專利名稱：間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞重建造血方法的建立及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞的多向分化等細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，通過分離具有多系分化潛能的骨髓間充質(zhì)源干細(xì)胞群聯(lián)合G-CSF等細(xì)胞因子注射建立了一種重建骨髓造血的方法，從而驗證了成體干細(xì)胞在特定環(huán)境下多系分化的體內(nèi)自體修復(fù)模式并提出骨髓移植新策略。
目前，臨床上的移植以骨髓、外周動員血、臍血移植為主，而造血干細(xì)胞的異體骨髓移植免疫排斥問題、以及外周動員血或臍血移植的造血干細(xì)胞質(zhì)和量等問題都有待于進(jìn)一步解決和克服，隨著對成體干細(xì)胞分化機(jī)制的認(rèn)識逐步深入，我們提出成體干細(xì)胞為存在于人體組織中具有多系分化潛能亞全能干細(xì)胞群，在特定環(huán)境下可誘導(dǎo)分化成多種組織細(xì)胞。本發(fā)明系骨髓間充質(zhì)源干細(xì)胞群分化造血干細(xì)胞造血重建自體移植模式，從新生兒、小鼠和兔骨髓，胎兒胰腺中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞群，證明其具有多能干細(xì)胞的特征，由此進(jìn)行了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)移植實驗。應(yīng)用具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞成功地重建了受超致死量照射的BALB/C小鼠的造血，并鑒定了重建受體小鼠的供體間充質(zhì)干細(xì)胞造血來源。本發(fā)明為成體干細(xì)胞群在骨髓移植中新用途。
本發(fā)明的目的是在國際上首次利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞群重建經(jīng)超致死量照射骨髓衰竭動物的造血，并達(dá)到長期存活，建立間充質(zhì)干細(xì)胞群聯(lián)合G-CSF等細(xì)胞因子分化造血細(xì)胞的方法并可應(yīng)用于造血障礙性疾病及多種造血細(xì)胞腫瘤疾病的治療，從而為臨床骨髓移植提供了新的骨髓移植途徑。
本發(fā)明的目的是通過下述方法實現(xiàn)的(

圖1)一、采用液體培養(yǎng)分離，擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，作為供體細(xì)胞(1)取人或動物骨髓，計數(shù)細(xì)胞，淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll 1.077g/ml)分離單個核細(xì)胞，離心1500轉(zhuǎn)/分，20分鐘，取白環(huán)以上細(xì)胞部分，重懸于RPMI1640培養(yǎng)液(GibcoBRL公司)中，計數(shù)細(xì)胞，用含DMEM-LG/F12，MCDB-201，2％FCS(GibcoBRL公司)培養(yǎng)液培養(yǎng)，接種濃度為1-2×106/ml。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，一天后換液，棄去非貼壁的細(xì)胞，以后每二天全量換液。至培養(yǎng)后第10天，細(xì)胞達(dá)80％融合，用0.25％胰酶(Sigma公司)消化，輸注。
供體細(xì)胞的鑒定將細(xì)胞置于有小玻片的3.5cm直徑平皿中，37℃，飽和濕度，5％CO2培養(yǎng)12天后取出空氣風(fēng)干，瑞士染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。倒置顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞于24小時內(nèi)即貼壁，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣，具有梭形、多角形等細(xì)胞形態(tài)。
細(xì)胞用2.5％戊二醛固定2小時，經(jīng)PBS洗凈，1％鋨酸固定2小時，丙酮梯度脫水，經(jīng)常規(guī)Ep0812包埋，聚合后超薄切片機(jī)切片。醋酸鈾枸櫞酸鉛染色，在H-100電子顯微鏡下觀察可見以纖維母細(xì)胞為主，特點(diǎn)為長形、梭形細(xì)胞，核異染色質(zhì)少，核仁明顯，胞漿中有擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微管、微絲，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向外分泌微絲。少數(shù)細(xì)胞胞漿中細(xì)胞器少，胞漿少，核仁明顯，可能為干細(xì)胞。
取各代細(xì)胞，消化計數(shù)，接種于24孔板內(nèi)(1×104細(xì)胞/孔)，每隔一天取兩孔細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，計算均值，繪制生長曲線。在細(xì)胞生長的對數(shù)期，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞倍增時間約為25小時。細(xì)胞每傳一代細(xì)胞數(shù)約增長2倍。
(2)將細(xì)胞消化，70％冷乙醇4℃固定24小時，10mg/ml PI染色(4℃，避光30分鐘)，用流式細(xì)胞儀(FACSVantage型)檢測，ModFIT軟件分析結(jié)果。細(xì)胞周期分析，發(fā)現(xiàn)超過80％的細(xì)胞都處于G0/G1期。利用流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行表型測定CD34，HLA-DR為陰性，CD44、CD29、CD13則為陽性。
SA方法證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞I、III型膠原、vWF因子表達(dá)陽性。
(3)測定各代細(xì)胞的端粒酶活性，證明其端粒酶高表達(dá)。
(4)體外及體內(nèi)多系誘導(dǎo)分化，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80％融合時，以5×103/cm2接種于25cm2培養(yǎng)瓶和6cm直徑的培養(yǎng)皿，成骨分化體系10-7M地塞米松、10mMβ-磷酸甘油、0.05mM維生素C和10％FCS的IMDM；脂肪分化體系含10-6M地塞米松、0.5mM3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)、0.1mM維生素C和10％FCS的IMDM。成軟骨分化體系DMEM-HG、MCDB、2％FCS、地塞米松10-7M、TGF-β10ng/ml。可成功誘導(dǎo)成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
(5)體外誘導(dǎo)分化的檢測，在第4天、第8天、第12天和第16天分別檢測鈣化小結(jié)、脂肪滴、堿性磷酸酶染色、蘇丹黑染色、及骨鈣蛋白、脂蛋白脂酶等基因的表達(dá)，從而鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和成脂肪分化潛能。阿爾新藍(lán)染色法檢測蛋白多糖，免疫組化法檢測II型膠原，RT-PCR法檢測II型膠原基因表達(dá)等，從而鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化潛能。
(6)提取培養(yǎng)細(xì)胞RNA采用RT-PCR方法檢測培養(yǎng)細(xì)胞中GATA-1，GATA-2，c-Myb，cKit，PU.1等mRNA的表達(dá)，證明至體內(nèi)注射時均為陰性，培養(yǎng)體系中沒有造血干祖細(xì)胞污染。
二、體內(nèi)重建造血的實驗研究將12周受體BALB/C小鼠Ce137全身照射850rad后輸入6×106/0.3ml/只經(jīng)培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，輸注細(xì)胞后第1天上、下午各一次肌肉注射G-CSF。觀察小鼠的存活情況。
小鼠在輸注前查尾靜脈血，計細(xì)胞總數(shù)、涂片、分類，輸細(xì)胞后每周各取1只小鼠取肝、脾、股骨，固定作病理切片，另外一側(cè)股骨沖出骨髓，計數(shù)有核細(xì)胞、涂片、測定GM-CFU值。PCR方法鑒定重建小鼠的血細(xì)胞來自供體細(xì)胞。輸全骨髓組外周血有核細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞數(shù)及GM-CFU數(shù)在輸后的第1，2周都高于單輸骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組，但單輸骨髓間充質(zhì)細(xì)胞組周血有核細(xì)胞恢復(fù)較快，小鼠存活好，至輸注后第3周，無論周血或骨髓中的有核細(xì)胞都較第2周明顯恢復(fù)，GM-CFU也明顯升高，而單輸造血細(xì)胞和D-hanks液組小鼠存活4-5天死亡。提示，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞群可重建經(jīng)超致死量照射骨髓衰竭動物的造血，并達(dá)到長期存活。間充質(zhì)干細(xì)胞群聯(lián)合G-CSF等細(xì)胞因子分化造血細(xì)胞的方法可應(yīng)用于造血障礙性疾病及多種造血細(xì)胞腫瘤疾病的治療，為臨床骨髓移植提供了新的骨髓移植途徑。
三、具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型的骨髓成體干細(xì)胞重建造血的應(yīng)用例作采用液體培養(yǎng)分離，擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，作為供體細(xì)胞，取BALB/C小鼠四肢去掉肌肉筋膜，沖出骨髓，計數(shù)細(xì)胞，用含DMEM-LG/F12，MCDB-201，2％FCS(GibcoBRL公司)培養(yǎng)液培養(yǎng)，接種濃度為1-2×106/ml。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，一天后換液，棄去非貼壁的細(xì)胞，以后每三天半量換液。至培養(yǎng)后第10天，用0.25％胰酶(Sigma公司)常規(guī)消化。供體細(xì)胞的鑒定細(xì)胞表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣，具有梭形、多角形等細(xì)胞形態(tài)。
電鏡觀察可見以纖維母細(xì)胞為主，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向外分泌微絲。少數(shù)細(xì)胞胞漿中細(xì)胞器少，胞漿少，核仁明顯，可能為干細(xì)胞。
生長曲線測定在細(xì)胞生長的對數(shù)期，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞倍增時間約為25小時。細(xì)胞每傳一代細(xì)胞數(shù)約增長2倍。
細(xì)胞周期檢測超過80％的細(xì)胞都處于G0/G1期。CD34，HLA-DR為陰性，CD44、CD29、CD13則為陽性。SA方法證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞I、III型膠原、vWF因子表達(dá)陽性。測定各代細(xì)胞的端粒酶活性，證明其端粒酶高表達(dá)。
體外及體內(nèi)多系誘導(dǎo)分化，可成功誘導(dǎo)成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。RT-PCR方法檢測培養(yǎng)細(xì)胞中GATA-1，GATA-2，c-Myb，cKit，PU.1mRNA表達(dá)至體內(nèi)注射時均為陰性，證明培養(yǎng)體系中沒有造血干祖細(xì)胞污染。
以上證明培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞為具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞。可作為體內(nèi)重建造血的供體細(xì)胞。
在小鼠體內(nèi)進(jìn)行重建造血的實驗將12周受體BALB/C小鼠分為5組，每組12只Ce137全身照射850rad后①正常小鼠照射后不經(jīng)任何處理②照射后4小時內(nèi)尾靜脈輸注6×106/0.3ml/只新鮮全骨髓③輸入6×106/0.3ml/只去基質(zhì)細(xì)胞的造血細(xì)胞④輸入6×106/0.3ml/只經(jīng)培養(yǎng)后的基質(zhì)細(xì)胞，輸注細(xì)胞后第1天上、下午各一次肌肉注射G-CSF。⑤照射后4小時內(nèi)尾靜脈輸注6×106/0.3ml/只培養(yǎng)第10天的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。輸注細(xì)胞后第1天小鼠注射G-CSF上、下午各一次。細(xì)心喂養(yǎng)，觀察各組小鼠的存活情況。
小鼠在輸注前查尾靜脈血，計細(xì)胞總數(shù)、涂片、分類，輸細(xì)胞后每周各組取1只小鼠取肝、脾、股骨，固定作病理切片，另外一側(cè)股骨沖出骨髓，計數(shù)有核細(xì)胞、涂片、測定GM-CFU值。輸全骨髓組周血有核細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞數(shù)及GM-CFU數(shù)在輸后的第1，2周都高于單輸骨髓成體干細(xì)胞組，但單輸骨髓成體干細(xì)胞組周血有核細(xì)胞恢復(fù)較快，小鼠存活好。至輸注后第3周，無論周血或骨髓中的有核細(xì)胞都較第2周明顯恢復(fù)(圖2，3)，GM-CFU也明顯升高，而單輸造血細(xì)胞和D-hanks液組小鼠存活4-5天死亡。圖4顯示，單輸成體干細(xì)胞組GM-CFU值于第二周開始恢復(fù)并于第三周超過輸全骨髓組。圖5顯示，通過PCR方法特異性地擴(kuò)增Y染色體的sry基因，確定在重建造血的小鼠體內(nèi)，造血細(xì)胞大部分來源于供體。圖6顯示，造血重建過程中脾集落變化情況，輸注后第二周，成體干細(xì)胞輸注組脾集落明顯多于全骨髓輸注組；輸注后第三周，兩者無明顯差別。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、通過對間充質(zhì)干細(xì)胞源成體干細(xì)胞群重建造血的研究，證明了間充質(zhì)干細(xì)胞群的多能性。
2、通過對間充質(zhì)干細(xì)胞源成體干細(xì)胞群重建造血的研究，證明成體干細(xì)胞為存在于人體組織中具有多系分化潛能的亞全能干細(xì)胞群，在特定環(huán)境下可誘導(dǎo)分化成多種組織細(xì)胞。
圖注圖1實驗流程1供者雄性骨髓2具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞3尾靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞4骨髓CFU-GM測定5病理檢測圖21全骨髓輸注2間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞輸注3正常對照圖31全骨髓輸注2間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞輸注3正常對照圖41全骨髓輸注2間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞輸注圖51分子量標(biāo)記2正常雌性鼠3正常雄性鼠4全骨髓輸注5間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞輸注圖61細(xì)胞輸注后第二周2細(xì)胞輸注后第三周。右側(cè)為全骨髓輸注；左側(cè)為間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞輸注
權(quán)利要求
1.利用具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞在細(xì)胞因子的刺激下進(jìn)行骨髓重建實驗，其特征在于體外培養(yǎng)和擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞群，在細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下進(jìn)行超致死量照射后的骨髓造血重建，實現(xiàn)人成體干細(xì)胞造血干細(xì)胞分化，間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞移植作為造血干細(xì)胞移植新途徑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于人成體多種組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞群體外分離，培養(yǎng)和擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于聯(lián)合注射G-CSF等干細(xì)胞誘導(dǎo)因子進(jìn)行造血干細(xì)胞誘導(dǎo)從而實現(xiàn)骨髓造血重建。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植重建造血的方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于成功地應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞骨髓移植應(yīng)用于造血障礙性疾病及多種造血細(xì)胞腫瘤疾病的治療。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型的成體干細(xì)胞重建造血的方法。涉及了具有多系分化潛能的骨髓間充質(zhì)源干細(xì)胞群的分離，聯(lián)合G－CSF等細(xì)胞因子注射重建受超致死劑量Ce
文檔編號A61P35/00GK1434119SQ0114051
公開日2003年8月6日 申請日期2001年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月19日
發(fā)明者趙春華, 姜學(xué)英, 呼瑩 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所