專利名稱：一種環(huán)菠蘿蜜烷三萜皂甙新化合物及其在免疫抑制和腫瘤治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從鐵破鑼全草或根莖中提取分離的一種新化合物及其衍生物，其骨架屬于環(huán)菠蘿蜜烷型三萜皂甙；本發(fā)明還涉及該化合物在制備藥物方面的用途，特別是在制備器官移植方面的免疫抑制劑、血管生成抑制藥物以及抗腫瘤藥物等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鐵破鑼[Beesia calthaefolia(Maxim.)Ulbr.]系毛茛科鐵破鑼屬(Beesia)植物；是一種民間常用草藥，也是我國特有的藥用植物。其根莖或全草藥用，具有清熱解毒，涼血，活血，消腫，鎮(zhèn)痛，散風(fēng)寒的功效；民間用來治療風(fēng)寒感冒，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，紅白痢疾，咽喉腫疼，頭痛，牙痛等病，外敷治療瘡癤和毒蛇咬傷。

發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)驗(yàn)室利用現(xiàn)代分離技術(shù)和結(jié)構(gòu)測定手段對鐵破鑼進(jìn)行化學(xué)成分研究過程中，從中分離得到一系列結(jié)構(gòu)新穎的單體化合物，通過活性篩選，發(fā)現(xiàn)這些單體化合物具有很強(qiáng)的藥理活性。本發(fā)明的目的之一是提供一種通式(1)的新化合物及其衍生物。許多醫(yī)學(xué)家認(rèn)為，臨床上器官移植的成功很大程度上歸功于一種天然產(chǎn)物—環(huán)孢菌素，環(huán)孢菌素和其它10余種非肽類藥物已經(jīng)有效地進(jìn)入臨床或臨床前開發(fā)階段，天然產(chǎn)物因此成為器官移植方面免疫抑制劑的重要源泉。其中R1為β-D-xylopyranosyl，R2為COCH3的式(1)化合物(簡稱化合物I)，該化合物在小鼠體內(nèi)試驗(yàn)可明顯抑制由ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，具有免疫抑制作用，是一種免疫抑制劑。另外通過深入的藥理活性篩選發(fā)現(xiàn)該化合物I還具有抑制微血管生成方面的活性(20μg/ml)和抑制成骨細(xì)胞增殖的活性(IC50＝32.78μg/ml)。
本發(fā)明所涉及的式(1)化合物，迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)專利或文獻(xiàn)報道。本發(fā)明的目的之二是提供一種通式(1)的新化合物及其衍生物在制備藥物方面的用途；特別是在制備器官移植方面的免疫抑制劑、血管生成抑制藥物、以及抗腫瘤藥物等領(lǐng)域。
本發(fā)明的技術(shù)方案依此包含如下步驟以鐵破鑼[Beesia calthaefolia(Maxim.)Ulbr.]根莖(3.5Kg)為原料，經(jīng)用95％乙醇回流提取兩次，每次兩小時；藥渣再用50％乙醇回流兩次，每次兩小時，合并兩次提取液后，回收溶劑，得浸膏。將浸膏用水溶解，依次用氯仿、正丁醇萃取，得氯仿萃取物292g。氯仿萃取物用硅膠柱H低壓柱層析，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫(9∶1∶0-8∶2∶0-7∶2.5∶0.5-6∶3∶1)，每份2000ml，共收集16份，其中8-11份(70g)，再次用硅膠柱H低壓柱層析，以氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫(10∶0-8∶2)，每份2000ml，共收集7份，其中1-2份合并，經(jīng)制備薄層層析(石油醚-乙酸乙酯-甲醇5∶4∶0.4展開7次)得到-白色無定形粉末，TLC檢查為單一斑點(diǎn)，得到R1為β-D-xylopyranosyl，R2為COCH3的式(1)化合物(即化合物I，1.25g)。
化合物I，白色無定型粉末，mp.196-200℃(CHCl3-MeOH)，[α]D20-11.3°(CHCl3∶MeOH 1∶1，c，0.12)，Liebermann-Burchard反應(yīng)陽性，Molish反應(yīng)陽性，薄層水解檢識有木糖。FAB-MS(見圖1)顯示m/z 685[M+Na]+，高分辨質(zhì)譜(HR FAB-MS)給出m/z663.408993[M+H]+，[Calcd 663.410824]，確定其分子式為C37H58O10，不飽和度為9。
IR譜(見圖2)在3600-3100及1040，1090cm-1出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，示甙類化合物；在1735，1240cm-1顯示強(qiáng)吸收帶，表明分子結(jié)構(gòu)中含乙?；?。1H NMR(見圖3)和13C NMR譜(見圖4)表明該化合物是一個9，19-環(huán)菠蘿蜜烷型三萜木糖甙，且含有一個乙?；鸵粋€縮酮碳(表1)。
1H NMR譜高場區(qū)顯示一對AB系統(tǒng)質(zhì)子的信號[δ0.25(1H，d，J＝4.0Hz，19-H)，0.43(1H，d，J＝4.0Hz，19-H)]，七個叔甲基質(zhì)子的單峰信號[δ1.06，1.08，1.39，1.47，1.58，1.64]和一個乙?；|(zhì)子信號[δ2.09]。糖的端基氫信號出現(xiàn)在δ4.86(1H，d，J＝7.5Hz)說明甙鍵為β構(gòu)型。低場區(qū)除了木糖質(zhì)子信號外，還顯示一對ABX系統(tǒng)信號[δ1.82(1H，d，J＝7.0Hz，H-17)；4.47(1H，dd，J＝7.0，2.0Hz，H-16)；5.67(1H，d，J＝2.0Hz，H-15)]，1H-1H COSY譜中(見圖5)，H-16與H-15，H-17兩質(zhì)子相關(guān)；HMQC譜中(見圖6)，H-15，H-16和H-17三質(zhì)子信號分別與碳譜中δ86.23(C-15)，79.86(C-16)和51.19(C-17)相關(guān)。
13CNMR譜顯示37個碳信號，糖的端基碳出現(xiàn)在δ107.64，低場區(qū)除了木糖碳和C-3信號外，還顯示3個連氧碳信號[δ72.03，82.44和110.70]；與beesioside II，IV比較，δ72.03可歸屬為C-25。根據(jù)化合物的不飽和度，扣除9，19環(huán)菠蘿蜜烷型四環(huán)三萜母核、一個糖環(huán)和一個乙?；?，分子結(jié)構(gòu)中還應(yīng)有2個環(huán)系。分子結(jié)構(gòu)中連氧季碳[δ82.44]，縮酮碳[δ110.70]和連氧叔碳[δ79.86(C-16)]提示分子結(jié)構(gòu)中存在16β，24和20，24雙環(huán)氧結(jié)構(gòu)，因此該化合物的平面結(jié)構(gòu)得以確定，同beesioside IV比較，差別在于12位無羥基取代；結(jié)合1H-1H COSY，13C-1H COSY和與beesioside IV比較，所有的碳?xì)湫盘柖嫉靡詺w屬(表1)。 化合物I分子模型顯示，若C-20為R構(gòu)型，C-24也應(yīng)為R；若C-20為S構(gòu)型，C-24也應(yīng)為S。Sakurai N等通過將觀察到的1H-1H偶合常數(shù)(J1516，J16，17)與根據(jù)Karplus公式計算值比較確定了化合物beesiosideIV中C-15，20和24的立體化學(xué)。如果C-20和24為R構(gòu)型，那么H-16和H-17之間的偶合常數(shù)應(yīng)為4.3Hz(船式)或7.2Hz(椅式)；如果C-20和24為S構(gòu)型，那么H-16和H-17之間的偶合常數(shù)應(yīng)為7.5Hz(船式)或7.0Hz(椅式)。在20R，24R情況下，如果H-15是α構(gòu)型，那么H-15和H-16之間的偶合常數(shù)應(yīng)為7.2Hz(船式)或4.7Hz(椅式)；如果H-15是β構(gòu)型，那么H-15和H-16之間的偶合常數(shù)應(yīng)為0.4Hz(船式)或7.2Hz(椅式)。在20S，24S情況下，如果H-15是α構(gòu)型，那么H-15和H-16之間的偶合常數(shù)應(yīng)為5.4Hz(船式)或8.2Hz(椅式)；如果H-15是β構(gòu)型，那么H-15和H-16之間的偶合常數(shù)應(yīng)為7.5Hz(船式)或1.7Hz(椅式)。化合物gbc-18中，J15，16＝2.0，J16，17＝7.0Hz，因此確定C-15，20和24的立體化學(xué)為20S，24S和15α-OAc。
1HNMR譜中3位氫出現(xiàn)在δ3.50(1H，dd，J＝11.5，3.5Hz)，根據(jù)其裂分方式和偶合常數(shù)大小可判斷3位氫為α構(gòu)型。與beesioside IV之甙元比較其13CNMR譜中C-3位甙化位移值(低場位移10.59ppm)，確定木糖連在C-3位。
綜合上述光譜分析，測定化合物I的結(jié)構(gòu)為(20S，24S)-15α-acetoxy-16β，24；20，24-diepoxy-9，19-cyclolanostane-3β，25-diol-3-O-β-D-xylopyranoside。
化合物I結(jié)構(gòu)測定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)IR(KBr)cm-13700-3100，2965，2930，2870，1735，1460，1380，1360，1240，1090，1040，965。FAB-MS m/z685(M+Na)+，665(M+H)+，535，453，115(100)，59，43。1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表1。
表1化合物I的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)positi δ1H(J in Hz) δ13C posit δ1H(J in Hz) δ13Con ion1 1.22m；1.58m 32.40 19 0.25d(4.0) 30.110.43d(4.0)2 1.93m；2.35m 30.11 20 82.443 3.50dd(11.5，88.46 21 1.33s 25.753.5)441.33 22 2.00m；1.65m40.075 1.31m47.50 23 2.60m；1.98m28.576 0.67q(12.5) 20.96 24 110.707 1.02m；1.30m 26.02* 25 72.038 1.76dd(12.8，47.77 26 1.64s 25.475.0)919.65 27 1.47s 25.2110 26.42 28 1.39s 24.6411 2.10m；1.05m 26.08* 29 1.06s 15.3612 1.66m；1.05m 33.13 30 1.08s 13.6613 46.54 COCH32.09s 21.4714 48.95 COCH3107.2815 5.67d(2.0) 86.23 1’ 4.86d(7.5) 107.6416 4.47dd(7.0，2.0) 79.86 2’ 4.03t(8.5) 75.5317 1.82d(7.0) 51.19 3’ 4.16t(8.5) 78.6318 1.58s21.55 4’ 4.23td(8.5，5.0)71.2119 0.25d(4.0) 30.11 5’ 3.73t(9.5) 67.130.43d(4.0)4.36dd(11.0，5.0)
經(jīng)藥理學(xué)研究，化合物I體內(nèi)試驗(yàn)具有較強(qiáng)的免疫抑制活性，體外試驗(yàn)具有較強(qiáng)的抑制血管生成活性和抑制成骨細(xì)胞增殖活性。
藥效學(xué)試驗(yàn)方法一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料與儀器小鼠Balb/c小鼠，雄性，18-20g體重；MTT四氮唑，購于Sigma公司；刀豆蛋白A購于Sigma公司；c-RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液每1000ml雙蒸水中，含RPMI-1640干粉10.4克，NaHCO32克，L-谷氨酰胺0.3克，青霉素G100U/ml，鏈霉素100ug/ml，10％小牛血清，無菌過濾；細(xì)胞工作液0.01M pH7.2的Hank’s液；SRBC取脫纖維SRBC，用生理鹽水洗至不溶血，最后取壓積SRBC配成5％、10％的SRBC懸液；樣品液準(zhǔn)確稱取樣品化合物，用蒸餾水溶解(DMSO助溶)配成1mg/ml溶液，再以生理鹽水稀釋成10μg/ml后無菌過濾。實(shí)驗(yàn)時配制成不同濃度的待測藥液。
Model 550酶標(biāo)儀Microplate Reader Instruction ManualCatalog Number 170-6750CO2培養(yǎng)箱NAPCO Model 54102.實(shí)驗(yàn)方法取樣品液給小鼠體內(nèi)腹腔注射，同時設(shè)置對照組，連續(xù)給藥七天后，分別無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，作MTT法淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，記錄OD值。
2.1 小鼠脾細(xì)胞懸液的制備將小鼠拉頸處死，用75％乙醇浸泡1-2分鐘，在超凈臺內(nèi)無菌取脾，置盛有Hank’s液的平皿中于鋼網(wǎng)上剪碎用針芯輕輕研磨，即成單細(xì)胞懸液。離心10分鐘(1000rpm)，棄上清液后洗兩次，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，細(xì)胞沉淀用c-RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)至1×107/ml濃度。
2.2 MTT法淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)新鮮分離的1×107/ml小鼠脾細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每空加入100μl，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計加入刺激劑(ConA)100μl/孔，每個樣品設(shè)三個平行孔并設(shè)對照孔(僅加c-1640)，每孔總體積200μl，然后將培養(yǎng)板置于37℃的5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。取出培養(yǎng)板，每孔吸棄上清夜100μl，各孔加5mg/ml MTT 10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。取出培養(yǎng)板，各孔加10％ SDS裂解液100μl，放培養(yǎng)箱中過夜，于570nm處酶標(biāo)儀比色測定OD值，并計算轉(zhuǎn)化值OD值。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果MTT法淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
表2化合物I對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖的影響(OD值±SD)給藥量 轉(zhuǎn)化值OD± ΔOD組別(ng) SD空 0 0.617 -白對照化10 0.285±0.00 -0.368合物I 8化50 0.323±0.03 -0.294合物I 3T淋巴細(xì)胞在體外受到非特異性有絲分裂原(ConA)刺激后，能轉(zhuǎn)化為體積較大、代謝旺盛并能進(jìn)行分裂的淋巴細(xì)胞，在這一過程中，加入淡黃色的MTT可被還原成藍(lán)紫色的MTT甲，產(chǎn)生的甲量與代謝水平呈正比。所以通過對溶解甲后藍(lán)紫色液體透光度的比色，根據(jù)OD值即可判定淋巴細(xì)胞的增殖程度。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，單體化合物I在小鼠體內(nèi)給藥時可明顯抑制由ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，具有免疫抑制作用，是一種免疫抑制劑。
二、雞胚尿囊膜(CAM)試驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察單體化合物I對新生血管生成的影響2.實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)方法a.樣品來源從鐵破鑼中分離得到的單體化合物I。
b.種蛋來源購自中國國防大學(xué)。
c.藥品制備及對照0.5mg單體化合物I溶于75％乙醇37.5μl，再加生理鹽水至總體積100μl，即得5mg/ml藥液，等體積混合溶媒做陰性對照，1∶3氫考肝素混合液做陽性對照。
d.雞蛋孵化將種蛋置恒溫、恒濕(37℃，60％)孵化箱中孵化，72小時后打破蛋殼入100mm平皿中繼續(xù)孵化72小時之后加藥(見下)。
e.加藥將上述5mg/ml濃度藥液稀釋至20μg/ml，溶媒對照做同樣稀釋后加在自制約2mm玻璃纖維濾紙片上，每片加藥液3μl(藥片)，將藥片分別放在雞胚尿囊膜血管分枝處，24小時后解剖顯微鏡下觀察該處血管變化。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)結(jié)果加化合物I的藥片處，血管發(fā)生自溶現(xiàn)象，無新生血管形成；溶媒對照藥片處血管無變化；氫考-肝素藥片處血管出現(xiàn)空白，無新生血管形成。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論腫瘤細(xì)胞分裂增生迅速，腫瘤的生長伴隨著微循環(huán)方面的血管增生，其營養(yǎng)成分是靠毛細(xì)血管運(yùn)輸?shù)?；雞胚尿囊膜(CAM)試驗(yàn)旨在檢驗(yàn)藥品對微循環(huán)方面的影響，從這一角度評價和篩選抗腫瘤藥物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單體化合物I有抑制微血管生成方面的活性。三、成骨細(xì)胞體外試驗(yàn)和對堿性磷酸酶的影響1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康膯误w化合物I對Wistar大鼠頭蓋骨成骨細(xì)胞增殖的影響和對堿性磷酸酶的影響。
2.成骨細(xì)胞體外試驗(yàn)方法及步驟無菌條件下取新出生的Wistar大鼠頭蓋骨，分離出頂骨和額骨，在D-HankS液中剝離纖維性骨膜后，切碎，經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化15min，每3分鐘振蕩一次，棄去消化液，以0.1％I型膠原酶10ml在37℃，消化2次，每次60min，收集消化液，1000rpm離心5min，去上清，將細(xì)胞接種于含20％小牛血清F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h換液，2-3天待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶時，傳代培養(yǎng)，所用實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均為第3-5代細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)時用細(xì)胞濃度為3萬細(xì)胞/ml。
步驟a.96孔平底中加入0.1ml細(xì)胞，37℃5％CO2培養(yǎng)24h。
b.每孔加入不同濃度含受試藥液、溶劑或空白20μl，每孔加入F12完全培基80μl，整個反應(yīng)體系為200μl，37℃培養(yǎng)72h。
c.換無血清培養(yǎng)液，每孔0.1ml。
d.加入20μl，5mg/ml MTT容液e.37℃孵育4h，f.吸出120μl，(倒掉)g.加入200μl二甲基亞砜，搖勻h.于570nm于酶標(biāo)儀上測定各孔的吸光度值。
3.成骨細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3及圖7。
4.試驗(yàn)結(jié)論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單體化合物I對成骨細(xì)胞具有抑制作用，抑制率IC50＝32.78μg/ml，另外對堿性磷酸酶活性實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)單體化合物I對堿性磷酸酶具有顯著的抑制作用，抑制程度為“+”


圖1化合物I的FAB-MS譜；圖2化合物I的IR光譜；圖3化合物I的1H-NMR譜；圖4化合物I的13C-NMR譜；
圖5化合物I的1H-1H COSY譜；圖6化合物I的HMQC光譜；圖7化合物I的成骨細(xì)胞抑制率。
表3化合物I的成骨細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種環(huán)菠蘿蜜烷三萜皂甙新化合物及其衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為 式中R1為H時，R2為H或-COCH3；R1為OH時，R2為H。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物及其衍生物，其中通式中R1為H，R2為-COCH3。
3.一種制備權(quán)利要求1或2的化合物及其衍生物的方法。
4.權(quán)利要求1或2所述化合物及其衍生物在制備治療藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中的藥物為免疫抑制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中的藥物為血管生成抑制劑及抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及從鐵破鑼全草或根莖中提取分離的一種新化合物及其衍生物,它具有式(1)化學(xué)結(jié)構(gòu)通式和免疫抑制活性、抑制血管生成活性和抑制成骨細(xì)胞增殖活性,本發(fā)明還涉及該化合物及其衍生物在制備藥物方面的用途,特別是在制備器官移植方面的免疫抑制劑,抑制血管生成方面的藥物,以及抗腫瘤藥物等領(lǐng)域。
文檔編號A61P37/00GK1342656SQ01123448
公開日2002年4月3日 申請日期2001年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月25日
發(fā)明者楊峻山, 鞠建華 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所