專利名稱：動(dòng)物骨髓提取物與中藥提取物配制成的保健食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物骨髓提取物與中藥提取物配制成的保健食品，具體涉及由鮮牛骨、鮮羊骨和鮮駱駝骨提取的骨髓多肽與人參、棗、枸杞提取物配制的保健食品。
骨髓多肽對(duì)人體細(xì)胞免疫功能具有促進(jìn)作用早已有文獻(xiàn)記載，如《上海免疫學(xué)》雜志，1998.04.30.18(2)上公開的“胎牛骨髓多肽對(duì)小鼠和人體細(xì)胞功能的影響”，提示該物質(zhì)對(duì)機(jī)體細(xì)胞免商功能具有促進(jìn)作用。但尚未有以鮮牛、羊和駱駝骨髓的提取物與中藥配制的食品在出版物上發(fā)表過。
本發(fā)明的目的在于提供一種保健食品，該保健品的主要原料為動(dòng)物骨和中藥。
本發(fā)明的原料包括鮮牛骨或鮮牛骨及附著組織，鮮羊骨或鮮羊骨及附著組織，鮮駱駝骨或鮮駱駝骨及附著組織，人參，棗和枸杞。
動(dòng)物骨髓提取物的制備1、按重量份70-80∶20-30∶1-5取鮮牛骨及附著組織、鮮羊骨及附著組織，鮮駱駝及附著組織清洗破碎進(jìn)行脫臭、脫腥處理。
2、蒸煮以上原料。
3、在PH4-5的條件下進(jìn)行酸水解。
4、在PH3.5-5.5，溫度35-55℃的條件下，在蛋白酶條件下，酶解。
5、將酶解后混合液濃縮為濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，得提取物骨髓多肽粉末。
中藥提取物的制備1、按重量份1∶50∶30取人參、棗、枸杞洗凈浸泡，加熱煎煮。
2、將煎煮液靜置過濾，濾液濃縮去沉淀，濃縮為稠浸膏。
3、將稠浸膏烘干得提取物粉末。
配制將動(dòng)物骨髓提取物與中藥提取物按重量份6∶0.5混合得本發(fā)明保健食品。
以上產(chǎn)品依據(jù)GB4789.2-5、10、11、15-94進(jìn)行食品衛(wèi)生檢驗(yàn)，結(jié)果如下砷(以AS計(jì)，mg/kg)0.16鉛(以Pb計(jì)，mg/kg)0.29，水分(％)3.54，總氮(％)14.52，細(xì)菌總數(shù)(個(gè)/g)1.85×103，大腸菌群(個(gè)/100g)＜30，致病菌未檢出，霉菌(個(gè)/g)＜10，酵母(個(gè)/g)＜10，符號(hào)GB16740-1997保健(功能)食品通用標(biāo)準(zhǔn)。
利用日立83550AA儀J AICP9000，依據(jù)Z/NSJ001-1997對(duì)產(chǎn)品中的微量元素的含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如下微量元素含量的單位mg/kg，磷415，鐵260，鈣211，鎂88.1，錳1.50，銅1.31，鋅9.6，硅216，鉀3356，鋁18.2，硼3.40，鍶0.07，鋰0.61，鉻0.42，鈉(％)1.44。依據(jù)GB/T14965-94對(duì)氨基酸的含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如下天冬氨酸5.01％蘇氨酸1.76％絲氨酸2.47％谷氨酸11.68％甘氨酸18.28％丙氨酸8.30％胱氨酸0.92％頡氨酸3.19％蛋氨酸1.46％異亮氨酸1.80％亮氨酸4.00％酪氨酸0.78％苯丙氨酸2.73％賴氨酸3.43％組氨酸0.87％精氨酸7.51％脯氨酸10.86％γ氨基丁酸0.68％鳥氨酸0.31％羥基脯氨酸10.15％。
通過高效液相色譜依據(jù)紫外吸收光譜分析通則分析測試其中骨髓多肽含量為0.31mg/mg。
中藥枸杞具有滋補(bǔ)肝腎，益精明目的作用，大棗具有補(bǔ)中益氣，養(yǎng)血安神的作用，人參具有大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津，安神的作用。
一、本產(chǎn)品進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)1急性毒性實(shí)驗(yàn)1.1試驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，18-20g，雌雄各10只。
1.2試驗(yàn)方法取受試物30g。用蒸餾水配成150ml均勻混懸液，按0.3ml/10g.bw經(jīng)口灌胃，灌胃前停食16h，每三小時(shí)灌胃一次，連續(xù)給予三次，累計(jì)為0.9ml/10g.bW，含固形物重為0.18g，即18g/kg.bw，觀察一周，并記錄動(dòng)物中毒癥狀及死亡情況。結(jié)果見表1表1小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果
1.3結(jié)論一周內(nèi)動(dòng)物未見明顯中毒癥狀及死亡發(fā)生，LD50＞18g/kg。按急性毒性分級(jí)，該受試物屬無毒級(jí)類物質(zhì)。
2．微核實(shí)驗(yàn)2.1試驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，24-26g，雌雄各30只。
2.2試驗(yàn)方法動(dòng)物按體重隨機(jī)分成6組，A組為陰性對(duì)照組，F(xiàn)組為環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組，另設(shè)四個(gè)試驗(yàn)劑量組。試驗(yàn)組劑量分別為2.0、4.0、6.0、8.0g/kg.bw。每只動(dòng)物經(jīng)口灌胃給予受試物。兩次灌胃間隔24小時(shí)，第二次灌胃6小時(shí)后，處死動(dòng)物，取胸骨骨髓涂片，Giemsa染色。每只動(dòng)物油鏡下觀察1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，結(jié)果如下表2微核試驗(yàn)觀察結(jié)果(X±S)
2.3結(jié)論各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組結(jié)果比較，差異無顯著必性；表明受試物骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。
3．小鼠精子畸形試驗(yàn)3.1試驗(yàn)動(dòng)物昆明種雄性小鼠，23-25g，共30只。
3.2試驗(yàn)方法動(dòng)物按體重隨機(jī)分成5組，A組為陰性對(duì)照組，E組為環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組，B、C、D組為試驗(yàn)組。試驗(yàn)組劑量分別為5.0、10.0、15.0g/kg.bw。動(dòng)物連續(xù)灌胃五天后，再繼續(xù)喂養(yǎng)30天，處死動(dòng)物，取兩側(cè)副睪涂片，伊紅染色。每只動(dòng)物高倍鏡下觀察1000個(gè)精子，記錄畸形精子數(shù)。結(jié)果見表3表3小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果(x±s)
3.3結(jié)論各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組結(jié)果比較，差異無顯著性，表明該受試物精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性。
4．Ames試驗(yàn)4.1試驗(yàn)菌珠采用經(jīng)鑒定符合生物學(xué)要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株進(jìn)行試驗(yàn)。
4.2試驗(yàn)方法采用多氯聯(lián)苯(PCB)誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿作為體外活化系統(tǒng)(±S9)。受試物分為五個(gè)劑量組，每皿加入量0.2mL含2、8、40、200、500ug受試物(以固形物計(jì))分別作為各劑量組，0.103Mpa、20min滅菌處理。同時(shí)設(shè)置空白及陽性對(duì)照組。采用平板摻入法記錄二次重復(fù)的平行樣品結(jié)果。
表4Ames試驗(yàn)結(jié)果(個(gè)/皿，x±s)
注-S9陽性對(duì)照組TA97、98、100為2、4、7-TNFone，加入量為0.3ug/皿，TA102
陽性物為敵克松，加入量為50ug/皿。
+S9陽性對(duì)照組TA97、98、100為2-AF，加入量為20ug/皿，TA102陽性物為1、8-二羥基蒽醌，加入量為50ug/皿。
4.3結(jié)論受試物各組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變數(shù)2倍，且無劑量反應(yīng)關(guān)系，故Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性。
5．30天喂養(yǎng)試驗(yàn)5.1動(dòng)物品種Wistar大鼠，共80只，體重75-90g，雌雄各半。
5.2劑量與分組設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組，每組20只動(dòng)物，雌雄各半。按人群推薦日攝入量0.1g/kg·bw擴(kuò)大20、50、100倍分別作為低、中、高劑量組，相應(yīng)實(shí)際劑量為2.0、5.0、10.0g/kg.bw。受試物給予途徑按1.5ml/100gbw經(jīng)口灌胃，連續(xù)給予30天，對(duì)照組同時(shí)給予等量蒸餾水。然后按試驗(yàn)要求測定有關(guān)的指標(biāo)。
5.3觀察指標(biāo)5.3.1臨床檢查包括一般表現(xiàn)、行為、中毒及死亡情況，記錄各組動(dòng)物每周體重和進(jìn)食量，計(jì)算食物利用率。
5.3.2血液學(xué)檢查連續(xù)給予30天后，測定后組動(dòng)物血紅蛋白(Hb)含量、紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)及分類、血小板(PLT)計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)除網(wǎng)織紅細(xì)胞為試管色法涂片計(jì)數(shù)外，其余指標(biāo)均采用日本產(chǎn)SYSMEXTMF820型自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀測定。
5.3.3血液生化學(xué)檢查連續(xù)給予30天后，測定各組動(dòng)物血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、葡萄糖(Glu)、肌酐(Cre)、總膽固醇(T.C)含量及白蛋白/球蛋白(Alb/Glo)比值。除葡萄糖采用美國Johnson公司產(chǎn)ONE TOUCHTM血糖分析儀快速紙片法測定外，其余指標(biāo)均采用德國產(chǎn)eppendorfTMECOM-F6124型自動(dòng)化分析儀、北京中生生物高技術(shù)公司生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測定。
5.3.4稱取各組動(dòng)物主要臟器重量并計(jì)算臟器系數(shù)。
5.3.5病理組織學(xué)檢查對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行大體解剖檢查，并對(duì)心、肝、脾、肺、腎等主要臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。
5.4試驗(yàn)結(jié)果5.4.1臨床檢查試驗(yàn)中各劑量動(dòng)物無中毒癥狀。體重及食物利用率結(jié)果見表5。
表中可見各劑量組動(dòng)物及食物利用率與對(duì)照組比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無顯著性。
表5受試物對(duì)大鼠體重及食物利用率的影響(x±s)
5.4.2血液學(xué)檢查各組隨機(jī)抽取部分動(dòng)物測定血液指標(biāo)，結(jié)果見表6.1、6.2。從表中可知，各項(xiàng)指標(biāo)測定結(jié)果與對(duì)照組比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無顯著性。所有血液學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。
表6.1受試物對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響(x±s)
表6.2受試物對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響(x±s)
5.4.3血液生化學(xué)檢查各組隨機(jī)抽取部分動(dòng)物測定血液生化學(xué)指標(biāo)，結(jié)果見表7.1、7.2。從表中可知，各項(xiàng)指標(biāo)測定結(jié)果與對(duì)照組比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無顯著性。
表7.1受試物對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響(x±s)
表7.2受試物對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響(x±s)
5.4.4臟器重量及系數(shù)稱取各組動(dòng)物心、肝、脾、肺、腎主要臟器重量埋頭苦干計(jì)算臟器系數(shù)，結(jié)果見表8.1、8.2。從表中可知，各劑量組各項(xiàng)指標(biāo)測定結(jié)果，與對(duì)照組比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無顯著性。
表8.1受試物大鼠臟器重量及系數(shù)的影響(X±S)
表8.2受試物大鼠臟器重量及系數(shù)的影響(X±S)
5.4.5病理組織學(xué)檢查結(jié)果對(duì)部分動(dòng)物心、肝、脾、肺、腎、腎上腺等臟器進(jìn)行大體解剖觀察和病理組織切片，除少量動(dòng)物肺組織呈現(xiàn)大鼠肺炎圖像外，其余臟器未見明顯中毒性病理改變。
由以上實(shí)驗(yàn)得知，本發(fā)明之工藝生產(chǎn)出的骨髓氨基酸多肽對(duì)兩種性別昆明種小鼠經(jīng)口毒性，累計(jì)三次經(jīng)口灌胃總量為18g/kg.bw，一周內(nèi)動(dòng)物未見明顯中毒癥狀，也無動(dòng)物死亡。按急性毒性分級(jí)，該受試物屬無毒級(jí)類物質(zhì)。三項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)(小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)、Ames試驗(yàn))結(jié)果均為陰性。30天喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明該受試物2.0、5.0、10.0g/kg.bw劑量(相當(dāng)于人群日推薦攝入量6g/60kg.bw的20、50、100倍)，對(duì)Wistar大鼠的臨床檢查(含體重增加和食物利用率)、血液學(xué)檢查、血液生化學(xué)檢查、主要臟器重量及臟器系數(shù)和病理組織學(xué)檢查均無明顯毒性影響。
二、以上產(chǎn)品進(jìn)行免疫性實(shí)驗(yàn)1．樣品給予途徑將樣品用無菌蒸餾水配成相應(yīng)濃度，各組小鼠每天經(jīng)口灌服相應(yīng)劑量，連續(xù)給予一個(gè)月后進(jìn)行以下試驗(yàn)工作。正常對(duì)照組灌服普通自來水。
2．動(dòng)物昆明種雄性小鼠，18-22g。湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物批準(zhǔn)號(hào)為鄂動(dòng)醫(yī)管字19-007。
3．分組按生產(chǎn)廠家推薦人群日飲用6g/60kg.bw，擴(kuò)大10、20、30倍，設(shè)計(jì)低、中、高三個(gè)劑量組，即1、2、3g/kg.bw。
4．試驗(yàn)方法與結(jié)果4.1試驗(yàn)前后動(dòng)物體重記錄見表1.各組動(dòng)物間體重?zé)o明顯差異。
表1試驗(yàn)前后動(dòng)物體重記錄(克，X±S)
4.2對(duì)動(dòng)物淋巴器官/體重比值的影響見表2，各組動(dòng)物間胸腺體重比和脾臟/體重比值無明顯差異。
表2對(duì)動(dòng)物沐巴器官/體重比值的影響(X±S)
4.3CouA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法MTT法(步驟同功能實(shí)驗(yàn)程序規(guī)定)結(jié)果見表3，從表3可見，與空白組比較，本產(chǎn)品中、高劑量組顯性增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖能力。
表3對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能影響
與空白組比較*P＜0.01#0.01＜P＜0.05注取0.1ml測定OD570值4.4二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)方法耳腫脹法。用DNFB致敏小鼠后，第5天再用NDFB攻擊右耳，24h后處死動(dòng)物剪下左右耳殼用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重，以左右耳的重之差來表示DTH的程度。
結(jié)果見表3，從表3可見與空白組比較，本產(chǎn)品低、中、高劑量組顯著性增強(qiáng)小鼠對(duì)DNFB誘發(fā)的DTH反應(yīng)。
4.5血清溶血素的測定方法血凝法。按照功能實(shí)驗(yàn)程序操作，根據(jù)血清凝聚程度的級(jí)別計(jì)算出抗體積數(shù)。
結(jié)果從表4可見，本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品高劑量組可顯著性升高血清溶血素含量。
表4對(duì)小鼠體液免疫功能的影響
與空白組比較*P＜0.01#0.01＜P＜0.054.6腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)方法半體內(nèi)法。制血20％的雞紅細(xì)胞懸液；每只鼠腹腔注射1mL該懸液，30min后處死動(dòng)物，將其仰立固定于鼠板上，開腹，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2mL，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠1min，然后，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片載玻片上，37℃溫育30min育畢用生理鹽水漂洗，涼干，以1∶1的丙酮甲醇溶液固定，4％Giemsa-磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，按下式計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)
結(jié)果見表5，從表5可見，本產(chǎn)品低中、高劑量吞噬百分?jǐn)?shù)、吞噬指數(shù)均明顯高于空白對(duì)照組。
表5對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
與空白組比較*P＜0.01
4.7小鼠碳廓清試驗(yàn)方法依程序規(guī)定的方法。根據(jù)注入墨汁2min、10min后血中碳濃度(測吸光值)，計(jì)算出各組小鼠的吞噬指數(shù)。
結(jié)果見表6，從表6可見，本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品低、中、高劑量組可顯著性提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù)。
表6對(duì)小鼠碳廓清功能的影響
與空白組比較*P＜0.014.8抗體生成細(xì)胞檢測方法改良Jerne玻片法(略)。
結(jié)果見表7，從表7可見，中、高劑量組均明顯高于正常對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異有顯著性(p＜0.01)。
表7對(duì)抗體生成細(xì)胞功能的影響
以上試驗(yàn)結(jié)果表明與空白組比較，1)中、高劑量組能明顯增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力；2)低、中、高劑量組能明顯增強(qiáng)二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；3)中、高劑量組能明顯升高小鼠血清溶血素含量；4)低、中、高劑量組能明顯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能；5)低、中、高劑量組能明顯增強(qiáng)小鼠碳廓清能力；6)中、高劑量組能明顯增強(qiáng)抗體生成細(xì)胞能力。按照免疫調(diào)節(jié)作用評(píng)價(jià)程序規(guī)定，該受試物具有免疫調(diào)節(jié)作用。
權(quán)利要求
1.動(dòng)物骨髓提取物與中藥提取物配伍制成的保健食品，其原料包括鮮牛骨或鮮牛骨及附著組織，鮮羊骨或鮮羊骨及附著組織，鮮駱駝骨或鮮駱駝骨及附著組織，人參，棗和枸杞。
2.如權(quán)利要求1所述動(dòng)物骨髓提取物與中藥提取物配伍制成的保健食品，其特征在于動(dòng)物骨髓提取物的原料鮮牛骨及附著組織，鮮羊骨及附著組織，鮮駱駝骨及附著組織之間的重量份為70-80∶20-30∶1-5。
3.如權(quán)利要求1所述動(dòng)物骨髓提取物與中藥提取物配伍制成的保健食品，其特征在于中藥提取物的原料人參、棗、枸杞之間的重量份為1∶50∶30。
4.如權(quán)利要求1所述動(dòng)物骨髓提取物與中藥提取物配伍制成的保健食品，其特征在于動(dòng)物骨髓提取物與中藥提取物之間的重量份為6∶0.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由動(dòng)物骨髓提取物與中藥提取物配伍制成的保健食品。其原料包括鮮牛骨或鮮牛骨及附著組織,鮮羊骨或鮮羊骨及附著組織,鮮駱駝骨或鮮駱駝骨及附著組織,人參,棗和枸杞。該保健食品具有提高機(jī)體免疫能力的功效,適合免疫能力低者服用。
文檔編號(hào)A61P37/02GK1325717SQ0111421
公開日2001年12月12日 申請(qǐng)日期2001年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月24日
發(fā)明者謝啟安 申請(qǐng)人:謝啟安