專利名稱：復(fù)合膠原基組織工程支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬組織工程支架的制備。
膠原和粘多糖物質(zhì)都是天然細(xì)胞外基質(zhì)，在組織工程支架方面的研究中應(yīng)用較廣，其是構(gòu)建人工皮膚、軟骨、血管等組織工程器官的首選材料。但目前所應(yīng)用的支架材料性能還不盡人意。
本發(fā)明的目的是提供一種復(fù)合膠原基組織工程支架及其制備方法，本發(fā)明是用于軟組織細(xì)胞培養(yǎng)的組織工程支架，該支架提高了現(xiàn)有膠原材料的細(xì)胞粘附性能，降低了材料的細(xì)胞毒性并改善了支架材料的制備工藝。
本發(fā)明的重量組成是膠原10份，硫酸軟骨素1-5份，殼聚糖0.5-3份，聚乙烯醇0.5-2份。
復(fù)合膠原基組織工程支架的制備方法包括下述步驟(1)按計(jì)量配置固體含量為0.4-1.0％的膠原丙二酸溶脹液，用0.2M的醋酸溶液溶解殼聚糖，0.3％丙二酸溶液溶解聚乙烯醇，并將其加入膠原溶賬液中，攪拌均勻得到膠原-殼聚糖-聚乙烯醇溶液；(2)離心除去氣泡，置于凍干容器中，控制冷凍溫度-30℃至-10℃，得到多孔的膠原-殼聚糖-聚乙烯醇支架材料；(3)用木瓜蛋白酶消化法從牛氣管軟骨中提取硫酸軟骨素；將濃度為0.1-0.5％硫酸軟骨素溶于交聯(lián)溶液中，交聯(lián)溶液為含有1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基-碳化二亞氨(EDC)的2N-嗎啡啉-乙磺酸(MES)的20-40％乙醇溶液；(4)膠原-殼聚糖-聚乙烯醇支架材料浸泡在上述交聯(lián)溶液中3-5小時(shí)，然后與硫酸軟骨素結(jié)合得到復(fù)合膠原基組織工程支架，清洗；(5)將得到復(fù)合膠原基組織工程支架再冷凍干燥，裁成所需的尺寸，滅菌，包裝備用。
以上所說的清洗方法是用0.1M Na2HPO4清洗復(fù)合膠原基組織工程支架兩小時(shí)，2MNaCl洗2小時(shí)，再用蒸餾水洗。
本發(fā)明得到的復(fù)合膠原基組織工程支架具有良好的物理、化學(xué)性能，生物相容性好，操作方便，并且可生物降解吸收；細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞在該支架中生長(zhǎng)良好，無毒副作用；支架的孔徑大小可以根據(jù)臨床需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。本發(fā)明制備的組織工程支架可用于人工皮膚、軟骨、血管等人工器官的構(gòu)建，且成本低、方法簡(jiǎn)便易重復(fù)，具有較廣泛的臨床應(yīng)用前景。
實(shí)例1
將500g濕牛氣管軟骨脫脂粉碎，用含有木瓜蛋白酶的緩沖溶液在37℃下消化處理16小時(shí)，加入三氯醋酸至終濃度為15％(w/v),0℃沉降1小時(shí)，4℃,8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘除去蛋白質(zhì)。上清液中加入NaOH和NaBH4至終濃度分別為0.5M和0.1M。4℃放置16小時(shí)，加入6MHCL進(jìn)行中和。再加入三氯醋酸并離心除去蛋白質(zhì)。上清液中加入5倍體積的100％乙醇，在-20℃下沉降16小時(shí)，4℃8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，用70％乙醇洗所得的GAG并離心兩次；用蒸餾水溶解并冷凍干燥。膠原溶脹液通過酶解法從牛肌鍵中提取，其固體含量為1.3％。
稱取膠原溶脹液50g，用0.3％的丙二酸溶液作為分散液配成濃度為0.7％的溶液，攪拌均勻，離心除去氣泡。稱取0.06g殼聚糖溶于0.2M醋酸溶液中，0.06g聚乙烯醇溶于0.3％丙二酸溶液中，然后將其與膠原溶脹液混合，攪拌均勻并離心。將膠原溶脹液倒入凍干容器，用真空冷凍干燥機(jī)凍干成海綿狀薄膜，厚度約為3mm。將該海綿狀薄膜浸在200ml含有50mM MES的40％乙醇(pH5.5)中0.5小時(shí)。然后置于200ml含有0.25％(w/v)硫酸軟骨素和30mM EDC的50mM MES的40％乙醇溶液中，反應(yīng)4小時(shí)后，用0.1M Na2HPO4(pH9.1)清洗該海綿狀薄膜兩小時(shí)，2M NaCl洗2小時(shí)，再用蒸餾水洗，凍干并用γ-射線滅菌。
本發(fā)明最終得到的復(fù)合膠原基組織工程支架孔隙均勻，尺寸穩(wěn)定，具有一定的韌性和強(qiáng)度。從

圖1中給出的復(fù)合膠原基組織工程支架的微觀掃描電鏡圖(SEM)可以看出，該支架具有連續(xù)的三維纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔徑約為30-100μm。采用光電子能譜PHI5300 ESCA系統(tǒng)對(duì)材料表面的組成進(jìn)行分析可知，殼聚糖的加入可使硫酸軟骨素的結(jié)合量明顯增加(見表1)；該復(fù)合膠原基組織工程支架材料具有很好的生物相容性，L929細(xì)胞在支架上培養(yǎng)7天后，細(xì)胞生長(zhǎng)成片，圖2、3是復(fù)合膠原基組織工程支架的微觀掃描電鏡圖(SEM)，圖中分別給出了細(xì)胞結(jié)合和未結(jié)合硫酸軟骨素的復(fù)合膠原基組織工程支架中生長(zhǎng)7天后的SEM圖，結(jié)果表明，結(jié)合了硫酸軟骨素的復(fù)合膠原基組織工程支架起到了促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。
實(shí)例2硫酸軟骨素和膠原溶脹液的提取如實(shí)例1。稱取膠原溶脹液50g，用0.3％的丙二酸溶液作為分散液，配成濃度為0.6％的溶液，攪拌均勻，離心除去氣泡。稱取0.08g殼聚糖溶于0.2M醋酸溶液中，0.08g聚乙烯醇溶于0.3％丙二酸溶液中，并將其與膠原溶脹液混合，攪拌均勻并離心。將該溶脹液倒入凍干容器中，用真空冷凍干燥機(jī)凍干成厚約3mm的復(fù)合膠原基組織工程支架，將支架浸在200ml含有50mM MES的40％乙醇(pH5.5)中0.5小時(shí)，然后置于200ml含有0.20％(w/v)硫酸軟骨素和30mMEDC的50mM的MES的40％乙醇溶液中，反應(yīng)4小時(shí)后，用0.1MNa2HPO4(pH9.1)清洗2小時(shí)，2M NaCl洗2小時(shí)，再用蒸餾水洗并凍干，得到產(chǎn)品。
實(shí)例3
硫酸軟骨素和膠原溶脹液的提取如實(shí)例1。稱取膠原溶脹液50g，用0.3％的丙二酸溶液作為分散液，配成濃度為0.8％的溶液，攪拌均勻，離心除去氣泡。稱取0.05g殼聚糖溶于0.2M醋酸溶液中，0.06g聚乙烯醇溶于0.3％丙二酸溶液中，并將其與膠原溶脹液混合，攪拌均勻并離心。將該溶液倒入凍干容器，用真空冷凍干燥機(jī)凍干成厚約3mm的復(fù)合膠原基組織工程支架，將該支架浸在200ml含有50mM MES的40％乙醇(pH5.5)中0.5小時(shí)，然后置于200ml含有0.3％(w/v)硫酸軟骨素和30mMEDC的50mM MES的40％乙醇溶液中，反應(yīng)4小時(shí)后，用0.1M Na2HPO4(pH9.1)清洗基質(zhì)2小時(shí)，2M NaCL洗2小時(shí)，再用蒸餾水洗并凍干得到產(chǎn)品。
表1 ESCA分析基質(zhì)表面元素組成
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合膠原基組織工程支架，其特征在于它的重量組成是膠原10份，硫酸軟骨素1-5份，殼聚糖0.5-3份，聚乙烯醇0.5-2份。
2.權(quán)利要求1所說的復(fù)合膠原基組織工程支架的制備方法，其特征在于它包括下述步驟(1)按計(jì)量配置固體含量為0.4-1.0％的膠原丙二酸溶脹液，用0.2M的醋酸溶液溶解殼聚糖，0.3％丙二酸溶液溶解聚乙烯醇，并將其加入膠原溶脹液中，攪拌均勻得到膠原-殼聚糖-聚乙烯醇溶液；(2)離心除去氣泡，置于凍干容器中，控制冷凍溫度-30℃至-10℃，得到多孔的膠原-殼聚糖-聚乙烯醇支架材料；(3)用木瓜蛋白酶消化法從牛氣管軟骨中提取硫酸軟骨素；將濃度為0.1-0.5％硫酸軟骨素溶于交聯(lián)溶液中，交聯(lián)溶液為含有1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基-碳化二亞氨(EDC)的2N-嗎啡啉-乙磺酸(MES)的20-40％乙醇溶液；(4)膠原-殼聚糖-聚乙烯醇支架材料浸泡在上述交聯(lián)溶液中3-5小時(shí)，與硫酸軟骨素結(jié)合得到復(fù)合膠原基組織工程支架，然后清洗；(5)將得到復(fù)合膠原基組織工程支架再冷凍干燥，裁成所需的尺寸，滅菌，包裝備用。
3.按照權(quán)利要求2所說的復(fù)合膠原基組織工程支架的制備方法，其特征在于所說的清洗方法是用0.1M Na2HPO4清洗復(fù)合膠原基組織工程支架兩小時(shí)，2M NaCl洗2小時(shí)，再用蒸餾水洗。
4.按照權(quán)利要求2所說的復(fù)合膠原基組織工程支架的制備方法，其特征在于所說的滅菌方法是用γ-射線滅菌。
全文摘要
本發(fā)明屬新型復(fù)合膠原基組織工程支架的制備。復(fù)合膠原基組織工程支架其組成是:膠原10份,硫酸軟骨素1－5份,殼聚糖0.5－3份,聚乙烯醇0.5－2份。膠原溶脹液與殼聚糖以及聚乙烯醇溶液共混,冷凍干燥制成,將該支架浸入含有硫酸軟骨素的交聯(lián)溶液中進(jìn)行交聯(lián)后再冷凍干燥,滅菌后得到產(chǎn)品。本發(fā)明的復(fù)合膠原基組織工程支架生物相容性好,對(duì)細(xì)胞粘附增殖有促進(jìn)作用,且成本低、制備方法簡(jiǎn)便,具有較廣泛的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1319436SQ0110920
公開日2001年10月31日 申請(qǐng)日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月28日
發(fā)明者張其清, 楊洪義 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所