專利名稱：可高效安全表達的新型核酸疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及一種核酸疫苗。
背景技術：
核酸疫苗，系將含有目標抗原(保護性抗原)編碼基因的真核細胞表達質粒直接注入機體，在體內表達目標抗原(保護性抗原)，以誘生特異性的免疫應答反應。
傳統(tǒng)的第一、二代疫苗，系將保護性抗原(例如，乙肝病毒的表面抗原、滅活或減毒的甲肝病毒)加工處理后形成的蛋白質類疫苗。
與傳統(tǒng)疫苗相比，核酸疫苗具有許多優(yōu)越性1.核酸疫苗接種后，其誘生免疫應答的機制類似于天然免疫。目標基因在體內表達出保護性抗原；抗原自行完成修飾過程后，具有與天然抗原相同的構象和抗原性，故使接種核酸疫苗產生的抗體具有較高的親和力。
2.核酸疫苗誘導機體產生全面的免疫應答。其不僅可以誘生體液免疫應答，產生特異性抗體，中和入侵的病原微生物，達到預防感染的目的，實現(xiàn)免疫預防的功能；更重要的是，由于核酸疫苗接種后，系在機體細胞內表達免疫原，有利于MHC I類分子的抗原遞呈，故可以誘生機體產生特異性細胞免疫反應(即特異性細胞毒性T淋巴細胞、CTL)，攻擊已被感染且有相應抗原表達的宿主細胞，對寄生有病原微生物的宿主細胞，乃至腫瘤細胞均具殺傷清除作用；因而，核酸疫苗也可望作為一種基因免疫治療手段，用于慢性感染性疾病及腫瘤的治療。
3.核酸疫苗不存在傳統(tǒng)減毒疫苗毒力回復的危險。理論上，可兼具滅活疫苗與減毒疫苗之長。
4.核酸疫苗容易制備成多價疫苗。即可將編碼不同抗原的基因構建在同一質粒中，或將不同抗原基因的多種重組質粒聯(lián)合應用。
5.與傳統(tǒng)的蛋白質疫苗相比，核酸疫苗的制備過程毋須涉及復雜的蛋白質純化工藝，成本較低廉；且性質穩(wěn)定，易于保存和運輸。
6.核酸疫苗具有多樣化的給藥途徑正是由于上述特點，核酸免疫技術被譽為疫苗發(fā)展史上的第三次革命，成為生物技術領域研究的熱點。
不過，國內外迄今為止的研究結果表明，基于現(xiàn)有的各種真核細胞表達體系所研制的核酸疫苗尚存在以下問題1.核酸疫苗表達質粒表達目標抗原的效率不高，導致誘生被接種者免疫應答的能力偏低，使核酸疫苗尚不能達到實用化的目的。
2.所接種的核酸疫苗質粒轉染機體細胞后，若長期存留于細胞中，則存在著隱患即核酸疫苗質粒DNA與宿主細胞染色體DNA整合，激活原癌基因。
上述兩個問題，已成為限制核酸疫苗實用化的“瓶頸”。近年來，國內外學者們已采用不同的方法，希望增強核酸疫苗的免疫誘生效力，例如在接種部位預先肌注麻醉劑布比卡因；在疫苗質粒中插入不同的細胞因子(如IL-2，GM-CSF等)或共刺激分子(如B7.1、B7.2等)的編碼基因；將疫苗質粒轉染樹狀突細胞之后再注入機體；用基因槍將疫苗質粒導入機體以及粘膜免疫等。盡管上述方法能不同程度地提高核酸疫苗的免疫效力，卻依然未達到理想的效果；而且，亦未能解決其安全性問題。顯然，如何使核酸疫苗能在機體內高效地表達，有效地誘生機體免疫應答；同時又能保證核酸疫苗的安全性，已成為核酸疫苗研究的技術關鍵。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種既能高效誘導免疫應答，又能確保使用者安全，不致產生任何有害作用的新型核酸疫苗。
核酸疫苗系核酸疫苗質粒的集合體。本發(fā)明將現(xiàn)有的常規(guī)核酸疫苗質粒與甲病毒(Alphavirus)的一種復制單元(a replication complex)NS1～NS4基因進行重組，形成新型的核酸疫苗質粒，再經(jīng)轉化、擴增、抽提與純化，制備新型核酸疫苗。所插入的復制單元NS1～NS4基因的堿基序列如圖1所示。
關于現(xiàn)有核酸疫苗質粒與甲病毒的復制單元NS1～NS4基因的重組，最好是將NS1～NS4基因插入于現(xiàn)有常規(guī)核酸疫苗質粒骨架中目標基因的上游。與現(xiàn)有常規(guī)核酸疫苗相比，本發(fā)明提供的新型核酸疫苗具有以下有益效果1.此種新型核酸疫苗轉染真核細胞后，疫苗質粒即可在CMV啟動子(或其它啟動子)的作用下，轉錄出復制單元及其下游的目的基因的RNA拷貝。該轉錄物中的復制單元RNA在轉染細胞中可翻譯出轉錄物自身復制所需要的酶。此后，該轉錄物即可在胞漿中大量自身復制，產生高拷貝的信息RNA，并進而表達目標抗原蛋白。在復制單元所編碼酶的作用下，其表達效率可超過國內外迄今所報道的核酸疫苗重組質粒；然后，所表達合成的高豐度目標抗原，被免疫細胞遞呈和加工；同時，在此過程中，還可誘生干擾素、白介素12及HSP(熱休克蛋白)，由于后者可對核酸疫苗發(fā)揮佐劑的作用，故可顯著提高宿主細胞的免疫應答效率。而常規(guī)的核酸疫苗質粒進入細胞后，不具備自身復制的能力，僅能轉錄出少量的信息RNA，故其合成目的蛋白的效率及誘生宿主免疫應答的能力均不高，遠遠低于本發(fā)明所創(chuàng)建的新型核酸疫苗質粒。
2.新型核酸疫苗質粒在細胞內的轉錄與表達水平達到一定豐度后，將誘導被其所轉染的細胞進入凋亡過程，從而形成一種“自毀機制”。“自毀機制”使體內的疫苗質粒得以被降解處理，解決了學術界所一直顧慮的核酸疫苗安全性問題。而且，凋亡形成的轉染細胞殘骸，被抗原遞呈細胞(例如樹突狀細胞)吞噬后，能夠強烈地激活免疫應答反應，是提高新型核酸疫苗效果的另一機制。
四

圖1是甲病毒的一種復制單元NS1～NS4基因的堿基序列。
圖2是本發(fā)明所提供的新型核酸疫苗的制備工藝流程圖。
五具體實施例方式
實施例本實施例中，常規(guī)核酸疫苗質粒1選用丙肝核酸疫苗NV/HC/CE1E2，所插入的一種甲病毒復制單元NS1～NS4基因2的堿基序列可見圖1。如圖2所示，通過連接反應將甲病毒復制單元NS1～NS4基因插入丙肝核酸疫苗質粒實現(xiàn)重組，形成新型核酸疫苗質粒3；再經(jīng)轉化、擴增、抽提、純化過程，即制備成新型核酸疫苗。其工藝流程如下(一)現(xiàn)有常規(guī)丙肝核酸疫苗質粒NV/HC/CE1E2與復制單元NS1～NS4基因的連接。
主要試劑2×T4DNA連接酶反應混合液1mol/L Tris·Cl(pH7.6) 1.0μl
100m mol/L MgCl21.0μl200m mol/L DTT 1.0μl10m mol/L ATP 1.0μlH2O5.5μl內切酶Bam HIT4DNA連接酶使用前配制。
操作步驟1.插入片段為0.2μg的甲病毒復制單元NS1～NS4基因的DNA(以下稱作外源DNA片段)。
2.用內切酶Bam HI切割0.5μg的丙肝核酸疫苗質粒NV/HC/CE1E2的DNA(以下稱作載體DNA)。在切割完畢后，加入2.5μl 100mmol/L Tris·Cl(pH8.3)，10mmol/L ZnCl2，再加入0.25單位小牛腸堿性磷酸酶，37℃保溫30分鐘，進行｀5端去磷酸化處理。
3.用1×TAE配制的低融點瓊脂糖凝膠(含0.5μg/ml EB)，電泳分離所需的DNA片段。
4.在長波紫外線下觀察電泳分離效果并估計DNA片段的含量，切下所需DNA片段，盡可能地切除不含所需DNA片段的多余凝膠，一般體積約為40～50μl，將其移入一個清潔的微型離心管中。
5. 65℃加熱10～15分鐘，以溶化低熔點瓊脂糖凝膠。
6.取出適量外源DNA與37℃預熱的載體DNA溶液混合，外源DNA與載體DNA的分子比率為2∶1，總體積不要超過10μl。另設兩個對照組，分別含載體DNA或外源DNA片段。
7.將三個微型離心管置37℃保溫5～10分鐘后，分別加入冰上預冷的10μl 2×T4DNA連接酶混合溶液，瓊脂糖凝固前立即混勻，在16℃反應12～16小時。
8.將連接完畢的連接混合物置70℃，10～15分鐘再融化。連接物DNA即新型核酸疫苗質粒，然后用于下一步對工程菌的轉化。
(二)將新型核酸疫苗質粒轉化工程菌主要試劑LB培養(yǎng)基或SOC培養(yǎng)基、含相應抗生素的瓊脂平板
SOB瓊脂平板0.1mol/L CaCl2CaCl2最好配制分裝成為1mol/L的貯存液，10ml，于-20℃貯存，使用前稀釋到100ml，用0.45μm的濾膜濾過滅菌。
1mol/L MgCl210mg/ml氨芐青霉素操作步驟1.制備感受態(tài)工程菌細胞(1)將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，37℃培養(yǎng)16～20小時。
(2)從平板中取出1個2～3mm大小的單菌落，移至含100ml LB或SOB培養(yǎng)基的500ml或1000ml三角瓶中，37℃300r/min強烈振蕩培養(yǎng)3小時，使細胞的濃度達到5×107個細胞/ml，此時，細菌的O.D.600一般在0.2～0.4之間，為對數(shù)生長期或對數(shù)生長前期。
(3)將培養(yǎng)物于冰上放置10分鐘，然后轉移到兩個50ml離心管中，4000r/min，4℃離心10分鐘(Sovall GS30轉頭)。
(4)棄上清，倒置離心管1分鐘，流盡剩余液體，然后加入10ml用冰預冷的0.1mol/CaCl2致敏液懸浮細胞，置于冰上10分鐘。
(5)4000r/min，4℃離心10分鐘回收細胞，棄上清，每50ml的原培養(yǎng)物再加入2ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液，懸浮細胞。此即感受態(tài)工程菌細胞。
(6)按每份200μl分裝細胞，若不馬上用于轉化，可以加入終濃度為10％的滅菌甘油，將該感受態(tài)細胞置于-70℃凍貯備用。
2.感受態(tài)工程菌的轉化(7)將前面1所述的連接物DNA(即新型核酸疫苗質粒)溶液，取10μl(40ng)，加入200μl感受態(tài)工程菌細胞中，溫和混勻，置于冰上30分鐘。進行此項操作步驟時，應設立兩個對照組□取10ng(10μl)已知的超螺旋閉環(huán)質粒DNA加至感受態(tài)細胞，作為陽性對照；□不加任何DNA的感受態(tài)細菌，作為陰性對照。
(8)42℃熱休克90秒鐘，迅速放回冰中，將細胞冷卻1～2分鐘后，加入800μl SOC培養(yǎng)基，37℃，225r/min，搖蕩培養(yǎng)細菌45～90分鐘，讓細菌中質粒表達抗生素抗性蛋白。
(9)取200μl轉化混合物鋪于90mm的SOB瓊脂平板上(SOB瓊脂中含有20mmolMgSO4和適當濃度的抗生素)，室溫下放置20～30分鐘，待溶液被瓊脂吸收后，倒置平皿于37℃培養(yǎng)12～16小時。待菌落長出后，挑取單菌落，即可用于進行下述的質粒擴增步驟。
(三)新型核酸疫苗質粒的擴增、抽提與純化主要試劑STE0.01mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA溶液□50mol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA該溶液可配制成100ml，6.76×104Pa消毒15分鐘，4℃貯存。
溶液□(新鮮配制)0.2N NaOH1％SDS溶液□5mol/L KAC 60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml酚、氯仿、乙醇。
操作步驟(1)將收集的菌體用10ml溶液□懸浮，再移至50ml離心管中。
(2)加入1ml用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)新鮮配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)混勻。
(3)加20ml新鮮配制的溶液□，蓋緊離心管管蓋，溫和地將離心管上下顛倒混勻5～7次，室溫放置5分鐘(可適當縮短，切忌延長)。(4)加入15ml冰預冷的溶液□，上下顛倒混勻，此步絕對避免強烈振蕩。冰浴放置10分鐘，此時形成的白色沉淀為細菌染色體DNA、大分子量RNA、鉀鹽/蛋白質/細胞膜的混合物。
(5)用日立離心機12000g，4℃離心20分鐘。
(6)將上清液通過4層消毒紗布過濾，置于另1個50ml日立離心管，加入0.6倍容積的異丙醇混勻，室溫放置10分鐘。
(7)12000g，室溫離心15分鐘。
(8)小心棄上清液，用70％乙醇室溫漂洗1次，1200g離心5分鐘后小心棄上清液，倒置離心管在濾紙上，流凈乙醇，或用消毒濾紙條擦凈管壁上乙醇，室溫放置5分鐘使乙醇蒸發(fā)。
(9)加入3ml TE，pH8.0，溶解DNA沉淀，進一步純化可根據(jù)具體條件選用超速離心法、或層析過柱法。所獲DNA產物經(jīng)檢定后，按需要分裝，即為核酸疫苗。
本發(fā)明不限于上述實施例，各種現(xiàn)有常規(guī)核酸疫苗質粒與甲病毒復制單元NS1～NS4的重組都能制備出本發(fā)明所提供的可高效安全表達的新型核酸疫苗。
權利要求
1.一種可高效安全表達的新型核酸疫苗，其特征在于形成該核酸疫苗的核酸疫苗質粒由現(xiàn)有常規(guī)核酸疫苗質粒與甲病毒的復制單元NS1～NS4基因重組而成。
2.根據(jù)權利要求1所述的可高效安全表達的新型核酸疫苗，其特征在于甲病毒的復制單元NS1～NS4基因插入于現(xiàn)有常規(guī)核酸疫苗質粒骨架中目標基因的上游。
全文摘要
一種可高效安全表達的新型核酸疫苗。形成該核酸疫苗的核酸疫苗質粒,由現(xiàn)有常規(guī)核酸疫苗質粒與甲病毒的復制單元NS1～NS4基因重組而成。此種核酸疫苗注入機體后,可在CMV啟動子的作用下,高拷貝地轉錄出NS1～NS4復制單元及其下游目標基因的RNA,其目標抗原的表達效率可超過國內外迄今所報道的核酸疫苗重組質粒;而且,當其在細胞內的轉錄與表達水平達到一定豐度后,還可以誘導被其所轉染的細胞進入凋亡過程,即形成一種“自毀機制”,從而有效地解決了核酸疫苗的安全性問題。
文檔編號A61K39/12GK1367020SQ01128979
公開日2002年9月4日 申請日期2001年10月19日 優(yōu)先權日2001年10月19日
發(fā)明者趙連三, 秦山 申請人:四川大學華西醫(yī)院