專利名稱：血管生成抑制劑的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及固體砷華(As4O6)及其藥物組合物的用途，其中As4O6為一種血管生成抑制劑。特別是，本發(fā)明涉及As4O6(已知為‘Chonjisan’)應用于治療血管生成和其它相關(guān)疾病的新應用。
2.技術(shù)背景描述血管生成，即由內(nèi)皮細胞形成血管的過程，其對于腫瘤生長很關(guān)鍵(Folkman J.Watson K，Ingber D，Hnahan D，在細胞增生向瘤形成的轉(zhuǎn)化過程中誘導血管生成(Induction of angiognesis during the transitionfrom hyperplasia to neoplasia)，Nature 1989 May 4；339(6219)；58-61)。其主要特性在一些血管性疾病中更為顯見，例如在糖尿病性視網(wǎng)膜病、關(guān)節(jié)炎、血管瘤和牛皮癬(Klagsbrun M & Folkman J in PeptideGrowth Factors and Their Receptors II(eds Sporn M.B & Boberts，A.B.)549-586(Spring，Berlin，1990))。
通?？稍谝恍┗颊叩慕悄ぶ杏^察到血管的侵入和再生，這些患者包括患有Stevens-Johnson氏癥狀簇(糜爛性多口外胚葉發(fā)育不全癥)及類似疾病、眼類天皰瘡及類似疾病、由毒性化學品，即堿、酸、洗滌劑或各種溶劑和揮發(fā)性氣體，而引起的角膜化學性損傷、沙眼、病毒感染、小水泡角膜炎；角膜移植患者；長期使用隱型眼鏡的患者。水性腔、晶狀體或玻璃體最初是透明無血管的，如果在這些組織中發(fā)生了新血管生成，嚴重的視力下降會導致日常生活困難。因此，人們對抑制新血管生成進行了一些醫(yī)學研究。
一般已知的血管生成抑制劑包括魚精蛋白敷用藥物(Taylor，S.etal.，Nature，297，307，1982)、肝素與cortizon的組合物(Folkman，J.Etal.，Science，221，71，1983)、醋酸強的松龍(Robin，J.B.，Arch，Opthalmol.，103，284，1985)、磺化多糖(日本專利laid-open No.63-119500)、除莠霉素A(日本專利laid-open No.63-295509)、煙曲霉素(日本專利laid-open No.1-279828)及β-干擾素(美國專利5,948,403)。然而，由于活性不充分，它們中的大多數(shù)并不能令人滿意，且它們對人體的不利副作用尤其令人關(guān)注。
砷是眾所周知的強環(huán)境致癌物，可引起皮膚癌和肺癌。但是，它在中藥中一直用于治療牛皮癬、梅毒和風濕。令人注意的是，直到1970年，中國人發(fā)現(xiàn)三氧化砷(As2O3)可治療急性早幼粒細胞性白血病(APL)。目前，在全世界包括美國在內(nèi)，一些關(guān)于砷化合物功能基團和其應用的研究正在積極地進行(Zhang TD用“AiLing No.1”治療急性粒細胞性白血病-臨床分析和實驗室研究(Treatment of acutegranulocytic leukemia with“Ai Ling No.1”-Clinical analysis andexperimental research).Chin J Integrated Chin West Med 419，1984)(LiYS，Zhang TD，Li CHW，Zhao XL，Wei ZHR，Tan W，Li RL，Mao YY27位惡性淋巴瘤患者治療中的中藥和西藥(Traditional Chinese andWestern Medicine in the treatment of 27 patients with malignantlymphoma).Chin J Oncol 1061，1988)(Sun HD，Ma L，Hu XC，Zhang TDAi-Lin I治療32例急性粒細胞性白血病(Ai-Lin I treated 32 cases ofacute promyelocytic leukemia).Chin J Integrated Chin West Med 12170，1992，Blood 1997 May 1；89(9)3354-60在治療急性粒細胞性白血病(APL)中使用三氧化砷(As2O3)II對復發(fā)患者的臨床療效及藥代動力學(Use of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocyticleukemia(APL)II.Clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsedpatients).Shen ZX，Chen GQ，Ni JH，Li XS，Xiong SM，Qiu QY，Zhu J，Tang W，Sun GL，Yang KQ，Chen Y，Zhou L，F(xiàn)ang ZW，Wang YT，Ma J，Zhang TD，Chen SJ，Chen Z，Wang ZY)。
在西方國家，曾用砷化合物治療梅毒，而現(xiàn)在一種用于治療錐蟲病的有機砷米拉索普是唯一使用的砷化合物。體外研究揭示，通過經(jīng)減量調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白和/或caspases活性來誘導凋亡，三氧化砷和米拉索普不僅對APL細胞具有細胞毒性，而且對其它類型的白血病細胞也具有細胞毒性(Blood 1998 Sep 1；92(5)1497-504三氧化砷和米拉索普誘導骨髓性白血病細胞系中的細胞程序死亡并通過PML和PML-RAR alpha非依賴性方式發(fā)揮作用(Arsenic trioxide and melarsoprolinduce programmed cell death in myeloid leukemia cell lines and functionin PML and PML-RAR alpha independent manner).Wang ZG，Rivi R，Delva L，Konig A Scheinberg DA，Gambacorti-Passerini C，Gabrilove JL，Warrell RP Jr.，Pandolfi PP，Blood 1996 Aug 1；88(3)1052-61對三氧化砷(As2O3)在治療急性粒細胞性白血病中的細胞與分子機制的體外研究伴隨Bcl-2表達的減量調(diào)節(jié)和PML-RAR alpha/PML蛋白的調(diào)節(jié)，As2O3誘導NB4細胞凋亡(In vitro studies on cellular and molecularmechanisms of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acutepromyelocytic leukemiaAs2O3induces NB4 cell apoptosis withdownregulation of Bel-2 expression and modulation of PML-RARalpha/PML proteins).Chen GQ，Zhu J，Shi XG，Ni JH，Zhong HJ，SiGY，Jin XL，Tang W，Li XS，Xong SM，Shen ZX，Sun GL，Ma J，Zhang P，Zhang TD，Gazin C，Naoe T，Chen SJ，Wang ZY，Chen Z，Blood 1997 May1；89(9)3345-53三氧化砷(As2O3)在急性粒細胞性白血病(APL)治療中的使用I.As2O3對APL細胞發(fā)揮劑量依賴性雙重功效(Use of arsenictrioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia(APL)I.As2O3exerts dose-dependent dual effects on APL celis).Chen GQ，Shi XG，Tang W，Xiong SM，Zhu J，Cai X，Han ZG，Ni JH，Shi GY，Jia PM，LiuMM，He KL，Niu C，Ma J，Zhang P，Zhang TD，Paul P，Naoe T，KitamuraK，Miller W，Waxam S，Wang ZY，de The H，Chen SJ，Chen Z，Br JHaematol 1998 Sep；102(4)1055-60砷誘導體外B細胞白血病細胞系中的凋亡caspases的活化及Bcl-2蛋白的減量調(diào)節(jié)(Arsenic inducesapoptosis in B-cell leukaemic cell lines in vitroactivation of caspases anddown-regulation of Bcl-2 protein).Akao Y，Mizoguchi H，Kojima S，NaoeT，Ohishi N，Yagi K，Blood 1997 Jul 15；90(2)562-70，米拉索普和三氧化砷在慢性B細胞白血病細胞系中的相對活性(Comparative activity ofmelarsoprol and arsenic trioxide in chronic B-cell leukemia lines).，KonigA，Wrazel L，Warrell RP Jr.，Rivi R，Pandolfi PP，Jakubowski A，Gabrilove JL)。
砷華(固體As4O6)為三氧化砷和其它大多數(shù)砷化合物提供了起始原料，它也用于殺蟲劑，并還用作玻璃制造中的脫色劑和皮革防腐劑。因此，與三氧化砷一樣，砷華也被認為是一種有毒的致癌化學物質(zhì)，化學家主要關(guān)心的僅是其分子結(jié)構(gòu)(Becker KA.，Plieth K.，andStranski I.N.三氧化砷的多形性變化(The polymorphic modifications ofarsenic trioxide).Prog.Inorg.Chem.4，1-72(1962)，Pupp C，Lao R.C.，Murray J.J.，pottie R.F.，一些多環(huán)芳香烴類、As4O6和SeO2的平衡蒸氣壓，以及這些空氣污染物的收集效率(Equilibrium vapor concentrationsof some polycyelic aromatic hybrocarbons.As4O6and SeO2and thecollection efficiencies of these air pollutants).Atmospheric EnvironmentVol.8，pp 915-925，1974，Grzechnik A.固體As4O6的可壓縮性及振動方式(Compressibility and vibrational modes in solid As4O6)Journal ofSolid State Chemistry，144(2)416-422，1999 May)。
同時，該發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，源自天然砷礦的As4O6可用作一種抗癌劑。因此，他向韓國工業(yè)產(chǎn)權(quán)局申請專利1998-16486，在1999年，日本專利局以同一發(fā)明授權(quán)他專利(日本專利No.3007627)。
據(jù)報導，當通過口服給藥時，三氧化砷在胃腸道和肝臟引起嚴重的副作用(Shen ZX，Chen GQ，Ni JH，Li XS，Xiong SM，Qiu QY，Zhu J，Tang W，Sun GL，Yang KQ，Chen Y，Zhou L，F(xiàn)ang ZW，Wang YT，Ma J，Zhang P，Zhang TD，Chen SJ，Chen Z，Wang ZY三氧化砷在急性粒細胞性白血病(APL)治療中的使用II.對復發(fā)患者的臨床療效及藥代動力學(Use of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acutepromyelocytic leukemia(APL)II.Clinical efficacy and pharmacokineticsin relapsed patients).Blood 1997 May 1；89(9)3354-60)。然而，根據(jù)發(fā)明人的實驗，當對重約200g的Sprague Dawley鼠口服給藥砷華100mg/kg28天時，只在腎觀察到較小的組織學變化，且并沒有在胃腸道和肝臟觀察到副作用。而且，如果使用10mg/kg和1mg/kg，則沒有觀察到任何的副作用。
本發(fā)明的另一個目的是提供由上述血管生成抑制劑構(gòu)成的藥物組合物。
圖2顯示本發(fā)明的砷華治療對BCE細胞增殖的抑制。
圖3顯示砷華對BCE細胞趨化性的影響。
圖4(A)至4(C)顯示本發(fā)明的砷華對新血管生成的抑制作用。
圖5(A)至5(B)顯示本發(fā)明的砷華經(jīng)口服給藥對鼠角膜新血管生成的抑制作用。
圖5(C)至5(E)是鼠經(jīng)口服給藥本發(fā)明的砷華后，其角膜的新血管生成的血管長度、鐘時和血管區(qū)域示意圖。
發(fā)明詳述為達到上述目的，本發(fā)明人使用

圖1所示結(jié)構(gòu)的砷華進行體外和體內(nèi)實驗，并發(fā)現(xiàn)砷華抑制毛細血管內(nèi)皮細胞的趨化性及由基礎(chǔ)纖維原細胞生長因子(bFGF)誘導的新血管生成。
本發(fā)明的砷華已知為‘Chonjisan’，其制備方法已通過同一發(fā)明人的韓國專利1998-16486得以公開。按照此方法，通過使用天然砷礦或砷試劑經(jīng)一系列的熱途徑來制備純的固體砷華。由于此方法可參考上述專利，所以在此不作詳細描述。只要提到以下一點就已足夠，即只要制得的砷華與圖1所示結(jié)構(gòu)相同，也可使用其它的制備方法。
當約50mg/kg/天本發(fā)明的血管生成抑制劑對一只鼠口服給藥時，證明由bFGF刺激的角膜新血管生成可被顯著抑制。在用于人時，可根據(jù)患者的疾病、年齡、性別和健康狀況調(diào)節(jié)血管生成抑制劑的劑量。
本發(fā)明的血管生成抑制劑可單獨使用，或與其他血管生成抑制劑組合使用。賦形劑、崩解劑、調(diào)味劑、助流劑及其他藥學可接受的添加物經(jīng)常與砷華組合，并通過口服或腸胃外投藥法得以使用。這里，劑型可選自粉劑、片劑或液態(tài)劑型。
而且，本發(fā)明的血管生成抑制劑可單獨使用，或與其他藥物聯(lián)合使用，這些藥物用于治療與血管生成機制相關(guān)的一些疾病，如癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、血管瘤和牛皮癬。
現(xiàn)在參照以下實施例詳細描述本發(fā)明，但并不對本發(fā)明構(gòu)成限制。實施例1.抑制內(nèi)皮細胞的增殖以下實驗用于研究砷華是否抑制牛毛細血管上皮(BCE)細胞的增殖。
1)動物、試劑和細胞使用重200g的雄性Sprague-Dawley鼠為實驗動物。將砷華(固體As4O6)溶于水中直至其成為lmM儲備液，并保持于室溫。牛毛細血管上皮(BCE)細胞由Dr.Tae-Hee Lee提供(Lee，T.H.，Rhim，T.，andKim，S.S.(1998)凝血酶原inkringle-2域?qū)τ诨A(chǔ)纖維原細胞生長因子刺激的毛細血管上皮細胞具有生長抑制活性(Prothromb inkringle-2domain has a growth inhibitory activity against basic fibroblast growthfactor-stimulated capillary endothelial cells).J.Biol.Chem.273，28805-28812)。BCE細胞保存于Dulbecco改進的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)，其中添加有10％熱滅活的牛胎血清(BCS；Hyclone Laboratories，Logan，Utah)L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(110單位/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和1.5ng/ml重組的人基礎(chǔ)纖維原細胞生長因子(bFGF；R&D Systems，Minneapolis，MN)。然后，將細胞在10％CO2的條件下于37℃溫育。本實驗使用傳代10-15的細胞。
2)內(nèi)皮細胞增殖試驗內(nèi)皮細胞增殖試驗的進行如Cao等所述(Cao，Y.，A.，An，S.S.A.，Ji，R.W.，Davodson，D.，Cao，Y.，and Llinas，M.(1997)血纖維蛋白溶酶原的Kringle5是新的內(nèi)皮細胞生長抑制劑(Kringle5 of plasminogen is anovel inhibitor for endothelial cell growth).J.Biol.Chem.271，22924-22928)。將生長于明膠包被板的細胞分散在0.05％胰蛋白酶溶液中并用含10％BCS的DMEM使之重新懸浮。將近12,500個細胞加入明膠化24孔板的每一個孔中，在10％CO2下于37℃溫育24小時。用0.25ml含5％BCS的新鮮DMEM替換培養(yǎng)基，并將樣品加入每一孔中。溫育30分鐘后，加入培養(yǎng)基，使最終達到0.5ml DMEM含5％BCS和3ng/ml bFGF。溫育72小時后，細胞被胰蛋白酶化，并用血球計計數(shù)。每一種條件平行進行三份，且實驗進行三次。
特別地，在3ng/ml bFGF的存在下，用BCE細胞分析濃度為10-200nM(10nM、20nM、50nM、100nM和200nM)的砷華。圖2顯示來自bFGF刺激的細胞和用作比較的無bFGF刺激的對照細胞的數(shù)據(jù)。結(jié)果，砷華對BCE細胞的抑制在100nM時最大，這顯示抑制作用依賴于劑量(IC50＝99nM)。在3天的溫育后，未檢測出明顯的與凋亡內(nèi)皮細胞相伴隨的細胞形態(tài)學變化，其包括脫離、變圓和碎裂。實施例2.砷華對內(nèi)皮細胞侵入的影響確定了砷華對牛毛細血管內(nèi)皮(BCE)細胞侵入的影響。
1)動物和細胞使用與實施例1相同的動物和細胞。
2)砷華對趨化性的影響用改進的Boyden室進行趨化性試驗，其中Boyden室裝有聚碳酸酯核孔膜(Boyden Chamber，Corning，Coring，NY)，其述于雜志(Veronique Rigot，Maxime Lehmann，F(xiàn)rederic andre，Noucha Daemi，Jacques Marvaldi and Jose Luis結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移所需的整合蛋白的連接和PCC的活化(Integrin ligation and PKC activation are required formigration of colon carcinoma cells).Journal of cell science 11l，3119-3129(1998))。將預涂布的濾膜(直徑6.5mm，孔尺寸8μm，Matrigel100itg/cm2)用250μl培養(yǎng)基重新水化。將在含有或不含有砷華(濃度為10nM、20nM、50nM、100nM和200nM)的200μl培養(yǎng)基中的1×105個細胞以三個一組分別移入每個室的上部，而下面的隔室填充有200μl無血清的DMEM，其中添加有0.1％BSA，還有(陽性對照)/沒有(陰性對照)作為化學誘發(fā)劑的10ng/ml bFGF。細胞在37℃溫育72小時后，用棉拭擦拭濾膜上表面的未遷移的細胞。固定濾膜下表面的已遷移的細胞，并用含0.125％Cumassie Blue的混合物(甲醇∶乙酸∶水，體積比為45∶10∶45)染色。通過計算每孔在五個顯微鏡視野內(nèi)的細胞數(shù)來確定趨化性，遷移的程度表達為每個顯微鏡視野內(nèi)的平均細胞數(shù)目。如圖3所示，在用bFGF處理后，細胞發(fā)生了嚴重的侵入。然而，砷華預處理以濃度依賴性方式阻斷了這種侵入。在100nM(IC50為48nM)，抑制高達83.4％。另一方面，沒有觀察到明顯的與凋亡內(nèi)皮細胞相伴隨的細胞形態(tài)學變化，其包括脫離、變圓和碎裂。實施例3砷華對在3-D培養(yǎng)基中的BCE細胞的管道形成的影響為研究砷華對血管生成的成熟過程，特別是毛細血管上皮細胞管道結(jié)構(gòu)形成的影響，在纖維蛋白凝膠上使用三維培養(yǎng)基培養(yǎng)BCE細胞。
1)動物和細胞使用與實施例1相同的動物和細胞。
2)管道形成試驗用以下己報道的途徑制備纖維蛋白凝膠(Bastaki M，Nelli EE，Dell’Era P，Rusnati M，Molinari-Tosatti MP，Parolini S，Auerbach R，RucoLP，Possati L，Presta M，在鼠內(nèi)皮中的由基礎(chǔ)纖維原細胞生長因子誘導的血管生成表型。主動脈和毛細血管內(nèi)皮細胞系的研究。(Basic fibrolastgrowth factor-induced angiogenic phenotype in mouse endothelium.Astudy of aortic and microvascular endothelial cell lines).ArteriosclerThromb Vasc Bio 1997 Mar；17(3)454-64)。簡要地說，將2.5mg/ml纖維蛋白原(Calbiochem，San Diego，CA)溶于DMEM，加入培養(yǎng)的BCE細胞至終濃度為105細胞/ml，然后加入凝血酶(0.5單位/ml)使凝結(jié)開始。將混合物立刻轉(zhuǎn)移到24孔板，在37℃5分鐘使凝膠形成。凝膠形成后，向每孔加入含或不含bFGF(10ng/ml)的0.5ml培養(yǎng)基和砷華(100nM)。48或96小時后，用倒置顯微鏡檢查管道的形成。
圖4A和4B顯示纖維蛋白凝膠上的BCE細胞排列成索狀并完成最大管道樣結(jié)構(gòu)的形成。圖4C顯示砷華處理減少了BCE細胞的管道生成?？傊?，砷華抑制了在3D培養(yǎng)基中的內(nèi)皮細胞的分化。實施例4角膜微囊血管生成試驗為進一步研究砷華在體內(nèi)的抗血管生成活性，對系統(tǒng)性給藥的砷華對bFGF誘導的新血管生成的抑制作用進行研究。角膜微囊試驗通過對已報道的程序微小改進(Polverini Pj，Bouck Np，Rastinejad F.血管生成的天然發(fā)生抑制劑的分析與純化(Assay and purification ofnaturally occurring inhibitor of angiogenesis)，Methods Enzymol.1991；198440-450)來進行。即，用氯胺酮麻醉鼠。通過插入白內(nèi)障刀來制造角膜囊，囊的基底距其下緣1-1.5mm。通過將含2μg重組bFGF(R&DSystems，Minneapolis，MN，U.S.A.)的30μl鹽水和300μg硫酸鋁(Sigma，St.Louis，Mo，U.S.A.)混合來制造球粒；將此懸浮液加入30μl 12％(質(zhì)量/體積)聚(甲基丙烯酸2-羥乙基酯)(Sigma，St.Louis，MO，U.S.A.)的乙醇溶液。然后，使此混合物的等份試樣凹陷于Teflon栓上并干燥產(chǎn)生近17個球粒，以便每一球粒包含近100ng bFGF。將一個球粒植入己麻醉的雄性Sprague Dawley鼠的每只眼的角膜微囊中，接著將紅霉素膏單次局部敷用在角膜表面。從植入當天開始，對于治療組，每天通過給動物灌胃喂50mg/kg砷華粉，而對于對照組，則喂給不含砷華的相同食物和水。每天用角膜顯微鏡檢查所有動物雙眼角膜的新血管生成，并在第7天評定血管生成應答。通過用標度線測量從下緣開始的血管長度(L)和如前所報道(D’Amato RJ，Loughnan MS，F(xiàn)lynn E，F(xiàn)olkman J，反應停是血管生成的抑制劑(Thalidomide is an inhibitor ofangiogenesis).Proc Natl Acad Sci USA 1994 Apr 26；91(9)4082-5)的下緣的鐘時數(shù)(C)，來確定角膜新血管生成的區(qū)域。使用一個公式來確定圓形條紋段的區(qū)域C/12×3.1416[r2-(r-L)2]，其中r是測量的鼠角膜的半徑，r＝5mm。
如圖5A和圖5B所示，通過口服給藥濃度為50mg/kg/天的砷華7天，對鼠的系統(tǒng)性治療顯著抑制了bFGF誘導的鼠角膜新血管生成。并且，如圖5C和圖5D所示，對角膜環(huán)形新血管生成的長度和鐘時的抑制超過60％。圖5E證實，用砷華處理的鼠的新血管生成區(qū)域被抑制近90％。與對照組動物相比較，經(jīng)砷華處理的鼠的角膜血管密度也顯著降低。在治療的過程中，受治鼠并沒有出現(xiàn)體重減少或不尋常的行為，這表明砷華在此實驗使用的劑量下沒有毒性。
因此，本發(fā)明的砷華——固體As4O6是一種新的血管生成抑制劑，其有足夠的能力去抑制體外或體內(nèi)的血管生成。并且，砷化合物也可用于各種血管生成疾病的藥物治療。
提出本發(fā)明的上述討論的目的是進行舉例說明和描述。上述討論并不是要將發(fā)明限制為此處公開的形式。盡管本發(fā)明的描述包括描述一個或更多實施例及某些變更和改進，但是其它的變更和改進也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如本領(lǐng)域的技術(shù)人員和專家在理解本公開之后所可能做出的變更和改進。本發(fā)明保護范圍包括將實施例轉(zhuǎn)化至允許范圍，其包括替換與權(quán)利要求可互換和/或等價結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟，無論所述替換、可互換和/或等價的結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟是否在此公開。
權(quán)利要求
1.一種將砷華(固體As4O6)用于治療與血管生成相關(guān)的疾病的用途，即對患有此癥的動物給予有效量的砷華(固體As4O6)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的動物是人。
3.一種將砷華(固體As4O6)用于治療與血管生成相關(guān)的疾病的用途，即對患有此癥的動物給予一種組合物，其中含有有效量的砷華(固體As4O6)和藥學上可接受的添加劑。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的動物是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的血管生成抑制劑,特別涉及砷華(固體As
文檔編號A61P9/10GK1329891SQ01110419
公開日2002年1月9日 申請日期2001年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月29日
發(fā)明者裴一周, 徐康文, 李昌勛 申請人:裴一周