專利名稱：薯蕷皂苷元的新制藥用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及薯蕷皂苷元的新制藥用途，具體說是薯蕷皂苷元在制備抗腫瘤藥物中的新制藥用途。
薯蕷皂苷元是一種從薯蕷屬植物中提取的一種皂甙元，當前國外合成皮質激素藥物所用的起始原料，有60％是薯蕷皂甙元，薯蕷的年產量為600-800噸，其中墨西哥年產量200-500噸。除了多種薯蕷當中含有薯蕷皂甙元之外，國內經普查，發(fā)現了穿龍、盾葉、黃山藥等植物含薯蕷皂甙元量較多。對于薯蕷皂甙元的提取，工業(yè)上國內外均采用將薯蕷皂甙塊莖干粉直接酸水解、溶劑汽油等有機溶劑提取薯蕷皂甙元的工藝方法。對于薯蕷皂甙元在臨床上的應用，文獻報道較少，有報道將薯蕷皂甙元用于制備護膚液，以薯蕷皂甙元、冰片、水楊酸、氯霉素、甘油、乙醇組成配方，主要用于治療痤瘡、質溢性皮炎和花斑癬等皮膚病，至今未見有文獻報道將薯蕷皂甙元制備成抗腫瘤的藥物。
本發(fā)明目的是提供薯蕷皂苷元的新制藥用途，即薯蕷皂苷元在制備抗腫瘤藥物中的新制藥用途。
薯蕷皂苷元是一種已知的具有藥物活性的物質，因此，可以按照常規(guī)的制劑方法，將其制備成臨床上可適用的任何一種藥劑，例如，片劑、膠囊劑、注射劑、口服液體制劑、顆粒劑等。
在制備上述制劑的過程當中，可以將薯蕷皂苷元與任何一種適用于制備成臨床藥劑的賦型劑混合使用，制備成藥物制劑。
由于薯蕷皂甙元在制備抗腫瘤藥物中的應用是發(fā)明人的首次發(fā)現，因此，無論是單獨使用薯蕷皂甙元為活性成分制成藥劑，還是利用薯蕷皂甙元的抗腫瘤活性與其他活性成分配合使用制成藥劑，均在本專利的保護范圍之內。
薯蕷皂甙元的抗腫瘤活性已經通過如下藥理實驗得以證實。
實驗例一 薯蕷皂苷元的體外抗腫瘤作用樣品薯蕷皂苷元diosgenin細胞培養(yǎng)L929，HeLa細胞株來自(American Tissue Culture Collection，ATCC，USA)，用RPMI 1640(Gibco)培養(yǎng)液，加入10％的胎牛血清，1％的抗牛素(10,000U/ml青霉素和10,00μg/ml鏈霉素)，2mM谷氨酰胺，置于4％的孵箱中培養(yǎng)。
體外細胞毒實驗取處于對數生長期的細胞，貼壁細胞(L929，HeLa)經胰蛋白酶消化后分別接種于96孔培養(yǎng)板(1×10個/ml)，待細胞完全貼壁后，分別加入以RPMI 1640培養(yǎng)液配制的各濃度樣品，每種樣品3個復孔，同時設0對照和陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)48h。用MTT法于595nm進行比色測定，其平均值為細胞存活光密度，將所得的結果與對照組進行比較，計算各條件下細胞死亡率(如下表所示)。 表1.不同濃度的薯蕷皂苷元誘導的腫瘤細胞死亡率(％)藥物濃度 腫瘤細胞死亡率(％)μg/ml L929HeLa1 0 05 7.5 12.310 15.020.520 25.837.350 45.250.510082.498.5細胞凋亡的形態(tài)學研究方法在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。與未經處理的酬性細胞對照比較，實驗組細抱(薯蕷皂苷元給藥組)具有典型的凋亡形態(tài)學改變，細胞體積縮小，變圓、固縮，有的晚期己形成凋亡小體。
利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA LadderDNA片段抽提及DNA凝膠電泳(1)實驗方法收集HeLa細胞(約2×106個)，轉移至離心筒內，離心后，PBS洗滌，加入細胞裂解緩沖液(5mM Tris，20mMEDTA，0.5％TritonX-100)37℃30min，然后于16,000rpm，4℃離心20min，吸取上清夜(含DNA片段)分別與RnaseA及蛋白酶K于37℃共培養(yǎng)1h，加入20μ1NaCl(5M)，120μl異丙醇，置于-20℃放置過夜，再次子16,000rpm，4℃離心15min，除去上清，重復離心一次。完全除去上清，加入20TE(Tris-EDTA)緩沖液，溶解DNA片段，在100V的電壓廠，用2％的瓊脂糖凝膠，在TBE(Tris-borate-EDTA)緩沖液中電泳30min，以BPB作指示劑，同時加入100bp的DNA Ladder分子量標準作為參照，用0.5g/mlEB{ethidium bromide)染色15min，脫色后在UV透射鏡下觀察。
(2)結論瓊脂糖凝膠電泳方法是分離、純化、鑒定DNA片段的典型方法，細胞凋亡時的突出的生物化學改變是染色質DNA的有控裂解，隨著核酸內切酶的活化，DNA降解成寡聚核小體，細胞核DNA裂解片段均為180-200個堿基對整倍數的寡聚核甘酸片段，在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜。經薯蕷皂苷元處理48h后，HeLa細胞懸液經裂解消化按常規(guī)法提取DNA后，于瓊脂糖凝膠中進行電泳，溴化乙啶(EB)染色，可見典型的梯狀條帶(Ladder)，而在陰性細胞中，其核是完整的，不會產生低分子量的DNA。
結論在離體條件下，薯蕷皂苷元為濃度為20-100Llg/ml時，其對L929和HeLa細胞有明顯的抑制作用。DNA凝膠電泳試驗證明，經薯蕷皂苷元處理48小時后，HeLa細胞懸浮液經裂解消化后，按常規(guī)方法提取DNA后，于瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色，可見典型的梯狀條帶(Ladder)，即薯蕷皂苷元可引起HeLa細胞調亡。
實驗例二 薯蕷皂苷元整體抗腫瘤作用實驗目的觀察薯蕷皂苷元(Diosgenin，Dio)的整體抗腫瘤作用。
方法觀察所示藥物對4種小鼠移植性腫瘤[肉瘤-180(S-180)、肝瘤腹水型(HepA)、小鼠宮頸癌-14(U14)艾氏腹水癌(EAC)]腋部皮正接中，于接種10日內每天給藥1次，計算各給藥組瘤腫抑制率。結果(1)Dio 200、100和50mg.kg-1ig對S180具有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為50.6％、42.9％和35.9％；Dio 10050和25mg.kg-1ip對S180均具有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為51.3％、46.8％和34.6％(2)Dio 200和100mg.kg-1ig對HepA具有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為41.6％和30.4％；當其ip劑量為100和50mg.kg-1時對HepA也具有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為41.0％和37.3％；(3)Dio 200、100和50mg.kg-1ig，對U14也具有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為44.6％34.7％和28.3％”；Dio100和50mg.kg-1ip對U14具有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為45.％和30.4％；(4)無論是灌胃，還是腹腔注射對EAC都沒有抑制作用(P＞0.05).結論薯蕷皂苷元具有明顯的抗腫瘤作用。
動物4種腫瘤腹水傳代小鼠，均購自吉林省腫瘤研究所；昆明小鼠，體重18-22g購自中國人民解放軍農牧大學實驗動物中心(動物合格證號10-5112)。
藥品 薯蕷皂苷元由吉林天藥科技有限公司制劑室提供。注射環(huán)磷酰胺，規(guī)格200mg/支，批號980101，上海華聯(lián)制藥有限公司產品。
方法實驗小鼠隨機分為對照(ig蒸餾水20ml.kg-1)、環(huán)磷酰胺(ip20mg.kg-1)、Dio(ig 200ml.kg-1、100ml.kg-1和50ml.kg-1)和Doi(ip100ml.kg-1、50ml.kg-1和25ml.kg-18組。選取移植腫瘤7天，腫瘤生長良好，腹部澎隆明顯的小鼠，腹部皮膚消毒，用一次性無菌采血器經腹壁刺入腹腔，抽取腹水放入無菌燒杯中以生理鹽水稀釋成1∶3的癌細胞混懸液，于每只實驗小鼠右腋下接種0.2ml[1]。各組動物于接種腫瘤次日開始給藥，每日1次，連續(xù)給藥10天。給藥結束次日，將動物稱體重后脫臼處死，剝離出皮下腫塊稱重，比較各組腫瘤生長情況，統(tǒng)計學處理方法采用組間“t”檢驗。結果各組動物體重、腫瘤重量及抑瘤率統(tǒng)計結果見表1-4。
表1 Dio對小鼠(S180)瘤重的影響(X±S)劑量 動物體重(g) 抑瘤動物組別mg.kg-瘤重(g) 率1數(n) 給藥前 給藥后(％)對照組- 10 18.5±1.51 24.3±3.06 1.56±0.70環(huán)磷酰2010 19.0±1.56 22.5±2.07 0.70±0.25**55.1胺Dio(ig) 200 10 18.7±1.95 23.3±1.83 0.77±0.29**50.6Dio(ig) 100 10 18.4±1.78 22.2±2.57 0.89±0.34*42.9Dio(ig) 5010 18.7±1.95 23.7±3.40 1.00±0.37*35.9Dio(ip) 100 10 19.1±1.91 23.2±1.93 0.76±0.24**51.3Dio(ip) 5010 18.9±1.97 24.9±3.14 0.83±0.32**46.8Dio(ip) 2510 18.9±1.91 22.9±3.96 1.02±0.30*34.6注與對照組比較，*p＜0.05；**p＜0.01表2 Dio對小鼠(HepA)瘤重的影響(X±S)劑量動物體重(g) 抑瘤動物組別 mg.kg 瘤重(g)率-1數(n)給藥前給藥后(％)對照組 - 918.0±1.41 26.3±2.961.61±0.38環(huán)磷酰 20 918.2±1.72 21.4±3.360.41±0.15***74.5胺Dio(ig) 20010 18.0±1.89 27.1±2.850.94±0.34***41.6Dio(ig) 10010 18.0±1.33 2.69±2.181.12±0.30**30.4Dio(ig) 50 10 18.1±1.20 26.8±2.251.21±0.53*24.8Dio(ip) 10010 18.1±1.37 24.2±1.810.95±0.37**41.0Dio(ip) 50 10 18.1±1.20 26.0±3.091.01±0.43**37.3Dio(ip) 25 10 18.1±1.45 24.0±3.161.17±0.64# 27.3注與對照組比較，#p＞0.05；**pp＜0.01；***p＜0.01
表3 Dio對小鼠U14瘤重的影響(X±S)劑量 動物體重(g) 抑瘤率組別 瘤重(g)mg.kg-1給藥前 給藥后(％)對照組 -18.3±0.95 28.9±2.98(9) 1.84±0.40環(huán)磷酰25.7±20 18.6±1.08 1.21±0.34**34.2胺3.40(10)Dio(ig)200 18.5±0.85 24.7±4.92(7) 1.02±0.50**44.6Dio(ig)100 18.5±0.85 26.4±3.62(8) 1.20±0.32**34.7Dio(ig)50 18.5±0.85 26.2±3.90(9) 1.32±0.61*28.326.1±Dio(ip) 100 18.4±0.84 1.00±0.54**45.73.04(10)24.0±Dio(ip) 5018.4±0.84 1.28±0.21**30.43.80(10)26.1±Dio(ip) 2518.4±0.84 1.44±0.84# 21.73.14(10)注與對照組比較，#p＞0.05；*p＜0.05；**p＜0.01表4 Dio對小鼠艾氏腹水瘤重(X±S)劑量動物體重(g) 抑瘤率組別 mg.kg-瘤重(g)1給藥前 給藥后(％)對照組 - 20.4±0.97 30.3±2.71(10) 1.91±1.10環(huán)磷酰 2020.4±0.97 26.6±3.89(10) 1.45±0.52#24.1胺Dio(ig) 200 20.5±0.85 27.8±3.53(9) 1.46±0.32#23.6Dio(ig) 100 20.4±0.97 2.69±3.99(10) 1.70±0.54#11.0Dio(ig) 5020.5±0.85 29.0±2.18(9) 1.50±0.68#21.5Dio(ip) 100 20.4±0.97 228.2±1.86(9) 1.78±0.80#6.8Dio(ip) 5020.4±0.97 27.1±2.56(10) 2.07±0.85#-8.4Dio(ip) 2520.4±0.97 30.5±4.72(10) 2.27±1.05#37.3注與照組比較，p＞0.05；*p＜0.05；實施例處方薯蕷皂甙元 250克淀粉 2500克共制成 1000個膠囊，每個內含主藥250毫克制法將淀粉先進行干燥，過120目篩，然后與薯蕷皂甙元混合均勻，過兩次120目篩，充分混勻，送檢合格后，分裝填入空膠囊中，即得。
權利要求
1.薯蕷皂苷元在制備抗腫瘤藥物中的應用。
2.根據權利要求1的用途，其特征在于所說的腫瘤是肉瘤-180。
3.根據權利要求1的用途，其特征在于所說的腫瘤是肝瘤腹水型。
4.根據權利要求1的用途，其特征在于所說的腫瘤是小鼠宮頸癌。
5.根據權利要求1的用途，其特征在于所說的腫瘤是艾氏腹水癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了薯蕷皂苷元的藥物新用途，即薯蕷皂苷元在制備抗腫瘤藥物中的應用，所說的腫瘤可以是肉瘤－180、肝瘤腹水型、小鼠宮頸癌、艾氏腹水癌。
文檔編號A61K31/7028GK1390551SQ0112931
公開日2003年1月15日 申請日期2001年6月11日 優(yōu)先權日2001年6月11日
發(fā)明者王本祥, 王麗娟, 王巖, 陳聲武, 董梅 申請人:吉林天藥科技股份有限公司