專利名稱：海狗油作為制備治療急性肝損傷的藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是將海狗油作為制備治療急性肝損傷的藥物的應(yīng)用，具體地講，本發(fā)明涉及的是將海狗油作為制備治療哺乳動(dòng)物以及人的急性肝損傷的藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知，糖尿病、肝病、前列腺、高血脂等疾病的患者數(shù)量是很巨大的，而實(shí)際應(yīng)用中，具有特別明顯效果而幾乎沒(méi)有副作用的藥物卻很難確認(rèn)。
通常認(rèn)為，愛(ài)斯基摩人和日本沿海漁民患此類疾病的患者數(shù)量比一般人群要明顯的低，研究人員相信這種現(xiàn)象和與他們食用富含不飽和脂肪酸的海狗肉、油有關(guān)。
但是，至今并未有具體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或者臨床結(jié)果加以證明。
在本發(fā)明中所述的海狗通常是指生活紐芬蘭、北大西洋地區(qū)、北極的一種哺乳動(dòng)物，它們體內(nèi)脂肪中不飽和脂肪酸含量高達(dá)25％，其分子結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)的脂肪酸分子結(jié)構(gòu)相似。
本發(fā)明所述的海狗油(又稱海豹油)是指由海狗的皮下脂肪提煉而成的純天然產(chǎn)品。
研究結(jié)果表明，海狗油中含有大量的人體必需的體內(nèi)不能自行合成的ω-3系長(zhǎng)碳鏈多烯不飽和脂肪酸以及少量的角鯊烯(SPUALENE)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種將海狗油作為制備治療急性肝損傷的藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)采用的海狗油為海狗體內(nèi)提取而成的微黃色油狀液體，由加拿大的大西洋衛(wèi)生食品有限公司以軟膠囊(0.5g/粒)方式提供，批號(hào)為11656，所述的海狗油在實(shí)驗(yàn)室采用室溫保存。
為了進(jìn)一步明確上述海狗油的成份和含量，以下對(duì)本發(fā)明所使用的海狗油的成份進(jìn)行分析和確認(rèn)。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)表明，從海狗油中提取的ω-3系多烯不飽和脂肪酸的化學(xué)主成份為EPA、DHA和DPA，其中EPA是指二十碳五烯酸；DPA是指二十二碳五烯酸；DHA是指二十二碳六烯酸；本發(fā)明的研究人員對(duì)上述獲得的海狗油進(jìn)行紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、氣相色譜、氣-質(zhì)聯(lián)用色譜等項(xiàng)目的測(cè)定，對(duì)所述樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)，具體如下本發(fā)明采用的海狗油樣品的檢測(cè)結(jié)果是(1)紫外吸收光譜用氯仿(分析純)把樣品配成5.9mg/ml溶液后進(jìn)行全波長(zhǎng)紫外掃描，所使用的儀器的型號(hào)是U-3210spectrophotometer(Japan制造)；參見(jiàn)附圖1，其結(jié)果表明樣品在249.8nm處有最大吸收，可以證明樣品中含有大量的不飽和鍵；(2)紅外吸收光譜參見(jiàn)附圖2，其結(jié)果表明，在3010cm-1和1745cm-1處的強(qiáng)吸收分別是不飽和＝C-H和＞C＝O伸縮振動(dòng)的特征吸收；1655cm-1處的弱吸收符合順式雙鍵(R1-C＝C-R2)的伸縮振動(dòng)特征吸收(1665-1635cm-1，反式為1675-1665cm-1)，H/ \H722cm-1處的吸收峰符合順式雙鍵＝C-H彎曲振動(dòng)的特征吸收(730-665cm-1，反式為980-960cm-1)。
綜合紅外和紫外光譜分析，可以認(rèn)為樣品中主要為順式非共軛脂肪酸。
(3)氣相色譜在本項(xiàng)檢測(cè)中，采用的標(biāo)準(zhǔn)品由SIGMA公司提供，分別為Cis-5，8，11，14，17-EICOSAPENTAENOIC ACID METHYL ESTER，二十碳五烯酸甲酯；Cis-4，7，10，13，16，19-DOCOSAHEXAENOIC ACID ETHYL ESTER，二十二碳六烯酸乙酯；Cis-7，10，13，16，19-DOCOSAPENTAENOIC ACID METHYL ESTER，二十二碳五烯酸甲酯；樣品為上述獲得的海狗油，用GC法分析脂肪酸需要將其乙酯化以利氣化，具體是取所述的樣品80μl，加0.5ml/l的NaOH-乙醇液1ml，充N2，加塞，于50攝氏度水浴中振搖至小油滴完全消失，加三氟化硼乙醇液1.5ml?；旌暇鶆颍?0度水浴中放5min，取出冷卻，加正庚烷1ml、飽和NaCl為2ml混合均勻，分層。取上層液于另一試管中，加少量無(wú)水NA2SO4，充N2，于4度放置待GC分析。
所使用的儀器為HP6890；氣相色譜條件玻璃充填柱2m×3mm，10％DEGS酸洗，101白色擔(dān)體，載氣N2，流速25ml/min，檢測(cè)器FID，柱溫180度，氣化室210度，檢測(cè)器270度，進(jìn)樣量1ul。
將標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷定容，配置成2.5mg/ml溶液，精密量取1ul進(jìn)行氣相含量測(cè)定，同樣的方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果是樣品和對(duì)照品的保留時(shí)間一致。
可參見(jiàn)附圖3-7。
(4)氣-質(zhì)聯(lián)用法采用的儀器為美國(guó)Trace 2000GC/Trace MS型氣-質(zhì)聯(lián)用儀，所有試劑均為分析純。
實(shí)驗(yàn)條件為氣相色譜條件PEG-20M玻璃毛細(xì)管柱(2m×0.32mm)；柱溫40度保持1min，以10度/min升溫至200度，保持5min，再以30度/min升溫至210度，保持2min；載氣N2，柱前壓3.0kpa，分流比1∶30，進(jìn)樣口溫度250度；離子源溫度250度，電離電壓70Ev，質(zhì)量掃描范圍350AmU.S-1；進(jìn)樣量1ml。
經(jīng)質(zhì)譜圖分析，確定樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的分子量相符。
至此，對(duì)本發(fā)明采用的海狗油的分子量、成份、含量和結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到確認(rèn)。
本發(fā)明的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中所用的材料的準(zhǔn)備。
一、海狗油所述的海狗油已經(jīng)在上述的內(nèi)容中詳細(xì)描述，實(shí)驗(yàn)時(shí)直接吸取原藥液或橄欖油稀釋后的藥液，大鼠每140g體重灌胃給予1.2ml(高劑量使用原藥液)或1ml(中，低劑量使用稀釋藥液)。
二、陽(yáng)性對(duì)照藥本發(fā)明中使用的陽(yáng)性對(duì)照藥為聯(lián)苯雙酯，每丸含量1.5mg，批號(hào)990527，由北京協(xié)和制藥廠生產(chǎn)，購(gòu)于北京協(xié)和制藥廠藥店。試驗(yàn)前將藥丸在乳缽中壓碎，邊研磨邊加入蒸餾水，制成濃度22.5mg/ml的混懸藥液，大鼠灌胃體積1ml/140g體重。
三、空白對(duì)照組大鼠每只灌胃1ml蒸餾水。
四、模型對(duì)照藥本發(fā)明中采用的模型對(duì)照藥是四氯化碳，分析純，由北京化工廠生產(chǎn)，批號(hào)990401，購(gòu)于北京醫(yī)藥商店。試驗(yàn)前用橄欖油配成0.1％溶液，按10ml/kg腹腔注射。
五、生化試劑及其它試劑AST酶及ALT酶檢測(cè)試劑盒為北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)，橄欖油，生理鹽水，福爾馬林均購(gòu)于北京醫(yī)藥商店。
六、試驗(yàn)動(dòng)物本發(fā)明中采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清結(jié)級(jí)wister大鼠，雌雄各半，體重130-150g，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)京動(dòng)許字(2000)第012號(hào)，由中國(guó)藥品生物制品檢定所中心提供。實(shí)驗(yàn)前觀察2天，選健康，活潑的動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)。
為了確認(rèn)本發(fā)明所述的海狗油在治療四氯化碳致急性肝損傷模型方面的療效，進(jìn)行了以下的動(dòng)物試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖橇私馑龅暮９酚驮谥委熕龅乃穆然贾录毙愿螕p傷方面的藥理學(xué)作用和效果，具體的方法與結(jié)果如下取大鼠48只，雌雄各半，體重130-150g，試驗(yàn)共分6組，每組8只，即空白對(duì)照組，模型對(duì)照組均灌胃給水1ml/只，陽(yáng)性對(duì)照藥聯(lián)苯雙酯0.16g/kg組，海狗油8.6ml/kg組，4.3ml/kg組，2.2ml/kg組。每天灌胃給藥1次，連續(xù)7天，在第7天給藥后5小時(shí)，除空白對(duì)照組外，均腹腔注射0.1％四氯化碳。給藥期間大鼠精神好，活動(dòng)自如，未見(jiàn)藥物引起的不良反應(yīng)，給藥滿7天，進(jìn)行以下指標(biāo)的檢測(cè)。
1、AST酶(門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)及ALT酶(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)的測(cè)定腹腔注射0.1％四氯化碳后，于第8天斷頭取血，待血液凝固后3000rpm，離心10分鐘，收取血清。按試劑盒要求分別測(cè)定血清中AST酶及ALT酶的含量，以兩組t檢驗(yàn)測(cè)定各組AST酶及ALT酶含量差異的顯著性。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1海狗油對(duì)AST酶及ALT酶的影響(一)


與空白對(duì)照組比#P＜0.05，*P＜0.01海狗油對(duì)AST酶及ALT酶的影響(二)

與空白對(duì)照組比*P＜0.01結(jié)果表明，空白對(duì)照組的AST酶及ALT酶在正常值范圍內(nèi)，模型對(duì)照組的值升高非常明顯；而陽(yáng)性對(duì)照組及海狗油4.3ml/kg-8.6ml/kg組的數(shù)值均有明顯降低，與模型對(duì)照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異或非常顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)。
2、病理組織學(xué)觀察及測(cè)定在取血同時(shí)逐一取同部位矸用10％福爾馬林固定48小時(shí)，常規(guī)制片，HE染色，光鏡檢查。顯微鏡下觀察可見(jiàn)空白對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)現(xiàn)特殊病變。模型對(duì)照動(dòng)物病變顯著嚴(yán)重，大部分動(dòng)物腹腔出血，肝中央靜脈高度擴(kuò)張淤血，匯管區(qū)組織及中央靜脈細(xì)胞嚴(yán)懲損害(退變一壞死)，陽(yáng)性對(duì)照藥及高劑量組與空白對(duì)照相近矸組織結(jié)構(gòu)明確，中劑量組個(gè)別大鼠匯管區(qū)組織及周邊少量肝細(xì)胞受損害，中央靜脈輕度擴(kuò)張充血，低劑量組病變較以上稍重，其效果次于高，中劑量組。詳見(jiàn)圖1-6。
海狗油在4.3-8.6ml/kg劑量下，連續(xù)灌胃7天，對(duì)大鼠四氯化碳所致的急性肝損傷，可以使升高的AST酶和ALT酶降低，可以有效地預(yù)防急性損傷的發(fā)生，肝病理組織學(xué)觀察認(rèn)為抗急性肝損傷作用明顯，提示了該藥在此劑量下，具有較好的抗急性肝損傷的作用。


以下是本發(fā)明的

，通過(guò)

并結(jié)合上述的具體描述，可以更清楚地理解本發(fā)明，具體如下附圖1是本發(fā)明所采用的海狗油的紫外吸收譜圖；附圖2是本發(fā)明所采用的海狗油的紅外吸收譜圖；附圖3-5是本發(fā)明中使用的EPA甲酯、DHA乙酯、DPA甲酯的標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖；附圖6-7是本發(fā)明所采用的海狗油的氣相色譜圖；
附圖8是本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)中病理組織學(xué)觀測(cè)及測(cè)定，其中附圖8-1是高劑量組，肝組織結(jié)構(gòu)與空白對(duì)照組相近，肝小葉與肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈部肝細(xì)胞排列成索，呈放射狀；附圖8-2是中劑量組，肝組織結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，部分動(dòng)物中央靜脈擴(kuò)張充血；附圖8-3是低劑量組，個(gè)別動(dòng)物匯管區(qū)組織變性壞死，肝細(xì)胞見(jiàn)核固縮，胞漿呈空泡變性；附圖8-4是對(duì)照組，肝組織結(jié)構(gòu)完整，清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈壁薄，肝細(xì)胞排列成索，呈放射狀；附圖8-5是模型對(duì)照組，中央靜脈高度擴(kuò)張，淤血，匯管區(qū)及中央靜脈附近肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害(退變-壞死)，肝細(xì)胞索消失；附圖8-6是陽(yáng)性對(duì)照組，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰，偶見(jiàn)中央靜脈擴(kuò)張有充血及部分炎性細(xì)胞；附圖8-7是對(duì)照組，肝組織結(jié)構(gòu)完整，清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈壁薄，肝細(xì)胞排列成索，呈放射狀；附圖8-8是模型對(duì)照組，中央靜脈高度擴(kuò)張，淤血，匯管區(qū)及中央靜脈附近肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害(退變-壞死)，肝細(xì)胞索消失；附圖8-9是陽(yáng)性對(duì)照組，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰，偶見(jiàn)中央靜脈擴(kuò)張有充血及部分炎性細(xì)胞；附圖8-10是高劑量組，肝組織結(jié)構(gòu)與空白對(duì)照組相近，肝小葉與肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈部肝細(xì)胞排列成索，呈放射狀；附圖8-11是中劑量組，肝組織結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，部分動(dòng)物中央靜脈擴(kuò)張充血；附圖8-12是低劑量組，個(gè)別動(dòng)物匯管區(qū)組織變性壞死，肝細(xì)胞見(jiàn)核固縮，胞漿呈空泡變性；
權(quán)利要求
1.一種主要成份為二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)的海狗油作為制備治療急性肝損傷的藥物的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用優(yōu)選2.2-8.6ml/kg的劑量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用更優(yōu)選4.3-8.6ml/kg的劑量。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是將海狗油作為制備治療急性肝損傷的藥物的應(yīng)用，研究人員發(fā)現(xiàn)，將本發(fā)明所述的海狗油在2.2ml/kg－8.6ml/kg劑量下，連續(xù)灌胃，對(duì)四氯化碳致大鼠急性肝損傷，所述的海狗油可明顯地抑制四氯化碳致AST酶(門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)及ALT酶(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)含量的升高，表明本發(fā)明所述的海狗油具有明顯的預(yù)防和治療急性肝損傷的作用。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1410074SQ01135518
公開(kāi)日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2001年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月30日
發(fā)明者徐康森, 李湛軍, 樂(lè)嘉靜, 忻余, 林蘭, 何謂鑒 申請(qǐng)人:中國(guó)藥品生物制品檢定所