專利名稱：抗乙肝病毒表面抗原s的人源化抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗乙肝病毒表面抗原S的人源化抗體及其制備方法。具體地說，它涉及這樣一種人源化抗體，它包括在其可變區(qū)的HCDR1，HCDR2，HCDR3和LCDR1，LCDR2，LCDR3上具有來源于人抗體的氨基酸序列的重鏈和輕鏈，通過從上述人源化抗體的重鏈刪除結(jié)合MHC II類分子的肽序列而使人抗-小鼠抗體(HAMA)的應(yīng)答最小化，它還涉及含有上述人源化抗體的各個重鏈和輕鏈基因的表達(dá)載體，通過用重鏈和輕鏈表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的能夠產(chǎn)生人源化抗體的轉(zhuǎn)化體，以及通過培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體大規(guī)模生產(chǎn)人源化抗體的方法。
背景技術(shù)：
乙肝病毒(HBV)侵入人體，導(dǎo)致慢性和急性肝炎。如果情況更糟的話，它可能是一種導(dǎo)致肝硬化和肝癌的病原。據(jù)估計全世界高達(dá)三億患者感染HBV(Tiollais和Buendia，Sci.Am.，264，48，1991)。HBV的包膜由三種蛋白質(zhì)組成。具體地說，它由包括S抗原的主要蛋白質(zhì)、包括S抗原和前S2抗原的中間蛋白質(zhì)、以及包括S抗原、前S2抗原和前S1抗原的大蛋白質(zhì)組成(Neurath，A.R.和Kent，S.B.H.，Adv.Vir.Res.，3465-142，1988)。上述所有的HBV表面抗原蛋白質(zhì)均能夠誘導(dǎo)中和HBV的抗體。其中，S抗原占總包膜蛋白的約80％，并且具有通常在所有HBV亞型中都存在的稱之為“共有a”的中和表位。
當(dāng)HBV感染時，例如，HBV陽性母親生產(chǎn)的新生兒或接觸HBV的醫(yī)學(xué)研究所的職員或接受HBV相關(guān)肝病患者的肝移植的接受者情況下，已用HB免疫球蛋白(HBIG)預(yù)防HBV感染(Beasley等，Lancet，2，1099，1983；Todo等，Hepatol.，13，619，1991)。然而，目前使用的HBIG由人血漿制備，因此存在抗抗原的特異性低和污染的可能性相對較高的缺點(diǎn)。而且，必須連續(xù)提供人血。
為了克服這些缺點(diǎn)，已經(jīng)研制出應(yīng)用抗HBV表面抗原的小鼠單克隆抗體的方法。通常，小鼠單克隆抗體具有對抗原高度親和和能夠大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，但是，它也具有這樣的缺點(diǎn)，即當(dāng)施用到人體中時會在人體中產(chǎn)生人抗小鼠抗體的應(yīng)答(在下文中，稱之為“HAMA應(yīng)答”)(Shawler等，J.Immunol.，135，1530，1985)。
為了克服這些缺點(diǎn)，已經(jīng)研制出人源化抗體，其中小鼠單克隆抗體的高親和性和特異性被維持，而HAMA應(yīng)答被降至最低。通過基因工程方法將小鼠單克隆抗體的互補(bǔ)決定簇(下文稱之為“CDRs”)移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)構(gòu)建人源化抗體。已經(jīng)報道這種人源化抗體在人體中表現(xiàn)小得多的免疫原性(Riechmann等，Nature，332，323，1988；Nakatani等，Protein Engineering，7，435，1994)。然而，據(jù)報道，這種方法產(chǎn)生的人源化抗體也有缺點(diǎn)，即當(dāng)反復(fù)給人體施用時，則抗體中來源于小鼠的CDRs能夠引起免疫應(yīng)答(Stephens等，Immunology，85，668-674，1995；Sharkey等，CancerResearch，55，5935s-5945s，1995)。因此，期望當(dāng)人源化抗體中來源于小鼠抗體的CDRs的氨基酸殘基被取代為人抗體的殘基時，HAMA應(yīng)答將被降低。
在抗體分子的可變區(qū)中有3個重鏈CDR環(huán)-HCDR1，HCDR2和HCDR3-和3個輕鏈CDR環(huán)-LCDR1，LCDR2和LCDR3。為了用本領(lǐng)域上述方法生產(chǎn)人源化抗體，移植了全部6個CDR環(huán)。然而，因為CDR中并不是所有殘基都直接結(jié)合抗原(Padlan等，F(xiàn)ASEB J.，9，133，1995)，所以通過將直接涉及抗原結(jié)合的小鼠單克隆抗體的特異性決定殘基(下文稱之為“SDRs”)移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)而構(gòu)建的人源化抗體將產(chǎn)生比已知的人源化抗體更低的HAMA應(yīng)答。
另一方面，輔助T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中的早期的活化過程中是必需的，MHC(主要組織相容性復(fù)合物)II類分子在選擇和活化T細(xì)胞中發(fā)揮必要的作用。MHC II類蛋白結(jié)合從蛋白質(zhì)抗原消化得到的具有9個氨基酸殘基的肽，它在抗原呈遞細(xì)胞的表面表達(dá)。當(dāng)通過與識別上述MHC II類分子的T細(xì)胞受體(TCR)的復(fù)合物形成激活T細(xì)胞時，則免疫應(yīng)答起始(Germain，R.N.Cell 76，287-299，1994)。因此，沒有可能結(jié)合MHC分子的肽序列的人源化抗體將不在人體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
以前，本發(fā)明人提供了一種通過應(yīng)用抗HBV表面抗原的小鼠單克隆抗體H67的基因的CDR-移植法構(gòu)建的人源化抗體，韓國專利申請?zhí)?63163(1998年9月3日)，并且在這個抗體基礎(chǔ)上，研究出了與上述人源化抗體相比具有的免疫原性降低的人源化抗體HZII-H67，且也申請韓國專利，申請?zhí)枮?8-32644。
因此，為了通過對上述人源化抗體HZII-H67的進(jìn)一步人源化來使HAMA應(yīng)答最小化，本發(fā)明人研究出這樣的人源化抗體，它們包括在其可變區(qū)的HCDR1，HCDR2，HCDR3和LCDR1，LCDR2，LCDR3上具有來自人抗體的氨基酸序列的重鏈和輕鏈，通過從上述人源化抗體的重鏈刪除了結(jié)合MHC II類分子的肽序列，而使人抗-小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答最小化，并且通過證明它在人體中的最小化了免疫應(yīng)答的可能性并具有良好的抗原結(jié)合能力，使它成為預(yù)防和治療乙肝病毒感染的優(yōu)秀候選物，從而完成本發(fā)明。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于提供抗HBV表面抗原S的人源化抗體，其使人體中的免疫原性降至最低，而同時具有優(yōu)秀的抗原結(jié)合能力，本發(fā)明還提供了其制備方法，以便有效預(yù)防和治療乙肝病毒感染。
附圖簡述

圖1顯示人源化抗體HZII-H67的重鏈可變區(qū)和本發(fā)明的抗HBV表面抗原S的人源化重鏈可變區(qū)突變體之間的核苷酸和氨基酸序列的比較結(jié)果。
圖2提供示意圖說明人源化重鏈突變體I34V(其中纈氨酸取代小鼠HCDR1的第34位的異亮氨酸)的制備方法。
圖3顯示包括由圖2的方法制備的I34V突變體的表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-I34V的限制性酶切圖譜。
圖4顯示說明抗表面抗原S的具有本發(fā)明的人源化重鏈突變體的人源化抗體的抗原結(jié)合能力的ELISA結(jié)果，A；HCDR1突變體，B；HCDR2突變體，C；HCDR3突變體，H/K；由HZII-H67的重鏈和輕鏈組成的人源化抗體HZII-H67。
圖5顯示說明包括本發(fā)明的兩種以上人源化重鏈突變的人源化抗體的抗表面抗原S的抗原結(jié)合能力的ELISA結(jié)果。
圖6顯示人源化抗體HZII-H67的輕鏈可變區(qū)和本發(fā)明的抗HBV表面抗原S的人源化輕鏈可變區(qū)突變體之間的核苷酸和氨基酸序列的比較結(jié)果。
圖7顯示示意圖，說明人源化重鏈突變體Q89L(其中亮氨酸取代小鼠LCDR1的第89位谷氨酰胺)的制備方法。
圖8顯示包括由圖7的方法制備的Q89L突變體的表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-Q89L的限制性酶切圖譜。
圖9顯示ELISA結(jié)果，說明具有本發(fā)明的人源化輕鏈突變體的抗表面抗原S的人源化抗體的抗原結(jié)合能力。
H/K；由HZII-H67的重鏈和輕鏈組成的人源化抗體HZII-H67圖10顯示W(wǎng)estern印跡分析結(jié)果，說明具有本發(fā)明的人源化重組重鏈突變體和輕鏈突變體的人源化抗體HzS-III的存在。
A；HzS-III，B；HZII-H67圖11顯示ELISA結(jié)果，說明具有本發(fā)明的人源化重組重鏈突變體和輕鏈突變體的抗HBV表面抗原S的人源化抗體HzS-III的抗原結(jié)合能力。
圖12顯示競爭性ELISA的結(jié)果，說明具有本發(fā)明的人源化重組重鏈突變體和輕鏈突變體的抗HBV表面抗原S的人源化抗體HzS-III和HzS-IV的抗原結(jié)合親和性。
圖13顯示本發(fā)明的人源化抗體HzS-III和HzS-IV的重鏈可變區(qū)和野生型小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67的重鏈可變區(qū)之間的氨基酸序列比較結(jié)果。
圖14顯示本發(fā)明的人源化抗體HzS-III和野生型小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67的輕鏈可變區(qū)之間的氨基酸序列比較結(jié)果。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供抗HBV表面抗原S的人源化抗體，它包括用人源氨基酸殘基取代鼠源的重鏈和輕鏈可變區(qū)上CDRs的氨基酸殘基的重鏈和輕鏈；包括各個人源化抗體的重鏈和輕鏈基因的表達(dá)載體；以及用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化體。
下面，將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
本發(fā)明提供了人源化重鏈突變體，其中用人源重鏈抗體上的氨基酸殘基取代抗HBV表面抗原S的人源化抗體的相應(yīng)重鏈可變區(qū)的HCDR1，HCDR2，HCDR3區(qū)上的鼠源氨基酸殘基，以及包括上述人源化重鏈突變體的表達(dá)載體。
比較鼠源人源化抗體HZII-H67抗體的重鏈可變區(qū)中HCDR1，HCDR2和HCDR3與人源抗體的相應(yīng)HCDR1，HCDR2和HCDR3區(qū)上的氨基酸序列，篩選最相似的CDR序列。然后，用人抗體源的氨基酸殘基取代不影響抗原結(jié)合活性的鼠源氨基酸殘基，而構(gòu)建本發(fā)明的人源化抗體。
為了用人源氨基酸取代人源化抗體HZII-H67中HCDR1區(qū)的鼠源氨基酸殘基，SEQ.ID.NO1代表的Asp-Tyr-Asn-Ile-Gln，本發(fā)明人將小鼠HCDR1區(qū)的氨基酸序列與人抗體的相比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠HCDR1與來自Kabat數(shù)據(jù)庫ID號35920的SEQ.ID.NO2表示的人HCDR1抗體序列的HCDR1的氨基酸殘基Asp-Tyr-Asn-Val-Asn高度同源。因此，本發(fā)明構(gòu)建了HCDR1突變體，其中顯示不同的第4和第5位氨基酸殘基被取代。
為了這么做，構(gòu)建了突變體I34V或Q35N，其中纈氨酸或天冬酰胺取代第34或第35位氨基酸殘基的異亮氨酸或谷氨酰胺，這兩位氨基酸殘基在小鼠和人抗體HCDR1區(qū)之間是不同的。
通過PCR和重組PCR，應(yīng)用人源化抗體的重鏈表達(dá)載體pRc/CMV-HC-HZIIS(KCTC 0489BP)作為模板構(gòu)建所述突變體(參見圖1和圖2)。
結(jié)果，分別應(yīng)用從SEQ.ID.No3和SEQ.ID.No4代表的HL和P1引物對以及SEQ.ID.No5和SEQ.ID.No6代表的P2和HC引物對得到的DNA片段作為模板，應(yīng)用HL和HC作為引物對，用重組PCR反應(yīng)構(gòu)建了人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體I34V。之后，將上述I34V突變體克隆到已經(jīng)克隆了人源化重鏈抗體的cDNA的表達(dá)載體中，而構(gòu)建重組表達(dá)載體，它被命名為pcDdA-HzSIIIh-I34V(參見圖3)。當(dāng)進(jìn)行了人源化抗體的重鏈可變區(qū)I34V突變體的核苷酸序列分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)I34V突變體已經(jīng)正確插入上述重組表達(dá)載體。
應(yīng)用SEQ.ID.No3，SEQ.ID.No7，SEQ.ID.No8和SEQ.ID.No.6代表的引物對，通過同樣方法用PCR和重組PCR構(gòu)建了Q35N突變體，其中在鼠和人抗體的HCDR1序列上顯示不同的氨基酸殘基中，用來自人重鏈的天冬酰胺取代第5位氨基酸殘基上的谷氨酰胺。之后，將Q35N克隆到表達(dá)載體中產(chǎn)生重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-Q35N。
另外，在本發(fā)明的人源化抗體中，其中來自人抗體的氨基酸殘基取代人源化抗體HZII-H67的鼠HCDR2區(qū)上的氨基酸殘基，優(yōu)選人源HCDR2氨基酸序列取代所有鼠源HCDR2氨基酸序列，除了直接涉及抗原結(jié)合的氨基酸殘基。為了將人源化抗體HZII-H67中的來源于小鼠HCDR2的氨基酸殘基改變?yōu)槿嗽窗被釟埢?，將小鼠和人源HCDR2區(qū)上的氨基酸序列作比較。找到小鼠HCDR2和人抗體DP-15重鏈上的HCDR2區(qū)之間的同源性后，用上述相同方法，通過取代不直接涉及與抗原結(jié)合的氨基酸殘基，而構(gòu)建HCDR2突變體。
結(jié)果，構(gòu)建了在HCDR2的第51位氨基酸殘基上用甲硫氨酸取代異亮氨酸的I51M突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No9和SEQ.ID.No10代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-I51M，以及在第54位氨基酸殘基上用絲氨酸取代蘇氨酸的T54S突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No11和SEQ.ID.No12代表的引物對)和包括該突變體重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-T54S，以及在第65位氨基酸殘基上用甘氨酸取代絲氨酸的S65G突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No13和SEQ.ID.No14代表的引物對)和包括該突變體的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-S65G。
另外，在本發(fā)明的人源化抗體中，其中來自人抗體的氨基酸殘基取代了人源化抗體HZII-H67的鼠HCDR3區(qū)上的氨基酸殘基，優(yōu)選人源HCDR3氨基酸序列取代所有鼠源HCDR3氨基酸序列，除非氨基酸殘基直接涉及抗原結(jié)合。為了將人源化抗體HZII-H67中的來源于小鼠HCDR3的氨基酸殘基改變?yōu)槿嗽窗被釟埢紫冗M(jìn)行小鼠HCDR3的丙氨酸掃描誘變，以便驗證那些氨基酸殘基直接涉及抗原結(jié)合。
結(jié)果，構(gòu)建了在HCDR3的第95位氨基酸殘基上用丙氨酸取代天冬氨酸的N95A突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No15和ISEQ.ID.No16代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-N95A，在第96位氨基酸殘基上用丙氨酸取代酪氨酸的Y96A突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No17和SEQ.ID.No18代表的引物對)和包括該突變體重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-Y96A，在第97位氨基酸殘基上用丙氨酸取代甘氨酸的G97A突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No19和SEQ.ID.No20代表的引物對)和包括該突變體的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-G97A，在第98位氨基酸殘基上用丙氨酸取代酪氨酸的Y98A突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No21和SEQ.ID.No22代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-Y98A，在第99位氨基酸殘基上用丙氨酸取代天冬酰胺的D99A突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No23和SEQ.ID.No24代表的引物對)和包括該突變體重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-D99A，在第100位氨基酸殘基上用丙氨酸取代谷氨酸的E100A突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No25和SEQ.ID.No26代表的引物對)和包括該突變體的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-E100A，以及在第100位氨基酸殘基上用丙氨酸取代絲氨酸的S100aA突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No27和SEQ.ID.No28代表的引物對)和包括該突變體的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-S100aA。
如上所述，通過用人源化抗體CDR區(qū)上的人源氨基酸取代不直接涉及抗原結(jié)合的鼠源氨基酸，而使本發(fā)明的人源化抗體比現(xiàn)有技術(shù)的更加人源化，并因此期望不影響抗原結(jié)合親和力。具體地說，在本發(fā)明中使用SDR-移植法，以使人源化抗體具有較少的HAMA應(yīng)答，并改善治療作用，其中直接涉及結(jié)合HBV表面抗原S的SDR區(qū)被取代為人抗體。這與小鼠抗體的CDR區(qū)中表現(xiàn)同源性的所有氨基酸均被取代為人抗體的現(xiàn)有技術(shù)的方法不同。
為了證明本發(fā)明的人源化抗體的重鏈上存在突變的人源化抗體可表達(dá)，本發(fā)明人用包含重鏈上各種突變基因的每種重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞。通過夾層ELISA測定從上述轉(zhuǎn)染體表達(dá)的抗體濃度后，再用間接ELISA測定包括抗表面抗原S的人源化重鏈突變體的人源化抗體的抗原結(jié)合能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有HCDR1突變體中，抗HBV表面抗原S的I34V的結(jié)合能力幾乎與野生型人源化抗體HZS-H67的重鏈的結(jié)合能力相同。對于HCDR2突變體，T54S和S65G表現(xiàn)幾乎與野生型抗體相同的抗原結(jié)合能力(參見圖4)。對于HCDR3突變體，E100A表現(xiàn)比野生型抗體略微較低的抗原結(jié)合能力，說明HCDR3突變體的谷氨酸殘基(E100)在與HBV表面抗原S結(jié)合中不重要。
因此，將數(shù)據(jù)庫中的人抗體HCDR3的氨基酸序列與人源化抗體HZII-H67中的鼠HCDR3的氨基酸序列相比較，以便將鼠HCDR3的氨基酸序列中的谷氨酸殘基取代為人抗體的氨基酸殘基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在與鼠HCDR3序列表現(xiàn)高度同源性的人抗體序列中(Kabat數(shù)據(jù)庫ID No 24562，39669，44760)，HCDR3的第100和101位氨基酸殘基上的絲氨酸和甘氨酸是共有氨基酸殘基。因此，本發(fā)明人構(gòu)建了這樣的突變體，其中分別用絲氨酸或甘氨酸取代第100和101氨基酸位置上的谷氨酸或丙氨酸，然后測定它們的抗原結(jié)合能力。
用上述同樣方法，構(gòu)建了E100S突變體，其中絲氨酸取代了第100位氨基酸殘基上的谷氨酸(應(yīng)用SEQ.ID.No29和SEQ.ID.No30代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-E100S，A101G突變體，其中甘氨酸取代了第101位氨基酸殘基上的丙氨酸(應(yīng)用SEQ.ID.No31和SEQ.ID.No32代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-A101G。測定了抗表面抗原S的具有人源化重鏈突變體的人源化抗體的抗原結(jié)合能力后，發(fā)現(xiàn)E100S的抗原結(jié)合能力類似于野生型的抗原結(jié)合能力，而A101G表現(xiàn)略微較低的抗原結(jié)合能力。
從上述結(jié)果，本發(fā)明人確定在所有人源化重鏈突變體中，I34V，T54S，S65G和E100S的抗原結(jié)合能力類似于野生型的抗原結(jié)合能力。因此，我們同時構(gòu)建了包括上述全部4種突變的重組突變體。
首先，為了構(gòu)件包括T54S和I34V突變的重組突變體，用pcDdA-HzSIIIh-T54S作為模板通過前面描述的同樣方法，進(jìn)行PCR和亞克隆，這樣構(gòu)建的表達(dá)載體被命名為pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V。
同時，為了構(gòu)建包括T54S，I34V和E100S突變的重組突變體，用pcDdA-HzSIIIh-I34V作為模板，通過前面描述的同樣方法，進(jìn)行PCR和亞克隆，這樣構(gòu)建的表達(dá)載體被命名為pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S。
另外，為了構(gòu)建包括T54S，I34V，E100S和S65G突變的重組突變體，用pcDdA-HzSIIIh-E100s作為模板，通過前面描述的同樣方法，進(jìn)行PCR和亞克隆。從中構(gòu)建了包括T54S，I34V，E100S和S65G所有突變的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S+S65G，它被命名為pcDdA-HzSIIIh。
為了考察本發(fā)明的在人源化抗體的重鏈上具有突變的人源化抗體的抗原結(jié)合能力，本發(fā)明人用包括上述突變的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞，并用間接ELISA測定抗表面抗原S的人源化抗體的抗原結(jié)合能力。
結(jié)果，分別含有I34V+T54S，I34V+T54S+E100S和I34V+T54S+E100S+S65G突變的每種人源化重鏈與野生型人源化抗體HZS-H67幾乎表現(xiàn)相同的抗表面抗原S的結(jié)合能力(參見圖5)。表達(dá)顯示抗HBV表面抗原S的抗原結(jié)合能力的重鏈重組突變體的表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh已經(jīng)于2000年9月22日保藏于韓國生命科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物收藏中心，保藏號為KCTC 10083BP。分析了從表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh表達(dá)出的人源化抗體HzS-III的氨基酸序列后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)它由包括SEQ.ID.No43代表的可變區(qū)氨基酸序列的人源化重鏈HzS-III-VH組成。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供了通過SDR-移植法生產(chǎn)的人源化輕鏈突變體，其中用來自人的輕鏈抗體上的氨基酸殘基取代抗HBV表面抗原S的人源化抗體的相應(yīng)輕鏈可變區(qū)的LCDR1，LCDR2，LCDR3區(qū)上的氨基酸殘基，以及包括突變體的表達(dá)載體。
本發(fā)明的人源化抗體是這樣構(gòu)建的，即用人源輕鏈氨基酸殘基取代人源化抗體HZII-H67的輕鏈可變區(qū)的LCDR1，LCDR2和LCDR3上的氨基酸殘基。對于人源化輕鏈，人源化抗體HZII-H67的LCDR1和LCDR2已經(jīng)具有來自人抗體的氨基酸殘基(對于LCDR1是D27cS，S31N，M33I；對于LCDR2是Q54K，S56T)。因此，本發(fā)明人試圖改變LCDR3上的氨基酸殘基。具體地說，為了將人源化抗體HZII-H67的LCDR3區(qū)上的鼠源氨基酸殘基改變?yōu)槿丝贵w的氨基酸殘基，本發(fā)明人比較了人源化輕鏈的氨基酸序列和與它表現(xiàn)高度同源性的人源化B1抗體輕鏈的LCDR3氨基酸序列(參見圖6)。從這本發(fā)明人推測鼠源LCDR3的第89和91位氨基酸殘基上的谷氨酰胺和蘇氨酸不直接涉及抗原結(jié)合。因此，我們將它們?nèi)〈鸀槿丝贵w中的氨基酸殘基亮氨酸和絲氨酸。
結(jié)果構(gòu)建了Q89L突變體，其中亮氨酸取代了第89位氨基酸殘基上的谷氨酸酰(應(yīng)用SEQ.ID.No33到SEQ.ID.No36代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIk-Q89L(參見圖7和圖8)，以及T91S突變體，其中絲氨酸取代了第91位氨基酸殘基上的蘇氨酸(應(yīng)用SEQ.ID.No33，SEQ.ID.No36，SEQ.ID.No37和SEQ.ID.No38代表的引物對)和包括上述突變體的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIk-T91S。
為了考察本發(fā)明的人源化抗體輕鏈上具有突變的抗HBV表面抗原S的人源化抗體的抗原結(jié)合能力，本發(fā)明人用包括各突變體的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞，用間接ELISA測定人源化抗體的抗原結(jié)合能力。
結(jié)果，含有T91S突變體(其中絲氨酸取代了第91位氨基酸殘基上的蘇氨酸)的人源化輕鏈表現(xiàn)與野生型人源化抗體HZS-H67的重鏈相同程度的抗表面抗原S的結(jié)合能力，本發(fā)明的表達(dá)T91S突變體的表達(dá)載體pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S被命名為pCMV-dhfr-HzSIIIk。表達(dá)具有抗HBV表面抗原S的抗原結(jié)合能力的突變體T91S的表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIk已經(jīng)于2000年9月22日保藏于韓國生命科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物收藏中心，保藏號為KCTC 10084BP。分析了從表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIk表達(dá)出的人源化抗體HzS-III的氨基酸序列后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)它由包括SEQ.ID.No42代表的可變區(qū)氨基酸序列的人源化重鏈HzS-III-VL組成。
本發(fā)明還提供了這樣的人源化抗體，它包括用來自人的氨基酸殘基取代抗HBV表面抗原S的小鼠單克隆抗體H67的重鏈和輕鏈可變區(qū)上的鼠源氨基酸殘基的重鏈和輕鏈。
為了構(gòu)建包括重組重鏈和輕鏈突變體的人源化抗體，本發(fā)明人用人源化重鏈表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh和人源化輕鏈表達(dá)載體pCMV-dhfr-HzSIIIk轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞。之后，溫育選擇出來的轉(zhuǎn)化體48小時，來表達(dá)同時具有人源化重鏈和輕鏈重組突變的人源化抗體HzS-III。通過夾層ELISA法測定培養(yǎng)基上清液中存在的人源化抗體HzS-III的濃度后，在應(yīng)用間接ELISA測定抗原結(jié)合能力。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人源化抗體HzS-III表現(xiàn)與野生型人源化抗體HZS-H67(H/K)幾乎相同程度的抗表面抗原S的結(jié)合能力(參見圖11)。
另外，本發(fā)明人用競爭性ELISA(競爭性ELISA，Ryu等，J.Med.Virol.，52，226，1997)測定了人源化抗體HzS-III的抗原結(jié)合親和性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管用人源氨基酸殘基取代了鼠源氨酸酸殘基，但本發(fā)明的人源化抗體HzS-III的抗原結(jié)合親和性與野生型人源化抗體HZII-H67的幾乎相同(參見圖12)。
篩選了人源化抗體HzS-III重鏈中結(jié)合MHC II類分子的肽序列后，本發(fā)明人構(gòu)建了不期望結(jié)合MHC II類分子的有氨基酸殘基取代的人源化重鏈，并測定了它們的抗原結(jié)合能力。為了生產(chǎn)所述人源化重鏈，構(gòu)建了用蘇氨酸取代第44位上的絲氨酸的S44T突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No46和47代表的引物對)和用天冬氨酸取代第68位上的蘇氨酸的T68D突變體(應(yīng)用SEQ.ID.No48和49代表的引物對)以及包括它們的重組表達(dá)載體。該表達(dá)載體已經(jīng)于2001年9月26日保藏于韓國生命科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物收藏中心，保藏號為KCTC 10080BP。將人源化重鏈表達(dá)載體pcDdA-HzSIVh和人源化輕鏈表達(dá)載體pCMV-dhfr-HzSIIIk轉(zhuǎn)染到動物細(xì)胞系中后，將上述轉(zhuǎn)化體保溫48小時，使它表達(dá)人源化抗體HzS-IV。測定得到的上清液中存在的人源化抗體HzS-IV的抗原結(jié)合親和性，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的人源化抗體HzS-IV表現(xiàn)與人源化抗體HzS-III幾乎相同的親和性(參見圖12)。
將表現(xiàn)優(yōu)秀的針對HBV表面抗原S的結(jié)合能力和抗原結(jié)合親和性的人源化抗體HzS-III和HzS-IV的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與野生型小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67的氨基酸序列相比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的人源化抗體HzS-III和HzS-IV比小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67含有較少的鼠源氨基酸，因為重鏈HCDR1，HCDR2，HCDR3或輕鏈LCDR1，LCDR2，LCDR3上的某些鼠源氨基酸殘基已經(jīng)改變?yōu)槿嗽窗被釟埢?。而且，在本發(fā)明的人源化抗體HzS-IV重鏈可變區(qū)上的氨基酸序列中，在構(gòu)架區(qū)有兩個可能通過結(jié)合人MHC II類分子而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的氨基酸殘基被改變，從而使免疫應(yīng)答最小化(參見圖13和圖14)。
因此，本發(fā)明的人源化抗體HzS-III和HzS-IV能夠成為預(yù)防乙肝病毒感染的優(yōu)秀候選，因為它們表現(xiàn)比現(xiàn)有技術(shù)的人源化抗體更優(yōu)秀的HBV結(jié)合活性和誘導(dǎo)更低的HAMA應(yīng)答。
下面，我們將通過實(shí)施例更詳細(xì)描述本發(fā)明。
然而，下面的實(shí)施例目的在于說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1編碼人源化重鏈抗體的基因的突變1-1HCDR1突變體的構(gòu)建為了用人源氨基酸取代人源化抗體HZII-H67的HCDR1區(qū)的鼠源氨基酸殘基，SEQ.ID.NO1代表的Asp-Tyr-Asn-Ile-Gln(Korea韓國專利申請?zhí)?8-32644)，本發(fā)明人比較了鼠HCDR1區(qū)與人抗體HCDR1區(qū)的氨基酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼠CDR1與來自Kabat數(shù)據(jù)庫ID編號為35920的SEQ.ID.NO2代表的人HCDR1抗體序列的HCDR1氨基酸殘基Asp-Tyr-Asn-Val-Asn高度同源。因此，本發(fā)明人構(gòu)建了顯示不同的第4和5位氨基酸殘基被取代的HCDR1突變體。1-1-1在第34位氨基酸殘基上纈氨酸取代異亮氨酸的突變體的構(gòu)建為了構(gòu)建第34位氨基酸殘基上纈氨酸取代異亮氨酸的突變體，在該位置上小鼠和人抗體的HCDR1區(qū)顯示不同而且該位置認(rèn)為不是抗原的直接結(jié)合表位，用SEQ.ID.No3到SEQ.ID.No6代表的序列作為引物、人源化抗體HZII-H67pRc/CMV-HC-HZIIS(KCTC 0489BP)的重鏈表達(dá)載體作為模板進(jìn)行PCR和重組PCR(圖1和圖2)。具體地說，用Taq DNA聚合酶(Takara Co.)進(jìn)行30次PCR循環(huán)反應(yīng)，94℃30秒，55℃30秒和72℃1分鐘。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用SEQ.ID.No3和SEQ.ID.No4代表的HL和P1引物從PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到長度為181bp的DNA片段，用SEQ.ID.No5和SEQ.ID.No6代表的P2和HC引物從PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到長度為284bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板和HL及HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)后，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體I34V。用限制性酶EcoRI和ApaI消化I34V突變體可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體(它是將抗HBV前S1抗原的人源化抗體(Korea韓國專利申請?zhí)?998-49663)的重鏈基因克隆到Invitrogen公司的pcDNA2的EcoRI-NotI位點(diǎn)上而得到的表達(dá)載體)的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-I34V(圖3)。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)I34V突變體的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)I34V突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。1-1-2天冬酰胺取代第35位氨基酸殘基上的谷氨酰胺的突變體的構(gòu)建為了構(gòu)建天冬酰胺取代第35位氨基酸殘基上的谷氨酰胺的突變體Q35N，在該位置上小鼠和人HCDR1抗體之間的氨基酸殘基不同并且該位置不認(rèn)為是抗原的直接結(jié)合表位，在如實(shí)施例<1-1-1>的相同條件下進(jìn)行PCR。
具體地說，用SEQ.ID.No3和SEQ.ID.No7代表的HL和P3引物擴(kuò)增得到大小為187bp的DNA片段，用SEQ.ID.No6和SEQ.ID.No8代表的HC和P4引物擴(kuò)增得到大小為278bp的DNA片段。通過將這兩個片段連接起來而得到大小為448bp的人源化抗體重鏈可變區(qū)突變體Q35N。用限制性酶EcoRI和ApaI消化Q35N突變體可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-Q35N。對人源化抗體重鏈可變區(qū)Q35N突變體的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體重鏈可變區(qū)Q35N突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。1-2HCDR2突變體的構(gòu)建為了將SEQ.ID.NO39代表的人源化抗體HZII-H67的HCDR2區(qū)上的鼠源氨基酸殘基取代為人源化氨基酸，本發(fā)明人將小鼠HCDR1抗體的氨基酸序列與人抗體HCDR1區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼠CDR2與SEQ.ID.NO40代表的種系人抗體的重鏈DP-15片段上的HCDR2區(qū)的氨基酸序列高度同源。因此，本發(fā)明人通過取代看起來不直接涉及抗原結(jié)合的氨基酸殘基而構(gòu)建了HCDR2突變體。1-2-1蛋氨酸取代第51位氨基酸殘基上的異亮氨酸的突變體的構(gòu)建為了構(gòu)建HCDR2突變體，用SEQ.ID.No9和SEQ.ID.No10代表的P5和P6引物而不是實(shí)施例<1-1-1>相同方法中的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P5引物擴(kuò)增得到大小為236bp的DNA片段，用HC和P4引物得到大小為230bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體重鏈可變區(qū)突變體I51M。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體I51M可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-I51M。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的I51M突變體的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)I51M突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。1-2-2絲氨酸取代第54位氨基酸殘基上的蘇氨酸的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No11和SEQ.ID.No12代表的P7和P8引物而不是實(shí)施<1-1-1>相同方法中使用的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P7引物擴(kuò)增得到大小為249bp的DNA片段，用HC和P8引物擴(kuò)增得到大小為218bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體重鏈可變區(qū)突變體T54S。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體T54S可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-T54S。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的突變體T54S的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)T54S突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。1-2-絲氨酸取代第65位氨基酸殘基上的甘氨酸的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No13和SEQ.ID.No14代表的P9和P10引物而不是實(shí)施<1-1-1>相同方法中使用的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P9引物擴(kuò)增得到大小為278bp的DNA片段，用HC和P10引物擴(kuò)增得到大小為185bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體S65G。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體S65G可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-S65G。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的突變體S65G的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)S65G突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。1-3HCDR3突變體的構(gòu)建為了將SEQ.ID.NO41代表的人源化抗體HZII-H67的HCDR3上的鼠源氨基酸殘基取代為人源化氨基酸，本發(fā)明人將小鼠HCDR3抗體的氨基酸序列與人抗體HCDR3區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行了比較。之后，本發(fā)明人通過取代小鼠HCDR3序列中看起來不直接涉及抗原結(jié)合的氨基酸殘基而構(gòu)建了HCDR3突變體。1-3-1丙氨酸取代第95位氨基酸殘基上的天冬酰胺的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No15和SEQ.ID.No16代表的P11和P12引物而不是實(shí)施<1-1-1>相同方法中使用的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P11引物擴(kuò)增得到大小為381bp的DNA片段，用HC和P12引物擴(kuò)增得到大小為88bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體N95A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體N95A可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-N95A。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的突變體N95A的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)N95A突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。1-3-2丙氨酸取代第96位氨基酸殘基上的酪氨酸的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No17和SEQ.ID.No18代表的P13和P14引物而不是實(shí)施<1-1-1>相同方法中使用的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P13引物擴(kuò)增得到大小為380bp的DNA片段，用HC和P14引物擴(kuò)增得到大小為85bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體Y96A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體Y96A可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-Y96A。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的突變體Y96A的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)Y96A突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。1-3-3丙氨酸取代第97位氨基酸殘基上的甘氨酸的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No19和SEQ.ID.No20代表的P15和P16引物而不是實(shí)施<1-1-1>相同方法中使用的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P15引物擴(kuò)增得到大小為383bp的DNA片段，用HC和P14引物擴(kuò)增得到大小為82bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體G97A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體G97A可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-G97A。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的突變體G97A的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)G97A突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。1-3-4丙氨酸取代第98位氨基酸殘基上的酪氨酸的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No21和SEQ.ID.No22代表的P17和P18引物而不是實(shí)施<1-1-1>相同方法中使用的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P17引物擴(kuò)增得到大小為386bp的DNA片段，用HC和P18引物擴(kuò)增得到大小為78bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體Y98A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體Y98A可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-Y98A。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的突變體Y98A的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)Y98A突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。1-3-5丙氨酸取代第99位氨基酸殘基上的天冬氨酸的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No23和SEQ.ID.No24代表的P19和P20引物而不是實(shí)施<1-1-1>相同方法中使用的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P19引物擴(kuò)增得到大小為390bp的DNA片段，用HC和P20引物擴(kuò)增得到大小為73bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體D99A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體D99A可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-D99A。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的突變體D99A的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)D99A突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。1-3-6丙氨酸取代第100位氨基酸殘基上的谷氨酸的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No25和SEQ.ID.No26代表的P21和P22引物而不是實(shí)施<1-1-1>相同方法中使用的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P21引物擴(kuò)增得到大小為390bp的DNA片段，用HC和P22引物擴(kuò)增得到大小為73bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體E100A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體E100A可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-E100A。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的突變體E100A的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)E100A突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。1-3-7丙氨酸取代第100a位氨基酸殘基上的絲氨酸的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No27和SEQ.ID.No28代表的P23和P24引物而不是實(shí)施<1-1-1>相同方法中使用的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P23引物擴(kuò)增得到大小為395bp的DNA片段，用HC和P24引物擴(kuò)增得到大小為67bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體S100aA。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體S100aA可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-S100aA。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的突變體S100aA的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)S100aA突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。實(shí)施例2具有人源化重鏈突變體的人源化抗體的表達(dá)為了在細(xì)胞中直接表達(dá)具有人源化重鏈突變體的人源化抗體，將本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到動物細(xì)胞系中。
具體地說，將COS7細(xì)胞在附加10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)中在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞以1×106個細(xì)胞/m的濃度接種到100mm培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)過夜。之后，用OPTI-MEMI(GIBCO)清洗3次。同時，將實(shí)施例1構(gòu)建的包括人源化重鏈突變體I34V，Q35N，I51M，T54S，S65G，N95A，Y96A，G97A，Y98A，D99A，E100A或S100aA的重組表達(dá)載體和人源化抗體HZII的輕鏈表達(dá)載體pKC-dhfr-HZIIS(KCTC 0490BP)各5μg用800μl OPTI-MEM I稀釋，將50μlLipofectamine(GIBCO)也用800μl OPTI-MEM I稀釋。將上述稀釋液在15ml試管中混合得到DNA-lipofectamine復(fù)合物，然后在室溫下保溫至少15分鐘。將6.4ml OPTI-MEM I加入各DNA-Lipofectamine復(fù)合物，然后將它們與清洗后的COS7細(xì)胞均勻混合而轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中溫育DNA-Lipofectamine復(fù)合物處理的細(xì)胞48小時而進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然后，收集上清液，用夾層ELISA法測定抗體濃度。為了進(jìn)行夾層ELISA，用抗-人IgG(Sigma Co.)作為捕獲抗體，用與辣根過氧化物酶(Sigma Co.)混合的抗-人抗體(Fc特異性)作為第二抗體。實(shí)施例3具有人源化重鏈突變體的人源化抗體的抗表面抗原S的抗原結(jié)合能力的測定將250ng HBV的表面抗原S(Greencross Co.)加到微平板的各個孔中，涂覆孔。將用上述實(shí)施例2得到的DNA-lipofectamine復(fù)合物轉(zhuǎn)染的各培養(yǎng)基加入平板，使基于實(shí)施例2測定的抗體濃度的各抗體濃度為分別為0，0.2，0.4，0.8，1.8，3.5和7ng。通過向上述平板的孔中加入與辣根過氧化物酶組合的抗-人抗體作為第二抗體進(jìn)行間接ELISA之后，在492nm測定光密度。作為對照，用HZII-H67 pRc/CMV-HC-HZIIS(KCTC 0489BP)和pKC-dhfr-HZIIS分別作為重鏈和輕鏈表達(dá)載體進(jìn)行同樣試驗。結(jié)果在圖4中顯示。
如圖4所示，在HCDR1突變體中，I34V的抗HBV表面抗原S的結(jié)合能力幾乎與野生型人源化抗體HZS-H67的重鏈的相同。對于HCDR2突變體，T54S和S65G表現(xiàn)幾乎與野生型抗體相同程度的抗原結(jié)合能力。另一方面，對于HCDR3突變體，E100A表現(xiàn)比野生型抗體略微較低的抗原結(jié)合能力，說明HCDR3突變體的谷氨酸殘基(E100)在與HBV表面抗原S結(jié)合中不重要。實(shí)施例4HCDR2突變體的構(gòu)建本發(fā)明人在上述實(shí)施例3中證實(shí)小鼠HCDR3序列的第100位氨基酸谷氨酸在與HBV表面抗原S結(jié)合中不重要。因此，我們將它與數(shù)據(jù)庫中的人抗體CDR3的氨基酸序列相比較，以便取代將上述氨基酸殘基取代為人抗體的氨基酸殘基。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在與小鼠HCDR3序列顯示高度同源性的人抗體序列中，HCDR3的第100和101位氨基酸殘基上的絲氨酸和甘氨酸是共有氨基酸殘基。因此本發(fā)明人構(gòu)建了分別用絲氨酸或甘氨酸取代第100和101位氨基酸殘基上的谷氨酸或丙氨酸的突變體，并測定了它們的抗原結(jié)合能力。4-1絲氨酸取代第100位氨基酸殘基上的谷氨酸的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No29和SEQ.ID.No30代表的P25和P26引物而不是實(shí)施<1-1-1>相同方法中使用的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P25引物擴(kuò)增得到大小為390bp的DNA片段，用HC和P26引物擴(kuò)增得到大小為73bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體E100A。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體E100A可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-E100A。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的突變體E100A的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)E100A突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。4-2甘氨酸取代第101位氨基酸殘基上的丙氨酸的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No31和SEQ.ID.No32代表的P27和P28引物而不是實(shí)施<1-1-1>相同方法中使用的P1和P2引物進(jìn)行PCR。用HL和P27引物擴(kuò)增得到大小為396bp的DNA片段，用HC和P28引物擴(kuò)增得到大小為68bp的DNA片段。用上述兩種DNA片段作為模板及HL和HC引物對進(jìn)行連接這兩個片段的重組PCR反應(yīng)，得到大小為448bp的人源化抗體的重鏈可變區(qū)突變體A101G S100aA。用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體A101G可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)而構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并將它命名為pcDdA-HzSIIIh-A101G。對人源化抗體的重鏈可變區(qū)的突變體A101G的核苷酸序列進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人源化抗體的重鏈可變區(qū)A101G突變體正確插入上述重組表達(dá)載體。4-3抗表面抗原S的抗原結(jié)合能力的測定將上述實(shí)施例<4-1>和<4-2>構(gòu)建的2個重組表達(dá)載體用實(shí)施例2和3的相同方法轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中后，本發(fā)明人用間接ELISA法測定了選擇轉(zhuǎn)化體的抗原結(jié)合能力。結(jié)果，E100S的抗原結(jié)合能力類似于野生型的抗原結(jié)合能力，而A101G表現(xiàn)略微降低的抗原結(jié)合能力。
從實(shí)施例3和<4-3>的結(jié)果，本發(fā)明確信在人源化重鏈突變體中，I34V，T54S，S65G和E100S的抗原結(jié)合能力類似于野生型的。因此，我們構(gòu)建了同時含有所有這四種突變的重組突變體。實(shí)施例5人源化重鏈基因的重組突變體5-1重組突變體T54S+I34V的構(gòu)建為了構(gòu)建含有T54S和I34V突變的重組突變體，用前面實(shí)施例<1-2-1>的重鏈基因表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-T54S作為模板，用實(shí)施例<1-1-1>的相同方法進(jìn)行PCR和亞克隆。從中構(gòu)建的表達(dá)載體被命名為pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V。5-2重組突變體T54S+I34V+E100S的構(gòu)建為了構(gòu)建含有T54S，I34V和E100S突變的重組突變體，用前面實(shí)施例<5-1>的重鏈基因表達(dá)載體p pcDdA-HzSIIIh-I34V作為模板，用實(shí)施例<1-1-1>的相同方法進(jìn)行PCR和亞克隆。從中構(gòu)建的表達(dá)載體被命名為pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S。5-3重組突變體T54S+I34V+E100S+S65G的構(gòu)建為了構(gòu)建含有T54S，I34V，E100S和S65G突變的重組突變體，用前面實(shí)施例<5-2>的重鏈基因表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-E100s作為模板，用實(shí)施例<1-1-1>的相同方法進(jìn)行PCR和亞克隆。結(jié)果構(gòu)建了包含T54S，I34V，E100S和S65G所有突變的重組表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh-T54S+I34V+E100S+S65G，將它命名為pcDdA-HzSIIIh。實(shí)施例6具有人源化重鏈重組突變體的人源化抗體的抗原結(jié)合能力的測定將250ng HBV的表面抗原S(Greencross Co.)加入到微平板的各孔中，進(jìn)行涂覆后，用各重組表達(dá)載體或上述實(shí)施例<4-1>到<4-3>構(gòu)建的pKC-dhfr-HZIIS載體用實(shí)施例2中的相同方法轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。將含有上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的各培養(yǎng)基加入平板，使各抗體的濃度分別為0.625，1.25，2.5，5，10和20ng。然后，用實(shí)施例2的相同方法測定光密度。作為對照，用pRc/CMV-HC-HZIIS和pKC-dhfr-HZIIS分別作為HZII-H67的重鏈和輕鏈表達(dá)載體進(jìn)行同樣的試驗。結(jié)果如圖5所示。
如圖5所示，分別含有I34V+T54S，I34V+T54S+E100S和I34V+T54S+E100S+S65G的重組突變體的各人源化重鏈，其中同時存在幾種突變，顯示與野生型人源化抗體HZS-H67的重鏈幾乎相同的針對表面抗原S的結(jié)合能力。針對HBV表面抗原S表現(xiàn)抗原結(jié)合能力的表達(dá)重鏈重組突變體的表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh已經(jīng)于2000年9月22日保藏于韓國生命科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物收藏中心，保藏號為KCTC 10083BP。對從表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh表達(dá)出的人源化抗體HzS-III的氨基酸進(jìn)行分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)它由包括SEQ.ID.No43代表的可變區(qū)氨基酸序列的人源化重鏈HzS-III-VH組成。實(shí)施例7人源化輕鏈基因的突變對于人源化輕鏈，人源化抗體HZII-H67的LCDR1和LCDR2已經(jīng)具有來自人抗體的氨基酸殘基。因此，本發(fā)明人試圖改變LCDR3中的氨基酸殘基。具體地說，為了將人源化抗體HZII-H67的LCDR3區(qū)中的鼠源氨基酸殘基改變?yōu)槿丝贵w的氨基酸殘基，本發(fā)明人將人源化輕鏈的氨基酸序列和與其具有高度同源性的人源化B1抗體的輕鏈的LCDR3氨基酸序列進(jìn)行比較。從中，本發(fā)明人推測鼠源LCDR3的第89和91位氨基酸殘基上的谷氨酰胺和蘇氨酸不直接涉及抗原結(jié)合。因此，我們用人B1抗體上的相應(yīng)輕鏈殘基的亮氨酸和絲氨酸取代它們。7-1亮氨酸取代第89位氨基酸殘基上的谷氨酰胺的突變體的構(gòu)建為了構(gòu)建人抗體的亮氨酸殘基取代鼠源LCDR3的第89位氨基酸殘基上的谷氨酰胺的突變體，用SEQ.ID.No33和SEQ.ID.No36代表的引物、用人源化抗體HZII-H67的輕鏈表達(dá)載體pKC-dhkr-HzIIS作為模板進(jìn)行PCR和重組PCR(圖6和圖7)。
具體地說，用Taq DNA聚合酶進(jìn)行25次PCR循環(huán)，94℃30秒，55℃30秒和72℃1分鐘。用SEQ.ID.No33和SEQ.ID.No36代表的LL和P29引物通過PCR擴(kuò)增大小為336bp的DNA片段，用SEQ.ID.No35和SEQ.ID.No36代表的P30和LC引物通過PCR擴(kuò)增大小為273bp的DNA片段。用上述兩個DNA片段作為模板、LL和P29作為引物對，連接這兩個片段而進(jìn)行重組PCR反應(yīng)，得到大小為743bp的人源化抗體的輕鏈可變區(qū)突變體Q89L。用限制性酶HindIII和SalI消化上述突變體Q89L可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將它們克隆到pBluescript KS+(StrataGen)而構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBlue-HzSIIIk-Q89L。對人源化抗體輕鏈可變區(qū)G89L突變體的核苷酸序列分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Q89L正確插入上述表達(dá)載體。在用限制性酶HindIII和ApaI消化上述pBlue-HzSIIIk-Q89L DNA后得到人源化輕鏈突變體片段，本發(fā)明人通過將上述片段重新克隆到pCMV-dhfr表達(dá)載體的HindIII-ApaI位點(diǎn)，而構(gòu)建了重組表達(dá)載體(圖7)，并將它命名為pCMV-dhfr-HzSIIIk-Q89L(圖8)。7-2絲氨酸取代第91位氨基酸殘基上的蘇氨酸的突變體的構(gòu)建用SEQ.ID.No33，SEQ.ID.No36，SEQ.ID.No37和SEQ.ID.No38代表的引物，在實(shí)施例<7-1>相同的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR。用LL和P31引物通過pCR擴(kuò)增大小為369bp的DNA片段，用P32和LC引物通過PCR擴(kuò)增大小為391bp的DNA片段。用上述兩個DNA片段作為模板、LL和LC作為引物對，連接這兩個片段而進(jìn)行重組PCR反應(yīng)，得到大小為743bp的人源化抗體的輕鏈可變區(qū)突變體T91S。用限制性酶HindIII和SalI消化上述突變體T91S可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人通過將它們克隆到pBluescriptKS+而構(gòu)建了重組質(zhì)粒。對人源化抗體輕鏈可變區(qū)T91S突變體的核苷酸序列分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)T91S正確插入上述重組表達(dá)載體。
在用限制性酶HindIII和ApaI消化上述pBlue-HzSIIIk-T89S DNA后得到人源化輕鏈突變體片段，本發(fā)明人通過將上述片段重新克隆到pCMV-dhfr表達(dá)載體的HindIII-ApaI位點(diǎn)，而構(gòu)建了重組表達(dá)載體pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S，并將它命名為pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S。實(shí)施例8具有人源化輕鏈突變體的人源化抗體的抗HBV表面抗原S的結(jié)合能力的測定用實(shí)施例<7-1>和<7-2>得到的表達(dá)載體pCMV-dhfr-HzSIIIk-Q89L或pCMV-dhfr-HzSIIIk-T91S，和pRc/CMV-HC-HZIIS載體作為人源化抗體HZII-H67的重鏈表達(dá)載體，按照實(shí)施例2的相同方法轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后，對選擇的轉(zhuǎn)化體溫育48小時。然后，通過夾層ELISA法測定上清液中的抗體濃度。按照實(shí)施例3的相同方法將抗體加到平板中，使各抗體的濃度分別為0，0.2，0.4，0.8，1.8，3.5和7ng。作為對照，用pRc/CMV-HC-HZIIS和pKC-dhfr-HZIIS分別作為HZII-H67的重鏈和輕鏈表達(dá)載體，進(jìn)行相同試驗。結(jié)果如圖9所示。
如圖9所示，含有絲氨酸取代第91位氨基酸殘基上的蘇氨酸的T91S突變體的人源化輕鏈表現(xiàn)與野生型人源化抗體HZS-H67的重鏈相同程度的抗表面抗原S的結(jié)合能力。表達(dá)表現(xiàn)抗HBV表面抗原S的抗原結(jié)合能力的突變體T91S的表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIk已經(jīng)于2000年9月22日保藏于韓國生命科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物收藏中心，保藏號為KCTC 10084BP。對從表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIk表達(dá)出來的人源化抗體HzS-IIId的氨基酸序列分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)它由包括SEQ.ID.No42代表的可變區(qū)氨基酸序列的人源化重鏈HzS-III-VL組成。實(shí)施例9具有人源化重鏈和輕鏈重組突變體的人源化抗體(HzS-III)的抗原結(jié)合能力的測定用實(shí)施例<5-2>得到的人源化重鏈表達(dá)載體pCDdA-HzSIIIh和實(shí)施例<7-2>得到的人源化輕鏈表達(dá)載體pCMV-dhfr-HzSIIIk，按照實(shí)施例2的同樣方法轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞后，通過保溫選擇得到的轉(zhuǎn)化體48小時而表達(dá)出同時具有人源化重鏈和輕鏈重組突變的人源化抗體HzS-III。為了確定從培養(yǎng)基得到的上清液中存在人源化抗體HzS-III，用辣根過氧化物酶(Sigma Co.)與抗-人抗體(Fc特異性)結(jié)合而得到的第二抗體進(jìn)行Western印跡分析。結(jié)果如圖10所示，檢測到大小約55kDa的人源化重鏈和大小約27kDa的人源化氫鏈。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的人源化抗體被正確表達(dá)并從轉(zhuǎn)化體中分泌出來。
通過夾層ELISA法測定了上清液中的分泌抗體的濃度后，用實(shí)施例3的同樣方法將抗體加入涂覆有HBV表面抗原S的平板中，使各抗體的濃度分別為0.625，1.25，2.5，5，10和20ng。作為對照，分別用pRc/CMV-HC-HZIIS和pKC-dhfr-HZIIS作為HZII-H67的重鏈和輕鏈表達(dá)載體進(jìn)行相同試驗。結(jié)果如圖11所示。
如圖11所示，同時具有人源化重鏈和輕鏈重組突變的人源化抗體HzS-III表現(xiàn)幾乎與野生型人源化抗體HZS-H67(H/K)相同程度的抗表面抗原S的結(jié)合能力。實(shí)施例10人源化抗體HzS-III的抗原結(jié)合親和性的測定用比較ELISA法測定人源化抗體HzS-III的抗原結(jié)合親和性(競爭性ELISA，Ryu等，J.Med.Virol.，52，226，1997)。將5ng從實(shí)施例8的COS7細(xì)胞產(chǎn)生的人源化抗體HzS-III和表面抗原S(from 1×10-7M到1×10-12M)在37℃預(yù)先保溫3小時后，將混合物加入預(yù)先涂覆有表面抗原S的96孔平板中。使孔平板在37℃反應(yīng)3小時后，用實(shí)施例3的相同方法通過ELISA測定光密度(圖12)。作為的對照，使用人源化抗體HZII-H67。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的人源化抗體HzS-III的抗原結(jié)合親和性約為4×109M-1，它與對照HZII-H67(3.2×109M-1)并沒有很大差異。實(shí)施例11結(jié)合MHCII類分子的肽序列從人源化抗體HzS-III中去除的人源化抗體HzS-IV的構(gòu)建本發(fā)明人用Stumiolo’s法(TEPITOPE)(Sturniolo等，NatureBiotechnology，17，555-561，1999)考察上述人源化抗體HzS-III中是否存在結(jié)合MHC II類分子的肽序列。另外，本發(fā)明人從與上述人源化抗體表現(xiàn)高度同源性的人種系DP-25蛋白中檢索序列，然后將它排除考慮。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)人源化重鏈上有2段肽序列結(jié)合MHC II類分子。第一段肽具有SEQ.ID.No44代表的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它結(jié)合51個MHC II類分子中的22個。第二個肽具有SEQ.ID.No45代表的氨基酸序列，并發(fā)現(xiàn)它結(jié)合14個MHC II類分子(表1)。
<表1>人源化重鏈HzSIIIh的TEPITOPE分析結(jié)果
為了減弱肽與MHC II分子的結(jié)合親和性，本發(fā)明人用蘇氨酸取代SEQ.ID.No44代表的氨基酸序列P9位上的絲氨酸，用天冬氨酸取代SEQ.ID.No45代表的氨基酸序列P6位上的蘇氨酸。結(jié)果，對于SEQ.ID.No44，可以結(jié)合肽的MHC II類分子的數(shù)目降低到11個(55％)。對于SEQ.ID.No45，在51個MHC II類分子中僅有1個分子可以結(jié)合肽。
因此，為了生產(chǎn)針對MHC II類分子結(jié)合親和性減弱的人源化重鏈，構(gòu)建了具有S44T和T68D突變的S44T/T68D突變體，其中蘇氨酸取代第44位上的絲氨酸(用SEQ.ID.No46和47代表的引物對)以及天冬氨酸取代第68位上的蘇氨酸(用SEQ.ID.No48和49代表的引物對)。
用限制性酶EcoRI和ApaI消化上述突變體S44T/T68D的可變區(qū)的兩個末端后，本發(fā)明人將上述片段克隆到pcDdA-HC表達(dá)載體的EcoRI-ApaI限制性酶切位點(diǎn)，而構(gòu)建了重組表達(dá)載體。該表達(dá)載體已經(jīng)于200年9月26日保藏于韓國生命科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物收藏中心，保藏號為KCTC 10080BP。
將人源化重鏈表達(dá)載體pcDdA-HzSIVh和人源化輕鏈表達(dá)載體pCMV-dhfr-HzSIIIk轉(zhuǎn)染到動物細(xì)胞系后，將上述轉(zhuǎn)化體溫育48小時而從中表達(dá)人源化抗體HzS-IV。測定得到的上清液中存在的人源化抗體HzS-IV的抗原結(jié)合親和性，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的人源化抗體HzS-IV顯示與人源化抗體HzS-III幾乎相同程度的結(jié)合親和性(參見圖12)。實(shí)施例12人源化抗體HzS-III和HzS-IV的氨基酸序列比較將人源化抗體HzS-III和HzS-IV的重鏈/輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與野生型小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67的氨基酸序列作比較。
結(jié)果如圖13和圖14所示，本發(fā)明的人源化抗體HzS-III和HzS-IV預(yù)期可能產(chǎn)生較低的HAMA應(yīng)答，因為人源化抗體HzS-III和HzS-IV的重鏈/輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列在重鏈的HCDR1，HCDR2，HCDR3或輕鏈的LCDR1，LCDR2，LCDR3上比小鼠單克隆抗體H67和人源化抗體HZII-H67的相應(yīng)部位含有較少的鼠源氨基酸殘基，并且HzS-IV比HzS-IH含有較少的能夠結(jié)合MHC II類分子的氨基酸序列。因此，本發(fā)明的人源化抗體HzS-III和HzS-IV能夠成為預(yù)防乙肝病毒的優(yōu)秀候選，因為它們比現(xiàn)有技術(shù)的人源化抗體誘導(dǎo)較低的HAMA應(yīng)答。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，通過用重鏈HCDR1，HCDR2，HCDR3和輕鏈LCDR1，LCDR2，LCDR3上的人源化氨基酸殘基取代鼠源氨基酸殘基而使本發(fā)明的抗HBV表面抗原S的人源化抗體比現(xiàn)有技術(shù)的人源化抗體更加人源化。而且，通過減少FR區(qū)中可能結(jié)合MHC II類分子的氨基酸序列而顯著降低在人體中的免疫原性可能性，并表現(xiàn)優(yōu)秀的抗原結(jié)合親和性。因此，本發(fā)明的人源化抗體能夠用于預(yù)防乙肝病毒感染。
序列表序列表<110>韓國生命工學(xué)研究院所<120>抗乙肝病毒表面抗原S的人源化抗體及其制備方法<130>lfpo-09-05<150>KR10-2000-0057891<151>2000-10-02<150>KR10-2001-0060966<151>2001-09-29<160>49<170>KopatentIn 1.55<210>1<211>5<212>PRT<213>小鼠<400>1Asp Tyr Asn Ile Gln1 5<210>2<211>5<212>PRT<213>人<400>2Asp Tyr Asn Val Asp1 5<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>HL<400>3gagaattcac attcacgatg tacttg<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>P1<400>4cccactgaac gttgtagtca gtg23<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>P2<400>5ctacaacgtt cagtgggtgc gcaag 25<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>HC<400>6gatgggccct tggtggaggc20<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>P3<400>7cgcacccagt taatgttgta gtcagtg27<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>P4<400>8caacattaac tgggtgcgcc aggcccc 27<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>P5<400>9gtaaggatac atatatccca tccactcaag 30<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>P6<400>10gggatatatg tatccttaca ctggtgg 27<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>P7<400>11cagtaccacc actgtaagga taaatatatc 30<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>P8<400>12ccttacagtg gtggtactgg ctacag 26<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>P9<400>13gtgactctgc cctggaactt ctgg24<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>P10<400>14ccagggcaga gtcacattga ctg 23<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>P11<400>15gtaaccatag gctcttgcac agtaatagac 30<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>P12<400>16gtgcaagagc ctatggttac gacgagtc28<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>P13<400>17gtaaccggcg tttcttgcac agtaatag28<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>P14<400>18caagaaacgc cggttacgac gagtctg 27<210>19<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>P15<400>19gtcgtaggca tagtttcttg cacag 25<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>P16<400>20gaaactatgc ctacgacgag tctgcctac 29<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>P17<400>21ctcgtcggca ccatagtttc ttgcac 26<210>22<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>P18<400>22ctatggtgcc gagtctgctt actg24<210>23<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>P19<400>23cagactcggc gtaaccatag tttcttg 27<210>24<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>P20<400>24ggttacggcg agtctgctta ctgggg 26<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>P21<400>25cagaggcgtc gtaaccatag tttc 24<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>P22<400>26ggttacgacg cctctgctta ctggggc27<210>27<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>P23<400>27gtaagcggcc tcgtcgtaac catgg 25<210>28<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>P24<400>28gacgaggccg cttactgggg ccaagg 26<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>P25<400>29gtaagcagac gagtcgtaac catag 25<210>30<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>P26<400>30cgactcgtct gcttactggg gccaag 26<210>31<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>P27<400>31ccagtaacca gactcgtcgt aacc 24<210>32<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>P28<400>32cgagtctggt tactggggcc aaggg 25<210>33<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>LL<400>33caaagcttgg aagcaagatg gaatca 26<210>34<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>P29<400>34ccttagtttg cagacagaaa taatttgcag 30<210>35<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>P30<400>35ctgtctgcaa actaaggcgg ttccg 25<210>36<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>LC<400>36gaagtcgacc taacactctc ccctgtt27<210>37<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>P31<400>37cctccttact ttgctgacag aaataatttg 30<210>38<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>P32<400>38gtcagcaaag taaggaggtt ccgtacac 28<210>39<211>17<212>PRT<213>小鼠<400>39Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Ser Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Ser<210>40<211>17<212>PRT<213>人<400>40Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln1 5 10 15Gly<210>41<211>8<212>PRT<213>小鼠<400>41Asn Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala1 5<210>42<211>112<212>PRT<213>人HzS-III-VL<400>42Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Asn Tyr20 25 30Gly Ile Asn Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Lys Gly Thr Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn65 70 75 80Pro Val Glu Ala Glu Asp Thr Ala Asn Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys85 90 95Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105110<210>43<211>118<212>PRT<213>人HzS-III-VH<400>43Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Asn Val Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Ser Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Asn Tyr Gly Tyr Asp Ser Ser Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>44<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>結(jié)合到MHCII類分子的肽序列<400>44Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser1 5<210>45<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>結(jié)合到MHCII類分子的肽序列<400>45Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val
1 5<210>46<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>P33<400>46ggaaagaccc ttgagtggat ggg23<210>47<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>P34<400>47ctcaagggtc tttccggggg cc 22<210>48<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>P35<400>48gcagagtcga tttgactgta gacaattc 28<210>49<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>P36<400>49cagtcaaatc gactctgccc tggaac 2權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合乙肝病毒表面抗原S的人源化重鏈突變體，其中人源重鏈HCDRs中的所有或部分氨基酸殘基取代了選自鼠源重鏈HCDR1，HCDR2和HCDR3的所有或部分氨基酸殘基。
2.按照權(quán)利要求1的人源化重鏈突變體，其中纈氨酸取代了HCDR1第34位氨基酸殘基上的異亮氨酸。
3.按照權(quán)利要求1的人源化重鏈突變體，其中絲氨酸取代了HCDR2第54位氨基酸上的蘇氨酸。
4.按照權(quán)利要求1的人源化重鏈突變體，其中甘氨酸取代了HCDR2第65位氨基酸上的絲氨酸。
5.按照權(quán)利要求1的人源化重鏈突變體，其中絲氨酸取代了HCDR3第100位氨基酸上的谷氨酸。
6.按照權(quán)利要求1的人源化重鏈突變體，其中它含有權(quán)利要求2到5的所有突變。
7.包含權(quán)利要求6的人源化重鏈突變體的表達(dá)載體pcDdA-HzSIIIh(保藏號KCTC 10083BP)。
8.特異性結(jié)合乙肝病毒表面抗原S的人源化重鏈突變體，其中人源重鏈HCDRs中的所有或部分氨基酸殘基取代了選自鼠源重鏈HCDR1，HCDR2和HCDR3的所有或部分氨基酸殘基，并且去除了結(jié)合MHC II類分子的肽序列。
9.按照權(quán)利要求8的人源化重鏈突變體，其中結(jié)合MHC II類分子的肽序列由SEQ.ID.No44或SEQ.ID.No45代表。
10.按照權(quán)利要求8的人源化重鏈突變體，其中蘇氨酸取代了SEQ.ID.No44代表的序列P9位上的絲氨酸。
11.按照權(quán)利要求8的人源化重鏈突變體，其中天冬氨酸取代了SEQ.ID.No45代表的序列P6位上的蘇氨酸。
12.按照權(quán)利要求8的人源化重鏈突變體，其中它含有權(quán)利要求10到11的所有突變。
13.含有權(quán)利要求12的人源化重鏈突變體的表達(dá)載體pcDdA-HzSIVh(保藏號KCTC 10080BP)。
14.特異性結(jié)合乙肝病毒表面抗原S的人源化輕鏈突變體，其中人源輕鏈LCDRs中的全部或部分氨基酸殘基取代了選自鼠源輕鏈LCDR1，LCDR2和LCDR3的全部或部分氨基酸殘基。
15.按照權(quán)利要求14的人源化輕鏈突變體，其中絲氨酸取代了LCDR1的第27位氨基酸上的天冬氨酸。
16.按照權(quán)利要求14的人源化輕鏈突變體，其中精氨酸取代了LCDR1的第31位氨基酸上的絲氨酸。
17.按照權(quán)利要求14的人源化輕鏈突變體，其中異亮氨酸取代了LCDR1的第33位氨基酸上的蛋氨酸。
18.按照權(quán)利要求14的人源化輕鏈突變體，其中賴氨酸取代了LCDR2的第54位氨基酸上的谷氨酰胺。
19.按照權(quán)利要求14的人源化輕鏈突變體，其中蘇氨酸取代了LCDR2的第56位氨基酸上的絲氨酸。
20.按照權(quán)利要求14的人源化輕鏈突變體，其中絲氨酸取代了LCDR3的第91位氨基酸上的蘇氨酸。
21.按照權(quán)利要求14的人源化輕鏈突變體，其中它含有權(quán)利要求15到20的所有突變。
22.含有權(quán)利要求21的人源化輕鏈突變體的表達(dá)載體pCMV-dhfr-HzSIIIk(保藏號KCTC 10084BP)。
23.同時用權(quán)利要求7或權(quán)利要求13的人源化重鏈表達(dá)載體和權(quán)利要求22的人源化輕鏈表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化體。
24.從權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)化體表達(dá)得到的抗乙肝病毒表面抗原S的人源化抗體。
25.制備人源化抗體的方法，它是比較小鼠和人抗體之間的CDR序列，選擇同源性最高的人CDR序列，和用人抗體CDR中的氨基酸殘基取代小鼠抗體CDR中的氨基酸殘基，其中小鼠CDR中的氨基酸殘基不影響抗原結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗乙肝病毒表面抗原S的人源化抗體及其制備方法。具體地說，它涉及這樣的人源化抗體，即包含在它們可變區(qū)的HCDR1，HCDR2，HCDR3和LCDR1，LCDR2，LCDR3上具有來源于人抗體的氨基酸序列的重鏈和輕鏈，還涉及含有上述人源化抗體的各重鏈和輕鏈基因的表達(dá)載體，以及通過用重鏈和輕鏈表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的能夠生產(chǎn)人源化抗體的轉(zhuǎn)化體，及其制備方法。本發(fā)明的一種人源化抗體比現(xiàn)有技術(shù)的人源化抗體更加人源化。因此，它最小化了在人體中的免疫應(yīng)答可能性并且具有良好的抗原結(jié)合能力，使它成為預(yù)防和治療乙肝病毒感染的優(yōu)秀候選物。
文檔編號A61P31/20GK1395617SQ01802990
公開日2003年2月5日 申請日期2001年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月2日
發(fā)明者洪孝貞, 金根洙 申請人:韓國生命工學(xué)研究院