專利名稱：產(chǎn)生改變的免疫原性應(yīng)答的蛋白質(zhì)及制備和應(yīng)用這種蛋白質(zhì)的方法
背景技術(shù)：
用在工業(yè)，制藥和商業(yè)應(yīng)用中的蛋白質(zhì)正日益普遍。結(jié)果，由于這種普遍的應(yīng)用引起的日益增加的暴露與一些安全的危害有關(guān)，而這些安全危害是某些人對(duì)多肽敏感引起的，于是隨后的暴露引起了可能是有害的，甚至是致命的極度的變態(tài)反應(yīng)。例如，眾所周知，蛋白酶在一些個(gè)體中引起危險(xiǎn)的超敏反應(yīng)。因此，盡管蛋白酶在工業(yè)中，例如，洗衣洗滌劑，化妝品，紡織品處理中等等的用途，以及例如，提供在去垢性情況下具有更有效的去污的改進(jìn)的蛋白酶的領(lǐng)域中進(jìn)行的廣泛的研究，但是由于它們能在一些人中產(chǎn)生超敏感性的變態(tài)反應(yīng)原的應(yīng)答，在工業(yè)中蛋白酶的用途一直存在疑問。
已經(jīng)做了大量的工作以減輕這些問題。在被探索以減少蛋白酶應(yīng)用的免疫原的可能性的這些策略中，有改進(jìn)生產(chǎn)過程，這個(gè)改進(jìn)的生產(chǎn)過程通過控制和使車間的攜帶有空中傳播的蛋白酶的塵?；驘熿F劑的濃度最小化來減少可能的接觸；改進(jìn)制粒法，這個(gè)改進(jìn)的制粒法減少了實(shí)際上產(chǎn)生于蛋白酶產(chǎn)物的灰塵或煙霧劑的量；和改進(jìn)回收方法以減少在最終產(chǎn)物中潛在的變態(tài)反應(yīng)性污染物的水平。然而，實(shí)質(zhì)上，減少蛋白酶變態(tài)反應(yīng)原性的努力還相當(dāng)不成功。此外，已進(jìn)行嘗試掩飾被超敏感個(gè)體中免疫球蛋白E(IgE)識(shí)別的蛋白酶中的表位(PCT公開號(hào)WO 92/10755)，或通過連接聚合物或肽/蛋白質(zhì)到有疑問的蛋白酶上以增大抗原決定簇或改變其性質(zhì)。
當(dāng)一個(gè)適應(yīng)性免疫應(yīng)答以一種夸大的或不適合的形式出現(xiàn)時(shí)，經(jīng)歷這個(gè)反應(yīng)的個(gè)體被稱為是超敏感的。超敏感性反應(yīng)是正常地有益的免疫應(yīng)答不適合地起作用的結(jié)果，而且有時(shí)引發(fā)炎癥反應(yīng)和組織損傷。它們能被許多抗原引發(fā)；而且超敏感性反應(yīng)從一個(gè)個(gè)體到另一個(gè)個(gè)體的原因?qū)⑹遣煌?。超敏感性通常在初次和抗原接觸時(shí)不出現(xiàn)，而是常在隨后接觸后出現(xiàn)。當(dāng)IgE應(yīng)答被引導(dǎo)抗無害的環(huán)境的抗原，如花粉、塵埃微?；騽?dòng)物的毛皮垢屑時(shí)，一種形式的超敏感性就出現(xiàn)了。結(jié)果，IgE致敏的肥大細(xì)胞釋放藥理學(xué)介體，產(chǎn)生急性發(fā)炎反應(yīng)，伴隨著如哮喘或鼻炎的癥狀。
但是，包括修飾IgE位點(diǎn)的策略在阻止初期的致敏反應(yīng)的產(chǎn)生方面通常不會(huì)成功。因此，這樣的策略，雖然可能中和或減少隨后的超敏感性反應(yīng)的嚴(yán)重性，但是將不會(huì)減少實(shí)際致敏的數(shù)量或人。例如，當(dāng)知道一個(gè)人對(duì)某抗原是超敏感性的時(shí)，通常的，而且僅有的處理這種情況的安全的方法是盡可能徹底地把超敏感性的人和抗原隔離。實(shí)際上，任何其它的起作用的過程對(duì)于超敏感性的個(gè)體的健康都將是危險(xiǎn)的。因此，盡管減少特定的蛋白對(duì)于超敏感性的個(gè)體的威脅是重要的，而對(duì)于工業(yè)的目的而言，使一個(gè)蛋白質(zhì)不能首先引發(fā)超敏感性的反應(yīng)是更有價(jià)值的。
T-淋巴細(xì)胞(T-細(xì)胞)在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)，及在免疫學(xué)的效應(yīng)物功能的完成中是重要的角色?？垢腥疽蜃雍湍[瘤的特異的免疫已知依賴于這些細(xì)胞，而且這些細(xì)胞被認(rèn)為對(duì)損傷的愈合起作用。另一方面，不能控制這些應(yīng)答可能導(dǎo)致自身侵襲。一般而言，抗原以抗原提呈細(xì)胞的形式被提呈到T-細(xì)胞，這些抗原提呈細(xì)胞通過各種細(xì)胞表面機(jī)制，以一種適合于被T-細(xì)胞抗原識(shí)別的方式捕獲和顯示抗原或部分抗原。一旦在T-細(xì)胞表面的受體(T-細(xì)胞受體)識(shí)別了特異性的表位，T-細(xì)胞開始了一系列的復(fù)雜的相互作用，包括增殖，導(dǎo)致B-細(xì)胞產(chǎn)生抗體。雖然T-細(xì)胞和B-細(xì)胞都被存在于給定的蛋白或肽上的表位激活，但是被這些單核細(xì)胞識(shí)別的實(shí)際的表位通常是不同的。實(shí)際上，激活T-細(xì)胞引發(fā)免疫多樣性發(fā)生的表位很少和在免疫應(yīng)答的過程中被B-細(xì)胞后來識(shí)別的表位是相同的。因此，在超敏感性方面，雖然在T-細(xì)胞和抗原間特異性的抗原相互作用在對(duì)抗原暴露的免疫應(yīng)答的引發(fā)中是一個(gè)至關(guān)重要的要素，但是那種相互作用的特異性，即被識(shí)別的表位，常常與隨后完全的過敏反應(yīng)的發(fā)展是無關(guān)的。
PCT公開號(hào)WO 96/40791公開了利用聚環(huán)氧烷作為一種起始物質(zhì)產(chǎn)生具有減少的變態(tài)反應(yīng)原性的聚環(huán)氧烷-多肽綴合物的一種方法。
PCT公開號(hào)WO 97/30148公開了具有減少的變態(tài)反應(yīng)原性的多肽綴合物，包括含有被共價(jià)連接的兩個(gè)或多個(gè)多肽分子的一個(gè)聚合載體分子。
PCT公開號(hào)WO 96/17929公開了具有減少的變態(tài)反應(yīng)原性的多肽的方法，包括將1到30個(gè)聚合分子綴到一個(gè)母本多肽上的步驟。
PCT公開號(hào)WO 92/10755公開了生產(chǎn)蛋白質(zhì)變異體的方法，這些蛋白質(zhì)變異體在動(dòng)物中誘發(fā)減少的免疫原性應(yīng)答。在這個(gè)申請中，目的蛋白，一系列蛋白酶和變異體被用于免疫大鼠。然后，來源于鼠的血清被用于測定在免疫血清中已產(chǎn)生和存在的多克隆抗體對(duì)目的蛋白和其變異體的反應(yīng)性。從這些結(jié)果，可能確定在制備物中的抗體是相對(duì)多還是相對(duì)少地與蛋白質(zhì)和其變異體反應(yīng)，因此允許分析蛋白質(zhì)中何種改變可能中和或降低免疫球蛋白結(jié)合的能力。從對(duì)大鼠的試驗(yàn)中，得出的結(jié)論是與枯草桿菌蛋白酶309各殘基中127、128、129、130、131、151、136、151、152、153、154、161、162、163、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、186、193、194、195、196、197、247、251、261對(duì)應(yīng)的任何一個(gè)改變都將引起免疫潛力的改變。
PCT公開號(hào)WO 94/10191公開了低變態(tài)反應(yīng)原性的蛋白，包括母本單體蛋白的寡聚物形式，其中寡聚體實(shí)質(zhì)性地保留了活性。
雖然一些研究已提供了減少某些蛋白變態(tài)反應(yīng)原性及識(shí)別在一些個(gè)體中引起過敏反應(yīng)的表位的方法，但是用于鑒定這些表位的檢測通常包括預(yù)先被暴露于抗原的血清中的IgE和IgG抗體的測定。然而，一旦免疫球蛋白Ig反應(yīng)被引發(fā)，致敏就已經(jīng)出現(xiàn)了。因此，需要一種測定最先引起致敏的表位的方法，因?yàn)檫@些表位的中和將明顯地引起致敏出現(xiàn)的較小的可能性，因此降低了引發(fā)致敏的可能性。也需要產(chǎn)生一種產(chǎn)生加強(qiáng)的免疫原性應(yīng)答(immunogenic response)的蛋白質(zhì)，而且需要鑒定產(chǎn)生低的免疫原性應(yīng)答的天然存在的蛋白質(zhì)。本發(fā)明滿足了這些和其它的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了產(chǎn)生期望的免疫原性應(yīng)答(immunogenic response)的蛋白質(zhì)，鑒定和制備這種蛋白質(zhì)的方法，及應(yīng)用這種蛋白質(zhì)的方法。例如，從下面的本發(fā)明的詳細(xì)的說明中顯而易見，本發(fā)明提供的方法和組合物在形成高和低變態(tài)反應(yīng)原性組合物中是有用的。本發(fā)明所用的高和低分別表示與沒有本發(fā)明蛋白的相同的組合物比較，產(chǎn)生較強(qiáng)的或較弱的免疫原性應(yīng)答的組合物。這樣的組合物可以包括清潔組合物，紡織品處理物，隱形眼鏡清洗溶液或產(chǎn)品，肽水解產(chǎn)品，廢物處理產(chǎn)品，包括用于皮膚、頭發(fā)及口腔護(hù)理的化妝品，藥物如除血液凝結(jié)塊的產(chǎn)品，科研用的產(chǎn)品，如酶，及包括疫苗的治療劑。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明篩選和提供了目的多肽。優(yōu)選地，目的多肽有T-細(xì)胞表位，而且隨后如下面所說明的被改變。然而，也可以以天然存在的屬性為基礎(chǔ)篩選目的多肽，而不改變目的多肽。而且，可以篩選沒有T-細(xì)胞表位的目的多肽，而且改變它，使它有T-細(xì)胞表位。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含T-細(xì)胞表位的目的多肽的變異體。變異體由于具有改變的T-細(xì)胞表位而不同于目的多肽，這樣所述的變異體和所述的多肽在個(gè)體中產(chǎn)生不同免疫原性應(yīng)答?？梢灾苽浜秃Y選變異體以產(chǎn)生比所述的目的多肽更強(qiáng)或弱的免疫原性應(yīng)答。
目的多肽可以是任何目的多肽。在一個(gè)方面，該多肽選自酶、激素、因子、疫苗和細(xì)胞因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，目的多肽沒有被所述的個(gè)體識(shí)別作為對(duì)所述的個(gè)體是內(nèi)源多肽，或沒有被識(shí)別為“自身的”。如本發(fā)明所表明的，目的多肽可以是酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶選自脂肪酶、纖維素酶、內(nèi)切葡糖苷酶H(endo-glucosidase H)、蛋白酶、糖酶、還原酶、氧化酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶和磷酸酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，目的多肽和所述的目的多肽的變異體均包括至少一些相同的活性。例如，如果提供了蛋白酶的變異體，所述的變異體將產(chǎn)生改變的免疫原性應(yīng)答，但仍舊保留有可檢測到的，而且優(yōu)選地可比較的蛋白酶活性。
在提供目的多肽的變異體時(shí)，T-細(xì)胞表位可以通過許多方式改變，這些方式包括氨基酸的置換、缺失、添加或它們的聯(lián)合。優(yōu)選地，通過進(jìn)行氨基酸的置換改變T-細(xì)胞表位。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)目的多肽同系物的相應(yīng)氨基酸進(jìn)行氨基酸置換，其中的同系物與目的多肽在相應(yīng)的位置不包括同樣的T-細(xì)胞表位。在一方面，包含至少一個(gè)T-細(xì)胞表位的目的多肽的末端部分被用目的多肽的同系物的相應(yīng)末端部分所置換，其中置換產(chǎn)生了所述的不同的免疫原性應(yīng)答。在本發(fā)明提供的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼產(chǎn)生期望免疫原性應(yīng)答的多肽的核酸。而且，本發(fā)明包括含有本發(fā)明提供的核酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。而且，一旦本發(fā)明的多肽和它的變異體被鑒定，它們的實(shí)質(zhì)上同源的序列或與多肽和變異體雜交的序列可以被鑒定，而且本發(fā)明提供了這樣的序列。下面同源性被進(jìn)一步定義，而且可以稱為相似性或同一性，優(yōu)選同一性。優(yōu)選地，同源的序列是編碼具有本發(fā)明提供的多肽和變異體的活性的肽的氨基酸序列或核酸。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是測定蛋白質(zhì)產(chǎn)生的免疫原性應(yīng)答的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括(a)從單一血源獲得樹突細(xì)胞的溶液，及原初的(naive)CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞的溶液；(b)在所述的樹突細(xì)胞的溶液中促進(jìn)分化；(c)將所述的分化的樹突細(xì)胞的溶液和所述的原初的CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞與所述的蛋白混合；及(d)測定在所述的步驟(c)中T-細(xì)胞的增殖。
測定蛋白質(zhì)產(chǎn)生的免疫原性應(yīng)答的方法也可以用于鑒定蛋白質(zhì)的類似的免疫原性應(yīng)答。因此，在一個(gè)方面，測定蛋白質(zhì)免疫原性應(yīng)答的方法進(jìn)一步包括比較一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的免疫原性應(yīng)答。蛋白質(zhì)相互間可能是同系物，相同蛋白質(zhì)的變異體，相同蛋白質(zhì)的不同類型，例如，不同的蛋白酶，或相同的蛋白的不同肽。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供了改變目的多肽免疫原性的方法，包括測定所述的多肽的免疫原性；鑒定在所述的多肽中的T-細(xì)胞表位；改變所述的T-細(xì)胞表位，以改變所述的多肽的免疫原性。如本發(fā)明所說明的，所述的改變可以通過改變單一的氨基酸或用同系物的相應(yīng)部分替換目的多肽的一部分，其中這種替換產(chǎn)生改變的免疫原性應(yīng)答。
通過下面的說明，熟練的技術(shù)人員將理解本發(fā)明的其它方面。
附圖的簡要說明

圖1中A，B1，B2與B3所示是解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的枯草桿菌蛋白酶(BPN′)的DNA(SEQ IDNO 1)和氨基酸(SEQ IDNO 2)序列，及這個(gè)基因的部分限制性內(nèi)切酶圖譜。
圖2顯示來源于解淀粉芽孢桿菌(SEQ IDNO 3)與遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)(野生型)(SEQ IDNO 4)的枯草桿菌蛋白酶中的保守的氨基酸殘基。
圖3A和3B顯示來源于解淀粉芽孢桿菌(BPN′)，枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)(SEQ IDNO 5)及遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列對(duì)比。
標(biāo)記*表示與枯草桿菌蛋白酶BPN′比較，缺少特定的氨基酸殘基。
圖4顯示16個(gè)外周單核血樣品對(duì)相應(yīng)于遲緩芽孢桿菌蛋白酶(GG36)的肽的加性的T-細(xì)胞應(yīng)答(additive T-cell response)。肽E05包括含有與解淀粉芽孢桿菌蛋白酶的170-173對(duì)應(yīng)的殘基的區(qū)域。
圖5顯示10個(gè)外周單核血樣品對(duì)相應(yīng)于人枯草桿菌蛋白酶分子的肽的加性的T-細(xì)胞應(yīng)答。肽F10、F9、F8和F7都含有相應(yīng)于這樣的區(qū)域的氨基酸序列DQMD，所述區(qū)域包含與圖3的序列對(duì)比中解淀粉芽孢桿菌蛋白酶170-173位相應(yīng)的殘基。
圖6A和6B/6C分別顯示與來源于遲緩芽孢桿菌蛋白酶和人枯草桿菌蛋白酶的序列的肽對(duì)應(yīng)的氨基酸串。
圖7所示的是人的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列(SEQ IDNO 6)。
圖8顯示BPN′(解淀粉芽孢桿菌)蛋白酶，SAVINASE(遲緩芽孢桿菌)蛋白酶和人的枯草桿菌蛋白酶(S2HSBT)的氨基酸序列對(duì)比。
圖9顯示從一個(gè)已知的對(duì)遲緩芽孢桿菌蛋白酶超敏感的個(gè)體提取的樣品中，對(duì)來源于遲緩芽孢桿菌蛋白酶的肽的T-細(xì)胞應(yīng)答。肽E05代表與解淀粉芽孢桿菌蛋白酶中的170-173對(duì)應(yīng)的區(qū)域。
圖10顯示從一個(gè)已知對(duì)遲緩芽孢桿菌蛋白酶超敏感的個(gè)體提取的樣品中，對(duì)在E05遲緩芽孢桿菌蛋白酶肽組中的各種丙氨酸置換的T-細(xì)胞應(yīng)答。
圖11顯示從一個(gè)已知對(duì)蛋白酶超敏感的個(gè)體提取的一樣品中，對(duì)在E05蛋白酶肽(被命名為非修飾序列的一個(gè)T-細(xì)胞表位的實(shí)施方案)組中的各種丙氨酸置換的T-細(xì)胞應(yīng)答；每個(gè)肽的序列被示出。
圖12顯示對(duì)人的枯草桿菌蛋白酶分子應(yīng)答者的百分率。
圖13A顯示對(duì)源于Humicola insolens endogluconase(接受號(hào)A23635)的肽的T-細(xì)胞應(yīng)答。肽A02和F06代表分別與Humicola insolensendogluconase的第70-84和37-51位殘基(T細(xì)胞表位的實(shí)施方案)相對(duì)應(yīng)的區(qū)域，其中圖13B中所示是全長序列，以粗體下劃線所示的是A02和F06。
圖14A所示的是對(duì)源于Thermomyces lanuginosa脂肪酶(接受號(hào)AAC08588和PID號(hào)g2997733)的肽的T-細(xì)胞的應(yīng)答。肽B02和C06代表分別與Thermomyces lanuginosa脂肪酶的T-細(xì)胞表位實(shí)施方案第83-100和108-121位殘基相對(duì)應(yīng)的區(qū)域，其中圖14B中所示的是全長序列，以粗體下劃線所示的是B02和C06。
圖15A所示的是對(duì)源于褶皺鏈霉菌(Strepotomyces plicatus)的內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(接受號(hào)P04067)的肽的T-細(xì)胞應(yīng)答。肽C06代表與褶皺鏈霉菌的內(nèi)切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的T-細(xì)胞表位實(shí)施方案第126-140位殘基相對(duì)應(yīng)的區(qū)域，其中圖15B中所示的是全長序列，以粗體下劃線所示的是C06。
圖16所示的是對(duì)22個(gè)個(gè)體搜集的源于BPN′的肽的T-細(xì)胞應(yīng)答，其中優(yōu)選的T-細(xì)胞表位的序列被示出。
圖17所示的是對(duì)22個(gè)個(gè)體搜集的源于GG36的肽的T-細(xì)胞應(yīng)答，其中示出的是T-細(xì)胞表位實(shí)施方案的序列，優(yōu)選的是GSISYPARYANAMAVGA和GAGLDIVAPGVNVQS序列。
圖18是本發(fā)明提供的雜種蛋白的實(shí)施方案，其中N-末端包括N-末端的GG36序列，C-末端包括C-末端的BPN′序列，而且其中這些序列與圖8中所示那些序列比較表明形成的雜合物缺失了每個(gè)蛋白的優(yōu)選的T-細(xì)胞表位。
本發(fā)明的詳細(xì)說明根據(jù)本發(fā)明，提供了鑒定T-細(xì)胞表位的方法。而且，可以根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定具有相對(duì)無效的或相對(duì)有效的T-細(xì)胞表位，或無T-細(xì)胞表位的包括天然出現(xiàn)蛋白質(zhì)在內(nèi)的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明允許產(chǎn)生期望的免疫原性應(yīng)答的蛋白質(zhì)的鑒定和產(chǎn)生，包括天然存在的蛋白質(zhì)及被突變以產(chǎn)生適合應(yīng)答的蛋白質(zhì)。應(yīng)理解，有時(shí)術(shù)語蛋白質(zhì)、多肽和肽可互換使用。其中肽是蛋白質(zhì)的一部分，熟練的技術(shù)人員通過術(shù)語應(yīng)用的上下文能理解這點(diǎn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定表位和非表位的檢測法，如下分化的樹突細(xì)胞與原初的人的CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞及目的肽混合。更詳細(xì)地，所提供的識(shí)別T-細(xì)胞表位的方法包括如下步驟(a)從單一血源獲得樹突細(xì)胞的溶液，及原初的CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞的溶液；(b)在所述的樹突細(xì)胞的溶液中促進(jìn)分化；(c)將所述的分化的樹突細(xì)胞的溶液和所述的原初的CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞與目的肽混合；(d)測定在所述的步驟(c)中的T-細(xì)胞的增殖。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于分析的目的肽源于目的多肽。在本發(fā)明的實(shí)踐中，可能精確地鑒定能在個(gè)體或個(gè)體的采樣中引起致敏性的表位的位置。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備了與目的多肽的全部或部分相對(duì)應(yīng)的一系列肽寡聚物。例如，產(chǎn)生了覆蓋了蛋白質(zhì)的相關(guān)的部分或全部的肽文庫。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生肽的方法是引入重疊至肽文庫中，例如產(chǎn)生與主題蛋白質(zhì)的氨基酸序列1-10對(duì)應(yīng)的第一肽，與主題蛋白質(zhì)的氨基酸序列4-14對(duì)應(yīng)的第二肽，與主題蛋白質(zhì)的氨基酸序列7-17對(duì)應(yīng)的第三肽，與主題蛋白質(zhì)的氨基酸序列10-20對(duì)應(yīng)的第四肽等等，直到與整個(gè)分子相對(duì)應(yīng)的代表性的肽都產(chǎn)生為止。通過在本發(fā)明提供的檢測法中單獨(dú)分析每個(gè)肽，可能精確地鑒定出T-細(xì)胞識(shí)別的表位的位置。在上述的實(shí)例中，一個(gè)特定的肽比它的鄰接的肽的較強(qiáng)的反應(yīng)將有利于表位錨定區(qū)域鑒定在三個(gè)氨基酸內(nèi)。測定這些表位的位置后，可能改變每個(gè)表位內(nèi)的氨基酸，直到肽產(chǎn)生了不同于原始蛋白的的T-細(xì)胞應(yīng)答。作為替代方案，可以用表位的原始的形式以刺激抗感染因子或腫瘤細(xì)胞等靶標(biāo)的免疫應(yīng)答。而且，可以用本發(fā)明鑒定有期望的高或低T-細(xì)胞表位效力的蛋白質(zhì)，它們可以以天然存在的形式被應(yīng)用。
用在本發(fā)明中的“抗原提呈細(xì)胞”指的是提呈抗原在其表面以致可被T-細(xì)胞表面上的受體識(shí)別的免疫系統(tǒng)細(xì)胞?？乖岢始?xì)胞的例子是樹突細(xì)胞、交錯(cuò)突細(xì)胞、活化的B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。
用在本發(fā)明中的“T-細(xì)胞增殖”指的是在有或無抗原的情況下，T-細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞溫育期間產(chǎn)生的T-細(xì)胞的量。
用在本發(fā)明中的“基線T-細(xì)胞增殖”指的是在缺少肽或蛋白質(zhì)抗原的情況下，在個(gè)體中正常觀察到的對(duì)抗原提呈細(xì)胞暴露應(yīng)答的T-細(xì)胞增值。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，基線T-細(xì)胞增值水平在每個(gè)個(gè)體的每個(gè)樣品的基礎(chǔ)上被測定為缺少抗原的情況下對(duì)抗原提呈細(xì)胞應(yīng)答的T-細(xì)胞增值。
用在本發(fā)明中的“T-細(xì)胞表位”指的是在對(duì)包括那個(gè)抗原的肽的免疫應(yīng)答的引發(fā)中被T-細(xì)胞受體識(shí)別的肽或蛋白質(zhì)的特征。T細(xì)胞識(shí)別T細(xì)胞表位通常認(rèn)為是通過這樣的機(jī)理，在該機(jī)理中，T-細(xì)胞識(shí)別連接到在抗原提呈細(xì)胞上表達(dá)的I類或II類主要組織相容性(MHC)分子上的抗原的肽片段(參見，例如Moeller，G.主編，“Antigenic Requirementsfor Activation of MHC-Restricted Response，”ImmunologicalReview，98卷，187頁(Copenhagen；Munksgaard)(1987)。
用在本發(fā)明中的“樣品”包括原初的單個(gè)核細(xì)胞，即對(duì)于討論的抗原未致敏的。
用在本發(fā)明中的“同系物”指的是與目的蛋白有類似的催化作用，結(jié)構(gòu)和/或用途的蛋白質(zhì)或酶。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，同系物和目的蛋白不必是進(jìn)化相關(guān)的，例如，不同種屬的相同功能的蛋白質(zhì)。期望發(fā)現(xiàn)一種與目的蛋白在三級(jí)和/或一級(jí)結(jié)構(gòu)上相似的同系物，因?yàn)橛猛滴锏念愃破沃脫Q目的蛋白中的表位將減少改變的破壞。因此，密切同源的酶將提供最期望的表位置換的來源?；蛘?，如果可能，考慮給定的蛋白質(zhì)的人的類似物是有益的。例如，用枯草桿菌蛋白酶的人的類似物(即人的枯草桿菌蛋白酶)的序列置換細(xì)菌枯草桿菌蛋白酶中的特定表位將在該細(xì)菌蛋白中引起較弱的變態(tài)反應(yīng)原性。
通過確保在表位上或其附近置換的氨基酸顯示與目的蛋白中的氨基酸類似的功能，三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或保守的殘基，可以確定“類似的”序列。這樣，若表位區(qū)域包括，例如，α-螺旋或β-片層結(jié)構(gòu)，則置換氨基酸將保持那種特定的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明提供的檢測法確定的表位隨后被修飾以減小或增大目的蛋白的免疫潛能。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在一個(gè)樣品中，將要被修飾的表位產(chǎn)生比基線T-細(xì)胞增殖大3倍的T-細(xì)胞增殖水平。當(dāng)被修飾時(shí)，在一個(gè)樣品中，表位產(chǎn)生比基線T-細(xì)胞增殖小3倍的，優(yōu)選比基線T-細(xì)胞增殖小2倍的，最優(yōu)選比基線T-細(xì)胞增殖小或?qū)嵸|(zhì)上相同的T-細(xì)胞增值水平。
優(yōu)選地，通過下面的方式之一修飾表位(a)用目的蛋白的人同系物的類似序列置換表位的氨基酸序列；(b)用目的蛋白的非人同系物的類似序列置換表位的氨基酸序列，其中，由于T-細(xì)胞表位的識(shí)別，類似的序列比目的蛋白質(zhì)產(chǎn)生較弱的免疫原的，如變態(tài)反應(yīng)原的應(yīng)答；(c)用實(shí)質(zhì)上模擬表位的主要三級(jí)結(jié)構(gòu)屬性的序列置換表位的氨基酸序列，但是，其中，由于T-細(xì)胞表位的識(shí)別，這個(gè)序列比目的蛋白質(zhì)產(chǎn)生較弱的免疫原的，如變態(tài)反應(yīng)原性的應(yīng)答；或(d)由于T-細(xì)胞表位的識(shí)別，用任何比目的蛋白質(zhì)產(chǎn)生較弱的免疫原的，如變態(tài)反應(yīng)原性的應(yīng)答的序列。
然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地意識(shí)到表位可以以其它方式進(jìn)行修飾，這取決于期望的結(jié)果。例如，如果期望得到T-細(xì)胞疫苗，則可考慮用通過增強(qiáng)的MHC結(jié)合和/或T-細(xì)胞識(shí)別增強(qiáng)對(duì)肽免疫應(yīng)答的氨基酸置換表位的氨基酸序列。在另一個(gè)具體實(shí)例中，如果期望改變抗自身抗原的自身免疫應(yīng)答，可考慮用在發(fā)炎或其它免疫應(yīng)答中減少或引起轉(zhuǎn)變的氨基酸置換表位的氨基酸序列。
本發(fā)明延伸到期望調(diào)節(jié)其免疫原性應(yīng)答的所有蛋白質(zhì)，例如，用做T-細(xì)胞疫苗的肽，或用做例如抗癌癥，感染性疾病和自身免疫疾病的治療因子的肽或蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)容易地意識(shí)到本發(fā)明的蛋白質(zhì)和肽不必然是天然的蛋白質(zhì)和肽。實(shí)際上，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明說明的檢測法被用于測定源于改組基因的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。基因改組和這樣基因的表達(dá)的說明參見，Stemmer，Pro.Nat’l Acad.Sci.USA 91-10747(1994)；Patten等，Current Opinion in Biotechnol.8724(1997)；Kuchner&Arnold，Trends Biotechnol.15523(1997)；Moore等，J.Mol.Biol.272336(1997)；Zhao等，Nature Biotechnol.16258(1998)；Giver等，Pro.Nat’l Acad.Sci.USA95-12809(1998)；Harayama，Trends Biotechnol.1676(1998)；Lin等，Biotechnol.，Prog.15467(1999)；和Sun，J.Comput.Biol.677(1999)。該檢測法被用于預(yù)測被改組的基因編碼的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。一旦被確定，蛋白質(zhì)可以改變以調(diào)節(jié)對(duì)該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
除了上述的蛋白質(zhì)和肽外，本發(fā)明能被用于減少蛋白質(zhì)的變態(tài)反應(yīng)原性。這些蛋白質(zhì)包括，但不限于葡聚糖酶、脂肪酶、纖維素酶、內(nèi)切葡糖苷酶H(endo-H)、蛋白酶、糖酶、還原酶、氧化酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶、磷酸酶、淀粉酶等等。除了減少天然存在的氨基酸序列對(duì)動(dòng)物，如人的變態(tài)反應(yīng)原性外，本發(fā)明包含減少突變的人的蛋白質(zhì)的變態(tài)反應(yīng)原性，如被改變的以改變蛋白質(zhì)的功能活性的蛋白質(zhì)。在許多情況下，人蛋白質(zhì)的突變，例如增加活性，在突變的蛋白質(zhì)中引起了新的T-細(xì)胞表位的加入。本發(fā)明的檢測法可以被用于確定新的T-細(xì)胞表位的存在，和確定將減少突變蛋白質(zhì)的變態(tài)反應(yīng)原性的置換氨基酸。
盡管本發(fā)明包含上述的蛋白質(zhì)和許多其它蛋白質(zhì)，為簡單起見，下面將說明一個(gè)特別優(yōu)選的本發(fā)明的實(shí)施方案——蛋白酶的修飾。蛋白酶是羰基水解酶，它通常起作用切斷蛋白質(zhì)或肽的肽鍵。用在本發(fā)明中的蛋白酶指的是天然存在的蛋白酶或重組蛋白酶。天然存在的蛋白酶包括α-氨酰肽水解酶，肽基氨基酸水解酶、?；被饷?、絲氨酸羧肽酶、金屬羧肽酶、巰基蛋白酶、羧基蛋白酶和金屬蛋白酶。絲氨酸、金屬、巰基和酸性蛋白酶是被包括在內(nèi)的，也包括內(nèi)切和外切蛋白酶。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了雜種多肽?！半s種多肽”是來源于至少兩個(gè)不同蛋白質(zhì)的工程蛋白質(zhì)，優(yōu)選地，所述至少兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)相互是同系物。例如，一個(gè)優(yōu)選的雜種多肽可以有一個(gè)蛋白質(zhì)的N-末端和該蛋白質(zhì)的同系物的C-末端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這兩個(gè)末端可以被組合成對(duì)應(yīng)全長的活性蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，同系物共有實(shí)質(zhì)上的相似性，但是沒有同樣的T-細(xì)胞表位。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，例如在C-末端有一個(gè)或多個(gè)T-細(xì)胞表位的目的多肽可以被同系物的C-末端置換其C-末端，該同系物的C-末端有較弱的T-細(xì)胞表位，較少的T-細(xì)胞表位，或無T-細(xì)胞表位。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，通過能鑒定在同系物中的T-細(xì)胞表位，能形成產(chǎn)生不同免疫原應(yīng)答的各種變體。而且可以理解，內(nèi)部和多個(gè)同系物能被用于產(chǎn)生本發(fā)明的變異體。
更一般地，本發(fā)明提供的變異體可以通過前體氨基酸序列一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失、插入、或它們的聯(lián)合來源于前體氨基酸序列。盡管這樣的修飾優(yōu)選地是針對(duì)編碼前體酶的氨基酸序列的“前體DNA序列”，但是這樣的修飾可能是通過前體蛋白質(zhì)的操作。前體DNA序列這類操作的適合方法包括本發(fā)明公開的方法，也包括對(duì)這個(gè)領(lǐng)域技術(shù)人員共知的方法(參看，例如，EP 0328299，WO89/06279及這里已經(jīng)參考引用的美國專利和申請)。
枯草桿菌蛋白酶是細(xì)菌或真菌蛋白酶，通常通過切斷蛋白質(zhì)或肽的肽鍵起作用。用在本發(fā)明中的枯草桿菌蛋白酶指的是天然存在的枯草桿菌蛋白酶或重組枯草桿菌蛋白酶。一系列天然存在的枯草桿菌蛋白已知被各種微生物物種產(chǎn)生，并常常被其分泌。這個(gè)系列的成員的氨基酸序列不是完全同源的。然而，在這個(gè)系列中的枯草桿菌蛋白酶顯示出相同或相似類型的蛋白水解活性。這類絲氨酸蛋白酶共有一個(gè)定義催化作用三聯(lián)體的共同氨基酸序列，這將其與糜蛋白酶相關(guān)類型絲氨酸蛋白酶區(qū)別開?？莶輻U菌蛋白酶和糜蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶都有催化作用三聯(lián)體，這個(gè)三聯(lián)體包含天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸。在枯草桿菌蛋白酶相關(guān)的蛋白酶中這些氨基酸的相對(duì)的順序，從氨基到羧基末端讀是天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸。然而，在糜蛋白酶相關(guān)的蛋白酶中，相對(duì)的順序是組氨酸-天冬氨酸-絲氨酸。因此，本發(fā)明的枯草桿菌蛋白酶指的是有枯草桿菌蛋白酶相關(guān)的蛋白酶的催化作用三聯(lián)體的絲氨酸蛋白酶。實(shí)例包括但不限于本發(fā)明圖3中鑒定的枯草桿菌蛋白酶。一般地，而且對(duì)于本發(fā)明的目的而言，在蛋白酶中氨基酸的編號(hào)是與圖1所示分配給成熟的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶序列的編號(hào)是對(duì)應(yīng)的。
“重組體”、“重組枯草桿菌蛋白酶”、“重組蛋白酶”指的是枯草桿菌蛋白酶或蛋白酶，其中編碼枯草桿菌蛋白酶或蛋白酶的DNA序列被修飾產(chǎn)生變異體(或突變)DNA序列，該DNA序列編碼天然存在的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失或插入。產(chǎn)生這樣修飾、及可以與本發(fā)明公開的方法結(jié)合的適合方法包括在美國專利4,760,025(RE 34,606)，美國專利5,204,015和美國專利5,185,258中公開的方法。
“非人枯草桿菌蛋白酶”和編碼它們的DNA可以從許多原核和真核生物中獲得。原核生物體適合的例子包括革蘭氏陰性生物，如大腸桿菌(E.coli)或假單胞菌，及革蘭氏陽性菌，如微球菌或芽孢桿菌。可以得到枯草桿菌蛋白酶和它們的基因的真核生物的例子包括酵母，如釀酒酵母，真菌如曲霉屬物種。
“人枯草桿菌蛋白酶”指的是人源的有枯草桿菌蛋白酶類型的催化活性的蛋白質(zhì)，例如，Kexin家族人源蛋白酶。這樣的蛋白的實(shí)例如圖7中的序列所示。此外，本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)的衍生物或同系物，包括來自于非人源如鼠或兔的那些，它們保持著肽的基本活性，如水解肽鍵的能力等等，同目的多肽有至少50％，優(yōu)選至少65％，而且最優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，而且有時(shí)多達(dá)95％或98％的同源性。在一個(gè)實(shí)施方案中，目的多肽如附圖所示。
本發(fā)明的氨基酸位置序號(hào)指的是圖1所示分配給成熟的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶序列的序號(hào)。然而，本發(fā)明不限于這種特定枯草桿菌蛋白酶的突變，而延伸到含有與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中特定指定殘基“等同的(equivalent)”位置的氨基酸殘基的前體蛋白酶。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，前體蛋白酶是遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶并在與上述列出的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的遲緩芽孢桿菌中的等同氨基酸殘基處進(jìn)行置換、缺失或插入。
如果前體蛋白酶的殘基(氨基酸)與解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的特定殘基或殘基部分是同源的(即在一級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)中位置是對(duì)應(yīng)的)或類似的(即有相同或相似的化學(xué)上結(jié)合，反應(yīng)或相互作用的功能能力)，那么前體蛋白酶的殘基(氨基酸)與解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的殘基是等同的。
本發(fā)明所用的“對(duì)應(yīng)的”通常指的是沿著肽的類似位置。
為了確定與原始結(jié)構(gòu)的同源性，前體蛋白酶的氨基酸序列直接和解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的原初序列比較，特別是與在已知序列的枯草桿菌蛋白酶中已知不變的一組殘基比較。例如，本發(fā)明圖2所示的是解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶和遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶間的保守殘基。對(duì)比保守的殘基后，為了保持對(duì)比，可以進(jìn)行必要的插入和缺失(即避免通過任意的缺失和插入消除保守殘基)，與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的原初序列中特定的氨基酸等同的殘基被限定。保守殘基的對(duì)比優(yōu)選地應(yīng)保守100％的這樣殘基。然而，大于75％或少至50％保守殘基的對(duì)比也足夠限定等同的殘基。催化作用三聯(lián)體，Asp32/His64/Ser221的保守性應(yīng)被保持。
例如，解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(carlsbergensis)和遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶氨基酸序列可以被對(duì)比以提供氨基酸序列間的最大量的同源性。這些序列的比較表明在每個(gè)序列中包含有大量的保守的殘基。在圖2中鑒定出了在BPN′和遲緩芽孢桿菌間保守的殘基。
因此，這些保守的殘基可被用于限定在其它枯草桿菌蛋白酶中解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶對(duì)應(yīng)的等同的氨基酸殘基，如遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶(PCT公開號(hào)WO89/06279,1989年7月13日公開)，本發(fā)明優(yōu)選的蛋白酶前體酶，或與優(yōu)選的遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶有高度同源性的稱為PB92(EP 0 328 299)的枯草桿菌蛋白酶。這些枯草桿菌蛋白酶的某些氨基酸序列在圖3A和3B中與解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的序列對(duì)比以產(chǎn)生保守殘基的最大同源性。如所觀察到的，遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶和解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶比較，在序列中存在大量的缺失。因此，例如，在解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶中Val165在其它枯草桿菌蛋白酶中的等同氨基酸，對(duì)于遲緩芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌而言是異亮氨酸。
因此，例如，在解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶中+170位置的氨基酸是賴氨酸(K)，Savinase中是精氨酸(R)。然而，在本發(fā)明的蛋白酶變異體的一個(gè)實(shí)施方案中，與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的+170位置等同的氨基酸被天冬氨酸(D)置換了。在本發(fā)明中對(duì)所有的氨基酸的縮寫和一字母代碼符合PatentIn用戶手冊(GenBank，Moutain View，CA)1990，第101頁。
通過用“序列比較算法”也可以確定同源序列。可通過如下方式進(jìn)行用于比較的最優(yōu)序列對(duì)比，如通過局部的同源性算法(Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981))，通過同源性對(duì)比算法(Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970))，通過檢索相似性的方法(Pearson&Lipman，Pro.Nat’l Acad.Sci.USA 852444(1998))，通過這些算法的計(jì)算機(jī)化工具(在Wisconsing GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，W1中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，TFASTA)，或通過目測。
適合測定序列相似性的算法的一個(gè)例子是BLAST算法，這在Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)中說明了。進(jìn)行BLAST分析的軟件通過The National Center for BiotechnologyInformation(http//wWw.ncbi.nlm.nih.gov/)是公共可用的。這種算法包括首先，通過在查詢序列中鑒定當(dāng)在數(shù)據(jù)庫序列中對(duì)比相同長度的字(word)時(shí)，或是匹配或是滿足某正的域值分?jǐn)?shù)T的長度為W的短字，鑒定出高分序列對(duì)(HSPs)。這些最初的鄰近字命中，作為開始的點(diǎn)去發(fā)現(xiàn)包含它們的較長的HSPs。這些字命中將沿著被比較的兩個(gè)序列的每個(gè)的兩個(gè)方向盡可能遠(yuǎn)的延伸，只要積累對(duì)比分值增大。當(dāng)積累對(duì)比分值從獲得的最大值回落數(shù)量X時(shí)；積累對(duì)比分值達(dá)到或低于零時(shí)；或任一個(gè)序列到達(dá)末端時(shí)，字命中延伸被停止。BLAST算法的參數(shù)W，T和X決定了對(duì)比的敏感性和速度。BLAST程序使用默認(rèn)的字長值(W)為11，BLOSUM62分值矩陣(參見Henikoff&Henikoff Pro.Nat’lAcad.Sci.USA 89，10915-10919(1989))對(duì)比(B)值為50，期望值(E)為10，M′5，N′4和兩條鏈的對(duì)比。
隨后BLAST算法對(duì)兩個(gè)序列之間的相似性進(jìn)行一個(gè)統(tǒng)計(jì)分析(參見例如Karlin&Altschul Pro.Nat’l Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。BLAST算法提供的一種相似性量度是最小的總概率(P(N))，這個(gè)值提供了兩條核苷酸序列或氨基酸序列間偶然出現(xiàn)匹配的可能性的指標(biāo)。例如一個(gè)氨基酸序列與一個(gè)蛋白質(zhì)，如蛋白酶相比較，如果在比較中，最小總概率小于約0.1，優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001，那么認(rèn)為這個(gè)氨基酸序列和該蛋白質(zhì)是相似的。
也可以通過測定前體蛋白在三級(jí)結(jié)構(gòu)水平上的同源性定義“等同的殘基”，其中前體蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)已通過x-射線晶體學(xué)被測定。等同的殘基被定義為在對(duì)比后，前體蛋白如蛋白酶和解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的特定氨基酸殘基兩個(gè)或多個(gè)主鏈原子(N對(duì)N，CA對(duì)CA，C對(duì)C，O對(duì)O)的原子坐標(biāo)在0.13nm內(nèi)，優(yōu)選0.1nm內(nèi)的殘基。在最佳的模型已被定向和定位使得蛋白(如所述蛋白酶)和解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的非氫蛋白原子的原子坐標(biāo)有最大的重疊后，達(dá)到對(duì)比，最佳模型是晶體學(xué)模型，這個(gè)模型給出了在可用的最高的分辨率時(shí)，實(shí)驗(yàn)的折射數(shù)據(jù)的最低的R因子。
與解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶特定的殘基功能類似的等同的殘基被定義為前體蛋白如蛋白酶的這樣的氨基酸其采用一種構(gòu)型，這樣它們以一種限定的和歸因于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶特定殘基的方式改變、修飾或有助于蛋白結(jié)構(gòu)，底物結(jié)合或催化作用。進(jìn)一步，它們是前體蛋白，例如，蛋白酶(它的三級(jí)結(jié)構(gòu)已通過x-射線晶體學(xué)得到)的在一定程度上占有類似位置的那些殘基，以致雖然在占有同源位置的基礎(chǔ)上，給定殘基的主鏈原子可以不滿足等同物的標(biāo)準(zhǔn)，但是殘基的側(cè)鏈原子中至少兩個(gè)的原子坐標(biāo)位于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的對(duì)應(yīng)的側(cè)鏈原子的0.13nm內(nèi)。解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)描述在EPO公開號(hào)0 251 446(與美國專利5,182,204是等同的，這個(gè)公開被并入本發(fā)明的參考文獻(xiàn)中)中，而且能夠按以上描述用于測定在三級(jí)結(jié)構(gòu)的水平上等同的殘基。
被鑒定用來置換、插入或缺失的一些殘基是保守的殘基，而其它的則不是。在殘基不是保守的情況下，一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換被限于產(chǎn)生這種變異體的置換，該變異體具有與自然界中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列不對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。在保守殘基的情況下，這樣的置換不應(yīng)產(chǎn)生天然存在的序列。本發(fā)明的變異體包括蛋白變異體的成熟形式，也包括該蛋白變異體的原(pro)-，前原(prepro)-形式。前原形式是優(yōu)選的結(jié)構(gòu)，因?yàn)檫@有利于蛋白變異體的表達(dá)，分泌和成熟。
“原序列”指的是結(jié)合在蛋白質(zhì)成熟形式的N-末端部分的氨基酸序列，當(dāng)這個(gè)原序列被除去產(chǎn)生了蛋白質(zhì)的“成熟”的形式。在自然界中發(fā)現(xiàn)的許多蛋白水解的酶是翻譯的酶原產(chǎn)物，而且在缺乏翻譯后加工時(shí)以這種方式被表達(dá)。雖然其它的原序列也是可用的，一個(gè)優(yōu)選的產(chǎn)生蛋白質(zhì)變異體，如蛋白酶變異體的原序列是解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的推定的原序列。
“信號(hào)序列”或“前序列”指的是可以參與蛋白質(zhì)的成熟或原形式分泌、結(jié)合到蛋白質(zhì)的N-末端部分或蛋白原的N-末端部分的任何氨基酸序列。這種信號(hào)序列的定義是一個(gè)功能性的定義，意思是包括被蛋白質(zhì)基因的N-末端部分編碼的，在自然情況下參與蛋白質(zhì)分泌實(shí)現(xiàn)的所有那些氨基酸序列。本發(fā)明利用了這樣的序列實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所定義的蛋白質(zhì)變異體的分泌。一個(gè)可能的信號(hào)序列包含被融合至遲緩芽孢桿菌(ATCC2153)枯草桿菌蛋白酶的其余信號(hào)序列的枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶信號(hào)序列的最初7個(gè)氨基酸殘基。
蛋白質(zhì)變異體的“前原”形式由具有可操作地連接到蛋白質(zhì)的氨基末端的原序列，及可操作地連接到原序列的氨基末端的“前”或“信號(hào)”序列的蛋白質(zhì)的成熟形式組成。
“表達(dá)載體”指的是包含可操作地連接到適合控制序列的DNA序列的DNA結(jié)構(gòu)，該控制序列能夠?qū)崿F(xiàn)所述的DNA在適合的宿主中表達(dá)。這樣的控制序列包括實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，控制這種轉(zhuǎn)錄的可選的操縱基因序列，編碼適合的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。該載體可以是質(zhì)粒，噬菌體顆粒，或簡單地潛在的基因組插入物。一旦轉(zhuǎn)化進(jìn)入適合的宿主，載體可以復(fù)制和獨(dú)立于宿主的基因組起作用，或可以，在某些情況下，整合其自身進(jìn)入基因組。因?yàn)橘|(zhì)粒是目前最普遍應(yīng)用的載體形式，所以在本發(fā)明的說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”有時(shí)相互可互換地使用。然而，本發(fā)明旨在包括起等同作用的本領(lǐng)域已知或?qū)⒁阎倪@樣的其它形式表達(dá)載體。
用在本發(fā)明中的“宿主細(xì)胞”通常是原核或真核宿主，優(yōu)選地，該宿主通過在美國專利4,760,025(RE 34,606)中公布的方法操作而使得宿主不能分泌酶活性的內(nèi)切蛋白酶。表達(dá)蛋白質(zhì)的一個(gè)優(yōu)選的宿主細(xì)胞是芽孢桿菌菌株BG2036，它在酶活性的中性蛋白質(zhì)和堿性蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶)方面是缺陷的。在美國專利5,264,366中詳細(xì)地說明了BG2036菌株的構(gòu)造。表達(dá)蛋白質(zhì)的其它的宿主細(xì)胞包括枯草芽孢桿菌I168(也描述于美國專利4,760,025(RE 34,606)和美國專利5,264,366中，其公布被并入本發(fā)明的參考文獻(xiàn)中)，和任何適合的芽孢桿菌株系，如地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌等等。
宿主細(xì)胞被用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。這些技術(shù)能在任何分子生物學(xué)實(shí)踐指南中被發(fā)現(xiàn)。例如，Sambrook等，MolecularCloning-A Laboratory Manual(第2版)卷1-3，Cold Springs HarborPublishing(1989)(“Sambrook”)；及Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等(eds.)，Current Protocols，a joint venturebetween Greene Publishing Associate，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.，(1997，增補(bǔ))(“Ausubel”)。這樣的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞具有復(fù)制編碼蛋白質(zhì)變異體的載體或表達(dá)期望的蛋白質(zhì)變異體的能力。在編碼蛋白質(zhì)變異體的前-或前原-形式的載體的情況下，這樣的變異體，當(dāng)被表達(dá)時(shí)，通常從宿主細(xì)胞被分泌進(jìn)入宿主細(xì)胞介質(zhì)中。
“可操作地連接”，當(dāng)說明兩個(gè)DNA區(qū)域間的關(guān)系時(shí)，簡單地指它們是功能上相互相關(guān)的。例如，一個(gè)前序列，如果它做為一信號(hào)序列起作用，參與極可能涉及信號(hào)序列切割的蛋白質(zhì)的成熟形式的分泌，則是可操作地被連接到肽上。如果啟動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子可操作地連接到編碼序列上；核糖體結(jié)合位點(diǎn)如果被定位以允許翻譯，則是可操作地被連接到編碼序列上。
編碼天然存在的前體蛋白質(zhì)的基因可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常用方法獲得。這些方法一般包括合成具有編碼目的蛋白區(qū)域的推定序列的標(biāo)記探針，從表達(dá)蛋白質(zhì)的生物體中制備基因組文庫，通過和探針雜交篩選文庫尋找目的基因。隨后，陽性的雜交克隆被繪制圖譜和測序。
可使用“雜交”分析是否給定的DNA片段或基因與本發(fā)明描述的DNA序列是對(duì)應(yīng)的，而且因此在本發(fā)明的范圍中。用于雜交的樣品在瓊脂糖凝膠上電泳(例如，0.8％的瓊脂糖)，這樣DNA片段的分離通根據(jù)大小能被觀察到。DNA片段通常通過溴乙錠染色觀察。凝膠簡單地在蒸餾水中被沖洗，接著在適合的溶液(如，例如，0.25M HCl)中輕輕振蕩脫嘌呤，接著輕輕振蕩變性30分鐘(例如，在0.4M NaOH中)。可以包括一個(gè)復(fù)性步驟，其中凝膠被放入1.5M NaCl，1M Tris，PH7.0中，同時(shí)輕輕振蕩30分鐘。然后，用轉(zhuǎn)移溶液(例如，6×SSC(900mM NaCl，90mM檸檬酸三鈉))，DNA被轉(zhuǎn)移到一個(gè)適合的帶正性電荷膜，例如最大強(qiáng)度的Nytran Plus膜(Maximum strength Nytran Plus membrane)(Schleicher&Schuell，Keene，N.H.)上。一旦完成轉(zhuǎn)移，通常約2個(gè)小時(shí)后，膜在例如2×SSC(2×SSC＝300mM NaCl，30mM檸檬酸三鈉)中沖洗，室溫下，空氣中干燥。隨后，膜應(yīng)在一個(gè)適合的預(yù)雜交溶液(例如，100mL的水溶液含20-50mL甲酰胺，25mL的20×SSPE(1×SSPE＝0.18M NaCl，1mM EDTA，10mM NaH2PO4，pH7.7)20％的SDS 2.5mL，和10mg/mL剪切的鯡魚或鮭魚精子DNA 1mL)中被預(yù)雜交(大約2個(gè)小時(shí)或以上)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，根據(jù)常規(guī)的方法，在預(yù)雜交溶液中甲酰胺的量取決于獲得的反應(yīng)的屬性是可以變化的。因此，在鑒定雜交分子方面，較低量的甲酰胺比用較高量的甲酰胺的同樣程序可以引起更完全的雜交。另一方面，通過用較多的甲酰胺，可以更容易地視覺鑒定強(qiáng)的雜交帶。
標(biāo)記與目的DNA序列互補(bǔ)的或幾乎互補(bǔ)的，而且通常長度是在100-1000個(gè)堿基之間的DNA探針(例如，根據(jù)制造商的說明書，用Megaprime標(biāo)記系統(tǒng))，以摻入32P至DNA中。標(biāo)記的探針通過加熱到95℃5分鐘被變性，而且立刻加到膜和預(yù)雜交溶液中。雜交反應(yīng)應(yīng)在合適的條件下進(jìn)行合適的時(shí)間，例如，在37℃下18個(gè)小時(shí)，同時(shí)輕輕振蕩或旋轉(zhuǎn)。膜被沖洗(例如，在2×SSC/0.3％SDS中)，而且隨后在適合的洗滌液中輕輕攪拌洗滌。期望的嚴(yán)謹(jǐn)性將是膜(濾膜)被沖洗的條件的反應(yīng)。
具體地，一個(gè)給定反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性(即，成功雜交的必要同源性程度)將取決于雜交后濾膜的沖洗條件。本發(fā)明定義的“低的嚴(yán)謹(jǐn)性”條件將包括用0.2×SSC/0.1％SDS的溶液在20℃下洗濾膜15分鐘。“高的嚴(yán)謹(jǐn)性”條件包括進(jìn)一步的洗滌步驟，包括用0.2×SSC/0.1％SDS的溶液在37℃下第二次洗濾膜30分鐘。
洗后，將膜干燥，檢測結(jié)合的探針。如果32P或其它的放射性同位素被用做標(biāo)記試劑，可以通過放射自顯影檢測結(jié)合的探針。其它探針的其它觀察技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是共知的。結(jié)合的探針的檢測表明核酸序列有期望的同源性，而且是包括在本發(fā)明內(nèi)的。
為了表達(dá)蛋白質(zhì)，隨后克隆的蛋白質(zhì)被用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。然后蛋白質(zhì)基因被連接到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒中。這個(gè)質(zhì)粒在宿主中復(fù)制，條件是，宿主包含有共知的質(zhì)粒復(fù)制必需的元件可操作地連接到所討論的基因上的啟動(dòng)子(如果基因自己的同源的啟動(dòng)子被宿主識(shí)別，即轉(zhuǎn)錄，這個(gè)啟動(dòng)子可以被作為基因自己的同源的啟動(dòng)子提供)，內(nèi)源的或被蛋白質(zhì)基因的內(nèi)源終止子區(qū)域提供的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化的區(qū)域(對(duì)于某些真核宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)基因被宿主轉(zhuǎn)錄而來的mRNA的穩(wěn)定是必需的)，和期望地，篩選基因，如抗生素抗性基因，它能夠通過生長在含有抗生素的培養(yǎng)基中使得被質(zhì)粒感染的宿主細(xì)胞連續(xù)的培養(yǎng)維持。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒也包含宿主的復(fù)制原點(diǎn)，因此不受染色體的限制在細(xì)胞質(zhì)中能產(chǎn)生大量的質(zhì)粒。然而，整合蛋白質(zhì)基因的多重拷貝進(jìn)入宿主的基因組中是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。對(duì)同源重組特別敏感的原核和真核生物體使這變得容易了。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基因可以是天然的基因，如源于遲緩芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的天然的基因。作為替代，可以產(chǎn)生編碼天然存在的或突變的前體蛋白質(zhì)的合成基因。在這樣的一個(gè)方法中，確定前體蛋白質(zhì)的DNA和/或氨基酸序列。此后，多個(gè)重疊的合成單鏈DNA片段被合成，它們通過雜交和連接產(chǎn)生編碼前體蛋白質(zhì)的合成DNA。合成基因構(gòu)建的一個(gè)例子參見美國專利5,204,015中的實(shí)施例3，它的公開被并入本發(fā)明的參考文獻(xiàn)中。
一旦天然存在的或合成的前體蛋白質(zhì)基因已被克隆，就可以進(jìn)行大量的修飾以增強(qiáng)基因超出天然存在的前體蛋白質(zhì)的合成的應(yīng)用。這樣的修飾包括重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，如美國專利4,760,025(RE 34,606)和歐洲專利公開號(hào)0 251 446公開的，和本發(fā)明說明的蛋白質(zhì)變異體的產(chǎn)生。
盡管其它的方法也是可用的，下面的盒式誘變方法可以被利用來使得本發(fā)明蛋白質(zhì)的變異體的構(gòu)建變得容易。首先，獲得編碼蛋白質(zhì)的天然存在的基因，整個(gè)或部分測序。然后，掃描序列尋找期望制造編碼的酶的一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變(缺失、插入或置換)的點(diǎn)。評(píng)價(jià)這個(gè)點(diǎn)的側(cè)翼序列中用于用寡核苷酸庫置換基因的短片段的限制性位點(diǎn)的存在，這個(gè)寡聚核苷酸庫當(dāng)被表達(dá)時(shí)將表達(dá)各種突變體。這樣的限制性位點(diǎn)是優(yōu)選在蛋白質(zhì)基因內(nèi)的單一的位點(diǎn)，這樣方便基因片段的置換。然而，倘若通過限制性酶切消化產(chǎn)生的基因片段能夠以正確的序列被重新組合，那么在蛋白質(zhì)基因上的不是過度冗余的任何方便的限制性位點(diǎn)都是可用的。如果限制性位點(diǎn)沒有在距離被選擇的點(diǎn)的方便的距離內(nèi)位置出現(xiàn)(距離10-15個(gè)核苷酸)，以閱讀框和被編碼的氨基酸中均不在最終的結(jié)構(gòu)中被改變的一種方式，通過在基因中置換核苷酸產(chǎn)生這樣的位點(diǎn)。為了改變基因的序列以符合期望的序列的基因突變是按照通常共知的方法通過M13引物延伸完成的。定位適合的側(cè)翼區(qū)域和評(píng)價(jià)得到兩個(gè)方便的限制性位點(diǎn)的序列的所需的改變的任務(wù)是通過遺傳密碼的冗余，基因的限制性酶圖譜和大量的不同的限制性酶常規(guī)地完成的。注意如果一個(gè)方便的側(cè)翼的限制性位點(diǎn)是可用的，需要用的上述方法僅僅涉及不包含位點(diǎn)的側(cè)翼區(qū)域。
一旦天然存在的DNA或合成DNA被克隆，在將要被突變的這個(gè)位置的側(cè)翼的限制性位點(diǎn)用同源限制性酶酶切，同時(shí)大量末端互補(bǔ)的末端寡聚核苷酸盒被連接到基因中。通過這個(gè)方法使得突變發(fā)生簡化，因?yàn)樗械墓丫酆塑账崮鼙缓铣捎型瑯拥南拗菩晕稽c(diǎn)，而且對(duì)于產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，合成的接頭不是必需的。
本發(fā)明一個(gè)方面的目的是取得與前體蛋白質(zhì)比較，有改變的變態(tài)反應(yīng)原潛能的變異體蛋白，因?yàn)闇p少的這種潛能使得酶的應(yīng)用更安全。盡管本發(fā)明用于降低變態(tài)反應(yīng)原潛能，但是本發(fā)明的突變可以和這個(gè)領(lǐng)域共知的突變聯(lián)合應(yīng)用以產(chǎn)生與前體比較改變的熱穩(wěn)定性和/或改變的底物特異性，修飾的活性或改變的堿穩(wěn)定性。
因此，本發(fā)明涉及改變包括遲緩芽孢桿菌中第170-173位殘基的T-細(xì)胞表位誘導(dǎo)T-細(xì)胞增值的能力。本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括修飾R170D，Y171Q和/或N173D中的一個(gè)或全部。相似地，如上述詳細(xì)討論的，據(jù)信在任何蛋白質(zhì)中的對(duì)應(yīng)殘基的修飾將在那個(gè)蛋白質(zhì)中引起重要的T-細(xì)胞表位的中和。因此，聯(lián)合對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基170-173的區(qū)域中目前公開的突變，在對(duì)應(yīng)于N76D/S103A/V104I/G159D的位置的置換，可選地聯(lián)合選自對(duì)應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的V68A，T213R，A232V，Q236H，Q245R和T260A的一個(gè)或多個(gè)置換可以被利用，除了減少本發(fā)明的變異體的變態(tài)反應(yīng)原性潛能外，也全面調(diào)節(jié)酶的穩(wěn)定性和/或蛋白水解活性。相似地，本發(fā)明提供的置換可以聯(lián)合遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中等同位置+76處天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)的突變，并聯(lián)合S103A/V104I/G159D突變，可選地，與選自對(duì)應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶V68A，T213R，A232V，Q236H，Q245R和T260A的位置的一個(gè)或多個(gè)置換聯(lián)合，以產(chǎn)生由此產(chǎn)生的突變酶的加強(qiáng)的穩(wěn)定性和/或加強(qiáng)的活性。
本發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施方式包括下面與對(duì)應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D；V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H；V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R；V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R；及V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A位置的置換殘基的具體聯(lián)合。盡管置換可以在任何芽孢桿菌蛋白中進(jìn)行，但是這些置換優(yōu)選在遲緩芽孢桿菌(重組的或天然類型的)枯草桿菌蛋白酶中進(jìn)行。
基于用變異體蛋白質(zhì)獲得的篩選的結(jié)果，上述述及的在解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的突變對(duì)于這些酶的蛋白水解活性，性能和/或穩(wěn)定性和這樣的變異體酶的清潔或洗滌性能是重要的。
本發(fā)明的許多蛋白質(zhì)變異體在配制各種洗滌劑組合物方面是有用的。大量的共知的化合物是適合的表面活性劑，它們在包括本發(fā)明蛋白質(zhì)突變體的組合物中有用。這些包括非離子的，陰離子的，陽離子的，陰離子或兩性離子的洗滌劑，如在美國4,404,128，Barry J.Anderson和美國Jiri Flora等4,261,868中所公開的。一個(gè)適合的洗滌劑組合物描述在美國專利5,204,015(前面被并入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)中)中的實(shí)施例7中。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟習(xí)能被用做洗滌劑組合物的不同的制劑。除了典型的洗滌劑組合物外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)變異體可以被用于天然或野生的蛋白質(zhì)被應(yīng)用的任何目的是容易理解的。因此，這些變異體可以被用于，例如，固體或液體肥皂應(yīng)用，洗碗制劑，清洗隱形眼鏡的溶液或產(chǎn)品，肽水解作用，廢物處理，紡織品應(yīng)用，做為蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的融合物切割酶等等。除了減少的變態(tài)反應(yīng)原性外，本發(fā)明的變異體可以包括，在洗滌劑組合物中增強(qiáng)的性能(同前體比較)。如本發(fā)明所用的，在洗滌劑中的增強(qiáng)的性能被定義為增強(qiáng)對(duì)某些酶敏感污跡如草或血液的清洗，這是在標(biāo)準(zhǔn)的洗滌循環(huán)后，通過常用的評(píng)估鑒定測定的。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)，尤其是蛋白酶能被制成pH在6.5-12.0間的共知的粉末的或液體的洗滌劑，它占洗滌劑重量的水平是約.01到約5％(優(yōu)選.1到.5％)。這些洗滌劑清潔組合物也可以包括其它的酶，如己知的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶或內(nèi)切糖苷酶，及助洗劑和穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)，尤其是蛋白酶添加到傳統(tǒng)的清潔組合物中不引起任何特別的使用限制。換而言之，任何適合于洗滌劑的溫度和pH，只要pH是在上述的范圍內(nèi)，溫度是在所描述的蛋白質(zhì)的變性溫度以下，也是適合本發(fā)明的組合物的。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也能單獨(dú)或和助洗劑和穩(wěn)定劑聯(lián)合被用于在沒有洗滌劑的清潔組合物中。
本發(fā)明的變異體蛋白質(zhì)能被包括在動(dòng)物飼料中，作為如動(dòng)物飼料添加劑的一部分，就如，例如在美國5,612,055；美國5,314,692；美國5,147,642中說明的一樣。
本發(fā)明的一個(gè)方面是包括本發(fā)明的變異體蛋白質(zhì)的用于紡織品處理的組合物。這種組合物能被用于處理絲織品或毛織物，就如在出版物，如RD216,034；EP134,267；US 4,533,359；和EP344,259中說明的一樣。
可以根據(jù)本領(lǐng)域共知的方法篩選變異體的蛋白水解活性。優(yōu)選的蛋白酶變異體包括在對(duì)應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D；V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H；V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/Q236H/Q245R；V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/A232V/Q236H/Q245R；及V68A/N76D/S103A/V104I/G159D/K170D/Y171Q/S173D/T213R/A232V/Q236H/Q245R/T260A的位置的多個(gè)置換。
當(dāng)和本發(fā)明的蛋白質(zhì)的前體蛋白質(zhì)比較，本發(fā)明的蛋白質(zhì)顯示修飾的免疫原性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)顯示減少的變態(tài)反應(yīng)原性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)顯示了增強(qiáng)的免疫原性。通過B-細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，或通過T-細(xì)胞或細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，或通過B-細(xì)胞和T-細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)證明了免疫原性的增強(qiáng)。熟悉的人將容易地意識(shí)到本發(fā)明的蛋白質(zhì)的用途很大部分是由蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)所決定的。例如，顯示了減少的變態(tài)反應(yīng)原性的酶能被用在清潔組合物中。“清潔組合物”是能被用于從底料，如織物，盤碟、隱形眼鏡，其它的固體底料，頭發(fā)(洗發(fā)液)，皮膚(肥皂和面霜)等等中除去不想要的化合物。
具有減少的變態(tài)反應(yīng)原性的蛋白質(zhì)，特別是纖維素酶，蛋白酶，和淀粉酶也能被用在紡織品的處理中?！凹徔椘返奶幚怼卑ㄟ@樣的工藝，其中紡織品，能被用于紡織，粘結(jié)或編織成紡織品或服裝的單獨(dú)的紗或纖維被處理以實(shí)現(xiàn)期望的特性。例如，這樣的期望的特性是“石洗”去起球、去毛、退漿、軟化和本領(lǐng)域技術(shù)人員共知的其它的紡織品處理。
本發(fā)明也包括個(gè)體對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的治療蛋白質(zhì)。特別地，缺乏該蛋白質(zhì)內(nèi)源生產(chǎn)的個(gè)體對(duì)于形成中和抗體是敏感的，而且變得難于治療。同樣地，蛋白質(zhì)的修飾可以引入潛在地免疫原性的新的表位。本發(fā)明的方法能被用于鑒定和修飾表位，例如在人的因子VIII中，以阻止中和應(yīng)答。
藥物組合物可以以各種形式制備，如顆粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊劑、懸浮液、軟膏、洗劑等等。藥物等級(jí)的有機(jī)或無機(jī)載體和/或適合口服和局部應(yīng)用的稀釋劑能被用于組成包含治療活性化合物的組合物。稀釋劑對(duì)于這個(gè)領(lǐng)域是共知的，包括含水的介質(zhì)，植物和動(dòng)物油和脂肪。穩(wěn)定劑、潤濕劑和乳化劑，用于改變滲透壓的鹽或用于獲得適當(dāng)pH值的緩沖液，及皮膚滲透增強(qiáng)劑能被用做輔助劑。藥物組合物也可以包括下面的一個(gè)或多個(gè)載體蛋白，如血清白蛋白；緩沖液；填料如微晶纖維素、乳糖、谷物和其它淀粉；結(jié)合劑；甜味劑和其它的調(diào)味劑；著色劑；和聚乙二醇。添加劑在本領(lǐng)域是共知的，而且用于各種制劑中。
本發(fā)明參考的所有出版物和專利完整地做為參考文獻(xiàn)被并入。下面是通過實(shí)施方案例的方式闡述，但是不構(gòu)成對(duì)權(quán)利要求書的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1用原初人T-細(xì)胞鑒定肽的T-細(xì)胞表位的實(shí)驗(yàn)從“原初的”人(即已知未被遲緩芽孢桿菌蛋白酶暴露過或致敏的人)中收集新鮮的人的外周血細(xì)胞用于遲緩芽孢桿菌蛋白酶和人枯草桿菌蛋白酶中表位的測定。原初的人意指已知過去未曾對(duì)蛋白酶暴露或引發(fā)對(duì)蛋白酶的反應(yīng)的個(gè)體。外周單個(gè)核血細(xì)胞(儲(chǔ)存在室溫下，不要超過24小時(shí))被制備如下來源于一個(gè)單位的全血的大約30mls白細(xì)胞層制備物用Dulbeccol氏磷酸緩沖液(DPBS)調(diào)至50ml，而且分成兩個(gè)試管。室溫下，樣品被放在12.5ml的lymphoprep密度分離介質(zhì)(Nycomed密度1.077g/ml)的上面。試管在600G離心30分鐘。兩相的分界面被收集，混合和在DPBS中洗滌。所得溶液的細(xì)胞密度通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測量。生活力是通過臺(tái)酚藍(lán)拒染試驗(yàn)測定的。
從由此產(chǎn)生的溶液中，從外周血單個(gè)核細(xì)胞樣品制備每個(gè)75ml培養(yǎng)瓶中108個(gè)細(xì)胞的密度的分化樹突細(xì)胞培養(yǎng)物如下(1)50ml無血清AIM V培養(yǎng)基(Gibco)被用1∶100稀釋度的β-巰基乙醇(Gibco)補(bǔ)充。在37℃，在5％的CO2中，培養(yǎng)瓶平放2個(gè)小時(shí)，使單核細(xì)胞附著在培養(yǎng)瓶壁上。
(2)單核細(xì)胞分化為樹突細(xì)胞如下除去非附著的細(xì)胞，產(chǎn)生的附著細(xì)胞(單核細(xì)胞)加入30ml AIM V，800單位/ml的GM-CSF(Endogen)和500單位/ml的IL-4(Endogen)；在37℃，在5％的CO2中的條件下，產(chǎn)生的混合物被培養(yǎng)5天。5天后，細(xì)胞因子TNFa(Endogen)被加入達(dá)到0.2單位/ml，而且細(xì)胞因子IL-1a(Endogen)被加入達(dá)到最終的濃度是50單位/ml，在37℃，在5％的CO2中，混合物被再溫育2天。
(3)在第7天，絲裂霉素C被加入達(dá)到濃度為50mg/ml以停止現(xiàn)在已分化的樹突細(xì)胞培養(yǎng)物的生長。在37℃，在5％的CO2中，溶液被溫育60分鐘。通過用一個(gè)細(xì)胞刮刀輕輕從瓶底部刮下附著的細(xì)胞收集樹突細(xì)胞。隨后，附著和沒有附著的細(xì)胞在600G離心5分鐘，在DPBS中洗滌和計(jì)數(shù)。
(4)制備的樹突細(xì)胞被放進(jìn)一個(gè)96孔圓底陣列中，每孔100ml總體積的AIM V介質(zhì)中2×104個(gè)細(xì)胞。
根據(jù)制造商的說明書，同時(shí)進(jìn)行如下的改動(dòng)，用人CD4+Cellect試劑盒(Biotex)從用于制備樹突細(xì)胞的冷凍的等份外周血細(xì)胞樣品中制備CD4+細(xì)胞等份的樣品被解凍和沖洗，這樣每個(gè)Cellect柱中將被提供大約108細(xì)胞；在4ml的DPBS和1ml Cellect試劑盒中的Cell試劑中重懸浮細(xì)胞，溶液在室溫下被維持20分鐘。在室溫下，產(chǎn)生的溶液在600G下離心5分鐘，而且沉淀在2ml的DPBS中重懸浮，加到Cellect柱中。從柱中流出物被收集在含有2％人血清的DPBS中，產(chǎn)生的CD4+細(xì)胞溶液被離心，在AIM V介質(zhì)中重懸浮和計(jì)數(shù)密度。
CD4+T-細(xì)胞懸浮液被重懸浮達(dá)到在每ml AIM V介質(zhì)中2×106個(gè)細(xì)胞數(shù)，以方便96孔板的有效的操作。
通過1∶10的比率在AIM V介質(zhì)中稀釋從DMSO中1M儲(chǔ)存溶液制備肽抗原。在96孔板的含有分化樹突細(xì)胞的每個(gè)孔中放10微升的儲(chǔ)存溶液。如上制備的稀釋的100微升CD4+T-細(xì)胞溶液被進(jìn)一步加入到每個(gè)孔中。有用的對(duì)照包括稀釋的DMSO空白，和破傷風(fēng)類毒素陽性對(duì)照。
在210微升的總的體積中每個(gè)孔的最終的濃度如下2×104CD4+2×105樹突細(xì)胞(R∶S＝10∶1)5mM肽實(shí)施例2遲緩芽孢桿菌的蛋白酶和人的枯草桿菌蛋白酶中的T-細(xì)胞表位的鑒定用在實(shí)施例1中說明的實(shí)驗(yàn)中的肽是以遲緩芽孢桿菌和人的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列為基礎(chǔ)制備的。肽抗原被設(shè)計(jì)如下從圖1中提供的人枯草桿菌蛋白酶或遲緩芽孢桿菌蛋白酶的任一個(gè)全長氨基酸序列，合成制備15mers(聚體)，除了3個(gè)殘基外，每個(gè)15mer與前一個(gè)和隨后的一個(gè)15mer重疊。
所用的肽與如圖8中提供的遲緩芽孢桿菌的氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)的，而且肽與如圖7中提供的人枯草桿菌蛋白酶的氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)的。在圖6中提供了所用的對(duì)應(yīng)于蛋白酶的肽。所有的試驗(yàn)被至少進(jìn)行兩次。所有的被報(bào)告的試驗(yàn)都對(duì)抗原破傷風(fēng)類毒素顯示出了強(qiáng)烈的陽性應(yīng)答。每個(gè)試驗(yàn)中的應(yīng)答被平均，然后標(biāo)準(zhǔn)化成基線應(yīng)答。如果應(yīng)答至少是基線應(yīng)答3倍，記錄這個(gè)陽性事件。
記錄，而且分別提供在圖4，圖5中是對(duì)從人的枯草桿菌蛋白酶和遲緩芽孢桿菌中制備的肽的免疫原性應(yīng)答(即T-細(xì)胞的增殖)。通過摻入氚的方法測定T-細(xì)胞增殖。圖4，圖5所示的結(jié)果是在10個(gè)個(gè)體(圖4)和16個(gè)個(gè)體(圖5)中對(duì)不同的肽的免疫原的加性應(yīng)答的比較。應(yīng)答被表示為相加的應(yīng)答，其中1.0等于對(duì)每個(gè)樣品的基線應(yīng)答。因此，在圖4中，10或以下的讀數(shù)是基線應(yīng)答，而且在圖5中，16.0或以下的讀數(shù)是基線應(yīng)答。應(yīng)答越高，T-細(xì)胞表位被認(rèn)為越有效。
如在圖4和5中所示，源于非致敏個(gè)體的原初血液樣品的免疫原性應(yīng)答對(duì)與解淀粉芽孢桿菌蛋白酶的第170-173位殘基對(duì)應(yīng)的遲緩芽孢桿菌的肽片段顯示了顯著的變態(tài)反應(yīng)原性應(yīng)答。如預(yù)期的，人枯草桿菌蛋白酶的對(duì)應(yīng)片段僅引發(fā)了基線應(yīng)答。
圖9所示的是在從已知對(duì)遲緩芽孢桿菌蛋白酶超敏感的一個(gè)個(gè)體提取的樣品中對(duì)于遲緩芽孢桿菌蛋白酶的肽的T-細(xì)胞應(yīng)答。肽E05代表與源于解淀粉芽孢桿菌的蛋白酶中170-173對(duì)應(yīng)的區(qū)域。如在圖9中所示，超敏感的個(gè)體對(duì)被肽E05代表的T-細(xì)胞表位是高度地應(yīng)答的。這個(gè)結(jié)果證實(shí)了，通過進(jìn)行本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)，可能預(yù)測被超敏感的個(gè)體T-細(xì)胞識(shí)別的主要表位。
圖10所示的是從一個(gè)已知對(duì)遲緩芽孢桿菌蛋白酶超敏感的個(gè)體提取的一樣品中對(duì)源于遲緩芽孢桿菌蛋白酶的E05肽中的各種丙氨酸置換的T-細(xì)胞應(yīng)答。被用作置換的丙氨酸置換是為了測定在該表位內(nèi)的任何特定殘基的作用。圖10的圖例是指丙氨酸被置換的肽的位置，即，在肽E06(序列GSISYPARYANAMAV)中，G到A＝2，S到A＝3，I到A＝4，S到A＝5，Y到A＝6，P到A＝7，R到A＝8，Y到A＝9，N到A＝10，M到A＝11，V到A＝12。如在圖10中所示，源于遲緩芽孢桿菌的蛋白酶中的R170A，Y171A和/或N173A殘基的任一個(gè)的置換在超敏感個(gè)體的血樣中都引起了明顯地減少的應(yīng)答。
從這個(gè)結(jié)果中，明顯地源于遲緩芽孢桿菌的蛋白酶內(nèi)的殘基170，171，173很大程度對(duì)變態(tài)過敏原反應(yīng)的引發(fā)負(fù)責(zé)。
實(shí)施例3Humicola insolens的纖維素酶(Carezyme)中的
T-細(xì)胞表位的鑒定在來自Humicola insolens的一個(gè)纖維素酶(Carezyme，NovoNordisk)的肽中進(jìn)行上述說明的過程。從圖13中，可以觀察到，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)T-細(xì)表位，A01和F06。
實(shí)施例4Thermomyces lanuginosa的脂肪酶(Lipase)中的T-細(xì)胞表位的鑒定在源于Thermomyces lanuginosa的脂肪酶(Lipasfrom NovoNordisk)的肽中進(jìn)行實(shí)施例2說明的過程。如從圖14中所觀察到的，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)T-細(xì)胞表位，A12和C06。在原初的供體中，肽E03取得了稍微增加的T-細(xì)胞增殖，然而，這個(gè)肽對(duì)于A12是連續(xù)的，而且它們代表了一個(gè)表位。在這方面，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，表位的長度能夠變化，而且通過本發(fā)明的方法可以測定天然存在的或突變的表位的精確的效力。
實(shí)施例5褶皺鏈霉菌的內(nèi)切葡聚糖酶H中的T-細(xì)胞表位的鑒定對(duì)源于褶皺鏈霉菌內(nèi)切葡聚糖酶H的肽中進(jìn)行實(shí)施例2說明的過程。從圖15中可以觀察到，發(fā)現(xiàn)了單一的T-細(xì)表位C06。
實(shí)施例6蛋白酶雜合物(GG36-BPN’)中的T-細(xì)胞表位的鑒定在測定T-細(xì)胞表位的位置以后，用已建立的蛋白質(zhì)工程技術(shù)構(gòu)建蛋白酶雜合物。構(gòu)建雜合物以便于蛋白質(zhì)的高度地變態(tài)過敏源原性的氨基酸序列被源于較低變態(tài)過敏源原性的同系物的對(duì)應(yīng)序列置換。在這個(gè)例子中，蛋白酶的最初122個(gè)氨基酸是來源于GG36，其余的氨基酸序列是來源于BPN′。
該雜合物首先從100ppm樣品被試驗(yàn)在北美條件下，24孔測定中，5ppm，超固定布樣，液體(Tide KT)于0.5在24孔測定中使用3K布樣，以及在N’，N’-二甲基酪蛋白測定中，5g/l DMC在NA去污劑中，TNBS檢測法。
實(shí)施例7天然存在的低免疫原性蛋白質(zhì)的鑒定利用本發(fā)明的方法，鑒定蛋白酶K比其它商業(yè)上可得到的蛋白酶產(chǎn)生較低的免疫原性應(yīng)答。本發(fā)明鑒定的蛋白酶K源于Tritirachium Albumlimber的。蛋白酶和方法學(xué)的全面說明參見Mathew，C.G.P.Isolationof high molecular weight eukaryotic DNA.in Methods Biology，卷2Nucleic Acids(Walker，J.M.編)，Humana，Clifton，NJ.(1984)31-34頁。
權(quán)利要求
1.包含T細(xì)胞表位的目的多肽的變異體，其中所述變異體由于具有改變的T-細(xì)胞表位而不同于所述目的多肽，以致所述變異體和所述多肽在個(gè)體中產(chǎn)生不同的免疫原性應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的變異體，其中所述變異體產(chǎn)生的所述免疫原性應(yīng)答比所述目的多肽產(chǎn)生的所述免疫原性應(yīng)答弱。
3.權(quán)利要求1的變異體，其中所述變異體產(chǎn)生的所述免疫原性應(yīng)答比所述目的多肽產(chǎn)生的所述免疫原性應(yīng)答強(qiáng)。
4.權(quán)利要求1的變異體，其中所述目的多肽選自酶、激素、因子、疫苗和細(xì)胞因子。
5.權(quán)利要求1的變異體，其中所述目的多肽不能被所述個(gè)體識(shí)別為所述個(gè)體內(nèi)源性的。
6.權(quán)利要求1的變異體，其中所述目的多肽是選自脂肪酶、纖維素酶、內(nèi)切葡糖苷酶H、蛋白酶、糖酶、還原酶、氧化酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶和磷酸酶的酶。
7.權(quán)利要求1的變異體，其中所述T-細(xì)胞表位是經(jīng)氨基酸置換而被改變的。
8.權(quán)利要求1的變異體，其中通過用所述目的多肽的同系物的對(duì)應(yīng)末端部分置換包含所述T-細(xì)胞表位的所述目的多肽的末端部分，改變所述T-細(xì)胞表位，其中所述同系物不包含與所述被置換的T-細(xì)胞表位同樣的T-細(xì)胞表位。
9.權(quán)利要求8的變異體，其中所述變異體包含至少一個(gè)比所述目的多肽和所述結(jié)合的同系物弱的T-細(xì)胞表位。
10.權(quán)利要求8的變異體，其中所述變異體包含至少兩個(gè)比所述目的多肽和所述結(jié)合的同系物弱的T-細(xì)胞表位。
11.編碼權(quán)利要求1的變異體的核酸。
12.包含權(quán)利要求11的核酸的表達(dá)載體。
13.被權(quán)利要求12的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
14.包含權(quán)利要求6的變異體的清潔組合物、動(dòng)物飼料組合物、或處理紡織品的組合物。
15.權(quán)利要求1的變異體，進(jìn)一步包含可藥用的載體。
16.清潔組合物、動(dòng)物飼料組合物、或處理紡織品的組合物，包含與同類型的另一酶相比，產(chǎn)生降低的免疫原性應(yīng)答的天然存在的酶。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述類型是蛋白酶。
18.權(quán)利要求16的組合物，其中所述酶是蛋白酶K。
19.測定蛋白質(zhì)產(chǎn)生的免疫原性應(yīng)答的方法，包括(a)從單一血源獲得樹突細(xì)胞的溶液，及原初的CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞的溶液；(b)在所述樹突細(xì)胞溶液中促進(jìn)分化；(c)將所述分化樹突細(xì)胞溶液和所述原初的CD4+和/或CD8+T-細(xì)胞與所述蛋白質(zhì)混合；及(d)測定在所述步驟(c)中T-細(xì)胞的增殖。
20.權(quán)利要求19的方法，進(jìn)一步包括將所述免疫原性應(yīng)答與另一蛋白質(zhì)比較。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述蛋白質(zhì)和所述另一蛋白質(zhì)相互是同系物。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述蛋白質(zhì)和所述另一蛋白質(zhì)均是蛋白酶。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述蛋白質(zhì)和所述另一蛋白質(zhì)均是相同蛋白質(zhì)的不同肽。
24.改變目的多肽的免疫原性的方法，包括a)測定所述多肽的免疫原性；b)鑒定所述多肽中的T-細(xì)胞表位；和c)改變所述T-細(xì)胞表位以改變所述多肽的免疫原性。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述T-細(xì)胞表位通過具有至少一個(gè)氨基酸置換而被改變。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述氨基酸置換是通過改變編碼所述T-細(xì)胞表位的核酸進(jìn)行的。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述T-細(xì)胞表位通過用所述目的多肽的同系物的對(duì)應(yīng)部分置換包含所述T-細(xì)胞表位的所述目的多肽的一部分而被改變，其中所述對(duì)應(yīng)部分不包含所述T-細(xì)胞表位。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述部分是所述目的多肽的末端部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生高和低變態(tài)反應(yīng)原性組合物的新方法和組合物。本發(fā)明具體包括中和或減少T－細(xì)胞識(shí)別表位的能力，因此防止個(gè)體對(duì)蛋白質(zhì)的致敏性?；蛘?，T－細(xì)胞表位被突變以產(chǎn)生增加的免疫原性反應(yīng)。而且，提供了天然存在的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K38/46GK1418253SQ01804669
公開日2003年5月14日 申請日期2001年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月8日
發(fā)明者D·A·埃斯特爾, F·A·哈丁 申請人:金克克國際有限公司