天處死小鼠，測體重及其瘤重。
實驗結(jié)果1、提取物對小鼠肉瘤B16生長的體內(nèi)抑制作用
***與生理鹽水對照組比較P＜0.012、提取物對小鼠肉瘤S180生長的體內(nèi)抑制作用
***與生理鹽水對照組比較P＜0.01
實施例10提取物對數(shù)突狀細胞和巨噬細胞的激活作用樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是已知的機體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞，APC)，DC是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種能直接激活初始型T細胞(naive)的抗原提呈細胞。DC在激活、啟動機體免疫應(yīng)答尤其是細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用。近年來，以DC為基礎(chǔ)的腫瘤特異性免疫治療在惡性腫瘤的臨床試用中取得了明顯的療效，但是其抗腫瘤療效，特別是在免疫功能低下的腫瘤患者體內(nèi)的抗腫瘤療效仍然受到限制，我們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，從動物膽囊來源的提取物在體外可以明顯的刺激DC產(chǎn)生細胞因子IL-12和腫瘤壞死因子a(TNF-a)材料與方法C57BL/6小鼠，6-8周齡，無菌條件下處死，制備脾細胞懸液，加入0.83％的NH4Cl溶解紅細胞，按照常規(guī)方法加入IL-4和GM-CSF培養(yǎng)DC，DC培養(yǎng)至第8天，收集細胞，離心，計數(shù)，配成50萬/ml，然后加入含有新鮮IL-4和GM-CSF的等體積RPMI-1640培養(yǎng)基，按照每孔200ul加至96孔培養(yǎng)板，然后加入不同稀釋度的牛膽汁提取物溶液或者/和LPS，48小時后收集上清，用ELISA(Endogen公司，美國)的IL-12(p70)和TNF-a檢測試劑盒測定IL-12和TNF-a的含量。
實驗結(jié)果提取物對樹突狀細胞產(chǎn)生IL-12的刺激作用
提取物對樹突狀細胞產(chǎn)生TNF-a的刺激作用
提取物對巨噬細胞產(chǎn)生TNF-a的刺激作用
實施例11提取物體外抑制腫瘤的生長。
處于對數(shù)生長期的小鼠黑色素瘤細胞B16，人胚腎細胞293，配成10萬/ml，按照每孔100ul加入至96孔板中，每孔1萬個細胞，同時加入含有不同濃度的提取物，培養(yǎng)72小時，加入MTT(Fluka公司，法國)，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，取出96孔培養(yǎng)板，棄上清，保留紫色沉淀，然后每孔加入二甲基亞砜100ul，等沉淀全部溶解后用紫外分光光度計于570nm處檢測吸收度。
實施例12提取物的理化性質(zhì)SDS-PAGE凝膠分析實施例1-3中的提取物的蛋白質(zhì)成分，濃縮膠用5％，分離膠用20％，利用Bio-Rad公司的MINI-PROTEIN II電泳儀，上樣30ul，200伏電壓電泳1小時，結(jié)果如圖1所示，原始膽囊、膽汁中含有大量的分子量在14左右的蛋白質(zhì)，而提取物中沒有分子量大于10KD的蛋白質(zhì)，但提取物中含有小分子的多肽和氨基酸。
提取物原液用Pierce/硫酸銅試劑盒(PIERCE公司，法國)測定多肽和氨基酸的濃度在200-5000ug/ml，連續(xù)3批的多肽和氨基酸濃度測定結(jié)果為，1837ug/ml，1220ug/ml，2189ug/ml。
權(quán)利要求
1一種佐劑，其特征在于，它是以動物的膽囊、膽汁、膽石、或人造膽石或者其混合物為原料制備的提取物，該提取物不含分子量大于10KD的蛋白質(zhì)，但含有小分子的多肽和氨基酸，并且在紫外掃描圖譜中在215nm處和280nm具有明顯的吸收峰。
2.如權(quán)利要求1所述的佐劑，其特征在于，提取物原液用Pierce/硫酸銅試劑盒測定多肽和氨基酸的濃度在300-3000ug/ml。
3如權(quán)利要求所述的佐劑，其特征在于，所述的動物選自羊、蛇、馬、豬、牛、狗等。
4如權(quán)利要求1所述的佐劑，其特征在于，原料選自下組動物的新鮮膽囊、膽汁、膽石或其混合物。
5如權(quán)利要求1所述的佐劑，其特征在于，原料選自下組粗制的、曬干的膽囊，膽汁粉，人造膽石。
6.如權(quán)利要求1所述的佐劑，其特征在于，它具有選自下組的形式口含片、注射劑。
7.一種制備佐劑的方法，其特征在于，包括步驟(1)將粉碎的、粉末狀的或液體的原料與醇溶劑在60-90℃下混合，其中原料選自下組動物的膽囊、膽汁、膽石、或人造膽石或者其組合，使混合物中醇溶劑終濃度為10-80％，并放置12小時-14天；(2)對步驟(1)中所述混合物進行離心，去除固體殘渣，并獲得上清液；(3)對步驟(2)中所述的上清液進行脫色、脫脂處理，經(jīng)萃取回收水相；(4)從步驟(3)中的所述水相去除有毒溶劑成分，從而獲得作為佐劑的提取物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，還包括步驟(5)在提取物中加入緩沖液。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的醇溶劑選自乙二醇、乙醇、丙三醇、或其組合。
10.如權(quán)利要求1所述佐劑的用途，其特征在于，它被用于制造用于治療病毒感染、病毒性感冒、免疫缺陷性疾病、腫瘤的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種動物中藥佐劑,它是以動物的膽囊、膽汁、膽石、或人造膽石或者其混合物為原料制備的提取物,該提取物不含分子量大于10KD的蛋白質(zhì),但含有小分子的多肽和氨基酸,并且在紫外掃描圖譜中在215nm處和280nm具有明顯的吸收峰。該佐劑可安全有效地激發(fā)和增強免疫應(yīng)答,可用于治療或輔助治療病毒感染、病毒性感冒、免疫缺陷性疾病、腫瘤。
文檔編號A61K35/37GK1371749SQ01105499
公開日2002年10月2日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月28日
發(fā)明者鞠佃文, 白敏 申請人:鞠佃文, 白敏