專利名稱：一種新型dna腫瘤疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種新型DNA腫瘤疫苗及其制備方法將HER2/neu基因特定片斷的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞系，用ELISA和流式細(xì)胞儀(FACS)檢測發(fā)現(xiàn)該基因體外表達(dá)良好。將pcDNA3-rSIDD DNA注射在小鼠肌肉，經(jīng)免疫組化染色證實(shí)注射部位的肌肉組織有HER2/neu的有效表達(dá)。二檢測HER2/neu特定基因片斷的免疫原性完整的HER2/neu作為胚胎組織和腫瘤表達(dá)的“自身”抗原，機(jī)體對(duì)其有一定的免疫耐受性。上述特定基因片斷并非天然的HER2/neu完整蛋白，但其中含有多個(gè)抗原表位，通過適當(dāng)?shù)拿庖叻桨缚梢哉T導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明將pcNDA3-rSIDD免疫小鼠，用ELISA方法檢測到抗HER2/neu抗體，且可持續(xù)數(shù)天時(shí)間，證明rSIDD可以引起體液免疫應(yīng)答；用特異性殺傷實(shí)驗(yàn)證明pcDNA3-rSIDD DNA免疫的小鼠脾細(xì)胞對(duì)表達(dá)PCDNA3-rSIDD轉(zhuǎn)染的腫瘤靶細(xì)胞有殺傷作用，若對(duì)該脾細(xì)胞在體外進(jìn)行加強(qiáng)刺激，其對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用則明顯加強(qiáng)，同時(shí)脾細(xì)胞表型出現(xiàn)明顯變化，表現(xiàn)在T細(xì)胞明顯加強(qiáng)，主要是CD8+T細(xì)胞明顯加強(qiáng)，而CD4+T細(xì)胞比例無明顯變化。說明rSIDD DNA免疫小鼠，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
同樣，通過DNA免疫技術(shù)，將人hSIDD DNA免疫小鼠，也可以誘導(dǎo)出相應(yīng)的抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答。經(jīng)過腫瘤細(xì)胞的再刺激后，hSIDD DNA免疫小鼠脾細(xì)胞對(duì)人pcDNA3-hSIDD轉(zhuǎn)染的腫瘤靶細(xì)胞表現(xiàn)出特異細(xì)胞毒作用，脾細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞的增加可能與此有關(guān)。說明hSIDD免疫小鼠，也可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
另外，本發(fā)明證明了這種免疫應(yīng)答與HER2/neu蛋白的種屬差異無關(guān)，而且能誘導(dǎo)針對(duì)外來抗原的免疫應(yīng)答。通過交叉反應(yīng)，即將人hSIDD DNA免疫小鼠，以大鼠rSIDD轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒試驗(yàn)，結(jié)果出現(xiàn)針對(duì)誘導(dǎo)抗原的免疫應(yīng)答。
三、制備新型DNA腫瘤疫苗本發(fā)明采用RT-PCR法克隆人HER-2/neu的特定片斷hSIDD，利用NotI/XhoI雙酶切定向插入到pcDNA3質(zhì)粒中，構(gòu)建人HER-2/neu基因真核表達(dá)載體pcDNA3-hSIDD。經(jīng)測序證實(shí)該載體中插入的序列為所需的特定片斷。將pcDNA3-hSIDD轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用QIAGEN的試劑盒大量抽提質(zhì)粒。將pcDNA3-hICDD以1μg/μl的濃度溶于生理鹽水中，即得人新型DNA腫瘤疫苗。
利用大鼠HER-2/neu基因的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(Hind III/XbalI)，從質(zhì)粒pSV2-neu中分離純化了大鼠HER-2/neu基因特定片段，并插入到質(zhì)粒pCDNA3中(Hind III/Xbal I)，構(gòu)建成大鼠HER-2/neu特定片段的真核表達(dá)載體pcDNA3-rSIDD。測序證實(shí)該載體中插入的序列為所需的特定片斷。將pCDNA3-rICDD轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用QIAGEN的試劑盒大量抽提質(zhì)粒。將pCDNA3-rICDD以1μg/μl的濃度溶于生理鹽水中，即得大鼠新型DNA腫瘤疫苗。
本發(fā)明新型DNA腫瘤疫苗及其制備方法的特點(diǎn)是選擇、分離及克隆能超越機(jī)體免疫耐受的HER-2/neu特定基因片斷。
以上實(shí)驗(yàn)證明rSIDD或hSIDD基因免疫可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的抗體和細(xì)胞應(yīng)答，可以打破機(jī)體對(duì)HER-2/neu的免疫耐受，可用作HER2/neu陽性腫瘤防治的新型腫瘤疫苗。本發(fā)明證實(shí)了1.用小鼠流產(chǎn)模型驗(yàn)證rSIDD\hSIDD DNA免疫對(duì)體內(nèi)的效應(yīng)。已知胚胎組織中高表達(dá)HER2/neu蛋白。以rSIDD\hSIDD基因免疫孕鼠后均可導(dǎo)致小鼠平均產(chǎn)仔數(shù)降低，并可發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)結(jié)節(jié)和壞死組織，表明通過SIDD基因免疫，可以打破機(jī)體對(duì)HER-2/neu自身產(chǎn)物的免疫耐受，清除HER2/neu陽性的胚胎組織。
2.在HER2/neu陽性腫瘤模型中證實(shí)PCDNA3rSIDD\hSIDD疫苗的抗腫瘤效應(yīng)，證明hSIDD免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答對(duì)腫瘤攻擊的保護(hù)作用。用hSIDD DNA免疫的小鼠對(duì)HER/neu陽性腫瘤細(xì)胞生長由明顯的抑制作用，機(jī)體生存時(shí)間延長。
本發(fā)明克隆了人和大鼠的HER-2/neu基因中強(qiáng)免疫原性片段，制備出DNA形式的腫瘤疫苗。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，該疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)HER-2/neu陽性的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞免疫和體液免疫，并具有良好的抗瘤效應(yīng)。
表一人pcDNA3-hSIDD的插入序列cDNAtcgag ctcgtcgacc ggtcgacgag ctcgagggtc gacgagctcg agggcgcgcgcccggccccc acccctcgca gcaccccgcg ccccgcgccc tcccagccgg gtccagccggagccatgggg ccggagccgc agtgagcacc atggagctgg cggccttgtg ccgctgggggctcctcctcg ccctcttgcc ccccggagcc gcgagcaccc aagtgtgcac cggcacagacatgaagctgc ggctccctgc cagtcccgag acccacctgg acatgctccg ccacctctaccagggctgcc aggtggtgca gggaaacctg gaactcacct acctgcccac caatgccagcctgtccttcc tgcaggatat ccaggaggtg cagggctacg tgctcatcgc tcacaaccaagtgaggcagg tcccactgca gaggctgcgg attgtgcgag gcacccagct ctttgaggacaactatgccc tggccgtgct agacaatgga gacccgctga acaataccac ccctgtcacaggggcctccc caggaggcct gcgggagctg cagcttcgaa gcctcacaga gatcttgaaaggaggggtct tgatccagcg gaacccccag ctctgctacc aggacacgat tttgtggaaggacatcttcc acaagaacaa ccagctggct ctcacactga tagacaccaa ccgctctcgggcctgccacc cctgttctcc gatgtgtaag ggctcccgct gctggggaga gagttctgaggattgtcaga gcctgacgcg cactgtctgt gccggtggct gtgcccgctg caaggggccactgcccactg actgctgcca tgagcagtgt gctgccggct gcacgggccc caagcactctgactgcctgg cctgcctcca cttcaaccac agtggcatct gtgagctgca ctgcccagccctggtcacct acaacacaga cacgtttgag tccatgccca atcccgaggg ccggtatacattcggcgcca gctgtgtgac tgcctgtccc tacaactacc tttctacgga cgtgggatcctgcaccctcg tctgccccct gcacaaccaa gaggtgacag cagaggatgg aacacagcggtgtgagaagt gcagcaagcc ctgtgcccga gtgtgctatg gtctgggcat ggagcacttgcgagaggtga gggcagttac cagtgccaat atccaggagt ttgctggctg caagaagatctttgggagcc tggcatttct gccggagagc tttgatgggg acccagcctc caacactgccccgctccagc cagagcagct ccaagtgttt gagactctgg aagagatcac aggttacctatacatctcag catggccgga cagcctgcct gacctcagcg tcttccagaa cctgcaagtaatccggggac gaattctgca caatggcgcc tactcgctga ccctgcaagg gctgggcatcaacacccacc tctgcttcgt gcacacggtg ccctgggacc agctctttcg gaacccgcac表2.是HER-2/neu基因特定片斷DNA免疫的小鼠脾細(xì)胞經(jīng)體外再刺激后對(duì)不同靶細(xì)胞的殺傷百分率(％) 表3.是pCDNA3空白對(duì)照質(zhì)粒免疫的小鼠脾細(xì)胞經(jīng)體外再刺激后對(duì)不同靶細(xì)胞的殺傷百分率(％) 表中所有殺傷數(shù)據(jù)均經(jīng)轉(zhuǎn)換符合方差齊，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠脾細(xì)胞對(duì)EL-4rSIDD和EL-4neu細(xì)胞殺傷有明顯差異(n＝4，P＜0.01)，而對(duì)EL-4和EL-4p細(xì)胞無明顯差異(P＞0.05)表4.是人HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠和對(duì)照質(zhì)粒免疫小鼠新鮮脾細(xì)胞經(jīng)體外再刺激后對(duì)不同靶細(xì)胞的殺傷百分率(％) 表中所有殺傷數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換符合方差齊，方差分析發(fā)現(xiàn)兩組小鼠脾細(xì)胞對(duì)EL-4hSIDD細(xì)胞殺傷有明顯差異(n＝4，p＜0.05)，而對(duì)EL-4p細(xì)胞無明顯差異。
圖2.是大鼠HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠后不同時(shí)間血清中抗HER-2/neu抗體水平，高為rSIDD組，底為對(duì)照組。
圖3是.DNA免疫小鼠新鮮脾細(xì)胞對(duì)不同靶細(xì)胞的殺傷柱1，3，5表示效應(yīng)細(xì)胞來源于HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠脾細(xì)胞，柱2，4，6表示效應(yīng)細(xì)胞來源于pCDNA3空白對(duì)照質(zhì)粒DNA免疫小鼠脾細(xì)胞，柱1，2表示的靶細(xì)胞為EL-4-p，柱3，4表示的靶細(xì)胞為EL-4-neu，柱5，6表示的靶細(xì)胞為EL-4-rSIDD圖4.是DNA免疫的小鼠脾細(xì)胞經(jīng)體外再刺激后對(duì)不同靶細(xì)胞的殺傷圖例中柱1，3，5，7表示脾細(xì)胞來源于HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠，柱2，4，6，8表示脾細(xì)胞來自pCDNA3對(duì)照質(zhì)粒免疫小鼠；柱1，2表示的靶細(xì)胞為EL-4-rSIDD，柱3，4表示的靶細(xì)胞為EL-4-neu，柱5，6表示的靶細(xì)胞為EL-4-p，柱7，8表示的靶細(xì)胞為EL-4細(xì)胞圖5.是HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠脾細(xì)胞體外刺激前后細(xì)胞表型的變化圖中左欄為新鮮脾細(xì)胞表型檢測，右欄為體外再刺激后脾細(xì)胞表型圖6.是pCDNA3對(duì)照質(zhì)粒免疫小鼠脾細(xì)胞體外刺激前后細(xì)胞表型的變化圖中左欄為新鮮脾細(xì)胞表型，右欄為體外再刺激后脾細(xì)胞表型圖7.是細(xì)胞ELISA法檢測人HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠血清抗HER-2/neu抗體圖8.是DNA免疫C57 BL/6小鼠新鮮脾細(xì)胞對(duì)不同靶細(xì)胞的殺傷百分率圖例中柱1，3表示效應(yīng)細(xì)胞來自人HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠，柱2，4表示效應(yīng)細(xì)胞來自pCDNA3對(duì)照質(zhì)粒免疫小鼠；柱1，2表示的靶細(xì)胞為EL-4-hSIDD，柱3，4表示的靶細(xì)胞為EL-4p細(xì)胞圖9.是人HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠脾細(xì)胞經(jīng)體外再刺激后對(duì)不同靶細(xì)胞的殺傷作用圖例中柱1，2，3表示效應(yīng)細(xì)胞來自人HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠，柱4，5，6表示效應(yīng)細(xì)胞來自pcDNA3對(duì)照質(zhì)粒免疫小鼠；柱1，4表示的靶細(xì)胞為EL-4 rSIDD，柱2，5表示的靶細(xì)胞為EL-4細(xì)胞，柱3，6表示的靶細(xì)胞為EL-4p細(xì)胞

圖10.是人HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠脾細(xì)胞表型在體外再刺激前后的變化圖中左欄為新鮮小鼠脾細(xì)胞表型，右欄為體外再刺激后脾細(xì)胞表型圖11.pCDNA3對(duì)照質(zhì)粒免疫小鼠脾細(xì)胞在體外再刺激前后細(xì)胞表型的變化圖中左欄為新鮮脾細(xì)胞表型，右欄為體外再刺激后脾細(xì)胞表型圖12.HER-2/neu特定片斷基因免疫Balb/C小鼠血清抗HER-2/reu抗體檢測圖13.HER-2/neu特定片斷基因免疫誘導(dǎo)小鼠流產(chǎn)子宮圖14.人HER-2/neu特定片段DNA免疫抑制HER-2/neu陽性腫瘤細(xì)胞生長的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)圖15.人HER-2/neu特定片斷免疫對(duì)腫瘤接種小鼠的保護(hù)作用圖例中 為SP2/0neu細(xì)胞接種于人HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠 實(shí)際存活時(shí)間＞120天 為SP2/0neu細(xì)胞接種于pCDNA3質(zhì)粒免疫小鼠，為SP2/0p細(xì)胞接種于人HER-2/neu特定片斷基因免疫小鼠
權(quán)利要求
1.一種新型DNA腫瘤疫苗，其特征在于采用克隆人HER-2/neu的特定片斷hSIDD，利用NotI/XhoI雙酶切定向插入pcDNA3質(zhì)粒中，構(gòu)建人HER-2/neu基因真核表達(dá)載體pcDNA3-hSIDD，將pcDNA3-hSIDD轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，抽提質(zhì)粒，將pcDNA3-hICDD溶于生理鹽水中，得DNA腫瘤疫苗。
2.按權(quán)利要求1所述的新型DNA腫瘤疫苗，其特征在于所述的克隆人HER-2/neu的特定片斷hSIDD，是從HER2/neu高表達(dá)的細(xì)胞株SKBR3克隆出的。
3.按權(quán)利要求1所述的新型DNA腫瘤疫苗，其特征在于所述的將pcDNA3-hICDD溶于生理鹽水的濃度是1μg/μl。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程領(lǐng)域,具體涉及一種新型DNA腫瘤疫苗及其制備方法,本發(fā)明采用克隆人HER－2/neu的特定片斷hSIDD,利用NotI/XhoI雙酶切定向插入pcDNA3質(zhì)粒中,構(gòu)建人HER－2/neu基因真核表達(dá)載體pcDNA3－h(huán)SIDD,將pcDNA3－h(huán)SIDD轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,抽提質(zhì)粒,將pcDNA3－h(huán)ICDD溶于生理鹽水中,得DNA腫瘤疫苗,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,該疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)HER－2/neu陽性的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞免疫和體液免疫,并具有良好的抗瘤效應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1380107SQ01126890
公開日2002年11月20日 申請(qǐng)日期2001年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月27日
發(fā)明者何球藻, 王纓, 張躍建, 秦慧蓮, 熊思東 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)