專利名稱：用于抗器官移植急性排斥反應(yīng)的單味藥－蘇木水提物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于抗器官移植急性排斥反應(yīng)的單味藥——蘇木水提物。
晚期或終末期患者在使用常規(guī)的治療方法無效時，采用器官移植是唯一行之有效的方法。經(jīng)過近百年來世界各國學(xué)者的艱辛研究和積極的臨床實踐，同種心臟移植術(shù)已日益成熟，從而使數(shù)以萬計的患者獲得了新生。從目前的發(fā)展水平來看，器官移植的成功以及存活時間的長短與諸多因素相關(guān)。除具備必需的設(shè)備和精湛的技術(shù)外，術(shù)后對排斥反應(yīng)進行及時的監(jiān)測、診斷和治療也十分重要。
化學(xué)免疫抑制劑在器官移植急性排斥反應(yīng)的預(yù)防和治療中起到了關(guān)鍵作用，并推動了心臟移植的發(fā)展。然而，并沒有達到滿意的效果。迄今為止，應(yīng)用于臨床的每一種化學(xué)免疫抑制劑都是非特異的，它們會降低受者的全身免疫功能，從而降低對感染和腫瘤的抵抗能力，并且藥物還有一定的毒副作用，如果不能耐受，常常被迫停藥，從而影響移植物的長期存活。另外，象CsA(環(huán)胞素)這樣的藥物，價格昂貴，也使受者難于承擔。因此，尋找有效、低毒副作用而又價格低廉的免疫抑制劑已成為醫(yī)學(xué)界目前普遍關(guān)注的課題。近年來，人們逐步認識到從中藥尋找出新的抗排斥反應(yīng)的藥物可能是一個充滿希望的新途徑，中藥具有毒副作用輕，價格低廉等特點。近年來，應(yīng)用單味中藥對抗免疫排斥進行了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)具有明確抗免疫排斥的藥物有如下兩種1、雷公藤多甙。雷公藤多甙對細胞免疫和體液免疫均有抑制作用。它能明顯延長小鼠皮膚、心臟和大鼠心臟同種移植物的存活，臨床同種腎移植初步應(yīng)用結(jié)果表明，雷公藤多甙可以取代硫唑嘌呤與環(huán)孢素A聯(lián)合用藥，但雷公藤多甙的毒副作用主要是胃腸道反應(yīng)、白細胞減少、血小板減少、男性病人精子減少，少數(shù)病人可出現(xiàn)乏力、嗜睡和頭痛等癥狀，有些毒副作用尚待進一步深入研究。如果做為常規(guī)用藥，還需進一步研究有效成份的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并加以提純、分離。
2、冬蟲夏草。人們廣泛地研究了其藥理作用，由于發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草提取的方法不同，顯示出不同的藥理作用，因此，應(yīng)用于器官移植尚需做大量的工作。
本發(fā)明的目的是提供一種毒副作用小、價格低廉、可以作為常規(guī)用藥的用于抗器官移植急性排斥反應(yīng)的單味藥——蘇木水提物。
本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明是蘇木水提物的一種新用途，是將蘇木水提物用做抗器官移植急性排斥反應(yīng)的藥物。
對祖國醫(yī)學(xué)來講，抗器官移植免疫排斥是個新課題，在急性排斥反應(yīng)中移植物在被排斥時常出現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞腫脹變性、血管周圍周圍炎性細胞浸潤、水腫、出血，小血管管壁增厚、管腔狹窄甚至血栓形成等一系列小血管病理損害和微循環(huán)障礙。這種病變與祖國醫(yī)學(xué)理論中的“淤血”較為相似。研究表明，活血化瘀藥物具有減輕細胞與血小板的聚集，調(diào)整血管壁通透性的紊亂，擴張血管，調(diào)整血液粘稠度，防止凝血及促進纖溶等作用，因而可改善排斥反應(yīng)所導(dǎo)致的移植物微循環(huán)障礙，使移植物的存活期延長。另外?；钛鏊幬锟梢种茩C體產(chǎn)生抗體。顯然，免疫抑制作用是這些藥物延長移植物存活的原因之一。本發(fā)明可延長移植心臟的存活時間，減輕排斥反應(yīng)將器官所致的免疫損傷，且毒副作用小，價格低廉。
下面是動物實驗數(shù)據(jù)模型的建立與分組實驗動物Wistar大鼠，雄性，160-200g，SD大鼠，雄性，體重200-250g。均購自北京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。
主要儀器SXP-1B型雙人雙目手術(shù)顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠；SSW-3型顯微手術(shù)器械包，上海醫(yī)療儀器廠；恒溫水浴箱，上海醫(yī)療儀器廠。
實驗用藥環(huán)胞素A將新山地明(瑞士山德士藥廠生產(chǎn)，每粒含CsA25mg)溶于生理鹽水，稀釋至1mg/ml濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 蘇木水提液的制備蘇木，購自黑龍江省藥材公司，產(chǎn)地云南，經(jīng)生藥鑒定。浸泡1小時后，水煎三次，每次40min，煎液混合后水浴80℃濃縮成1.75g/ml濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 進行供心切取術(shù)和受體手術(shù)。
實驗分組及處理將術(shù)后清醒(約2h)能站立，移植心跳有力(24h內(nèi)供心不停跳)者，做為實驗用動物模型。將上述大鼠隨機分成四組，每組5只。第一組為模型對照組，除正常喂養(yǎng)外，灌服同體積生理鹽水。第二組環(huán)胞素組，手術(shù)后24h后，灌服配制好的環(huán)胞素溶液，按40mg/kg給藥。第三組為蘇木組，于術(shù)后24h后，灌服蘇木水提物，按17.5g/kg給藥。第四組為SD對照組(SD大鼠分別為供體、受體)，手術(shù)后24h給同體積的生理鹽水，連續(xù)灌服11日后，分別處死動物。
結(jié)果各組動物在術(shù)后24h后，飲食、飲水較正常，術(shù)后約3-4d后，刀口愈合良好。實驗對照組，發(fā)育較好，皮毛有光澤，其移植心一般在5-7d左右停搏。蘇木組發(fā)育較正常，皮毛有光澤，在11d時，仍可觸及其心搏。環(huán)胞素A組發(fā)育較差，飲食較少，皮毛不光澤，其移植心在11d時，仍可觸及心搏。
病理形態(tài)學(xué)觀察實驗對照組可見移植心完全被腹腔組織包裹，看不到心臟搏動。心臟腫大、呈花斑狀，心室肌切面可見心臟壁增厚、松馳、部分區(qū)域呈灰白色。光鏡低倍下可見心肌細胞水腫較明顯，并見有片狀出血和壞死。周圍可見大量炎細胞浸潤，少量的心肌細胞纖維。高倍鏡下可見有彌漫性水腫，大量炎細胞浸潤和少量的心肌細胞，大部分心肌纖維化，并可見含鐵血黃素和出血。在高倍鏡(400×)下，可見大量的單個核細胞浸潤，可見少量心肌纖維，部分心肌細胞腫脹、空泡變性，可只有心肌溶解，纖維細胞增生和膠質(zhì)纖維形成，以及纖維化等改變，同時可見血管擴張，心肌細胞崩解成細顆粒。
蘇木組的心臟表面光滑紅潤、在腹腔內(nèi)無包裹現(xiàn)象，心跳搏動有力。低倍鏡下整個病變較輕，可見有彌漫性的炎細胞浸潤，部分心肌細胞變性，周圍可見水腫。高倍鏡下偶見心肌細胞顆粒變性，并仍可見有橫紋，間質(zhì)見有少量單核、淋巴細胞浸潤，水腫較輕。
CsA組心臟表面光滑紅潤、無包裹，心搏有力。低倍鏡下可在內(nèi)膜下層見有局灶性炎細胞浸潤，周圍無明顯水腫。高倍鏡下在心內(nèi)膜下見有小灶狀炎細胞浸潤，外膜見有少量淋巴細胞浸潤，心肌細胞改變不明顯。
SD組變化較輕，表面光滑、無包裹，心搏有力，低倍鏡下可見有少量炎細胞浸潤，心肌細胞未見明顯改變，周圍未見有水腫。高倍鏡下可見血管壁正常，周圍心肌有炎細胞浸潤，未見有心肌細胞變性、壞死。
超微結(jié)構(gòu)的改變心肌透射電鏡下，模型組可見有大量炎細胞，細胞核幼稚，主要為淋巴細胞、漿細胞、粒細胞等，并見有間質(zhì)出血，心肌細胞線粒體空泡變性較明顯，肌絲囊空泡變性，部分肌絲排列松散，斷裂，潤盤以育較差。
蘇木組可見心肌細胞發(fā)育良好，間質(zhì)可見大量炎細胞，以淋巴細胞、漿細胞為多，線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)育良好。血管內(nèi)皮細胞中有大量吞飲泡和質(zhì)狀突起。
CsA組可見較少炎細胞，心肌纖維Z線兩端明暗帶較清楚，線粒體發(fā)育良好，未見紊狀變性和斷裂，血管內(nèi)皮細胞發(fā)育良好。
SD組可見心肌細胞功能活躍、細胞核較完整、炎細胞浸潤較少，血管內(nèi)皮細胞，線粒體發(fā)育良好。
關(guān)于心臟移植急性排斥反應(yīng)模型本實驗采用了目前比較公認的大鼠同種異位心臟移植模型，該模型系Ono氏在1969年所創(chuàng)立的腹部異位心臟移植模型。雖然供體心臟不具有心臟本身的功能，但由于有充分的血液供應(yīng)，并能存活一定的時間，可以做為研究急性排斥反應(yīng)的發(fā)生機制、以及對其進行防治等方面較理想的動物模型。
病理形態(tài)學(xué)變化本實驗觀察到的結(jié)果表明，模型組的移植心一般在5-7天時，心搏觸及不明顯，待11天處死動物后，光鏡下可見移植心的心肌細胞發(fā)生大面積壞死和心肌纖維化，提示排斥反應(yīng)較重，其移植心臟的存活期與文獻報道相一至。同時此期還可發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷，心肌間質(zhì)有大量出血，提示急性體液免疫反應(yīng)也參與了急性排斥反應(yīng)，這種結(jié)果與人類心臟移植發(fā)生的排斥反應(yīng)相類似。
SD大鼠對照組的移植心臟，在處死時心搏仍較有力，光鏡下僅見有炎細胞的浸潤，心肌和血管均未發(fā)生明顯改變，提示同種SD個體間心臟移植后不發(fā)生急性排斥反應(yīng)，但由于手術(shù)的過程也是創(chuàng)傷的過程，故可見有一定程度炎性反應(yīng)。
CsA組的移植心在處死時，心搏仍有力，且表面光滑，光鏡下病變較輕，有炎細胞和淋巴細胞的浸潤，但心肌細胞未有明顯的改變，說明CsA可以明顯減輕排斥反應(yīng)，延長移植物的存活時間，不失為目前抑制排斥反應(yīng)的一種良藥。然而動物的一般情況表現(xiàn)較差，可見CsA對動物的損傷和毒副作用也是明顯的。
蘇木組的移植心在11天時，仍可見有力的心搏，且表面較光滑，無包裹。且光鏡下雖可見較明顯炎細胞及淋巴細胞的浸潤、心肌細胞變性和周圍水腫，而未見有心肌細胞的壞死，提示中藥蘇木對急性排斥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展有一定的抑制作用，對心肌損傷也具有一定的保護作用。同時也未見有明顯的毒副作用。
心肌超微結(jié)構(gòu)的變化CsA可明顯抑制急性排斥反應(yīng)所致的心肌損傷，而且對體液因素也有一定的抑制作用。從心肌細胞的功能和線粒體的發(fā)育以及炎細胞浸潤的情況中亦得到證實，中藥蘇木也可以在一定程度上抑制免疫排斥反應(yīng)，其心肌細胞和線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)育良好，但間質(zhì)可見有大量的炎細胞。從超微結(jié)構(gòu)的角度，證明了蘇木抗免疫排斥作用。
PEP mRNA的表達水平變化當心臟移植后發(fā)生急性排斥反應(yīng)時，細胞毒性T細胞被激活、聚集，PFP表達水平明顯升高。
從本研究的結(jié)果來看，未經(jīng)任何處理的模型組的心肌組織，在11天時，其PFP的mRNA表達水平明顯增高，與同期的心肌病理形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化相吻合，SD對照組未見明顯PFP的mRNA的表達。CsA可以明顯抑制PFP的mRNA表達水平，從而抑制急性排斥反應(yīng)。
從蘇木組的結(jié)果來看，其PFP的mRNA表達水平明顯低于模型對照組，但要較CsA組略高，表明蘇木可以抑制CTL細胞PFP的表達，具有一定的抗免疫排斥作用。
顆粒B(GraB)mRNA的表達水平變化近年來研究表明，顆粒酶是一種重要的效應(yīng)分子，其細胞毒作用已研究明確。
本研究結(jié)果表明，模型組GraB的mRNA表達水平明顯增高，SD對照組無明顯表達，這也說明了本實驗?zāi)Ｐ褪浅晒Φ?。CsA組與蘇木組GraB的mRNA表達水平明顯減輕，表明了CsA和蘇木對GraB的表達具有下調(diào)作用。
蘇木組與CsA組之間的GraB和mRNA表達水平無顯著差異。
外周血IL-2水平的變化從本研究的結(jié)果來看，在發(fā)生了急性排斥反應(yīng)的模型組，IL-2明顯升高，說明IL-2參與了排斥反應(yīng)。而CsA減低IL-2的水平，抑制了免疫應(yīng)達從而發(fā)揮其免疫抑制作用。蘇木組IL-2水平也明顯低于模型對照組，提示蘇木對IL-2的分泌，也有一定的抑制作用，這樣對細胞毒性T細胞(CTL)的產(chǎn)生和成熟也具有一定的抑制作用，從而影響排斥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。
外血周IL-6水平的變化本研究的結(jié)果表明，模型組的IL-6水平明顯增高，SD對照組IL-6水平較低，表明發(fā)生急性排斥反應(yīng)時，IL-6參與了其中的反應(yīng)。CsA可以明顯抑制IL-6的分泌，從而阻斷或減輕排斥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。蘇木組的IL-6水平也明顯低于模型組，提示蘇木可以抑制IL-6的分泌，從而減輕急性排斥反應(yīng)所帶來的損傷。
CD4+、CD8+比值的變化本研究中模型組該比值明顯升高，而CsA組和蘇木組的比值均較低，表明CsA和蘇木均可調(diào)節(jié)免疫功能，使CD4+/CD8+的比值接近于正常水平，顯示了蘇木與CsA同樣具有免疫調(diào)節(jié)作用。
心肌細胞的凋亡本實驗的研究結(jié)果表明，模型組心肌細胞凋亡明顯增強，SD對照組僅有極少量的細胞凋亡，而CsA可明顯抑制心肌細胞的凋亡。蘇木組的心肌細胞凋亡明顯見少，提示蘇木可以通過抑制心肌細胞的凋亡，從而減輕急性排斥反應(yīng)。
通過本研究，可以得出如下結(jié)論大鼠同種異位心臟移植模型是研究心臟移植急性排斥反應(yīng)的一個較理想的模型。蘇木具有一定的抗免疫排斥作用，可以延長移植心臟的存活時間，減輕排斥反應(yīng)對心肌所致的免疫損傷。蘇木可以抑制心肌浸潤細胞穿孔素的mRNA的表達，對顆粒酶B的mRNA表達也具有一定的抑制作用，并能夠抑制心肌細胞的過度凋亡。蘇木可以減低心臟移植模型外周血IL-2、IL-6的含量，調(diào)節(jié)外周圍血CD+4/CD+6的比值的紊亂，從而發(fā)揮其免疫抑制作用。
綜上所述，蘇木具有器官移植抗免疫排斥作用。
實施例本發(fā)明是一種蘇木水提物的新用途，是將蘇木水提物用于抗器官移植急性排斥反應(yīng)。蘇木水提物可以是蘇木水提液，制備方法是將蘇木浸泡1小時后，水煎三次，每次35-45min，煎液混合水浴80-90℃濃縮成1.75g/ml濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.一種蘇木水提物的新用途，其特征在于是將蘇木水提物用做抗器官移植急性排斥反應(yīng)的單味藥。
全文摘要
本發(fā)明是一種蘇木水提物的新用途，是將蘇木水提物用做抗器官移植急性排斥反應(yīng)的單味藥。本發(fā)明可延長移植心臟的存活時間，減輕排斥反應(yīng)對器官所致的免疫損傷，且毒副作用小，價格低廉。
文檔編號A61P37/00GK1393250SQ0112790
公開日2003年1月29日 申請日期2001年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月4日
發(fā)明者周亞濱 申請人:周亞濱