專利名稱：G－csf偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能顯示粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)活性的新的多肽，顯示G-CSF活性的多肽與非多肽組分的偶聯(lián)物，制備這種多肽或偶聯(lián)物的方法以及所述多肽或偶聯(lián)物在治療，尤其對(duì)白細(xì)胞減少癥的治療方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞在骨髓中的生長(zhǎng)，分裂和分化的過(guò)程稱為造血(Dexter andSpooncer，Ann.Rev.Cell.Biol.，3423，1987)。每種類型的血細(xì)胞都來(lái)自多能干細(xì)胞。體內(nèi)通常能產(chǎn)生三種類型的血細(xì)胞紅血細(xì)胞(紅細(xì)胞)，血小板和白血細(xì)胞(白細(xì)胞)，后者的大多數(shù)參與宿主的免疫防御。造血前體細(xì)胞的增殖和分化由一個(gè)細(xì)胞因子家族調(diào)節(jié)，這一家族的細(xì)胞因子包括集落刺激因子(CSF′s)例如G-CSF和白細(xì)胞介素(Arai et al.，Ann.Rev.Biochem.，59783-836，1990)。G-CSF在體內(nèi)的主要生物學(xué)作用是刺激某些稱為嗜中性粒細(xì)胞的白細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育(Welte et al.，PNAS-USA 821526-1530，1985，Souza et al.，science，23261-65，1986)。當(dāng)嗜中性粒細(xì)胞被釋放到血流時(shí)，這些細(xì)胞便行使抗御細(xì)菌感染的功能。
Nagataet al.，nature 319415-418，1986曾報(bào)道過(guò)人G-CSF(hG-CSF)的氨基酸序列。hG-CSF是一種單體蛋白，它通過(guò)形成2個(gè)G-CSF分子和2個(gè)受體的2∶2復(fù)合物與G-CSF受體二聚化(Horanet al.，(1996)，Biochemistry 35(15)4886-96)。Aritomi et al.，nature 401713-717，1999描述了hG-CSF和G-CSF受體的BN-BC功能域之間形成的復(fù)合物的X線結(jié)構(gòu)。它們確定以下hG-CSF的殘基為受體結(jié)合界面的一部分G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，L15，K16，E19，Q20，L108，D109，D112，T115，T116，Q119，E122，E123，和L124。rhG-CSF在大腸桿菌，釀酒酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)已有報(bào)道(Souza etal.，Science 23261-65，1986，Nagata et al.，Nature 319415-418，1986，Robinsonand Wittrup，Biotechnol.Prog.11171-177，1985)。
重組人G-CSF(rhG-CSF)通常用于治療各種形式的白細(xì)胞減少癥。因此，可得到冠以filgrastim(Gran和Neupogen)，lenograstim(Neutrogin和Granocyte)和nartograstim(Neu-up)名稱的rhG-CSF商業(yè)制品。Gran和Neupogen是非糖基化的且可以在重組大腸桿菌細(xì)胞中制備。Neutrogin和Granocyte是糖基化的且可在重組CHO細(xì)胞中制備，Neu-up是非糖基化的，其在重組大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的完整rhG-CSF的N末端區(qū)域有5個(gè)氨基酸被取代。
已報(bào)道了hG-CSF的多個(gè)蛋白工程變體(US5,581,476，US5,214,132，US5,362,853，US4,904,584和Riedhaar-Olson et al.，Biochemistry 359034-9041，1996)。為引入比天然多肽至少多一個(gè)的糖鏈，已有人建議對(duì)hG-CSF和其它多肽進(jìn)行修飾(US5,218,092)。所述多肽的氨基酸序列可以通過(guò)氨基酸取代，氨基酸缺失或氨基酸插入進(jìn)行修飾以添加另外的糖鏈。除此之外，對(duì)天然hG-CSF的聚合物修飾，包括附著PEG基團(tuán)，已有報(bào)道(Satake-Ishikawa Cell Structure and Function 17157-160，1992，US5,824,778，US5,824,784，WO96/11953，WO95/21629，WO94/20069)。
Bowen et al.，Experimental Hematology 27(1999)，425-432公開了PEG偶聯(lián)的G-CSF突變蛋白的分子質(zhì)量及其活性維持時(shí)間之間的關(guān)系。提示所述蛋白上PEG偶聯(lián)部分的分子量與體外活性之間有明顯反比關(guān)系，然而體內(nèi)活性隨分子量的增加而增加。推測(cè)偶聯(lián)物的較低親和力有增加半壽期的作用，因?yàn)槭荏w介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是一種調(diào)節(jié)造血生長(zhǎng)因子水平的重要機(jī)制。
市售rhG-CSF有短期的藥理學(xué)作用，且在白細(xì)胞減少狀態(tài)的持續(xù)期間通常必須一天給藥一次以上。具有較長(zhǎng)循環(huán)半壽期的分子會(huì)減少緩解白細(xì)胞減少癥和預(yù)防隨后的感染所必需的給藥次數(shù)?，F(xiàn)有rG-CSF產(chǎn)品的另一問(wèn)題是劑量依賴性骨痛的出現(xiàn)。因?yàn)楣峭词腔颊呓邮躵G-CSF治療時(shí)體會(huì)到的明顯副作用，所以能提供一種不引起骨痛的rG-CSF產(chǎn)品是人們所期望的，這種產(chǎn)品可以本身沒(méi)有這種作用，或者是這種產(chǎn)品在足夠小的劑量下有效但該劑量不引起骨痛。因此，很明顯有必要改進(jìn)重組G-CSF樣分子。
關(guān)于半壽期，增加蛋白的循環(huán)半壽期的一個(gè)途徑是保證蛋白的清除，尤其是通過(guò)腎臟的清除和受體介導(dǎo)的清除的下降。這可以通過(guò)將蛋白與能增加表觀分子量的化學(xué)組分偶聯(lián)，從而降低腎臟的清除作用，增加上述分子的體內(nèi)半壽期來(lái)實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步地，蛋白附著一個(gè)化學(xué)組分可以有效地阻斷蛋白裂解性酶與蛋白的物理接觸，由此可以使蛋白免遭非特異性蛋白水解作用的降解。聚乙二醇(Polyethylene glycol)(PEG)便是這樣一種化學(xué)組分，它已在治療性蛋白制品的制備中應(yīng)用。一種被稱為SD/01的N末端連接了單個(gè)PEG基團(tuán)的G-CSP分子目前正進(jìn)行臨床試驗(yàn)。盡管這種PEG化G-CSF分子比非PEG化G-CSF半壽期增加，但它活性低，所以必須以相當(dāng)高的劑量給藥。由此，上面討論的骨痛問(wèn)題并沒(méi)有通過(guò)這個(gè)分子解決。此外，已知G-CSF分子的半壽期的改進(jìn)仍有相當(dāng)大的空間。
所以，仍然有必要提供一種既能顯示在白細(xì)胞減少癥的治療中有用的活性，同時(shí)半壽期增加但副作用降低的新型分子。本發(fā)明涉及這樣的分子。
發(fā)明簡(jiǎn)述更具體地，本發(fā)明涉及特異性偶聯(lián)物，其包含一種顯示G-CSP活性的多肽和一種非多肽組分，本發(fā)明還涉及上述偶聯(lián)物的制備方法和它們?cè)卺t(yī)學(xué)治療和藥物制備方面的應(yīng)用。由此，本發(fā)明第一個(gè)方面涉及各種特異性偶聯(lián)物，這些偶聯(lián)物包含顯示G-CSF活性的多肽，該多肽具有與SEQ ID NO1所示人G-CSF的氨基酸序列不同在于至少一個(gè)特定的包含非多肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基的氨基酸序列，且至少有一個(gè)非多肽組分附著到該多肽的附著基團(tuán)上。本發(fā)明的偶聯(lián)物與商業(yè)提供的rhG-CSF相比有一個(gè)或多個(gè)改進(jìn)的特性，包括增加了體內(nèi)的功能半壽期，增加了血清半壽期，降低了副作用，降低了免疫原性和/或增加了生物利用度。所以，應(yīng)用本發(fā)明的偶聯(lián)物進(jìn)行醫(yī)學(xué)治療可以表現(xiàn)出優(yōu)于現(xiàn)有G-CSF化合物的許多優(yōu)點(diǎn)。
另一方面，本發(fā)明涉及顯示G-CSF活性且形成本發(fā)明的偶聯(lián)物的一部分的多肽。預(yù)計(jì)本發(fā)明的多肽可以用于治療，診斷或其它的目的，但也可具體作為制備本發(fā)明偶聯(lián)物的中間產(chǎn)物。
本發(fā)明另一方面涉及一種多肽偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含顯示G-CSF活性的多肽，該多肽的氨基酸序列與rhG-CSF的氨基酸序列(其氨基酸序列在SEQ ID NO1中列出)不同在于至少一個(gè)氨基酸殘基是引入或除去的包含非多肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基，并且足夠數(shù)量或類型的非多肽組分提供了與已知重組G-CSF產(chǎn)品相比半壽期增加的偶聯(lián)物。
本發(fā)明的另一方面還涉及制備本發(fā)明偶聯(lián)物的方法，包括編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，包含此核苷酸序列的表達(dá)載體，和包含上述核苷酸序列或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的最后一方面涉及包含本發(fā)明偶聯(lián)物或多肽的組合物，制備藥物組合物的方法，本發(fā)明的偶聯(lián)物或組合物作為藥物的應(yīng)用，和用上述組合物治療哺乳動(dòng)物的方法。尤其，本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或組合物可以用于使正在進(jìn)行某些類型的放射治療，化療，和骨髓移植的癌癥患者預(yù)防感染，用于動(dòng)員祖細(xì)胞在外周血祖細(xì)胞移植中聚集，用于治療無(wú)論什么原因所致的嚴(yán)重慢性或相對(duì)的白細(xì)胞減少癥，和用于支持對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病(acutemyeloid leukaemia)患者的治療。另外，本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或組合物可以用于AIDS或其它免疫缺陷病以及細(xì)菌感染的治療。
發(fā)明詳述定義在本申請(qǐng)和發(fā)明的上下文中應(yīng)用了以下定義術(shù)語(yǔ)“偶聯(lián)物”是指由一個(gè)或多個(gè)多肽，通常為單獨(dú)一個(gè)多肽與一個(gè)或多個(gè)非多肽組分例如聚合物分子，親脂性化合物，糖(carbohydrate)組分或有機(jī)衍生制劑共價(jià)連接形成的異源分子。術(shù)語(yǔ)共價(jià)連接是指多肽和非多肽組分直接彼此共價(jià)連接，或者是通過(guò)一個(gè)或多個(gè)間插組分，例如橋，間隔臂，或連接組分彼此間接共價(jià)連接。優(yōu)選，偶聯(lián)物在相應(yīng)的濃度和條件下是可溶性的，即在生理性的體液中例如血液是可溶性的。術(shù)語(yǔ)“非偶聯(lián)的多肽”可用于指偶聯(lián)物的多肽部分。
本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“多肽”可以和術(shù)語(yǔ)“蛋白”交換使用。
術(shù)語(yǔ)“聚合物分子”是由二個(gè)或多個(gè)單體共價(jià)連接形成的分子，其中，除聚合物是人白蛋白或另一種高豐度血漿蛋白外，所有單體都不是僅含有一種氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)“聚合物”可以和術(shù)語(yǔ)“聚合物分子”交換使用。該術(shù)語(yǔ)將包括糖分子，但通常情況下，該術(shù)語(yǔ)不包括通過(guò)體內(nèi)N-或O-的糖基化(以下進(jìn)一步描述)連接到所述多肽上的這類糖分子，因?yàn)檫@類分子在下文中被稱為“寡糖組分”。除非對(duì)聚合物分子的數(shù)目有清楚的說(shuō)明，每次提及本發(fā)明多肽中包含的“一個(gè)聚合物”，“一個(gè)聚合物分子”，“聚合物”或“聚合物分子”或在本發(fā)明中應(yīng)用的上述稱謂都涉及一個(gè)或多個(gè)聚合物分子。
術(shù)語(yǔ)“附著基團(tuán)”是指多肽中能夠偶聯(lián)到相關(guān)非多肽組分上的氨基酸殘基基團(tuán)。例如，在聚合物偶聯(lián)，尤其與PEG偶聯(lián)的情況中，常用的附著基團(tuán)是賴氨酸的ε氨基或N末端氨基。其它的聚合物附著基團(tuán)包括游離羧酸基團(tuán)(例如，C末端氨基酸殘基的游離羧酸基團(tuán)或天冬氨酸或谷氨酸殘基的游離羧酸基團(tuán))，適當(dāng)活化的羰基基團(tuán)，氧化的糖組分和巰基基團(tuán)。有用的附著基團(tuán)和它們相配對(duì)的非肽組分見下表。
對(duì)于體內(nèi)的N糖基化，術(shù)語(yǔ)“附著基團(tuán)”以非常規(guī)的方式應(yīng)用以表示構(gòu)成N糖基化位點(diǎn)的氨基酸殘基(帶有N-X’-S/T/C-X＂序列，其中X’是除脯氨酸外的任何氨基酸殘基，X＂可以是任何氨基酸殘基，其可以是脯氨酸也可以不是脯氨酸，優(yōu)選其不是脯氨酸，N是天冬酰胺，S/T/C可以是絲氨酸，蘇氨酸或半胱氨酸，優(yōu)選是絲氨酸或蘇氨酸，最優(yōu)選是蘇氨酸)。盡管N-糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺殘基是糖基化過(guò)程中寡糖部分附著的部位，但這種附著不能實(shí)現(xiàn)，除非存在N糖基化位點(diǎn)的其它氨基酸殘基。因此，當(dāng)非肽組分是寡糖組分且經(jīng)過(guò)N-糖基化實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)時(shí)，與目標(biāo)多肽氨基酸序列的改變連用的術(shù)語(yǔ)“包含非肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基”應(yīng)理解為構(gòu)成N糖基化位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基以下述方式改變，該是將功能性N糖基化位點(diǎn)引入到該氨基酸序列或從所述序列中除去。
在本申請(qǐng)中，氨基酸的名稱和原子名稱(例如，CA，CB，NZ，N，O，C，等)依照蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)(www.pdb.org)的定義應(yīng)用，這些名稱是根據(jù)IUPAC命名法命名的(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids andPeptides(residue names，atom names etc.)，Eur.J.Biochem.138，9-37(1984)和在Eur.J.Biochem.中對(duì)它們的更正152，1(1985)。術(shù)語(yǔ)“氨基酸殘基”主要是指20個(gè)天然氨基酸中的氨基酸，即丙氨酸(Ala或A)，半胱氨酸(Cys或C)，天冬氨酸(Asp或D)，谷氨酸(Glu或E)，苯丙氨酸(Phe或F)，甘氨酸(Gly或G)，組氨酸(His或H)，異亮氨酸(Ile或1)，賴氨酸(Lys或K)，亮氨酸(Leu或L)，蛋氨酸(Met或M)，天冬酰胺(Asn或N)，脯氨酸(Pro或P)，谷氨酰胺(Gln或Q)，精氨酸(Arg或R)，絲氨酸(Ser或S)，蘇氨酸(Thr或T)，纈氨酸(Val或V)，色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)殘基。
用于定義氨基酸的位置/取代的術(shù)語(yǔ)舉例說(shuō)明如下F13是指參考氨基酸序列中編號(hào)13的位置由苯丙氨酸殘基占據(jù)。F13K是指位置13的苯丙氨酸殘基已經(jīng)被賴氨酸殘基取代。除非另有說(shuō)明，本文中氨基酸殘基的編號(hào)與SEQ ID NO1所示hG-CSF的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)?？晒┻x擇的取代用＂/＂表示，例如，Q67D/E是指其中第67位的谷氨酰胺被天冬氨酸或谷氨酸取代的氨基酸序列。多個(gè)取代用＂+＂表示，例如，S53N+G55S/T是指其中第53位的絲氨酸殘基被天冬酰胺取代且第55位的甘氨酸殘基被絲氨酸或蘇氨酸殘基取代的一個(gè)氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”是指二個(gè)或多個(gè)核苷酸分子的連續(xù)延伸。核苷酸序列可以是基因組型，cDNA型，RNA型，半合成或合成來(lái)源的，或它們的任何組合。
術(shù)語(yǔ)“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”通常是指一種在體外擴(kuò)增目的核苷酸序列的方法，例如US4,683,195中所述。通常，PCR方法涉及應(yīng)用能優(yōu)先與模板核酸雜交的寡核苷酸引物，進(jìn)行引物延伸合成的反復(fù)循環(huán)。
“細(xì)胞”，“宿主細(xì)胞”，“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”在本發(fā)明中可以交換使用且所有這些術(shù)語(yǔ)都應(yīng)該包括細(xì)胞生長(zhǎng)或培養(yǎng)后產(chǎn)生的后代?！稗D(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”可以交換使用，指將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程。
“可操作地連接(Operably linked)”是指二個(gè)或多個(gè)核苷酸序列通過(guò)酶連接或其它方式共價(jià)連接以使該序列的正常功能能夠?qū)崿F(xiàn)。例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)序列作為參與多肽的分泌的前蛋白表達(dá)，那么將編碼前序列或分泌前導(dǎo)序列(secretory leader)的核苷酸序列可操作地連接到多肽的核苷酸序列上啟動(dòng)子或增強(qiáng)子如果影響該序列的轉(zhuǎn)錄則可操作地連接到編碼序列上；如果核糖體結(jié)合部位位于可促進(jìn)翻譯的位置，那么將核糖體結(jié)合部位可操作地連接到編碼序列上。通?！翱刹僮鞯剡B接”是指被連接的核苷酸序列是鄰近的，且在分泌前導(dǎo)序列的情況下，是鄰近的同時(shí)又是處在閱讀狀態(tài)的。連接可以方便的在限制性酶切位點(diǎn)完成。如果這樣的部位不存在，那么需要應(yīng)用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法。
術(shù)語(yǔ)“引入”是指引入含非多肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基，尤其通過(guò)對(duì)現(xiàn)有氨基酸基的取代，或通過(guò)插入另外的氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)“除去”是指將包含非多肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基除去，尤其通過(guò)將該氨基酸殘基用另外的氨基酸殘基取代的方式除去，或者選擇地通過(guò)刪除(沒(méi)有取代)預(yù)除去的氨基酸殘基。
當(dāng)對(duì)親代多肽進(jìn)行取代時(shí)，這些取代優(yōu)選是“保守性取代”，換句話說(shuō)取代是在具有相似特點(diǎn)的氨基酸，例如，小氨基酸，酸性氨基酸，極性氨基酸，堿性氨基酸，疏水性氨基酸和芳香性氨基酸之間進(jìn)行取代。
本發(fā)明中優(yōu)選的取代尤其選自下表中列出的保守取代組保守取代組
在與給定的物質(zhì)聯(lián)用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性”是指該物質(zhì)能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。免疫反應(yīng)可以是細(xì)胞或抗體介導(dǎo)的反應(yīng)(對(duì)免疫原性的進(jìn)一步解釋參見，例如RoittEssential Immunology(8th Edition，Blackwell))。正常情況下，抗體反應(yīng)性的降低將意味著免疫原性的降低。降低的免疫原性可以通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的任何適當(dāng)?shù)姆椒?，例如體內(nèi)的方法或體外的方法確定。
術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)功能半壽期”以其正常的含意使用，即在體內(nèi)/靶器官內(nèi)多肽或偶聯(lián)物仍然存在50％生物學(xué)活性的時(shí)間，或多肽或偶聯(lián)物的活性是最初活性的50％的時(shí)間。確定體內(nèi)功能半壽期的另一種方法可以是確定“血清半壽期”，即50％的多肽或偶聯(lián)物分子在被清除之前在血漿或血流中循環(huán)的時(shí)間。血清半壽期的其它術(shù)語(yǔ)包括“血漿半壽期”，“循環(huán)半壽期”，“血清清除率”“血漿清除率”，“清除半壽期”。多肽或偶聯(lián)物由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)，腎臟，脾臟或肝臟中的一個(gè)或多個(gè)，通過(guò)受體介導(dǎo)的降解，或通過(guò)特異性或非特異性蛋白水解作用，尤其通過(guò)受體介導(dǎo)的清除和腎臟的清除而被清除。通常，清除取決于蛋白的大小(相對(duì)于腎小球過(guò)濾的截留值)，電荷，附著的糖鏈，和該蛋白的細(xì)胞受體的存在。被保留的功能性通常選自增殖或受體結(jié)合活性。體內(nèi)功能半壽期和血清半壽期可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ù_定，這在以下的材料和方法中進(jìn)一步討論。
關(guān)于體內(nèi)功能半壽期或血清半壽期所用的術(shù)語(yǔ)“增加的”是指偶聯(lián)物或多肽的相應(yīng)半壽期經(jīng)可比條件下的測(cè)定，相對(duì)于參考分子，例如非偶聯(lián)的hG-CSF(例如Neupogen)的半壽期在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上是增加的。例如，相應(yīng)半壽期可能增加至少大約25％，例如至少大約50％，例如至少大約100％，200％，500％或1000％。
所用術(shù)語(yǔ)“腎臟清除”的正常的含意是指腎臟，例如通過(guò)腎小球的過(guò)濾，腎小管的分泌或腎小管的排泄進(jìn)行的任何清除。腎臟清除依賴于偶聯(lián)物的物理特征，包括大小(直徑)，對(duì)稱性，形狀/剛性和電荷。通過(guò)任何適當(dāng)?shù)臋z測(cè)，例如，一個(gè)現(xiàn)有體內(nèi)檢測(cè)法可以確定腎臟清除的降低。通常，腎臟清除可通過(guò)給予患者一種標(biāo)記的(例如，放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記的)多肽偶聯(lián)物并檢測(cè)所收集的患者尿中標(biāo)記物的活性進(jìn)行確定。在可比較的條件下，腎臟清除的降低可對(duì)比相關(guān)的參考多肽例如，相應(yīng)的非偶聯(lián)多肽，非偶聯(lián)的相應(yīng)的野生型多肽或另一偶聯(lián)多肽(例如并非依照本發(fā)明的偶聯(lián)多肽)確定。優(yōu)選，偶聯(lián)物的腎臟清除率與相關(guān)的參考多肽相比降低至少50％，優(yōu)選至少降低75％，最優(yōu)選至少降低90％。
通常，受體的活化是和受體介導(dǎo)的清除(RMC)相關(guān)聯(lián)的，這使得多肽與其受體在非活化的情況下的結(jié)合不能導(dǎo)致RMC，而受體的活化導(dǎo)致RMC。清除是由于受體結(jié)合的多肽的內(nèi)化并隨后被溶酶體降解所致。設(shè)計(jì)偶聯(lián)物使其能夠結(jié)合和活化足夠數(shù)目的受體，以獲得最佳體內(nèi)生物學(xué)反應(yīng)并避免活化比獲得該反應(yīng)所需數(shù)量更多的受體，從而可使RMC降低。這可以反映在降低的體外生物學(xué)活性和/或增加的分離率方面。
通常，體外生物學(xué)活性的降低反映了功效/效率的降低和/或有效性的降低，這可以通過(guò)用確定這些特性中任何一種的任何適當(dāng)方法確定。例如，體外生物學(xué)活性可以在基于螢光素酶的試驗(yàn)中確定(參見材料和方法)。經(jīng)可比條件下的測(cè)定，與相應(yīng)的參考多肽的體外生物學(xué)活性比較，偶聯(lián)物的體外生物學(xué)活性可降低至少30％，例如可降低至少50％，60％或75％，例如降低至少90％。換而言之，偶聯(lián)物可能具有相應(yīng)非偶聯(lián)多肽或相應(yīng)野生型多肽的體外生物學(xué)活性的大約1％，通常，至少大約2％，例如至少大約5％。例如，經(jīng)可比條件下的測(cè)定，該體外生物學(xué)活性可以是參考多肽的大約1-50％，例如，大約2-40％，例如大約5-25％。在需要降低體外生物學(xué)活性以降低受體介導(dǎo)的清除的情況下，但很明顯為獲得所期望的受體活化顯然需要維持足夠的生物學(xué)活性。
優(yōu)選，多肽偶聯(lián)物和其受體的分離率的增加將達(dá)到一定程度，使得可以導(dǎo)致在受體配體復(fù)合物的任何實(shí)質(zhì)性內(nèi)吞發(fā)生之前將多肽偶聯(lián)物從其受體上釋放出來(lái)。受體多肽結(jié)合親和力(包括分離率)可以依照本文材料和方法部分的描述確定。體外RMC可以如下確定標(biāo)記(例如放射性的或熒光的標(biāo)記)多肽偶聯(lián)物，刺激包含針對(duì)該多肽的受體的細(xì)胞，洗滌這些細(xì)胞并檢測(cè)標(biāo)記物的活性?；蛘?，將偶聯(lián)物暴露于表達(dá)相關(guān)受體的細(xì)胞。適當(dāng)時(shí)間的溫育后將上清液取出轉(zhuǎn)移到包含相似細(xì)胞的培養(yǎng)孔中。這些細(xì)胞對(duì)上清液的生物反應(yīng)可以與非偶聯(lián)多肽或另一參考多肽對(duì)比確定，這就是RMC降低程度的測(cè)量值。
通常，偶聯(lián)物體外生物學(xué)活性的降低可以是其被非多肽組分修飾的結(jié)果。然而，為進(jìn)一步降低體外生物學(xué)活性或?yàn)槠渌?，可能還需要對(duì)偶聯(lián)物的多肽部分進(jìn)行修飾。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，與相應(yīng)的野生型的多肽相比，位于多肽的受體結(jié)合區(qū)或其附近的至少一個(gè)氨基酸殘基可以用另一氨基酸殘基取代，以降低體外生物學(xué)活性。通過(guò)取代引入的氨基酸殘基可以是能夠降低偶聯(lián)物的體外生物學(xué)活性的任何氨基酸殘基。便利地，被引入的氨基酸殘基包含本文定義的非多肽組分附著基團(tuán)。尤其，當(dāng)非多肽組分是聚合物分子例如PEG時(shí)，被引入的氨基酸殘基可以是賴氨酸殘基。
術(shù)語(yǔ)“顯示G-CSF活性”是指多肽或偶聯(lián)物有天然G-CSF，尤其具有SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列的G-CSF的一個(gè)或多個(gè)功能，包括與G-CSF受體結(jié)合的能力(Pukunaga et al.，J.Bio.Chem，26514008，1990)。G-CSF活性用下面材料和方法中描述的初步檢測(cè)方法可以便利地檢測(cè)。“顯示”G-CSF活性的多肽當(dāng)顯示可檢測(cè)的功能，例如可檢測(cè)的增殖活性或受體結(jié)合活性(例如那些通過(guò)材料和方法中描述的初步檢測(cè)方法確定的活性)時(shí)，被認(rèn)為具備了這樣的活性。本文中顯示G-CSF活性的多肽也可以稱為“G-CSF分子”。
術(shù)語(yǔ)“親代G-CSF”或“親代多肽”是指將根據(jù)本發(fā)明被修飾的分子。親代G-CSF通常是hG-CSF或其變體?！白凅w”是其一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基與親代多肽不同的多肽，通常1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個(gè)氨基酸殘基不同。rhG-CSF的實(shí)例包括filgrastim(Gran和eupogen)，lenograstim(Neutrogin和Granocyte)和nartograstim(Neu-up)。
本發(fā)明的偶聯(lián)物如上所述，本發(fā)明第一方面涉及包含顯示G-CSF活性的多肽以及附著至該多肽的附著基團(tuán)上的至少一個(gè)非多肽組分的偶聯(lián)物，該多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID NO1所示的氨基酸序列不同在于引入或去除至少一個(gè)包含非多肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基。被引入和/或去除的氨基酸殘基在以下進(jìn)一步描述。應(yīng)理解偶聯(lián)物本身也顯示G-CSF活性。
通過(guò)引入和/或去除包含非多肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基，可以定向改造多肽，以使多肽分子更易于與所選定的非多肽組分偶聯(lián)，使偶聯(lián)模式最優(yōu)化(例如保證非多肽組分在G-CSF分子表面最優(yōu)化分布并保證分子中只存在將進(jìn)行偶聯(lián)的附著基團(tuán))，從而獲得既具備G-CSF活性還具有與現(xiàn)有G-CSF分子相比改善了一個(gè)或多個(gè)特性的新的偶聯(lián)分子。
多肽可以是任何來(lái)源的，尤其可以來(lái)源于哺乳動(dòng)物，但目前優(yōu)選來(lái)源于人。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，具備G-CSF活性的多肽的一個(gè)以上的氨基酸殘基被變更，例如這種變更包括去除和引入含所選非多肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基。
除本發(fā)明公開的旨在去除和/或引入非多肽組分的附著位點(diǎn)的氨基酸殘基的變更之外，可以理解本發(fā)明的多肽的氨基酸序列在需要時(shí)可以包含其它的與引入或去除附著位點(diǎn)無(wú)關(guān)的變更，即其它的取代，插入或缺失。這些變更可以，例如，包括截去N末端和/或C末端一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，或在N末端和/或C末端添加一個(gè)或多個(gè)額外的殘基，例如在N末端添加蛋氨酸殘基。
本發(fā)明的偶聯(lián)物與hG-CSF相比，尤其與rhG-CSF(例如filgrastim，lenograstim或artograstim)或已知的hG-CSF變體相比有一個(gè)或多個(gè)以下改善的特性體內(nèi)的功能半壽期增加，血清半壽期增加，腎臟清除減少，受體介導(dǎo)的清除減少，副作用例如骨痛減弱，和免疫原性降低。
可以理解，包含非多肽組分的附著基團(tuán)的氨基酸殘基，不管它是被引入還是被去除，都將根據(jù)所選擇的非多肽組分的性質(zhì)，且在多數(shù)情況下，根據(jù)多肽和非多肽組分之間實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)的方法選擇。例如，非多肽組分是聚合物分子例如聚乙二醇或聚環(huán)氧烷衍生的分子時(shí)，包含附著基團(tuán)的氨基酸殘基可以從賴氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，組氨酸和精氨酸中選擇。當(dāng)偶聯(lián)賴氨酸殘基時(shí)，適當(dāng)?shù)幕罨肿邮抢鐏?lái)自Shearwater Polymers，Inc.的PEG-SPA，氧基羰基氧-N-二羧酰亞胺-PEG(US5,122,614)，或可從PolyMASC Pharmaceuticals plc.得到的PEG。對(duì)這些分子中的第一個(gè)分子將在以下作進(jìn)一步描述。
為避免對(duì)親代hG-CSF分子的結(jié)構(gòu)和功能的破壞，依照本發(fā)明需要變更的氨基酸殘基總數(shù)，例如如本發(fā)明下面描述的，(與SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列相比)通常不超過(guò)15個(gè)。引入或去除的實(shí)際的氨基酸殘基的數(shù)目和類型尤其依賴于所期望的偶聯(lián)的性質(zhì)和程度(例如，非肽組分的特征，多少非多肽組分期望或可能與多肽偶聯(lián)，期望偶聯(lián)發(fā)生的部位或應(yīng)該避免偶聯(lián)發(fā)生的部位，等)。優(yōu)選，本發(fā)明偶聯(lián)物的多肽部分或本發(fā)明的多肽有1-15個(gè)氨基酸殘基，通常2-10個(gè)氨基酸殘基，例如3-8個(gè)氨基酸殘基，例如4-6個(gè)氨基酸殘基，與SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列相比不同。所以，通常本發(fā)明的偶聯(lián)物的多肽部分或本發(fā)明的多肽有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個(gè)氨基酸殘基不同于SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列。
通常偶聯(lián)物的多肽部分有至少大約80％與SEQ ID NO1相同的氨基酸序列，優(yōu)選至少大約90％，例如至少大約95％。氨基酸序列的同源性/同一性可以便利地，周例如ClustalW程序，版本1.8，1999年6月，用缺省參數(shù)從被比對(duì)的序列確定(Thompson et al.，1994，ClustalWImproving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice，NucleicAcids Res.224673-4680)或從PFAM家族數(shù)據(jù)庫(kù)版本4.0(http//pfam.wustl.edu/)(Nucleic Acids Res.1999 Jan 1；27(1)260-2)通過(guò)應(yīng)用GENEDOC版本2.5(Nicholas，K.B.，Nicholas H.B.Jr.，和Deerfield，D.W.II.1997 GeneDocAnalysis and Visualization of Genetic Variation，EMBNEW.NEWS 414；Nicholas，K.B.and Nicholas H.B.Jr.1997 GeneDocAnalysis andVisualization of Genetic Variation)進(jìn)行確定。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽的氨基酸序列和SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列之間的差異在于引入至少一個(gè)且經(jīng)常是多個(gè)，例如1-15個(gè)包含非多肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基，優(yōu)選通過(guò)替換的方式引入到氨基酸序列中。所以，多肽部分變更了與所選非多肽組分結(jié)合的特定氨基酸殘基的含量，從而獲得更有效的，特異的和/或更大范圍的偶聯(lián)。例如，當(dāng)包含所選非多肽的附著基團(tuán)的氨基酸殘基總數(shù)變更到較佳水平時(shí)，由于偶聯(lián)獲得的分子的形狀，大小和/或電荷的改變，偶聯(lián)物的清除通常明顯降低。進(jìn)一步地，當(dāng)包含所選非多肽的附著基團(tuán)的氨基酸殘基總數(shù)增加時(shí)，更大比例的多肽分子被所選非多肽組分掩蔽，導(dǎo)致較低免疫反應(yīng)。
本申請(qǐng)中所用術(shù)語(yǔ)“一種不同”是指允許另外的不同存在。所以，除了特定的氨基酸的不同之外，其它的氨基酸殘基可以發(fā)生突變。
在另一優(yōu)選實(shí)施例中，多肽的氨基酸序列和SEQ ID NO1所示氨基酸序列之間的不同是至少一個(gè)，優(yōu)選多個(gè)，例如1-15個(gè)含非多肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基從氨基酸序列中被去除，優(yōu)選被取代。通過(guò)去除一個(gè)或多個(gè)包含非多肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基，可以避免非多肽組分偶聯(lián)在多肽上導(dǎo)致不利偶聯(lián)的部位，例如在多肽的功能部位處或其附近的氨基酸殘基上(因?yàn)樵诖祟惒课坏呐悸?lián)可能由于受體的識(shí)別受到影響導(dǎo)致所產(chǎn)生的偶聯(lián)物失活或G-CSF活性下降)。本文術(shù)語(yǔ)“功能部位”是指一個(gè)或多個(gè)為hG-CSF功能或效應(yīng)所必不可少或者相關(guān)的氨基酸殘基。這樣的氨基酸殘基構(gòu)成功能部位的一部分。功能部位可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法確定，優(yōu)選通過(guò)分析多肽和相關(guān)受體，例如hG-CSF受體(參見Aritomi et al.，nature 401713-717，1999)的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)確定。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列有如下不同a)至少一個(gè)特定的包含非多肽組分附著基團(tuán)且存在于SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列中的氨基酸殘基被去除，優(yōu)選通過(guò)取代的方式去除，b)至少一個(gè)特定的包含非多肽組分附著基團(tuán)的氨基酸殘基被引入到氨基酸序列中，優(yōu)選通過(guò)取代，上述特定的氨基酸殘基可以是本文以下部分描述的那些氨基酸殘基中的任何一種。這個(gè)實(shí)施方案被認(rèn)為具有特定的意義，因?yàn)樗沟糜锌赡芏ㄏ蛟O(shè)計(jì)多肽使之能與選擇的非多肽組分獲得最佳的偶聯(lián)。例如，通過(guò)引入和去除以下部分公開的選定氨基酸殘基，有可能保證所選擇的非多肽組分的附著基團(tuán)的最佳分布，所產(chǎn)生的偶聯(lián)物的非多肽組分的位置可以使得a)有效地掩蔽多肽的表位和其它的表面部分和b)保證偶聯(lián)物具有最佳的Stokes半徑，不引起太多的結(jié)構(gòu)破壞從而減弱多肽的功能。
本發(fā)明的偶聯(lián)物通常包含足夠數(shù)量和類型的非多肽組分以使偶聯(lián)物的體內(nèi)功能半壽期和/或血清半壽期與hG-CSF，例如filgrastim，lenograstim或nartograstim比較，優(yōu)選與包含N末端附著的單個(gè)20kDa PEG組分的rhG-CSF比較得到增加。體內(nèi)功能半壽期的增加可以通過(guò)如本文材料和方法中的描述便利地確定。
本發(fā)明的偶聯(lián)物可以包含非多肽組分的至少一個(gè)尚未偶聯(lián)、可進(jìn)行偶聯(lián)的附著基團(tuán)。在本發(fā)明的上下文中所用的術(shù)語(yǔ)“可偶聯(lián)的附著基團(tuán)”是指位于多肽中可進(jìn)行偶聯(lián)的部位的附著基團(tuán)，且當(dāng)進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)，若不存在特殊的預(yù)防措施，上述附著基團(tuán)便可與相關(guān)的非多肽組分偶聯(lián)。例如，這類附著基團(tuán)可以是多肽表現(xiàn)其活性必需或相關(guān)的氨基酸殘基的一部分。避免另外的可偶聯(lián)的附著基團(tuán)的偶聯(lián)的一個(gè)便利的是通過(guò)輔助分子，例如以在題目為“對(duì)功能部位的阻斷”部分描述的方式對(duì)附著基團(tuán)進(jìn)行掩蔽。應(yīng)理解尚未被偶聯(lián)但可偶聯(lián)附著基團(tuán)的數(shù)目由特定的G-SCF多肽和可偶聯(lián)的附著基團(tuán)的位置決定。例如，多肽偶聯(lián)物包含一個(gè)或二個(gè)未被偶聯(lián)但可偶聯(lián)的附著基團(tuán)，和至少一個(gè)，優(yōu)選二個(gè)或多個(gè)已被偶聯(lián)的附著基團(tuán)。
本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分被附著到賴氨酸上或N末端氨基酸殘基上本發(fā)明一方面涉及一種多肽偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含i)顯示G-CSF活性的多肽，該多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列不同在于它至少存在選自以下取代中的一個(gè)取代T1K，P2K，L3K，G4K，P5K，A6K，S7K，S8K，L9K，PICK，Q11K，S12K，F(xiàn)13K，L14K，L15K，E19K，Q20K，V21K，Q25K，G26K，D27K，A29K，A30K，E33K，A37K，T38K，Y39K，L41K，H43K，P44K，E45K，E46K，V48K，L49K，L50K，H52K，S53K，L54K，I56K，P57K，P60K，L61K，S62K，S63K，P65K，S66K，Q67K，A68K，L69K，Q70K，L71K，A72K，G73K，S76K，Q77K，L78K，S80K，F(xiàn)83K，Q86K，G87K，Q90K，E93K，G94K，S96K，P97K，E98K，L99K，G100K，P101K，T102K，D104K，T105K，Q107K，L108K，D109K，A111K，D112K，F(xiàn)113K，T115K，T116K，W118K，Q119K，Q120K，M121K，E122K，E123K，L124K，M126K，A127K，P128K，A129K，L130K，Q131K，P132K，T133K，Q134K，G135K，A136K，M137K，P138K，A139K，A141K，S142K，A143K，F(xiàn)144K，Q145K，S155K，H156K，Q158K，S159K，L161K，E162K，V163K，S164K，Y165K，V167K，L168K，H170K，L171K，A172K，Q173K和P174K，和ii)至少有一個(gè)非多肽組分附著到該多肽的賴氨酸殘基上。
hG-CSF包含四個(gè)賴氨酸殘基，其中K16位于受體結(jié)合功能域，其它的分別位于距離受體結(jié)合功能域相對(duì)較近的23，34和40位。為了避免這些賴氨酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的偶聯(lián)反應(yīng)(因?yàn)檫@種偶聯(lián)可以使所產(chǎn)生的偶聯(lián)物的活性喪失或嚴(yán)重下降)需要去除至少一個(gè)賴氨酸殘基，例如二個(gè)，三個(gè)或所有這些殘基。所以，在另一更優(yōu)選的方面本發(fā)明涉及以上定義的多肽偶聯(lián)物，其中選自K16，K23，K34和K40的至少一個(gè)氨基酸殘基被刪除或被另一氨基酸殘基取代。優(yōu)選至少K16被另一氨基酸殘基取代。
優(yōu)選的氨基酸取代實(shí)例包括Q70K，Q90K，T105K，Q120K和T133K中的一個(gè)或多個(gè)，例如這些取代中的二個(gè)，三個(gè)或四個(gè)，例如Q70K+Q90K，Q70K+T105K，Q70K+120K，Q70K+T133K，Q90K+T105K，Q90K+Q120K，Q90K+T133K，T105K+Q120K，T105K+T133K，Q120K+T133K，Q70K+Q90K+T105K，Q70K+Q90K+Q120K，Q70K+Q90K+T133K，Q70K+T105K+T120K，Q70K+T105K+T133K，Q70K+Q120K+T133K，Q09K+T105K+Q120K，Q90K+T105K+T133K，Q90K+Q120K+T133K，T105K+T120K+T133K， Q90K+T10SK+Q120K+T133K，Q70K+T105K+Q120K+T133K， Q70K+Q90K+Q120K+T133K，Q70K+Q90K+T105K+T133K或Q70K+Q90K+T105K+Q120K。
這一部分中描述的第二個(gè)方面的偶聯(lián)物的多肽(即至少存在一個(gè)被引入和一個(gè)被去除的賴氨酸)優(yōu)選包含至少一個(gè)，例如一個(gè)，二個(gè)，三個(gè)或四個(gè)選自K16R，K16Q，K23R，K23Q，K34R，K34Q，K40R和K40Q的取代，更優(yōu)選包含取代K16R和K23R中的至少一個(gè)，以便避免這些殘基的偶聯(lián)。優(yōu)選，上述多肽包含至少選自K16R+K23R，K16R+K34R，K16R+K40R，K23R+K34R，K23R+K40R，K34R+K40R，K16R+K23R+K34R，K16R+K23R+K40R，K23R+K34R+K40R，K16R+K34R+K40R和K16R+K23R+K34R+K40R的一個(gè)取代。這些取代可能產(chǎn)生與天然或親代的多肽相比最小的結(jié)構(gòu)差異。
除了以上列舉的取代，本發(fā)明的多肽偶聯(lián)物也包括選自R22K，R146K，R147K，R166K和R169K的一個(gè)或多個(gè)取代。
依照本發(fā)明的這一方面偶聯(lián)物的非多肽組分可以是任何分子，當(dāng)應(yīng)用給定的偶聯(lián)方法時(shí)，該分子有賴氨酸作為附著基團(tuán)例如糖部分的附著基團(tuán)，優(yōu)選非多肽組分是聚合物分子。聚合物分子可以是在標(biāo)題為“聚合物的偶聯(lián)”部分中提及的分子中的任何分子，但上述聚合物分子優(yōu)選選自線性或分支狀的聚乙二醇或另一聚環(huán)氧烷。優(yōu)選的聚合物分子是例如來(lái)自ShearwaterPolymers，Inc.的PEG-SPA或oxycarbonyl-oxy-N-dicarboxyimide PEG(US5,122,614)。
可以理解，在這一部分指定的任何氨基酸的變更，尤其是取代可與本發(fā)明的其它部分指定的任何氨基酸變更，優(yōu)選取代，即公開的特定氨基酸的修飾，包括糖基化位點(diǎn)的引入和/或去除結(jié)合。
本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是以半胱氨基作為附著基團(tuán)的分子本發(fā)明的另一方面涉及一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含i)顯示G-CSF活性的多肽，該多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列不同，它至少存在選自以下取代中的一個(gè)取代T1C，P2C，L3C，G4C，P5C，A6C，S7C，S8C，L9C，P10C，Q11C，S12C，F(xiàn)13C，L14C，L15C，E19C，Q20C，V21C，R22C，Q25C，G26C，D27C，A29C，A30C，E33C，A37C，T38C，Y39C，L41C，H43C，P44C，E45C，E46C，V48C，L49C，L50C，H52C，S53C，L54C，I56C，P57C，P60C，L61C，S62C，S63C，P65C，S66C，Q67C，A68C，L69C，Q70C，L71C，A72C，G73C，S76C，Q77C，L78C，S80C，F(xiàn)83C，Q86C，G87C，Q90C，E93C，G94C，S96C，P97C，E98C，L99C，G100C，P101C，T102C，D104C，T105C，Q107C，L108C，D109C，A111C，D112C，F(xiàn)113C，T115C，T116C，W118C，Q119C，Q120C，M121C，E122C，E123C，L124C，M126C，A127C，P128C，A129C，L130C，Q131C，P132C，T133C，Q134C，G135C，A136C，M137C，P138C，A139C，A141C，S142C，A143C，F(xiàn)144C，Q145C，R146C，R147C，S155C，H156C，Q158C，S159C，L161C，E162C，V163C，S164C，Y165C，R166C，V167C，L168C，R169C，H170C，L171C，A172C，Q173C和P174C，和ii)至少一個(gè)非多肽組分偶聯(lián)到多肽的半胱氨酸殘基上。
hG-CSF的受體結(jié)合功能域在第17位包含一個(gè)半胱氨酸殘基，該半胱氨酸不形成胱氨酸，且為了避免非多肽組分與上述半胱氨酸的偶聯(lián)將該半胱氨酸去除是有利的。所以，在本發(fā)明另一更優(yōu)選方面涉及一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含i)顯示G-CSF活性的多肽，該多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列不同，它至少存在選自以下取代中的一個(gè)取代T1C，P2C，L3C，G4C，P5C，A6C，S7C，S8C，L9C，P10C，Q11C，S12C，F(xiàn)13C，L14C，L15C，E19C，Q20C，V21C，R22C，Q25C，G26C，D27C，A29C，A30C，E33C，A37C，T38C，Y39C，L41C，H43C，P44C，E45C，E46C，V48C，L49C，LSOC，H52C，S53C，L54C，I56C，P57C，P60C，L61C，S62C，S63C，P65C，S66C，Q67C，A68C，L69C，Q70C，L71C，A72C，G73C，S76C，Q77C，L78C，S80C，F(xiàn)83C，Q86C，G87C，Q90C，E93C，G94C，S96C，P97C，E98C，L99C，G100C，P101C，T102C，D104C，T105C，Q107C，L108C，D109C，A111C，D112C，F(xiàn)113C，T115C，T116C，W118C，Q119C，Q120C，M121C，E122C，E123C，L124C，M126C，A127C，P128C，A129C，L130C，Q131C，P132C，T133C，Q134C，G135C，A136C，M137C，P138C，A139C，A141C，S142C，A143C，F(xiàn)144C，Q145C，R146C，R147C，S155C，H156C，Q158C，S159C，L161C，E162C，V163C，S164C，Y165C，R166C，V167C，L168C，R169C，H170C，L171C，A172C，Q173C和P174C，上述取代與C17的去除結(jié)合，優(yōu)選C17用任何其它的氨基酸殘基，例如用絲氨酸殘基取代，和ii)以半胱氨酸殘基作為其附著基團(tuán)的非多肽組分。
依照本發(fā)明的這一方面優(yōu)選的取代是用半胱氨酸取代精氨酸，例如R146C，R147C，R166C和R169C取代中的一種或多種。
可以理解，在這一部分指定的任何氨基酸修飾，尤其是取代可與本發(fā)明的其它部分指定的任何氨基酸變更，優(yōu)選取代，即公開的特定氨基酸的修飾，包括糖基化位點(diǎn)的引入和/或去除結(jié)合。
本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中的非多肽組分結(jié)合到一個(gè)酸性基團(tuán)上或C末端的氨基酸殘基上本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含i)顯示G-CSF活性的多肽，該多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列不同，它至少存在選自以下取代中的一個(gè)取代T1D，P2D，L3D，G4D，P5D，A6D，S7D，S8D，L9D，P10D，Q11D，S12D，F(xiàn)13D，L14D，L15D，K16D，Q20D，V21D，R22D，K23D，Q25D，G26D，A29D，A30D，K34D，A37D，T38D，Y39D，K40D，L41D，H43D，P44D，V48D，L49D，L50D，H52D，S53D，L54D，I56D，P57D，P60D，L61D，S62D，S63D，P65D，S66D，Q67D，A68D，L69D，Q70D，L71D，A72D，G73D，S76D，Q77D，L78D，S80D，F(xiàn)83D，Q86D，G87D，Q90D，G94D，S96D，P97D，L99D，G100D，P101D，T102D，T105D，Q107D，L108D，A11ID，F(xiàn)113D，T115D，T116D，W118D，Q119D，Q120D，M121D，L124D，M126D，A127D，P128D，A129D，L130D，Q131D，P132D，T133D，Q134D，G135D，A136D，M137D，P138D，A139D，A141D，S142D，A143D，F(xiàn)144D，Q145D，R146D，R147D，S155D，H156D，Q158D，S159D，L161D，V163D，S164D，Y165D，R166D，V167D，L168D，R169D，H170D，L171D，A172D，Q173D和P174D；或至少一個(gè)取代選自T1E，P2E，L3E，G4E，P5E，A6E，S7E，S8E，L9E，P10E，Q11E，S12E，F(xiàn)13E，L14E，L15E，K16E，Q20E，V21E，R22E，K23E，Q25E，G26E，A29E，A30E，K34E，A37E，T38E，Y39E，K40E，L41E，H43E，P44E，V48E，L49E，L50E，H52E，S53E，L54E，I56E，P57E，P60E，L61E，S62E，S63E，P65E，S66E，Q67E，A68E，L69E，Q70E，L71E，A72E，G73E，S76E，Q77E，L78E，S80E，F(xiàn)83E，Q86E，G87E，Q90E，G94E，S96E，P97E，L99E，G100E，P101E，T102E，T105E，Q107E，L108E，A11IE，F(xiàn)113E，T115E，T116E，W118E，Q119E，Q120E，M121E，L124E，M126E，A127E，P128E，A129E，L130E，Q131E，P132E，T133E，Q134E，G135E，A136E，M137E，P138E，A139E，A141E，S142E，A143E，F(xiàn)144E，Q145E，R146E，R147E，S155E，H156E，Q158E，S159E，L161E，V163E，S164E，Y165E，R166E，V167E，L168E，R169E，H170E，L171E，A172E，Q173E和P174E；和ii)含有一個(gè)以天冬氨酸或谷氨酸殘基作為其附著基團(tuán)的非多肽組分。
依照本發(fā)明的這一方面優(yōu)選取代的實(shí)例包括Q67D/E，Q70D/E，Q77D/E，Q86D/E，Q90D/E，Q120D/E，Q131D/E，Q134D/E，Q145D/E和Q173D/E。
除了上述列舉的取代，依照上述的任何方面的偶聯(lián)物的多肽包含選自D27，D104，D109，D112，E19，E33，E45，E46，E93，E98，E122，E123，和E163的至少一個(gè)氨基酸殘基的去除，優(yōu)選通過(guò)取代去除。對(duì)任何其它的氨基酸殘基可以進(jìn)行取代，尤其可以對(duì)天冬酰胺或谷氨酰胺殘基進(jìn)行取代，以避免這些殘基的偶聯(lián)。尤其，多肽可以包含以下取代中的至少一個(gè)取代D27N，D104N，D109N，D112N，E1 9Q，E33Q，E45Q，E46Q，E93Q，E98Q，E122Q，E123Q和E163Q。優(yōu)選，在上述一個(gè)或多個(gè)位置上的氨基酸取代另外可以與以下取代中的至少一個(gè)結(jié)合D109N，D112N，E19Q，E122Q和E123Q。用這些氨基酸殘基中的任何一個(gè)氨基酸的取代可能產(chǎn)生最小的結(jié)構(gòu)差異。
依照本發(fā)明這一方面的以酸性基團(tuán)作為附著基團(tuán)的偶聯(lián)物的非多肽組分可以是具備上述特征的任何非多肽組分，目前優(yōu)選非多肽組分是聚合物分子或一種有機(jī)的衍生物，尤其是聚合物分子，且偶聯(lián)物通過(guò)例如Sakane andPardridge，F(xiàn)harmaceutical Research Vol.14，No.8，1997，pp 1085-1091所述進(jìn)行制備。
可以理解，在這一部分指定的任何氨基酸的變更，尤其是取代可與本發(fā)明的其它部分指定的任何氨基酸變更，優(yōu)選取代，即公開的特定氨基酸的修飾，包括糖基化位點(diǎn)的引入和/或去除結(jié)合。
本發(fā)明的其它偶聯(lián)物除了上述例如在標(biāo)題為“本發(fā)明的偶聯(lián)....”的那部分中指定的非多肽組分外，本發(fā)明的偶聯(lián)物可以進(jìn)一步包含多肽在可糖基化的宿主細(xì)胞中被表達(dá)且在糖基化位點(diǎn)或被引入的糖基化位點(diǎn)上獲得糖基化時(shí)所產(chǎn)生的糖部分。
本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是糖組分本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含一個(gè)顯示G-CSF活性的糖基化的多肽，該多肽包含的氨基酸序列和SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列不同，它至少有一個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)是通過(guò)選自以下取代中的至少一個(gè)取代的方式被引入到氨基酸序列中L3N+P5S/T，P5N，A6N，S8N+P1OS/T，P10N，Q11N+F13S/T，S12N+L14S/T，F(xiàn)13N+L15S/T，L14N+K16S/T，K16N+L18S/T，E19N+V21S/T，Q20N+R22S/T，V21N+K23S/T，R22N+I24S/T，K23N+Q25S/T，Q25N+D27S/T，G26N+G28S/T，D27N+A29S/T，A29N+L31S/T，A30N+Q32S/T，E33N+L35S/T，A37N+Y39S/T，T38N+K40S/T，Y39N+L41S/T，P44N+E46S/T，E45N+L47S/T，E46N+V48S/T，V48N+L50S/T，L49N+G51S/T，L50N+H52S/T，H52N+L54S/T，S53N+G55S/T，P60N，L61N，S63N+P65S/T，P65N+Q67S/T，S66N+A68S/T，Q67N+L69S/T，A68N+Q70S/T，L69N+L71S/T，Q70N+A72S/T，L71N+G73S/T，G73N+L75S/T，S76N+L78S/T，Q77N+H79S/T，L78N，S80N+L82S/T，F(xiàn)83N+Y85S/T，Q86N+L88S/T，G87N+L89S/T，Q90N+L92S/T，E93N+I95S/T，P97N+L99S/T，L99N+P101S/T，P101N+L103S/T，T102N+D104S/T，D104N+L106S/T，T105N+Q107S/T，Q107N+D109S/T，L108N+V110S/T，D109N+A111S/T，A111N+F113S/T，D112N+A114S/T，F(xiàn)113N，T115N+I117S/T，T116N+W118S/T，W118N+Q120S/T，Q119N+M121S/T，Q120N+E122S/T，M121N+E123S/T，E122N+L124S/T，E123N+G125S/T，L124N+M126S/T，M126N+P128S/T，P128N+L130S/T，L130N+P132S/T，P132N+Q134S/T，T133N+G135S/T，Q134N+A136S/T，A136N+P138S/T，P138N+F140S/T，A139N+A141S/T，A141N+A143S/T，S142N+F144S/T，A143N+Q145S/T，F(xiàn)144N+R146S/T，Q145N+R147S/T，R146N+A148S/T，R147N+G149S/T，S155N+L157S/T，H156N+Q158S/T，S159N+L161S/T，L161N+V163S/T，E162N，V163N+Y165S/T，S164N+R166S/T，Y165N+V167S/T，R166N+L168S/T，V167N+R169S/T，L168N+H170S/T，R169N+L171S/T和H170N+A172S/T，其中S/T代表一個(gè)S或T殘基，優(yōu)選T殘基。
可以理解，為了制備依照這一方面的偶聯(lián)物，其多肽必須在能夠?qū)⒐烟遣糠指街教腔稽c(diǎn)的可進(jìn)行糖基化的宿主細(xì)胞中表達(dá)，或者使多肽在體外得到糖基化?？商腔乃拗骷?xì)胞的實(shí)例在下面題目為“寡糖部分的偶聯(lián)”部分給出。
或者，依照這一方面的偶聯(lián)物包含顯示G-CSF活性的多肽，該多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列不同，它存在選自P5N，A6N，P10N，P60N，L61N，L78N，F(xiàn)113N和E162N，更優(yōu)選選自PSN，A6N，PION，P60N，L61N，F(xiàn)113N和E162N，例如選自P60N，L61N，F(xiàn)113N E162N中的至少一個(gè)取代。
或者，本發(fā)明該方面的偶聯(lián)物包含顯示G-CSF活性的多肽，該多肽含有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列不同在于選自下組的至少一個(gè)取代的氨基酸序列D27N+A29S，D27N+A29T，D104N+L106S，D104N+L106T，D109N+A111S，D109N+A111T，D112N+A114S和D112N+A114T，更優(yōu)選選自D27N+A29S，D27N+A29T，D104N+L106S，D104N+L106T，D112N+A114S，和D112N+A114T，如選自D27N+A29S，D27N+A29T，D104N+L106S，和D104N+L106T。
除了糖分子，在這部分描述的依照本發(fā)明這一方面的偶聯(lián)物可以包含另外的非多肽組分，尤其是在本申請(qǐng)中描述的，與偶聯(lián)物的多肽部分存在的一個(gè)或多個(gè)附著基團(tuán)偶聯(lián)的聚合物分子。
可以理解，在這一部分指定的任何氨基酸的變更，尤其是取代可與本發(fā)明的其它部分指定的任何氨基酸變更，尤其是取代，即公開的特定氨基酸的修飾結(jié)合。
環(huán)狀變換的變體(Circularly permuted variants)在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽偶聯(lián)物的多肽部分可以是本發(fā)明中另外公開的多肽序列的環(huán)狀變換的變體形式。在這樣的環(huán)狀變換的多肽中，當(dāng)新的N末端和C末端在兩個(gè)原來(lái)由肽鍵連接的鄰近的氨基酸殘基之間形成時(shí)，最初的N末端和C末端或者直接地通過(guò)肽鍵或者通過(guò)一個(gè)肽接頭間接地連接在一起。因?yàn)橥ǔＷ畛醯腘末端和C末端彼此之間有一些距離，所以它們通常通過(guò)有適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度和成分的肽接頭的方式連接，以使偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)和活性不受負(fù)面地影響。很明顯，新的N末端和C末端在氨基酸殘基對(duì)之間不應(yīng)該形成，因?yàn)檫@會(huì)干擾多肽的活性。環(huán)狀變換的G-CSF受體拮抗劑在US6,100,070中公開，關(guān)于肽接頭和新的N末端和C末端位置和制備該變體的方法的進(jìn)一步的參考信息可以從中得到。
本發(fā)明的偶聯(lián)物對(duì)白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的形成作用在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽偶聯(lián)物的特征是偶聯(lián)物顯示G-CSF活性且包含與SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列至少有一個(gè)氨基酸不同的氨基酸序列，并且該偶聯(lián)物至少有一個(gè)非多肽組分附著到多肽的附著基團(tuán)上，多肽的偶聯(lián)物至少進(jìn)一步滿足下列(A)-(D)標(biāo)準(zhǔn)中的至少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(A)一次皮下給予大鼠每kg體重100mg藥物后(在偶聯(lián)物多肽部分的重量的基礎(chǔ)上)i)與給藥每kg體重100μg未偶聯(lián)的hG-CSF相比，給藥后12小時(shí)白細(xì)胞形成增加的數(shù)率至少與其相同且至少達(dá)到同一水平(按每升血的細(xì)胞數(shù)量計(jì)算)，和ii)在至少大約96小時(shí)，優(yōu)選至少大約120小時(shí)期間，白細(xì)胞的水平增加(按每升血的細(xì)胞數(shù)量計(jì)算)其水平高于給藥前的白細(xì)胞水平；(B)一次皮下給予大鼠每kg體重25μg藥物后(在偶聯(lián)物多肽部分的重量的基礎(chǔ)上)i)與給藥每kg體重100μg未偶聯(lián)的hG-CSF相比，給藥后12小時(shí)白細(xì)胞形成增加的數(shù)率至少與其相同且至少達(dá)到同一水平(按每升血的細(xì)胞數(shù)量計(jì)算)，和ii)在至少大約72小時(shí)，優(yōu)選至少大約96小時(shí)，更優(yōu)選至少大約120小時(shí)期間，白細(xì)胞的水平增加(按每升血的細(xì)胞數(shù)量計(jì)算)，其水平高于給藥前的白細(xì)胞水平；(C)一次皮下給予大鼠每kg體重100μg藥物后(在偶聯(lián)物多肽部分的重量的基礎(chǔ)上)i)與給藥每kg體重100μg未偶聯(lián)的hG-CSF相比，給藥后12小時(shí)白細(xì)胞形成增加的數(shù)率至少與其相同且至少達(dá)到同一水平(按每升血的細(xì)胞數(shù)量計(jì)算)，和ii)在至少大約96小時(shí)，優(yōu)選至少大約120小時(shí)期間，白細(xì)胞的水平增加(按每升血的細(xì)胞數(shù)量計(jì)算)其水平高于給藥前的白細(xì)胞水平；(D)一次皮下給予大鼠每kg體重25μg藥物后(在偶聯(lián)物多肽部分的重量的基礎(chǔ)上)i)與給藥每kg體重100μg未偶聯(lián)的hG-CSF相比，給藥后12小時(shí)嗜中性粒細(xì)胞形成增加的數(shù)率至少與其相同且至少達(dá)到同一水平(按每升血的細(xì)胞數(shù)量計(jì)算)，和ii)在至少大約72小時(shí)，優(yōu)選至少大約96小時(shí)，更優(yōu)選至少大約120小時(shí)期間，嗜中性粒細(xì)胞的水平增加(按每升血的細(xì)胞數(shù)量計(jì)算)，其水平高于給藥前的嗜中性粒細(xì)胞水平。
本發(fā)明的偶聯(lián)物的非多肽組分如以上進(jìn)一步指出的本發(fā)明的偶聯(lián)物的非多肽組分優(yōu)選選自聚合物分子，親脂性化合物，糖部分(例如，通過(guò)體內(nèi)糖基化的方式)和有機(jī)衍生物。所有這些制品都可以呈現(xiàn)所期望的對(duì)偶聯(lián)物的多肽部分的特性，尤其是體內(nèi)功能半壽期和/或血清半壽期增加。偶聯(lián)物的多肽部分通常僅僅與一種類型的非多肽組分偶聯(lián)，但也可以與二種或多種不同類型的非多肽組分，例如與聚合物分子和一種寡糖組分，與一種親脂性的基團(tuán)和一種寡糖組分，與一種有機(jī)衍生物和一種寡糖組分，與一種親脂性的基團(tuán)和一種聚合物分子等等偶聯(lián)。與二種或多種不同的非多肽組分的偶聯(lián)可以同時(shí)也可以先后進(jìn)行。
制備本發(fā)明偶聯(lián)物的方法在以下“與親脂性化合物的偶聯(lián)”，“與聚合物分子的偶聯(lián)”，“與寡糖組分的偶聯(lián)”和“與有機(jī)衍生物偶聯(lián)”部分，對(duì)與特定類型非多肽組分的偶聯(lián)進(jìn)行描述。通常，依照本發(fā)明的多肽偶聯(lián)物可以通過(guò)在有益于多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞制備，然后獲得多肽，其中a)該多肽包含至少一種非O-糖基化位點(diǎn)且宿主細(xì)胞是能夠進(jìn)行體內(nèi)糖基化的真核宿主細(xì)胞，和/或b)在體外多肽易于和非多肽組分偶聯(lián)。
與親脂性化合物的偶聯(lián)多肽和親脂性化合物可以通過(guò)直接的或通過(guò)應(yīng)用接頭彼此偶聯(lián)。親脂性化合物可以是天然化合物例如一種飽和的或非飽和的脂肪酸，脂肪酸二酮，萜，前列腺素，維生素，類胡蘿卜素或類固醇，或合成的化合物例如碳酸，乙醇，胺和具有一個(gè)或多個(gè)烷基，芳基，鏈烯基或其它多元不飽和化合物。多肽和親脂性化合物之間的偶聯(lián)，選擇地通過(guò)一種接頭，可以按照本領(lǐng)域已知的方法，例如按照Bodanszky Peptide Synthesis John Wiley，New York，1976 and in WO96/12505描述的方法進(jìn)行。
與聚合物分子的偶聯(lián)將與多肽偶聯(lián)的聚合物分子可以是任何一種適當(dāng)?shù)木酆衔锓肿樱缣烊坏幕蚝铣傻木畚锘螂s聚物，通常多肽與分子量在大約300-100,000Da的范圍的分子偶聯(lián)，例如在大約500-20,000Da，更優(yōu)選在大約1000-15,000Da，甚至更優(yōu)選在大約2000-12,000Da，例如在大約3000-10,000的范圍之間的分子。本發(fā)明關(guān)于聚合物分子所使用的一詞“大約”是指一個(gè)大概范圍的分子量且反映這樣一個(gè)事實(shí)，即通常在給定的聚合物制品中會(huì)有一個(gè)確定的分子量分布。
均聚物的實(shí)例包括多羥基化合物(即聚-OH)，聚胺(即聚-NH2)和聚羧酸(即聚-COOH)。雜聚物是包含不同偶聯(lián)基團(tuán)，例如羥基和胺基的聚合物。
適當(dāng)?shù)木酆衔锓肿拥膶?shí)例包括選自聚環(huán)氧烷(PAO)，包括聚亞烷基二醇(PAG)，例如線性的或分支的聚乙二醇(PEG)和聚丙烯乙二醇(PPG)，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸鹽(poly-carboxylate)，poly-(vinylpyrolidone)，聚乙烯-馬來(lái)酸酐(polyethylene-co-maleic acid anhydride)，聚苯乙烯馬來(lái)酸酸酐(polystyrene-co-maleic acid anhydride)，右旋糖酐，including羧甲基右旋糖酐或任何其它的適合降低免疫原性和/或增加體內(nèi)功能半壽期和/或血清半壽期的生物聚合物的聚合物分子。聚合物分子的另一實(shí)例是人白蛋白或另一豐富的血漿蛋白。通常，聚環(huán)氧烷來(lái)源的聚合物是適合生物的，無(wú)毒性的，無(wú)抗原性的，無(wú)免疫原性的，有各種水溶解特性，且易從活的生物體排泄。
PEG是優(yōu)選的聚合物分子，因?yàn)榕c多肽例如右旋糖酐相比它僅有幾個(gè)能夠進(jìn)行交叉連接的反應(yīng)基團(tuán)。尤其，單一功能的PEG，例如甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因?yàn)樗呐悸?lián)化學(xué)反應(yīng)相對(duì)簡(jiǎn)單(僅僅一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)可用于與多肽上的附著基團(tuán)的偶聯(lián))所以受到關(guān)注。因而，交叉連接的危險(xiǎn)被排除，所產(chǎn)生的多肽偶聯(lián)物是較均一的且聚合物分子與多肽的反應(yīng)比較容易受到控制。
為了實(shí)現(xiàn)聚合物分子和多肽的共價(jià)連接，提供的聚合物分子的羥基結(jié)尾的基團(tuán)是活化的形式，即是功能性的反應(yīng)基團(tuán)。適當(dāng)?shù)幕罨木酆衔锓肿涌梢再?gòu)買到，例如從Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，AL，USA，或從PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK.購(gòu)買到?；蛘?，聚合物分子可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的便利的方法，例如WO90/13540中公開的方法活化。本發(fā)明中應(yīng)用的活化的線性或分支狀的聚合物分子的具體的實(shí)例在Shearwater Polymers，Inc.1997 and 2000 Catalogs(Functionalized Biocompatible Polymers forResearch and pharmaceuticals，Polyethylene Glycol and Derivatiyes，納入本發(fā)明作參考)中描述。活化的PEG聚合物的具體實(shí)例包括以下線性PEGsNHS-PEG(例如SPAPEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，和SCM-PEG)，和NOR-PEG)，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRESPEG，VS-PEG，IODO-PEG，和MAL-PEG，和分支狀的PEGs例如PEG2-NHS和那些在US5,932,462 and US5,643,575公開的聚合物，它們都被納入本發(fā)明作參考。進(jìn)一步地，在以下被納入本發(fā)明作參考的出版物中，公開了有用的聚合物分子和/或PEG化化合物US5,824,778，US5,476,653，WO97/32607，EP 229,108，EP 402,378，US4,902,502，US5,281,698，US5,122,614，US5,219,564，WO92/16555，WO94/04193，WO94/14758，WO94/17039，WO94/18247，WO94/28024，WO95/00162，WO95/11924，W095/13090，WO95/33490，WO96/00080，WO97/18832，WO98/41562，WO98/48837，WO99/32134，WO99/32139，WO99/32140，WO96/40791，WO98/32466，WO95/06058，EP 439 508，WO97/03106，WO96/21469，WO95/13312，EP 921 131，US5,736,625，WO98/05363，EP 809 996，US5,629,384，WO96/41813，WO96/07670，US5,473,034，US5,516,673，EP 605 963，US5,382,657，EP 510 356，EP 400 472，EP183 503 and EP 154 316。
多肽和活化的聚合物分子的偶聯(lián)可通過(guò)應(yīng)用任何便利的方法，例如按照以下參考文獻(xiàn)中描述的方法(這些文獻(xiàn)也描述了聚合物分子的適當(dāng)?shù)幕罨椒?進(jìn)行R.F.Taylor，(1991)，＂Protein immobilisation.Fundamental andapplications＂，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，＂Chemistry of ProteinConjugation and Crosslinking＂，CRC Press，Boca Raton；G T.Hermanson et al.，(1993)，＂Immobilized Affinity Ligand Techniques＂，Academic Press，N.Y.)。根據(jù)多肽的附著基團(tuán)(實(shí)例在上面已給出)和聚合物的功能基團(tuán)(例如胺，羥基，羧基，醛，sulfydryl，琥珀酰亞胺(succinimidyl)，馬來(lái)酰亞胺，vinysulfone或鹵代醋酸鹽(haloacetate)技術(shù)人員知道所要應(yīng)用的活化方法和/或偶聯(lián)化學(xué)。PEG化可以是直接指向所有的多肽上的可利用的附著基團(tuán)(即被暴露在多肽表面的那些附著基團(tuán))的偶聯(lián)或者可以是直接指向一個(gè)或多個(gè)特定的附著基團(tuán)，例如N末端氨基(US5,985,265)的偶聯(lián)。進(jìn)一步地，偶聯(lián)可以以一步或逐步的方式完成(例如象WO99/55377描述的那樣)。
可以理解，為了制備最佳的分子，針對(duì)附著的PEG分子的數(shù)量，附著的PEG分子的大小和形狀(例如，這些分子是線性的還是分支的)，這些分子附著在多肽中的位置，可以對(duì)PEG化進(jìn)行設(shè)計(jì)。對(duì)使用的聚合物的分子量的選擇要考慮到期望達(dá)到的效果。例如如果偶聯(lián)的主要目的是獲得高分子量和較大外形的偶聯(lián)物(例如降低腎臟的清除)，那么可以選擇與一個(gè)或幾個(gè)高分子量的聚合物分子或許多較小分子量的聚合物分子偶聯(lián)以獲得所期望的效果。然而，優(yōu)選，使用幾個(gè)分子量較低的聚合物分子。當(dāng)存在多數(shù)表位需要掩蔽時(shí)，可以應(yīng)用足夠數(shù)量的低分子量的聚合物分子(例如分子量大約在5,000Da)以有效掩蔽所有或大部分多肽表位。例如可以應(yīng)用2-8，例如3-6個(gè)這樣的聚合物。如以下列舉的實(shí)例，與應(yīng)用具有較高分子量的較少的聚合物分子(例如1-3個(gè)分子量為12,000-20,000的分子)相比，應(yīng)用具有較低分子量的較多的聚合物分子(例如4-6個(gè)分子量為5000的分子)在改善多肽偶聯(lián)物的體內(nèi)功能半壽期方面更有優(yōu)點(diǎn)，即使在附著的聚合物分子的總分子量相同的情況下，也是如此?？梢韵嘈?，較小分子量的較多的聚合物分子的存在比例如單獨(dú)一個(gè)較大的聚合物分子可以為多肽提供較大的半徑或外觀形狀，至少當(dāng)聚合物分子是相對(duì)均一地分布在多肽表面時(shí)情況是這樣的。
只有一個(gè)聚合物分子偶聯(lián)到蛋白的單個(gè)附著基團(tuán)上不是優(yōu)選的，在這種僅僅一個(gè)聚合物分子偶聯(lián)的情況下，通常該聚合物分子可以是線性的或分支的，且分子量相對(duì)高，例如大約20kDa時(shí)是有利的。
通常，聚合物的偶聯(lián)是在使盡可能多的可利用的聚合物附著基團(tuán)與聚合物分子反應(yīng)的條件下進(jìn)行的。這可以通過(guò)使聚合物的摩爾數(shù)適當(dāng)超過(guò)多肽的摩爾數(shù)的方式達(dá)到?；罨木酆衔锓肿优c多肽的典型的摩爾比是達(dá)到大約1000-1，例如達(dá)到大約200-1或達(dá)到大約100-1。然而，在一些情況下，上述比例可以有所降低，例如達(dá)到大約50-1，10-1或5-1。
本發(fā)明對(duì)聚合物分子通過(guò)一個(gè)接頭與多肽偶聯(lián)也進(jìn)行了研究。適當(dāng)?shù)慕宇^對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的。優(yōu)選的實(shí)例是氰尿酰氯(Abuchowski et al.，(1977)，J.Biol.Chem.252，3578-3581；US4,179,337；Shafer et al.，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
偶聯(lián)后，按本領(lǐng)域已知的方法如通過(guò)將伯胺加入到反應(yīng)混合物中而封閉殘留的活化聚合物分子，并通過(guò)合適的方法除去所產(chǎn)生的失活的聚合物分子(參見材料與方法)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽偶聯(lián)物包含PEG分子，其附著至可用于PEG化多肽中的一些，大多數(shù)或優(yōu)選基本上全部的賴氨酸殘基上，所述PEG分子具體地是線性或分支的PEG分子，例如分子量約1-15kDa，通常約2-12kDa，例如約3-10kDa，例如約5或6kDa的PEG分子。
可以理解，根據(jù)多種情況，例如多肽的氨基酸序列，所使用的活化的PEG化合物的性質(zhì)和特定的PEG化條件，包括PEG與多肽的摩爾比，可獲得不同程度的PEG化，較高程度的PEG化通?？梢酝ㄟ^(guò)PEG與多肽的較高比率獲得。然而，由任何給定的PEG化過(guò)程所產(chǎn)生的PEG化多肽通常將包含多肽偶聯(lián)物的隨機(jī)分布。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的多肽偶聯(lián)物包括附著至可用于PEG化多肽賴氨酸殘基上的PEG分子，和另外附著至多肽的N末端氨基酸殘基上的PEG分子。
與寡糖組分的偶聯(lián)與寡糖組分的偶聯(lián)可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。為了完成包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的G-CSF分子的體內(nèi)糖基化，必須將編碼多肽的核苷酸序列插入到可糖基化的真核表達(dá)宿主中。表達(dá)宿主細(xì)胞可選自真菌(絲狀真菌或酵母)、昆蟲、動(dòng)物細(xì)胞，或選自轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞或HEK細(xì)胞，如HEK293，或昆蟲細(xì)胞，如SF9細(xì)胞，或者酵母細(xì)胞如釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)、畢赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)或下文描述的任何宿主細(xì)胞。也可應(yīng)用體外糖(右旋糖酐)與多肽的氨基酸殘基的共價(jià)偶聯(lián)，例如，按照WO87/05330和Aplin等，CRC Crit Rev.Biochem.，pp.259-306，1981中所描述的方法進(jìn)行。
寡糖組分或PEG與蛋白-和肽-結(jié)合的Gln殘基的在體外的偶聯(lián)可通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TG酶)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在所謂交聯(lián)反應(yīng)中谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化供體的胺基轉(zhuǎn)移到蛋白結(jié)合型和肽結(jié)合型的Gln殘基上。供體的胺基可以是蛋白結(jié)合型或肽結(jié)合型的，例如象賴氨酸殘基中的ε胺基，或者可以是小的或大的有機(jī)分子的一部分。在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化的交聯(lián)中一個(gè)可起胺基供體作用的小的有機(jī)分子的實(shí)例是腐胺(1，4丁二胺)。在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化的交聯(lián)中起胺基供體作用的較大的有機(jī)分子的一個(gè)實(shí)例是包含胺基的PEG(Satoet al.，Biochemistry 35，13072-13080)。
通常，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶是高度特異性的酶，不是每個(gè)暴露在蛋白質(zhì)表面的Gln殘基都可以在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的催化下交聯(lián)到包含胺基的底物上。相反，僅僅幾個(gè)Gln殘基可自然起到谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶底物的功能，但決定哪一個(gè)Gln-殘基是谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的好的底物的準(zhǔn)確標(biāo)準(zhǔn)尚未可知。所以，為了使蛋白易于進(jìn)行谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化的交聯(lián)反應(yīng)，通常在方便的位置添加已知可以很好地行使谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶底物功能的氨基酸序列是首要條件。已知幾種氨基酸序列本身是或者包含極好的天然谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶底物例如P物質(zhì)，快反應(yīng)型彈性蛋白酶抑制肽，血纖蛋白原，纖連蛋白，α2纖溶酶抑制物，α酪蛋白和β酪蛋白。
與有機(jī)衍生劑的偶聯(lián)顯示G-CSF活性的多肽的共價(jià)修飾可通過(guò)多肽的附著基團(tuán)與有機(jī)衍生劑反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。合適的衍生劑和方法在本領(lǐng)域中是公知的。例如，半胱氨?；鶜埢３Ｅcα-鹵代乙酸酯(和相應(yīng)的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)產(chǎn)生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨?；鶜埢部膳c溴三氟丙酮、α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸、氯乙?；姿狨ァ-烷基馬來(lái)酰亞胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、對(duì)氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑反應(yīng)進(jìn)行衍生。組氨酰基殘基通過(guò)與二乙基焦碳酸酯在pH5.5-7.0下反應(yīng)進(jìn)行衍生，因?yàn)樵撛噭?duì)組氨酰基側(cè)鏈來(lái)說(shuō)是相對(duì)特異的。對(duì)溴苯甲酰甲基溴化物也可用于衍生。該反應(yīng)優(yōu)選在0.1M卡可酸鈉中于pH6.0下進(jìn)行反應(yīng)。賴氨酰基和氨基末端殘基可與琥珀酸酐或其它羧酸酐反應(yīng)。用這些試劑衍生具有使賴氨?；鶜埢碾姾赡孓D(zhuǎn)的作用。衍生含α-氨基的殘基的其它合適的試劑包括亞氨基酯如methyl picolinimidate、磷酸吡多醛、吡多醛、氯代氫硼化物、三硝基苯磺酸、鄰甲基異脲、2，4-戊二酮和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸鹽的反應(yīng)。精氨?；鶜埢ㄟ^(guò)與一種或多種常規(guī)試劑的反應(yīng)來(lái)修飾，所述試劑包括苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生要求反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行，因?yàn)殡夜δ芑哂懈叩膒Ka。
而且，這些試劑可與賴氨酸以及精氨酸胍基反應(yīng)。羧基側(cè)基(天冬氨?；蚬劝滨；?通過(guò)與碳二亞胺(R-N＝C＝N-R’)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行選擇性地修飾，其中R和R’是不同的烷基，如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮翁-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。而且，天冬氨酰基和谷氨?；ㄟ^(guò)與銨離子反應(yīng)轉(zhuǎn)化為天冬酰胺酰基和谷氨酰胺?；?br> 功能性位點(diǎn)的封閉已經(jīng)報(bào)道聚合物的過(guò)度偶聯(lián)可導(dǎo)致與聚合物偶聯(lián)的多肽活性喪失。該問(wèn)題可通過(guò)如去除位于功能性位點(diǎn)的附著基團(tuán)或在偶聯(lián)前封閉功能性位點(diǎn)而消除。后一種策略構(gòu)成本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案(第一種策略在上文中進(jìn)行了舉例說(shuō)明，如通過(guò)去除鄰近功能性位點(diǎn)的賴氨酸殘基)。更具體來(lái)說(shuō)，按照第二種策略，多肽和非多肽組分之間的偶聯(lián)是在多肽功能性位點(diǎn)在能夠結(jié)合多肽功能性位點(diǎn)的輔助分子封閉的條件下進(jìn)行的。
優(yōu)選地，輔助分子能特異性識(shí)別多肽的功能性位點(diǎn)，如受體，特別是G-CSF受體或G-CSF受體的一部分。
另外，輔助分子可以是抗體，特別是識(shí)別顯示G-CSF活性的多肽的單克隆抗體。特別是，輔助分子可以是中和性單克隆抗體。
可使多肽在偶聯(lián)之前與輔助分子相互作用。這確保多肽的功能性位點(diǎn)被掩蓋或保護(hù)并因此不能被非多肽組分如聚合物衍生。從輔助分子洗脫后，非多肽組分和多肽之間的偶聯(lián)可用至少部分保留的功能性位點(diǎn)來(lái)恢復(fù)。
具有被封閉的功能性位點(diǎn)的多肽與聚合物、親脂性化合物、寡糖組分，有機(jī)衍生劑或任何其它化合物的隨后偶聯(lián)以常規(guī)方式進(jìn)行，如按上文“與......偶聯(lián)”的章節(jié)中所述的方法進(jìn)行。
不考慮用于掩蓋偶聯(lián)物中多肽功能性位點(diǎn)的輔助分子的性質(zhì)，理想的是輔助分子不含或僅僅含有少量的與分子中指定非多肽組分結(jié)合的基團(tuán)，其中與這些基團(tuán)的偶聯(lián)將阻止偶聯(lián)的多肽從輔助分子上解除吸附。因此，可與多肽非掩蓋部分中存在的附著基團(tuán)選擇性偶聯(lián)并且輔助分子可反復(fù)用于重復(fù)偶聯(lián)。例如，如果非多肽組分是聚合物分子如PEG這種具有賴氨酸ε氨基或N-末端氨基酸殘基作為附著基團(tuán)的分子時(shí)，理想的是輔助分子基本上不含可偶聯(lián)的ε氨基，優(yōu)選不含任何ε氨基。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，輔助分子是能夠與多肽功能性位點(diǎn)結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽，該蛋白質(zhì)或肽不含任何與指定非多肽組分可偶聯(lián)的附著基團(tuán)。
本發(fā)明的實(shí)施例中多肽偶聯(lián)物是從多種多樣的編碼目的多肽的核苷酸序列中制備的，功能基團(tuán)的阻斷是在偶聯(lián)之前在微滴定板中實(shí)現(xiàn)的，例如，將表達(dá)出來(lái)的多肽變體加入到包含被固定的阻斷基團(tuán)，例如受體，抗體或類似物的微滴定板中。
在另一實(shí)施例中，輔助分子首先與固相，例如充填材料，例如交聯(lián)葡聚糖或瓊脂糖珠，的柱子，或一種表面，例如反應(yīng)器皿共價(jià)連接。隨后，將多肽裝載到攜帶輔助分子的柱體材料上，然后依照本領(lǐng)域熟知的方法，例如按照上面題目為“與...的偶聯(lián)”章節(jié)中描述的進(jìn)行偶聯(lián)。該程序允許多肽偶聯(lián)物通過(guò)洗脫與輔助分子分離。多肽偶聯(lián)物通過(guò)常規(guī)技術(shù)在不導(dǎo)致多肽偶聯(lián)物實(shí)質(zhì)性降解的物理化學(xué)條件下洗脫。包含多肽偶聯(lián)物的液相從固相中被分離，但輔助分子仍然與多肽偶聯(lián)物共價(jià)連接。多肽偶聯(lián)物與輔助分子的分離可以用其它的方法實(shí)現(xiàn)例如，輔助分子可以用一個(gè)第二分子(例如生物素)衍生，所述第二分子可以被一個(gè)特異性結(jié)合物(例如鏈霉抗生物素)識(shí)別?？梢詫⑻囟ǖ慕Y(jié)合物與固相連接，這樣使多肽偶聯(lián)物與輔助分子-第二分子復(fù)合物在經(jīng)過(guò)第二個(gè)輔助物-固相柱時(shí)得到分離，在隨后洗脫時(shí)，輔助分子-第二分子復(fù)合物保留在固相柱上，而多肽偶聯(lián)物從柱上被洗脫下來(lái)。多肽偶聯(lián)物可以任何適當(dāng)?shù)姆绞綇妮o助分子中釋放出來(lái)。通過(guò)提供輔助分子從與其結(jié)合的G-CSF的功能位點(diǎn)分離的條件可解除保護(hù)作用。例如，聚合物偶聯(lián)的抗體和抗獨(dú)特型抗體之間形成的復(fù)合物可以通過(guò)將pH值調(diào)整到酸性或堿性水平得到解離。
標(biāo)記后的多肽的偶聯(lián)在另一實(shí)施方案中多肽和一段標(biāo)記物，即通常一段由1-30，例如1-20個(gè)氨基酸殘基組成的一段氨基酸序列或肽片段作為融合蛋白被表達(dá)。除了能使純化快速和容易外，該標(biāo)記物還是實(shí)現(xiàn)被標(biāo)記的多肽和非多肽組分之間偶聯(lián)的便利工具。尤其，標(biāo)記物可以用來(lái)完成微滴定板中的偶聯(lián)或通過(guò)標(biāo)記物將標(biāo)記后的多肽固定到其它載體，例如順磁性珠上。在微滴定板上與標(biāo)記的多肽偶聯(lián)具有以下優(yōu)點(diǎn)，標(biāo)記的多肽可從培養(yǎng)肉湯直接固定在微滴定板上(原則上不經(jīng)任何純化)并進(jìn)行偶聯(lián)。因此，可減少操作步驟的總數(shù)(從表達(dá)到偶聯(lián))。而且，標(biāo)記物可起間隔臂分子的作用以確保更易于使固定的多肽偶聯(lián)。使用標(biāo)記多肽進(jìn)行的偶聯(lián)可以是與本文中公開的任何非多肽組分的偶聯(lián)，如與聚合物分子如PEG的偶聯(lián)。
所要應(yīng)用的特定標(biāo)記物的特征并不重要，只要該標(biāo)記物能夠和多肽一起被表達(dá)且能夠被固定到適當(dāng)?shù)谋砻婊蜉d體物質(zhì)上?？梢允袌?chǎng)上購(gòu)買到許多適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物，例如購(gòu)自Unizyme boratories，Denmark.。例如所述標(biāo)記物可以是任一下列序列His-His-His-His-His-HisMet-Lys-His-His-His-His-His-HisMet-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-HisMet-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-GlnMet-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln或以下的任何序列EQKLISEEDL(一種在Mol.Cell.Biol.C 53610-16，1985中描述的C末端標(biāo)記物)DYKDDDDK(一種C末端或N末端標(biāo)記物)YPYDVPDYA也可以從市場(chǎng)上獲得抗上述標(biāo)記物的抗體，例如可購(gòu)自ADI，Aves Laband Research Diagnostics。
應(yīng)用標(biāo)記后的多肽進(jìn)行PEG化便利方法在以下材料與方法部分描述。隨后可以用從市場(chǎng)上可購(gòu)到的酶將標(biāo)記物從多肽中切割下來(lái)。
制備本發(fā)明的多肽或本發(fā)明偶聯(lián)物的多肽組分的方法本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物的多肽部分，選擇地，以糖基化形式，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽?。所述方法包括?gòu)建編碼多肽的核苷酸序列并且在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主中表達(dá)。然而，本發(fā)明的多肽也可以通過(guò)化學(xué)合成的方法制備，盡管這種方法的效率較低，或者將化學(xué)合成和重組DNA技術(shù)結(jié)合應(yīng)用。
編碼本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物的多肽部分的核苷酸序列可以通過(guò)分離或合成編碼親代G-CSF，例如具有SEQ ID NO1顯示的氨基酸序列的hG-CSF的核苷酸序列構(gòu)建，然后改變核苷酸序列以引入(即插入或取代)或刪除(即去除或取代)相關(guān)的氨基酸殘基。
依照常規(guī)方法通過(guò)定點(diǎn)突變可便利地修飾核苷酸序列?；蛘?，可通過(guò)化學(xué)合成核苷酸序列，例如通過(guò)應(yīng)用一種寡聚核苷酸合成器制備，其中寡聚核苷酸是在目的多肽的氨基酸序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，且優(yōu)選那些有利于在制備重組多肽的宿主細(xì)胞中表達(dá)的那些密碼子。例如可以合成編碼目的多肽部分的幾個(gè)小寡核苷酸，然后通過(guò)PCR，連接反應(yīng)或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)將所述寡核苷酸裝配起來(lái)(Barany，PNAS88189-193，1991)。通常，每個(gè)寡核苷酸包含用于補(bǔ)足性裝配的5′或3′的懸垂部分。
可以應(yīng)用另外的核苷酸序列修飾方法，這種方法用于制備高產(chǎn)量篩選的多肽變體，例如，在US5,093,257，中公開的涉及同源交叉的方法，和涉及基因改組(shuffling)的方法，即二個(gè)或多個(gè)同源核苷酸序列的重組導(dǎo)致新的核苷酸序列與起初的核苷酸序列比較具有多個(gè)核苷酸改變?；蚋慕M(也稱為DNA改組)涉及一個(gè)或多個(gè)隨機(jī)片段的循環(huán)和核苷酸序列的組裝，然后進(jìn)行篩選以選擇編碼具有所需特性的多肽的核苷酸序列。為了進(jìn)行同源基礎(chǔ)的核酸改組，核苷酸序列相關(guān)的部分優(yōu)選至少50％相同，例如至少60％相同，更優(yōu)選至少70％相同，例如至少80％相同。重組可以在體外或者體內(nèi)進(jìn)行。
適當(dāng)?shù)捏w外基因改組方法的實(shí)例由Stemmer et al.，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；vol.91，pp.10747-10751；Stemmer(1994)，nature vol.370，pp.389-391；Smith(1994)，Nature vol.370，pp.324-325；Zhao et al.，natureBiotechnology，1998，Mar；16(3)258-61；Zhao H.and Arnold，F(xiàn)B，1997，Vol.25.No.6 pp.1307-1308；Shao et al.，Nucleic Acids Research 1998，Jan 15；26(2)pp.681-83；and WO95/17413公開。適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)改組方法的實(shí)例在WO97/07205中公開。其它的通過(guò)體外或體內(nèi)重組的核酸序列的突變技術(shù)已由例如WO97/20078和US5,837,458公開。特定的改組技術(shù)的實(shí)例包括“家族改組”，“合成改組”和“計(jì)算機(jī)摹擬(in silico)改組”。家族改組涉及將來(lái)自不同種屬的同源基因的家族進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)改組循環(huán)，然后進(jìn)行篩選或選擇。家族改組技術(shù)已由例如Crameriet al.，(1998)，nature Vol.391，pp.288-291；Christians et al.，(1999)，nature Biotechnology vol.17，pp.259-264；Chang et al.，(1999)，nature Biotechnology vol.17，pp.793-797；and Ness et al.，(1999)，natureBiotechnology Vol.17，893-896公開。合成改組涉及提供重疊的合成寡核苷酸文庫(kù)，所述寡核苷酸是以例如令人感興趣的同源基因序列比對(duì)為基礎(chǔ)的。將合成的寡核苷酸重組，然后將所形成的重組核酸序列進(jìn)行篩選，如果需要，可將所形成的重組序列用于進(jìn)一步的改組循環(huán)。合成改組技術(shù)在WO00/42561中公開。In silico改組中涉及DNA的改組程序，該改組程序是應(yīng)用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行或模擬的，所以部分或全部避免了核酸的人工操作。WO00/42560公開了In silico改組的技術(shù)。
一旦完成組裝(通過(guò)合成，定點(diǎn)突變或其它的方法)，即將編碼多肽的核苷酸序列插入到一種重組載體中，且可操作地連接到期望轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中G-CSF表達(dá)所需的調(diào)控序列上。
可以理解，不是所有的載體和表達(dá)調(diào)控序列都能同樣完好的表達(dá)編碼本發(fā)明描述的多肽的核苷酸序列。即使應(yīng)用同樣的表達(dá)系統(tǒng)所有的宿主也不是都能同樣完好地行使其功能。然而，本領(lǐng)域中有一種技術(shù)可以在無(wú)不適當(dāng)試驗(yàn)的情況下對(duì)這些載體，表達(dá)調(diào)控序列和宿主進(jìn)行選擇。例如，在選擇載體時(shí)，必須考慮到宿主，因?yàn)檩d體必須在宿主中復(fù)制或能夠整合到染色體中。也應(yīng)該考慮載體的拷貝數(shù)量，其調(diào)控拷貝數(shù)量的能力，和任何其它的由載體編碼的蛋白的表達(dá)，例如抗生素標(biāo)志物。在選擇表達(dá)調(diào)控序列時(shí)，也應(yīng)該考慮許多因素。這些因素包括，例如，序列的相對(duì)長(zhǎng)度，序列的可控制性，和該調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列的相容性，尤其要注意多肽的核苷酸序列的可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)。選擇宿主時(shí)應(yīng)該考慮宿主與所選載體的相容性，由核苷酸序列編碼的產(chǎn)物的毒性，宿主的分泌特性，宿主正確折疊多肽的能力，宿主的發(fā)酵或培養(yǎng)條件，和由核苷酸序列編碼的產(chǎn)物的純化的難易。
重組載體可以是自主復(fù)制的載體，即這種載體可以作為染色體外的實(shí)體存在，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒?；蛘?，載體也可以是這樣一種載體，當(dāng)導(dǎo)入到宿主細(xì)胞時(shí)，其被整合到宿主細(xì)胞基因組中且同被整合的染色體一起復(fù)制。
載體優(yōu)選是一種表達(dá)載體，在該表達(dá)載體中編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列被可操作性地連接到核苷酸序列轉(zhuǎn)錄所需的另外的區(qū)段上。通常，載體來(lái)源于質(zhì)?；虿《綝NA。本發(fā)明中提到的在宿主細(xì)胞中表達(dá)的許多適宜的表達(dá)載體可從商業(yè)渠道購(gòu)買或者在文獻(xiàn)中有描述。用于真核宿主的表達(dá)載體包括，例如來(lái)自SV40，牛乳突淋瘤病毒，腺病毒和細(xì)胞巨化病毒的包含表達(dá)調(diào)控序列的載體。特定的載體是，例如pCDNA3.1(+)\Hyg(InVitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。用于酵母細(xì)胞的表達(dá)載體包括2μ質(zhì)粒和它們的衍生物，POT1(US4,931,373)，在Okkels，Ann.New York Acad.Sci.782，202-207，1996，和pPICZ A，B或C(Invitrogen)中描述了pJS037載體。用于昆蟲細(xì)胞的載體包括pVL941，pBG311(Cate等，＂Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting SubstanceAnd Expression of the Human Gene In Animal Cells＂，細(xì)胞45，pp.685-98(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(兩者都可以從Invitrogen獲得)。用于細(xì)菌宿主的表達(dá)載體包括已知的細(xì)菌質(zhì)粒，例如來(lái)自E.Coli的質(zhì)粒，包括pBR322，pET3a和pET12a(兩個(gè)都來(lái)自Novagen Inc.，WI，USA)，較寬宿主范圍的質(zhì)粒，例如RP4，噬菌體DNA，例如λ噬菌體的許多衍生物，例如NM989，和其它的DNA噬菌體，例如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。
本發(fā)明中應(yīng)用的其它載體包括允許編碼多肽的核苷酸序列以一定的拷貝數(shù)擴(kuò)增的那些載體。上述可擴(kuò)增的載體在本領(lǐng)域中已熟知。它們包括，例如能夠通過(guò)DHFR擴(kuò)增(參見，例如，Kaufman，U.S.Pat.No.4,470,461，Kaufman和Sharp，＂Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase eDNAGeneAnalysis Of Signals Utilized For Efficient Expression＂，Mol.Cell.Biol.，2，pp.1304-19(1982))和谷氨酰胺合成酶擴(kuò)增(＂GS＂)的載體(參見，例如，US 5,122,464 and EP 338,841)。
重組載體可進(jìn)一步包含能夠使所述載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。此序列的一個(gè)例子(宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí))是SV40的復(fù)制起始點(diǎn)。當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞時(shí)，能夠使載體復(fù)制的合適序列是酵母質(zhì)粒2μ復(fù)制基因REP1-3和復(fù)制起始點(diǎn)。
載體也可含有能選擇的標(biāo)記，如基因，其產(chǎn)物補(bǔ)充宿主細(xì)胞的缺陷，如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母TPI的基因(P.R.Russell，Gene40，1985，pp.125-130)，或者賦予對(duì)藥物如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性的基因。對(duì)于絲狀真菌來(lái)說(shuō)，能選擇的標(biāo)記包括amdS、pyrG、arcB、niaD、sC。
術(shù)語(yǔ)“控制序列”在本文中包括對(duì)本發(fā)明多肽表達(dá)必需的或有利的所有成分。每個(gè)控制序列對(duì)編碼多肽的核苷酸序列來(lái)說(shuō)可以是天然的或外來(lái)的。這些控制序列包括但不限于前導(dǎo)區(qū)、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或上游活化序列、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子?？刂菩蛄兄辽侔▎?dòng)子。
本發(fā)明可以使用各種各樣的表達(dá)控制序列。這些可使用的表達(dá)控制序列包括與前述表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)基因相連的表達(dá)控制序列以及已知控制原核或真核細(xì)胞或其病毒的基因表達(dá)的任何序列及其各種組合。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的合適控制序列的實(shí)例包括SV40和腺病毒的早期或晚期啟動(dòng)子，如腺病毒2的主要晚期啟動(dòng)子、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒立即早期基因啟動(dòng)子(CMV)、人延伸因子1α(EF-1α)啟動(dòng)子、果蠅最小熱休克蛋白70啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、人遍在蛋白C(UbC)啟動(dòng)子、人生長(zhǎng)激素終止子、SV40或腺病毒Elb區(qū)聚腺苷酸化信號(hào)和Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol 1987 Aug 20；196(4)947-50)。
為了改善在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，可以將合成的內(nèi)含子插入編碼所述多肽的核苷酸序列的5’未翻譯區(qū)。合成內(nèi)含子的實(shí)例是來(lái)自質(zhì)粒pCI-Neo的合成內(nèi)含子(購(gòu)自Promega Corporation，WI，USA)。
昆蟲細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的合適控制序列的實(shí)例包括多角體蛋白啟動(dòng)子、P10啟動(dòng)子、苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)多角體病毒堿性蛋白啟動(dòng)子、桿狀病毒立即早期基因1啟動(dòng)子和桿狀病毒39K延遲早期基因啟動(dòng)子和SV40聚腺苷酸化序列。在酵母宿主細(xì)胞中使用的合適控制序列的實(shí)例包括酵母α交配系統(tǒng)的啟動(dòng)子、酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)啟動(dòng)子、來(lái)自酵母糖酵解基因或乙醇脫氫酶基因的啟動(dòng)子、ADH2-4c啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型GAL啟動(dòng)子。在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的合適控制序列的實(shí)例包括ADH3啟動(dòng)子和終止子、由編碼米曲霉TAKA淀粉酶丙糖磷酸異構(gòu)酶或堿性蛋白酶、黑曲霉α淀粉酶、黑曲霉或構(gòu)巢曲霉(A.Nidulans)葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂肪酶的基因衍生的啟動(dòng)子、TPI1終止子和ADH3終止子。在細(xì)菌宿主細(xì)胞中使用的合適控制序列的實(shí)例包括lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)的啟動(dòng)子和噬菌體λ的主要啟動(dòng)子區(qū)域。
信號(hào)肽的存在或不存在如取決于用于多肽生產(chǎn)的表達(dá)宿主細(xì)胞、被表達(dá)的蛋白質(zhì)(是細(xì)胞內(nèi)的還是細(xì)胞外的蛋白質(zhì))和是不是需要分泌。為了在絲狀真菌中使用，信號(hào)肽可以由編碼曲霉屬菌株的淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因、編碼米赫根毛霉脂肪酶或蛋白酶或Humicola lanuginosa脂肪酶的基因方便衍生。信號(hào)肽優(yōu)選由編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因衍生。為了在昆蟲細(xì)胞中使用，信號(hào)肽可以由昆蟲基因方便地衍生(參見WO90/05783)，如鱗翅目Manducasexta脂動(dòng)激素前體(US5023328)、蜜蜂蜂毒素(InVitrogen)、蛻皮甾類UDP葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase)(egt)(Murphy等人，Protein Expression andPurification 4，349-357(1993))或人胰脂酶(hpl)(Methods in Enzymology 284，pp.262-272，1997)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用的優(yōu)選信號(hào)肽是下文實(shí)施例所示人干擾素β的或鼠Igκ輕鏈信號(hào)肽(Coloma，M(1992)J.Imm.Methods 15289-104)。為了在酵母細(xì)胞中使用，發(fā)現(xiàn)合適的信號(hào)肽是釀酒酵母α-因子信號(hào)肽(參見US4870008)、改性的羧肽酶信號(hào)肽(參見L.A.Valls等人，Cell 48，1987，pp.887-897)、酵母BAR1信號(hào)肽(參見WO87/02670)和酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號(hào)肽(參見M.Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)和合成的前導(dǎo)序列TA57(WO98/32867)。已發(fā)現(xiàn)適宜于大腸桿菌的信號(hào)肽是ompA。
編碼顯示G-CSF活性的多肽的本發(fā)明核苷酸序列，無(wú)論是通過(guò)定點(diǎn)誘變、合成還是其它方法制備的，都可以包括也可以不包括編碼信號(hào)肽的核苷酸序列。多肽從表達(dá)該多肽的細(xì)胞中分泌時(shí)，存在信號(hào)肽。如果存在，此信號(hào)肽應(yīng)當(dāng)由選來(lái)用于表達(dá)多肽的細(xì)胞識(shí)別。信號(hào)肽可以與多肽同源(如，通常與G-CSF相連)或異源(即，來(lái)自于除hG-CSF之外的另一來(lái)源)或者可以與宿主細(xì)胞同源或異源，即是由宿主細(xì)胞正常表達(dá)的信號(hào)肽或是由宿主細(xì)胞非正常表達(dá)的。因此，信號(hào)肽可以是原核的如由細(xì)菌如大腸桿菌衍生的，或真核的，如由哺乳動(dòng)物或昆蟲或酵母細(xì)胞衍生的。
可以使用任何合適的宿主產(chǎn)生本發(fā)明偶聯(lián)物的多肽或多肽部分，包括細(xì)菌、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲、哺乳動(dòng)物或其它合適的動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞系以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物。細(xì)菌宿主細(xì)胞的實(shí)例包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如芽孢桿菌屬，如短芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌、假單孢菌屬或鏈霉菌屬或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌菌株。載體可引入細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如可通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見如Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics168111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見如Young and Spizizin，1961，Journal ofBacteriology 81823-829，或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal ofMolecular Biology 56209-221)、電穿孔(參見如Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6742-751)或偶聯(lián)(參見如Koehler and Thome，1987，Joumal ofBacteriology 1695771-5278)來(lái)進(jìn)行。合適的絲狀真菌宿主細(xì)胞的實(shí)例包括曲霉屬菌株，如米曲霉、黑曲霉或構(gòu)巢曲霉，鐮刀菌屬或木霉菌屬。真菌細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過(guò)程涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁通過(guò)本身已知的方式再生。在EP238023和US5679543中描述了轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的合適方法。在Malardier等人1989，Gene 78147-156和WO96/00787中描述了轉(zhuǎn)化鐮刀菌屬的合適方法。合適的酵母宿主細(xì)胞的實(shí)例包括糖酵母屬的菌株，如釀酒酵母屬、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬，如巴斯德畢赤酵母或P.Methanolica、漢遜酵母屬，如多形漢遜酵母或Yarrowia。酵母可使用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.And Simon，M.I.，editors，Guide toYeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology Volume 194，pp182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，Joumal ofBacteriology 153163；和Hinnen等人1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 751920中所述的方法和Clontech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA，USA(在YeastmakerTMYeast Tranformation System Kit的產(chǎn)品使用說(shuō)明書)公開的來(lái)轉(zhuǎn)化。合適昆蟲宿主細(xì)胞的實(shí)例包括鱗翅目細(xì)胞系，如草地夜蛾(Sf9或Sf21)或粉紋夜蛾細(xì)胞(High Five)(US5077214)。可以按Invitrogen所述方法轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞并在其中產(chǎn)生異源多肽。合適哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的實(shí)例包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系(如，CHO-K1；ATCC CCL-61)、綠猴細(xì)胞系(COS)(如，COS1(ATCC CRL-1650)、COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠細(xì)胞(如，NS/O)、倉(cāng)鼠幼鼠腎臟(BHK)細(xì)胞系(如，ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人細(xì)胞(如，HEK293(ATCC CRL-1573))，以及組織培養(yǎng)中的植物細(xì)胞。另外合適的細(xì)胞系在本領(lǐng)域中是已知的并可購(gòu)自公開的保藏中心如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland。將外源性DNA引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、病毒載體和由Life Technologies Ltd，Paisley，UK所述的使用Lipofectamin2000的轉(zhuǎn)染方法。這些方法在本領(lǐng)域中是已知的，例如在Ausbel等人(eds.)，1996，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，New York，USA中所述的。按建立的方法進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，例如在Animal Cell Biotechnology，Methods and Protocols，Nigel Jenkins編，1999，Human Press Inc，Totowa，New Jersey，USA and Harrison MA and RaeIF，General Techniques of Cell Culture，Cambridge University Press 1997中的公開的。
在本發(fā)明生產(chǎn)方法中，細(xì)胞用本領(lǐng)域已知的方法在適于生產(chǎn)多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，細(xì)胞可以在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)振搖燒瓶培養(yǎng)、小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、成批、補(bǔ)料分批或固體狀態(tài)發(fā)酵)或在合適培養(yǎng)基和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵來(lái)發(fā)酵。培養(yǎng)在含有碳和氮源和無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)進(jìn)行。合適的培養(yǎng)基可商購(gòu)或可以按公開的組成來(lái)制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述的)。如果多肽分泌在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，多肽可從培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不被分泌，可從細(xì)胞裂解物中回收。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)回收所得多肽。例如，可通過(guò)常規(guī)方法包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法包括但不限于層析(如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(如，制備性等電聚焦)、溶解度差異(如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，如Protein Purification，J.-C.Jansonand Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)來(lái)純化多肽。在下列文獻(xiàn)中公開了純化具有G-CSF活性的多肽的具體方法由D.Metcalf和N.A.Nicola在The hemopoietic colony-stimulating factors，p.50-51，CambridgeUniversity Press(1995)中，由C.S.Bae等，在Appl.Microbiol.Biotechnol，52338-344(1999)和在US4,810,643中描述。
本發(fā)明的藥物組合物和其應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)一步包含本發(fā)明描述的多肽或偶聯(lián)物的組合物和至少一種可藥用載體或賦形劑。
用本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或藥物組合物可以制備治療某些疾病的藥物，尤其用于預(yù)防正接受某些類型的化療，放療和骨髓移植治療的癌癥患者的感染，在外周血前體細(xì)胞移植時(shí)用于動(dòng)員前體細(xì)胞匯聚，用于嚴(yán)重的慢性或相對(duì)的白細(xì)胞減少癥患者的治療，用于急性髓細(xì)胞性白血病患者的治療，用于AIDS病或其它的免疫缺陷病的治療，和抗真菌治療，尤其用于對(duì)全身性或侵襲性念珠菌病的治療。
另一方面，依照本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或藥物組合物應(yīng)用于治療患廣泛的造血疾病，包括放療或化療引發(fā)的那些造血疾病，尤其是白細(xì)胞減少癥，AIDS或其它的免疫缺陷病的患者，該方法包含給予患病的哺乳動(dòng)物上述多肽，偶聯(lián)物或藥物組合物。
將本發(fā)明的多肽和偶聯(lián)物以“治療有效的”劑量，即足以對(duì)給藥治療的疾病產(chǎn)生所期望的效果的劑量，給予患者。準(zhǔn)確的劑量將根據(jù)所要治療的疾病決定，且可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員用已知的技術(shù)確定。本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可以例如用類似于rhG-CSF，例如Neupogen的治療劑量給藥。本發(fā)明偶聯(lián)物的適當(dāng)劑量預(yù)計(jì)是在大約5-300μg/kg體重的范圍內(nèi)(根據(jù)偶聯(lián)物的蛋白部分的重量)，10-200μg/kg，例如25-100μg/kg。本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或組合物的有效量尤其依賴于，疾病，劑量和給藥的時(shí)間表，多肽或偶聯(lián)物或組合物是否單獨(dú)給藥或與其它的治療制劑結(jié)合給藥，組合物的血清半壽期，患者的一般健康狀況，和給藥的頻率，這些對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。優(yōu)選，本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物，制品或組合物以有效量給予，尤其所給劑量足以使所涉及的患者體內(nèi)白細(xì)胞，尤其是嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到正常。依照慣例通過(guò)每隔一定時(shí)間間隔簡(jiǎn)單地計(jì)數(shù)白細(xì)胞來(lái)確定白細(xì)胞數(shù)量是否已達(dá)到正常。
本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物優(yōu)選以包含一個(gè)或多個(gè)可藥用載體或賦形劑的組合物形式給藥?？砂讯嚯幕蚺悸?lián)物以本領(lǐng)域人人盡知的方式配制成藥物組合物以產(chǎn)生儲(chǔ)存十分穩(wěn)定且適合對(duì)人或動(dòng)物給藥的多肽藥物?？梢詫⑺幬锝M合物以多種形式配制，包括液態(tài)或凝膠體，或凍干的或任何其它的形式。優(yōu)選形式取決于所要治療的具體指征，這一點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。
因此，本發(fā)明提供治療各種形式的白細(xì)胞減少癥的組合物和方法。尤其本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或組合物可用來(lái)預(yù)防正接受某些類型的放療，化療和骨髓移植的癌癥患者的感染，在外周血前體細(xì)胞移植時(shí)用于動(dòng)員前體細(xì)胞匯聚，用于治療嚴(yán)重的慢性或相對(duì)的白細(xì)胞減少癥和用于患急性髓細(xì)胞性白血病患者的支持治療。另外，本發(fā)明的多肽，偶聯(lián)物或組合物可用于治療AIDS或其它的免疫缺陷病，用于抗真菌治療，尤其用于治療全身性或侵襲性念珠菌病，和用于治療細(xì)菌感染。
藥物的形式本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可以“原型”和/或以它們的鹽形式應(yīng)用。適當(dāng)?shù)柠}包括，但不限于，堿金屬鹽或堿土金屬鹽，例如鈉，鉀和鎂鹽，和例如鋅鹽。這些鹽和復(fù)合物可以作為一種水晶型和/或無(wú)定形的結(jié)構(gòu)存在。
賦形劑“可藥用的”是指一種所使用的劑量和濃度在接受藥物的患者體內(nèi)不產(chǎn)生任何不良作用的載體或賦形劑。上述可藥用的載體和賦形劑在本領(lǐng)域是人所共知的(參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack Publishing Company；Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins，S.Frokjaer和L.Hovgaard，Eds.，Taylor& Francis；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press)。
藥物的混合本發(fā)明的藥物組合物可以單獨(dú)給藥或與其它的治療劑結(jié)合給藥?？梢詫⑦@些制劑作為同一藥物組合物的一部分給藥，或與本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物分開，同時(shí)給藥或按照另一治療時(shí)間表給藥。另外，本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物或藥物組合物可以用作對(duì)其它治療的一種輔助治療。
患者本發(fā)明中的“患者”既包括人也包括其它哺乳動(dòng)物。所以一些對(duì)人治療和對(duì)牲畜使用的方法都是可應(yīng)用的。
給藥途徑本發(fā)明制劑可以多種方式給藥，包括但不限于，經(jīng)口服、皮下、靜脈內(nèi)、腦內(nèi)、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、肺內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、眼球內(nèi)或以任何其它可接受的方式給藥?？梢赃B續(xù)地灌輸給藥，盡管大藥丸注射劑是可接受的，但應(yīng)用技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的。
非胃腸道給藥劑(Parentals)藥物組合物的實(shí)例是設(shè)計(jì)成非腸道給藥的溶液劑。盡管在很多情況下，藥物溶液劑可以以適用于立即使用的液體制劑形式提供，但所述非腸道制劑也可以以冷凍或凍干形式提供。在前者情況下，所述組合物在使用前必須解凍。后一劑型通常用于增強(qiáng)組合物中所包含的活性組分在各種貯存條件下的穩(wěn)定性，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣，凍干制劑通常比其液體相應(yīng)物更穩(wěn)定。所述凍干制劑在使用前通過(guò)加入一種或多種適宜的可藥用稀釋劑如滅菌注射用水或滅菌生理鹽水溶液重新配制。
在非胃腸道給藥的情況下，制成凍干制劑或水溶液備用，如通過(guò)將具有所需純度的多肽與一種或多種本領(lǐng)域常用的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(統(tǒng)稱為“賦形劑”)適當(dāng)混合來(lái)制備，賦形劑如緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑、非離子去污劑、抗氧化劑和/或其它各種添加劑。
緩沖劑有助于將pH保持在接近生理?xiàng)l件的范圍中。它們通常以大約2mM-50mM的濃度范圍存在。本發(fā)明使用的合適緩沖劑包括有機(jī)和無(wú)機(jī)酸及其鹽如檸檬酸鹽緩沖劑(如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖劑(如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖劑(如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖劑(如，富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸(gluconate)鹽緩沖劑(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖劑(如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖劑(如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩沖劑(如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。其它可能的緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑和三甲胺鹽如Tris。
加入防腐劑來(lái)阻滯微生物生長(zhǎng)，加入的量通常約為0.2％-1％(w/v)。本發(fā)明使用的合適防腐劑包括酚、苯甲醇、間甲酚、羥苯甲酸(paraben)甲酯、羥苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基銨氯化物、苯亞甲基 鹵化物(如苯亞甲基 氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷雙胺、羥苯甲酸烷基酯如甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。
可以加入等滲劑來(lái)確保液體組合物的等滲性，等滲劑包括多羥糖醇，優(yōu)選三羥或更高級(jí)糖醇，如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羥基醇的量可為0.1％-25％重量比，通常為1％-5％，以其它組分的相對(duì)量計(jì)算。
穩(wěn)定劑涉及一大類賦形劑，其功能范圍從膨脹劑到溶解治療劑的或有助于防止變性或與容器壁粘合的添加劑。通常的穩(wěn)定劑可以是多羥糖醇(上文列舉的)；氨基酸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等，有機(jī)糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)醇如環(huán)己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即＜10個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；單糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖?；诨钚缘鞍踪|(zhì)重量計(jì)算，穩(wěn)定劑通常的存在范圍為0.1-10000重量份。
可以存在非離子表面活性劑或清潔劑(也稱作“濕潤(rùn)劑”)以有助于溶解治療劑以及保護(hù)治療性多肽來(lái)避免攪拌誘導(dǎo)的聚集，其也允許配方劑暴露于剪切表面壓力而沒(méi)有引起多肽變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(吐溫20、吐溫80等)。
其它各種賦形劑包括膨脹劑或填充劑(如淀粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、蛋氨酸、維生素E)和共溶劑。
活性組分也可以被包裹在制備的微囊中，例如通過(guò)coascervation技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的，例如羥甲基纖維素、明膠或聚(甲基甲丙烯酸酯)微囊，包裹在膠體狀藥物釋放體系(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)中或包裹在大乳劑中。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(同上)中公開了這些技術(shù)。
體內(nèi)給藥所使用的非胃腸道制劑必須是滅菌的。該過(guò)程容易完成，例如，通過(guò)無(wú)菌濾膜來(lái)過(guò)濾。
持續(xù)釋放制劑持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有多肽或偶聯(lián)物的固體疏水聚合物半滲透材料、具有合適形式如膜或微囊的材料。持續(xù)釋放材料的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基甲丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease技術(shù)或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能夠長(zhǎng)時(shí)間釋放分子如長(zhǎng)達(dá)或超過(guò)100天，某些水凝膠在較短時(shí)間內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。包囊中的多肽長(zhǎng)時(shí)間保留在體內(nèi)時(shí)，它們因在37℃潮濕的環(huán)境中暴露而變性或聚集，導(dǎo)致喪失生物學(xué)活性并且可能改變免疫原性。合理的穩(wěn)定策略可根據(jù)所涉及的機(jī)理設(shè)計(jì)。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)理是通過(guò)硫代二硫化物相互交換形成分子內(nèi)S-S鍵，那么可通過(guò)修飾巰基、凍干酸性溶液、控制含濕量、使用適宜的添加劑和開發(fā)特異性聚合物型組合物來(lái)達(dá)到穩(wěn)定。
肺釋放適于與霧化劑(噴射或超聲霧化劑)一起使用的偶聯(lián)物制劑通常包含以每ml溶液大約0.01-25mg偶聯(lián)物，優(yōu)選大約0.1-10mg/ml的濃度溶于水中的偶聯(lián)物。所述制劑也可以包含緩沖劑和簡(jiǎn)單的糖(例如用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)滲透壓)，和/或0.1-10mg/ml濃度范圍的人血清白蛋白?？墒褂玫木彌_劑的實(shí)例為醋酸鈉、枸櫞酸鈉和甘氨酸。優(yōu)選地，所述緩沖劑將將含有適用于調(diào)節(jié)溶液的pH在3-9范圍的組成和克分子濃度。通常，1mM-50mM的緩沖劑克分子濃度適用于該目的?？墒褂玫奶堑膶?shí)例為乳糖、麥芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖和木糖，通常用量為所述制劑重量的1％-10％范圍。
所述霧化制劑也可以包含表面活性劑用于減少或防止在形成氣霧劑時(shí)溶液霧化引起的蛋白質(zhì)的表面誘導(dǎo)性聚集?？墒褂酶鞣N常規(guī)的表面活性劑，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧化乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。用量通常在所述配方劑重量的0.001-4％范圍。本發(fā)明特別優(yōu)選的表面活性劑是聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯。
產(chǎn)生適宜的本發(fā)明液體微粒分散體的特定制劑和方法描述于WO9420069、US5915378、US5960792、US5957124、US5934272、US5915378、US5855564、US5826570和US5522385，所有文獻(xiàn)引入本文供參考。
用于與可計(jì)量劑量的吸入裝置一起使用的偶聯(lián)物制劑通常包括細(xì)粉。該粉劑可通過(guò)凍干，然后研磨液體偶聯(lián)物制劑制備并且也可以包含穩(wěn)定劑如人血清白蛋白(HAS)。通常，加入超過(guò)0.5％(w/w)的HAS。因此，如果需要，可將一種或多種糖或糖醇加到所述制劑中。其實(shí)例包括乳糖、麥芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇、山梨糖、海藻糖、木糖醇和木糖，制劑中所加入的量可在本發(fā)明偶聯(lián)物的大約0.01％-200％(w/w)范圍，優(yōu)選大約為1-50％。然后，將所述制劑凍干并研磨至所需粒度。
然后，將適宜大小的微粒在表面活性劑的輔助下懸浮在推進(jìn)劑中。所述推進(jìn)劑可以是適用于本發(fā)明目的的任何常規(guī)物質(zhì)，如含氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或烴，包括三氯氟甲烷、二氯氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其組合。適宜的表面活性劑包括三油酸山梨糖醇酯和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性劑。然后，將混合物裝入釋放裝置中。適用于本發(fā)明的市售可計(jì)量劑量的吸入器的實(shí)例為由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C.生產(chǎn)的Ventolin可計(jì)量劑量吸入器。
所述與粉末吸入器一起使用的偶聯(lián)物制劑將包括含有偶聯(lián)物的極細(xì)干粉末并且也可以包含膨脹劑，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇，其促進(jìn)粉末從裝置中分散的量，例如為所述制劑重量的50％-90％。所述粉末微粒在肺中應(yīng)該具有與直徑中度值小于10微米，優(yōu)選在0.5-5微米之間，最優(yōu)選在1.5-3.5微米之間，密度大約為1g/cm2的微粒相當(dāng)?shù)臍鈩?dòng)性。適用于本說(shuō)明書的粉末吸入器的實(shí)例為Fisons Corp.，Bedford，Mass.生產(chǎn)的旋轉(zhuǎn)吸入型(Spinhaler)粉末吸入器。
應(yīng)用于這些裝置的粉末可以按US5,997,848，US5,993,783，US5,985,248，US5,976574，US5,922,354，US5,785,049和US5,654,007中公開的方法制備和/或傳輸。
為肺部傳輸治療產(chǎn)品設(shè)計(jì)的機(jī)械裝置包括但不限制于霧化器、可計(jì)量劑量吸入器和粉末吸入器，所有這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。一些適用于本發(fā)明的市售裝置的特定實(shí)例為由Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Missouri生產(chǎn)的Ultravent霧化器，由Marquest Medical Products，Englewood，Colorado生產(chǎn)的Acorn II霧化器，由Glaxo Inc.，Research Triangle Park，North Carolina生產(chǎn)的Ventolin可計(jì)量劑量吸入器；由Fisons Corp.，Bedford，Massachusetts制造的旋轉(zhuǎn)吸入型粉末吸入器；“持續(xù)霧化”裝置，Inhale Therapeutic System，Inc.，San Carlos，California；由Alkermes，Cambridge，Massachusetts制造的AIR吸入器；和由Aradigm Corporation，Hayward，California制造的AERx肺部藥物釋放系統(tǒng)。
也關(guān)注編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列在基因治療中的應(yīng)用。特別感興趣的是按上文“本發(fā)明偶聯(lián)物中的非多肽組分是糖”章節(jié)中所述方法使用編碼多肽的核苷酸序列。因此，在基因治療過(guò)程中即核苷酸序列在人體內(nèi)表達(dá)后完成多肽的糖基化。
關(guān)注的基因治療的應(yīng)用包括對(duì)那些期待多肽能提供有效治療的疾病的治療。所述治療包括對(duì)各種類型的白細(xì)胞減少癥的治療，尤其用于預(yù)防正接受某些類型的化療和骨髓移植，外周前體細(xì)胞移植時(shí)對(duì)前體細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)員，匯聚治療的患者的感染，包括對(duì)嚴(yán)重的慢性或相對(duì)的白細(xì)胞減少癥的治療，對(duì)急性髓細(xì)胞性白血病患者的治療，對(duì)AIDS或其它免疫缺陷病的治療。
基因治療的G-CSF的局部傳輸可使治療劑到達(dá)靶部位而避免了與非特異性給藥有關(guān)的潛在毒性問(wèn)題。
本發(fā)明還涉及體外和體內(nèi)基因治療方法學(xué)。
將潛在的治療基因轉(zhuǎn)移到特定細(xì)胞群中的一些方法是已知的?？蛇M(jìn)一步參見如，Mulligan，“The Basic Science Of Gene Therapy”，Science，260，pp.926-31(1993)。這些方法包括直接的基因轉(zhuǎn)移，如Wolff等人在“Direct Gene Transfer Into MouseMuscle In vivo”，Science 247，pp.1465-68(1990)中公開的；脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，如，Caplen等人在“Liposome-mediated CFTRGene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis”NatureMed.，3，pp.39-46(1995)中；Crystal在“The Gene As A Drug”，Nature Med.，1，pp.15-17(1995)中和Gao and Huang在“A Novel Cationic Liposome ReagentFor Efficient Transfection of Mammalian Cells”，Biochem.Biophys Res.Comm.，179，pp.280-85(1991)中公開的；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移，如，Kay等人在“In vivo Gene Therapy ofHemophilia BSustained Partial Corretion In Factor IX-Deficient Dogs”，Science，262，pp.117-19(1993)中，Anderson在“Human Gene Therapy”，Science，256，pp.808-13(1992)中公開的；DNA病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。這些DNA病毒包括腺病毒(優(yōu)選基于Ad-2或Ad-5的載體)、皰疹病毒(優(yōu)選基于單純皰疹病毒的載體)和微小病毒(優(yōu)選基于“缺損”或非自主微小病毒的載體，更優(yōu)選基于腺伴隨病毒的載體，最優(yōu)選基于AAV-2的載體)。如參見，Ali等人“The Use Of DNA Viruses asVectors for Gene Therapy”，Gene Therapy，1，pp.367-84(1994)；US4797368和US5139941。
下面在非限制性的實(shí)施例中對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述。


圖1rhG-CSF(Neupogen)和SPA-PEG 5000-偶聯(lián)的hG-CSF K16RK34R K40R Q70K Q90K Q120K的體內(nèi)半壽期。
圖2rhG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 5000-偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34RK40R Q70K Q120K和SPA-PEG 5000-偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34R K40RQ70K Q90K Q120K的體內(nèi)生物學(xué)活性。
圖3rhG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 12000偶聯(lián)的hG-CSF K16RK34R K40R和不同劑量的SPA-PEG 5000-偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34RK40R Q70K Q90K Q120K的體內(nèi)生物學(xué)活性。
序列表所附序列表包含以下序列SEQ ID NO1人G-CSF的氨基酸序列。
SEQ ID NO2編碼人G-CSF的合成的DNA序列，具有利于在大腸桿菌中最佳表達(dá)的密碼子使用特性。
SEQ ID NO3OmpA信號(hào)序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO4編碼OmpA信號(hào)序列的合成的DNA序列。
SEQ ID NO5合成的組氨酸標(biāo)記物。
SEQ ID NO6編碼SEQ ID NO5所示組氨酸標(biāo)記物的合成的DNA序列。
SEQ ID NO7人G-CSF信號(hào)肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO8編碼人G-CSF，包括SEQ ID NO7所示信號(hào)肽的，合成的DNA序列，其具有適于在CHO細(xì)胞中最佳表達(dá)的密碼子使用特性。
材料與方法確定所要修飾的氨基酸的方法可接近的表面區(qū)域(ASA)
通過(guò)NMR波譜儀確定的10種結(jié)構(gòu)的3D全貌(Zink et al.，(1994)Biochemistry338453-8463)可從蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank)(PDB)(www.rcsb.org/pdb/)中獲得?？蓪⒃撔畔⑤斎胗?jì)算機(jī)程序Access(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55379-400(1971))版本2(Copyright 1983 YaleUniversity)并用于計(jì)算結(jié)構(gòu)中各個(gè)原子的可接近的表面區(qū)域(ASA)。該方法通常使用1.4大小的探針并將可接近的表面區(qū)域(ASA)定義為探針中心形成的面積。于該計(jì)算前，從坐標(biāo)中去除所有水分子和所有氫原子，以及其它不與該蛋白質(zhì)直接相連的原子。
側(cè)鏈的分部(fractional)ASA側(cè)鏈原子的分部ASA通過(guò)側(cè)鏈中原子的ASA總和除以延長(zhǎng)的ALA-x-ALA三肽中該殘基類型側(cè)鏈原子的ASA代表值來(lái)計(jì)算。參見Hubbard，Campbell & Thomton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在該例中，CA原子被看作甘氨酸殘基側(cè)鏈的一部分但不被看作其它殘基的一部分。下表表示側(cè)鏈的100％ASA標(biāo)準(zhǔn)Ala 69.23 A2Leu 140.76 A2Arg 200.35 A2Lys 162.50 A2Asn 106.25 A2Met 156.08 A2Asp 102.06 A2Phe 163.90 A2Cys 96.69 A2Pro 119.65 A2Gln 140.58 A2Ser 78.16 A2Glu 134.61 A2Thr 101.67 A2Gly 32.28 A2Trp 210.89 A2His 147.00 A2Tyr 176.61 A2Ile 137.91 A2Val 114.14 A2該結(jié)構(gòu)中未探測(cè)到的殘基被定義為100％暴露，因?yàn)榭梢哉J(rèn)為這些殘基位于彈性區(qū)域。
確定原子之間的距離用分子制圖軟件，例如InsightIIO v.98.0，MSI INC可以非常容易地確定原子之間的距離。
對(duì)所要修飾的殘基的總體考慮事項(xiàng)如上所述，依照本發(fā)明需要修飾的氨基酸殘基優(yōu)選是下述氨基酸殘基其側(cè)鏈表面是暴露的，尤其其側(cè)鏈的25％以上暴露在分子表面，更優(yōu)選50％以上的側(cè)鏈暴露在分子表面。另一種考慮是優(yōu)選將位于受體接觸面上的殘基排除以免其對(duì)受體的結(jié)合或活化可能產(chǎn)生干擾或至少使干擾降低到最小。進(jìn)一步考慮的是應(yīng)該將距離最近的lys(Glu，Asp)CB-CB(對(duì)Gly而言為CA)不足10的殘基排除。最后，優(yōu)選的修飾部位具體是具有親水和/或帶電殘基，即Asp，Asn，Glu，Gln，Arg，His，Tyr，Ser和Thr的那些，具有精氨酸殘基的部位尤其優(yōu)選。
對(duì)進(jìn)行修飾的G-CSF氨基酸殘基的確定以下例舉了確定本發(fā)明所要修飾的氨基酸殘基時(shí)一般應(yīng)該考慮的因素。
對(duì)應(yīng)用X線晶體學(xué)(Hill et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905167-5171)和NMR波譜學(xué)方法(Zink et al.，(1994)Biochemistry338453-8463)得到的人G-CSF三維結(jié)構(gòu)已有報(bào)道。如上所述，Aritomi等(nature 401713-717，1999)已確定以下hG-CSF殘基為受體結(jié)合界面的一部分G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，512，L15，K16，E19，Q20，L108，D109，D112，T115，T116，Q119，E122，E123，和L124。因此，盡管可以對(duì)這些殘基進(jìn)行修飾，但優(yōu)選不修飾這些殘基。
通過(guò)將Zink等(1994)確定的G-CSF的10種NMR結(jié)構(gòu)用作輸入結(jié)構(gòu)，然后計(jì)算側(cè)鏈的平均ASA，而將以下殘基確定為具有25％以上的ASAM0，T1，P2，L3，G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，F(xiàn)13，L14，L15，K16，C17，E19，Q20，V21，R22，K23，Q25，G26，D27，A29，A30，E33，K34，C36，A37，T38，Y39，K40，L41，H43，P44，E45，E46，V48，L49，L50，H52，S53，L54，I56，P57，P60，L61，S62，S63，P65，S66，Q67，A68，L69，Q70，L71，A72，G73，C74，S76，Q77，L78，S80，F(xiàn)83，Q86，G87，Q90，E93，G94，S96，P97，E98，L99，G100，P101，T102，D104，T105，Q107，L108，D109，A111，D112，F(xiàn)113，T115，T116，W118，Q1 19，Q120，M121，E122，E123，L124，M126，A127，P128，A129，L130，Q131，P132，T133，Q134，G135，A136，M137，P138，A139，A141，S142，A143，F(xiàn)144，Q145，R146，R147，S155，H156，Q158，S159，L161，E162，V163，S164，Y165，R166，V167，L168，R169，H170，L171，A172，Q173，P174。
同樣，以下殘基具有50％以上ASAM0，T1，P2，L3，G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，F(xiàn)13，L14，L15，K16，C17，E19，Q20，R22，K23，G26，D27，A30，E33，K34，T38，K40，L41，H43，P44，E45，E46，L49，L50，S53，P57，P60，L61，S62，S63，P65，S66，Q67，A68，L69，Q70，L71，A72，G73，S80，F(xiàn)83，Q90，G94，P97，E98，P101，D104，T105，L108，D112，F(xiàn)113，T115，T116，Q119，Q120，E122，E123，L124，M126，P128，A129，L130，Q131，P132，T133，Q134，G135，A136，A139，A141，S142，A143，F(xiàn)144，R147，S155，S159，E162，R166，V167，R169，H170，L171，A172，Q173，P174。
用分子制圖程序InsightIIv.98.0確定以下殘基，它們具有距離最近的氨基15以上的CB原子(在甘氨酸的情況下是CA)，這樣的原子被確定為賴氨酸的NZ原子和N末端殘基T1的N原子。以下所列包括在10種NMR結(jié)構(gòu)的至少一種中滿足這一標(biāo)準(zhǔn)的殘基。G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，L14，L15，L18，V21，R22，Q25，G26，D27，G28，A29，Q32，L35，C36，T38，Y39，C42，H43，P44，E45，E46，L47，V48，L49，L50，G51，H52，S53，L54，G55，156，P57，W58，A59，P60，L61，S62，S63，C64，P65，S66，Q67，A68，L69，Q70，L71，A72，G73，C74，L75，S76，Q77，L78，H79，S80，G81，L82，F(xiàn)83，L84，Y85，Q86，G87，L88，L89，Q90，A91，L92，E93，G94，I95，S96，P97，E98，L99，G100，P101，T102，L103，D104，T105，L106，Q107，L108，D109，V110，A111，D112，F(xiàn)113，A114，T115，T116，I117，W118，Q119，Q120，M121，E122，E123，L124，G125，M126，A127，P128，A129，L130，Q131，P132，T133，Q134，G135，A136，M137，P138，A139，F(xiàn)140，A141，S142，A143，P144，Q145，R146，R147，A148，G149，G150，V151，L152，V153，A154，S155，H156，L157，Q158，S159，F(xiàn)160，L161，E162，V163，S164，Y165，R166，V167，L168，R169，H170，L171，A172，Q173，P174。
分子制圖程序InsightIIv.98.0也用于確定以下殘基，它們具有距離最近的氨基10A以上的CB原子(在甘氨酸的情況下是CA)，這樣的原子被確定為天冬氨酸的CG原子，谷氨酸的CD原子和C末端殘基P174的C原子。以下所列包括在10種NMR結(jié)構(gòu)的至少一種中滿足這一標(biāo)準(zhǔn)的殘基。M0，T1，P2，L3，G4，P5，A6，S7，S8，L9，P10，Q11，S12，P13，L14，T38，Y39，K40，M1，C42，L50，G51，H52，S53，L54，G55，I56，P57，W58，A59，P60，L61，S62，S63，C64，P65，S66，Q67，A68，L69，Q70，L71，A72，G73，C74，L75，S76，Q77，L78，H79，S80，G81，L82，F(xiàn)83，L84，Y85，Q86，G87，L88，I117，M126，A127，P128，A129，L130，Q131，P132，T133，Q134，G135，A136，M137，P138，A139，F(xiàn)140，A141，S142，A143，F(xiàn)144，Q145，R146，R147，A148，G149，G150，V151，L152，V153，A154，S155，H156，L157，V167，L168，R169，H170，L171。
綜合以上所列并經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，有可能選擇單個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行修飾，從而產(chǎn)生一組的有限數(shù)目的氨基酸殘基，它們?cè)谔囟℅-CSF多肽中的修飾很可能產(chǎn)生所期望的特性。
hG-CSF和其變體的PEG化方法hG-CSF和其變體在溶液中PEG化人hG-CSF和其變體在50mM磷酸鈉，100mM NaCl，pH8.5的溶液中以250μg/ml的濃度進(jìn)行PEG化。PEG的摩爾數(shù)超過(guò)所述蛋白上PEG化位點(diǎn)的100倍。將反應(yīng)混合物放入37℃熱混合器中，1200rpm，30分鐘。30分鐘后，加入摩爾數(shù)過(guò)量的甘氨酸終止反應(yīng)。
用陽(yáng)離子交換層析去除反應(yīng)混合物中過(guò)量的PEG，甘氨酸和其它副產(chǎn)品。用20mM檸檬酸鈉pH2.5稀釋PEG化反應(yīng)混合物至離子強(qiáng)度7mS/cm以下。用5N HCl調(diào)整pH值至2.5。將上述混合物加到用20mM檸檬酸鈉pH2.5平衡過(guò)的SP-sepharose FF柱上。用4個(gè)柱體積的平衡緩沖液將未結(jié)合的物質(zhì)從柱上洗下來(lái)。用20mM的檸檬酸鈉，750mM氯化鈉以三個(gè)柱體積洗脫P(yáng)EG化蛋白。濃縮純PEG化G-CSF并用分子量截留值(mwco)為10kDa的VivaSpin濃縮儀對(duì)其進(jìn)行緩沖液的交換。
有G-CSF活性的標(biāo)記多肽在微量滴定板中的PEG化表達(dá)攜帶適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物，例如上述一般描述中列舉的任何一種標(biāo)記物，并顯示G-CSF活性的多肽，然后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至能固定標(biāo)記多肽的微量滴定板的一個(gè)或多個(gè)孔中。當(dāng)標(biāo)記物是Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln時(shí)，使用可購(gòu)自QIAGEN的鎳-氨三乙酸(Ni-NTA)HisSorb微量滴定板。
將標(biāo)記多肽固定到微量滴定板，然后用適于結(jié)合和隨后PEG化的緩沖液洗滌各孔，然后與選擇的活化PEG一起溫育。例如，可使用ShearwaterPolymers的M-SPA-5000。應(yīng)使活化的PEG與多肽的摩爾比優(yōu)化，但通常大于10∶1，例如大約100∶1或更高。室溫反應(yīng)合適的時(shí)間，通常約1小時(shí)后，除去活化的PEG溶液以便中止反應(yīng)。偶聯(lián)蛋白通過(guò)與適當(dāng)?shù)木彌_液溫育而從微量滴定板中被洗脫下來(lái)。適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液可能包含咪唑，過(guò)量NTA或另一種螯合化合物。分析所述偶聯(lián)蛋白的相應(yīng)生物學(xué)活性和免疫原性?？扇芜x使用本領(lǐng)域公知的方法，如使用二氨基肽酶將該標(biāo)記物切割下來(lái)并用GCT(谷氨酰環(huán)轉(zhuǎn)移酶)將1-位的Gln轉(zhuǎn)化為焦谷氨?；詈笥肞GAP(焦-谷氨?；?氨肽酶)將其切割下來(lái)，產(chǎn)生無(wú)標(biāo)記的蛋白質(zhì)。該方法包括幾步驟金屬螯合親和層析?；蛘撸梢詫⒔?jīng)過(guò)標(biāo)記的多肽進(jìn)行偶聯(lián)。
有一個(gè)封閉的受體結(jié)合位點(diǎn)的hG-CSF活性多肽的PEG化為了使hG-CSF以一定方式最佳PEG化，并保證參與受體識(shí)別的賴氨酸不被PEG化，已經(jīng)開發(fā)了下列方法純化的hG-CSF如實(shí)施例3中描述的方法獲得。hG-CSF多肽和G-CSF受體可溶性功能域以2∶2化學(xué)計(jì)量組成的同型二聚體復(fù)合物在磷酸鹽緩沖液(PBS)pH 7中形成。hG-CSF多肽的濃度是大約20ug/ml或1uM且受體以相同的摩爾濃度存在。
將來(lái)自Shearwater Polymers，Inc的M-SPA-5000以相當(dāng)于比hG-CSF多肽過(guò)量5，20和100摩爾的三種不同濃度加入。反應(yīng)時(shí)間為室溫30分鐘。反應(yīng)了30分鐘后，將反應(yīng)混合物調(diào)為pH2.0，且將反應(yīng)混合物上樣至VydacC18柱上，然后基本上按已描述的方法(Utsumi等，J.Biochem.，Vol.101，1199-1208，(1987)用乙腈梯度液洗脫?；蛘?，可使用異丙醇梯度洗脫。
用本文描述的初步篩選試驗(yàn)對(duì)各組分進(jìn)行分析，然后將上述方法獲得的活性PEG化hG-CSF多肽于-80℃儲(chǔ)存在包含1mg/ml人血清白蛋白(HSA)的PBS pH7中。
用于確定偶聯(lián)和非偶聯(lián)型hG-CSF和其變體的特性的方法確定hG-CSF和其變體的分子大小偶聯(lián)型或非偶聯(lián)型hG-CSF或其變體的分子量可以通過(guò)SDS-PAGE，凝膠過(guò)濾，基質(zhì)輔助的激光解吸附質(zhì)譜測(cè)定法(matrix assisted laser desorptionmass spectrometry)或者平衡離心法確定。
確定多肽濃度用280nm光密度檢測(cè)法，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，或本領(lǐng)域熟知的其它此類免疫檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)多肽的濃度。而且，樣品中的多肽濃度也可用Biacore儀器用包被了該多肽特異性抗體的Biacore芯片進(jìn)行檢測(cè)。
將上述抗體通過(guò)多種化學(xué)方法共價(jià)偶聯(lián)到Biacore芯片上?；蛘?，使抗體非共價(jià)結(jié)合，例如通過(guò)特異性針對(duì)抗多肽抗體Fc部分的抗體來(lái)結(jié)合。將Fc特異性抗體首先共價(jià)偶聯(lián)到芯片上。然后使抗多肽抗體流過(guò)該芯片并被第一抗體直接結(jié)合。進(jìn)一步地，可用鏈霉親和素包被的表面(例如BiacoreSensor Chip SA)固定生物素化抗體(Real-Time Analysis of BiomolecularInteractions，Nagata and Handa(Eds.)，2000，Springer Verlag，Tokyo；Biacore2000 Instrument Handbook，1999，Biacore AB)。
當(dāng)樣品流過(guò)該芯片時(shí)，多肽將結(jié)合到包被抗體上且質(zhì)量的增加能得到檢測(cè)?？捎靡阎獫舛鹊亩嚯闹破防L出標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨后確定樣品中多肽的濃度。每次注射樣品后，通過(guò)能去除結(jié)合型分析物的適當(dāng)洗脫液(例如低pH值的緩沖液)使傳感器芯片再生。
通常，所應(yīng)用的抗體是抗野生型多肽的單克隆抗體。在野生型多肽中引入突變或其它操作(額外糖基化或聚合物偶聯(lián))可以改變上述抗體的識(shí)別。進(jìn)一步地，能使多肽的分子量增加的操作將使胞質(zhì)基因共振信號(hào)(plasmonresonance signal)增強(qiáng)。因此，有必要對(duì)每一種待測(cè)分子建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
檢測(cè)偶聯(lián)和非偶聯(lián)型hG-CSF和其變體的體外和體內(nèi)活性的方法初步試驗(yàn)1-體外G-CSF活性試驗(yàn)鼠細(xì)胞系NFS-60(從Dr.J.Ihle，St.Jude Children′s，Research Hospital，Tennessee，USA獲得)的增殖依賴于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中活性G-SCF的存在。因此，hG-CSF和其變體的體外生物學(xué)活性可以如下檢測(cè)，把G-CSF樣品加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，溫育一段時(shí)間后檢測(cè)正在分裂的NFS-60細(xì)胞的數(shù)量。
將NFS-60細(xì)胞培養(yǎng)在包含10％w/w FBS(胎牛血清)，1％w/w Pen/Strep，每升10μg的hG-CSF和2mM Glutamax的Iscoves DME培養(yǎng)基中。在加入樣品前，用無(wú)hG-CSF的生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后稀釋細(xì)胞至2.2×105細(xì)胞/ml的濃度。加100μl細(xì)胞懸液至96孔微滴定板(Corning)的每孔中。
包含偶聯(lián)型或非偶聯(lián)型G-CSF或其變體的樣品用生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋至濃度達(dá)到1.1×10-6M至1.1×10-13M。每種樣品取10μl加至包含NFS-60細(xì)胞的3個(gè)孔中。由10μl哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)培養(yǎng)基組成的對(duì)照加在每個(gè)微滴定板的8個(gè)孔中。細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)(37℃，5％CO2)后用WST-1細(xì)胞增殖劑(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany)對(duì)每個(gè)孔中正在分裂的細(xì)胞進(jìn)行定量。各孔加0.01ml WST-1，然后在5％CO2的空氣環(huán)境下37℃溫育150min?；罴?xì)胞中線粒體脫氫酶分解四唑鹽WST-1形成甲臜(formazan)，該產(chǎn)物可通過(guò)450nm下的吸光率定量。從而對(duì)每個(gè)孔中的活細(xì)胞進(jìn)行定量。
在上述檢測(cè)基礎(chǔ)上，計(jì)算每種偶聯(lián)和非偶聯(lián)G-CSF分子或其變體的劑量反應(yīng)曲線，然后確定每種分子的EC50值。該值等于獲得非偶聯(lián)的人G-CSF的最大增殖活性的50％所必需的活性G-CSF蛋白的量。所以，EC50值是對(duì)給定蛋白的體外活性的直接測(cè)量。
初步試驗(yàn)2-體外G-CSF活性試驗(yàn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠造血細(xì)胞系BaF3，該質(zhì)粒攜帶人G-CSF受體基因，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，fos的啟動(dòng)子和其后的螢光素酶報(bào)告基因。用G-CSF樣品刺激上述細(xì)胞系，多種細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)引發(fā)對(duì)fos表達(dá)的刺激，隨后導(dǎo)致螢光素酶的表達(dá)。這種刺激可以通過(guò)Steady-GloTM螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Promega，Cat.No.E2510)監(jiān)測(cè)，籍此可以對(duì)G-CSF樣品的體外活性進(jìn)行檢測(cè)。
在37℃潮濕的5％CO2空氣環(huán)境下，在完全培養(yǎng)基(RPMI-1640/HEPES(Gibco/BRL，Cat.No.22400)，10％FBS(HyClone，特定的)，1×青霉素/鏈霉素(Gibco/BRL，Cat.No.15140-122)，1×L-谷氨酰胺，(Gibco/BRL，Cat.No.25030-081)，10％WEHI-3培養(yǎng)液(可產(chǎn)生muIL-3)中培養(yǎng)BaF3/hGCSF-R/pfos-lux細(xì)胞，使其生長(zhǎng)到5×105細(xì)胞/mL的密度(匯合的)。每2-3天以大約2×104細(xì)胞/mL進(jìn)行再接種。
在檢測(cè)的前一天，將對(duì)數(shù)期細(xì)胞以2×105細(xì)胞/mL懸浮在饑餓培養(yǎng)基中(DMEM/F-12(Gibco/BRL，Cat.No.11039)，1％BSA(Sigma，Cat.No.A3675)，I×青霉素/鏈霉素(Gibco/BRL，Cat.No.15140-122)，1×L-谷氨酰胺(Gibco/BRL，Cat.No.25030-081)，0.1％WEHI-3培養(yǎng)液)，維持饑餓狀態(tài)20小時(shí)。然后用PBS洗滌細(xì)胞兩次并用臺(tái)盼蘭活性染色法檢測(cè)所述細(xì)胞的活性。將細(xì)胞以4×106細(xì)胞/mL的濃度重新懸浮在試驗(yàn)培養(yǎng)基中(RPMI-1640(無(wú)酚紅，Gibco/BRL，Cat.No.11835)，25mM HEPES，1％BSA(Sigma，Cat.No.A3675)，1×青霉素/鏈霉素(Gibco/BRL，Cat.No.15140-122)，I×L-谷氨酰胺(Gibco/BRL，Cat.No.25030-08 1)，然后96孔微滴定板(Corning)中每孔加50μl所述細(xì)胞。用試驗(yàn)培養(yǎng)基將包含偶聯(lián)型或非偶聯(lián)型G-CSF或其變體的樣品稀釋到濃度為1.1×10-7M至1.1×10-12M。每種樣品50μl加入包含BaF3/hGCSF-R/pfos-lux細(xì)胞的三個(gè)孔中。將陰性對(duì)照50μl培養(yǎng)基加入到每塊微滴定板的8個(gè)孔中。將平板輕輕混合并于37℃保溫2小時(shí)。依照PromegaSteady-GloTM的操作步驟(Promega Steady-GIo螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)，Cat.No.E2510)檢測(cè)螢光素酶的活性。每孔加100μl底物，然后輕輕混勻。在TopCount發(fā)光儀(Packard)上以SPC(單光子計(jì)數(shù))的模式檢測(cè)發(fā)光。
根據(jù)上述檢測(cè)，可以繪出每種偶聯(lián)和非偶聯(lián)G-CSF分子或其變體的劑量反應(yīng)曲線，之后，可確定每種分子的EC50值。
第二步試驗(yàn)-G-CSF或其變體與hG-CSF受體的結(jié)合層析應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)rhG-CSF或其變體與hG-CSF受體的結(jié)合進(jìn)行研究。所述受體可以是純化的細(xì)胞外受體功能區(qū)，結(jié)合到純化的細(xì)胞漿膜上的受體，或整個(gè)細(xì)胞，這些細(xì)胞可以是天然表達(dá)G-CSF受體的細(xì)胞系(例如NFS-60)或用編碼所述受體的cDNAs轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。rhG-CSF或其變體與天然hG-CSF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)的能力可通過(guò)其與標(biāo)記后的G-CSF-類似物，例如生物素化的hG-CSF或放射性碘標(biāo)記的hG-CSF共同溫育進(jìn)行分析。這種檢測(cè)的實(shí)例由Yamasaki等(Drugs.Exptl.Clin.Res.24191-196(1998))描述。
可選擇地將hG-CSF受體的細(xì)胞外功能域偶聯(lián)到Fc上且將其固定到96孔板上。隨后加入RhG-CSF或其變體，它們的結(jié)合可以用特異性的抗hG-CSF抗體或生物素化的或放射性碘標(biāo)記的hG-CSF進(jìn)行檢測(cè)。
對(duì)偶聯(lián)型或非偶聯(lián)型rhG-CSF和其變體的體內(nèi)半壽期的檢測(cè)本發(fā)明一個(gè)重要方面是延長(zhǎng)生物學(xué)半壽期，這可以通過(guò)構(gòu)建以下hG-CSF實(shí)現(xiàn)，其中的多肽與聚合物組分偶聯(lián)或不偶聯(lián)。hG-CSF血清濃度的快速消減使評(píng)估對(duì)使用偶聯(lián)型和非偶聯(lián)型hG-CSF及其變體進(jìn)行的治療的生物學(xué)反應(yīng)變得重要。優(yōu)選，在靜脈內(nèi)(i.v.)給藥后，本發(fā)明的偶聯(lián)型和非偶聯(lián)型hG-CSF和其變體也具有延長(zhǎng)的血清半壽期，使例如ELISA方法或初步篩選檢測(cè)成為可能。體內(nèi)生物半壽期的檢測(cè)按照以下描述進(jìn)行。
應(yīng)用雄性Sprague Dawley大鼠(7周齡)。在給藥的當(dāng)天，稱量動(dòng)物體重(每個(gè)動(dòng)物280-310g)。將非偶聯(lián)型和偶聯(lián)型hG-CSF樣品按每kg體重100μg經(jīng)尾靜脈注射給三只大鼠。注射后1分鐘，30分鐘，1，2，4，6，和24小時(shí)，在CO2麻醉下每只大鼠眼球取血500μl。室溫儲(chǔ)存血樣品11/2小時(shí)后，離心分離血清(4℃，18000xg離心5分鐘)。-80℃儲(chǔ)存血樣品至分析日。將樣品在冰上解凍后通過(guò)G-CSF體外活性試驗(yàn)(參見初步試驗(yàn)1和2)對(duì)血清樣品中的G-CSF進(jìn)行定量。
US5,824,778中描述了測(cè)定G-CSF或其變體的體內(nèi)半壽期的另一試驗(yàn)，該文獻(xiàn)引入本發(fā)明作參考。
偶聯(lián)型和非偶聯(lián)型hG-CSF和其變體的體內(nèi)生物學(xué)活性的檢測(cè)對(duì)SPF Sprague Dawley大鼠(購(gòu)自M & B A/S，丹麥)中hG-CSF的體內(nèi)生物學(xué)活性的檢測(cè)用于評(píng)估偶聯(lián)型和非偶聯(lián)型G-CSF和其變體的生物學(xué)功效。
新到的大鼠當(dāng)天隨機(jī)分為6組。所有動(dòng)物需要適應(yīng)7天，其間要去掉狀態(tài)差或體重極端的個(gè)體。順應(yīng)階段開始時(shí)的體重范圍是250-270g。
給藥當(dāng)天大鼠需禁食16小時(shí)，隨后按每kg體重100μg皮下注射hG-CSF或其變體。每種hG-CSF樣品給一組6只隨機(jī)分配的大鼠注射。在給藥前和給藥后6，12，24，36，48，72，96，120和144小時(shí)從大鼠尾靜脈抽取300μl血樣品，用EDTA抗凝。對(duì)血樣品進(jìn)行以下血液學(xué)參數(shù)的分析血紅蛋白，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，血細(xì)胞比容，平均細(xì)胞體積(mean cell volume)，平均細(xì)胞血紅蛋白濃度(mean cell haemoglobin concentration)，平均細(xì)胞血紅蛋白(mean cellhaemoglobin)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)，分化型白細(xì)胞計(jì)數(shù)(嗜中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞)。根據(jù)這些檢測(cè)可以對(duì)偶聯(lián)型和非偶聯(lián)型hG-CSF和其變體進(jìn)行評(píng)估。
US5,681,720，US5,795,968，US5,824,778，US5,985,265和Bowenet al.，Experimental Hematology 27425-432(1999)描述了測(cè)定hG-CSF或其變體的體內(nèi)生物學(xué)活性的其它試驗(yàn)例。
確定多肽-受體結(jié)合親和力(結(jié)合率和解離速度)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，放射免疫分析(RIA)，或本領(lǐng)域熟知的其它此類免疫檢測(cè)技術(shù)可以檢測(cè)受體和配體之間的結(jié)合強(qiáng)度。使用胞質(zhì)基因共振檢測(cè)的Biacore儀(Zhou etal.，Biochemistry3，32，8193-98；Faegerstram和O′Sh annessy，1993，In Handbook of Affinity Chromatography，229-52，MarcelDekker，Inc.，NY)也可以檢測(cè)配體-受體結(jié)合相互作用。
Biacore技術(shù)允許受體結(jié)合到金顆粒表面并使配體流過(guò)所述受體。胞質(zhì)基因共振檢測(cè)實(shí)時(shí)對(duì)結(jié)合到該表面的物質(zhì)進(jìn)行直接計(jì)量。使用該技術(shù)可獲得結(jié)合速度常數(shù)和解離速度常數(shù)并因此直接確定配體-受體解離常數(shù)和親和力常數(shù)。
hG-CSF偶聯(lián)物的體外免疫原性檢測(cè)用檢測(cè)偶聯(lián)物相對(duì)于參考分子或制品的免疫原性的ELISA方法確定本發(fā)明偶聯(lián)物的免疫原性下降。通常，參考分子或制品是重組人G-CSF制品例如Neupogen或另一種重組人G-CSF制品，例如US5,824,784中描述的N末端PEG化rhG-CSF分子。ELISA方法是以抗體為基礎(chǔ)建立的，所述抗體來(lái)自用上述重組G-CSF制品中的一種進(jìn)行治療的患者。當(dāng)試驗(yàn)中本發(fā)明偶聯(lián)物的反應(yīng)與參考分子或制品相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上明顯下降時(shí)應(yīng)認(rèn)為免疫原性是下降的。
G-CSF生物檢測(cè)中對(duì)活性的中和用上述G-CSF生物檢測(cè)方法分析抗G-CSF血清對(duì)hG-CSF偶聯(lián)物的中和作用。
使用來(lái)自G-CSF參考分子治療的患者或來(lái)自已被免疫的動(dòng)物的血清。加入固定濃度(1∶20-1∶500(患者血清)或20-1000ng/ml(動(dòng)物血清)稀釋)或從1∶20(pt血清)或1000ng/ml(動(dòng)物血清)開始進(jìn)行5倍連續(xù)稀釋的上述血清。在總量為80μlDMEM培養(yǎng)基+10％FCS中以從10nM開始進(jìn)行7倍稀釋的濃度或以固定濃度(1-100pM)加入HG-CSF偶聯(lián)物。將血清與hG-CSF偶聯(lián)物在37℃溫育1小時(shí)。
然后將樣品(0.01ml)轉(zhuǎn)移到包含NFS-60細(xì)胞的0.1ml DMEM培養(yǎng)液的96孔組織培養(yǎng)板中。培養(yǎng)物在5％CO2的空氣環(huán)境下37℃溫育48小時(shí)。然后加0.01ml WST-1(WST-1細(xì)胞增殖劑Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)至培養(yǎng)物中，在5％CO2的空氣環(huán)境下37℃溫育150分鐘。活細(xì)胞中線粒體脫氫酶對(duì)四唑鹽WST-1的分解導(dǎo)致形成甲臜，該產(chǎn)物通過(guò)檢測(cè)450nm的吸光度進(jìn)行定量。
在有固定量血清的條件下對(duì)hG-CSF偶聯(lián)物樣品進(jìn)行滴定時(shí)，中和效應(yīng)被定義為抑制倍數(shù)(FI)，計(jì)量為EC50(有血清)/EC50(無(wú)血清)。G-CSF變體蛋白的抗體中和作用的下降被定義為 實(shí)施例1編碼hG-CSF的合成基因的構(gòu)建和克隆以下DNA片段是按照Stemmer et al.，(1995)，Gene 164，pp.49-53描述的通用步驟合成的片段1，由以下序列組成Bam HI消化位點(diǎn)，編碼YAP3信號(hào)肽的序列(WO98/32867)，編碼TA57前導(dǎo)序列的序列(WO98/32867)，編碼KEX2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列(AAAAGA)，編碼hG-CSF的序列(其密碼子使用特點(diǎn)有利于在大腸桿菌中表達(dá))，(SEQ ID NO2)和Xba I消化位點(diǎn)。
片段2，由以下序列組成Bam HI消化位點(diǎn)，編碼YAP3信號(hào)肽的序列(WO98/32867)，一個(gè)編碼TA 57前導(dǎo)序列的序列(WO98/32867)，編碼組氨酸標(biāo)記物的序列(SEQ ID NO5)，編碼KEX2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列(AAAAGA)，編碼hG-CSF的序列(其密碼子使用特點(diǎn)有利于在大腸桿菌中表達(dá))，(SEQ ID NO2)和Xba I消化位點(diǎn)。
片段3，由以下序列組成Nde I消化位點(diǎn)，編碼OmpA信號(hào)肽的序列(SEQ ID NO3)，編碼hG-CSF的序列(其密碼子使用特點(diǎn)有利于在大腸桿菌中表達(dá))，(SEQ ID NO2)和Bam HI消化位點(diǎn)。
片段4，由以下序列組成Bam HI消化位點(diǎn)，Kozak共有序列(Kozak，M.JMol Biol 1987 Aug 20；196(4)947-50)，編碼hG-CSF信號(hào)肽的序列(SEQ IDNO7)和編碼hG-CSF的序列(其密碼子使用特點(diǎn)有利于在CHO中表達(dá))，(SEQ ID NO8)和Xba I消化位點(diǎn)。
用標(biāo)準(zhǔn)DNA技術(shù)將DNA片段1和2插入到質(zhì)粒pJSO37(Okkels，Ann.New York Acad.Sci.782202-207，1996)中的Bam HI和Xba I消化位點(diǎn)。這樣產(chǎn)生質(zhì)粒pG-CSFcerevisiae和pHISG-CSFcerevisiae。
用標(biāo)準(zhǔn)DNA技術(shù)將DNA片段3插入到質(zhì)粒pET12a(Invitrogen)中的Nde I和Bam HI消化位點(diǎn)。這樣產(chǎn)生質(zhì)粒pG-CSFcoli。
用標(biāo)準(zhǔn)DNA技術(shù)將DNA片段4插入到質(zhì)粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中的Bam HI和Xba I消化位點(diǎn)。這樣產(chǎn)生質(zhì)粒pG-CSFCHO。
實(shí)施例2hG-CSF在釀酒酵母(S.cerevisiae)和大腸桿菌(E.coli)中的表達(dá)用質(zhì)粒pG-CSFcerevisiae或pHISG-CSFcerevisiae轉(zhuǎn)化釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YNG318(可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，VA，USA以ATCC 208973的保藏號(hào)獲得)，分離出包含這兩種質(zhì)粒中任一種的轉(zhuǎn)化子，然后在細(xì)胞外分別表達(dá)攜帶和不攜帶HIS標(biāo)記物的hG-CSF，以上各個(gè)步驟按照文獻(xiàn)中描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。用pG-CSFcoli轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen，Cat.No.69387-3)，分離出包含該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，隨后在上清液和細(xì)胞的外周胞質(zhì)中表達(dá)hG-CSF，以上步驟按照Novagen的pET SystemManual(第8版)中描述的進(jìn)行。
釀酒酵母和大腸桿菌對(duì)hG-CSF的表達(dá)可以用ImmunoPureUltra-Sensitive ABC兔IgG染色試劑盒(Pierce)和多克隆抗hG-CSF抗體(PeproTech EC Ltd.)通過(guò)Western印跡分析來(lái)檢驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所述蛋白具有正確的大小。
在釀酒酵母和大腸桿菌中的攜帶和不攜帶N末端組氨酸標(biāo)記物的hG-CSF的表達(dá)水平可用市售G-CSF特異性ELISA試劑盒(Quantikine HumanG-CSF Immunoassay，R & D Systems Cat.No.DCS50)進(jìn)行定量。檢測(cè)到的數(shù)值在以下列出。

實(shí)施例3從釀酒酵母培養(yǎng)上清中純化hG-CSF及其變體hG-CSF的純化如下進(jìn)行通過(guò)離心去除細(xì)胞。然后將去除了細(xì)胞的上清液通過(guò)0.22μm的過(guò)濾器過(guò)濾除菌。經(jīng)過(guò)濾除菌后的上清液在10mM，pH4.5的醋酸鈉中稀釋5倍。每5升稀釋后的上清液加入10ml濃縮的醋酸調(diào)整pH。在將該溶液應(yīng)用于陽(yáng)離子交換柱之前其離子強(qiáng)度應(yīng)該在8mS/cm以下。
將稀釋后的上清液以90cm/h的線性流速裝載到已用50mM，pH4.5的醋酸鈉平衡的SP-sepharose FF(Pharmacia)柱上，直到該柱的洗出液達(dá)到穩(wěn)定的UV和基線導(dǎo)電性水平。用所述平衡緩沖液洗柱直到柱流出液的UV吸光度和導(dǎo)電性達(dá)到穩(wěn)定水平，從而去除未結(jié)合的物質(zhì)。用線性梯度；30個(gè)柱體積；0-80％的緩沖液B(50mM NaAc，pH4.5，750mM NaCl)以45cm/h的流速將結(jié)合的G-CSF蛋白從柱子上洗脫下來(lái)。根據(jù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果將包含G-CSF的組分匯集。加入氯化鈉直到該溶液的離子強(qiáng)度在80mS/cm以上。
將上述蛋白溶液裝載到已用50mM NaAc，pH4.5，750mM NaCl平衡的Phenyl Toyo Pearl 650S柱上。用該平衡緩沖液洗下未結(jié)合的物質(zhì)。通過(guò)應(yīng)用MilliQ水的逐步梯度進(jìn)行G-CSF的洗脫。包含G-CSF的組分被匯集。通過(guò)應(yīng)用上述2步?jīng)_洗(down stream)的策略，能獲得90％以上純度的G-CSF。然后純化的蛋白通過(guò)在280nm的分光光度檢測(cè)和/或通過(guò)氨基酸分析進(jìn)行定量。
包含G-CSF的組分被匯集。用VivaSpin濃縮器(mwco5kDa)進(jìn)行緩沖液交換和濃縮。
實(shí)施例4對(duì)非偶聯(lián)的和偶聯(lián)的hG-CSF和其變體的鑒定和定量SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)純化并濃縮的G-CSF進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果主要是表觀分子量大約17kDa的單一條帶。
吸光度通過(guò)分光光度測(cè)量法評(píng)估G-CSF濃度。通過(guò)檢測(cè)在280nm的吸光度和應(yīng)用0.83的理論消光系數(shù)可以計(jì)算出蛋白的濃度。
氨基酸分析通過(guò)氨基酸分析更準(zhǔn)確測(cè)定蛋白。對(duì)純化的G-CSF所進(jìn)行的氨基酸分析揭示，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的氨基酸組分與根據(jù)DNA序列推測(cè)的氨基酸組成是一致的。
實(shí)施例5PEG化wt G-CSF和G-CSF變體的MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定用MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定法評(píng)估附著到PEG化wt G-CSF和所選擇的PEG化G-CSF變體上的PEG基團(tuán)數(shù)。
Wt G-CSF包含5個(gè)預(yù)計(jì)為SPA-PEG附著位點(diǎn)的伯氨基(N末端氨基和K16，K23，K34和K40上的∈氨基)。wt G-CSF用SPA-PEG 5000 PEG化后，MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)顯示主要存在附著有4，5和6個(gè)PEG基團(tuán)的wtG-CSF變體，此外，附著7個(gè)PEG基團(tuán)的wt G-CSF變體也清晰可見，但量較少。
具有K16R，K34R，K40R，Q70K，Q90K，和Q120K取代的G-CSF變體也包含5個(gè)伯氨基(N末端氨基和K23，K70，K90和K120上的ε氨基)。這種G-CSF變體被SPA-PEG5000 PEG化后，MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)顯示主要存在附著有4，5和6個(gè)PEG基團(tuán)的G-CSF變體，此外，附著7個(gè)PEG基團(tuán)的G-CSF變體也清晰可見，但量較少。
具有K16R，K34R，和K40R取代的G-CSF包含2個(gè)伯氨基(N末端氨基和K23上的ε氨基)。該G-CSF變體用SPA-PEG 12000 PEG化后，MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)顯示主要存在附著有2和3個(gè)PEG基團(tuán)的G-CSF變體，此外，附著4個(gè)PEG基團(tuán)的G-CSF變體也清晰可見，但量較少。
上述觀察清楚地顯示除包含氨基的氨基酸殘基外，其它的氨基酸殘基在所應(yīng)用的PEG化條件下有時(shí)也可以進(jìn)行PEG化。上述觀察還顯示在引入氨基的部位進(jìn)行PEG化具有一定重要性。這在wt G-CSF和G-CSF變體的SDS-PAGE分析中也已觀察到。
如實(shí)施例11所述，當(dāng)應(yīng)用SPA-PEG化學(xué)法時(shí)組氨酸170完全被PEG化。此外，K23和S159被部分PEG化。這解釋了除hG-CSF和其變體中已經(jīng)形成的伯氨基外，還有1-2個(gè)另外的PEG化位點(diǎn)。
實(shí)施例6PEG化和非PEG化G-CSF變體的肽作圖為了繪制G-CSF和G-CSF變體上另外的SPA-PEG附著位點(diǎn)，應(yīng)用以下策略。
為了將預(yù)期的PEG化位點(diǎn)數(shù)降至最少，選擇具有少量氨基的G-CSF變體。所選擇的G-CSF變體具有K16R，K34R，K40R和H170Q取代。除了K23上的在先資料顯示無(wú)任何程度PEG化的ε胺基外，該變體僅僅包含一個(gè)N末端伯胺。所以，在該G-CSF變體中胺基基團(tuán)上的PEG化背景明顯降低。應(yīng)用SPA-PEG 5000對(duì)G-CSF變體進(jìn)行PEG化。PEG化后，使G-CSF變體變性，使其二硫鍵還原，使所得巰基烷基化，然后用谷氨酸特異性蛋白酶降解已烷基化并PEG化的蛋白。最后，所形成的肽通過(guò)反相HPLC分離。
平行地對(duì)具有K16R，K34R，和K40R取代的非PEG化G-CSF變體進(jìn)行同樣的處理，以獲得一個(gè)HPLC參考層析圖。
對(duì)PEG化G-CSF變體和非PEG化G-CSF變體的降解的HPLC層析作圖比較應(yīng)該揭示出在PEG化時(shí)哪個(gè)肽消失。通過(guò)對(duì)非PEG化G-CSF變體的肽進(jìn)行N末端氨基酸測(cè)序而對(duì)這些肽進(jìn)行的鑒定可間接指出PEG化位置。
原則上，優(yōu)選應(yīng)用具有K16R，K34R，K40R和H170Q所有這些取代的非PEG化G-CSF變體，但實(shí)踐中不必如此。
更具體地，將大約1mg具有K16R，K34R，K40R和H170Q取代的PEG化G-CSF變體和大約500μg具有K16R，K34R，和K40R取代的非PEG化G-CSF變體在SpeedVac濃縮器中干燥。將兩種樣品分別溶解在400μl6M胍，0.3M Tris HCl，pH8.3中，然后37℃變性過(guò)夜。變性后，通過(guò)加入50μl 0.1MDTT的6M胍，0.3M TrisHCl，pH8.3溶液還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵。室溫下溫育2h后，加入50μl0.6M碘乙酰胺的6M胍，0.3M Tris-HCl，pH8.3溶液使原有巰基烷基化。烷基化在室溫下進(jìn)行30min，然后用NAP5柱將已還原并烷基化的蛋白的緩沖液換成50mM NH4HCO3。在SpeedVac濃縮器中樣品的體積降低到大于200μl后，分別加入20μg和10μg谷氨酸特異性蛋白酶。谷氨酸特異性蛋白酶的降解在37℃進(jìn)行16h。所產(chǎn)生的肽應(yīng)用PhenomenexJupiter C18柱(0.2×5cm)以0.1％TFA水溶液中的線性乙腈梯度洗脫，從而進(jìn)行反相HPLC分離。通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法分析所收集的組分，隨后對(duì)所選擇的肽進(jìn)行N末端氨基酸序列分析。
對(duì)PEG化G-CSF變體和非PEG化G-CSF變體的降解的HPLC層析作圖比較揭示，在PEG化時(shí)僅二個(gè)組分消失。對(duì)非PEG化G-CSF變體的這兩個(gè)組分進(jìn)行N末端氨基酸序列分析顯示，這兩種肽都來(lái)源于G-CSF的N末端。其中一種肽由Gln11以后的意外切割產(chǎn)生的氨基酸殘基1-11組成。另一肽由Glu19后的預(yù)期切割產(chǎn)生的氨基酸殘基1-19組成。
預(yù)期G-CSF的N末端肽可用該方法鑒定，因?yàn)镹末端氨基容易被PEG化。然而，用該方法沒(méi)有鑒定出SPA-PEG 5000的其它附著位點(diǎn)。
間接鑒定PEG 5000附著位點(diǎn)的另一種做法是直接鑒定PEG化肽中的附著位點(diǎn)。然而，在對(duì)降解的PEG化G-CSF變體進(jìn)行HPLC分離時(shí)，包含PEG化肽的組分彼此之間沒(méi)有分開且未能與幾個(gè)包含非PEG化肽的組分分開。所以，對(duì)這些組分的N末端氨基酸序列分析除了提示K23能被部分PEG化外沒(méi)獲得任何有用的數(shù)據(jù)。
為克服這些問(wèn)題，從第一次HPLC分離的組分中制備兩份PEG化肽的匯集物。將這二個(gè)匯集物在SpeedVac濃縮器中干燥，溶解在200μl新鮮配制的50mM NH4HCO3中并用1μg糜蛋白酶進(jìn)一步降解。所產(chǎn)生的肽應(yīng)用Phenomenex.Jupiter C18柱(0.2×5cm)以0.1％TFA水溶液中的線性乙腈梯度洗脫，從而經(jīng)反相HPLC分離。通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜法分析所收集的級(jí)分，隨后對(duì)所選擇的肽進(jìn)行N末端氨基酸序列分析。
經(jīng)N末端氨基酸序列測(cè)定，K23和S159都被部分PEG化。無(wú)法確定這兩個(gè)位置上PEG化實(shí)際程度，但因?yàn)閺淖畛醯腍PLC分離中鑒定出K23和S159未被修飾的肽并已測(cè)序，所以可確定PEG化僅僅是部分的。
實(shí)施例7
wt G-CSF和G-CSF變體的糖基化當(dāng)通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜分析對(duì)純化的wt G-CSF和G-CSF變體進(jìn)行分析時(shí)總是能觀察到比所分析的G-CSF分子的質(zhì)量大了約324Da的另一組分。因?yàn)榫哂凶钚≠|(zhì)量的組分始終具有G-CSF分子的質(zhì)量且因?yàn)镚-CSF分子有正確的N末端氨基酸序列，所以可以得出這樣的結(jié)論，上述另外的成分是攜帶二個(gè)己糖殘基的經(jīng)過(guò)修飾的G-CSF分子。在許多情況下，未經(jīng)修飾的G-CSF分子產(chǎn)生最強(qiáng)的信號(hào)但在一些情況下經(jīng)過(guò)修飾的G-CSF分子的信號(hào)強(qiáng)度是最強(qiáng)的。
在分析為鑒定另外的PEG化位點(diǎn)而產(chǎn)生的肽時(shí)，從每次降解中鑒定出二個(gè)可用于鑒定糖基化位點(diǎn)的肽。
在兩次HPLC分離中，這兩種肽相繼被洗脫出且MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)顯示這兩種肽有約324Da的質(zhì)量差異。質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)提示該肽包含氨基酸殘基124-162。對(duì)所有4種肽的N末端氨基酸序列分析顯示這種分配是正確的且Thr133是唯一的修飾位點(diǎn)。在具有未經(jīng)修飾的肽的質(zhì)量的肽中，Thr133在序列中清晰可見，但在具有324Da的附著質(zhì)量的肽中第133位無(wú)法排布氨基酸殘基。因?yàn)樗衅渌陌被釟埢寄芘挪荚谠撔蛄兄?，所以可以得出這樣的結(jié)論，即Thr133是唯一的修飾位點(diǎn)。這個(gè)糖基化位點(diǎn)以前曾報(bào)道用于CHO細(xì)胞中表達(dá)的重組G-CSF中，但此聚糖與酵母中附著的聚糖不同。
非糖基化wt G-CSF利用反相HPLC與糖基化wt G-CSF分離，具體是應(yīng)用Vydac C18柱(0.21×5cm)以51％乙腈的0.1％TFA溶液經(jīng)等度洗脫為一個(gè)經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜分析顯示僅含非糖基化wt G-CSF的級(jí)分。
實(shí)施例8共價(jià)偶聯(lián)有不同數(shù)量的PEG分子的G-CSF分子的分離共價(jià)偶聯(lián)4，5或6個(gè)PEG基團(tuán)的G-CSF分子如下分離。用20mM檸檬酸鈉pH2.5平衡SPsepharose FF柱，然后將20mM檸檬酸鈉，pH2.5中的PEG化蛋白裝載到上述SPsepharose FF柱上。任何未結(jié)合的物質(zhì)都被從柱子上洗掉。洗脫用pH梯度進(jìn)行。PEG化G-CSF在大約pH3.8時(shí)開始從柱子中洗脫且繼續(xù)洗脫在pH3.8到4.5的級(jí)分中。
對(duì)這些級(jí)分進(jìn)行SDS-PAGE和質(zhì)譜分析。這些分析表明PEG化程度最高的G-CSF存在于低pH級(jí)分中。PEG化程度較低G-CSF洗脫在高pH級(jí)分中。
對(duì)PEG化G-CSF所進(jìn)行的氨基酸分析顯示，消光系數(shù)的理論值與實(shí)驗(yàn)測(cè)定值非常一致。
實(shí)施例9hG-CSF變體的構(gòu)建將hG-CSF中的氨基酸特異性取代為其它氨基酸殘基，例如上面在一般描述中所討論的特異性取代，是用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)DNA技術(shù)引入的。用包含編碼無(wú)HIS標(biāo)記物之hG-CSF的基因的質(zhì)粒pG-CSF cerevisiae可制備新的G-CSF變體，所述hG-CSF基因在PCR反應(yīng)中作DNA模板。使這些變體在釀酒酵母中表達(dá)且如實(shí)施例3所述純化。所構(gòu)建的部分G-CSF變體在以下列舉(參見實(shí)施例9和10)實(shí)施例10SPA-PEG向hG-CSF或其變體的共價(jià)偶聯(lián)如上所述(hG-CSF和其變體在溶液中的PEG化)使人G-CSF和其變體共價(jià)連接SPA-PEG 5000，SPA-PEG 12000和SPA-PEG 20000(Shearwater)。偶聯(lián)物的體外活性在實(shí)施例12中列舉。
實(shí)施例11通過(guò)定點(diǎn)誘變和隨后對(duì)純化變體的PEG化來(lái)鑒定G-CSF中的SPA-PEG附著位點(diǎn)可以將SPA-PEG附著到G-CSF中除賴氨酸之外的其它氨基酸殘基上。為確定SPA-PEG是否附著到組氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和精氨酸上，制備一些變體，使其中的這些氨基酸被取代為賴氨酸，丙氨酸或谷氨酸。使這些變體在釀酒酵母中表達(dá)，純化和PEG化，然后在SDS-PAGE上分析附著的SPA-PEG分子的數(shù)量。給定氨基酸被谷氨酸或丙氨酸取代后附著SPA-PEG的數(shù)量的下降強(qiáng)有力地提示該氨基酸通過(guò)SPA-PEG被PEG化，且這種現(xiàn)象進(jìn)一步得到將該氨基酸取代成賴氨酸后PEG化程度不變的結(jié)果的支持。所分析的變體在以下列舉。

以上數(shù)據(jù)顯示除N末端，K16，K34和K40之外，SPA-PEG也可共價(jià)結(jié)合到H170上。進(jìn)一步地，上述數(shù)據(jù)顯示僅僅10％的可利用的K23氨基酸殘基被PEG化，大約10％的S159被PEG化。
實(shí)施例12非偶聯(lián)的和偶聯(lián)的hG-CSF和其變體的體外生物學(xué)活性如以上“主要試驗(yàn)2-體外hG-CSF活性檢測(cè)”所述對(duì)非偶聯(lián)的和偶聯(lián)的hG-CSF和其變體的體外生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)SPA-PEG 5000與可利用的PEG化位點(diǎn)偶聯(lián)和不偶聯(lián)所產(chǎn)生的每個(gè)變體所檢測(cè)的EC50值在以下列舉。這些值已經(jīng)相對(duì)于非偶聯(lián)的hG-CSF(Neupogen)標(biāo)準(zhǔn)化。每次在同樣的檢測(cè)條件下檢測(cè)該值以及變體的值。在所述檢測(cè)中hG-CSF的EC50值是30pM。


以上數(shù)據(jù)顯示K23取代成精氨酸不增加偶聯(lián)蛋白的活性。這是由于這樣一個(gè)事實(shí)，即僅有10％的K23被PEG化，偶聯(lián)后的K23R變體基本與hG-CSF具有相同的的PEG基團(tuán)附著數(shù)和相同的PEG化位置。在K16，K34和K40位置上去除賴氨酸產(chǎn)生了在PEG化后具有明顯活性的G-CSF變體。該變體與SPA-PEG5000偶聯(lián)后與未偶聯(lián)的變體相比不明顯降低活性。所以，N末端和H170被SPA-PEG 5000 PEG化不降低hG-CSF的活性。由此決定應(yīng)用hG-CSF K16R K34R K40R作為插入新PEG化位點(diǎn)的主鏈。在該主鏈中，E45和H159殘基之間引入了21個(gè)新的PEG化位點(diǎn)。這些殘基分布在hG-CSF中不與G-CSF受體相互作用的部位。在Q70，Q90，T105，Q120，T133和S142位置引入新的PEG化位點(diǎn)得到被SPA-PEG 5000 PEG化后仍保持明顯活性的hG-CSF變體。所以，具有2或3個(gè)新的PEG化位點(diǎn)的hG-CSF變體結(jié)合了這些新的PEG化位點(diǎn)。用SPA-PEG 5000 PEG化后這些變體中最具活性的是hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q120K和hG-CSF K16R K34R K40R Q70KQ90K Q120K。
此外，可使SPA-PEG 5000，SPA-PEG 12000和SPA-PEG 20000附著到hG-CSF K16R K34R K40R上。它們各自的體外EC50值分別是非偶聯(lián)的hG-CSF(Neupogen)的35％，10％和1％。
實(shí)施例13非偶聯(lián)的和偶聯(lián)的hG-CSF和其變體的體內(nèi)半壽期非偶聯(lián)的hG-CSF(Neupogen)和SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSF K16RK34R K40R Q70K Q90K Q120K的體內(nèi)半壽期如以上(非偶聯(lián)的和偶聯(lián)的hG-CSF和其變體的體內(nèi)半壽期的檢測(cè))所述進(jìn)行檢測(cè)。所得結(jié)果在圖1中顯示。Neupogen和SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34R K40R Q70KQ90K Q120K的體內(nèi)半壽期經(jīng)測(cè)定分別為2.01小時(shí)和12.15小時(shí)。所以，在hG-CSF中引入新的PEG化位點(diǎn)并使這些位點(diǎn)與SPA-PEG 5000偶聯(lián)可使體內(nèi)半壽期明顯增加。在較早的一項(xiàng)試驗(yàn)中，將Neupogen的體內(nèi)半壽期與具有較大的N末端PEG偶聯(lián)分子(10kDa)的hG-CSF相比較。此時(shí)，體內(nèi)半壽期分別確定為1.75小時(shí)和7.01小時(shí)。所以，與Neupogen和具有10kDa的N末端PEG偶聯(lián)分子的hG-CSF相比，SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSF K16RK34R K40R Q70K Q90K Q120K的半壽期明顯延長(zhǎng)。
實(shí)施例14非偶聯(lián)的和偶聯(lián)的hG-CSF和其變體的體內(nèi)生物學(xué)活性非偶聯(lián)的hG-CSF(Neupogen)，SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSF K16RK34R K40R Q70K Q120K和SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34RK40R Q70K Q90K Q120K的體內(nèi)生物學(xué)活性如以上(非偶聯(lián)的和偶聯(lián)的hG-CSF和其變體的體內(nèi)生物學(xué)活性的檢測(cè))所述進(jìn)行檢測(cè)。所得結(jié)果在圖2中顯示。在t＝0小時(shí)每kg體重注射100μg后48小時(shí)時(shí)未檢測(cè)出Neupogen的活性。初次注射后，直到72小時(shí)都能檢測(cè)出SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSFK16R K34R K40R Q70K Q120K的活性，而直到96小時(shí)，SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K仍保留體內(nèi)活性。所以，可以看出兩種偶聯(lián)的變體與Neupogen比較都有較長(zhǎng)時(shí)間的體內(nèi)生物學(xué)活性且SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90K Q120K的活性在體內(nèi)維持的時(shí)間是Neupogen的兩倍。
此外，對(duì)Neupogen，SPA-PEG 12000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34R K40R和不同劑量SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90KQ120K的體內(nèi)生物學(xué)活性進(jìn)行了檢測(cè)。所得結(jié)果顯示在圖3。如較早時(shí)觀察到的，在以每kg體重100μg最初注射后48小時(shí)未檢測(cè)出Neupogen的活性。每kg體重給藥5μg SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34R K40R Q70KQ90K Q120K與Neupogen相比可使體內(nèi)生物學(xué)活性略微延長(zhǎng)，而每kg體重給藥上述化合物25μg和100μg使得hG-CSF活性在最初注射后各自到72和96小時(shí)仍維持活性。SPA-PEG 12000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34R K40R在每kg體重給藥100μg后直到72小時(shí)仍維持體內(nèi)活性。如實(shí)施例5所述，SPA-PEG 12000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34R K40R偶聯(lián)有2或3個(gè)SPA-PEG12000基團(tuán)，而SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34R K40R Q70K Q90KQ120K偶聯(lián)有5或6個(gè)SPA-PEG 5000基團(tuán)。所以，兩種化合物的分子量分別是42-54kDa和43-48kDa。SPA-PEG 5000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34RK40R Q70K Q90K Q120K與具有基本相同分子量的SPA-PEG 12000偶聯(lián)的hG-CSF K16R K34R K40R相比體內(nèi)生物學(xué)活性能維持較長(zhǎng)時(shí)間的結(jié)果顯示，被偶聯(lián)的PEG分子的分布對(duì)體內(nèi)生物學(xué)活性的維持時(shí)間是至關(guān)重要的。
序列表序列表<110>馬克西根公司(Maxygen ApS)<120>G-CSF偶聯(lián)物<130>8wo02<150>DK PA 2000 00024<151>2000-01-10<150>DK PA 2000 00341<151>2000-03-02<150>DK PA 2000 00943<151>2000-06-16<160>8<170>PatantIn version 3.0<210>1<211>174<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys50 55 60Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65 70 75 80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe130 135 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145 150 155 160Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170<210>2<211>525<212>DNA<213>人工序列<400>2acccctctgg gcccggccag cagtctgcct cagagttttt tactgaaatg cttagaacag 60gtgcgtaaaa tccagggcga tggcgcggcc ctgcaggaaa aactgtgcgc gacctataaa120ctgtgccatc ctgaagaact ggtcctgtta ggccatagct taggcatccc gtgggcgcct180ctgagtagct gcccgagtca ggccctgcag ctggccggct gcctgagtca gttacatagt240ggcttatttt tatatcaggg cttactgcag gcgttagaag gcattagtcc ggaactgggc300ccgaccctgg ataccttaca gttagatgtc gcggattttg ccaccaccat ttggcagcag360atggaagaat taggcatggc gcctgcgtta cagcctaccc agggcgccat gcctgcgttt420gcgagtgcgt ttcagcgtcg cgccggcggc gtgttagtgg ccagccatct gcagagcttt480ctggaagtga gttatcgtgt gttacgccat ctggcccagc cttaa525<210>3<211>21<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>3Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala1 5 10 15Thr Val Ala Gln Ala20<210>4<211>63<212>DNA<213>人工序列<400>4atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60gcc 63<210>5<211>15<212>PRT<213>人工序列<400>5Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln Gln1 5 10 15<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>6atgaaacacc aacaccaaca tcaacatcaa catcaacatc aacag 45<210>7<211>30<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln1 5 10 15Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala20 25 30<210>8<211>615<212>DNA<213>人工序列<400>8atggccggcc ctgccacaca gtcccccatg aagctgatgg ccctgcagct gctgctgtgg 60cactccgccc tgtggacagt gcaggaggcc acccctctgg gccccgccag ctccctgcct120cagtccttcc tgctgaagtg cctggagcag gtgagaaaga tccagggcga cggcgccgcc180ctgcaggaga agctgtgcgc cacatacaag ctgtgccacc ctgaggagct ggtgctgctg240ggccacagcc tgggcatccc ctgggcccct ctgtccagct gcccctccca ggccctgcag300ctggccggct gcctgtccca gctgcactcc ggcctgttcc tgtaccaggg cctgctgcag360gccctggagg gcatctcccc cgagctgggc cccacactgg ataccctgca gctggacgtg420gccgatttcg ccaccacaat ctggcagcag atggaggagc tgggcatggc ccctgccctg480cagcctaccc agggcgccat gcctgccttt gcctccgcct ttcagagacg ggccggcggc540gtgctggtgg ccagccacct gcagagcttt ctggaggtgt cctacagagt gctgcggcac600ctggcccagc cttga 61權(quán)利要求
1.一種多肽偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含i)一種顯示G-CSF活性的多肽，該多肽包含與SEQ ID NO1所示氨基酸序列不同的氨基酸序列，該序列的不同之處在于至少一個(gè)選自下組的取代T1K，P2K，L3K，G4K，P5K，A6K，S7K，S8K，L9K，PICK，Q11K，S12K，F(xiàn)13K，L14K，L15K，E19K，Q20K，V21K，Q25K，G26K，D27K，A29K，A30K，E33K，A37K，T38K，Y39K，L41K，H43K，P44K，E45K，E46K，V48K，L49K，L50K，H52K，S53K，L54K，I56K，P57K，P60K，L61K，S62K，S63K，P65K，S66K，Q67K，A68K，L69K，Q70K，L71K，A72K，G73K，S76K，Q77K，L78K，S80K，F(xiàn)83K，Q86K，G87K，Q90K，E93K，G94K，S96K，P97K，E98K，L99K，G100K，P101K，T102K，D104K，T105K，Q107K，L108K，D109K，A111K，D112K，F(xiàn)113K，T115K，T116K，W118K，Q119K，Q120K，M121K，E122K，E123K，L124K，M126K，A127K，P128K，A129K，L130K，Q131K，P132K，T133K，Q134K，G135K，A136K，M137K，P138K，A139K，A141K，S142K，A143K，F(xiàn)144K，Q145K，S155K，H156K，Q158K，S159K，L161K，E162K，V163K，S164K，Y165K，V167K，L168K，H170K，L171K，A172K，Q173K和P174K，和ii)至少一個(gè)附著至該多肽的賴氨酸殘基上的非多肽組分。
2.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中SEQ ID NO1的氨基酸殘基K16，K23，K34和K40中的至少一個(gè)已缺失或用另一個(gè)氨基酸殘基取代。
3.權(quán)利要求2的偶聯(lián)物，其中K16，K23，K34和K40中的至少一個(gè)已被R或Q殘基取代。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述多肽包含至少一個(gè)選自下組的取代P5K，A6K，S7K，S8K，L9K，P44K，E45K，E46K，V48K，L49K，L50K，H52K，S53K，L54K，I56K，P57K，P60K，L61K，S62K，S63K，P65K，S66K，Q67K，A68K，L69K，Q70K，L71K，A72K，G73K，S76K，Q77K，L78K，S80K，F(xiàn)83K，Q86K，G87K，Q90K，E93K，G94K，S96K，P97K，E98K，L99K，P101K，D104K，T105K，Q107K，L108K，D109K，A111K，D112K，F(xiàn)113K，T115K，T116K，W118K，Q119K，Q120K，M121K，E122K，E123K，L124K，M126K，A127K，P128K，A129K，L130K，Q131K，P132K，T133K，Q134K，G135K，A136K，M137K，P138K，A139K，A141K，S142K，A143K，F(xiàn)144K，Q145K，S155K，H156K，Q158K，S159K，L161K，E162K，V163K，S164K，Y165K，V167K，L168K，H170K，L171K，A172K，Q173K和P174K。
5.權(quán)利要求4的偶聯(lián)物，其中所述多肽包含至少一個(gè)選自Q70K，Q90K，T105K，Q120K和T133K的取代。
6.一種偶聯(lián)物，其包含i)一種顯示G-CSF活性的多肽，該多肽包含與SEQ ID NO1所示氨基酸序列不同的氨基酸序列，該序列的不同之處在于至少一個(gè)選自下組的取代T1C，P2C，L3C，G4C，P5C，A6C，S7C，S8C，L9C，P10C，Q11C，S12C，F(xiàn)13C，L14C，L15C，E19C，Q20C，V21C，R22C，Q25C，G26C，D27C，A29C，A30C，E33C，A37C，T38C，Y39C，L41C，H43C，P44C，E45C，E46C，V48C，L49C，L50C，H52C，S53C，L54C，I56C，P57C，P60C，L61C，S62C，S63C，P65C，S66C，Q67C，A68C，L69C，Q70C，L71C，A72C，G73C，S76C，Q77C，L78C，S80C，F(xiàn)83C，Q86C，G87C，Q90C，E93C，G94C，S96C，P97C，E98C，L99C，G100C，P101C，T102C，D104C，T105C，Q107C，L108C，D109C，A111C，D112C，F(xiàn)113C，T115C，T116C，W118C，Q119C，Q120C，M121C，E122C，E123C，L124C，M126C，A127C，P128C，A129C，L130C，Q131C，P132C，T133C，Q134C，G135C，A136C，M137C，P138C，A139C，A141C，S142C，A143C，F(xiàn)144C，Q145C，R146C，R147C，S155C，H156C，Q158C，S159C，L161C，E162C，R166C，V167C，L168C，R169C，H170C，L171C，A172C，Q173C和P174C，和ii)至少一個(gè)附著至該多肽的半胱氨酸殘基上的非多肽組分。
7.一種偶聯(lián)物，其包含i)一種顯示G-CSF活性的多肽，該多肽包含與SEQ ID NO1所示氨基酸序列不同的氨基酸序列，該序列的不同之處在于至少一個(gè)選自下組的取代T1D/E，P2D/E，L3D/E，G4D/E，P5D/E，A6D/E，S7D/E，S8D/E，L9D/E，PIOD/E，Q11D/E，S12D/E，F(xiàn)13D/E，L14D/E，L15D/E，K16D/E，Q20D/E，V21D/E，R22D/E，K23D/E，Q25D/E，G26D/E，A29D/E，A30D/E，K34D/E，A37D/E，T38D/E，Y39D/E，K40D/E，L41D/E，H43D/E，P44D/E，V48D/E，L49D/E，L50D/E，H52D/E，S53D/E，L54D/E，I56D/E，P57D/E，P60D/E，L61D/E，S62D/E，S63D/E，P65D/E，S66D/E，Q67D/E，A68D/E，L69D/E，Q70D/E，L71D/E，A72D/E，G73D/E，S76D/E，Q77D/E，L78D/E，S80D/E，F(xiàn)83D/E，Q86D/E，G87D/E，Q90D/E，G94D/E，S96D/E，P97D/E，L99D/E，G100D/E，P101D/E，T102D/E，T105D/E，Q107D/E，L108D/E，A111D/E，F(xiàn)113D/E，T115D/E，T116D/E，W118D/E，Q119D/E，Q120D/E，M121D/E，L124D/E，M126D/E，A127D/E，P128D/E，A129D/E，L130D/E，Q131D/E，P132D/E，T133D/E，Q134D/E，G135D/E，A136D/E，M137D/E，P138D/E，A139D/E，A141D/E，S142D/E，A143D/E，F(xiàn)144D/E，Q145D/E，R146D/E，R147D/E，S155D/E，H156D/E，Q158D/E，S159D/E，L161D/E，V163D/E，S164D/E，Y165D/E，R166D/E，V167D/E，L168D/E，R169D/E，H170D/E，L171D/E，A172D/E，Q173D/E和P174D/E，和ii)至少一個(gè)附著至該多肽的天冬氨酸或谷氨酸殘基上的非多肽組分。
8.權(quán)利要求7的偶聯(lián)物，其中所述多肽包含至少一個(gè)選自Q67D/E，Q70D/E，Q77D/E，Q86D/E，Q90D/E，Q120D/E，Q131D/E，Q134D/E，Q145D/E和Q173D/E的取代；和/或至少一個(gè)選自D27N，D104N，D109N，D112N，E19Q，E33Q，E45Q，E46Q，E93Q，E98Q，E122Q，E123Q和E163Q的取代。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述非多肽組分選自天然的和合成的均聚物和雜聚物。
10.權(quán)利要求9的偶聯(lián)物，其中所述聚合物是選自線性或分支的聚乙二醇，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸和聚-(乙烯吡咯烷酮)的合成型均聚物或雜聚物。
11.權(quán)利要求10的偶聯(lián)物，其中所述聚合物是線性或分支的聚乙二醇。
12.權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中所述聚乙二醇的分子量約1000-15,000Da。
13.權(quán)利要求11或12的偶聯(lián)物，其包含2-8個(gè)聚乙二醇組分。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述多肽與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相比有1-15個(gè)氨基酸殘基不同。
15.權(quán)利要求14的偶聯(lián)物，其中所述多肽與SEQ ID NO1所示氨基酸序列相比有2-10個(gè)氨基酸殘基不同。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述多肽已糖基化。
17.權(quán)利要求16的偶聯(lián)物，其中所述多肽包含至少一個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)。
18.包含一種的顯示G-CSF活性的糖基化多肽的偶聯(lián)物，所述多肽包含與SEQ ID NO1所示氨基酸序列不同的氨基酸序列，該序列的不同之處在于通過(guò)至少一個(gè)選自下組的取代將至少一個(gè)非天然存在的糖基化位點(diǎn)引入該氨基酸序列中L3N+P5S/T，P5N，A6N，S8N+P10S/T，P10N，Q11N+F13S/T，S12N+L14S/T，F(xiàn)13N+L15S/T，L14N+K16S/T，K16N+L18S/T，E19N+V21S/T，Q20N+R22S/T，V21N+K23S/T，R22N+I24S/T，K23N+Q25S/T，Q25N+D27S/T，G26N+G28S/T，D27N+A29S/T，A29N+L31S/T，A30N+Q32S/T，E33N+L35S/T，A37N+Y39S/T，T38N+K40S/T，Y39N+L41S/T，P44N+E46S/T，E45N+L47S/T，E46N+V48S/T，V48N+L50S/T，L49N+G51S/T，LSON+H52S/T，H52N+L54S/T，S53N+G55S/T，P60N，L61N，S63N+P65S/T，P65N+Q67S/T，S66N+A68S/T，Q67N+L69S/T，A68N+Q70S/T，L69N+L71S/T，Q70N+A72S/T，L71N+G73S/T，G73N+L75S/T，S76N+L78S/T，Q77N+H79S/T，L78N，S80N+L82S/T，F(xiàn)83N+Y85S/T，Q86N+L88S/T，G87N+L89S/T，Q90N+L92S/T，E93N+I95S/T，P97N+L99S/T，L99N+P101S/T，P101N+L103S/T，T102N+D104S/T，D104N+L106S/T，T105N+Q107S/T，Q107N+D109S/T，L108N+V110S/T，D109N+A111S/T，A111N+F113S/T，D112N+A114S/T，F(xiàn)113N，T115N+I117S/T，T116N+W118S/T，W118N+Q120S/T，Q119N+M121S/T，Q120N+E122S/T，M121N+E123S/T，E122N+L124S/T，E123N+G125S/T，L124N+M126S/T，M126N+P128S/T，P128N+L130S/T，L130N+P132S/T，P132N+Q134S/T，T133N+G135S/T，Q134N+A136S/T，A136N+P138S/T，P138N+F140S/T，A139N+A141S/T，A141N+A143S/T，S142N+F144S/T，A143N+Q145S/T，F(xiàn)144N+R146S/T，Q145N+R147S/T，R146N+A148S/T，R147N+G149S/T，S155N+L157S/T，H156N+Q158S/T，S159N+L161S/T，L161N+V163S/T，E162N，V163N+Y165S/T，S164N+R166S/T，Y165N+V167S/T，R166N+L168S/T，V167N+R169S/T，L168N+H170S/T，R169N+L171S/T和H170N+A172S/T。
19.權(quán)利要求18的偶聯(lián)物，其包含至少一個(gè)選自P5N，A6N，P10N，P60N，L61N，L78N，F(xiàn)113N和E162N；或選自D27N+A29S，D27N+A29T，D104N+L106S，D104N+L106T，D109N+A111S，D109N+A111T，D112N+A114S和D112N+A114T的取代。
20.權(quán)利要求18或19的偶聯(lián)物，其中已引入兩個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。
21.權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其進(jìn)一步包含至少一個(gè)連接到所述多肽的氨基酸殘基上的非多肽組分，其中所述非多肽組分與N-或O-連接的糖組分不同。
22.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其體內(nèi)功能半壽期和/或血清半壽期與N末端附著了單個(gè)20kDa PEG組分的rhG-CSF相比已增加。
23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其滿足以下(A)-(D)中的至少一個(gè)條件(A)對(duì)大鼠按每kg體重100μg(基于所述偶聯(lián)物中多肽組分的重量)的劑量皮下給藥一次i)與按照每kg體重100μg的劑量給予非偶聯(lián)的hG-CSF相比，在給藥后12小時(shí)內(nèi)，以至少大約相等的速率增加白細(xì)胞的形成并達(dá)到至少大約相同的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))，和ii)給藥至少約96小時(shí)后，使白細(xì)胞的水平提高到超過(guò)給藥前的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))；(B)對(duì)大鼠按每kg體重25μg(基于所述偶聯(lián)物中多肽組分的重量)的劑量皮下給藥一次i)與按照每kg體重100μg的劑量給予非偶聯(lián)的hG-CSF相比，在給藥后12小時(shí)內(nèi)，以至少大約相等的速率增加白細(xì)胞的形成并達(dá)到至少大約相同的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))，和ii)給藥至少約72小時(shí)后，使白細(xì)胞的水平提高到超過(guò)給藥前的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))；(C)對(duì)大鼠按每kg體重100μg(基于所述偶聯(lián)物中多肽組分的重量)的劑量皮下給藥一次i)與按照每kg體重100μg的劑量給予非偶聯(lián)的hG-CSF相比，在給藥后12小時(shí)內(nèi)，以至少大約相等的速率增加中性粒細(xì)胞的形成并達(dá)到至少大約相同的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))，和ii)給藥至少約96小時(shí)后，使中性粒細(xì)胞的水平提高到超過(guò)給藥前的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))；(D)對(duì)大鼠按每kg體重25μg(基于所述偶聯(lián)物中多肽組分的重量)的劑量皮下給藥一次i)與按照每kg體重100μg的劑量給予非偶聯(lián)的hG-CSF相比，在給藥后12小時(shí)內(nèi)，以至少大約相等的速率增加中性粒細(xì)胞的形成并達(dá)到至少大約相同的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))，和ii)給藥至少約72小時(shí)后，使中性粒細(xì)胞的水平提高到超過(guò)給藥前的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))。
24.一種顯示G-CSF活性的多肽偶聯(lián)物，其包含一種多肽并且在該多肽的附著基團(tuán)上附著了至少一個(gè)非多肽組分，其中該多肽的氨基酸序列與SEQID NO1所示氨基酸序列相比有至少一個(gè)氨基酸殘基不同，這種多肽偶聯(lián)物的體內(nèi)功能半壽期和/或血清半壽期與N末端附著了單個(gè)20kDa PEG組分的rhG-CSF相比已增加。
25.權(quán)利要求24的多肽偶聯(lián)物，其附著有兩個(gè)或多個(gè)非多肽組分。
26.一種顯示G-CSF活性的多肽偶聯(lián)物，其包含一種多肽并且在該多肽的附著基團(tuán)上附著了至少一個(gè)非多肽組分，其中該多肽的氨基酸序列與SEQID NO1所示氨基酸序列相比有至少一個(gè)氨基酸殘基不同，這種多肽偶聯(lián)物的特征在于它滿足以下(A)-(D)中的至少一個(gè)條件(A)對(duì)大鼠按每kg體重100μg(基于所述偶聯(lián)物中多肽組分的重量)的劑量皮下給藥一次i)與按照每kg體重100μg的劑量給予非偶聯(lián)的hG-CSF相比，在給藥后12小時(shí)內(nèi)，以至少大約相等的速率增加白細(xì)胞的形成并達(dá)到至少大約相同的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))，和ii)給藥至少約96小時(shí)后，使白細(xì)胞的水平提高到超過(guò)給藥前的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))；(B)對(duì)大鼠按每kg體重25μg(基于所述偶聯(lián)物中多肽組分的重量)的劑量皮下給藥一次i)與按照每kg體重100μg的劑量給予非偶聯(lián)的hG-CSF相比，在給藥后12小時(shí)內(nèi)，以至少大約相等的速率增加白細(xì)胞的形成并達(dá)到至少大約相同的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))，和ii)給藥至少約72小時(shí)后，使白細(xì)胞的水平提高到超過(guò)給藥前的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))；(C)對(duì)大鼠按每kg體重100μg(基于所述偶聯(lián)物中多肽組分的重量)的劑量皮下給藥一次i)與按照每kg體重100μg的劑量給予非偶聯(lián)的hG-CSF相比，在給藥后12小時(shí)內(nèi)，以至少大約相等的速率增加中性粒細(xì)胞的形成并達(dá)到至少大約相同的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))，和ii)給藥至少約96小時(shí)后，使中性粒細(xì)胞的水平提高到超過(guò)給藥前的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))；(D)對(duì)大鼠按每kg體重25μg(基于所述偶聯(lián)物中多肽組分的重量)的劑量皮下給藥一次i)與按照每kg體重100μg的劑量給予非偶聯(lián)的hG-CSF相比，在給藥后12小時(shí)內(nèi)，以至少大約相等的速率增加中性粒細(xì)胞的形成并達(dá)到至少大約相同的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))，和ii)給藥至少約72小時(shí)后，使中性粒細(xì)胞的水平提高到超過(guò)給藥前的水平(計(jì)為每升血中的細(xì)胞數(shù))。
27.一種顯示G-CSF活性的多肽，其具有權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)限定的氨基酸序列。
28.一種核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求27的多肽。
29.一種表達(dá)載體，其攜有權(quán)利要求28的核苷酸序列。
30.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求28的核苷酸序列或權(quán)利要求29的表達(dá)載體。
31.制備權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述多肽偶聯(lián)物的方法，包括在可導(dǎo)致所述多肽表達(dá)的條件下依照權(quán)利要求30的宿主細(xì)胞，并收獲所述多肽，其中a)所述多肽包含至少一個(gè)N-或O-糖基化位點(diǎn)且所述宿主細(xì)胞是一種能進(jìn)行體內(nèi)糖基化的真核宿主細(xì)胞，和/或b)使所述多肽在體外與一個(gè)非多肽組分偶聯(lián)。
32.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物和一種可藥用載體或賦形劑。
33.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的多肽偶聯(lián)物或權(quán)利要求32的組合物作為藥物的應(yīng)用。
34.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物或權(quán)利要求27的多肽在制備用于治療疾病的藥物中的用途，所述疾病具體指廣泛性造血疾病包括放射治療或化療所致的疾病，白細(xì)胞減少癥，AIDS或其它免疫缺陷病，以及細(xì)菌感染或其它感染。
35.一種治療哺乳動(dòng)物的疾病的方法，包括給予有相應(yīng)需要的哺乳動(dòng)物以有效量的權(quán)利要求1-26任一項(xiàng)所述偶聯(lián)物或權(quán)利要求32所述組合物，其中所述疾病是指廣泛性造血疾病包括放射治療或化療所致的疾病，白細(xì)胞減少癥，AIDS或其它免疫缺陷病，以及細(xì)菌感染或其它感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及多肽偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物含有顯示G－CSF活性的多肽且該多肽的氨基酸序列不同于人類G－CSF序列之處在于至少引入和/或去除一個(gè)特定的氨基酸殘基，所述殘基含有一個(gè)能附著非多肽組分的基團(tuán)，并且該多肽有至少一個(gè)偶聯(lián)到該多肽的附著基團(tuán)上的非多肽組分。附著基團(tuán)可以是例如賴氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸或谷氨酸殘基或糖基化位點(diǎn)，非多肽組分可以是例如聚合物例如聚乙二醇或多糖。偶聯(lián)物有一個(gè)或多個(gè)改善的特性例如生物半壽期增加且副作用降低。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1404401SQ01803590
公開日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2001年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月10日
發(fā)明者托本·L·尼森, 金·V·安德森, 克里斯琴·K·漢森, 簡(jiǎn)·M·米凱爾森, 漢斯·T·沙姆拜伊 申請(qǐng)人:馬克西根控股公司