專利名稱：一種用于直接肌肉注射治療糖尿病的質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于直接肌肉注射治療糖尿病的質(zhì)粒。本發(fā)明將含人降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒直接導(dǎo)入骨骼肌組織，使之表達(dá)CGRP蛋白，實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)，以對(duì)1型糖尿病進(jìn)行基因治療。
1型糖尿病的發(fā)生是遺傳易感性和環(huán)境因素共同作用引起自身免疫損傷的結(jié)果。由于糖尿病易感性等位基因的存在或缺乏相應(yīng)的保護(hù)性基因(推測(cè)多數(shù)可能為調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的基因)，使得針對(duì)B細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)易于發(fā)生。免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的失衡，主要是T細(xì)胞免疫平衡穩(wěn)態(tài)的喪失，啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)生進(jìn)行性胰島B細(xì)胞損害和功能喪失，胰島素分泌減少，血糖升高，最終表現(xiàn)為臨床糖尿病。
在糖尿病的自身免疫發(fā)病機(jī)制中，T淋巴細(xì)胞，尤其是CD4+的T輔助淋巴細(xì)胞扮演了重要的角色。CD4+T細(xì)胞按其分泌的細(xì)胞因子不同，在功能上可分為Th1亞群(分泌IL-2、IFN-γ等)和Th2亞群(分泌IL-4、IL-10等)。胸腺中產(chǎn)生的純真T細(xì)胞(naive T lymphocytes)受不同類型的抗原刺激，在復(fù)雜的細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞作用下，分化為Th1、Th2亞群。兩大Th亞群可保持相對(duì)的亞群穩(wěn)定性，在免疫應(yīng)答反應(yīng)中相互拮抗，互相抑制。Th1亞群細(xì)胞分泌的致炎性細(xì)胞因子，可促進(jìn)自身免疫性炎癥損害；Th2亞群細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子一般情況下則具有對(duì)抗自身免疫炎癥的作用。人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的大量證據(jù)表明，Th1/Th2亞群失衡是造成胰島B細(xì)胞損害的重要原因。針對(duì)這種T細(xì)胞功能失衡進(jìn)行免疫干預(yù)的實(shí)驗(yàn)性治療，有可能獲得從病因水平防治該類疾病的有效手段。
CGRP是具有重要免疫調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)肽。主要存在于人和哺乳動(dòng)物的感覺(jué)神經(jīng)中。已有的研究結(jié)果表明，CGRP可在離體情況下，抑制T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和IL-2與IFN-γ的分泌，從而改變了Th1/Th2亞群對(duì)比，進(jìn)而對(duì)自身免疫性病變?nèi)?型糖尿病的發(fā)病和病情產(chǎn)生防治作用。
我們著重研究了CGRP在體情況下對(duì)Th細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。CGRP作為肽類神經(jīng)遞質(zhì)，半衰期僅有數(shù)分鐘，且人工合成的多肽價(jià)昂，用CGRP直接注射進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)干預(yù)，難度很大。我們構(gòu)建了含人CGRP基因的重組質(zhì)粒，創(chuàng)立了CGRP裸質(zhì)粒肌肉注射基因轉(zhuǎn)移方法，很方便地獲得了長(zhǎng)期穩(wěn)定的在體CGRP表達(dá)，觀察到了在體情況下CGRP對(duì)Th細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用。我們?nèi)〉昧薈GRP轉(zhuǎn)基因治療的自身免疫糖尿病小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞，測(cè)定了其增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子分泌，發(fā)現(xiàn)CGRP轉(zhuǎn)基因治療抑制了ConA活化的T細(xì)胞增殖，而且也抑制了Th1細(xì)胞因子IFN-γ的分泌，對(duì)Th2因子IL-4沒(méi)有抑制作用。轉(zhuǎn)基因治療后腹腔液中由巨噬細(xì)胞分泌的IL-12也顯著減少，可能從分化水平抑制了Th1亞群。這種選擇性抑制將改變IFN-γ/IL-4的比率，調(diào)節(jié)了體內(nèi)Th1/Th2亞群的平衡。從自身免疫糖尿病發(fā)病的T細(xì)胞免疫機(jī)制出發(fā)，我們證實(shí)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的CGRP通過(guò)對(duì)致炎性Th1亞群功能的選擇性抑制，減輕了胰島炎和胰島B細(xì)胞損害，并最終降低了自身免疫性糖尿病的發(fā)病率，減輕了糖尿病病情。
本發(fā)明提供了一種用于直接肌肉注射治療1型糖尿病的質(zhì)粒，該質(zhì)粒是含有CGRP基因的載體pcDNA3.1(-)，其中，CGRP基因可在pcDNA3.1(-)中的CMV啟動(dòng)子的引導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明所述的CGRP基因含有人CT/CGRP基因的第2、3、5、6外顯子的核苷酸序列。
CMV-巨細(xì)胞病毒；PolyA-多聚腺苷酸；EcoRI，BamHI，HindIII-限制性內(nèi)切酶；T7-啟動(dòng)子代號(hào)；BGHpA-牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸；Ampicilin-氨芐青霉素基因；ColEl-質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)；SV40 ori-猴腎病毒復(fù)制起始點(diǎn)；SV40pA-猴腎病毒多聚腺苷酸；fl ori-絲狀噬菌體復(fù)制起始點(diǎn)；kb-千堿基對(duì)；Neomycin-新霉素；ori-復(fù)制起始點(diǎn)；pCMV-巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子；內(nèi)切酶NheI PmeI之間的片段為pcDNA(-)的多克隆位點(diǎn)，目的DNA連接在該多克隆片段的內(nèi)切酶EcoRI/HindII之間和EcoRI/BamHI之間。圖2 CGRP重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
CGRP基因被克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)中并受啟動(dòng)子CMV的控制。圖3 多次小劑量STZ注射后小鼠血糖和胰島素的變化。
每天腹腔注射40mg/kg劑量的streptozotocin(STZ)，連續(xù)注射5天，分別于注射后的不同時(shí)間從小鼠的尾靜脈取1滴血，用Glucotrend血糖測(cè)定儀測(cè)定血糖濃度，觀察血糖濃度變化；從小鼠眼球取血約0.5mL，4000g離心10分鐘，用人胰島素多抗抗體和放免方法測(cè)定小鼠血清胰島素濃度，觀察胰島素水平變化(圖3A為血糖，B為胰島素。n＝5；*p＜0.05)圖4 CGRP質(zhì)粒肌肉注射后骨骼肌組織和血漿中CGRP蛋白含量增加。
質(zhì)粒注射后骨骼肌勻漿和血漿中CGRP由放射免疫方法測(cè)定，圖4A為骨骼肌勻漿，B為血漿?？梢?jiàn)轉(zhuǎn)基因治療后，小鼠血漿和骨骼肌中CGRP的含量均較轉(zhuǎn)基因前明顯增高，增高幅度為1-3倍，表達(dá)時(shí)間可持續(xù)4周以上。(n≥6；*p＜0.05)圖5 RT-PCR方法測(cè)定CGRP質(zhì)粒肌肉注射后骨骼肌CGRP mRNA的表達(dá)。
分別于轉(zhuǎn)基因后第3、14、28天提取質(zhì)粒注射區(qū)域的骨骼肌，用RT-PCR方法測(cè)定其CGRP mRNA的水平，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照C57BL小鼠、注射空質(zhì)粒對(duì)照小鼠均無(wú)CGRP mRNA表達(dá)，而CGRP轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌中，在轉(zhuǎn)基因3天時(shí)即有CGRP mRNA的表達(dá)，且可持續(xù)達(dá)4周以上。RT-PCR電泳照片1正常C57BL小鼠，2 pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因，3 CGRP質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因3天，4 CGRP質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因14天，5 CGRP質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因28天，6無(wú)擴(kuò)增模板的陰性對(duì)照，7 CGRP質(zhì)粒的陽(yáng)性對(duì)照，MMarker。圖6CGRP質(zhì)粒注射對(duì)自身免疫糖尿病小鼠T細(xì)胞增殖的影響。
使用3H-TdR摻入方法，比較了空質(zhì)粒對(duì)照組與CGRP轉(zhuǎn)基因組糖尿病小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞在外來(lái)抗原ConA刺激下的增殖效應(yīng)，結(jié)果如圖6。CGRP轉(zhuǎn)基因治療糖尿病小鼠的T淋巴細(xì)胞在ConA(2μg/ml)刺激下，其增殖效應(yīng)顯著低于空質(zhì)粒注射對(duì)照組(n＝5；*p＜0.05)。圖7CGRP轉(zhuǎn)基因?qū)ψ陨砻庖咛悄虿⌒∈笃⑴KT淋巴細(xì)胞因子分泌的影響。
通過(guò)測(cè)定活化T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子分析其功能狀態(tài)，其中IFN-γ反映致炎性Th1亞群的功能，而IL-4則反映Th2亞群功能。圖7A和B顯示在ConA(2μg/ml)或抗小鼠CD3抗體/PMA(0.005μg/ml)刺激下，空質(zhì)粒對(duì)照組和CGRP轉(zhuǎn)基因治療組小鼠T細(xì)胞IFN-γ和IL-4分泌量的差別?？梢?jiàn)CGRP轉(zhuǎn)基因治療顯著降低了致炎性Th1因子IFN-γ的分泌，但對(duì)抑炎性Th2因子IL-4的分泌無(wú)影響。T細(xì)胞取自STZ注射后7天(CGRP轉(zhuǎn)基因后12天)的小鼠。*p＜0.05，n＝4。圖8CGRP轉(zhuǎn)基因?qū)π∈笞陨砻庖咝蕴悄虿“l(fā)病率的影響。
對(duì)比觀察空質(zhì)粒對(duì)照組和CGRP質(zhì)粒注射轉(zhuǎn)基因組小鼠糖尿病的發(fā)病率，以血糖高于12mmol/L為糖尿病發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)?？梢?jiàn)CGRP轉(zhuǎn)基因顯著降低了STZ致自身免疫性糖尿病的發(fā)病率，4周時(shí)由73％降至23％。CGRP轉(zhuǎn)基因治療組和空質(zhì)粒注射對(duì)照組各30只小鼠，以χ2檢驗(yàn)比較兩組發(fā)病率，*p＜0.05。圖9CGRP轉(zhuǎn)基因?qū)μ悄虿⌒∈笱呛脱獫{胰島素水平的影響。
比較CGRP轉(zhuǎn)基因治療組與空質(zhì)粒對(duì)照組的平均血糖水平，CGRP質(zhì)粒注射組顯著降低，持續(xù)4周以上，在4周時(shí)血糖降低幅度達(dá)3mmol/L(圖9A)。CGRP轉(zhuǎn)基因治療組和空質(zhì)粒注射對(duì)照組各30只小鼠，以兩組間t檢驗(yàn)比較血糖均數(shù)。*p＜0.05。
采用放射免疫法測(cè)定血漿胰島素水平，與血糖改善的結(jié)果相一致，CGRP治療組胰島素水平較空質(zhì)粒對(duì)照組顯著增高(圖9B)。兩組各隨機(jī)取7只小鼠取血測(cè)定胰島素，以兩組間t檢驗(yàn)比較胰島素均數(shù)。*p＜0.05。
給糖尿病小鼠注射CGRP質(zhì)粒后第3、14、28天切取小鼠脛前肌注射局部骨骼肌組織約0.5g，提取總RNA，用RT-PCR方法檢測(cè)外源DNA在肌肉組織中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA。以注射pcDNA3.1(-)的小鼠為對(duì)照。以β-action的mRNA為PT-PCR內(nèi)參對(duì)照。結(jié)果表明正常對(duì)照C57BL小鼠、注射空質(zhì)粒對(duì)照小鼠均無(wú)CGRP mRNA表達(dá)，而CGRP轉(zhuǎn)基因小鼠的骨骼肌中，在轉(zhuǎn)基因3天時(shí)即有CGRP mRNA的表達(dá)，且可持續(xù)達(dá)4周以上(圖5)。這證明了本發(fā)明使用的肌肉直接注射的方法，可以使外源人CGRP基因在骨骼肌內(nèi)表達(dá)。5CGRP質(zhì)粒注射對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能及自身免疫反應(yīng)的影響為觀察導(dǎo)入的重組質(zhì)粒表達(dá)的CGRP對(duì)小鼠T細(xì)胞免疫的作用，我們分離培養(yǎng)脾臟T淋巴細(xì)胞，測(cè)定CGRP轉(zhuǎn)基因后T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的改變。轉(zhuǎn)基因組糖尿病小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞在外來(lái)抗原ConA刺激下的增殖效應(yīng)顯著低于空質(zhì)粒對(duì)照(圖6)；而CGRP轉(zhuǎn)基因治療也顯著降低了致炎性Th1因子IFN-γ的分泌，但對(duì)抑炎性Th2因子IL-4的分泌無(wú)影響(圖7A和B)。這種對(duì)Th1細(xì)胞的選擇性抑制可改變IFN-γ/IL-4的比率，調(diào)節(jié)了體內(nèi)Th1/Th2亞群的平衡。從自身免疫疾病發(fā)病的T細(xì)胞免疫機(jī)制出發(fā)，CGRP基因治療將抑制自身免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生。6CGRP質(zhì)粒注射后對(duì)1型糖尿病發(fā)病率的影響我們比較了空質(zhì)粒注射對(duì)照組和CGRP質(zhì)粒注射轉(zhuǎn)基因小鼠糖尿病的發(fā)病率，以血糖高于12mmol/L為糖尿病發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)。由圖8可見(jiàn)CGRP轉(zhuǎn)基因顯著降低了STZ致自身免疫性糖尿病的發(fā)病率，4周時(shí)由73％降至23％。7CGRP注射后對(duì)糖尿病小鼠血漿胰島素水平和血糖水平的影響我們又測(cè)定并比較了對(duì)照組和CGRP轉(zhuǎn)基因治療組小鼠的平均血糖水平，見(jiàn)圖9A。質(zhì)粒注射后CGRP治療組血糖較空質(zhì)粒對(duì)照組降低，持續(xù)4周以上，4周時(shí)降低幅度達(dá)3mmol/L。
采用放射免疫法測(cè)定血漿胰島素水平。圖9B比較了兩組小鼠的血漿胰島素的改變，與血糖改善的結(jié)果相一致，CGRP治療組胰島素水平較空質(zhì)粒對(duì)照組顯著增高。持續(xù)時(shí)間亦達(dá)4周以上。說(shuō)明我們構(gòu)建的重組CGRP質(zhì)粒肌肉注射后能夠顯著降低糖尿病的發(fā)病率并減輕糖尿病的病情。
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100 105 110gac aac ttt gtg ccc acc aat gtg ggc tcc aaa gcc ttt ggc cgg cgc 384Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe Gly Arg Arg115 120 125cgc agg gac ctt cgg gtc tga 405Arg Arg Asp Leu Arg Val130<210> 2<211> 134<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2Met Asp Phe Trp Lys Phe Phe Pro Phe Leu Ala Leu Ser Ser Met Trp1 5 10 15Val Leu Cys Leu Ala Ser Ser Leu Gln Ala Ala Pro Phe Arg Ser Ala20 25 30Leu Glu Ser Ser Leu Asp Leu Gly Thr Leu Ser Asp Gln Glu Lys His35 40 45Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ile Gln Asp Tyr Glu Gln Lys Ala Arg Lys50 55 60Leu Glu Gln Glu Glu Gln Glu Thr Glu Gly Ser Arg Lys Gly Ser Ser65 70 75 80Ser Ser Val Ile Ser Gln Lys Arg Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val85 90 95Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu Arg Arg Ser Gly Gly Val Val Lys100 105 110Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe Gly Arg Arg115 120 125Arg Arg Asp Leu Arg Val130
權(quán)利要求
1.一種用于直接肌肉注射治療糖尿病的質(zhì)粒，該質(zhì)粒是含有CGRP基因的載體pcDNA3.1(-)，其中，CGRP基因可在pcDNA3.1(-)中的啟動(dòng)子的引導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。
2.按照權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其中，所述的CGRP基因具有SEQID NO1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于直接肌肉注射治療糖尿病的質(zhì)粒，該質(zhì)粒是含有CGRP(人降鈣素基因相關(guān)肽)基因的載體pcDNA3.1(－)，其中，CGRP基因可在pcDNA3.1(－)中的CMV啟動(dòng)子的引導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。
文檔編號(hào)A61P3/10GK1410128SQ01141448
公開(kāi)日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2001年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月25日
發(fā)明者王憲, 孫威, 王留義 申請(qǐng)人:北京大學(xué)