專利名稱：含伴刀豆蛋白a的復(fù)合移植體,其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)，特別是涉及含伴刀豆蛋白A的復(fù)合移植體，其制備方法及其在治療因各種原因?qū)е碌能浌墙M織損傷中的應(yīng)用。
超過關(guān)節(jié)軟骨生理耐受能力的撞擊、剪切、扭曲和摩擦等外力均可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨或其它永久軟骨的機(jī)械損傷。由于成年哺乳動物的關(guān)節(jié)軟骨缺乏直接血液、淋巴及神經(jīng)供應(yīng)，加之其代謝效率很低，所以成熟的關(guān)節(jié)軟骨組織一旦受到損傷，將很難以自然修復(fù)。一般說來，軟骨再生主要依賴于活的軟骨細(xì)胞的存在。在軟骨再生過程中，首先由相似于成纖維細(xì)胞的某些細(xì)胞增殖形成幼稚組織，然后由這些細(xì)胞分化成軟骨母細(xì)胞并合成軟骨基質(zhì)。分化并增殖的細(xì)胞被埋入軟骨隱窩內(nèi)以形成靜止的軟骨細(xì)胞。另一方面，軟骨細(xì)胞不僅自然修復(fù)十分緩慢，而且修復(fù)的組織還常常隨時間的推移而發(fā)生退行性變化。因此，修復(fù)因創(chuàng)傷、炎癥及各種退行性病變和先天性疾病等引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷，一直是組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里的一個難以解決的問題。
近年來，隨著關(guān)節(jié)鏡技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用和運(yùn)動醫(yī)學(xué)的發(fā)展，已相繼出現(xiàn)并在臨床上使用了許多關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)技術(shù)。例如，這些技術(shù)包括(1)人為損傷軟骨下骨并暴露骨髓腔以促進(jìn)軟骨再生；(2)利用骨—軟骨移植(包括自體和異體移植)技術(shù)修復(fù)軟骨組織；(3)通過軟骨膜或骨膜移植再生軟骨組織；(4)局部應(yīng)用生長因子(如IGF、bFGF、PDGF、TGF-β、HGF、CGF及BMP等)促進(jìn)軟骨組織原位再生和修復(fù)。
組織工程學(xué)是二十世紀(jì)九十年代逐步建立并發(fā)展起來的一門綜合學(xué)科。它應(yīng)用工程學(xué)的基本原理和方法，預(yù)先在體外構(gòu)建一個具有生物學(xué)活性的移植體，然后植入哺乳動物體內(nèi)，以修復(fù)組織缺損，代替組織或器官的部分或全部功能，或作為一個體外裝置，暫時替代器官的部分功能，達(dá)到延長包括人在內(nèi)的哺乳動物生命，提高生存質(zhì)量的目的。組織工程的基本要素是活的細(xì)胞、可供細(xì)胞完成生命周期的支架材料以及細(xì)胞與支架材料之間的相互作用。目前已開展的組織工程研究涉及軟骨、骨、肌腱、肌肉、血管、皮膚、肝臟、胰臟、腎臟及血管等組織或器官。其中，軟骨組織因細(xì)胞成分單一、支架材料來源充分，所以有關(guān)軟骨組織修復(fù)及其代用品的研究在組織工程領(lǐng)域相對起步較早。
利用組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨缺損的基本步驟包括體外培養(yǎng)并增殖少量所需的特異性組織細(xì)胞；將所得到的活細(xì)胞移植到預(yù)制備的基質(zhì)材料中繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞與基質(zhì)材料充分結(jié)合后，將所得到的結(jié)合體植入體內(nèi)特定部位，以其代替受損組織或器官并在原位發(fā)揮這些組織或器官的功能。
軟骨細(xì)胞是目前軟骨組織工程的主要細(xì)胞來源?？陕?lián)合使用機(jī)械分離和酶(如膠原酶)消化方法從軟骨組織中制備軟骨細(xì)胞培養(yǎng)物。軟骨細(xì)胞單層(二維)培養(yǎng)方法的缺陷在于多次傳代細(xì)胞常常出現(xiàn)反分化現(xiàn)象。Benya等人(Benya and Shaffer，Cell 30373，1982)首次利用瓊脂糖凝膠基質(zhì)成功地完成了軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)。他們的研究還證明，在這種三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，不僅可有效地保留體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的固有表型，而且可使已出現(xiàn)反分化的細(xì)胞回復(fù)其高分化狀態(tài)和細(xì)胞表型。此后，其它一些研究者也相繼利用膠原蛋白凝膠(Yasui et al.，Exp.Cell Biol.5092，1982)和海藻糖凝膠(Hanselman et al.，J.Cell Sci.10717，1994)以及多聚2-羥乙基甲基丙烯酸鹽含水凝膠(Reginate et al.，Arthritis.Rheum.37(9)1338，1994)培養(yǎng)得到了具有穩(wěn)定表型和典型形態(tài)特征的軟骨細(xì)胞或組織。為了克服三維培養(yǎng)系統(tǒng)存在的難以大量回收增殖細(xì)胞的問題，也已將微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)引入哺乳動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)。研究證明，使用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)，特別是使用II型膠原蛋白微載體培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，不僅可顯著提高細(xì)胞增殖速度，而且可長時間保持細(xì)胞表型及生理功能(Freed et al.，Biomaterials 51257，1993；Frondoza et al.，Biomaterials 17879，1996)。
在組織工程中，三維支架起到臨時細(xì)胞外基質(zhì)作用，為細(xì)胞提供附著、增殖、分化和代謝場所。更具體地說，在軟骨組織工程中，軟骨細(xì)胞以其所附著的三維支架為模板發(fā)生并形成新的軟骨組織。軟骨組織工程的支架材料可以是天然或合成來源的。其中纖維蛋白、膠原蛋白等天然生物材料是軟骨組織工程研究中最常也是最早使用的支架材料。由于這些材料本身就是細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分，故具有良好的組織兼容性，并具有軟骨細(xì)胞生長與分化狀態(tài)良好和易于形成相應(yīng)的軟骨組織等優(yōu)點。但由于材料來源的生物學(xué)差異性，而致使目前尚難以實現(xiàn)大批量生產(chǎn)。與天然材料相比，人工合成的材料具有可隨意控制分子量、降解時間和疏水性，以及具有良好的組織兼容性等優(yōu)點，所以也常被用作組織工程的支架材料。目前常用的合成材料包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酯(PGA)或它們的共聚物。
自Chesterman等人首次利用體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損以來，一些研究者相繼利用不同的基質(zhì)材料和不同來源的軟骨細(xì)胞進(jìn)行軟骨組織工程和軟骨修復(fù)實驗研究，已取得了某些成功的經(jīng)驗，并為進(jìn)一步的深入研究和臨床應(yīng)用提供了有益的探索。
顏煒群等人(Weiqun Yan et al.，J.Biol.Chem.272(12)7833-7840，1997；Weiqun Yan et al.，J.Biol.Chem.265(17)10125-10131，1990)的研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞有絲分裂原伴刀豆蛋白A(ConA)可抑制軟骨細(xì)胞的DNA合成，并促進(jìn)細(xì)胞高分子硫酸化蛋白糖(PG)、堿性磷酸酶(AKPase)和維生素D3受體的合成，及細(xì)胞外基質(zhì)中鈣的攝入和沉積。觀察結(jié)果表明，ConA對體外培養(yǎng)的靜止軟骨細(xì)胞的成熟化和終末分化具有顯著的特異性促進(jìn)作用。然而，ConA對在體軟骨細(xì)胞生長和軟骨組織生長的生物學(xué)作用，迄今尚未見報導(dǎo)。
本發(fā)明人在上述現(xiàn)有技術(shù)研究成果的基礎(chǔ)上，制備了含淋巴細(xì)胞有絲分裂原伴刀豆蛋白A(ConA)的膠原蛋白凝膠，并以其作為修復(fù)哺乳動物軟骨組織損傷的移植體。將所說的移植體植入哺乳動物關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨組織損傷部位，觀察4～20周后，結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，不僅受損傷的軟骨組織得以充分修復(fù)，而且再生的軟骨組織在組織學(xué)和生理、生化特征上基本接近或相同于正常軟骨組織，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于修復(fù)哺乳動物軟骨組織損傷的移植體，特征在于所說的移植體基本上是由膠原蛋白基質(zhì)和均勻地分散在所說基質(zhì)中的凝集素組成的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施案方案，其中所說的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物、Lentil、WGA、PHA-L或PHA-P，以及UEA或它們的衍生物或片段。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施案方案，其中所說的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物或片段。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施案方案，其中所說的伴刀豆蛋白A衍生物選自由一個、二個、四個、八個或十六個分子量為26KDa的亞單位構(gòu)成的單體、二聚體、天然存在形式的四聚體、八聚體和十六聚體伴刀豆蛋白A，以及其一個或多個亞單位結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈被選自琥珀酸、唾液酸的有機(jī)酸或選自烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、酯基、羧基或羥基的脂族或芳族基團(tuán)取代的衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施案方案，其中所說的膠原蛋白是膠原蛋白I或II。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施案方案，其中所說的膠原蛋白是膠原蛋白II。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施案方案，其中所說的膠原蛋白是天然或合成來源的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施案方案，其中所說的膠原蛋白是人、牛、馬、羊或豬來源的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施案方案，其中所說的膠原蛋白是人來源的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施案方案，其中所說的移植體中伴刀豆蛋白A的含量約為1至100μg/ml膠原凝膠基質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施案方案，其中所說的膠原蛋白基質(zhì)可以是膠原蛋白與甲殼素的0.1∶1至10∶1(w/w)混合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施案方案，其中所說的移植體還可含有一種或多種選自堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、血小板衍生的生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、肝細(xì)胞生長因子、軟骨細(xì)胞生長因子和骨形成蛋白的細(xì)胞生長因子。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備如上限定的移植體的方法，該方法包括(1)提供含有培養(yǎng)液的適當(dāng)濃度的膠原蛋白基質(zhì)；(2)在所說的溶液中加入適當(dāng)濃度的植物凝集素，并混合均勻；(3)將所得到植物凝集素-膠原蛋白混合液于大約37℃下保溫約30分鐘，以得到半固態(tài)凝膠；(4)必要時凍干所說的凝膠。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的膠原蛋白基質(zhì)還可以是膠原蛋白與甲殼素的0.1∶1至10∶1(w/w)混合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的伴刀豆蛋白A或其衍生物的濃度為1至100μg/ml。
本發(fā)明的再一個目的是提供如上限定的移植體在修復(fù)哺乳動物軟骨組織損傷中的應(yīng)用。


圖1A和1B分別顯示在兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷部位植入含有50μg/ml ConA的移植體8周后的局部組織的40×(圖1A)和100×(圖2B)顯微照片。其中箭頭A指示正常軟骨組織；箭頭B指示修復(fù)的軟骨組織。
圖2A和圖2B分別顯示在兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷局部植入含ConA(圖2A)和bFGF(圖2B)的移植體12周后的局部組織顯微照片(EB，100×)。其中箭頭A指示正常軟骨組織；箭頭B指示修復(fù)的軟骨組織。
一般說來，軟骨組織在由靜止期向成熟期轉(zhuǎn)變過程中，主要表現(xiàn)有下列三個方面的形態(tài)與生物學(xué)特征(1)細(xì)胞由扁平形狀逐漸變成圓形；(2)細(xì)胞增殖速度逐漸減慢或停止增殖；(3)細(xì)胞合成并在細(xì)胞外基質(zhì)中大量堆積高分子量蛋白多糖。顏煒群等人(Weiqun Yan et al.，J.Biol.Chem.272(12)7833-7840，1997；Weiqun Yan et al.，J.Biol.Chem.285(17)10125-10131，1990；Weiqun Yan et al.，J.Bone Miner.Metab.1377-80，1995)以前的體外實驗發(fā)現(xiàn)，在離體條件下，伴刀豆蛋白A(ConA)可抑制培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的DNA合成，同時促進(jìn)軟骨細(xì)胞蛋白多糖和堿性磷酸酶的合成。他們的研究還表明，ConA及某些其它植物凝集素可強(qiáng)有力的誘導(dǎo)靜止的軟骨細(xì)胞發(fā)生上述細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)改變，并證明ConA等植物凝集素具有促進(jìn)靜止的軟骨細(xì)胞成熟化、終末分化和鈣化的生物學(xué)活性。因此推測有可能將植物凝集素，特別是ConA作為一種哺乳動物軟骨組織的再生誘導(dǎo)劑，用于誘導(dǎo)和促進(jìn)軟骨組織損傷的修復(fù)。
因此本發(fā)明提供了一種基本上以膠原蛋白凝膠為基質(zhì)，并含有適當(dāng)濃度的植物凝集素特別是伴刀豆蛋白A的移植體，其制備方法及在治療哺乳動物因各種原因?qū)е碌能浌墙M織損傷中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，作為軟骨組織再生誘導(dǎo)劑的植物凝集素可以是任何一種植物凝集素，包括但不只限于天然或合成來源的ConA、Lentil、WGA、PHA-L和PHA-P，以及UEA(I或II)，但其中特別優(yōu)選的是ConA。伴刀且蛋白A(ConA)作為一種已知的有絲分裂原，最初是從豆科植物的種子中分離并純化的。迄今尚未見動物組織中存在有ConA。已知ConA可與淋巴細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)并促進(jìn)淋巴細(xì)胞的有絲分裂和增殖。
作為本發(fā)明的軟骨組織修復(fù)移植體的基質(zhì)材料，可以使用任何天然或合成來源的膠原蛋白或膠原蛋白與甲殼素的0.1∶1至10∶1(w/w)混合物。膠原蛋白可以是由人、牛、馬、羊、豬或狗的肌腱組織中天然提取的，或以化學(xué)方法或DNA重組技術(shù)人工合成的。其中優(yōu)選的是人膠原蛋白I或II，特別是人膠原蛋白I?？梢园凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法從上述來源分離并純化膠原蛋白I或II，特別是人膠原蛋白II或其衍生物或片段?；蛘撸部苫谀z原蛋白的氨基酸序列，以肽合成方法或DNA重組技術(shù)合成或在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的膠原蛋白或其片段，或它們的衍生物。為避免可能發(fā)生的免疫原性反應(yīng)，最好使用同種動物來源的膠原蛋白或衍生物。
膠原蛋白是結(jié)締組織的基質(zhì)成分之一。在正常生理條件下，膠原蛋白形成具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膠原纖維，為細(xì)胞粘附、生長、分化與代謝提供極好的支架材料和部分營養(yǎng)支持。膠原蛋白還具有良好的組織兼容性和促進(jìn)組織修復(fù)的功能。因此，以膠原材料作為組織充填材料可更有利于促進(jìn)細(xì)胞或組織的再生與修復(fù)。
為了制備用于關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)的本發(fā)明的移植體，例如可在冰水浴中將0.1％至0.5％(w/v)的膠原蛋白溶液與等體積培養(yǎng)基A(含有10％新生小牛血清、50mg/L抗壞血酸和60mg/L卡那霉素的2×MEM培養(yǎng)基)相混合。然后向所得混合物中加入不同劑量的ConA。將此ConA/膠原蛋白混合物于30℃保溫30分鐘后，即可得到可直接用作哺乳動物軟骨組織損傷修復(fù)材料的凝膠狀移植體。為了便于儲存，必要時可在常規(guī)凍干條件下凍干所說的凝膠。一般說來，如此得到的移植體中ConA的濃度為大約1～100μg/ml，最好為大約20～80μg/ml。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，雖然用于制備本發(fā)明的移植體的優(yōu)選植物凝集素是ConA，但某些情況下也可使用其它已知的植物凝集素，例如Lentil、WGA、PHA-L和PHA-P，以及UEA等代替ConA。與ConA相比，雖然這些植物凝集素刺激靜止的軟骨細(xì)胞成熟化和終末分化的活性較弱，但它們亦可作為制備本發(fā)明的軟骨修復(fù)移植體的候選物質(zhì)。在此應(yīng)特別指出的是，由于包括ConA在內(nèi)的植物凝集素的完整分子均具有凝集紅細(xì)胞的作用，所以必要時可制備并選擇使用這些植物凝集素的片段或片段組合或其衍生物。所有這些片段、片段組合或功能類似物或衍生物都將包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的移植體可用于修復(fù)包括人在內(nèi)的各種哺乳動物因各種原因?qū)е碌能浌呛?或骨組織損傷。所說的軟骨和/或骨組織損傷可以是由于創(chuàng)傷等機(jī)械損傷、化學(xué)損傷和各種病原微生物引起的感染性或非感染性損傷及免疫功能失調(diào)(如變態(tài)反應(yīng)或自家免疫病等)導(dǎo)致的軟骨和/或骨損傷。其中所說的哺乳動物包括人、牛、馬、羊、豬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠和豚鼠等。
在某些情況下，特別是當(dāng)局部軟骨組織損傷過多，或合并有周圍軟組織損傷如關(guān)節(jié)周圍軟組織損傷時，或損傷部位距離骨髓腔較遠(yuǎn)時，也可在本發(fā)明的移植體中加入一種或多種已知具有細(xì)胞或組織再生促進(jìn)活性的生長因子。這些生長因子包括但不只限于堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子2(IGF-II)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、軟骨細(xì)胞生長因子(CGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)以及骨形成蛋白(BMP)等。我們的實驗研究表明，在附加使用生長因子的情況下，生長因子可與ConA發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步加速局部軟骨組織和其周圍軟組織的修復(fù)和傷口愈合，并可大大減少ConA的使用濃度。一般說來，在聯(lián)合使用ConA和生長因子如bFGF時，ConA的濃度可限制在大約10～20μg/ml，生長因子(bFGF)的濃度可限制在大約1～5ng/ml。
為了觀察ConA等植物凝集素在活體條件下對軟骨細(xì)胞成熟與分化的誘導(dǎo)和刺激活性，進(jìn)而研究本發(fā)明的基本上由膠原蛋白和ConA組合的移植體的臨床適用性。本發(fā)明利用關(guān)節(jié)軟骨機(jī)械創(chuàng)傷動物模型，全面觀察了不同濃度ConA對動物活體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨組織的再生和修復(fù)作用(參見實施例2)，并比較了本發(fā)明的ConA-膠原蛋白復(fù)合移植體與生長因子(bFGF)-膠原蛋白復(fù)合移植體在促進(jìn)受損傷的關(guān)節(jié)軟骨再生和修復(fù)中的不同效果(參見實施例3)。
在為本發(fā)明目的所進(jìn)行的動物實驗研究中，使用以機(jī)械方法造成膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損(深達(dá)軟骨下骨板，直徑5mm)的新西蘭大白兔作為模型。實驗組動物在軟骨缺損處植入按上述方法制備的ConA-膠原蛋白復(fù)合體。以損傷部位只植入膠原蛋白凝膠(或其凍干制品)的動物作為陰性對照組，并以損傷部位未植入任何材料的動物作為空白對照組。分別于手術(shù)后第4、8、12和20周處死動物，觀察在添加不同濃度的ConA的情況下，本發(fā)明的ConA-膠原蛋白凝膠移植體誘導(dǎo)動物關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的能力及其效果。
結(jié)果可見，手術(shù)植入后第4～20周，每毫升體積含20和50μg ConA的移植體顯著地誘導(dǎo)了缺損區(qū)軟骨組織的再生與修復(fù)。植入后第4周，可見缺損區(qū)已幾乎被再生的組織完全充填，但修復(fù)區(qū)與周圍正常組織分界明顯。再生的組織中的表層可見大量非融合的軟骨細(xì)胞，而且基底部有明顯的新生骨小梁形成。第20周時可見再生的組織表面光滑，并與周圍正常組織融合良好。組織學(xué)檢查可見再生的組織內(nèi)有軟骨陷窩形成，且陷窩內(nèi)有大量圓形軟骨細(xì)胞積聚。相反，第4～12周時對照組動物的關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)只有少量白色軟骨組織不完全充填，而且表面粗糙；組織學(xué)觀察可見缺損區(qū)以纖維樣組織修復(fù)為主，陷窩內(nèi)未見有典型的成熟期透明軟骨細(xì)胞。第20周時，對照組動物軟骨缺損部位仍以纖維組織修復(fù)為主，而且再生的組織表面亦不規(guī)則。
基于已在體外實驗中證實的肝細(xì)胞生長因子(HGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)對培養(yǎng)的哺乳動物關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖促進(jìn)活性，我們還分別制備了含有這些細(xì)胞生長因子的移植體材料(HGF和bFGF的濃度分別為5μg/ml和10μg/ml)，并按上述同樣方法觀察了這些移植體對在體軟骨組織的修復(fù)活性，同時與ConA相比較。與以前的體外細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果相符，可見細(xì)胞生長因子HGF和bFGF在體內(nèi)條件下同樣表現(xiàn)有明顯的軟骨細(xì)胞再生與修復(fù)促進(jìn)活性。例如在植入含有這些因子的移植體后(第8-20周)，軟骨缺損區(qū)逐漸被新生的軟骨組織充填，而且與正常組織融合良好，基底部亦可見有與正常骨小梁相似的再生并鈣化的骨組織形成。然而平行的比較實驗也表明，在軟骨組織修復(fù)速度和再生修復(fù)質(zhì)量上，這些生長因子明顯地不如ConA移植體。
另外，我們的初步實驗結(jié)果還顯示，在某些情況(如軟骨組織缺損面積較大，或移植體宿主的組織再生能力較差，或合并有關(guān)節(jié)軟骨組織損傷等情況)下，可在膠原蛋白基質(zhì)中加入適當(dāng)量的細(xì)胞生長因子及甲殼素或甲殼多糖，以期在這些因子的協(xié)同作用下，更有利地加速和促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨組織的再生與修復(fù)。當(dāng)ConA與生長因子(如bFGF)聯(lián)合使用時，可適當(dāng)?shù)販p少兩者在膠原蛋白或膠原蛋白/甲殼素基質(zhì)中的摻入量。例如，可將ConA和生長因子(如bFGF)的濃度分別限制在5～20μg/ml和0.5～5μg/ml基質(zhì)。
為了誘導(dǎo)局部軟骨組織(如關(guān)節(jié)軟骨組織)的再生與修復(fù)，也可使用局部關(guān)節(jié)腔內(nèi)直接注射方法投用ConA或溶液態(tài)膠原蛋白/ConA混合物。然而，我們的比較實驗結(jié)果顯示，直接局部關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射ConA或ConA/膠原蛋白溶液所產(chǎn)生的軟骨組織修復(fù)效果遠(yuǎn)不如關(guān)節(jié)腔內(nèi)植入本發(fā)明的ConA/膠原蛋白或ConA/膠原蛋白/甲殼素移植體(數(shù)據(jù)未出示)。很顯然，這種差異主要是由于溶液態(tài)ConA在游離狀態(tài)下半衰期相對較短，而且注入組織(如關(guān)節(jié)腔內(nèi))后可被組織液(如關(guān)節(jié)液)稀釋，或通過周圍軟組織吸收而進(jìn)入全身血液循環(huán)系統(tǒng)，從而降低了局部有效濃度，影響了其生物學(xué)活性的發(fā)揮。反之，如使用本發(fā)明的凝膠態(tài)或凍干的固態(tài)移植體時，作為ConA之載體材料的膠原蛋白，其不僅本身具有一定的組織再生促進(jìn)活性，而且還為新的細(xì)胞和組織的再生提供一個良好的三維空間環(huán)境，從而更有益于其空隙中ConA分子的緩慢釋放，以長時間保持局部有效濃度和其生物學(xué)作用的發(fā)揮。
在生理條件下，骨內(nèi)成骨過程包括靜止軟骨細(xì)胞成熟化和成熟的軟骨細(xì)胞向肥大軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變(即終末分化)兩個階段。在胚胎時期，大部分軟骨細(xì)胞經(jīng)終末分化完成軟骨內(nèi)成骨過程。但在出生后，則只有小部分軟骨細(xì)胞保留軟骨內(nèi)成骨功能(如垢板軟骨和肋軟骨生長板軟骨細(xì)胞)，以支持骨的縱向生長。我們的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，植物凝集素在誘導(dǎo)缺損軟骨組織再生的同時，還可刺激并誘導(dǎo)軟骨下骨區(qū)域的軟骨內(nèi)成骨過程，即在局部投用ConA等植物凝集素后，可見軟骨缺損區(qū)基底部有明顯的軟骨組織鈣化和海綿狀新生骨小梁形成。因此可以認(rèn)為，ConA能夠在活體條件下誘導(dǎo)軟骨再生和軟骨內(nèi)成骨的全過程，即軟骨細(xì)胞終末分化、骨吸收和新骨形成，以及進(jìn)一步的骨組織改建。
下列實施旨在舉例描述，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在此應(yīng)特別指出的是，在不背離本發(fā)明的基本精神和原則的前提下，對本發(fā)明的個別技術(shù)細(xì)節(jié)的任何改動和改變均將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實施例1以膠原蛋白和甲殼素為基質(zhì)材料的復(fù)合移植體的制備向大約1 00ml預(yù)制備的0.3％人膠原蛋白(Sigma)溶液中加入約100ml含10％新生牛血清(Gibco)、50mg/L抗壞血酸和60mg/L卡那霉素的2×MEM培養(yǎng)基(Gibco)。經(jīng)簡單混合后，向所得混合物中加入大約150mg甲殼素和5mg ConA(Sigma)，并于室溫下緩慢攪拌均勻。然后將如此得到的混合物倒入淺盤中，并置于37℃孵箱中保溫30分鐘，以形成其中均勻地分散有ConA的膠原-甲殼素凝膠。為了便于儲存起見，可將這樣的凝膠塊切成約10×15×20mm大小，并置于凍干機(jī)中冷凍干燥，以得到帶有致密微孔結(jié)構(gòu)的含ConA的軟骨修復(fù)移植體。
實施例2ConA對生理條件下關(guān)節(jié)軟骨再生與修復(fù)及軟骨內(nèi)成骨的影響選擇平均體重約2.5kg的雄性新西蘭大白兔30只，隨機(jī)分成6組，每組5只動物。用3％戊巴比妥(50mg/kg)經(jīng)腹腔內(nèi)注射麻醉動物后，將動物固定于操作臺上。經(jīng)臏骨外側(cè)手術(shù)切開動物膝關(guān)節(jié)，暴露股骨遠(yuǎn)端臏骨面關(guān)節(jié)軟骨。用手工鉆在關(guān)節(jié)軟骨表面造成直徑為5，深達(dá)軟骨下骨板的全層軟骨缺損。
實驗組動物(第3-6組)分別在膝關(guān)節(jié)軟骨缺損部位植入基本上按實施例1所述方法制備的，以牛膠原蛋白為基質(zhì)材料的移植體。各實驗組動物所使用的移植體中ConA的濃度分別為10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml和100μg/ml。對照組分別為不植入任何材料的空白對照組(第1組)和只植入同樣大小不含ConA的空膠原蛋白凝膠的陰性對照組(第2組)。植入手術(shù)完成后，包扎動物膝關(guān)節(jié)傷口并將動物送回籠中正常飼養(yǎng)。植入后第4周處死動物，解剖膝關(guān)節(jié)，進(jìn)行組織學(xué)觀察和評價。結(jié)果如下列表1所示。
表1ConA對大白兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型的組織再生和修復(fù)作用
從表1所示的結(jié)果可以看出，與我們以前的體外細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果相符，植物凝集素ConA在體內(nèi)環(huán)境下同樣表現(xiàn)有明顯的軟骨組織原位再生和軟骨內(nèi)成骨誘導(dǎo)與促進(jìn)活性(也參見圖1A和1B)，并且在使用膠原蛋白凝膠作為基質(zhì)的情況下，ConA局部給藥劑量與軟骨組織修復(fù)效果之間存在著明顯的量效關(guān)系。另外，實驗還表明，ConA促進(jìn)軟骨組織原位再生和軟骨內(nèi)成骨的局部有效濃度為20～50μg/ml，增大這一濃度似乎不會進(jìn)一步改善其使用效果。
實施例3ConA與bFGF促進(jìn)軟骨組織再生與修復(fù)作用的比較選擇平均體重約為2.5 的雄性新西蘭大白兔15只，按照實施例3種所述的方法制備關(guān)節(jié)軟骨缺損動物模型，并將這些模型動物隨機(jī)分成三組，每組5只動物。第1組為只植入空膠原蛋白+甲殼素基質(zhì)(參見實施例1)的空白對照組；第2組為植入以膠原蛋白+甲殼素為基質(zhì)材料制備的含bFGF(10μg/ml)的移植體；第3組為植入以同樣基質(zhì)材料制備的含ConA(50μg/ml)的移植體。移植手術(shù)后，分別于第4、8、12和20周處死動物，解剖膝關(guān)節(jié)并制備創(chuàng)傷局部的組織學(xué)切片，然后進(jìn)行顯微鏡(100×)下組織學(xué)觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果如下列表2所示。
表2ConA與bFGF促進(jìn)和誘導(dǎo)大白兔關(guān)節(jié)軟骨組織再生和修復(fù)作用的比較
從上列表2所示的結(jié)果可以看出，雖然某些細(xì)胞生長因子(如bFGF等)在哺乳動物活體內(nèi)也表現(xiàn)有顯著的關(guān)節(jié)軟骨再生與修復(fù)刺激活性，但在長時間連續(xù)觀察期間，可見ConA誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨組織原位再生和修復(fù)的活性明顯好于細(xì)胞生長因子。
權(quán)利要求
1，一種用于修復(fù)哺乳動物軟骨組織損傷的移植體，特征在于所說的移植體基本上是由膠原蛋白基質(zhì)和均勻地分散在所說基質(zhì)中的凝集素組成的。
2，根據(jù)權(quán)利要求1的移植體，其中所說的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物、Lentil、WGA、PHA-L或PHA-P，以及UEA或它們的衍生物或片段。
3，根據(jù)權(quán)利要求1的移植體，其中所說的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物或片段。
4，根據(jù)權(quán)利要求1的移植體，其中所說的膠原蛋白是膠原蛋白I或II。
5，根據(jù)權(quán)利要求1的移植體，其中所說的膠原蛋白是膠原蛋白II。
6，根據(jù)權(quán)利要求1的移植體，其中所說的膠原蛋白是人、牛、馬、羊或豬來源的。
7，根據(jù)權(quán)利要求1的移植體，其中所說的膠原蛋白是人來源的。
8，根據(jù)權(quán)利要求1的移植體，其中所說的移植體中伴刀豆蛋白A的含量約為1至100μg/ml膠原凝膠基質(zhì)。
9，根據(jù)權(quán)利要求1的移植體，其中所說的膠原蛋白基質(zhì)可以是膠原蛋白與甲殼素的0.1∶1至10∶1(w/w)混合物。
10，根據(jù)權(quán)利要求1的移植體，其中所說的移植體還可含有一種或多種選自堿性成纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、血小板衍生的生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、肝細(xì)胞生長因子、軟骨細(xì)胞生長因子和骨形成蛋白的細(xì)胞生長因子。
全文摘要
本發(fā)明總地涉及組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)，特別是涉及植物凝集素伴刀豆蛋白A的體內(nèi)誘導(dǎo)和促進(jìn)哺乳動物軟骨組織再生和修復(fù)活性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基本上由伴刀豆蛋白A和膠原蛋白組成的軟骨組織修復(fù)移植體，其制備方法及其在治療哺乳動物因各種原因?qū)е碌能浌墙M織損傷中的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/18GK1398645SQ01123470
公開日2003年2月26日 申請日期2001年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月26日
發(fā)明者顏煒群, 陳昕, 楊同書, 侯立中, 馬昭若, 胡春光, 申鳴 申請人:吉林圣元科技有限責(zé)任公司