專利名稱：具有抑菌功效的膠原－DNA－Ag復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生化制品，特別涉及一種具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物及其制備方法。
有報(bào)道用III型膠原與Ag-SD(磺胺嘧啶銀)混合制成的溶液治療燒傷后殘余傷面(III型膠原Ag-SD液治療燒傷后殘余傷面，吳小龍等。江蘇醫(yī)藥1992；18(3)；137-138)。它是將濃度為0.5～0.1％的III型膠原溶液與半量的Ag-SD霜混合，然后涂在創(chuàng)面上使用。但由于膠原溶液在儲(chǔ)存過(guò)程中容易腐敗變性，所以這種溶液只能現(xiàn)用現(xiàn)配。且在這種溶液中，膠原分子與Ag-SD分子是互相獨(dú)立的。
特開(kāi)平6-304241介紹了一種含銀膠原海綿膜。其制造方法是將水溶性銀鹽吸附到陶瓷類物質(zhì)或是通過(guò)離子交換結(jié)合后，在銀的熔點(diǎn)以上燒結(jié)、粉碎制得結(jié)合了銀的陶瓷類物質(zhì)。然后將該物質(zhì)添加到膠原溶液中。攪拌。冷凍干燥。即得一種抗菌性膠原膜。在這種方法制得的膠原海綿膜中，陶瓷銀類物質(zhì)與膠原的吸附是物理吸附。所得膠原膜的抗菌效果取決于陶瓷銀類物質(zhì)的粒度和與膠原吸附結(jié)合的數(shù)量。結(jié)合的少，影響抗菌效果；結(jié)合的多又使得到的膠原膜變硬。
Cu2+、Hg2+、Ag+等重金屬離子具有殺菌功能，其共同點(diǎn)是通過(guò)與細(xì)菌體內(nèi)含巰基活性基團(tuán)的酶類結(jié)合使其失去活性，從而使細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖受到抑制。同樣，作為重金屬離子，它亦能使蛋白質(zhì)失去生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服以上技術(shù)不足，提供一種具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物及其制備方法，使得這些金屬離子與膠原復(fù)合，既發(fā)揮這些金屬離子的抑菌特性，又保留膠原蛋白的生物活性，制取一種性能優(yōu)異的膠原復(fù)合物，用做醫(yī)學(xué)臨床生物敷料。
本發(fā)明通過(guò)采用DNA與Ag+結(jié)合，然后再與膠原復(fù)合，得到一種膠原-DNA-Ag復(fù)合物，解決了膠原遇重金屬離子失活變性的問(wèn)題，制備一種具有抑菌功能，同時(shí)兼具一定強(qiáng)度的膠原-DNA-Ag復(fù)合物。DNA可與膠原分子結(jié)合成凝膠類物質(zhì)。當(dāng)在DNA鈉鹽的水溶液中加入可溶性銀鹽溶液時(shí)，通過(guò)離子交換，使得DNA鈉鹽中的部份Na+被Ag+取代，然后，再通過(guò)透析除去溶液中游離的小離子，即可得到一種分子中含有Ag+的DNA溶液。
本發(fā)明還提供了一種用于治療燒、燙傷及止血的藥物，該藥物含有上述復(fù)合物作為活性成分。所述藥物可含有同類藥物中通常含有的輔劑、成型劑等，并可制成各種劑型，如敷料、片劑、粉劑等。
本發(fā)明提供了膠原-DNA-Ag復(fù)合物及其制備方法本發(fā)明所采用的原料為膠原蛋白水溶液采用從小牛皮中提取的膠原，濃度0.1-10％，最好是0.4-1.0％。DNA采用從魚精中提取的、分子量100萬(wàn)以上的DNA，濃度0.1-5.0％，最好是0.1-1.0％。可溶性銀鹽使用的是1％至飽合濃度的AgNO3水溶液，最好是1％-10％。
將DNA溶解于4℃以下的去離子水中，制備濃度0.1-5.0％的DNA水溶液。加入1％-飽合的可溶性銀鹽水溶液，攪拌5-20min，透析24-96h，至透析外液中檢測(cè)不出相應(yīng)的游離離子。
將濃度為0.1-10％的膠原蛋白溶液在-20-40℃透析。在3.3-26.6KPa下，減壓脫氣5-20min，在0.05-0.5MPa下，用φ0.05-1.0mm噴嘴噴入上述DNA溶液中。將形成的凝膠瀝去水份，洗滌，裝入10×10×0.5cm模型中，在-20--200℃下凍結(jié)，以P205及KOH為干燥劑，在-30-40℃、0.038-7.4KPa下真空干燥或真空冷凍干燥得膠原海綿膜?；?qū)⒁褔娙隓NA的膠原液攪拌，得一無(wú)色透明狀膠乳，將其用0.3-1.0MPa、80-200℃的干熱空氣噴霧干燥，即得膠原-DNA-Ag白色粉末。包裝、滅菌。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)效果1、提供了一種具有抑菌性能的膠原-DNA-Ag復(fù)合物制品做生物敷料，該制品對(duì)金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠濃桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌(Escherichia coli)有較強(qiáng)的抑制作用，做生物敷料時(shí)可有效地抑制細(xì)菌感染。
2、在本發(fā)明提供的這種具有抑菌性能的膠原-DNA-Ag復(fù)合物制品中，Ag+與DNA以離子鍵結(jié)合并隱藏在大分子內(nèi)部，所以具有緩釋性。
3、本發(fā)明提供的這種具有抑菌性能的膠原-DNA-Ag復(fù)合物制品，與液態(tài)膠原制品相比，可在室溫下長(zhǎng)時(shí)間地有效保存。
4、本發(fā)明提供的這種具有抑菌性能的膠原-DNA-Ag復(fù)合物，根據(jù)干燥方法的不同，可以制成膜狀物、粉狀物使用。
5、在依據(jù)本發(fā)明提供的具有抑菌性能的膠原-DNA-Ag海綿膜制品中，由于DNA-Ag是以分子狀態(tài)與膠原分子通過(guò)范德華力及氫鍵結(jié)合，所以，與陶瓷銀膠原膜相比，膠原-DNA-Ag海綿膜柔軟性更好，不板結(jié)。
6、在本發(fā)明的膠原-DNA-Ag復(fù)合物中，引入的多糖大分子DNA與膠原分子通過(guò)范德華力及氫鍵結(jié)合，互相纏繞成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而，增強(qiáng)了這種膠原復(fù)合物的機(jī)械強(qiáng)度7、本發(fā)明中采用的膠原與Ag+復(fù)合的媒介DNA與膠原一樣，都是來(lái)自生物體的具有生物活性的物質(zhì)。因此，保證了膠原-DNA-Ag復(fù)合物中的膠原蛋白的生物活性不喪失。
8、在本發(fā)明提供的這種具有抑菌性能的膠原-DNA-Ag復(fù)合物制品中，Ag含量可以通過(guò)調(diào)整DNA溶液的PH值及加入的可溶性銀鹽量來(lái)調(diào)節(jié)。
9、本發(fā)明提供的這種膠原復(fù)合物也可以附著在其它基材上使用。如各種天然纖維、人造纖維、高分子材料等。
具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物及其制備方法。
具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物由以下原料制備膠原蛋白濃度為0.1-10％，最好是0.4-1.0％，DNA濃度0.1-5.0％，最好是0.1-1.0％，DNA鹽是DNA鈉鹽，可溶性銀鹽濃度為1％至飽合的AgNO3，最好是1％-10％。膠原DNA∶Ag比例為1.5-2.5∶0.5-1.5∶0.05-0.2(W/W/W)。
具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，以濃度0.1-10％膠原蛋白、濃度0.1-5.0％DNA、濃度1％至飽合濃度的可溶性銀鹽，經(jīng)離子交換、透析、脫氣、成型、冷凍、干燥、滅菌制成醫(yī)用抑菌膠原復(fù)合物。離子交換，將DNA溶于預(yù)冷至4℃的去離子水中，加入1％-飽合AgNO3溶液，攪拌5-20min，反應(yīng)溫度-20-40℃，將離子交換反應(yīng)完成后的DNA-AgNO3混合液透析，溫度-20-40℃，時(shí)間24-96h。透析，將0.1-10％的膠原溶液透析，透析溫度為-20-40℃，時(shí)間24-96h。將透析后的膠原溶液脫氣，壓力為3.3-26.6KPa，時(shí)間5-20min。將脫氣后的膠原溶液噴入DNA-Ag溶液中，噴嘴孔徑0.05-1.0mm、孔密度5-50個(gè)/cm2、壓力0.05-0.5MPa。將成型后的膠原-DNA-Ag復(fù)合物冷凍，溫度-20--200℃。將冷凍后的膠原-DNA-Ag復(fù)合物干燥，干燥溫度-30-40℃，壓力0.038-7.4KPa，干燥劑為P2O5、KOH、液氮、干冰，為真空干燥或真空冷凍干燥，得膠原-DNA-Ag海綿膜，包裝，滅菌?；?qū)⒁褔娙隓NA的膠原液攪拌，得一無(wú)色透明狀膠乳，將獲得的膠原-DNA- Ag膠乳噴霧干燥，干燥用熱風(fēng)壓力為0.3-1.0MPa，溫度為80-200℃，得粉狀膠原-DNA-Ag復(fù)合物，包裝，滅菌。膠原-DNA-Ag復(fù)合物具有抑菌功效，抑制的菌種有金黃色葡萄球菌、綠濃桿菌、大腸桿菌，用于治療燒、燙傷及止血的藥物。


圖1、金黃色葡萄球菌——膠原-DNA-Ag海綿膜。
圖2、金黃色葡萄球菌——膠原-DNA海綿膜。
圖3、金黃色葡萄球菌——純膠原海綿膜。
圖4、純金黃色葡萄球菌。
圖5、綠膿桿菌——膠原-DNA-Ag海綿膜。
圖6、綠膿桿菌——膠原-DNA海綿膜。
圖7、綠膿桿菌——純膠原海綿膜。
圖8、純綠膿桿菌。
圖9、大腸桿菌——膠原-DNA-Ag海綿膜。
圖10、大腸桿菌——膠原-DNA海綿膜。
圖11、大腸桿菌——純膠原海綿膜。
圖12、純大腸桿菌。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將1g DNA在攪拌下溶于預(yù)冷至4℃的1000ml去離子水中。加入1％AgNO32g。攪拌10分鐘。將該溶液置于透析袋中，透析24-96h。
取0.7％膠原溶液300ml，在4℃下，透析24-96h。在13.3KPa下脫氣10分鐘。然后用直徑1cm，孔徑0.4mm，孔數(shù)為50個(gè)/cm2的噴頭，在0.15MPa壓力下，將其噴入上述DNA溶液中。將得到的凝膠置于100目的篩網(wǎng)上瀝去水份，用200ml預(yù)冷至4℃的去離子水洗滌三次，裝入10×10×0.5cm的模型中，冷凍溫度-20℃，用P2O5、KOH做干燥劑，真空干燥，可得10片膠原蛋白海綿膜，總重3.1g，Ag含量0.21％(W/W)。包裝、Co60照射。
實(shí)施例2將5g DNA在攪拌下溶于預(yù)冷至4℃的100ml去離子水中，調(diào)溶液PH值為8-10，加入飽和AgNO30.5g，攪拌20min，透析24-96h.
取0.5％膠原溶液2000ml，在4℃下，透析24-96h，在13.3KPa下脫氣10min。然后用直徑1cm、孔徑0.5mm、孔數(shù)50個(gè)/cm2的噴頭，在0.1MPa壓力下，將其噴入上述DNA溶液中。將得到的凝膠置于100目的篩網(wǎng)上瀝去水份，用2000ml預(yù)冷至4℃的去離子水洗滌三次，裝入10×10×0.5cm的模型中，冷凍溫度-20℃。用P2O5、KOH做干燥劑，干燥，得55片膠原蛋白海綿膜，重16.2g，Ag含量0.25％(W/W)，包裝、Co60照射。
實(shí)施例3將1g DNA在攪拌下溶于預(yù)冷至4℃的100ml去離子水中，加入2％AgNO3溶液1g，攪拌10min，透析24-96h.
取0.5％膠原溶液400ml，在4℃下，透析24-96h，在13.3KPa下脫氣10min，然后用直徑1cm、孔徑0.5mm、孔數(shù)50個(gè)/cm2的噴頭，在0.1MPa壓力下，將其噴入上述DNA溶液中，攪拌，將得到的無(wú)色透明膠乳用壓力為0.5MPa、溫度為120℃的空氣噴霧干燥，得膠原-DNA-Ag復(fù)合物粉末1.8g，Ag含量0.20％(W/W)，包裝、Co60照射。
抑菌實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4(1)、混菌培養(yǎng)基平板制備將已培養(yǎng)好的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的斜面培養(yǎng)物分別用接種環(huán)刮下少許菌苔，然后用已滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基制成5ml菌懸液。取該菌懸液0.1ml用營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋10倍備用。
取無(wú)菌培養(yǎng)皿12個(gè)，分組，編號(hào)。其中I組1-4號(hào)各加入上述已配制好的金黃色葡萄球菌菌懸液1ml；II組5-8號(hào)各加入上述已配制好的綠膿桿菌菌懸液1ml；III組9-12號(hào)各加入上述已配制好的大腸桿菌菌懸液1ml。再分別加入冷卻至50℃左右的20ml營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，充分冷凝后備用。
(2)、抑菌試驗(yàn)將直徑2.5cm，經(jīng)Co60滅菌后的膠原-DNA-Ag、膠原-DNA復(fù)合海綿膜及純膠原海綿膜按下述分組后，貼于混菌液培養(yǎng)基平板中央位置，做好標(biāo)記，于35-37℃倒置在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時(shí)，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。分組情況如下I組1-4號(hào)，金黃色葡萄球菌試驗(yàn)組1、膠原-DNA-Ag海綿膜圖1；2、膠原-DNA海綿膜圖2；3、膠原海綿膜圖3；4、空白金黃色葡萄球菌圖4。
II組5-8號(hào)，綠膿桿菌試驗(yàn)組
5、膠原-DNA-Ag海綿膜圖5；6、膠原-DNA海綿膜圖6；7、膠原海綿膜圖7；8、空白 綠膿桿菌圖8。
III組9-12號(hào)，大腸桿菌試驗(yàn)組9、膠原-DNA-Ag海綿膜圖9；10、膠原-DNA海綿膜圖10；11、膠原海綿膜圖11；12、空白大腸桿菌圖12。
(3)、試驗(yàn)結(jié)果膠原-DNA-Ag海綿膜對(duì)三種菌均有抑菌作用，抑菌圈直徑3cm以上，清晰；膠原-DNA海棉膜對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，24小時(shí)抑菌圈直徑3cm以上，清晰；48小時(shí)模糊。對(duì)其余二種菌沒(méi)有抑菌作用；純膠原海綿膜對(duì)三種菌均無(wú)抑菌作用。
止血實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料膠原-DNA-Ag海綿膜由實(shí)施例一及實(shí)施例二提供的產(chǎn)品；明膠海綿由南京第三制藥廠生產(chǎn)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大耳白兔由大連醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。
(2)動(dòng)物模型的建立選10只健康大耳白兔，體重2.5-3.0Kg，雌雄不限，單籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每5只一組分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組，在大耳白兔耳部制造2cm×1cm大小的出血?jiǎng)?chuàng)面。實(shí)驗(yàn)組用膠原-DNA-Ag海綿膜，對(duì)照組用明膠海綿膜。
(3)觀察指標(biāo)用膠原-DNA-Ag海綿膜和明膠海綿膜敷壓后，記錄大耳白兔耳部創(chuàng)面止血時(shí)間。
(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果止血時(shí)間膠原-DNA-Ag海綿膜和明膠海綿膜止血時(shí)間分別為57.2±15.4S和96.0±15.1S；出血量分別為1.6±0.3ml和2.6±0.7ml，二者比較有顯著性差異(P≤0.05)。
用膠原-DNA-Ag海綿膜敷壓后10min、24h、48h觀察均末見(jiàn)海綿脫落和再出血現(xiàn)象，有效地密封出血?jiǎng)?chuàng)面。而明膠海綿膜三例在敷料與組織間有滲出現(xiàn)象，另外，對(duì)出血急促的兔耳部創(chuàng)面，血流常會(huì)穿過(guò)明膠的泡孔結(jié)構(gòu)面滲出，根據(jù)上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，膠原-DNA-Ag海綿膜止血效果優(yōu)于明膠海綿。
膠原-DNA-Ag海綿膜對(duì)燒傷的治療實(shí)施例6(1)、病例選擇4例燒傷后殘余傷面患者，平均深I(lǐng)I度、III度燒傷，治療組用膠原-DNA-Ag海綿膜2例，對(duì)照組用膠原海綿2例，創(chuàng)面細(xì)菌培養(yǎng)分別為金黃色葡萄球菌，綠濃桿菌各一例。
(2)、處置方法創(chuàng)面用無(wú)菌生理鹽水清洗之前，做創(chuàng)面組織細(xì)菌培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。創(chuàng)面用無(wú)菌生理鹽水清洗后，分別覆蓋膠原-DNA-Ag海綿膜、膠原海綿膜，隔日用無(wú)菌生理鹽水清洗換藥一次，比較二者治療的結(jié)果。
(3)、治療結(jié)果

結(jié)果表明治療組較對(duì)照組殘余傷面痊愈時(shí)間稍有縮短，創(chuàng)面細(xì)菌數(shù)量差異較大。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，4例全部具有肉芽組織特點(diǎn)，均無(wú)痂皮形成。
具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物，用于治療燒、燙傷及止血有著促進(jìn)肉芽組織形成、抑制痂皮形成的特點(diǎn)，用于生物敷料在醫(yī)學(xué)臨床使用，柔軟舒適，創(chuàng)面貼合性好，透氣、吸水、止血、抑菌消炎，促進(jìn)皮膚再生。
權(quán)利要求
1.具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物，其特征在于由以下原料制備膠原蛋白濃度為0.1-10％，，DNA濃度為0.1-5.0％，可溶性銀鹽AgNO3溶液濃度為1％至飽合，膠原蛋白DNA∶Ag比例為1.5-2.5∶0.5-1.5∶0.05-0.2(W/W/W).
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，其特征在于是以膠原蛋白濃度為0.1-10％、DNA濃度為0.1-5.0％、可溶性銀鹽AgNO3溶液濃度為1％至飽合濃度，經(jīng)離子交換、透析、脫氣、成型、冷凍、干燥、滅菌制成醫(yī)用抑菌膠原復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，其特征在于是以膠原蛋白濃度為0.4-1.0％，DNA濃度為0.1-1.0％，AgNO3溶液濃度為1％-10％，經(jīng)離子交換、透析、脫氣、成型、冷凍、干燥、滅菌制成醫(yī)用抑菌膠原復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，其特征在于在離子交換步驟中，將DNA溶于預(yù)冷至4℃的去離子水中，加入1％-飽合的AgNO3溶液，攪拌5-20分鐘，反應(yīng)溫度為-20-40℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，其特征在于將離子交換反應(yīng)完成后的DNA-AgNO3混合液透析，溫度為-20-40℃，時(shí)間為24-96h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，其特征在于在透析步驟，將0.1-10％的膠原溶液透析，透析溫度為-20-40℃，時(shí)間為24-96小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，其特征在于將透析后的膠原溶液脫氣，壓力為3.3-26.6 KPa，時(shí)間為5-20min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，其特征在于將脫氣后的膠原溶液噴入DNA-Ag溶液中，噴嘴孔徑0.05-1.0mm、孔密度為5-50個(gè)/cm2、壓力為0.05-0.5MPa.
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，其特征在于將成型后的膠原-DNA-Ag復(fù)合物冷凍，溫度為-20—-200℃
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，其特征在于將冷凍后的膠原-DNA-Ag復(fù)合物干燥，干燥溫度為-30-40℃，壓力為0.038-7.4 KPa，干燥劑為P2O5、KOH、液氮、干冰，干燥方法為真空干燥或真空冷凍干燥，得膠原-DNA-Ag海綿膜。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，其特征在于將獲得的膠原-DNA-Ag膠乳噴霧干燥，干燥用熱風(fēng)壓力為0.3-1.0MPa，溫度為80-200℃，得粉狀膠原-DNA-Ag復(fù)合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物的制備方法，其特征在于滅菌，滅菌方法為Co60照射。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抑菌功效的膠原-DNA-Ag復(fù)合物，其特征在于DNA鹽是DNA鈉鹽。
14.一種用于治療燒、燙傷及止血的藥物，其特征在于該藥物含有權(quán)利要求1所述的復(fù)合物或按照權(quán)利要求2至12任一項(xiàng)所述方法制備的復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明屬生化制品，特別涉及一種具有抑菌功效的膠原－DNA－Ag復(fù)合物及其制備方法，以濃度為0.1－10％膠原蛋白、濃度為0.1－5.0％DNA、濃度為1％至飽合AgNO
文檔編號(hào)A61K35/12GK1406489SQ01128060
公開(kāi)日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2001年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月18日
發(fā)明者周久才, 劉占龍, 金桂菊, 邢磊 申請(qǐng)人:阜新橡膠有限責(zé)任公司