專利名稱：抗生血管蛋白和片段及其應用方法
相關申請本發(fā)明是2000年7月21日申請的U.S.S.N.09/625 191、2000年4月4日申請的U.S.S.N.09/543 371、2000年1月7日申請的U.S.S.N.09/479 118的部分連續(xù)申請。U.S.S.N.09/625 191又是U.S.S.N.09/543371的部分連續(xù)申請，其中U.S.S.N.09/479 118是1999年6月17日申請的U.S.S.N.09/335 224的部分連續(xù)申請，其又要求了1998年6月17日申請的美國臨時申請60/089 689和1999年3月25日申請的美國臨時申請60/126 175的優(yōu)先權。所有這些申請的全部內容在這里引作參考。政府支持本發(fā)明全部或部分受到美國衛(wèi)生部(National Institutes of Health)DK-51711和DK55001項目的支持。國家在本發(fā)明中享有一定權利。
背景技術：
基膜是特定胞外基質的薄層，其提供了上皮細胞和內皮細胞在其上生長的支持結構，從而包圍肌肉或脂肪(Paulsson，M.，1992，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.2793-127)?；|總是和細胞相關，并且文獻也大量報道過，基質不僅提供了機械支持而且還影響細胞行為，例如分化和增殖。血管基質由膠原、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、纖粘連蛋白和巢蛋白這樣的大分子組成(Timpl，R 996，Curr.Opin.Cell.Biol.8618-24)。從功能上說，膠原促進細胞粘著、遷移、分化和生長(Paulsson，M.，1992，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.2793-127)，并且通過這些功能推測在內皮細胞增殖和血管生成期間起著重要的作用，血管生成期是從已有的血管生成新血管的過程(Madri，J.A.等，1986，J.Histoclzem.Cytochem.3485-91；Folkman，J.，1972，Ann.Surg.175409-16)。
血管生成是一個復雜的過程，需要內皮細胞萌發(fā)、遷移和增殖，以及它們分化成管樣結構并且產生包圍發(fā)育的血管的基膜基質。另外，血管生成是一個對于正常生理作用(例如傷口修復和子宮內膜改造)來說是決定性的過程(Folkman，J.等，1995，J；Biol.Chem.771.26710931-34)?，F在文獻大量報道超過數立方毫米大小的實體腫瘤的轉移和生長需要血管生成(Folkman，J.，1972，Ann.Surg.175409-16；Folkman，J.，1995，Nat.Med.27-31)。腫瘤質的擴展不僅在于血液充滿腫瘤，而且還在于新內皮毛細血管產生的幾種生長因子和基質蛋白對腫瘤細胞的分泌刺激(Folkman，J.，1995，Nat.Med.127-31)。最近，鑒定出了很多種血管生成抑制劑，稱為制管張素(O′Reilly，M.S.等，1994，Cell 79315-28)、內靜素(內靜素)(O′Reilly，M.S.等，1997，Cell88277-85)、抑制素(restin)(Ramchandran，R.等，1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.255735-9)和色素上皮組織衍生因子(PEDF)(Dawson，D.W.等，1999，Science 285245-8)。
IV型膠原表達為六種截然不同的α-鏈α1至α6(Prockop，D.J.等，1995，Annu.Rev.Biochem.64403-34)，并且裝配成三鏈螺旋。其進一步形成給基膜中的其它大分子提供支架的網絡。這些α-鏈由三個結構域組成N-末端7S結構域、中間三鏈螺旋結構域和C-末端球形非膠原(NC1)結構域(Timpl，R.等，1981，Eur.J.Biochem.120203-211)。幾項研究表明膠原代謝的抑制劑具有抗血管生成功能，支持基膜膠原合成和貯存對血管生成和存活很重要的觀點(Maragoudakis，M..等，1994，Kidney Int.43147-50；Haralabopoulos，G.C.等，1994，Lab.Invest.71575-82)。但是，仍然沒有完全明白基膜組織和血管生成中膠原的準確作用。
整聯蛋白是重要的細胞表面粘著受體家族，其作為很多化合物的粘著分子而發(fā)揮功能。它們涉及細胞-細胞或者細胞-胞外基質相互作用，并且兩者都介導細胞與胞外基質的相互作用，從而引起細胞與其結合。整聯蛋白是αβ異二聚體，由兩個非共價結合的跨膜糖蛋白亞基組成——α亞基和β亞基。所有的α亞基都表現出彼此之間有同源性，所有的β亞基也是如此?，F在鑒定了16種α亞基(α1至α9、αD、αL、αM、αV、αX、αIIb和αIELb)和8種β亞基(β1至β8)，它們形成22種不同的組合(β1和α1至α9；β1和αV；β2和αD、αL、αM和αX；β3和αV和αX；β4和α6；β5和αV；β6和αV；β7和α4和αIELb；β8和αV)。通過一些整聯蛋白亞基mRNA的交替剪接可以進一步擴大可獲得的整聯蛋白亞基庫。
當細胞表面上某一個特定點的整聯蛋白濃度高于某一最小閾值時，整聯蛋白通常就會與它們的配體結合，形成病灶或者半橋粒。低結合親和性和病灶形成的組合使得整聯蛋白依據其分子濃度或弱或強地結合。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及抗血管生成蛋白質和它們的生物活性片段。這里描述的片段證明抗血管生成蛋白質可以再分為具有不連續(xù)活性的區(qū)域，例如抗血管生成和抗腫瘤細胞活性，這些不連續(xù)活性只有在更大蛋白質分子細分時才顯現。在IV型膠原的α3(IV)NC1結構域情況下，這些活性區(qū)域也處于古德帕斯徹(Goodpasture)表位之外。
特別地，本發(fā)明涉及抗血管生成的分離的α3(IV)NC1結構域的非古德帕斯徹片段，其具有下面特征中的一項或多項(a)結合αVβ3整聯蛋白的能力；(b)抑制內皮細胞增殖的能力；和(c)引起內皮細胞程序性死亡的能力。這種分離的非古德帕斯徹片段通過這里描述的不依賴于RGD的機理結合αvβ3整聯蛋白。這里描述這樣一種分離的IV型膠原的α3(IV)NC1結構域片段，并且指定為塔牡斯達丁(Tumstatin)。這里使用的術語“塔牡斯達丁”包括SEQ ID NO10或SEQ ID NO19。另外，另一種分離的非古德帕斯徹片段，這里指定為Tum-1或者塔牡斯達丁N53(SEQ ID NO22)，由全長塔牡斯達丁(SEQ ID NO10)的氨基酸殘基54至244的氨基酸序列組成。這里公開的其它分離的片段包括Tum-2(SEQ ID NO23)、Tum-3(SEQID NO24)、Tum-4(SEQ ID NO25)和Tum-5(SEQ ID NO26)，它們分別由全長塔牡斯達丁(SEQ ID NO10)的殘基1至132(Tum-2)、殘基133至244(Tum-3)、殘基181至244(Tum-4)和殘基54至132(Tum-5)的氨基酸序列組成。這里也公開了肽片段，包括T1(SEQID NO27)、T2(SEQ ID NO28)、T3(SEQ ID NO29)、T4(SEQID NO30)、T5(SEQ ID NO31)和T6(SEQ ID NO32)，它們分別由全長塔牡斯達丁(SEQ ID NO10)的殘基1至20(T1)、54至73(T2)、69至88(T3)、84至103(T4)、99至117(T5)和114至132(T6)的氨基酸殘基組成。還有另一種全長塔牡斯達丁的肽片段是這里指定的塔牡斯達丁-45-132(SEQ ID NO33)，由全長塔牡斯達丁(SEQ ID NO10)的氨基酸殘基45至132組成。全長塔牡斯達丁的另一種片段指定為Tum-5-126-C-A(SEQ ID NO34)，由塔牡斯達丁-45-132組成，其中(全長塔牡斯達丁)126位的半胱氨酸定點誘變?yōu)楸彼帷?br> 被還原(例如堿還原)的塔牡斯達丁的片段這里也描述為具有抗血管生成功能。兩種其它片段是“塔牡斯達丁333”(SEQ ID NO20)和“塔牡斯達丁334”(SEQ ID NO21)，由塔牡斯達丁全長(SEQ IDNO10)的殘基2至125(塔牡斯達丁333)和殘基2至245組成。
本發(fā)明的特征還在于抗腫瘤細胞，分離的α3(IV)NC1結構域的非古德帕斯徹片段，其具有下面特征的一項或多項(a)結合αvβ3整聯蛋白的能力；(b)結合內皮細胞的能力；(c)抑制腫瘤細胞增殖的能力，和(d)不能抑制內皮細胞的增殖。分離的非古德帕斯徹片段通過不依賴于RGD的機理能夠結合αvβ3整聯蛋白，這一點如這里所述。一種分離的非古德帕斯徹片段包括全長塔牡斯達丁(SEQ ID NO10)的氨基酸殘基185至203的氨基酸序列。全長塔牡斯達丁的另一種肽片段這里指定為T3，由全長塔牡斯達丁(SEQ IDNO10)的氨基酸殘基69至88組成。還有全長塔牡斯達丁的另一種肽片段這里指定為塔牡斯達丁-45-132，由全長塔牡斯達丁(SEQIDNO10)的氨基酸殘基45至132組成。全長塔牡斯達丁的另一種片段這里指定為Tum-5-126-C-A(SEQ ID NO34)，由塔牡斯達丁-45-132組成(SEQ ID NO33)，其中(全長塔牡斯達丁)126位的半胱氨酸定點誘變?yōu)楸彼?。被還原(例如堿還原)的塔牡斯達丁的片段這里也描述為具有抗血管生成功能。
本發(fā)明還涉及受體、結合蛋白，例如與抗血管生成蛋白和肽相互作用(例如結合)的蛋白質，從而提供評價抗血管生成蛋白、肽和化合物的靶物。這些受體和它們的亞基介導血管生成、腫瘤生長和轉移、內皮細胞增殖和遷移、內皮細胞管生成。這些受體也介導細胞程序性死亡。
特別地，本發(fā)明涉及整聯蛋白亞基α1、α2、α3、αV、β1和β3，已經發(fā)現它們結合安瑞斯丁(安瑞斯丁)(安瑞斯丁是IV型膠原的NC1結構域的α1鏈、整聯蛋白亞基α1、α2和β1)，已經發(fā)現它們結合卡斯達丁(Canstatin)(卡斯達丁是IV型膠原的NC1結構域的α2鏈、整聯蛋白亞基α5、α6、αV、β1和β3)，已經發(fā)現它們結合塔牡斯達丁(Tumstatin)(塔牡斯達丁是IV型膠原的NC1結構域的α3鏈)。整聯蛋白結合介導的血管生成和內皮細胞增殖可以通過施用安瑞斯丁、卡斯達丁或者塔牡斯達丁，或者施用作為安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁的受體而與上述整聯蛋白亞基結合的其他蛋白質、肽或化合物而抑制。整聯蛋白結合介導的內皮細胞程序性死亡也可以通過施用安瑞斯丁、卡斯達丁或者塔牡斯達丁、或者施用作為安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁的受體而與上述整聯蛋白亞基結合的其他蛋白質、肽或化合物而抑制。這樣的化合物可以包括安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的抗體、片段或者部分，或者包括與上述整聯蛋白亞基結合的安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的這些區(qū)域的蛋白質或肽。
本發(fā)明還涉及通過施用模擬整聯蛋白亞基作為安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的受體的蛋白質、肽或化合物而增強、促進或者誘導血管生成和細胞增殖的方法。這樣的蛋白質、肽或化合物包括由選擇的亞基組成的用來與可獲得的安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁相互作用(例如結合)的整聯蛋白、生物活性(例如抗血管生成)片段、突變體、類似物、同系物及其衍生物，還有其多聚體(例如二聚體)和融合蛋白(這里也稱為嵌合蛋白)。這樣的蛋白質、肽或化合物也包括硫酸乙酰肝素蛋白多糖，其每個細胞結合安瑞斯丁的Kd1值是8.5×10-11M并且其Bmax1是3×106位點。如這里所指的，“可獲得的”指能夠與整聯蛋白或者其亞基或片段接觸或者相互作用(例如結合)的可溶的或者循環(huán)的蛋白質。通過施用抗安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁、或其生物活性(例如抗血管生成)片段、突變體、類似物、同系物及其衍生物、多聚體(例如二聚體)和融合蛋白的抗體也可以增強血管生成和細胞增殖。這樣的抗體結合這些分子，從而防止它們與它們各自的整聯蛋白受體相互作用并且抑制血管生成活性。
本發(fā)明還包括用于鑒定以類似于安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁及其抗血管生成變體和片段的方式來抑制血管生成的蛋白質、肽和化合物的試劑盒。這樣的試劑盒包括合適的整聯蛋白的亞基(例如α1、α2、β3等)和進行下面的實施例中描述的測試之一所需要的這樣的其它成分。使用試劑盒進行的特別測試包括下面的實施例12和28中描述的細胞粘著測試和下面的實施例26中描述的競爭增殖測試。
本發(fā)明還涉及抑制組織(例如哺乳動物或人組織)中血管生成、腫瘤生長或者腫瘤轉移的方法，其中組織接觸IV型膠原的NC1結構域的一個或多個α鏈(例如α1至α6)，并且其中血管生成、腫瘤生長或者腫瘤轉移是一種或多種整聯蛋白或者整聯蛋白亞基介導的。
更具體地說，本發(fā)明特征在于抑制組織中血管生成的方法，其中血管生成是由一種或多種內皮細胞整聯蛋白(例如α1β1，α2β1，α3β1，αVβ3)或者一種或多種內皮細胞整聯蛋白亞基(例如α1，α2，α3，αV，β1，β3)介導的。該方法包括內皮細胞接觸安瑞斯丁或者其片段、突變體、同系物、類似物或者等位變體。通過抑制下面的一項或多項能夠抑制血管生成內皮細胞增殖、內皮細胞遷移或者內皮細胞管生成。
本發(fā)明特征還在于抑制組織中腫瘤生長或轉移的方法，其中腫瘤生長或轉移是由一種或多種內皮細胞整聯蛋白(例如α1β1、α2β1、α3β1、αVβ3)或者一種或多種內皮細胞整聯蛋白亞基(例如α1、α2、α3、αV、β1、β3)介導的。該方法包括內皮細胞接觸安瑞斯丁或者其片段、突變體、同系物、類似物或者等位變體。通過抑制下面的一項或多項能夠抑制腫瘤生長內皮細胞增殖、內皮細胞遷移或者內皮細胞管生成。
另外，本發(fā)明特征在于促進或誘導組織中內皮細胞程序性死亡的方法，其中內皮細胞程序性死亡是由一種或多種內皮細胞整聯蛋白(例如α1β1、α2β1、α3β1、αVβ3)或者一種或多種內皮細胞整聯蛋白亞基(例如α1、α2、α3、αV、β1、β3)介導的。該方法包括內皮細胞接觸安瑞斯丁或者其片段、突變體、同系物、類似物或者等位變體。通過抑制下面的一項或多項能夠促進或誘導程序性細胞死亡內皮細胞增殖、內皮細胞遷移或者內皮細胞管生成。
本發(fā)明特征在于抑制組織中血管生成的方法，其中血管生成是由一種或多種內皮細胞整聯蛋白(例如α1β1、α2β1)或者一種或多種內皮細胞整聯蛋白亞基(例如α1、α2、β1)介導的。該方法包括內皮細胞接觸卡斯達丁或者其片段、突變體、同系物、類似物或者等位變體。通過抑制下面的一項或多項能夠抑制血管生成內皮細胞增殖、內皮細胞遷移或者內皮細胞管生成。
本發(fā)明特征還在于抑制組織中腫瘤生長或轉移的方法，其中腫瘤生長或轉移是由一種或多種內皮細胞整聯蛋白(例如α1β1、α2β1)或者一種或多種內皮細胞整聯蛋白亞基(例如α1、α2、β1)介導的。該方法包括內皮細胞接觸卡斯達丁或者其片段、突變體、同系物、類似物或者等位變體。通過抑制下面的一項或多項能夠抑制腫瘤生長內皮細胞增殖、內皮細胞遷移或者內皮細胞管生成。
另外，本發(fā)明特征在于促進或誘導組織中內皮細胞程序性死亡的方法，其中內皮細胞程序性死亡是由一種或多種內皮細胞整聯蛋白(例如α1β1、α2β1)或者一種或多種內皮細胞整聯蛋白亞基(例如α1、α2、β1)介導的。該方法包括內皮細胞接觸卡斯達丁或者其片段、突變體、同系物、類似物或者等位變體。通過抑制下面的一項或多項能夠促進或誘導程序性細胞死亡內皮細胞增殖、內皮細胞遷移或者內皮細胞管生成。
本發(fā)明特征在于抑制組織中血管生成的方法，其中血管生成是由一種或多種內皮細胞整聯蛋白(例如α5β3、α6β1、αVβ3)或者一種或多種內皮細胞整聯蛋白亞基(例如α5、α6、αV、β1、β3)介導的。該方法包括內皮細胞接觸塔牡斯達丁或者其片段、突變體、同系物、類似物或者等位變體。通過抑制下面的一項或多項能夠抑制血管生成內皮細胞增殖、內皮細胞遷移或者內皮細胞管生成。
本發(fā)明特征還在于抑制組織中腫瘤生長或轉移的方法，其中腫瘤生長或轉移是由一種或多種內皮細胞整聯蛋白(例如α5β3、α6β1，αVβ3)或者一種或多種內皮細胞整聯蛋白亞基(例如α5、α6、αV、β1、β3)介導的。該方法包括內皮細胞接觸塔牡斯達丁或者其片段、突變體、同系物、類似物或者等位變體。通過抑制下面的一項或多項能夠抑制腫瘤生長內皮細胞增殖、內皮細胞遷移或者內皮細胞管生成。
另外，本發(fā)明特征在于促進或誘導組織中內皮細胞程序性死亡的方法，其中內皮細胞程序性死亡是由一種或多種內皮細胞整聯蛋白(例如α5β3、α6β1、αVβ3)或者一種或多種內皮細胞整聯蛋白亞基(例如α5、α6、αV、β1、β3)介導的。該方法包括內皮細胞接觸塔牡斯達丁或者其片段、突變體、同系物、類似物或者等位變體。通過抑制下面的一項或多項能夠促進或誘導程序性細胞死亡內皮細胞增殖、內皮細胞遷移或者內皮細胞管生成。
本發(fā)明進一步特征在于抑制組織中血管生成或細胞增殖的方法，包括以下面的一種或多種方式與組織接觸與整聯蛋白的α1亞基特異性結合的抗體或肽、與整聯蛋白的α2亞基特異性結合的抗體或肽、與整聯蛋白的α3亞基特異性結合的抗體或肽、與整聯蛋白的α5亞基特異性結合的抗體或肽、與整聯蛋白的α6亞基特異性結合的抗體或肽、與整聯蛋白的αV亞基特異性結合的抗體或肽、與整聯蛋白的β1亞基特異性結合的抗體或肽、或者與整聯蛋白的β3亞基特異性結合的抗體或肽。該方法可以用來治療特征在于血管生成或細胞增殖的疾病。
另外，本發(fā)明特征在于促進或者誘導組織中血管生成或細胞增殖的方法，包括組織接觸下面的一種或多種整聯蛋白的α1亞基、整聯蛋白的α2亞基、整聯蛋白的α3亞基、整聯蛋白的α5亞基、整聯蛋白的α6亞基、整聯蛋白的αV亞基、整聯蛋白的β1亞基、或者整聯蛋白的β3亞基。整聯蛋白的亞基的一種或多種可以是可溶形式，它們也可以是單體、二聚體、三聚體、四聚體或者多聚體。
本發(fā)明特征還在于抑制脊椎動物增殖疾病的方法，其中所述疾病特征在于安瑞斯丁的受體(例如α1β1整聯蛋白、α2β1整聯蛋白、α3β1整聯蛋白、αVβ3整聯蛋白)介導的血管生成；該方法包括抑制安瑞斯丁受體介導的血管生成，從而抑制增殖疾病。安瑞斯丁受體介導的血管生成的抑制能夠導致腫瘤生長和轉移的抑制或者已發(fā)生腫瘤的退化。通過增殖細胞接觸抑制安瑞斯丁受體介導的血管生成的分子能夠實現對安瑞斯丁受體介導的血管生成的抑制作用，所述分子是例如特異性結合安瑞斯丁受體的抗體(例如多克隆抗體或單克隆抗體)、抗體片段或者肽。
另外，本發(fā)明特征在于促進組織中血管生成的方法，包括與組織接觸含有能夠結合安瑞斯丁的一種或多種可溶性受體的組合物。
另一方面，本發(fā)明特征在于抑制脊椎動物增殖疾病的方法，其中所述疾病特征在于卡斯達丁的受體(例如α1β1整聯蛋白、α2β1整聯蛋白)介導的血管生成；該方法包括抑制卡斯達丁受體介導的血管生成，從而抑制增殖疾病?？ㄋ惯_丁受體介導的血管生成的抑制能夠導致腫瘤生長和轉移的抑制或者已發(fā)生腫瘤的退化。通過增殖細胞接觸抑制卡斯達丁受體介導的血管生成的分子能夠實現對卡斯達丁受體介導的血管生成的抑制作用，所述分子是例如特異性結合卡斯達丁受體的抗體(例如多克隆抗體或單克隆抗體)、抗體片段或者肽。
另外，本發(fā)明特征在于促進組織中血管生成的方法，包括所述組織接觸含有能夠結合卡斯達丁的一種或多種可溶性受體的組合物。
另一方面，本發(fā)明特征在于抑制脊椎動物增殖疾病的方法，其中所述疾病特征在于塔牡斯達丁的受體(例如α5β1整聯蛋白、α6β1整聯蛋白、αVβ3整聯蛋白)介導的血管生成；該方法包括抑制塔牡斯達丁受體介導的血管生成，從而抑制增殖疾病。塔牡斯達丁受體介導的血管生成的抑制能夠導致腫瘤生長和轉移的抑制或者已發(fā)生腫瘤的退化。通過增殖細胞接觸抑制塔牡斯達丁受體介導的血管生成的分子能夠實現對塔牡斯達丁受體介導的血管生成的抑制作用，所述分子是例如特異性結合塔牡斯達丁受體的抗體(例如多克隆抗體或單克隆抗體)、抗體片段或者肽。
另外，本發(fā)明特征在于促進組織中血管生成的方法，包括所述組織接觸含有能夠結合塔牡斯達丁的一種或多種可溶性受體的組合物。
另一方面，本發(fā)明特征在于抑制組織中血管生成的方法，包括與組織接觸降低組織中FLIP水平的分子。
本發(fā)明特征還在于含有作為生物活性成分的一種或多種特異性結合一種或多種安瑞斯丁受體或者安瑞斯丁受體亞基(例如α1β1整聯蛋白、α2β1整聯蛋白、α3β1整聯蛋白、αVβ3整聯蛋白、α1整聯蛋白亞基、α2整聯蛋白亞基、α3整聯蛋白亞基、αV整聯蛋白亞基、β1整聯蛋白亞基、β3整聯蛋白亞基)的分子(例如抗體、抗體片段、肽)的組合物。該組合物可以任選地含有藥學可接受載體。所述組合物可以用于抑制特征在于血管生成的疾病的方法中，其中所述方法包括對患者施用所述組合物。所述疾病可以以血管生成活性為特征，并且所述組合物可以與放射治療、化學治療或免疫治療結合對患者施用。
另一方面，本發(fā)明特征在于含有作為生物活性成分的一種或多種安瑞斯丁受體或者安瑞斯丁受體亞基(例如α1β1整聯蛋白、α2β1整聯蛋白、α3β1整聯蛋白、αVβ3整聯蛋白、α1整聯蛋白亞基、α2整聯蛋白亞基、α3整聯蛋白亞基、αV整聯蛋白亞基、β1整聯蛋白亞基、β3整聯蛋白亞基)的組合物。該組合物可以任選地含有藥學可接受載體。所述組合物可以用于促進或誘導血管生成的方法，其中所述方法包括對患者施用所述組合物。所述疾病可以以血管生成活性為特征，并且所述組合物可以與放射治療、化學治療或免疫治療結合對患者施用。
本發(fā)明特征還在于含有作為生物活性成分的一種或多種特異性結合一種或多種卡斯達丁受體或者卡斯達丁受體亞基(例如α1β1整聯蛋白、α2β1整聯蛋白、α1整聯蛋白亞基、α2整聯蛋白亞基、β1整聯蛋白亞基)的分子(例如抗體、抗體片段、肽)的組合物。該組合物可以任選地含有藥學可接受載體。所述組合物可以用于抑制特征在于血管生成活性的疾病的方法中，其中所述方法包括對患者施用所述組合物。所述疾病可以以血管生成活性為特征，并且所述組合物可以與放射治療、化學治療或免疫治療結合對患者施用。
另一方面，本發(fā)明特征在于含有作為生物活性成分的一種或多種卡斯達丁受體或者卡斯達丁受體亞基(例如α1β1整聯蛋白、α2β1整聯蛋白、α1整聯蛋白亞基、α2整聯蛋白亞基、β1整聯蛋白亞基)的組合物。該組合物可以任選地含有藥學可接受載體。所述組合物可以用于促進或誘導血管生成的方法，其中所述方法包括對患者施用所述組合物。所述疾病可以以血管生成為特征，并且所述組合物可以與放射治療、化學治療或免疫治療結合對患者施用。
本發(fā)明特征還在于含有作為生物活性成分的一種或多種特異性結合一種或多種塔牡斯達丁受體或者塔牡斯達丁受體亞基(例如α5β1整聯蛋白、α6β1整聯蛋白、αVβ3整聯蛋白、α5整聯蛋白亞基、α6整聯蛋白亞基、αV整聯蛋白亞基、β1整聯蛋白亞基、β3整聯蛋白亞基)的分子(例如抗體、抗體片段、肽)的組合物。該組合物可以任選地含有藥學可接受載體。所述組合物可以用于抑制特征在于血管生成活性的疾病的方法中，其中所述方法包括對患者施用所述組合物。所述疾病可以以血管生成活性為特征，并且所述組合物可以與放射治療、化學治療或免疫治療結合對患者施用。
另一方面，本發(fā)明特征在于含有作為生物活性成分的一種或多種塔牡斯達丁受體或者塔牡斯達丁受體亞基(例如α5β1整聯蛋白、α6β1整聯蛋白、αVβ3整聯蛋白、α5整聯蛋白亞基、α6整聯蛋白亞基、αV整聯蛋白亞基、β1整聯蛋白亞基、β3整聯蛋白亞基)的組合物。該組合物可以任選地含有藥學可接受載體。所述組合物可以用于促進或誘導血管生成的方法，其中所述方法包括對患者施用所述組合物。所述疾病可以以血管生成活性為特征，并且所述組合物可以與放射治療、化學治療或免疫治療結合對患者施用。
另一方面，本發(fā)明特征在于一種測定細胞(例如癌細胞)是否易受安瑞斯丁活性的影響的方法，包括下面的步驟(a)提供含有該細胞的樣品(例如來自哺乳動物)，(b)使樣品與一種或多種抗體(例如α1β1整聯蛋白、α2β1整聯蛋白、α3β1整聯蛋白、αVβ3整聯蛋白、α1整聯蛋白亞基、α2整聯蛋白亞基、α3整聯蛋白亞基、αV整聯蛋白亞基、β1整聯蛋白亞基、β3整聯蛋白亞基抗體)反應足夠時間并且處于適合這一種或多種抗體與細胞結合的條件下；如果細胞對安瑞斯丁的作用敏感，則可形成細胞-抗體復合物；然后是(c)檢測細胞-抗體復合物的存在；這樣樣品中細胞-抗體復合物的存在是細胞易受安瑞斯丁活性影響的指征。所述哺乳動物可以患有至少部分特征在于不期望的血管生成的疾病。
另一方面，本發(fā)明特征在于一種測定細胞(例如癌細胞)是否易受卡斯達丁活性的影響的方法，包括下面的步驟(a)提供含有該細胞的樣品(例如來自哺乳動物)，(b)使樣品與一種或多種抗體(例如抗α1β1整聯蛋白、α2β1整聯蛋白、α1整聯蛋白亞基、α2整聯蛋白亞基、β1整聯蛋白亞基抗體)反應足夠時間并且處于適合這一種或多種抗體與細胞結合的條件下；如果細胞對卡斯達丁的作用敏感則在哪里形成細胞-抗體復合物；然后是(c)檢測細胞-抗體復合物的存在；這樣樣品中細胞-抗體復合物的存在是細胞易受卡斯達丁活性的影響的指征。所述哺乳動物可以患有至少部分特征在于不期望的血管生成的疾病。
另一方面，本發(fā)明特征在于一種測定細胞(例如癌細胞)是否易受塔牡斯達丁活性的影響的方法，包括下面的步驟(a)提供含有該細胞的樣品(例如來自哺乳動物)，(b)使樣品與一種或多種抗體(例如抗α5β1整聯蛋白、α6β1整聯蛋白、αVβ3整聯蛋白、α1整聯蛋白亞基、α5整聯蛋白亞基、α6整聯蛋白亞基、αV整聯蛋白亞基、β1整聯蛋白亞基、β3整聯蛋白亞基抗體)反應足夠時間并且處于適合這一種或多種抗體與細胞結合的條件下；如果細胞對塔牡斯達丁的作用敏感，則可形成細胞-抗體復合物；然后是(c)檢測細胞-抗體復合物的存在；這樣樣品中細胞-抗體復合物的存在是細胞易受塔牡斯達丁活性的影響的指征。所述哺乳動物可以患有至少部分特征在于不期望的血管生成的疾病。
本發(fā)明還涉及具有抗血管生成功能的包括IV型膠原的α鏈的NC1結構域的蛋白質。特別地，本發(fā)明涉及新的蛋白質安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁，并且涉及生物活性(例如抗血管生成)片段、其突變體、類似物、同系物和衍生物、以及多聚體(例如二聚體)和融合蛋白(這里也稱作嵌合蛋白)。這些蛋白質全部包括IV型膠原的NC1(非膠原性1)結構域的C-末端片段。更具體地，安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁各自分別是IV型膠原的α1鏈、α2鏈和α3鏈的NC1結構域的C-末端片段。特別地，安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁是單體蛋白質。這三種蛋白質都體內抑制腫瘤生長，并且在幾種體外模型中(包括內皮管測試)也抑制毛細管的形成。
本發(fā)明包括在這些細胞中作為內皮細胞中安瑞斯丁的受體，介導抗血管生成活性，包括內皮細胞程序性死亡的整聯蛋白或整聯蛋白亞基(例如α1β1，α1β2，α2β1整聯蛋白)。安瑞斯丁也特異性結合和抑制基質金屬蛋白酶2、3和9的基膜降解活性；這樣的降解活性是血管生成的整體部分。
本發(fā)明還包括分離的和重組產生的安瑞斯丁，其包括具有抗血管生成活性的IV型膠原α1鏈的NC1結構域、分離的安瑞斯丁的抗血管生成片段、分離的安瑞斯丁的多聚體和抗血管生成片段和編碼這些抗血管生成蛋白質的多核苷酸。也包括含有分離的安瑞斯丁、其抗血管生成片段或者這兩者作為生物活性成分的組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明特征在于治療例如哺乳動物癌癌癥的增殖性疾病的方法，其中所述疾病特征在于生血管活性，所述方法包括對哺乳動物施用含有抗血管生成安瑞斯丁或者其片段的組合物。抗血管生成的安瑞斯丁及其片段也可以用來防止細胞遷移或內皮細胞增殖。另一個特征是分離的抗血管生成的安瑞斯丁及其片段的抗體。
本發(fā)明還包括在這些細胞中作為內皮細胞中卡斯達丁的受體，介導抗血管生成活性，包括內皮細胞程序性死亡的整聯蛋白或整聯蛋白亞基(例如α1β1和α1β2整聯蛋白)。
本發(fā)明還包括分離的和重組產生的卡斯達丁，其包括具有抗血管生成活性的IV型膠原α2鏈的NC1結構域、分離的卡斯達丁的抗血管生成片段、分離的卡斯達丁的多聚體和抗血管生成片段和編碼這些抗血管生成蛋白質的多核苷酸。也包括含有分離的卡斯達丁、其抗血管生成片段、或者這兩者作為生物活性成分的組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明特征在于治療例如哺乳動物癌癌癥的增殖性疾病的方法，其中所述疾病特征在于生血管活性，所述方法包括對哺乳動物施用含有抗血管生成卡斯達丁或者其片段的組合物?？寡苌煽ㄋ惯_丁及其片段也可以用來防止細胞遷移或內皮細胞增殖。另一個特征是分離的抗血管生成的卡斯達丁及其片段的抗體。
本發(fā)明還包括在這些細胞中作為內皮細胞中塔牡斯達丁的受體，介導抗血管生成活性，包括內皮細胞程序性死亡的整聯蛋白或整聯蛋白亞基(例如α5β1，α6β1和αVβ3整聯蛋白)。
本發(fā)明還包括分離的和重組產生的塔牡斯達丁，其包括具有抗血管生成活性的IV型膠原α3鏈的NC1結構域、分離的塔牡斯達丁的抗血管生成片段、分離的塔牡斯達丁的多聚體和抗血管生成片段和編碼這些抗血管生成蛋白質的多核苷酸。也包括含有分離的塔牡斯達丁、其抗血管生成片段或者這兩者作為生物活性成分的組合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明特征在于治療例如哺乳動物癌癥的增殖性疾病的方法，其中所述疾病特征在于生血管活性，所述方法包括對哺乳動物施用含有抗血管生成的塔牡斯達丁或者其片段的組合物?？寡苌傻乃邓惯_丁及其片段也可以用來防止細胞遷移或內皮細胞增殖。另一個特征是分離的抗血管生成的塔牡斯達丁及其片段的抗體。


圖1A和1B是描述人IV型膠原的α1鏈的核苷酸(圖1A，SEQ IDNO1)和氨基酸(圖1B，SEQ ID NO2)序列的圖。雙下劃線指明pET22b(+)正向(SEQ ID.NO3)和反向(SEQ ID NO4)引物的位置，單下劃線指明pPICZαA正向(SEQ ID NO15)和反向(SEQID NO16)引物的位置。
圖2是描述安瑞斯丁克隆載體pET22b(+)的示意圖。指明其中克隆安瑞斯丁的正向(SEQ ID NO3)和反向(SEQ ID NO4)引物和位點。
圖3A和3B是說明安瑞斯丁(圖3A，0μg/ml至10μg/ml，x-軸)和內靜素(圖3B，0μg/ml至10μg/ml，x-軸)對3H-胸苷摻入(y-軸)作為內皮細胞(C-PAE)增殖的指示劑的作用的一對線形圖。
圖4A、4B、4C和4D一組四個條形圖，說明安瑞斯丁和內靜素對3H-胸苷摻入(y-軸)作為內皮細胞增殖的指示劑的作用。圖4A、4B和4C說明安瑞斯丁(0μg/ml-50μg/ml(圖4A和4B)和0μg/ml-10μg/ml(Fig.4C))分別對786-O，PC-3，HPEC細胞的作用。圖4D說明0.1-10μg/ml內靜素對A-498細胞的作用。
圖5A、5B和5C是一組四個顯微照片，說明安瑞斯丁(2μg/ml，圖5B)和內靜素(20μg/ml，圖5C)通過FBS誘導的趨化性對人臍帶內皮細胞(ECV-304)遷移的作用。圖5A說明沒有處理的細胞。
圖6是說明圖5的結果的條形圖。圖6說明安瑞斯丁(2μg/ml或20μg/ml)和內靜素(2.5μg/ml和20μg/ml)對ECV-304內皮細胞遷移的作用。
圖7是說明安瑞斯丁對內皮管生成的作用的線形圖。y-軸表示管生成百分比，x-表示抑制劑濃度。處理是沒有(對照，◆)，BSA(對照，△)，7S結構域(對照，×)和安瑞斯丁(■)。
圖8A和8B是一對顯微照片，說明安瑞斯丁(0.8μg/ml，圖8B)相對于對照物(Fig.8A)對內皮管生成的作用。
圖9A、9B、9C和9D是四個線形圖，說明體內安瑞斯丁和內靜素對腫瘤生長的作用。圖9A是說明對于10mg/kg安瑞斯丁-處理(□)，BSA-處理(+)，和對照小鼠(●)，腫瘤體積從700mm3增加的圖。圖9B說明對于10mg/kg安瑞斯丁-處理(□)和BSA-處理(+)腫瘤，腫瘤體積從100mm3增加的圖。圖9C說明對于對于10mg/kg安瑞斯丁-處理(□)，內靜素-處理(▲)，和對照小鼠(●)，腫瘤體積從大約100mm3增加的圖。圖9D說明安瑞斯丁-處理(□)對對照物(●)，從200mm3腫瘤增加的圖。圖10A和10B是一對直方圖，說明各種處理下(x-軸)作為C-PAE細胞(圖10A)和PC-3細胞(圖10B)在OD405下的吸光度(y-軸)的函數的Caspase-3活性的量。每一個柱形代表三個孔的平均值+/-標準誤差。圖11A和11B是描述人IV型膠原的α2鏈的核苷酸(圖11A，SEQ ID NO5)和氨基酸(圖11B，SEQID NO6)序列的圖。雙下劃線指明pET22b(+)正向(SEQ ID NO7)和反向(SEQ ID NO8)引物的位置，單下劃線指明pPICZαA正向(SEQ ID NO17)和反向(SEQ ID NO18)引物的位置。
圖12是描述卡斯達丁克隆載體pET22b(+)的示意圖。指明其中克隆了卡斯達丁的正向(SEQ ID NO7)和反向(SEQ ID NO8)引物和位點。
圖13A，13B，13C和13D是直方圖，說明各種濃度的卡斯達丁(x-軸)對內皮細胞(C-PAE)的增殖的作用(圖13A和13C)和對非-內皮細胞(786-O，PC-3和HEK 293)的作用(圖13B和13D)。以3H-胸苷摻入(圖13A和13B)和亞甲基藍染色(圖13C和13D)的函數測定增殖。
圖14是條形圖，說明對于沒有VEGF(沒有VEGF或者血清)，和有VEGF(1％FCS和10ng/ml VEGF)細胞的處理，和對于0.01卡斯達丁(1％FCS和10ng/ml VEGF和0.01μg/ml卡斯達丁)和1.0μg/ml卡斯達丁(1％FCS和10ng/ml VEGF和1μg/ml卡斯達丁)的處理每個條框區(qū)(y-軸)遷移的內皮細胞的數目。
圖15是說明BSA(□)，卡斯達丁(■)，和α5NC1(○)的不同處理下以對照(PBS-處理孔)管形成(y-軸)的量的線形圖。垂直棒形圖代表平均值的標準誤差。
圖16是作為t＝0(y-軸)時存在的蛋白質的百分比的粘著斑蛋白的水平對時間(x-軸)的函數的FLIP(FLICE-抑制蛋白，或者FADD-樣白血病介素-1β-轉化酶-抑制蛋白)水平的圖。
圖17A，17B，17C和17D是描述卡斯達丁(■)，內靜素(○)和對照(□)對PC-3細胞(圖17A和17B)和786-O細胞(圖17C和17D)對分數腫瘤體積(y-軸，圖17A和17B)或者腫瘤體積立方毫米(y-軸，圖17C和17D)的作用，對處理的天數作圖(x-軸)的條形圖。
圖18A和18B是描述人IV型膠原的α3鏈的核苷酸(圖18A，SEQ ID NO9)和氨基酸(圖18B，SEQ ID NO10)序列的圖。雙下劃線指明pET22b(+)正向(SEQ ID.NO11)和反向(SEQ ID NO12)引物的位置。也指出了”塔牡斯達丁333”(SEQ ID NO20)和”塔牡斯達丁334”(SEQ ID NO21)片段的起點和終點(“*”＝塔牡斯達丁333；”+”＝塔牡斯達丁334)。
圖19是描述塔牡斯達丁克隆載體pET22b(+)的示意圖。指明其中克隆塔牡斯達丁的正向(SEQ ID NO11)和反向(SEQ ID NO12)引物和位點。
圖20是說明塔牡斯達丁突變體Tumsatin N-53(Tum-1)中α3(IV)NC1單體中截短的氨基酸的位置的示意圖。實心圓圈相應于從塔牡斯達丁缺失N-末端53個氨基酸殘基產生該突變體。短線標出的二硫鍵和它們在α1(IV)NC1和α2(IV)NC1中一樣排列。
圖21A、21B和21C是三個直方圖，說明當用各種濃度的塔牡斯達丁(x-軸)處理時3H-胸苷對C-PAE細胞(圖21A)、PC-3細胞(圖21B)和786-O細胞(圖21C)的摻入(y-軸)。所以的組代表三次重復的樣品。
圖22是說明x軸與遞增量的αVβ3結合的0.1μg/ml Tumstatatin對C-PAE細胞攝入顏料的影響的直方圖。y-軸給出的是OD655的吸光度。“0.1％FCS”代表0.1％FCS處理過(沒有刺激的)對照物，而“20％FCS”是20％FCS處理過(刺激的)對照物。剩余的條框代表單獨的αVβ3對照物和用塔牡斯達丁加遞增濃度的αVβ3處理的情況。每個條框代表三個孔的平均值+/-標準誤差。該實驗重復三次。星號表明t-試驗P＜0.05。
圖23A和23B是一對直方圖，說明作為各種處理下(x-軸)C-PAE細胞(圖23A)和PC-3細胞(圖23B)OD405吸光度(y-軸)的函數的Caspase-3活性的量。每個條框柱代表三個孔的平均值+/-標準誤差。
圖24A、24B、24C和24D是四個直方圖，說明在整聯蛋白亞基α1至α6、β1或者αVβ3整聯蛋白阻斷抗體存在下，HUVEC細胞對用塔牡斯達丁(圖24A)、或者IV型膠原對照物(圖24B)、玻連蛋白(圖24C)或者層粘連蛋白-1(圖24A)包被的平板的結合。在每個表的上方列出了平板包被物，每個表的x-軸是用于溫育的抗體。BSA-包被的平板用作負對照。
圖25是說明C-PAE細胞與塔牡斯達丁-包被的平板的結合的直方圖。BSA-包被的平板用作負對照。
圖26是說明各種量(x-軸)的塔牡斯達丁(●)，BSA(對照，□)和7S結構域(對照，O)對內皮管形成的作用(y-軸)的線形圖。
圖27A和27B是一對線形圖，說明塔牡斯達丁(●)和內靜素(○)相對對照物(□)隨著處理天數(x-軸)對腫瘤體積的作用(mm3，y-軸)。用星號標記的點是顯著的，t-實驗測定P＜0.05。
圖28是說明腫瘤體積隨著對照小鼠(□)和用塔牡斯達丁變體N-53處理的小鼠(●)處理的天數(x-軸)而增加(y-軸)的圖。用星號標記的點是顯著的，t-實驗測定P＜0.05。
圖29是說明遞增濃度的塔牡斯達丁和Numstatin N-53下(x-軸)細胞生存能力(作為OD590的函數，y-軸)的圖。每個點代表三個孔的平均值+/-標準誤差。星號代表t-實驗測定P＜0.05。
圖30是線形圖，說明各種濃度的安瑞斯丁(●)、卡斯達丁(○)、12kDa安瑞斯丁片段(■)、8kDa安瑞斯丁片段(□)和10kDa卡斯達丁片段(▲)(x-軸)對內皮管形成的抑制作用(y-軸)。
圖31是線形圖，說明各種濃度的塔牡斯達丁片段333(●)、塔牡斯達丁片段334(○)、BSA(對照，■)、α6(對照，□)和塔牡斯達丁(▲)(x-軸)對內皮管形成的抑制作用(y-軸)。
圖32A、32B和32C是三個直方圖，說明遞增濃度的塔牡斯達丁(x-軸)對HPE(圖32A)、C-PAE(圖32B)和WM-164(圖32C)細胞的增殖的作用(y-軸)。
圖33A和33B是一對說明遞增濃度的塔牡斯達丁(◆)、Tum-1(□)、Tum-2(●)、Tum-3(◇)和Tum-4(▲)(x-軸)對C-PAE細胞(圖33A)和WM-164細胞(圖33B)相對數目的影響(y-軸)的圖。
圖34A和34B是一對說明遞增濃度的塔牡斯達丁(◆)、Tum-1(□)、Tum-2(●)、Tum-3(◇)和Tum-4(▲)(x-軸)對C-PAE細胞(圖34A)和WM-164細胞(圖34B)細胞生存能力的影響(y-軸)的圖。每個點代表三個孔的平均值+/-標準誤差。
圖35說明用5μg/ml的Tum-1、Tum-2、Tum-3、Tum-4，或80ng/mlTNF-α或PBS緩沖液(對照)處理的C-PAE細胞(x-軸)在OD405的吸光度(y-軸)所顯示出的Caspase-3活性的直方圖。
圖36A、36B和36C是三個直方圖。圖36A、36B和36C說明在對照物IgG、αVβ3、αVβ5和BSA存在下C-PAE細胞與包被有Tum-1(圖36A)、Tum-2(圖36B)和Tum-4(圖36C)的平板的結合百分率(y-軸)。
圖37是說明與包被有PBS、塔牡斯達丁、Turn-1、Tum-2、Tum-4或BSA(x-軸)的平板粘著的WM-164細胞OD655吸光度(y-軸)表示的亞甲基藍染色的水平的直方圖。
圖38A、38B、38C、38D和38E是五個直方圖，說明預先與Tum-4抗體(1∶100、1∶200、1∶500稀釋度)(x-軸)溫育的用1.5μg/ml的Tum-1(圖38A)或Tum-2(圖38B)、或αVβ3蛋白質(圖38C)處理的C-PAE細胞(y-軸)，或者用塔牡斯達丁(圖38D)或Tum-4(圖38E)處理的WM-164細胞的增殖。
圖39是說明x-軸上塔牡斯達丁(●)、內靜素(△)、αVβ3抗體(□)和IgG(◆)(對照)的濃度對y-軸上相對細胞數目的圖。每個點代表三個孔平均值+/-標準誤差。每項實驗重復三次。星號代表t-實驗測定P＜0.05。
圖40是說明遞增濃度的卡斯達丁(◆)、Can-1(■)和Can-2(▲)(x-軸)對C-PAE細胞相對細胞數(y-軸)的作用。每一種蛋白質的每種濃度試驗重復四次。
圖41是說明使用PBS(對照)、卡斯達丁、Can-1和Can-2處理的每一栓形成的血管的平均數(y-軸)的直方圖。
圖42是塔牡斯達丁蛋白質序列的圖示，指明了T1、T2、T3、T4、T5和T6肽的位置。GP-A＝第一古德帕斯徹表位。GP-B＝第二古德帕斯徹表位。
圖43A、43B、43C和43D是四個直方圖，說明T3肽對內皮細胞增殖的抑制(圖43A、43B和43C)和對內皮細胞程序性死亡的誘導(圖43D)。圖43A說明用10μg/ml的肽T2、T3、T4、T5或T6(x-軸)處理的C-PAE細胞的增殖(y-軸)。圖43B說明用0.1、1.0或10μg/ml的T3肽處理C-PAE細胞的增殖(y-軸)。圖43C說明當用與各種濃度的αVβ3整聯蛋白(x-軸)預先溫育的T3肽處理時C-PAE細胞的細胞生長(y-軸)。圖43D說明MTT實驗測定的用10μg/ml肽T2、T3、T4、T5或T6處理之后的C-PAE細胞的存活能力(y-軸)。所有的柱值代表三個孔的平均值+/-SEM。
圖44A、44B、44C、44D、44E、44F和44G是7個直方圖，說明當用整聯蛋白抗體、小鼠IgG(對照)、或者肽T2、T3、T4、T5或T6處理時C-PAE細胞的附著。圖44A說明在BSA(對照)、沒有抗體(對照)、小鼠IgG(對照)和αVβ3整聯蛋白抗體(x-軸)下，HUVEC細胞怎樣結合Tum-5肽(10μg/ml)包被的平板(y-軸)。圖44B是說明C-PAE細胞(y-軸)與用10μg/ml重組Tum-5肽(x-軸)包被的96-孔平板的附著的直方圖。圖44C是說明C-PAE細胞(y-軸)結合包被Tum-5并用2.5μg/ml肽T2、T3、T4、T5或T6處理的96-孔平板(x-軸)，或者結合用T3處理的Tum-4包被的平板的直方圖。PBS處理作為對照。圖44D說明不同濃度的T3肽(x-軸)對C-PAE細胞(y-軸)與Tum-5-包被的平板的結合的作用。PBS處理作為對照。圖44E說明在PBS(對照)、IgG(對照)或者αVβ3整聯蛋白抗體存在下C-PAE細胞(y-軸)與T2、T3、T4、T5或T6-包被的平板(x-軸)的結合。圖44F說明當與PBS(對照)、IgG(對照)或者αV整聯蛋白抗體、β1整聯蛋白抗體、β3整聯蛋白抗體、αVβ5整聯蛋白抗體或者BSA(對照)(x-軸)溫育時，C-PAE細胞(y-軸)與T3-包被的平板的結合。圖44G說明當與PBS(對照)、BSA(對照)或者不同濃度(0.1、1.0、10.0μg/ml)的T3肽或者不同濃度(0.1、1.0、10.0μg/ml)的T6肽(x-軸)溫育時，C-PAE細胞(y-軸)與玻連蛋白(2.5μg/ml)包被的平板的結合。每一個柱子代表三個孔的平均值+/-SEM。實驗重復三次。星號表示t-實驗測定P＜0.05。
圖45是直方圖，說明在PBS(對照)、αVβ3整聯蛋白抗體、β1整聯蛋白抗體、α6整聯蛋白抗體或者BSA(對照)存在下，HUVEC細胞與塔牡斯達丁-N53包被(20μg/ml)的平板的附著。
圖46是說明用賦形劑(對照，○◇)、每日每千克5毫克的塔牡斯達丁-N53(□)或者每日每千克20毫克的塔牡斯達丁-N53(◇)處理的PC3前列腺腫瘤(PC3前列腺異種移植模型)經15天(x-軸)以mm3表示的平均腫瘤體積(y-軸)的圖。
圖47是說明用賦形劑(對照，○)、每日每千克20毫克的塔牡斯達丁-N53(□)或者每日每千克5毫克的塔牡斯達丁-N53(◇)處理的MDA-MB435乳腺癌腫瘤經22天(x-軸)以mm3表示的平均腫瘤體積(y-軸)的圖。
圖48是直方圖，說明當用PBS(對照)、緩沖液(對照)、20μg/ml的塔牡斯達丁-N53、10μg/ml的塔牡斯達丁-45-132和5μg/ml的塔牡斯達丁-45-132(x-軸)處理時S-期C-PAE細胞百分比(y-軸)。在10％FBS存在下進行細胞周期測定。
圖49是直方圖，說明在PBS(對照)、αVβ3整聯蛋白抗體、β1整聯蛋白抗體、α6整聯蛋白抗體或者BSA(對照)存在下HUVEC細胞與塔牡斯達丁-45-132-包被(20μg/ml)的平板的附著(y-軸)。
圖50A和50B是兩個直方圖，說明塔牡斯達丁-45-132對細胞增殖的作用。圖50A說明用0、0.125、0.250、0.500、1.0或2.0μM的濃度(x-軸)的大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132(黑色條框)或者293細胞表達的全長塔牡斯達丁(白色條框)處理的C-PAE細胞的BrdU實驗測定的細胞增殖(OD450下，y-軸)。圖50B說明用0、0.1、1.0、5.0和10.0μg/ml濃度(x-軸)的Pichia表達的塔牡斯達丁-45-132處理C-PAE的亞甲基藍染色(OD655)測定的細胞增殖。沒有刺激的C-PAE細胞作為對照物。
圖51是說明大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132和Tum-5-126-C-A對細胞周期影響的直方圖。說明0時刻(對照)和用0、1、10和20μg/ml(x-軸)的塔牡斯達丁-45-132(黑色條框)或者Tum-5-126-C-A(白色條框)處理之后S-期C-PAE細胞百分比(y-軸)。實驗重復三次。
圖52A、52B、52C和52D是四個直方圖，說明塔牡斯達丁-45-132和Tum-5-126-C-A對細胞存活能力的影響。圖52A說明MTT實驗中用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-軸)塔牡斯達丁-45-132(黑色條框)和烷基化并且還原的塔牡斯達丁-45-132(白色條框)處理的C-PAE細胞在OD562下測定的細胞生存能力(y-軸)。圖52B說明MTT實驗中用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-軸)Tum-5-126-C-A處理的C-PAE細胞在OD562下測定的細胞生存能力(y-軸)。圖52C說明MTT實驗中用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-軸)塔牡斯達丁-45-132處理的PC-3細胞在OD562下測定的細胞生存能力(y-軸)。圖52D說明MTT實驗中用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-軸)塔牡斯達丁-45-132處理的DU-145細胞在OD562下測定的細胞生存能力(y-軸)。
圖53是直方圖，說明了對照、對照+DEVD-fmk、TNF-α、TNF-α+DEVD-fmk、塔牡斯達丁-45-132(1μg/ml和10μg/ml)、塔牡斯達丁-45-132(10μg/ml)+DEVD-fmk條件(x-軸)下的caspase-3活性(OD405下測定的，y-軸)。
圖54是線形圖，說明在用賦形劑(對照，□)、1mg/kg塔牡斯達丁-45-132(◆)、1mg/kgTum-5-126-C-A(●)、20mg/kg內靜素(○)和微量泵控制的塔牡斯達丁-45-132(1mg/kg，△)處理第0、5、10、15和20天(x-軸)時以V/Vo(平均腫瘤體積/最初腫瘤體積)表示的分數腫瘤體積(y-軸)。
具體實施例方式
很多種疾病都是不期望的血管生成的結果。換句話說，如果有可能終止某些癥狀下或者特定組織中毛細血管的生長和擴張，則可以預防或減輕很多疾病和不期望的癥狀。基膜組織依賴IV型膠原網絡的形成，推測通過IV型膠原的C-末端球形非膠原(NC1)結構域而發(fā)生(Timpl，R.，1996，Curr.Opin.Cell.Biol.8618-24；Timpl，R.等，1981，Eur.J.Biochem.120203-211)。IV型膠原由6種不同的基因產物組成，即α1至α6(Prockop，D.J.等，1995，Annu.Rev.Biochenz.64403-34)。α1和α2異構體普遍存在于人基膜中(Paulsson，M.，1992，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.2793-127)，而其它四種異構體表現出有限分布(Kalluri，R.等，1997，J Clin.Invest.992470-8)。
從已經存在的血管形成新的毛細管、血管生成，是腫瘤生長和轉移過程必需的(Folkman，J.等，1992，J.Biol.Chem.26710931-4；Foll man，J.1995，Nat.Med.127-31；Hanahan，D.等，1996，Cell86353-64)。人和動物腫瘤開始時不血管化，但是，腫瘤生長大于數mm3時，就必須血管化(Folkman，J.1995，Nat.Med.127-31；Hanahan，D.等，1996，Cell 86353-64)。向血管生成表型的轉變需要血管生成刺激劑的正調節(jié)和血管生成抑制劑的負調節(jié)(Folkman，J.1995，Nat.Med.127-31)。血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞因子(bFGF)是腫瘤中最常表達的生血管因子。血管化的腫瘤可以過量表達一種或多種生血管因子，它們可以協同促進腫瘤生長。受體拮抗劑對單一生血管因子例如VEGF的抑制不足以阻止腫瘤生長。最近鑒定了很多血管生成抑制劑，并且一些因子例如IFN-α，血小板因子-4(Maione，T.E.等，1990，Science 24777-9)和PEX(Brooks，P.C.等，1998，Cell 92391-400)不與腫瘤細胞相關，而制管張素(O′Reilly，M.S.等，1994，Cell 79315-28)和內靜素(O′Reilly，M.S.等，1997，Cell 8827785)是腫瘤組織本身產生的與腫瘤相關的血管生成抑制劑。
盡管用這些內源血管生成抑制劑治療腫瘤生長和轉移非常有效并且是一個有吸引力的想法，但是必須考慮一些潛在的與抗血管生成治療相關的問題。要認真考慮長期抗血管生成治療誘導的推遲的毒性，以及損害的傷口愈合的可能性或者治療期間發(fā)生的復發(fā)性血管生成。
整聯蛋白一般具有短的C-末端細胞質結構域，以連接受體和細胞支架，和用于結合配體的長N-末端胞外結構域。配體結合中涉及這兩個α和β亞基，并且存在很多組潛在的配體。一些常見的配體包括纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白和各種類型的膠原。其中的一些(例如纖連蛋白和層粘連蛋白)被多種整聯蛋白結合。已知膠原I被整聯蛋白α1β1、α2β1和α3β1結合，而膠原IV被整聯蛋白α1β1和α2β1結合。上皮細胞被整聯蛋白α2β1、α6β1、αVβ3和α6β4結合。細胞因子激活的內皮細胞被α4β1和αLβ2結合，而血管內皮被αMβ2整聯蛋白結合。
在本發(fā)明中，公開了與抗血管生成蛋白質和肽相互作用(例如特異性結合)的細胞表面受體，特別是結合抗血管生成蛋白質安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁的整聯蛋白和整聯蛋白亞基。這些整聯蛋白為評價新的抗血管生成蛋白質、肽和化合物或者目前已知的抗血管生成蛋白質肽和化合物的更有效的變體和片段，特別是安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁的更有效的變體和片段提供了靶物。具體地說，本發(fā)明涉及整聯蛋白亞基α1、α2、α3、αV、β1和β3，發(fā)現它們結合安瑞斯丁、它是IV型膠原NC1結構域的α1鏈。本發(fā)明還涉及整聯蛋白亞基α1、α2和β1，發(fā)現它們結合卡斯達丁，它是IV型膠原NC1結構域的α2鏈。另外，本發(fā)明還涉及整聯蛋白亞基α5、α6、αV、β1和β3，發(fā)現它們結合塔牡斯達丁，它是IV型膠原NC1結構域的α3鏈。其它整聯蛋白和整聯蛋白亞基也可以結合安瑞斯丁，卡斯達丁或塔牡斯達丁，并且這些可以利用這里描述的方法鑒定(參見，例如，下面的實施例12、26和28)。
通過施用安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁，或者施用作為安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁的受體結合上述整聯蛋白亞基的另一種蛋白質、肽或者化合物，可以抑制內皮細胞的血管生成和增殖，或者促進或誘導內皮細胞的程序性死亡。這樣的蛋白質、肽和化合物包括安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的抗體、片段或部分，或者包括特異性結合上述整聯蛋白亞基的安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的那些區(qū)的蛋白質或肽。所謂“特異性結合”指具有配體(例如抗原)與特異性結合蛋白(例如抗體或受體)結合的高親合力和/或高親和性。例如，抗體與該特異性抗原上的表位結合強于相同抗原與任何其它表位的結合，特別是那些在相同樣品中或者與相同樣品相關的分子中作為感興趣的特異性抗原存在的那些。
特異性結合感興趣的分子的抗體能以非常弱的但是仍然可檢測的水平結合其它分子(證明與感興趣的分子結合10％或者更少)。例如通過利用合適的對照物，容易從與感興趣的分子特異性抗體結合辨別這樣弱的結合，或者背景結合。
一般制備特定肽的抗體，制備給定肽的抗體的方法是本領域技術人員公知的(參見，例如，Ausubel，F.M.等(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，1987，至1999年的增補本)第11章，特別是11.4.2-11.11.5頁(“Preparation of MonoclonalAntibodies”)，11.12.1-11.13.4頁(“Preparation of Polyclonal Antisera”)并且最特別是11.14.1-11.15.4頁(“Preparation of AntipeptideAntibodies”))。定制的抗體也可以購自多個供應商，例如購自BerkeleyAntibody Co.，Richmond，California，USA。制備整聯蛋白和整聯蛋白亞基的抗體的方法也是公知的，并且制備這樣的抗體的方法曾由Gallatin，W.M.等(美國專利No.5,817,515)，和Kim，K.J.等(美國專利Nos.5,652,110；5,652,109；5,578,704)描述，它們在這里全文引作參考。
可以重組制備這里描述的可溶形式的整聯蛋白和整聯蛋白亞基。制備可溶性受體和蛋白質的方法是本領域公知的，并且制備可溶形式的整聯蛋白和整聯蛋白受體的方法由Briesewitz，R.等(1993，J.Biol.Chem.2682989-2996)和Kem，A.等(1994，J.Biol.Chem.26922811-22816)描述；并且也由Gallatin，W.M.等(美國專利Nos.5,728,533和5,831,029)和Duong，L.T.等(美國專利No.5,895,754)描述，它們在這里全文引作參考。
本發(fā)明還涉及通過施用模擬作為安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的受體的整聯蛋白亞基的蛋白質、肽或者化合物來增強血管生成和細胞增殖，或者抑制細胞程序性死亡的方法。這樣的蛋白質、肽或者化合物包括選擇的亞基組成的整聯蛋白，它能結合可獲得的安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁、和其生物活性(例如抗生血管)片段、突變體、類似物、同系物及其衍生物、以及其多聚體(例如二聚體)和融合蛋白(這里也稱作嵌合蛋白)，從而防止它們與它們各自的整聯蛋白受體相互作用并且抑制生血管活性的。結合安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁、或者其變體和片段的蛋白質、肽或化合物還包括安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁、或者抗其變體或片段的抗體。這樣的抗體結合這些分子，從而防止它們與它們各自的整聯蛋白受體相互作用并且抑制血管生成活性。
在本發(fā)明中，安瑞斯丁、卡斯達丁和/或塔牡斯達丁、或者它們的片段或突變體可以單獨使用或者結合使用來抑制組織中血管生成、內皮細胞增殖、內皮細胞遷移、或者內皮細胞官形成、或者誘導或促進組織中程序性細胞死亡。安瑞斯丁、卡斯達丁和/或塔牡斯達丁的結合可以進一步結合其它膠原結構域或者NC1鏈，或者其它形式的治療，例如放射療法、化學治療、免疫治療。這些分子降低抗程序性細胞死亡蛋白質FLIP(FLICE-抑制蛋白或FADD-樣白細胞介素-1β轉換酶抑制蛋白)的水平。因此降低FLIP水平的分子抑制血管生成，從而引發(fā)caspase活性并且傳送終止程序性細胞死亡信號。
這里描述的安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁的受體(例如α1β1、α2β1、α3β1、α5β1、α6β1和αVβ3整聯蛋白)和/或它們的亞基(例如α1、α2、α3、α5、α6、αV、β1、β3)可以結合使用來促進或誘導血管生成。安瑞斯丁、卡斯達丁和/或塔牡斯達丁的抗體也可以結合成一個治療方案，安瑞斯丁、卡斯達丁和/或塔牡斯達丁的受體和它們的受體亞基的抗體也可以這樣。
本發(fā)明還包括鑒定以類似于安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁和其抗生血管變體和片段的方式抑制血管生成的抗生血管的蛋白質、肽和化合物的試劑盒。這樣的試劑盒包括整聯蛋白的合適亞基(例如α1、α2、β3等)，和進行下面的實施例中描述的測試之一所必須的這樣的其它成分。使用這樣的試劑盒進行的特別的測試包括下面實施例12和28描述的細胞粘著測試，和下面實施例26描述的競爭增殖測試。例如，鑒定行為方式類似于塔牡斯達丁的蛋白質、肽或化合物的試劑盒包括進行實施例28的細胞粘著測試所必需的那些成分和試劑，例如整聯蛋白亞基α6、αV、β1、β3和IgG(作為對照物)的抗體。該試劑盒可以任選地包括要用實驗化合物和對照物例如IV型膠原或者層粘連蛋白-1包被的96-孔平板(或者可選地預先包被的平板)。所述試劑盒可以任選地包括BSA或者其它封閉劑，和吸附用的細胞(例如HUVEC細胞)，以及用于生長、胰蛋白酶消化、再懸浮和細胞染色的試劑。
一旦鑒定出一種潛在的抗生血管化合物，可以使用另一種試劑盒通過與用來鑒定第一位置中的化合物的相同的整聯蛋白亞基競爭來證實抗生血管活性的降低。在下面的實施例26中描述了進行競爭增殖測試的這樣的試劑盒的模型。所述試劑盒包括增殖測試(下面的實施例中描述的)中使用的細胞和蛋白質形式的合適的整聯蛋白亞基。所述試劑盒也可選地包括測定整聯蛋白亞基干擾實驗化合物的抗增殖活性的作用所必需的染料和其它試劑。
在本發(fā)明中，描述了具有抗生血管性質的蛋白質、其片段、類似物、衍生物、同系物和突變體、以及這些蛋白質、類似物、衍生物、同系物和突變體抑制血管生成介導的增殖性疾病的使用方法。所述蛋白質包括IV型膠原的α鏈的NC1結構域，或者該結構域的部分，尤其是包括IV型膠原的α1、α2、和α3鏈的NC1結構域的單體。這些蛋白質，特別是當單體形式時，在癌癥體內模型中阻止腫瘤生長，并且在幾個體外模型包括內皮管測試中也抑制毛細管形成。
這些蛋白質也包括NC1結構域的連接區(qū)。α1、α2或α3鏈是優(yōu)選的，因為證據表明α4、α5或α6鏈具有降低的或者檢測不到的抗生血管活性。一般情況下，蛋白質的單體形式是優(yōu)選的，因為證據表明六聚體形式也具有極小的或者降低的活性。
更特別地，本發(fā)明描述了一種稱為安瑞斯丁的蛋白質，它是相應于人IV型膠原的NC1結構域的α1鏈的N-末端處的氨基酸的大約230個氨基酸長的蛋白質(Hostikka，S.L.等，1988，J.Biol.Chem.26319488-93)。
如這里所公開的，使用能周質運送的細菌表達質粒(例如pET22b)可以在大腸桿菌中生產人安瑞斯丁，這樣得到可溶性蛋白質。蛋白質表達為C-末端帶有6-組氨酸標記的29kDa融合蛋白。附加的3kDa(超出26kDa)來自多接頭和組氨酸標記序列。使用pcDNA 3.1真核載體在293腎細胞中也產生分泌性的可溶蛋白質安瑞斯丁。這種293-產生的蛋白質沒有純化或檢測標記。
安瑞斯丁處理之后2小時的時候就引起內皮細胞程序性死亡，并且該作用對于內皮細胞是特異性，因為的用高劑量安瑞斯丁處理的腫瘤細胞中沒有發(fā)現顯著的細胞凋亡。有代表性的CD-31染色圖案表明，相對于對照小鼠處理過的脈管系統有所減少。將腫瘤切片染色用于PCNA(增殖細胞核抗原)、纖連蛋白和IV型膠原，并且證明IV型膠原和腫瘤細胞周圍纖連蛋白之間的腫瘤細胞增殖、內含物或者體系結構沒有差異。
大腸桿菌生產的安瑞斯丁以劑量依賴方式抑制bFGF刺激的內皮細胞的增殖，ED50是0.25μg/ml。對于腎癌細胞(786-O)、前列腺癌細胞(PC-3)，或者人前列腺上皮細胞(HPEC)的增殖沒有發(fā)現顯著作用。內靜素在ED50是0.75μg/ml時抑制C-PAE細胞增殖，比安瑞斯丁高三倍，并且不抑制A-498癌細胞。
如上所述，內皮細胞增殖和遷移的特異性抑制表明安瑞斯丁通過細胞表面蛋白質或受體而發(fā)揮功能。基質金屬蛋白酶或者MMP的抑制提示安瑞斯丁在腫瘤生長和轉移中的直接作用，類似于batimastat(BB-94)和marimastat(BB-2516)。
最近的研究推測α1β1和α1β1和α2β1整聯蛋白結合從EHS肉瘤腫瘤分離的IV型膠原(Senger，D.R.等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9413612-13617)。因為安瑞斯丁是IV型膠原α1鏈的片段，對它的評價是通過其介導的α1β1/α2β1整聯蛋白的內皮細胞結合能力。研究證明其功能上阻斷整聯蛋白α1和β1亞基抗體，并且明顯減少HUVEC細胞與安瑞斯丁包被的培養(yǎng)孔的結合(圖10A)。α1抗體抑制內皮細胞對安瑞斯丁包被的平板的附著60％，并且使用β1整聯蛋白抗體抑制70％。這些結果與使用125I標記的安瑞斯丁的結合測試的結果相吻合。安瑞斯丁結合內皮細胞，其高親和性的Kd1值是8.5×10-11，低親和性的Kd2值是4.6×10-8。當用IV型膠原包被平板時，使用α1中和抗體發(fā)現適度抑制30％，用β1抗體抑制40％，用αvβ3抗體抑制15％(圖10B)。安瑞斯丁和IV型膠原包被的平板之間的細胞附著差異可能是由于整個IV膠原分子上潛在的另外的整聯蛋白結合位點，而安瑞斯丁為α1β1整聯蛋白提供了單一的并且特異性的結合位點 (參見圖10A和10B)。
整聯蛋白，特別是α1β1，可以介導安瑞斯丁的腫瘤抑制活性。安瑞斯丁與α1β1的結合可以負調節(jié)VEGF-誘導的內皮細胞的增殖和遷移，正如其它人先前證明的VEGF對α1整聯蛋白的依賴性(Bloch，W.等，1997，J.Cell.Biol.139265-278)?？偠灾@些結果表明安瑞斯丁可以在血管生成級聯中的不同階段發(fā)揮其作用。已經證明抗α1和α2整聯蛋白亞基的抗體能夠體內抑制血管生成(Senger，D.R.等.，WO 99/16465)。安瑞斯丁可以通過直接抑制VEGF和/或bFGF的活性而發(fā)揮功能。大鼠安瑞斯丁的半衰期是36小時提示臨床應用要求的劑量可以比其它蛋白質抑制劑例如內靜素和angiostatin小得多(O′Reilly，M.S.等，1994，Cell 79315-328；O′Reilly，M.S.，等，1997，Cell 88277-285)。
在本發(fā)明中，根據通過抑制內皮細胞的增殖和遷移的測試，或者通過抑制內皮管形成的測試，可以使用IV型膠原的α2鏈的NC1結構域卡斯達丁抑制血管生成?？ㄋ惯_丁抑制內皮細胞增殖并且誘導這些細胞的程序性細胞死亡，而不抑制非內皮細胞的增殖或程序性細胞死亡。抗程序性細胞死亡蛋白質FLIP的負調節(jié)介導卡斯達丁誘導的程序性細胞死亡。CD-31組織學染色證明，處理過的小鼠脈管系統必對照有所減少?？ㄋ惯_丁對內皮細胞增殖和遷移的特異性抑制也證明其抗生血管活性，并且其可以通過細胞表面蛋白質/受體而發(fā)揮功能。Integrins是潛在的候選分子，依據是它們的胞外基質結合能力和介導遷移和增殖等細胞行為的能力。特別地，αVβ3整聯蛋白是一種可能的卡斯達丁受體，由于其在血管生成期間的誘導作用，和它混雜的結合能力。
在本發(fā)明中，利用血管生成和腫瘤生長的體外和體內模型，使用IV型膠原的α3鏈的NC1結構域塔牡斯達丁(Timpl，R.等，1981，Eur.J.Biochem.120203-11；Turner，N.等，1992，J.Clin.Invest.89592-601)調節(jié)血管內皮細胞的增殖和血管的形成。塔牡斯達丁在腫瘤血管生成過程中的不同階段發(fā)揮其作用。塔牡斯達丁對內皮細胞的特異性抑制作用明顯提示它通過細胞表面蛋白或受體而發(fā)揮功能。最近有人報道相應于塔牡斯達丁的C-末端部分的19個氨基酸長的合成肽結合αVβ3整聯蛋白(Shahan，T.A.等，1999，Cancer Res.594584-4590)。下面實施例描述的細胞粘著測試的結果表明塔牡斯達丁結合內皮細胞表面上的αVβ3和α6β1整聯蛋白。當為了抑制其與αVβ3整聯蛋白結合進而結合內皮細胞，使塔牡斯達丁與αVβ3整聯蛋白預溫育時，塔牡斯達丁的抗增殖作用顯著降低(圖22)。這表明塔牡斯達丁的抗增殖作用至少是部分地通過與增殖的內皮細胞的細胞表面上αVβ3整聯蛋白結合而介導。因為血管生成依賴于αVβ3整聯蛋白介導的特異性內皮細胞的粘著作用(Brooks，P.S.等，1994，Cell 791157-1164；Brooks，P.S.等，1994，Science 264569-571)，塔牡斯達丁可以通過破壞增殖的內皮細胞與基質成分(例如玻連蛋白和纖連蛋白)的相互作用而影響抗血管生成。內皮細胞與玻連蛋白和纖連蛋白的正常的相互作用被認為是重要的抗程序性細胞死亡信號(Isik，F.F.等，1998，J.Cell.Physio.175149-155)。塔牡斯達丁誘導生長刺激的內皮細胞的程序性細胞死亡，并且當塔牡斯達丁加給亞匯合的單層，即當細胞指數生長時，該作用最顯著。塔牡斯達丁對于其中內皮細胞被激活的腫瘤脈管系統可以是選擇性的。
所謂”α3(IV)NC1結構域”的片段指哺乳動物IV型膠原的α3鏈的NC1結構域的氨基酸序列的片段或部分。這樣的片段的一個例子是SEQ ID NO10的氨基酸序列的片段。
α3(IV)鏈(塔牡斯達丁)的分布局限于某些基膜，例如GBM、耳蝸的幾種基膜、眼睛基膜例如前晶狀體被膜，Descemet′s膜、卵巢和睪丸基膜(Frojdman，K.等，1998，Differentiation 83125-30)和牙槽毛細管基膜(Kashtan，C.E.，1998，J.Am.Noc.Nephrol.91736-50)。但是，腎小球膜、血管基膜、皮膚表皮基膜和肝的血管基膜中不存在該鏈(Kashtan，C.E.，上文)。在傷口愈合過程中，除α3和α4鏈之外的IV型膠原的α鏈將裝配形成新的毛細管，因為那兩種鏈不是已經存在的即真皮脈管系統的基膜的成分。因為α3(IV)鏈不是正常人皮膚中原始成分，使用塔牡斯達丁處理可能不改變損傷傷口愈合中膠原組裝和血管生成的過程。
α3(IV)鏈在人腎血管基膜以及GBM中表達(Kalluri，R.等，1997，J.Clin.Invest.992470-8)。推測這些“預先存在的”血管在原發(fā)腎腫瘤例如腎細胞癌的過程中涉及。塔牡斯達丁通過破壞由α3(IV)鏈與其它α鏈裝配介導的新血管化而對于原發(fā)性腎癌的治療是有效的。1996年美國診斷出患有腎細胞癌的患者數目大約三萬人(Mulders，P.等，1997，Cancer Res.575189-95)，對轉移病例的預測非常不利。盡管放射治療和化學治療有所發(fā)展，但是接受治療的患者的長期存活率還沒有顯著提高(Mulders，P.等，上文)。由于腎細胞癌沒有效果顯著的治療選擇，因而強調開發(fā)新的治療策略的重要性?？紤]到該事實，針對實體腫瘤新血管化最近在幾種動物模型中證實前途有望的結果(Baillie，C.T.等，1995，Br.J.Can cer 72257-67；Burrows，F.J.等，1994，Pharmacol.Ther.64155-74；Thorpe，P.E.等，1995，Breast CancerRes.Treat.36237-51)。塔牡斯達丁體內抑制腎細胞癌生長的作用證實該分子作為該種腫瘤類型的有效抗生血管治療是有效的。
在本發(fā)明中，塔牡斯達丁以劑量依賴方式體外特異性抑制牛肺動脈細胞的血清刺激的增殖，并且體外對腫瘤細胞系PC-3和786-O的增殖沒有作用。盡管塔牡斯達丁不抑制內皮細胞遷移，但是它體外顯著抑制小鼠主動脈內皮細胞的管形成，并且也誘導內皮細胞程序性死亡。在Matrigel栓測試中，塔牡斯達丁體內抑制新血管化67％，并且在6mg/kg下，在小鼠異種移植模型中抑制人腎細胞癌細胞(786-O)和前列腺癌細胞(PC-3)的腫瘤生長?？偠灾@些結果表明塔牡斯達丁通過抑制生血管過程中各種步驟而抑制新血管形成。
在體內研究中，在Matrigel栓測試中，塔牡斯達丁抑制血管生成并且在小鼠異種移植模型中抑制PC-3腫瘤和786-O腫瘤的生長。塔牡斯達丁抑制大腫瘤的生長的事實是令人鼓舞的，特別是考慮到臨床標準對腫瘤的治療。
因為塔牡斯達丁具有古德帕斯徹綜合癥的病原表位(Butkowski，R.J.等，1987，J.Biol.Chem.2627874-7；Saus，J.等，1988，J.Biol.Chem.26313374-80；Kalluri，R.等，1991，J Biol.Chem.26624018-24)，它是一種特征在于肺出血和/或快速發(fā)病的腎小球性腎炎的自身免疫疾病，因此急性或慢性施用塔牡斯達丁有可能誘發(fā)這種自身免疫疾病。有幾個研究小組試圖作圖或者預測出古德帕斯徹綜合癥自身表位在α3(IV)NC1上的位置，曾報道過N-末端部分，中間部分，和C-末端部分攜帶表位(Kalluri，R.等，1995，J.Am.Soc.Nephrol.61178-85；(Kalluri，R.等，1996，J.Biol.Chem.2719062-8；Levy，J.B.等，1997，J.Am.Soc.Nephrol.81698-1705；Quinones，S.等，1992，J.Biol.Chem 26719780-4；Kefalides，N.A.等，1993，KidneyInt.4394-100；Netzer，K.O.等，1999，J.Biol.Chem.27411267-74)。最近有人報道該自身抗體的反應性只是針對α3(IV)NC1的N-末端，并且與腎存活率有關。使用重組嵌合構建體完成了該項實驗(Hellmark，T.等，1999，Kidney Int.55936-44)。N-末端部分前40個氨基酸鑒定為與疾病相關的病原表位。因此為了去除古德帕斯徹綜合癥病原表位，合成了缺失N-末端53個氨基酸殘基的截短的塔牡斯達丁，該分子在小鼠異種移植模型中表現出對786-O腫瘤生長的抑制作用。另外，該分子不結合來自古德帕斯徹綜合癥嚴重患者的自身抗體。塔牡斯達丁N-53(這里也稱作“Tum-1”)也有效降低內皮細胞的存活力。令人驚奇的是，塔牡斯達丁N-53(Tum-1)的該作用比全長分子高。這些結果證明即使去除N-末端53個氨基酸，塔牡斯達丁的抗生血管區(qū)是保守的。
除了Tum-1之外，也制備了其它塔牡斯達丁缺失突變體，包括Tum-2，Tum-3和Tum-4。這些在下面的實施例35中描述。如上所述，Tum-1包括C-末端191個氨基酸，并且缺失N-末端53個氨基酸。”塔牡斯達丁333”包括塔牡斯達丁的N-末端氨基酸2-125。Tum-3包括C-末端112個氨基酸。Tum-4包括C-末端64個氨基酸，其包括氨基酸185-203(Han等，1997，J.Biol.Chem.27220395-401)。全長塔牡斯達丁的氨基酸54-132區(qū)指定為Tum-5。構建Tum-5的一種延長的變型指定為“塔牡斯達丁-45-132”，以提高Tum-5的表達和溶解性。塔牡斯達丁-45-132由Tum-5和延長的N-末端另外9個氨基酸組成。另外，構建塔牡斯達丁-45-132的突變體指定為“Tum-5-126-C-A”。該突變體由塔牡斯達丁-45-132的序列組成，其中(全長塔牡斯達丁)的126位的半胱氨酸定點誘變?yōu)楸彼?。由Tum-5制備其它缺失突變體，其包括T1和一組部分重疊的肽(T2、T3、T4、T5和T6)。
下面的表1中詳細給出了這些突變體。
表1.重組塔牡斯達丁和塔牡斯達丁的缺失突變體


*Tum-5-126-C-A中的“A”指(全長塔牡斯達丁分子)126位的半胱氨酸殘基定點誘變?yōu)楸彼帷?br> 盡管如這里所示，Tum-4抑制黑素瘤細胞增殖(WM-164細胞)，并且結合αVβ3受體，但是該區(qū)域可能不負責塔牡斯達丁的抗生血管活性。相反，塔牡斯達丁缺失突變體Tum-2，它包含塔牡斯達丁d N-末端一半，表現出了抗生血管功能，但是沒有抗腫瘤細胞活性。因此，看來在某些實驗條件下，這兩種活性可以分開。
如圖34A和35A所示，全長塔牡斯達丁和缺失突變體Tum-1兩者表現出相同的抗生血管活性的事實表明，殘基1-53區(qū)域對于該活性不是必需的。Tum-1與全長塔牡斯達丁相比提高的抗生血管活性可以合理解釋為每微克突變體蛋白質活性分子數增加，這一點與較大全長分子相反。
全長塔牡斯達丁和缺失突變體Tum-1和Tum-2都表現出抗生血管活性(即抑制內皮細胞增殖并且引起它們的程序性細胞死亡)，而Tum-3和Tum-4則不如此的事實提示塔牡斯達丁的抗生血管性質主要位于殘基54-132的區(qū)域。該活性也可以延伸到殘基132之外的一些殘基，但是有一點是清楚的，即Tum-3不包含足夠的抗生血管區(qū)域來表現抗生血管功能。
但是，Tum-4抑制WM-164黑素瘤細胞的生長(如圖33B所示)，而Tum-1和Tum-2則不如此，這表明塔牡斯達丁的抗腫瘤細胞活性不在殘基181-244之中。考慮到Shahan等(1999，Cancer Res.594584-4590)的結果，更可能的是該抗腫瘤細胞活性位于殘基185-203之中。塔牡斯達丁的抗生血管活性和抗腫瘤細胞活性是分開的，這一點是令人驚奇的，因為抗血管生成領域中的大多數研究表明可以通過限制血液供應來抑制腫瘤。
令人感興趣的是，因為缺失突變體Tum-1和Tum-2的抗生血管活性與塔牡斯達丁的抗生血管活性相等，當它包含在全長折疊的塔牡斯達丁分子中時，殘基54-132區(qū)域的抗生血管活性也是有效的，這一點是清楚的。相反，Tum-4具有抗腫瘤活性，而Tum-3(它與Tum-4一樣含有殘基185-203)則沒有。因此，當185-203區(qū)域作為全長折疊的塔牡斯達丁的部分存在時，即使在較大塔牡斯達丁片段之內(例如Tum-3之內)，該區(qū)域也沒有抗腫瘤細胞活性。根據Han等(1997，J.Biol.Chem.27220395-20401)所做的，只有通過截短該分子(如下面的實施例所述)或者通過合成有代表性的肽而暴露該區(qū)域時才實現該活性。
全長塔牡斯達丁的其它片段和突變體也具有抗生血管活性。塔牡斯達丁-45-132特異性抑制內皮細胞的增殖并且引起內皮細胞程序性死亡，而對非內皮細胞沒有顯著作用。即使從母體蛋白質截斷64％，它也具有和244個氨基酸的全長分子一樣的活性。應用Matrigel栓體內測試進一步證明塔牡斯達丁-45-132的抗生血管作用。研究發(fā)現1μg/ml的塔牡斯達丁-45-132抑制PC-3腫瘤，并且在小鼠異種移植模型中降低新血管化作用和微血管密度。通過免疫細胞化學證實生物素化塔牡斯達丁-45-132結合到內皮細胞表面上。根據競爭增殖測試確定的，免疫沉淀實驗表明塔牡斯達丁-45-132結合內皮細胞表面上的αVβ3和β1整聯蛋白。
另外，發(fā)現堿性還原的塔牡斯達丁-45-132和沒有還原的塔牡斯達丁-45-132一樣有效。堿性還原破壞半胱氨酸之間的二硫鍵，該二硫鍵起著保持折疊蛋白分子的構象的作用。相對于沒有還原的分子，堿性還原的塔牡斯達丁-45-132沒有降低活性，這表明半胱氨酸鍵介導的塔牡斯達丁-45-132的構象特征對于其抗生血管活性不是必需的。術語”突變體”，因此也可以指被還原的，或者其中一個或多個半胱氨酸殘基突變?yōu)槠渌被峄蛘咄耆笔У乃邓惯_丁分子的全部或部分。
構建塔牡斯達丁-45-132的突變體，Tum-5-126-C-A，其中(全長分子)殘基126處的半胱氨酸突變?yōu)楸彼?。該突變表現出增強的蛋白質表達，并且該分子具有和塔牡斯達丁-45-132相當的抗生血管功能，而在小鼠異種移植研究中抑制腫瘤生長，其中該突變體實際上抑制腫瘤生長，其程度比塔牡斯達丁-45-132強得多。
抗生血管和抗腫瘤細胞活性都位于古德帕斯徹綜合癥表位區(qū)之外。所謂α3(IV)NC1結構域的“非古德帕斯徹綜合癥片段”指哺乳動物IV型膠原的α3鏈的NC1結構域的氨基酸序列(例如蛋白質、肽或多肽的)片段或部分，其中所述片段不包括古德帕斯徹綜合癥自身表位。最近有人報道所述自身抗體只與α3(IV)NC1的N-末端反應。
抗生血管和抗腫瘤細胞區(qū)都不含有常規(guī)的“RGD”(Arg-Gly-Asp)結合位點，因此兩個區(qū)通過不依賴RGD的機理結合它們的配體。所說的(例如蛋白質、肽或多肽的)片段結合整聯蛋白或整聯蛋白亞基的能力是“不依賴于RGD的”，指該片段能夠結合整聯蛋白或者整聯蛋白亞基，盡管該片段不包含肽序列RGD(Arg-Gly-Asp)。雖然都不含有RGD序列，抗生血管和抗腫瘤細胞區(qū)兩者都仍然結合αVβ3整聯蛋白，并且兩者都結合內皮細胞。
所說的(例如蛋白質、肽或多肽的)片段具有“結合αVβ3整聯蛋白的能力”，指所述片段能結合該整聯蛋白或者其亞基(即αV和/或β3)或者用抗該整聯蛋白或者其亞基的抗體預處理導致該片段與該整聯蛋白和/或其亞基的結合被抑制(例如，如下面實施例12或28提供的方法證明的)。
從這些相似性來看，令人驚奇的是(1)抗生血管區(qū)抑制內皮細胞增殖，而抗腫瘤細胞區(qū)則不然，和(2)抗生血管區(qū)不抑制腫瘤細胞，而抗腫瘤細胞區(qū)則抑制這些細胞。
所說的(例如蛋白質，肽或多肽的)片段“不能抑制腫瘤細胞增殖”或者它“沒有抑制腫瘤細胞增殖的能力”，指所述片段不阻止腫瘤細胞的增殖(例如培養(yǎng)的黑素瘤細胞，例如WM-164細胞)。下面的實施例(例如實施例36、37和38)中給出了試驗方法。同樣，所說的(例如蛋白質、肽或多肽的)片段“具有抑制腫瘤細胞增殖的能力”指所述片段阻止腫瘤細胞的增殖(例如培養(yǎng)的黑素瘤細胞，例如WM-164細胞)。下面的實施例(例如實施例36、37和38)中給出了測驗該能力的方法。
所說的(例如蛋白質、肽或多肽的)片段“不能抑制內皮細胞增殖”或者它“沒有抑制內皮細胞增殖的能力”，指所述片段不阻止內皮細胞的增殖(例如培養(yǎng)的C-PAE細胞)。下面的實施例(例如實施例5、6、7、26、34、36、38和其它)中給出了測驗該能力的方法。
所說的(例如蛋白質、肽或多肽的)片段具有“結合內皮細胞的能力”指所述片段結合內皮細胞(例如C-PAE細胞)。下面的實施例(例如實施例26、28、37)中給出了測驗該能力的方法。
對于一個人來說，為了進一步描繪抗生血管活性或抗腫瘤細胞活性所需要的精確的最短長度，利用下面實施例中描述的方法制備另外的缺失突變體即不困難也不麻煩。這樣的努力是非常有益的，因為仍然表現出期望的活性的盡可能小的分子比同樣活性但含有非必需氨基酸的較大分子以重量為基礎更有效。
塔牡斯達丁特異性地抑制內皮細胞增殖提示其可能通過細胞表面蛋白質/受體發(fā)揮功能。血管生成也取決于整聯蛋白αVβ3介導的特異性內皮細胞粘著作用(Brooks，P.C.等，1994，Cell 791157-64)。細胞附著測試表明塔牡斯達丁通過αVβ3和α6β1整聯蛋白結合內皮細胞。可溶性αVβ3整聯蛋白部分恢復塔牡斯達丁的抗增殖作用。塔牡斯達丁可以破壞增殖的內皮細胞與基質成分的相互作用，從而驅使內皮細胞進行程序性細胞死亡(Re，F.等，1994，.Cell.Biol.127537-46)。基質金屬蛋白酶(MMP′s)作為關鍵酶調節(jié)腫瘤中新血管的形成(Ray，J.M.等，1994，Eur.Respir.J.72062-72)。最近，研究證明MMP-2的抑制劑(PEX)能夠通過抑制血管生成能夠抑制腫瘤生長(Brooks，P.C.等，Cell 92391-400)。塔牡斯達丁可以通過抑制MMPs的活性而發(fā)揮功能。
Petitclerc等(2000，J.Biol.Chem.2758051-61)證明α3(IV)NC1通過αVβ3整聯蛋白結合內皮細胞，但是推測該結合是通過α3(IV)NC1結構域的N-末端中存在的RGD序列。但是，該RGD序列不是NC1結構域的部分，而是由三股螺旋區(qū)衍生，并且包括在Neilson等(1993，J.Biol.Chem.2688402-5)描述的原始克隆中，Petitclerc等使用該克隆在293胚胎腎細胞中重組表達α3(IV)NC1。當利用定點誘變去除該序列時，保留了αVβ3結合位點，說明這是不依賴RGD的結合機理。
Shahan等(1999，Cancer Res.594584-4590)鑒定殘基185-203是αVβ3整聯蛋白的配體，并且推測這種相互作用對于相關的抗腫瘤細胞功能是重要的。下面的實施例37和38說明其他不同的塔牡斯達丁的54-132殘基區(qū)域的不依賴于RGD的αVβ3(不是αVβ5或β1)整聯蛋白結合位點。該第二位點對于抑制腫瘤細胞增殖不是必需的，但是對于抗生血管活性是需要的。Tum-2結合內皮細胞和黑素瘤細胞，但是只抑制內皮細胞的增殖，并且對腫瘤細胞增殖沒有作用。Tum-4含有殘基185-203，結合內皮細胞和黑素瘤細胞，但是只抑制黑素瘤細胞的增殖。對于兩個整聯蛋白結合位點，使用可溶性αVβ3蛋白質的競爭測試足以逆轉抗增殖活性。這提示塔牡斯達丁上這兩種不同的不依賴于RGD的αVβ3結合位點介導兩個分開的抗腫瘤活性，可能是通過不同的αVβ3整聯蛋白介導的機理。這里描述的結果證明αVβ3和α6β1整聯蛋白結合塔牡斯達丁，并且αVβ3結合是不依賴RGD的。
在細胞粘著測試中使用缺失突變體來檢測整聯蛋白結合位點。在塔牡斯達丁的N-末端部分中，有從三股螺旋非膠原部分衍生的RGD序列(氨基酸殘基7-9)。RGD是αVβ3受體的結合位點。但是，缺失該序列的Tum-1仍然結合αVβ3整聯蛋白。因此該結合位點是RGD獨立的，如對185-203區(qū)所示。該區(qū)的抗體(例如抗-Tum-4抗體)，其已被證明部分地結合αVβ3結合位點，不阻止Tum-1結合αVβ3受體，并且Tum-1的抗增殖作用也不受影響。此外，Tum-2(殘基1-132)，其不包含C-末端αVβ3結合位點(殘基185-203)，如實施例38所示，在細胞粘著測試中結合αVβ3并且抑制內皮細胞增殖。當塔牡斯達丁或Tum-2與αVβ3蛋白質溫育來飽和內皮細胞膜上的αVβ3受體時，塔牡斯達丁的抗增殖作用顯著降低(43-74％)。這是出人意料的，考慮到塔牡斯達丁的可溶性αVβ3受體的親和性相對于膜鍵合的αVβ3要弱得多而且不足夠。這里描述的結果證明αVβ3結合位點可能位于氨基酸54-132之內。
αVβ3介導的塔牡斯達丁的抗生血管活性與VEGF正調節(jié)內皮細胞上αVβ3的表達的想法相吻合(Senger等，1996，Am.J.Pathol.149293-305；Suzume等，1998，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.391028-1035)。因為血管生成取決于αVβ3整聯蛋白介導的特異性內皮細胞粘著作用(Brooks等，1994，Science 264569-571；Brooks等，1994，Cell 791157-1183)，通過破壞增殖的內皮細胞與基質成分(例如玻連蛋白和纖連蛋白)之間的相互作用可以介導塔牡斯達丁的抗生血管作用，所述的這種相互作用被認為是重要的抗程序性細胞死亡信號(36)。
第二個不依賴于RGD的位點在氨基酸水平上與185-203位點沒有明顯同源性，但是兩者都結合內皮細胞和黑素瘤細胞上的αVβ3整聯蛋白，沒有發(fā)現內皮細胞增殖的抑制。
塔牡斯達丁可體內和體外抑制血管生成，導致腫瘤進程的抑制。為了對患者應用該策略，也必須考慮全身施用可能的毒性或副作用。
塔牡斯達丁分布有限并且在真皮基膜中幾乎不存在的實事提示塔牡斯達丁治療帶來副作用的可能性極小。
而且，有限器官(例如腎臟)的血管基膜中塔牡斯達丁的存在提示其在有限器官定向腫瘤中潛在的獨特優(yōu)點。最后，期望研發(fā)應用基因轉移方法(Kashihara，N.等，1997，Exp.Nephrol.5126-31；Maeshima，Y等，1996，J.Am.Soc.Nephrol.72219-29；Maeshima，T.等，1998，J.Clin.Invest.1012589-97)在腫瘤血管中體內表達塔牡斯達丁基因的可替代的策略。
α3(IV)鏈的分布局限于選擇的器官的基膜，因此考慮到該分子可能通過抑制α3鏈組裝的機理，塔牡斯達丁可能較小有害。此外，在腎臟血管基膜中發(fā)現α3(IV)鏈(Kalluri，R.等，1997，J.Clin.Invest.992470-8)，并且想必這些血管在原發(fā)性腎腫瘤(例如腎細胞癌)的發(fā)展中涉及。因此，塔牡斯達丁通過破壞α3(IV)鏈和其它α鏈的組裝在這樣的腫瘤的治療中是有效的。
如這里使用的，術語“血管生成”指組織或器官中新血管的產生，并且涉及內皮細胞增殖。在正常生理條件下，只有在非常特定有限情況下人或動物才經歷血管生成。例如，一般在傷口愈合、胎兒和胚胎發(fā)育、luteum體、子宮內膜和胎盤的形成中才觀察有血管生成。術語“內皮”指構成漿液腔、淋巴管和血管的平上皮細胞的薄層。因此“抗生血管活性”指一種成分抑制血管生長的能力。血管生長是一系列復雜作用，并且包括位于各內皮細胞之下的基膜的局部擊穿、那些細胞的增殖、細胞遷移到未來血管的位置、細胞的再組織化形成新血管膜、內皮細胞增殖停止、以及摻入外膜細胞和支持新血管壁的其它細胞。因此這里使用的“抗生血管活性”包括這些階段的任何或所有階段的中斷，結果是新血管的形成被抑制。
抗生血管活性可以包括內皮抑制活性，這是指一種成分一般性地抑制血管生成的能力，例如，在成纖維細胞生長因子、血管生成相關因子或者其它已知生長因子的存在下抑制培養(yǎng)基中牛毛細管內皮細胞的生長或遷移。“生長因子”是一種刺激細胞的生長、再生或合成活性的成分。“血管生成相關因子”是抑制或促進血管生成的因子。血管生成相關因子的一個例子是血管生成生長因子，例如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，它是一種血管生成促進劑。血管生成相關因子的另一個例子是血管生成抑制因子，例如制管張素(參見例如美國專利No.5,801,012，美國專利No.5 837 682，美國專利No.5 733876，美國專利No.5 776 704，美國專利No.5 639 725，美國專利No.5792 845，WO 96/35774，WO 95/29242，WO 96/41194，WO 97/23500)或者內靜素(參見例如，WO97/15666)。
“基本上相同的生物活性”或者“基本上相同或優(yōu)勢的生物活性”是指一種成分具有抗生血管活性，并且根據標準測試其行為類似于安瑞斯丁，卡斯達丁和塔牡斯達丁，“標準測試”包括但不限于分子生物領域用來評價抗生血管活性、細胞周期停止和程序性細胞死亡的那些方法。這樣的測試包括但不限于內皮細胞增殖、內皮細胞遷移、細胞周期分析和內皮細胞管形成的測試、程序性細胞死亡檢測(例如通過程序性死亡細胞的形態(tài)學或者膜聯蛋白V-FITC測試尿囊絨膜(CAM)、裸鼠中腎癌腫瘤生長的抑制。下面的實施例中提供了這樣的測試。
“Arresten”這里也稱作“Arrestin”，意指包括安瑞斯丁序列的氨基酸序列的片段、突變體、同系物、類似物和等位變體，以及來自其它哺乳動物的安瑞斯丁和安瑞斯丁氨基酸序列的片段、突變體、同系物、類似物和等位變體。
這里使用的“卡斯達丁”，意指包括卡斯達丁序列的氨基酸序列的片段、突變體、同系物、類似物和等位變體，以及來自其它哺乳動物的卡斯達丁和卡斯達丁氨基酸序列的片段、突變體、同系物、類似物和等位變體。
這里使用的“塔牡斯達丁”，意指包括塔牡斯達丁序列的氨基酸序列的片段、突變體、同系物、類似物和等位變體，以及來自其它哺乳動物的塔牡斯達丁和塔牡斯達丁氨基酸序列的片段、突變體、同系物、類似物和等位變體。
要明白本發(fā)明涉及包括具有內皮抑制活性(例如，一種成分一般性地抑制血管生成的能力，以及在成纖維細胞生長因子、血管生成相關因子或者其它已知生長因子的存在下抑制培養(yǎng)基中牛毛細管內皮細胞的生長或遷移的能力)的安瑞斯丁，卡斯達丁或塔牡斯達丁的所有的衍生物。本發(fā)明包括全安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁蛋白質、這些蛋白質的衍生物和這些蛋白質的生物活性片段。這包括具有安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁活性并且具有氨基酸取代或者具有與氨基酸功能基團連接的糖基或者其它分子的蛋白質。
本發(fā)明還描述了安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁的片段、突變體、類似物和類似物。安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的“片段”是比安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁分子短的至少包括安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁肽的25個連續(xù)的氨基酸的任何氨基酸序列。這樣的分子可以包括也可以不包括從克隆過程中衍生的另外的氨基酸，例如相應于全長或部分連接序列的氨基酸殘基或氨基酸序列。本發(fā)明包括這些變體，無論有還是沒有另外的氨基酸殘基，必須具有和天然或者全長參照多肽分子基本上相同的生物活性。
根據標準實驗測定的，一個具有和全長塔牡斯達丁相同的抗生血管活性的片段被指定為“塔牡斯達丁N-53”。塔牡斯達丁N-53包括其中缺失N-末端53個氨基酸的塔牡斯達丁分子。研究發(fā)現這里描述的其它突變體片段具有非常高的抗生血管活性水平，如這里描述的測試所證明的。“塔牡斯達丁333”、“塔牡斯達丁334”、“12kDa安瑞斯丁片段”、“8kDa安瑞斯丁片段”和“10kDa卡斯達丁片段”具有的ED50值分別是75ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、50ng/ml和80ng/ml。相反，全長安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁具有的ED50值分別是400ng/ml、400ng/ml和550ng/ml。塔牡斯達丁333包括SEQ ID NO10的氨基酸2至125，而塔牡斯達丁334包括SEQ ID NO10的氨基酸126-245。
安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的“突變體”是指相對于等參考物安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁肽的氨基酸序列的氨基酸序列中有任意變化的多肽。這樣的變化可以自發(fā)產生或者通過人為操作，通過化學能量(例如，X-射線)，或者通過其它形式的化學誘變，或者通過遺傳工程而產生，或是配對或者遺傳信息變化的其它形式的結果。突變包括例如堿基變化、缺失、插入、反轉、易位或者重疊。安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的突變形式可以表現出相對于等參照物安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁肽的提高的或降低的抗生血管活性，并且這樣的突變體可以包括也可以不包括從克隆過程中衍生的另外的氨基酸，例如，相應于全長或部分連接序列的氨基酸殘基或氨基酸序列。
通過PCR克隆可以產生本發(fā)明的抗生血管蛋白的突變體/片段。用這種方法產生指定為“塔牡斯達丁333”和“塔牡斯達丁334”的片段，并且具有比全長塔牡斯達丁優(yōu)越的抗生血管活性，如下面的實施例23所述，并且如圖30和31所示。要制備這樣的片段，以這樣一種方式從已知序列設計PCR引物，使得每一組引物都從蛋白質整體擴增已知的亞序列。然后將這些亞序列克隆到合適的表達載體中，例如pET22b載體，并且如下面測試中所述對所表達的蛋白質測定其抗生血管活性。
通過假單孢桿菌彈性蛋白酶消化也可以產生本發(fā)明的抗生血管蛋白的突變體/片段，如Mariyama，M.等(1992，J.Biol.Chem.2671253-8)，和下面的實施例33所述。使用該方法來制備12kDa和8kDa安瑞斯丁突變體和10kDa卡斯達丁突變體，所有這三種都具有比原來全長蛋白質更高的抗生血管活性。
安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的“類似物”指與全安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁分子或者其片段或等位變體基本上相似，并且基本上具有相同的或優(yōu)越的生物活性的非天然分子。這樣的類似物指包括具有生物活性的安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的衍生物(例如如上定義的化學衍生物)、及其片段、突變體、類似物和等位變體，這些衍生物具有與沒有修飾的安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁肽、片段、突變體、類似物或等位變體功能相似的激動劑或拮抗劑作用。
安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的“等位變體”指包含相對于安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁肽的參照天然多肽序列發(fā)生改變的多肽序列。編碼安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁多肽的多核苷酸的“等位基因”指包含相對于編碼安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁參照多肽多核苷酸序列序列變體的多核苷酸，其中編碼安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁多肽的多核苷酸的等位基因編碼安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁多肽的等位形式。
給定的多肽可以是安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的片段、突變體、類似物或等位變體，也可以是它們中的兩種或多種，例如，一種多肽可以是安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁多肽的類似物和突變體。例如，實驗室可以制備安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁分子的截短的分子(例如安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的片段)。如果通過本領域公知的方法誘變這個片段，則可產生安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的片段和突變體的分子。在另一個實施例中，可以制備一種突變體，后來發(fā)現它是以一些哺乳動物個體中的安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的等位形式存在。這樣一種突變體安瑞斯丁，卡斯達丁或塔牡斯達丁分子因此是突變體和等位變體。本發(fā)明包括片段、突變體、等位變體和類似物的這樣的組合。
例如，下面實施例23中描述的大腸桿菌表達克隆方法制備的塔牡斯達丁是一種單體。它也是一種融合蛋白或嵌合蛋白，因為大腸桿菌表達克隆方法給表達的蛋白質加上天然蛋白質中不存在的多接頭和組氨酸標記。在實施例23中描述的塔牡斯達丁片段“塔牡斯達丁N-53”是全長塔牡斯達丁蛋白質的片段和缺失突變體，并且當使用大腸桿菌表達克隆的方法制備時，也對其加上另外的序列，因此它是全長塔牡斯達丁蛋白質的融合或嵌合突變體片段。當一起結合到例如二聚體、三聚體等中時，該塔牡斯達丁N-53亞基將產生塔牡斯達丁蛋白質的嵌合突變體片段的多聚體融合體。
本發(fā)明包括具有和安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁基本上相同的氨基酸序列的蛋白質，或者和編碼安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的多核苷酸基本上相同的核酸序列的多核苷酸?！盎旧舷嗤男蛄小敝负蛥⒄招蛄芯哂兄辽偌s70％序列同一性的核酸或多肽，例如另一種核酸或多肽，一般與參照序列具有至少大約80％序列同一性，優(yōu)選至少大約90％序列同一性，更優(yōu)選至少大約95％同一性，并且最優(yōu)選與參照序列具有至少大約97％序列同一性。序列比較的長度一般是至少75個核苷酸堿基或者25個氨基酸，更優(yōu)選至少150核苷酸堿基或者50個氨基酸，并且最優(yōu)選243-264個核苷酸堿基或者81-88個氨基酸。這里使用的“多肽”指氨基酸分子鏈而不是指產物的具體長度。因此，多肽定義包括肽、寡肽和蛋白質。該術語也包括進行了糖基化、乙?；?、磷酸化等表達后修飾的多肽。
這里使用的“序列同一性”指兩個聚合體分子之間亞基序列相似性，例如兩個多核苷酸或者多肽之間。當相同的單體亞基占據兩個分子中同一個亞基位置時，例如，如果絲氨酸占據兩個肽中每一個肽的一個位置的話，則它們在這個位置處是相同的。兩個序列之間的同一性是匹配數目或相同位置數目的直接函數，例如，如果兩個肽或化合物序列中一半位置(例如長度是10個亞基的聚合物中5個位置)是相同的，則這兩個序列是50％相同的；如果位置的90％，例如，10個中9個匹配，則這兩個序列具有90％序列同一性。舉例來說，氨基酸序列R2R5R7R10R6R3和R9R8R1R10R6R36個位置中三個是相同的，因此具有50％序列同一性，而序列R2R5R7R10R6R3和R8R1R10R6R35個位置中3個是相同的，因此具有60％序列同一性。兩個序列之間的同一性是匹配數目或相同位置數目的直接函數。因此，如果一個特定肽中缺失參照序列的一部分，則為了計算序列同一性的目的而不計該缺失的部分，例如，R2R5R7R10R6R3和R2R5R7R10R36個位置中5個是相同的，因此具有83.3％序列同一性。
經常利用序列分析軟件來測定同一性，例如BLASTN或者BLASTP(下載網址是http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。通過BLASTN(對于核苷酸序列)比較兩個序列的默認參數(例如，“Blast”-ing兩個序列彼此之間，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html)是配對＝1，錯配＝-2，開放缺口＝5，延伸缺口＝2。當對于蛋白質序列使用BLASTP時，默認參數是配對＝0，錯配＝0，開放缺口＝11，延伸缺口＝1。
當兩個序列具有“序列同源性”時，意思是兩個序列彼此之間不同之處只是在于保守取代。對于多肽序列，這樣的保守取代包括在序列的給定位置的一個氨基酸被取代為相同類型的另外一個氨基酸(例如具有相同的疏水性、電荷、pK或者其它構象或者化學性質特性的氨基酸，例如頡氨酸取代亮氨酸、精氨酸取代賴氨酸)，或者通過不將多肽的構象或折疊改變至破壞該多肽的生物活性的程度的序列的一些位置處一處或多處非保守型氨基酸取代、缺失或插入?！氨Ｊ厝〈钡睦影ㄒ粋€非極性(疏水性)殘基例如異亮氨酸、頡氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸被取代為另一個氨基酸；一個極性(親水性)殘基被取代為另一個氨基酸，例如精氨酸和賴氨酸之間、谷氨酰胺和天冬酰胺之間、蘇氨酸和絲氨酸之間；一個堿性殘基(例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸)被取代為另一個氨基酸；或者一個酸性殘基(例如天冬氨酸或谷氨酸)被取代為另一個氨基酸；或者使用化學衍生的殘基置換非衍生殘基；條件是所述多肽表現出必不可少的生物活性。具有序列同源性的兩個序列可以稱為“序列同系物”。
本發(fā)明包括這里描述的蛋白質和肽的突變體，其中所述突變體基本上不改變蛋白質或肽的活性，也就是說突變是有效“沉默”突變。這里給出一種這樣的突變體，Tum-5-126-C-A，其中(全長塔牡斯達丁分子的)126位殘基半胱氨酸從半胱氨酸突變?yōu)楸彼?。這種突變防止在該殘基處形成二硫鍵，但是Tum-5-126-C-A仍保持其母體分子塔牡斯達丁-45-132的全部活性。
一般使用序列分析軟件來測定多肽的同源性(例如，SequenceAnalysis Software Package of the Genetics Computer Group，Universityof Wisconsin Bioteclmology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705)。蛋白質分析軟件通過對各種取代，缺失和其它修飾對比同源性程度來匹配相似序列。保守型取代一般包括下面組中的取代甘氨酸、丙氨酸，頡氨酸、異亮氨酸、亮氨酸，天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺，絲氨酸、蘇氨酸，賴氨酸、精氨酸，和苯丙氨酸、酪氨酸。
本發(fā)明還包括安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁的化學衍生物?！盎瘜W衍生物”指通過功能側基的反應而具有一個或多個化學衍生殘基的多肽。這樣衍生的殘基包括，例如，其中自由氨基被衍生化生成胺鹽酸鹽、對甲苯磺?；?、芐酯基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲?；哪切┓肿樱杂婶然梢员谎苌甥}、甲酯和乙酯或者其它類型的酯或者酰肼，自由羥基可以被衍生化生成O-?；騉-烷基衍生物，組氨酸的咪唑氮原子可以被衍生化生成N-im芐基組氨酸(N-imbenzylhistidine)。作為化學衍生物也包括那些肽，其包含一個或多個20個標準氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物。例如4-羥基脯氨酸可以被取代為脯氨酸；3-甲基組氨酸可以被取代為組氨酸；高絲氨酸可以被取代為絲氨酸；和鳥氨酸可以被取代為賴氨酸。
本發(fā)明還包括包含抗生血管蛋白質、它們的片段、突變體、同系物、類似物和等位變體(例如塔牡斯達丁和卡斯達丁、或者T1和T4)的融合蛋白和嵌合蛋白。作為重組表達和克隆方法的結果可以制備融合蛋白或嵌合蛋白，例如，當在大腸桿菌中生產時，可以制備包括另外的氨基酸或相應于全長或部分連接序列(例如本發(fā)明的安瑞斯丁的氨基酸序列)的蛋白質(參見實施例2，下文)，包括給蛋白質添加另外的載體序列，包括組氨酸標記。如這里使用的，術語“融合或嵌合蛋白”意指包括該類型變化為原來的蛋白質序列。對卡斯達丁和塔牡斯達丁蛋白質也進行了類似改變(分別見實施例14和23)。融合或嵌合蛋白可以由單一蛋白質的多聚體(例如抗生血管蛋白質的重復單元)組成，融合和嵌合蛋白也可以由幾種蛋白質例如幾種抗生血管蛋白質制成。融合或嵌合蛋白可以包括兩種或多種已知抗生血管蛋白質的結合(例如，制管張素和內靜素，或者制管張素和內靜素的生物活性片段)，或者與定向試劑結合的抗生血管蛋白質(例如，內靜素與表皮生長因子(EGF)或RGD肽)，或者與免疫球蛋白分子結合的抗生血管蛋白質(例如，內靜素和IgG，特別是與Fc部分去除的IgG)。融合和嵌合蛋白也可以包括抗生血管蛋白質、它們的片段、突變體、同系物、類似物、等位變體以及其它抗生血管蛋白質，例如，內靜素或者angiostatin。其它抗生血管蛋白質可以包括restin和apomigren；(WO 99/29856，其中內容在這里引作參考)和內靜素的片段(WO99/29855，其中內容在這里引作參考)。這里使用的術語“融合蛋白”或者“嵌合蛋白”也可以包括另外的成分，例如用于送遞化學治療物質，其中編碼該化學治療物質的多核苷酸與編碼抗生血管蛋白的多核苷酸連接。融合或嵌合蛋白也可以包括抗生血管蛋白的多聚體，例如二聚體或三聚體。這樣的融合或嵌合蛋白可以通過翻譯后修飾連接在一起(例如化學連接)，或者可以通過重組制備全融合蛋白。
本發(fā)明也包括包含安瑞斯丁、卡斯達丁、塔牡斯達丁、它們的片段、突變體、同系物、類似物和等位變體的多聚體蛋白質?！岸嗑垠w”指包括亞基蛋白質的一個或多個拷貝的蛋白質。所述亞基蛋白質可以是本發(fā)明蛋白質的一種，例如，安瑞斯丁重復兩次或多次、或者片段、突變體、同系物、類似物或者等位變體，例如塔牡斯達丁突變體或片段，例如塔牡斯達丁333，重復兩次或多次。這樣一種多聚體可以是融合或嵌合蛋白，例如重復的塔牡斯達丁突變體可以與多接頭序列和/或一種或多種抗生血管肽結合，其可以以單一拷貝存在，也可以串連重復，例如，一種蛋白質可以在總蛋白質中包括兩個或多個多聚體。
本發(fā)明還包括含有一種或多種分離的編碼安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的多核苷酸的組合物，以及包含這樣一種多核苷酸的載體和宿主細胞，和制備安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁、它們的片段、突變體、同系物、類似物和等位變體的方法。這里使用的術語“載體”指其中可以插入或克隆核酸片段的載體，其將核酸片段的功能轉移到宿主細胞中。這樣一種載體也可以實現轉移的核酸片段的復制和/或表達。載體的例子包括從例如質粒、噬菌體或者哺乳動物、植物或昆蟲病毒衍生的核酸分子，或者非病毒載體例如配體一核酸偶聯物、脂質體或者脂質-核酸復合體。要轉移的核酸分子通過可操作地連接于表達控制序列，形成能表達所轉移的核酸的表達載體。這樣的核酸轉移一般稱為“轉化”，并且指在宿主細胞中插入外源多核苷酸，與插入所用方法無關。例如，包括直接吸收、轉導或者F介導。所述異源多核苷酸可以保持為沒有整合的載體(例如質粒)，也可以整合到宿主基因組中?！安僮鬟B接”指其中描述的成分是允許它們以它們想要的方式發(fā)揮功能的關系的情況，例如，一個控制序列“操作連接”于編碼序列是以這樣一種方式連接，使得在與控制序列相容的條件下實現編碼序列的表達?！熬幋a序列”是當置于合適的調節(jié)序列的控制下(例如操作連接于合適的調節(jié)序列)時轉錄成mRNA并且翻譯成多肽的多核苷酸序列。通過5′-末端翻譯起始密碼子和3′-末端翻譯終止密碼子確定編碼序列的邊界。這樣的邊界可以是天然存在的，或者通過本領域公知的方法導入或者加給多核苷酸序列。編碼序列可以包括但不限于mRNA、cDNA和重組多核苷酸序列。
可以選擇其中克隆多核苷酸的載體，因為其在原核生物中發(fā)揮功能，或者，可以選擇它在真核生物中有功能。能克隆編碼安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁蛋白質的多核苷酸并且能從所述多核苷酸表達那些蛋白質的載體的兩個例子是pET22b和pET28(a)載體(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)和修飾的pPICZαA載體(InVitrogen，San Diego，California，USA)，它們分別可以在細菌和酵母中表達所述蛋白質。參見例如，WO 99/29878，其全文引作參考。
一旦多核苷酸克隆到合適的載體中，其可以轉化到合適的宿主細胞中?！八拗骷毎敝敢呀浕蛘吣軌虮挥脕斫邮苁褂幂d體轉移的核酸的細胞。
宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞、哺乳動物、植物、或者昆蟲細胞，并且可以作為單細胞存在，或者作為聚集體存在，例如，作為培養(yǎng)物，或者在組織培養(yǎng)物中，或者在組織或器官中。宿主細胞也可以來自多細胞生物體，例如哺乳動物的正?；蚣膊〗M織。如這里使用的宿主細胞，意在不僅包括用核酸轉化的原初細胞，而且也包括仍然包含該核酸的這樣的細胞的后代。
在一個實施方案中，分離的編碼抗生血管蛋白質的多核苷酸另外還包括編碼多肽的多核苷酸接頭。這樣的接頭對于本領域技術人員是公知的，例如所述接頭可以包括至少一個其他的編碼至少一個其他氨基酸的密碼子。典型地，接頭包括1至約20或者30個氨基酸。多核苷酸接頭象編碼抗生血管蛋白質的多核苷酸一樣被翻譯，會導致表達的抗生血管蛋白的氨基末端或羧基末端攜帶至少一個附加的氨基酸殘基。重要的是，所述附加的氨基酸(或者多個氨基酸)，不危害所述抗生血管蛋白的活性。
將選擇的多核苷酸插入載體之后，載體轉化到合適的原核菌株中并且在適合產生生物活性抗生血管蛋白的合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)(例如保持)菌株，從而產生生物活性抗生血管蛋白，或者其突變體、衍生物、片段或者融合蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明包括將編碼抗生血管蛋白的多核苷酸克隆到載體pET22b、pET17b或pET28a中，然后將其轉化到細菌中。所述細菌宿主菌株然后表達所述抗生血管蛋白。一般情況下，每升培養(yǎng)液可以生產約10-20毫克或更多的抗生血管蛋白。
在本發(fā)明另一個實施方案中，真核載體包括修飾的酵母載體。一個方法是使用其中包含多個克隆位點的pPICzα質粒。多克隆位點已經插入一個His標記基元。另外，可以修飾載體加入一個NdeI位點，或者其它合適的限制性位點。這樣的位點是本領域技術人員公知的。該實施方案產生的抗生血管蛋白包括一個或多個組氨酸，一般是大約5-20個組氨酸的組氨酸標記基元(His.tag)。該標記必須不干擾所述蛋白質的抗生血管性質。
例如，產生安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的一個方法是分別擴增SEQ ID NO1、SEQ ID NO5或SEQ ID NO9的多核苷酸，并且將其克隆到表達載體中(例如pET22b、pET28(a)、pPICZαA，或者一些其它表達載體)，將包含該多核苷酸的載體轉化到能表達該多核苷酸編碼的多肽的宿主細胞中，在適合表達該蛋白質的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)轉化的宿主細胞，然后從培養(yǎng)物中提取并純化所述蛋白質。產生一般的抗生血管蛋白特別是安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁的實例方法在下面的實施例中提供。
安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁蛋白質也可以表達為轉基因動物的產品，例如作為轉基因牛、山羊、綿羊或豬的奶的成分，或者作為轉基因植物的產品，例如，與谷物中淀粉分子結合或連接。這些方法也可以用SEQ ID NO1、SEQ ID NO5或SEQ ID NO9的亞序列使用，產生SEQ ID NO2、SEQ ID NO6或SEQ ID NO10的蛋白質的一部分。使用這些方法可以制備片段塔牡斯達丁-333、塔牡斯達丁-334、塔牡斯達丁-N53、Tum-2、Tum-3、Tum-4、塔牡斯達丁-45-132和肽T1、T2、T3、T4、T5和T6。
也可以通過已知的常規(guī)化學合成方法制備安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁。通過合成手段構建本發(fā)明蛋白質的方法是本領域技術人員公知的。合成構建的安瑞斯丁，卡斯達丁或者塔牡斯達丁蛋白質序列，由于和重組產生的安瑞斯丁，卡斯達丁或塔牡斯達丁具有共同的一級、二級或三級結構和/或構象特征，所以可以具有相同的生物學性質，包括生物活性。因此，在篩選治療用化合物中和在開發(fā)抗體的免疫學方法中，合成構建的安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁蛋白質序列可以用作生物活性或免疫學替代物，例如替代重組產生的純化的安瑞斯丁、卡斯達丁或者塔牡斯達丁蛋白質。
如標準實驗測定的，安瑞斯丁、卡斯達丁和塔牡斯達丁蛋白質用于抑制血管生成，并且在下面的實施例中提供。安瑞斯丁、卡斯達丁或者塔牡斯達丁不抑制其它類型細胞(例如非內皮細胞)的生長。
可以在分離的DNA或cDNA文庫之外克隆編碼安瑞斯丁、卡斯達丁或者塔牡斯達丁的多核苷酸。核酸和多肽，這里稱為是“分離的”，指核酸或多肽基本上不含有(即獨立于)它們的來源物(例如存在于核酸的混合物中或者細胞)中的物質，其可以進行進一步處理?！胺蛛x的”核酸或多肽包括通過這里描述的方法、類似方法、或者其它合適的方法獲得的核酸或多肽，包括基本上純的核酸或多肽、通過化學合成核酸或多肽、通過化學和生物方法結合產生的核酸或多肽和重組產生的分離的核酸或多肽。因此，分離的多肽相對來說沒有正常情況下與其相關的其它蛋白質、碳水化合物、脂質和其它細胞成分。分離的核酸不與衍生該核酸的生物體的天然存在的基因組中鄰接的兩個核酸鄰接(即共價連接)。因此，該術語包括例如插入到載體(例如自主復制病毒或質粒)中的核酸，或者作為獨立于其它核酸(例如化學方法或者限制性內切酶處理產生的核酸片段)的分開的分子存在的核酸。
本發(fā)明的多核苷酸和蛋白質也可以用來設計分離其它抗生血管蛋白的探針。特別的方法描述于Jacobs等的美國專利No.5,837,490，其內容在這里全文引作參考。寡核苷酸探針的設計應當參照下面的這些參數(a)如果有的話，應該設計到具有最少不確定堿基(“N′s”)的序列區(qū)域，和(b)應該設計到具有大約80℃的Tm(假設對于每一個A或T是2℃，對于每一個G或C是4℃)。
應用標記寡核苷酸的一般使用技術優(yōu)選地用g-32p-ATP(比活性6000Ci/mmole)和T4多核苷酸激酶標記寡核苷酸。也可以利用其它標記技術。沒有摻入的標記應該優(yōu)選通過凝膠過濾層析或者其它成熟方法去除，插入到探針中的放射量應該通過在閃爍計數器中定量測定。優(yōu)選地，得到的探針的比活性應該是大約4×106dpm/pmole。含有全長克隆庫的細菌培養(yǎng)液應該融化，并且使用100微升原種接種含有25毫升無菌L-液體培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)燒瓶，所述液體培養(yǎng)基含有100微克/毫升的氨芐青霉素。培養(yǎng)物應該優(yōu)選在37℃下生長至飽和，并且所述飽和培養(yǎng)物應該優(yōu)選在新鮮L-液體培養(yǎng)基中稀釋。這些稀釋物的等份應該優(yōu)選制成平板，以確定當在37℃下培養(yǎng)過夜時，在150mm培養(yǎng)皿(裝有100微克/毫升的氨芐青霉素和1.5％瓊脂的L-培養(yǎng)基的固體細菌培養(yǎng)基)上得到大約5000個清楚的并且分離很好的菌落的稀釋度和體積。也可以利用已知的并且菌落分離很好的其它方法。
然后應用標準菌落雜交方法將菌落轉移給硝基纖維素過濾器并且溶胞、變性和烘干。高度嚴謹的條件是至少象下面這樣嚴格的那些條件，例如，65℃下1×SSC，或者42℃下1×SSC和50％甲酰胺。中等嚴謹性條件是至少象下面這樣嚴格的那些條件65℃下4×SSC，或者42℃下4×SSC和50％甲酰胺。低嚴謹性條件是至少象下面這樣嚴格的那些條件50℃下4×SSC，或者40℃下6×SSC和50％甲酰胺。
然后在溫和攪動下，在含有0.5％SDS、100μg/ml的酵母RNA和10mM EDTA(大約10mL/150mm過濾器)的6×SSC(20×原種是175.3g NaCl/升、88.2g檸檬酸鈉/升，用氫氧化鈉調節(jié)到pH7.0)中65℃將過濾器溫育1小時，優(yōu)選地，然后把探針加入濃度大于或等于1×106dpm/mL的雜交混合物。然后該過濾器在65℃溫和攪動下優(yōu)選溫育過夜。然后優(yōu)選地，該過濾器用500mL的2×SSC/0.5％SDS在室溫下無攪動洗滌，優(yōu)選地接著用500mL的2×SSC/0.1％SDS在室溫下溫和搖動下洗滌15分鐘。第三次洗滌可選用0.1×SSC/0.5％SDS在65℃下洗滌30分鐘至1小時。然后優(yōu)選地干燥過濾器并且放射自顯影足夠時間，來觀察X-射線膜上的正克隆。也可以利用其它已知的雜交方法。然后收集正克隆，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用標準方法分離質粒DNA。然后通過限制性分析、雜交分析或者DNA測序來確認這些克隆。
雜交的嚴謹條件指允許第一核酸序列與第二核酸序列雜交的溫度和緩沖液成分條件，其中這些條件決定彼此雜交的那些序列之間的同一性程度。因此，“高嚴謹性條件”是其中只有彼此非常類似的核酸序列將雜交的那些條件。如果它們在中等嚴謹性條件下雜交，則序列可能具有較小相似性。在低嚴謹性條件下雜交，兩個要雜交的序列仍然需要較小相似性。通過將雜交條件從沒有雜交發(fā)生的嚴謹性水平變?yōu)榈谝淮伟l(fā)現雜交的水平，可以確定給定序列將與大多數與之類似的那些序列雜交的條件。決定特定雜交的嚴謹性的精確條件不僅包括離子強度、溫度和去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺)的濃度，而且還包括這樣的因素例如核酸序列的長度、它們的堿基成分、兩個序列之間錯配堿基對的百分比和其它不一樣序列中序列的亞型(例如重復單元的小片段)的出現率。洗滌是這樣的步驟，其中設置條件，以確定彼此雜交序列之間相似性的最小程度。一般情況下，從只有同源雜交發(fā)生的最低溫度，兩個序列之間1％的錯配會導致任何選擇的SSC濃度融解溫度(Tm)降低1℃。一般情況下，SSC濃度加倍會導致Tm升高大約17℃。利用這些指標，根據尋找的錯配的水平憑經驗可以確定洗滌溫度。Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel，F.M.等，編著，John Wiley & Sons，Inc.，1995，增刊更新)第2.10.1至2.10.16頁，和6.3.1至6.3.6頁解釋了雜交和洗滌條件。
高嚴謹性條件可以利用下面任一項的條件雜交(1)1×SSC(10×SSC＝3M NaCl，0.3M檸檬酸三鈉.2H2O(88g/升)，用1M HCl調節(jié)pH至7.0)，1％SDS(十二烷基硫酸鈉)，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，65℃，(2)1×SSC，50％甲酰胺，1％SDS，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，42℃，(3)1％牛血清白蛋白(級分V)，1mM Na2-EDTA，0.5M NaHPO4(pH7.2)(1M NaHPO4＝134g Na2HPO4.7H2O，4ml85％H3PO4/升)，7％SDS，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，65℃，(4)50％甲酰胺，5×SSC，0.02M Tris-HCl(pH7.6)，1×Denhardt′s溶液(100×＝10g Ficoll 400，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白(級分V)，水達500ml)，10％硫酸葡聚糖，1％SDS，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，42℃，(5)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，1％SDS，100微克/毫升變性鮭精DNA，65℃，或者(6)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，50％甲酰胺，1％SDS，100微克/毫升變性鮭精DNA，42℃，高嚴謹性洗滌是下面任一項(1)0.3-0.1×SSC，0.1％SDS，65℃，或者(2)1mM Na2EDTA，40mM NaHPO4(pH7.2)，1％SDS，65℃。上述條件要用于50個堿基對或更長的DNA-DNA雜合體。其中相信雜合體長度少于18個堿基對，則雜交和洗滌溫度應該比計算的該雜合體的Tm低5-10℃，其中以℃表示的Tm＝(2×A和T堿基數)+(4×G和C堿基數)。對于據信長度大約18至大約49個堿基對的雜合體，以℃表示的Tm＝(81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-500/L)，其中“M”是一價陽離子(例如Na+)的克分子濃度，“L”是雜合體堿基對長度。
中等嚴謹性條件可以利用下面任一項的條件雜交(1)4×SSC，(10×SSC＝3M NaCl，0.3M檸檬酸三鈉·2H2O(88g/升)，用1M HCl調節(jié)pH至7.0)，1％SDS(十二烷基硫酸鈉)，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，65℃，(2)4×SSC，50％甲酰胺，1％SDS，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，42℃，(3)1％牛血清白蛋白(級分V)，1mM Na2-EDTA，0.5MNaHPO4(pH7.2)(1M NaHPO4＝134g Na2HPO4·7H2O，4ml 85％H3PO4/升)，7％SDS，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，65℃，(4)50％甲酰胺，5×SSC，0.02M Tris-HCI(pH7.6)，1×Denhardt′s溶液(100×＝10gFicoll 400，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白(級分V)，水至500ml)，10％硫酸葡聚糖，1％SDS，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，42℃，(5)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，1％SDS，100微克/毫升變性鮭精DNA，65℃，或者(6)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，50％甲酰胺，1％SDS，100微克/毫升變性鮭精DNA，42℃，中等嚴謹性洗滌是1×SSC，0.1％SDS，65℃。上述條件要用于50個堿基對或更長的DNA-DNA雜合體。其中相信雜合體長度少于18個堿基對，則雜交和洗滌溫度應該比計算的該雜合體的Tm低5-10℃，其中以℃表示的Tm＝(2×A和T堿基數)+(4×G和C堿基數)。對于據信長度大約18至大約49個堿基對的雜合體，以℃表示的Tm＝(81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-500/L)，其中”M”是一價陽離子(例如Na+)的克分子濃度，并且”L”是雜合體堿基對長度。
低嚴謹性條件可以利用下面任一項的條件雜交(1)4×SSC，(10×SSC＝3M NaCl，0.3M檸檬酸三鈉·2H2O(88g/升)，用1MHCl調節(jié)pH至7.0)，1％SDS(十二烷基硫酸鈉)，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，50℃，(2)6×SSC，50％甲酰胺，1％SDS，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，40℃，(3)1％牛血清白蛋白(級分V)，1mM Na2-EDTA，0.5M NaHPO4(pH7.2)(1M NaHPO4＝134g Na2HPO4·7H2O，4ml85％H3PO4/升)，7％SDS，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，50℃，(4)50％甲酰胺，5×SSC，0.02M Tris-HCl(pH7.6)，1×Denhardt′s溶液(100×＝10gFicoll 400，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白(級分V)，水至500ml)，10％硫酸葡聚糖，1％SDS，0.1-2mg/ml變性鮭精DNA，40℃，(5)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，1％SDS，100微克/毫升變性鮭精DNA，50℃，或者(6)5×SSC，5×Denhardt′s溶液，50％甲酰胺，1％SDS，100微克/毫升變性鮭精DNA，40℃，低嚴謹性洗滌是下面任一項(1)2×SSC，0.1％SDS，50℃，或者(2)0.5％牛血清白蛋白(級分V)，1mM Na2EDTA，40mM NaHPO4(pH7.2)，1％SDS。上述條件要用于50個堿基對或更長的DNA-DNA雜合體。其中相信雜合體長度少于18個堿基對，則雜交和洗滌溫度應該比計算的該雜合體的Tm低5-10℃，其中以℃表示的Tm＝(2×A和T堿基數)+(4×G和C堿基數)。對于據信長度大約18至大約49個堿基對的雜合體，以℃表示的Tm＝(81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-500/L)，其中“M”是一價陽離子(例如Na+)的克分子濃度，并且“L”是雜合體堿基對長度。
本發(fā)明包括使用安瑞斯丁、卡斯達丁、塔牡斯達丁或者它們的生物活性片段、類似物、同系物、衍生物或者突變體抑制哺乳動物組織中血管生成的方法。特別地，本發(fā)明包括用有效量的一種或多種抗生血管蛋白、或者其一種或多種生物活性片段、或者具有抗生血管活性的片段的組合、或者激動劑和拮抗劑治療血管生成介導的疾病的方法?？股艿鞍子行Я渴亲阋砸种茖е录膊』虬Y狀的血管生成從而完全或部分減輕疾病或癥狀的量。通過觀察疾病癥狀的減輕可以確定血管生成介導的疾病的減輕，例如腫瘤大小的減小或者阻止腫瘤生長。如這里使用的，術語“有效量”也指足以表現出意味深長的患者利益，即相關醫(yī)學癥狀的治療、愈合、預防或減輕、或者這樣的癥狀的治療、愈合、預防或減輕的速度加快的組合物或方法的各活性成分的總量。當結合施用時，該術語指不管組合、依次或者同時施用都產生治療作用的活性成分的組合量。血管生成介導的疾病包括但不限于癌癥、實體腫瘤、生于血液的腫瘤(例如白血病)、腫瘤轉移、良性腫瘤(例如血管瘤、聽覺神經瘤、神經纖維瘤、器官纖維變性、沙眼和生膿性風濕性肉芽腫)、類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、眼科血管生成疾病(例如糖尿病性視網膜病、早熟視網膜病、斑點變性、角膜移植排異、新血管青光眼、晶狀體后纖維組織形成、纖維組織形成)、Osler-Webber綜合癥、心肌血管生成、血小板新血管化、毛細管擴張、血友病關節(jié)、血管纖維瘤、和傷口肉芽?？股艿鞍子糜谥委焹绕ぜ毎^多或異常刺激疾病。這些疾病包括但不限于腸粘連、局限性回腸炎、動脈粥樣硬化、硬皮病、和肥大傷疤(例如瘢痕瘤)?？股艿鞍淄ㄟ^阻止胚胎植入所需要的血管化可以用作控制生育藥物。抗生血管蛋白用于治療作為病理結果的疾病例如貓抓傷(Rocheleminalia quintosa)和潰瘍(Heliobacter pylori)?？股艿鞍祝缤ㄟ^抑制脂肪組織中毛細管形成，從而防止其擴展，也可以用來防止透析移植物血管發(fā)病狹窄，和肥胖癥?？股艿鞍滓部梢杂脕碇委熅植?例如沒有轉移的)疾病?！鞍┌Y”指腫瘤生長、增生或者增殖性生長或者細胞異常發(fā)育病理狀態(tài)，并且包括實體腫瘤、非實體腫瘤和任何異常細胞增殖，例如白血病所見到的。如這里使用的，“癌癥”也指血管生成依賴性癌癥和腫瘤，即它們的生長要求血管數量和密度增加以供給它們血液的腫瘤。“消退”指使用本領域技術人員公知的方法確定的腫瘤質的減少和大小的減小。
或者，在期望血管生成增加的情況下，例如傷口愈合，或者在梗塞后的心臟組織中，可以使用抗生血管蛋白的抗體或抗血清來阻斷局部的天然抗生血管蛋白和進程，從而增加新血管形成，這樣抑制組織的萎縮。
抗生血管蛋白可以與其它組合物和用于治療疾病的方法結合使用。例如，可以結合抗生血管蛋白、常規(guī)使用手術、放射療法、化學療法或免疫療法治療腫瘤，然后可以接著對患者施用抗生血管蛋白，達到停止微量轉移并且穩(wěn)定和抑制任何殘留的原發(fā)性腫瘤的生長的程度。所述抗生血管蛋白、或者其片段、抗血清、受體激動劑或者受體拮抗劑、或者其組合，也可以與其它抗生血管化合物、或者蛋白質、其它抗生血管蛋白(例如制管張素、內靜素)的片段、抗血清、受體激動劑、受體拮抗劑結合。另外，也可以與藥學可接受的賦形劑和可選的緩釋基質(例如生物可降解聚合物)組合形成治療組合物。
本發(fā)明的組合物也可以含有其它抗生血管蛋白或者化合物，例如內靜素或制管張素和其突變體、片段和類似物。所述組合物可以進一步含有提高蛋白質活性或者維護其在治療中的活性或應用的其它物質，例如化學治療物質或放射性物質。所述組合物中也可以包括這樣的其他因子和/或物質，與本發(fā)明的蛋白質產生協同作用或者減小副作用。另外，施用本發(fā)明的組合物可以并行地與其它治療一起進行，例如與化學治療或發(fā)射治療方案結合施用。
本發(fā)明包括通過使組織接觸含有本發(fā)明蛋白質的組合物來抑制哺乳動物(例如人)組織中血管生成的方法。所謂“接觸”是指不只是局部施用，而且還有將組合物輸入組織或者輸入組織的細胞的那些送遞方法。
本發(fā)明也包括應用隨時間緩釋或者持續(xù)釋放送遞系統。這樣的送遞系統在難以手術或者不可能手術的情況下特別需要，例如由于年齡或者疾病病程本身而衰弱的患者，或者風險-利益分析表明控制超過治療的情況。
這里使用的持續(xù)釋放基質通常是由聚合物等可通過酶或酸/堿水解或者通過溶解而降解的材料制成的。一旦插入到體內，酶和體液就對基質作用。持續(xù)釋放基質期望選自生物相容性物質，例如脂質體、聚交酯(聚乙酸)、聚乙醇酸交酯(乙醇酸的聚合物)、聚交酯共聚乙醇酸交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚(原)酯、聚蛋白質、透明質酸、膠原、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯丙稀、聚乙烯吡咯烷酮和硅氧烷。
優(yōu)選的生物可降解基質是聚交酯、聚乙醇酸交酯或者聚交酯共聚乙醇酸交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)之一基質。
本發(fā)明血管生成調節(jié)組合物可以是固體、液體或者氣溶膠，并且可以通過任何已知的給藥途經施用。固體組合物的例子包括藥丸、乳膏和可埋植劑量單位。藥丸可以口服給藥，治療性乳膏可以局部施用?？陕裰矂┝繂挝豢梢跃植渴┯?，例如在腫瘤位點；或者其可以埋植用于血管生成調節(jié)組合物的全身釋放，例如皮下埋植。液體組合物的例子包括適合皮下、靜脈內、動脈內注射的制劑和局部和眼內給藥的制劑。氣溶膠制劑的例子包括用于對肺給藥的吸入制劑。
應用本領域技術人員公知的配制方法和藥學可接受制劑、蛋白質和蛋白質片段可以獲得上述基本上純的具有抗生血管活性的蛋白質和蛋白質片段。這些制劑可以通過標準途經施用。一般情況下，組合物可以通過局部、經皮、腹膜內、顱內、腦室內、大腦內、陰道內、子宮內、口服、直腸或者腸胃外(例如靜脈內、脊柱內、皮下或者肌內)途經施用。另外，可以將抗生血管蛋白摻入到生物可降解聚合物中使化合物持續(xù)釋放，在期望送遞藥物之處附近植入所述聚合物，例如，在腫瘤位點或者植入，使得抗生血管蛋白全身性緩慢釋放。也可以使用滲透小型泵提供高濃度抗生血管蛋白的控制送遞，通過套管達到感興趣的部位，例如直接到轉移的腫瘤中或者到供給腫瘤的管中。例如Brem等(1991，J.Neurosurg74441-446)詳細描述了可生物降解聚合物和它們的應用，該文獻在這里全文引作參考。
例如，含有本發(fā)明多肽的組合物可以通過單位劑量注射靜脈內施用。參照本發(fā)明治療組合物使用的術語“單位劑量”實際上指對接受者適合的單位劑量的不連續(xù)單位，每一個單位含有計算產生與要求的稀釋度相關的期望的治療作用的預定量活性物質，即載體和賦形劑。
本發(fā)明的組合物的施用方式包括靜脈內、肌內、腹膜內、胸骨內、皮下和動脈內注射和輸液。用于腸胃外注射的藥物組合物包括藥學可接受無菌水溶液或不含水的溶液、分散劑、懸浮劑或者乳狀液以及用于在使用之前再勾兌成無菌可注射溶液或分散劑的無菌粉末劑。合適的含水和不含水的載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑的例子包括水、乙醇、polyois(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇和類似物)、羧甲基纖維素和其合適的混合物、植物油(例如橄欖油)和可注射有機酯例如油酸乙酯。例如，通過利用卵磷脂等包衣材，通過在分散劑情況下保持要求的顆粒度，通過利用表面活性劑，都可以保持適當的流動性。這些組合物也可以含有佐劑，例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。通過包括各種抗細菌和抗真菌物質例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等可以保證防止微生物的作用。也可以期望含有等張劑例如糖、氯化鈉等。通過含有象一硬脂酸鋁和明膠這樣的延遲吸收的物質可以實現可注射藥物形式的長時間吸收。通過在可生物降解聚合物例如聚交酯聚乙醇酸交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中將藥物制成微膠囊基質可制備成注射貯存形式。根據藥物和聚合物的比例和使用的特定聚合物的性質，可以控制藥物釋放的速度。通過將藥物包埋在與身體組織相容的脂質體或者微乳狀液中也可以制備貯存式可注射制劑。例如通過截留細菌的過濾器過濾或者在使用之前摻入在無菌水或者其它無菌可注射介質中能溶解或分散的無菌固體組合物形式的滅菌劑，可以將可注射制劑滅菌。
本發(fā)明的治療組合物可以含有所述成分的藥學可接受鹽，例如，所述鹽可以從無機酸或有機酸衍生。所謂“藥學可接受鹽”指經可靠醫(yī)學鑒定范圍內的適用于與人和低級動物的組織接觸而沒有過度毒性、過敏反應等并且有合理的利潤/風險比的那些鹽。藥學可接受鹽是本領域公知的。例如，S.M.Berge，等詳細描述了藥學可接受鹽，見J.Pharmaceutical Sciences(1977)661 et seq.，其在這里引作參考。藥學可接受鹽包括與無機酸(例如鹽酸、磷酸)或者與有機酸(例如乙酸、酒石酸、苯乙醇酸)形成的酸性鹽(與多肽的自由氨基形成的)。與自由羧基形成的鹽可以衍生自無機堿(例如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物)和有機堿(例如異丙基胺、三甲基胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因)等?？梢栽诒景l(fā)明的化合物的最后分離和純化過程中就地制備鹽或者分開地通過使自由堿官能團與合適的有機酸反應來制備鹽。代表性的酸性鹽包括但不限于乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡萄糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、heptonoate、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基甲磺酸鹽(羥乙磺酸鹽)、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、pamoate、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫代氰酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽和十一烷基酸鹽。使用下面的試劑可以將含氮堿基季銨鹽化，例如低級烷基鹵化物(例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)、硫酸二烷基酯(例如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯)、長鏈鹵化物(例如十烷基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物)；芳基烷基鹵化物(象芐基和苯乙基溴化物)和其它。從而獲得水或者油可溶性或可分散產物?？梢杂脕砩伤帉W可接受酸性鹽的酸的例子包括無機酸(例如鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸)和有機酸(例如草酸、馬來酸、琥珀酸和檸檬酸)。
這里使用的術語“藥學可接受的”、“生理耐受的”及其語法變換形式是指組合物、載體、稀釋劑和試劑，它們可互換使用并且代表能夠以最小的不期望的生理作用例如惡心、頭暈和胃不適等對哺乳動物施用。含有溶解于其中或者懸浮于其中的活性成分的藥物組合物的制備是本領域公知的并且不局限于配制。典型地，這樣的組合物制備成注射液或者液體溶液或懸浮液，但是也可以在使用之前在液體中制備成適用于溶液或懸浮液的固體形式。制劑也可以是被乳化的。
活性成分可以以適合這里描述的治療方法的量與藥學可接受的并且與活性成分相容的賦形劑混合。合適的賦形劑包括例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等和它們的混合物。另外，如果需要，所述組合物可以含有少量輔助物質(例如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑等增強活性成分效力的物質)。
本發(fā)明的抗生血管蛋白也可以包括在含有前體藥物的組合物中。如這里使用的，術語“前體藥物”指能在體內快速轉化得到母體的化合物，例如通過在血液中酶解。T.Higuchi和V.Stella在Prodrugs asNovel Delivery Systems(Vol.14，the ACS Symposium Series)和Bioreversible Carriers in Drug Design(Edward B.Roche編著，AmericanPharmaceutical Association and Permagon Press，1987)中提供了充分的討論，這兩篇文獻在這里引作參考。如這里使用的，術語“藥學可接受前體藥物”指(1)經可靠醫(yī)學鑒定范圍內的適用于與人和動物的組織接觸而沒有過度毒性、過敏反應等并且有合理的利潤/風險比并且對于它們的應用有效的那些本發(fā)明化合物的前體藥物和(2)可能情況下母體化合物的兩性離子形式。
本發(fā)明的抗生血管蛋白的劑量取決于疾病狀態(tài)和要治療的癥狀和其它臨床因素，例如人或動物的體重和施用化合物的途經。對于治療人或動物，可以施用大約10mg/kg體重至大約20mg/kg體重的蛋白質。在組合治療中，例如與放射療法、化學療法或免疫療法結合的本發(fā)明的蛋白質，有可能將劑量減小到例如大約0.1mg/kg體重至大約0.2mg/kg體重。根據抗生血管蛋白在具體動物或人體內的半衰期，可以每天幾次至一周一次施用抗生血管蛋白。要明白本發(fā)明具有人用和獸用的用途。本發(fā)明的方法包括一次給藥和多次給藥、同時或者經延長的時間。另外，抗生血管蛋白可以與其它形式的治療結合施用，例如放射療法、化學療法或免疫療法。
抗生血管蛋白制劑包括適合口服、直腸、眼部(包括玻璃體內或眼房內)、鼻、局部(包括口腔和舌下)、子宮內、陰道或者腸胃外(包括皮下、腹膜內、肌內、靜脈內、真皮內、顱內、氣管內和硬膜外)施用的那些。生血管蛋白制劑可以方便地以單位劑量形式存在并且可以通過常規(guī)制藥技術制備。這樣的技術包括將活性成分和藥物載體和賦形劑混合的步驟。一般情況下，通過均勻密切地混合活性成分和液體載體或者研細地固體載體或者兩者來制備這些劑型。如果需要，然后將產品成型。
適合腸胃外施用的制劑包括含水和不含水無菌注射液，其可以含有抗氧化劑、緩沖液、制菌劑和使得制劑與接受者的血液等張的溶質；含水和不含水無菌懸浮液，其可以含有懸浮劑和增稠劑。制劑可以裝在一劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以保存在冷凍干燥(凍干)條件下，在使用之前只需要加入無菌液體，例如注射用水?？梢詮那懊婷枋鲱愋偷臒o菌粉末劑，顆粒劑和片劑制備臨時注射溶液和懸浮液。
當口服施用有效量的本發(fā)明的蛋白質時，本發(fā)明的抗生血管蛋白可以是片劑、膠囊、粉末劑、溶液或酏劑形式。當以片劑形式施用時，本發(fā)明的藥物組合物可以另外含有固體載體例如明膠或佐劑。片劑、膠囊和粉末劑含有大約5-95％的本發(fā)明蛋白質，優(yōu)選大約25-90％的本發(fā)明蛋白質。當以液體形式施用時，可以加入液體載體例如水、石油、動物來源或植物來源的油，例如花生油、礦物油、豆油、或芝麻油或者合成油。藥物組合物的液體形式可以進一步含有生理鹽水、葡萄糖或者其它糖溶液或者二醇類，例如乙二醇、丙二醇或者聚乙二醇。當以液體形式施用時，藥物組合物含有大約0.5-90％重量的本發(fā)明蛋白質，優(yōu)選大約1-50％重量的本發(fā)明蛋白質。
當通過靜脈內、皮或皮下注射施用有效量的本發(fā)明的蛋白質時，本發(fā)明的蛋白質是沒有熱原并且腸胃外可接受的水溶液形式。關于pH、等張性、穩(wěn)定性等，本領域技術人員能夠制備這樣的腸胃外可接受的蛋白質溶液。用于靜脈內、皮或皮下注射的優(yōu)選的藥物組合物除了本發(fā)明的蛋白質之外，應該含有等張賦形劑，例如氯化鈉注射液、Ringer′s注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸化Ringer′s注射液或者本領域公知的其它賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物還可以含有穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖液、抗氧化劑，或者本領域技術人員公知的其它添加劑。
本發(fā)明的藥物組合物中含有的本發(fā)明的蛋白質的量取決于要治療的癥狀的性質和嚴重程度，并且取決于治療之前患者的狀況。最后，主治醫(yī)生決定對各患者治療所用的本發(fā)明的蛋白質的量。開始時，主治醫(yī)生將給予低劑量的本發(fā)明的蛋白質并且觀察患者反應?？梢越o予較大劑量的本發(fā)明的蛋白質，直到對患者獲得最佳治療效果，在這一點上不再增加劑量。
使用本發(fā)明的藥物組合物靜脈內治療的時間將隨著要治療的疾病的嚴重程度和各患者的癥狀和潛在的特應性反應而不同。每一次施用本發(fā)明的蛋白質的時間是連續(xù)靜脈內給藥12-24小時范圍內。最后主治醫(yī)生決定使用本發(fā)明的藥物組合物靜脈內治療的合適的時間。
優(yōu)選的單位劑量制劑是含有日劑量或單位、日亞劑量、或者其合適的施用成分的片段。應該明白除了特別提到的所述成分之外，本發(fā)明的制劑可以含有就研究的制劑類型來說本領域常規(guī)的其它試劑?？蛇x地，細胞毒性試劑可以和抗生血管蛋白或者其生物功能蛋白質片段混合或組合，對患者提供雙重治療。
目前所述治療組合物對于獸用也是有價值的。除人之外，特別是馴養(yǎng)動物和良種馬，是用本發(fā)明的蛋白質進行這樣的治療的預計的患者。
細胞毒性試劑例如蓖麻毒蛋白，可以與抗生血管蛋白和它的片段連接，從而為破壞結合抗生血管蛋白的細胞提供工具?？梢栽诤芏嗖课话l(fā)現這些細胞，包括但不限于微轉移病灶和原發(fā)腫瘤。與細胞毒性試劑連接的蛋白質可以以最大送遞量的方式對預計部位灌注。例如，蓖麻毒蛋白連接的高親和性片段通過套管送遞到血管中供給靶位或者直接供給靶物。這樣的藥物也可以通過與輸液套管連接的滲透泵耦合灌注的方式送遞?？梢院脱苌傻拇碳┮黄鹗┯每股艿鞍椎霓卓箘┑慕M合，提高組織的血管化。這種治療方案提供了有效的破壞轉移腫瘤的方法。
另外的治療方法包括施用與細胞毒性試劑連接的抗生血管蛋白、其片段、類似物、抗血清、或者受體激動劑和拮抗劑。要明白所述抗生血管蛋白可以是人源或動物源的。通過化學反應或者通過與表達系統結合的重組技術也可以合成制備所述抗生血管蛋白。通過將分離的IV型膠原酶酶解產生具有抗生血管活性的蛋白質，也可以制備抗生血管蛋白。通過模擬將IV型膠原裂解為抗生血管蛋白的內源酶的作用的化合物也可以制備抗生血管蛋白。通過化合物影響裂解酶的活性也可以調節(jié)抗生血管蛋白的制備。
本發(fā)明還包括基因治療方法，其中將編碼抗生血管蛋白、整聯蛋白、整聯蛋白亞基或者其突變體、片段、或者融合蛋白的多核苷酸導入患者并且在患者體內調節(jié)。Gene Transfer into Mammalian SomaticCells in vivo，N.Yang(1992)Crit.Rev.Biotechn.12(4)335-356中公開了向細胞轉移或送遞表達基因產物蛋白質的DNA的各種方法，也稱為基因治療，該文獻在此引作參考?；蛑委煱▽NA序列插入離體或體內治療中使用的體細胞或胚系細胞?；蛑委煿δ茉谟谥脫Q基因、增加正?；虍惓；蚬δ芎蛯垢腥炯膊『推渌膊?。
用基因療法治療這些醫(yī)學難題的策略包括這樣的治療策略，例如鑒定缺陷基因，然后加入功能基因替代缺陷基因功能或者稍微增加基因功能；或者預防策略，例如加入基因產生治療所述癥狀的蛋白質或者產生更易接受治療方案的組織或器官。作為預防策略的一個例子，可以置換患者中例如編碼一種或多種抗生血管蛋白的基因，這樣防止血管生成；或者插入使得腫瘤細胞更容易接受放射的基因，然后對腫瘤放射將提高引起腫瘤細胞的殺死率。
本發(fā)明想到很多轉移抗生血管蛋白的DNA或調節(jié)序列的方法。除了常見的與抗生血管蛋白特異性相聯的啟動子序列或者其他提高抗生血管蛋白的產率，序列之外的啟動子序列的轉染也認為是基因治療的方法。Transkaryotic Therapies，Inc.，ofCambridge，Mass中找到該技術的一個例子，利用同源重組插入啟動細胞中紅細胞生成素基因的“基因開關”。參見Genetic Engineering News，Apr.15，1994。這樣的“基因開關”能被用來激活表達那些蛋白質(或受體)的細胞中的抗生血管蛋白(或者它們的受體)。
用于基因治療的基因轉移方法廣義上分為三類物理方法(例如電穿孔、直接基因轉移和顆粒轟擊)、化學方法(例如脂質基載體或者其它非病毒載體)和生物方法(例如病毒衍生的載體和受體攝取)。例如，可以使用非病毒載體，它包括DNA包被的脂質體，可以直接對患者靜脈內注射這樣的脂質體/DNA復合體。相信脂質體/DNA復合體在肝臟濃縮，在那里它們給噬菌體和Kupfer細胞送遞DNA。這些細胞存活期長，因此長期提供送遞的DNA的表達。另外，基因的載體或者“裸”DNA可以直接注射給目標器官、組織或腫瘤，用于定向送遞治療DNA。
通過送遞位點也描述了基因治療方法。送遞基因的基本方式包括離體基因轉移、體內基因轉移和體外基因轉移。在離體基因轉移中，取來自患者的細胞并且在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將DNA轉染到該細胞中，轉染的細胞數目擴增，然后再移植給該患者。在體外基因轉移中，轉化的細胞是培養(yǎng)基中生長的細胞，例如組織培養(yǎng)細胞，而不是來自特定患者的特定細胞。這些“實驗細胞”被轉染，選擇轉染的細胞并且擴增，用于對患者移植或者其它用途。
體內基因轉移涉及細胞在患者體內的時候將DNA導入細胞。方法包括使用病毒介導的基因轉移，使用非感染病毒來向患者體內送遞基因或者對患者的某一位置注射裸DNA，一定百分比的細胞吸收基因并在其中表達基因產物。另外，可以使用這里描述的其它方法，例如使用“基因槍”，用于體外插入DNA或者控制抗生血管蛋白產生的調控序列。
基因治療的化學方法涉及脂質基化合物，不一定是脂質體，來轉移DNA穿過細胞膜。脂質轉染試劑或細胞轉染劑，與帶負電荷的DNA結合的脂質基正電荷，構成能夠跨越細胞膜的復合體并且將DNA提供給細胞內部。另一種化學方法使用基于受體的胞吞作用，其涉及特異配體與細胞表面受體結合和將其包被并運送過細胞膜。所述配體結合該DNA并且這個復合體被運送給細胞。將配體基因復合體注射到血液中，然后具有該受體的靶細胞將特異性結合該配體并且將該配體-DNA復合體運送到細胞中。
很多基因治療方法使用病毒載體來將基因插入到細胞中，例如離體方法中使用改變的逆轉錄病毒載體將基因導入外周和腫瘤滲透淋巴細胞、肝細胞、表皮細胞、肌細胞或者其它體細胞。然后將這些改變的細胞導入患者，提供來自插入的DNA的基因產物。
也通過體內方法使用病毒載體將基因插入細胞。對于指導外源基因的組織特異性表達，可以使用已知是組織特異性的順式作用調控元件或啟動子。或者，這可以使用體內對特異的解剖學構造原位送遞DNA或表達載體來實現。例如，通過體外將轉導的內皮細胞植入到動脈壁上選擇的位點實現體內基因向血管的轉移。病毒轉染也表達基因產物的周圍的細胞。例如通過導管直接將病毒載體送遞到體內位點，這樣只含有病毒要感染的區(qū)域，并且提供長期的位點特異性基因表達。通過將改變的病毒注射到與器官連接的血管中，使用逆轉錄病毒的體內基因轉移在哺乳動物組織和肝組織中也已經證明。
已經用于基因治療方案的病毒載體包括但不限于逆轉錄病毒，其它RNA病毒例如骨髓灰質炎病毒或者新培斯病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、SV 40、牛痘和其它DNA病毒。復制缺陷鼠逆轉錄病毒載體是最廣泛使用的基因轉移載體。鼠白血病逆轉錄病毒由與核核心蛋白和聚合酶(pol)酶復合的單鏈RNA組成，由蛋白質核心(gag)包被并且由確定宿主范圍的糖蛋白膜(env)包圍。逆轉錄病毒基因組結構包括5′和3′長末端重復單元(LTR)連接的gag、pol和env基因。逆轉錄病毒載體系統利用這樣的事實，即包含5′和3′LTRs和包裝信號的最小載體的足以使載體包裝、感染并且整合到靶細胞中，條件是在包裝細胞系中反式供給病毒結構蛋白質。用于基因轉移的逆轉錄病毒載體的重要優(yōu)點是包括在大多數細胞類型中充分感染并且進行基因表達，嚴謹的單一拷貝載體整合到靶細胞染色體DNA中，以及容易操作逆轉錄病毒基因組。
腺病毒由與核心蛋白復合并且由衣殼蛋白包圍的線性雙鏈DNA組成。分子病毒學的發(fā)展有能力開發(fā)這些生物體的生物學，產生能體內將新的基因序列轉導到靶細胞中的載體。腺病毒基載體將以高水平表達基因產物蛋白。腺病毒載體具有高轉染效率，即使伴隨低病毒效價也是如此。另外，病毒具有全感染性，不區(qū)分細胞，所以不需要注射生產者細胞系。腺病毒載體另一個潛在的優(yōu)點是能夠在實現體內長期表達異源基因。
DNA送遞的物理方法包括融合脂小泡(例如脂質體)和用于膜融合的其它小泡，DNA插入陽離子脂質的脂質顆粒例如脂質轉染劑，多賴氨酸介導的DNA轉移，DNA的直接注射，例如將DNA微注射到胚細胞或體細胞中，充氣送遞DNA-包被顆粒，例如”基因槍”中使用的金顆粒，和無機化學方法例如磷酸鈣轉染。首先在轉化植物組織中使用顆粒介導的基因轉移方法。使用顆粒轟擊裝置，或者“基因槍”，產生一種運動力，推動DNA包被的高密度顆粒(例如金或鎢)有高速度，使其穿過靶器官、組織或細胞。在體外系統中可以使用顆粒轟擊，或者使用離體或體內技術，將DNA導入細胞、組織或器官。另一種方法是配體介導的基因治療，涉及DNA與特異性配體復合，形成配體-DNA偶聯物，將DNA導入特異細胞或組織。
已經發(fā)現將質粒DNA注射到肌細胞中產生高百分比的轉染率，并且持續(xù)表達標記基因的細胞。質粒的DNA可以或者可以不整合到細胞的基因組中。轉染的DNA沒有整合將使得基因產物蛋白質在最后分化的沒有增殖的組織中轉染和表達延長的時間而不用擔心細胞或線粒體基因組中突變性插入、缺失或者改變。長期但是不必須永久性的治療性基因轉移到特異細胞中，可以對遺傳病提供治療或者提供預防性應用。周期性反復注射DNA，保持基因產物水平，接受者細胞的基因組不發(fā)生突變。異源DNA沒有整合使得細胞內存在幾種不同的異源DNA構建體，所有的構建體表達不同的基因產物。
用于基因轉移的電穿孔利用電流產生電穿孔易接受的基因轉移的細胞或組織。使用給定場強的短暫的電脈沖來以這樣的方式提高膜的透過性使得DNA分子能夠透過膜并進入細胞。可以在體外系統中使用該技術，或者使用離體或體內技術，將DNA導入細胞、組織或器官。
可以應用體內載體介導的基因轉移將外來DNA轉染到細胞中。方便地將載體-DNA復合體導入體液或者血液，然后點特異性進入體內的靶器官或組織。可以使用脂質體和聚陽離子，例如聚賴氨酸、脂質轉染劑或者細胞轉染劑。可以研發(fā)這樣的脂質體，它是細胞特異性的或器官特異性的，因此可通過靶細胞吸收脂質體攜帶外來DNA。定向某些細胞上的特異受體的免疫脂質體注射可以用作將DNA插入攜帶該受體的細胞的常規(guī)方法。使用過的另一種載體系統是用于體內基因轉移的將DNA傳遞給肝細胞的脫唾液酸糖蛋白/聚賴氨酸偶聯物系統。
轉染的DNA也可以與其它類型的載體復合以便將該DNA載到受體細胞中，然后留在胞質或核質中。DNA可以與基因工程得到的小泡復合體中的載體核蛋白質偶聯并且直接載進細胞核。
抗生血管蛋白基因調節(jié)可以通過施用結合編碼抗生血管蛋白的基因、或者與該基因相關的控制區(qū)域、或者其相應的RNA轉錄區(qū)的化合物來改變轉錄或翻譯的速度。另外，可以對患者施用用編碼抗生血管蛋白的DNA序列轉染的細胞，提供那些蛋白質的體內來源。例如，可以用包含編碼抗生血管蛋白的核苷酸序列的載體轉染細胞。轉染的細胞可以是來自患者正常組織、患者病理組織的細胞或者可以是不是患者的細胞。
例如，用能夠表達本發(fā)明的蛋白質的載體轉染從患者取出的腫瘤細胞，再給患者導入。轉染的腫瘤細胞在患者體內產生抑制腫瘤生長水平的蛋白質?；颊呖梢允侨嘶蛘叻侨藙游?。細胞也可以不用載體，或者用本領域公知的物理方法或化學方法轉染，例如電穿孔、離子穿孔或者通過“基因槍”。另外，可以直接對患者注射DNA，不借助載體。特別地，可以將DNA注射到皮膚、肌肉或血液中。
將抗生血管蛋白轉染到患者體內的基因治療方案可以通過抗生血管蛋白DNA整合到細胞的基因組中，到小染色體中或者作為細胞胞質或核質中分開復制或非復制DNA構建體?？股艿鞍椎谋磉_可以持續(xù)一段長時間或者可以周期性反復注射，保持細胞、組織或器官中期望的蛋白質水平或者確定的血液水平。
另外，本發(fā)明包括抗體和抗血清，其可以用來測試新的抗生血管蛋白，并且也可以在特征在于或與生血管活性相關或者缺少生血管活性的疾病和癥狀的診斷、預后或治療中使用。這樣的抗體和抗血清也可以在期望的情況下用來正調節(jié)血管生成，例如，在梗塞后心臟組織中，抗本發(fā)明蛋白質的抗體或抗血清可以用來阻斷局部的天然抗生血管蛋白和過程，并且增加新血管的生成，并且抑制心臟組織的萎縮。
這樣的抗體和抗血清可以與藥學可接受成分和載體結合形成診斷、預后或治療組合物。術語“抗體”或“抗體分子”指免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗體結合位點或抗原互補位的分子。
使用特異性結合抗生血管蛋白的抗體的被動抗體療法可以用來調節(jié)生依賴于血管生成的過程，例如再生、發(fā)育和傷口愈合和組織修復。另外，可以施用抗生血管蛋白的Fab區(qū)的抗血清阻斷該蛋白的同源抗血清結合該蛋白質的能力。
也可以使用本發(fā)明的抗生血管蛋白產生對抑制劑和受體特異性的抗體。抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體?？梢栽诒绢I域技術人員公知用來檢測或定量測定體液或組織中抗生血管蛋白或者它們的受體的診斷方法和試劑盒中使用特異性結合抗生血管蛋白或者它們的受體的這些抗體。這些測定的結果可以用來診斷或預測癌癥和其它血管生成介導的疾病的發(fā)生或復發(fā)。
本發(fā)明還包括抗生血管蛋白、那些蛋白質的抗體和含有那些蛋白質和/或它們的抗體的組合物在診斷或預后特征在于生血管活性的疾病中的用途。這里使用的術語“預后方法”指能預測確診患有疾病特別是血管生成依賴性疾病的人或動物疾病的相關進程的方法。這里使用的術語“診斷方法”指能確定人或動物血管生成依賴性疾病的存在或類型的方法。
在檢測和定量測定能結合蛋白質的抗體的診斷方法和試劑盒中可以使用抗生血管蛋白。這些試劑盒將允許檢測循環(huán)的抗生血管蛋白的抗體，它指示原位原發(fā)腫瘤分泌的抗生血管蛋白存在下微轉移的擴散。具有這樣的循環(huán)的抗蛋白質抗體的患者更可能發(fā)生多個腫瘤和癌癥，并且更可能治療或緩和一段時間之后復發(fā)癌癥。這些抗蛋白質抗體的Fab片段也可以用作產生蛋白Fab片段抗血清的抗原，所述抗血清可以用來中和蛋白抗體。這樣一種方法將通過蛋白抗體還原循環(huán)蛋白質的去除，從而有效提高抗生血管蛋白的循環(huán)水平。
本發(fā)明還包括對抗生血管蛋白特異性的受體的分離。具有與組織結合的高親和性的蛋白質片段可以用來在親和柱上分離抗生血管蛋白的受體。受體的分離和純化步驟是說明抗生血管蛋白作用機理的基本步驟。受體的分離和激動劑和拮抗劑的鑒定將有利于研發(fā)調節(jié)受體活性和發(fā)揮生物活性途經的藥物。利用原位和溶液雜交技術，受體的分離使構建探測受體位置和合成的核苷酸探針成為可能。此外，可以分離受體的基因，插入到表達載體中并且轉染到細胞中，例如患者腫瘤細胞，以提高細胞類型、組織或腫瘤結合抗生血管蛋白和抑制局部血管生成的能力。
可以使用抗生血管蛋白研發(fā)用于從培養(yǎng)的腫瘤細胞分離抗生血管蛋白的受體的親和柱。分離和純化受體之后進行氨基酸測序。利用該信息可以鑒定和分離編碼該受體的基因。接著，研發(fā)用于插入到能表達受體的載體中的克隆的核酸序列。這些技術是本領域技術人員公知的。編碼受體的核酸序列轉染到腫瘤細胞中，并且由轉染的腫瘤細胞表達受體，提高了這些細胞對內源或外源抗生血管蛋白的響應能力，從而降低轉移生長速度。
可以在標準的微量化學設備中合成本發(fā)明的血管生成抑制蛋白質并且通過HPLC和質譜檢測純度。蛋白質合成方法，HPLC純化和質譜是本領域技術人員公知的。已在重組大腸桿菌或酵母表達系統中產生抗生血管蛋白和它們的受體，并且用柱層析純化。
可以合成完整抗生血管蛋白的不同的蛋白質片段，用于幾種應用，包括但不限于如下作為研發(fā)特異性抗血清的抗原，作為在抗生血管蛋白結合位點處有活性的激動劑和拮抗劑，作為與定向殺死結合抗生血管蛋白的細胞的細胞毒性試劑連接或者結合使用的蛋白質。
抗生血管蛋白的合成的蛋白質片段具有各種各樣的用途。以高特異性和親合力結合抗生血管蛋白的受體的蛋白質被放射標記并且利用放射自顯影和膜結合技術用于觀察和定量測定結合位點。該應用提供了重要的診斷和研究工具。受體結合性質的知識有利于研究與受體連接的轉導機理。
抗生血管蛋白和從它們衍生的蛋白質可以用標準方法與其它分子偶聯。抗生血管蛋白的氨基和羧基末端都包含酪氨酸和賴氨酸殘基，并且用很多技術進行同位素和非同位素標記，例如使用常規(guī)技術進行放射性標記(酪氨酸殘基-氯胺T，iodogen，乳過氧化物酶；賴氨酸殘基-Bolton-Hunter試劑)。這些偶聯技術是本領域技術人員公知的?；蛘?，給不具有這些殘基的片段加上酪氨酸或賴氨酸以有利于標記蛋白質上反應性氨基和羥基基團。根據對氨基酸可獲得的官能團選擇偶聯技術，包括但不限于氨基、硫氫基、羧基、酰胺、苯酚和咪唑。使用各種試劑進行這些偶聯，其中包括戊二醛、重氮化聯苯胺、碳二亞胺和對苯醌。
抗生血管蛋白化學偶聯于同位素、酶、載體蛋白質、細胞毒性試劑、熒光分子、化學發(fā)色團、生物發(fā)光物和其它化合物，用于各種各樣的應用?？衫眠m合具體反應的不同的技術確定偶聯反應效率。例如，利用高特異性活性的氯胺T和Na125I完成對本發(fā)明蛋白質的放射性標記。用偏亞硫酸氫鈉終止反應并且在可自由使用的柱子上將混合物脫鹽。從柱子上洗脫標記的蛋白質并且收集級分。從各級分中取小份并且在γ計數器上測定放射性。用這種方法，可從標記的蛋白質分離沒有反應的Na125I。將具有最高特異性放射性的蛋白質級分貯存用于下面的應用，例如分析結合抗生血管蛋白的抗血清的能力。
另外，利用短壽命同位素標記抗生血管蛋白，可以實現正電子發(fā)射X線體層照像術，體內觀察受體結合位點或者用其它現代放射照像技術確定含有蛋白質結合位點的腫瘤的位置。
系統地取代這些合成的蛋白質中的氨基酸可以得到增強或者減弱受體結合作用的抗生血管蛋白受體的高親和性蛋白質激動劑和拮抗劑。這樣的激動劑被用來抑制微轉移生長，從而限制癌癥擴散。在不適當血管化情況下使用抗生血管蛋白的拮抗劑來阻斷抗生血管蛋白的抑制作用并且促進血管生成。例如，該項處理可以具有促進糖尿病患者傷口愈合的治療作用。
通過下面的實施例進一步詳細說明本發(fā)明，這些實施例不是要解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。相反，要清楚地明白可以有各種其它實施方案、改進、及其等效方案，在閱讀這里的說明之后，可以提示本領域技術人員，而不脫離本發(fā)明的精神和/或后面的權利要求書的范圍。
實施例實施例1天然安瑞斯丁的分離從人胎盤和羊膜組織可以獲得毫克量的安瑞斯丁。有人描述過安瑞斯丁和類似蛋白質的分離方法(例如，Langeveld，J.P.等，1988，JBiol.Chem.26310481-10488；Saus，J.等，1988，JBiol.Chem.26313374-13380；Gunwar，S，等，1990，J.Biol.Chem.2655466-5469；Gunwar S.等，1991，J Biol.Chem.26615318-15324；Kahsai，T.Z.等，1997，J.Biol.Chem.27217023-17032)。安瑞斯丁的重組體形式的制備由Neilson等(1993，J Biol.Chem.2688402-8406)描述。也可以在293腎細胞中表達該蛋白質(例如，通過Hohenester，E.等，1998，EMBO J 171656-1664描述的方法)。也可以根據Pihlajaniemi，T.等(1985，J.Biol.Chem.2607681-7687)的方法分離安瑞斯丁。
IV型膠原的NC1結構域的α1鏈的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸(SEQ ID NO2)序列在圖1中給出，并且相應于GenBankAccession No.M11315(Brinker，J.M.等，1994)。安瑞斯丁一般包括IV型膠原的α1鏈的NC1結構域及其可能的連接區(qū)，連接區(qū)是指NC1前面的含有12個氨基酸的結構域。
使用細菌膠原酶、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、HPLC和親和層析(Gunwar，S.等，1991，J.Biol.Chem.26615318-24；Weber，S.等，1984，Eur.J.Biochem.139401-10)從人胎盤分離天然安瑞斯丁。使用C-18疏水柱(Pharmacia，Piscataway，New Jersey，USA)將IV型膠原單體通過HPLC純化。使用乙腈梯度(32％-39％)洗脫組成蛋白，可見到一個主峰和一個小的雙重峰。SDS-PAGE分析表明第一個峰中有兩個帶，并且在第二個峰中沒有檢測到蛋白質。免疫印跡也沒有在第二個峰中發(fā)現可檢測到的蛋白質，并且主峰鑒定是安瑞斯丁。
實施例2在大腸桿菌中重組生產安瑞斯丁從α1 NC1(IV)/pDS載體(Neilson，E.G.等，1993，J.Bio.Chem.2688402-5)通過PCR擴增編碼安瑞斯丁的序列，要使用正向引物5′-CGG GAT CCT TCT GTT GAT CAC GGC TTC-3′(SEQ ID NO3)和反向引物5′-CCC AAG CTT TGT TCT TCT CAT ACA GAC3′(SEQID NO4)。得到的cDNA片段用BamHI和HindIII酶切并且連接到預先酶切的pET22b(+)(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中。圖2給出了該構建體。該構建體位于帶有pelB前導序列的符合讀框的安瑞斯丁下游和可讀框中，以位于胞質并且可溶蛋白表達。另一個載體序列加給蛋白質編碼氨基酸MDIGINSD(SEQ ID NO13)。該序列的3′端符合讀框地連接多組氨酸標記序列。另一個載體序列位于cDNA的3′端和組氨酸標記編碼的氨基酸KLAAALE(SEQ ID NO14)之間。對陽性克隆雙鏈測序。
首先將編碼安瑞斯丁的質粒構建體轉化到大腸桿菌HMS174(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中，然后轉化到BL21(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中進行表達。使用過夜細菌培養(yǎng)物接種500ml LB培養(yǎng)基。該培養(yǎng)物生長大約4小時，直到細胞密度達到OD600時0.6。然后通過加入IPTG至終濃度為1-2mM來誘導蛋白質表達。誘導2小時之后，以5000×g離心收集細胞并且再次懸浮于6M胍，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液中溶菌。對再懸浮的細胞進行短時間聲波處理，并且以12,000×g離心30分鐘。以每分鐘2毫升的速度使上清液級分通過5ml Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen，Hilden，德國)4-6次。用含有10mM和25mM咪唑以及8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液洗滌，去除沒有特異性結合的蛋白質。用含有8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)以及遞增濃度的咪唑(50mM、125mM and250mM)的溶液從柱中洗脫出安瑞斯丁蛋白質。洗脫出的蛋白質用4℃的PBS透析兩次。在透析過程中，總蛋白質中的一小部分沉淀下來。收集透析的蛋白質并且以大約3500×g離心分離為沉淀和上清液級分。通過BCA分析(Pierce Chemical Co.，Rocldbrd，Illinois，USA)和定量SDS-PAGE來分析測定各級分中的蛋白質濃度。沉淀中的總蛋白質級分大約是22％，回收的其余78％是可溶性蛋白質。蛋白質總收率是大約10mg/l。
大腸桿菌表達的蛋白質主要分離為可溶性蛋白質，并且SDS-PAGE表明有29kDa單體泳帶。另外的3kDa來自多連接體和組氨酸標記序列可以通過安瑞斯丁和6-組氨酸標記的抗體進行免疫檢測。
實施例3293胚胎腎細胞中安瑞斯丁的表達使用包含α1(IV)NC1的pDS質粒以擴增安瑞斯丁，要求使得前導信號序列符合讀框地加到pcDNA 3.1真核表達載體(InVitlogen，San Diego，Califomia，USA)中。前導序列從全長α1(IV)鏈5′端克隆5′到NC1結構域使蛋白質分泌到培養(yǎng)基中。用側翼引物對包含安瑞斯丁的重組載體測序。進一步純化無差錯cDNA克隆并且用于體外翻譯研究來證實蛋白質表達。應用氯化鈣方法使用包含安瑞斯丁的質粒和對照質粒轉染293細胞。通過遺傳霉素抗生素處理(LifeTechnologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)來篩選轉染的克隆。在抗生素存在下細胞生長3星期直到顯然不再有細胞凋亡。然后在T-225燒瓶中擴增克隆展平并且生長直到匯合。然后收集上清液并且使用amicon濃縮器(Amicon，Inc.，Beverly，Massachusetts，USA)濃縮。通過SDS-PAGE，免疫印跡分析和ELISA對濃縮的上清液分析安瑞斯丁表達。通過ELISA檢測上清液中的較強結合。SDS-PAGE分析表明主泳帶是大約30kDa。使用安瑞斯丁-特異性抗體對包含安瑞斯丁的上清液進行親和層析(Gunwar，S.等，1991，J.Biol.Chem.26615318-24)。鑒定主峰含有大約30kDa的單體，其與安瑞斯丁抗體發(fā)生免疫反應。每升培養(yǎng)液產生1-2mg重組安瑞斯丁。
實施例4安瑞斯丁抑制內皮細胞增殖C-PAE細胞在含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM中生長至匯合并且保持接觸抑制48小時。對照細胞是786-O(腎癌)細胞，PC-3細胞、HPEC細胞和A-498(腎癌)細胞。37℃下利用胰蛋白酶作用(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)5分鐘收獲細胞。向包被有10μg/ml纖連蛋白的24-孔平板的每一個孔中加入含有12500個細胞和1％FCS的DMEM的懸浮液。在37℃、5％CO2和95％濕度下將細胞溫育24小時。去除培養(yǎng)基并且用含有0.5％FCS和3ng/ml bFGF(R & D Systems，Minneapolis，Minnesota，USA)的DMEM替換。沒有刺激的對照物不接受bFGF。用0.01～50μg/ml濃度范圍的安瑞斯丁或內靜素處理細胞。在處理時所有的細胞接受1μCurie的3H-胸苷。24小時之后，去除培養(yǎng)基并且用PBS洗滌孔三次。用1N NaOH抽提細胞并且加給含有4ml ScintiVerse II(FisherScientific，Pittsburgh，Pennsylvania，USA)溶液的閃爍瓶。使用閃爍計數器測定胸苷插入。圖3A和3B給出結果，圖3A和3B是一對說明3H-胸苷摻入不同量的安瑞斯丁(圖3A)或內靜素(圖3B)處理的C-PAE細胞的圖。安瑞斯丁表現出和內靜素一樣抑制C-PAE中的胸苷摻入。圖4A、4B、4C和4D也給出了用安瑞斯丁和內靜素處理的對照細胞的行為，安瑞斯丁對786-O細胞(圖4A)、PC-3細胞(圖4B)或HPEC細胞(圖4C)有較小作用。內靜素對A-498細胞(圖4D)沒有作用。圖3和4中所有的組代表三次重復的樣品。
實施例5安瑞斯丁誘導內皮細胞程序性死亡向6-孔組織培養(yǎng)平板的每一個孔加入5萬C-PAE細胞，在補加有10％FBS的DMEM中培養(yǎng)12小時。在2、4和6小時的時間點，在加入新鮮培養(yǎng)基時一起加入5μg/ml安瑞斯丁或者40ng/ml TNFα(正對照)。對照孔接受等體積的PBS。分離的細胞和粘連的細胞集中在一起并且以1500rpm離心。
用結合緩沖液(Clontech，Palo Alto，California，USA)沖洗細胞，并且根據廠商說明用FITC-標記的膜聯蛋白V(Clontech，Palo Alto，California，USA)進行標記來測定作為程序性細胞死亡指征的磷脂酰基-絲氨酸(PS)的外表化作用。使用FACStar Plus流式細胞儀(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)計數膜聯蛋白-FITC標記的細胞。對于每一次處理，計數10000個細胞并且貯存。然后使用標準CellQuest軟件(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)分析該數據。相對于對照物來說，2小時時膜聯蛋白-V-染色(程序性細胞死亡)細胞百分比增加至大約27％，而正對照TNFα在4和6小時時接近20％。對于安瑞斯丁-處理的細胞，程序性細胞死亡細胞的百分比在2小時時是大約18％，在4和6小時時是大約23％。在實驗期間也發(fā)現內皮細胞形態(tài)的變化，而對照細胞沒有明顯變化，而安瑞斯丁-處理的和非粘連細胞指示程序性細胞死亡的細胞形態(tài)表現出變化。
實施例6安瑞斯丁抑制內皮細胞遷移應用Boyden室測試(Neuro-Probe，Inc.，Cabin John，Maryland，USA)，對人臍帶內皮細胞(ECV-304細胞，ATCC 1998-CRL，ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110-2209，USA))測試安瑞斯丁和內靜素對FBS-誘導的趨化性的抑制作用。ECV-304細胞在含有10％FBS和5ng/ml DilC18(3)活體熒光染料(Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon，USA)的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。受胰蛋白酶作用之后，在含有0.5％FBS的M199中洗滌并稀釋細胞，在有或沒有安瑞斯丁或內靜素(2-40μg/ml)的情況下在上室孔中接種60,000個細胞。將含有2％FBS的M199培養(yǎng)基放置于下室中作為chemotactant。用8微米孔徑的聚碳酸酯過濾器(Poretics Corp.，Livermore，California，USA)將含有細胞的隔室和chemotactant分開。在37℃、5％CO2和95％濕度下溫育4.5小時。棄去沒有遷移的細胞并且用PBS沖洗上面的細胞之后，用塑料片刮過濾器，固定在4％甲醛PBS溶液中，并且置于載玻片上。利用高強度熒光場，通過數字SenSysTM相機記錄幾個獨立的同質圖象，所述數字相機用成像處理軟件PMIS(Roper Scientific/Photometrics，Tucson，Arizona，USA)操作。
圖5A、5B和5C給出幾個有代表性的照片，說明2μg/ml的安瑞斯丁和20μg/ml的內靜素一樣有效。使用OPTIMAS 6.0軟件(MediaCybernetics，Rochester，NY)計數細胞，結果如圖6所示，這是顯微照片看到的圖形形式結果。
實施例7安瑞斯丁抑制內皮管形成為了測定內皮管形成的抑制作用，320微升的Matrigel(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)加到24-孔平板的每一個孔中并且使之聚合(Grant，D.S.等，1994，Pathol.Res.Pract.190854-63)。25000個小鼠主動脈內皮細胞(MAE)在沒有抗生素的EGM-2培養(yǎng)基(Clonetics Corporation，San Diego，California，USA)中的懸浮液注入Matrigel包被的每一個孔中。用遞增濃度的安瑞斯丁、BSA、無菌PBS或者7S結構域處理細胞。所有的測試都重復進行三次。細胞在37℃下溫育24-48小時并且使用CIZ2Olympus顯微鏡(3.3目鏡，10X物鏡)觀察。然后使用400 DK套裝TMAX膠片對細胞照像(Kodak)。用diff-quik定影劑(SigmaChemical Company，St.Louis，Missouri，USA)對細胞染色并且再次照像。觀察10個場，計數管數并且取平均值。圖7給出結果，表明安瑞斯丁(X)相對對照物(無菌PBS，+，BSA，A；7S結構域，-X-)來說抑制管形成。圖8A中可以觀察到具有代表性的形成得很好的管，該圖顯示用7S結構域處理過的細胞(放大100×倍)。另一方面，圖8B，顯示用0.8μg/ml安瑞斯丁處理的MAE細胞管形成不好或者不形成(放大100×倍)。
也對C57/BL6小鼠進行體內matrigel測試。Matrigel在4℃下解凍過夜。其然后與20U/ml的肝素(Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，USA)、150ng/ml的bFGF(R & D Systems，Minneapolis，Minnesota，USA)和1μg/ml的安瑞斯丁或者10μg/ml的內靜素混合。使用21g針頭皮下注射這種matrigel混合物。
對照組接受相同的混合物，但是沒有生血管抑制劑。14天之后，殺死小鼠并且取出matrigel栓。將matrigel栓固定在4％多聚甲醛的PBS溶液中在室溫下固定4小時，然后轉換到PBS中24小時。將所述栓包埋在石蠟中，切片，并且H&E染色。用光學顯微鏡檢查切片并且從10個高強度場計數血管數并且取平均值。
在有或沒有遞增濃度的安瑞斯丁下，當在bFGF存在下放置Matrigel時，在1μg/ml的安瑞斯丁或者10μg/ml的內靜素情況下觀察到血管數減少50％。這些結果表明安瑞斯丁通過抑制生血管過程的各個步驟而影響新血管的形成。結果還表明1μg/ml的安瑞斯丁和10μg/ml的內靜素在體內抑制新血管形成上同樣有效。
實施例8安瑞斯丁體內抑制腫瘤轉移對C57/BL6小鼠靜脈內注射1百萬MC38/MUC1(Gong，J.等，1997，Nat.Med.3558-61)。26天中每隔一天，對5只對照小鼠注射10mM的無菌PBS，同時6只實驗小鼠接受4mg/ml的安瑞斯丁。處理26天之后，對每只小鼠計數肺腫瘤結數，并且取兩組的平均值。每組記錄有兩例死亡。安瑞斯丁顯著地將原發(fā)腫瘤結平均數從對照小鼠的300減少到200。
實施例9安瑞斯丁體內抑制腫瘤生長對7至9周齡雄性無胸腺裸鼠皮下注射二百萬786-O細胞。在第一組6只小鼠中，讓腫瘤生長至大約700mm3。在第二組6只小鼠中，讓腫瘤生長至大約100mm3。對有700mm3腫瘤的小鼠以20mg/kg的濃度，對有100mm3腫瘤的小鼠以10mg/kg的濃度，每天I.P.注射安瑞斯丁無菌PBS溶液，注射10天。對照小鼠接受BSA或PBS賦形劑。圖9A和9B給出了結果。圖9A是說明10mg/kg安瑞斯丁-處理的(□)、BSA處理的(+)和對照小鼠(●)腫瘤體積從700mm3增加的圖。安瑞斯丁處理的小鼠的腫瘤從700mm3減小至500mm3，而BSA處理的和對照小鼠的腫瘤在10天內生長至大約1200mm3。圖9B說明對于攜帶100mm3腫瘤的小鼠，安瑞斯丁(□)也導致腫瘤收縮至大約80mm3，而BSA-處理的腫瘤(+)10天內增大至接近500mm3。
收集大約5千萬PC-3細胞(人前列腺癌細胞)并且皮下注射給7-至9周齡雄性無胸腺裸鼠。讓腫瘤生長10天，然后用游標卡尺測量。
利用標準公式計算腫瘤體積(寬2×長×0.52(O′Reilly，M.S.等，1997，Cell 88277-85；O′Reilly，M.S.等，1994，Cell 7931528)。將動物分為5-6只小鼠的組。實驗組每日I.P.注射安瑞斯丁(10mg/kg/天)或者內靜素(10mg/kg/天)。對照組每天接受PBS。結果見圖9C，說明安瑞斯丁(□)抑制腫瘤生長而且比內靜素(▲)或者對照(●)更好。重復實驗，但是使用安瑞斯丁劑量是4mg/kg/天。結果在圖9D中給出(安瑞斯丁，□；對照，●)。8天之后停止處理(二箭頭)，但是沒有另外的安瑞斯丁處理也有顯著的抑制作用持續(xù)12多天。
不加處理12天之后，腫瘤開始不受安瑞斯丁抑制影響。
實施例10安瑞斯丁的免疫組織化學處理10-20天之后殺死用于腫瘤研究的小鼠。
將腫瘤切除并且固定在4％多聚甲醛中。組織包埋在石蠟中并且切成3μm切片并且固定在載玻片上。將切片去石蠟，37℃下用300mg/ml蛋白酶XXIV(SIGMA Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)再水合和處理5分鐘。用100％乙醇終止消化并且在空氣中風干切片并且用10％兔血清封閉。然后將玻片在4℃下與大鼠抗小鼠CD-31單克隆抗體(PharMingen，San Diego，California，USA)的1∶50稀釋液一起溫育過夜，接著37℃下連續(xù)兩次在兔抗大鼠免疫球蛋白(DAKO)和大鼠APAAP(DAKO)的1∶50稀釋液中溫育30-分鐘。用新洋紅進行顏色反應，并且用蘇木紫對切片對比染色。CD-31染色圖案說明處理小鼠對對照小鼠的脈管系統有所減少。
對于PCNA染色，組織切片在室溫下與PCNA的抗體(SignetLaboratories，Dedham，Massachusetts，USA)的1∶200的稀釋液溫育60分鐘。使用USA Horeseradish過氧化物酶系統(SignetLaboratories，Dedham，Massachusetts，USA)根據廠商說明進行檢測。用蘇木紫對玻片對比染色。使用1∶500稀釋度的多克隆抗-纖連蛋白(SIGMA Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)和1∶100稀釋度的抗-IV型膠原(ICN Phannaceuticals，Costa Mesa，California，USA)實施對纖連蛋白和IV型膠原的染色。使用Vectastain Elite ABC試劑盒(Vector Laboratories.Inc.，Burlingame，California，USA)根據廠商說明進行檢測。PCNA、纖連蛋白和IV型膠原胞外基質染色說明IV型膠原和纖連蛋白的腫瘤細胞增殖或者腫瘤細胞周圍內含物或者體系結構沒有差異。
實施例11安瑞斯丁的循環(huán)半衰期對200g大小的大鼠靜脈內注射從人胎盤分離的天然安瑞斯丁。每只大鼠接受5mg人安瑞斯丁。通過使用安瑞斯丁的抗體，在不同的時間點通過直接ELISA對血清分析循環(huán)安瑞斯丁的存在。作為對照，在各時間點也對血清白蛋白進行評價來保證對于分析使用相同量的血清。發(fā)現安瑞斯丁在血清中循環(huán)的半衰期是大約36小時。
對另一組大鼠I.P.和/或皮下注射200μg的人安瑞斯丁，并且評價肺、腎、肝、胰、脾、腦、睪丸、卵巢等中的疾病發(fā)病癥狀。進行直接ELISA并且測定這些大鼠血清中的安瑞斯丁抗體，并且在腎小球基膜上注意到一些內源IgG沉積，這一點以前就觀察到過(Kalluri，R.等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 916201-5)。腎中抗體沉積不伴隨任何炎癥或者腎功能衰退。這些實驗提示安瑞斯丁是不致病的。
實施例12安瑞斯丁對細胞粘著的作用37℃下用10μg/ml濃度的人安瑞斯丁或者人IV型膠原(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)包被96-孔平板過夜。37℃下用10％ BSA(SIGMA Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)PBS溶液將剩余的蛋白質結合位點封閉2小時。HUVEC細胞在EGM-2 MV培養(yǎng)基(Clonetics Corporation，SanDiego，California，USA)中生長至亞匯合(70-80％)。細胞溫和地受胰蛋白酶作用并且重新懸浮于無血清培養(yǎng)基中(5×104細胞/毫升)。然后將細胞與10μg/ml的抗體混合并且溫育15分鐘，并且在室溫下溫和攪拌。然后將100微升的細胞懸浮液加給每一個孔，并且在37℃和5％CO2下將平板溫育45分鐘。通過用無血清培養(yǎng)基洗滌去除沒有粘著的細胞并且計數粘著的細胞。對照小鼠IgG和抗人β1整聯蛋白亞基小鼠單克隆抗體亞基(克隆P4C10)購自Life Technologies(Gibco/BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)。單克隆抗體α1整聯蛋白亞基和αVβ3(分別是克隆CD49a和LM609)購自CHEMICONInternational(Temecula，California，USA)。
結果在圖10A和10B中給出，圖10A和10B是一對直方圖，說明細胞與小鼠IgG(c，對照)、或者α1或β1整聯蛋白亞基的抗體、或者αVβ3整聯蛋白抗體混合包被的平板上附著HUVEC細胞的百分比(y-軸)。圖10A和10B分別說明安瑞斯丁包被的或者IV型膠原包被的平板上附著細胞的百分比。對于安瑞斯丁包被的平板，對于α1亞基發(fā)現細胞粘著被抑制60％，對于β1亞基被抑制70％(圖10A)，而IV型膠原包被的平板(圖10B)顯示更輕的抑制作用，對于α1是30％，對于β1是40％，對于αVβ3中和抗體是15％。
實施例13安瑞斯丁對基質金屬蛋白酶的結合和抑制MMP-2、MMP-9和抗這些酶的抗體購自Oncogene，Inc.。使用如前所述(Kalluri，R.et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 916201-5)的從人胎盤分離的天然安瑞斯丁進行直接ELISA。MMP-2和MMP-9都特異性結合安瑞斯丁。它們不結合7S結構域。該結合分別獨立于TIMP-2和TIMP-1結合。
為了評價安瑞斯丁降解基膜的能力，37℃溫和攪拌下Matrigel與MMP-2和MMP-9溫育6小時。通過SDS-PAGE分析上清液，并且用抗IV型膠原α2鏈抗體免疫印跡。降解測試開始時，以遞增濃度加入安瑞斯丁，并且觀察MMP-2活性的抑制。在SDS-PAGE凝膠中確定的NC1結構域是26kDa的單體和56kDa的二聚體，并且使用IV型膠原抗體通過蛋白質印跡可以觀測。遞增濃度的安瑞斯丁抑制MMP-2對基膜的降解，說明安瑞斯丁能夠結合MMP-2并且防止它降解基膜膠原。對于MMP-9觀察到類似結果。
實施例14.卡斯達丁在大腸桿菌中的重組生產使用pET22b細菌表達質粒，人卡斯達丁在大腸桿菌中作為功能蛋白質產生，該蛋白質攜帶C-末端6-組氨酸標記。
圖11A和11B分別給出了IV型膠原α2NC1結構域的核苷酸序列(SEQ ID NO5)和氨基酸序列(SEQ ID NO6)。從α2NC1(IV)/pDS載體(Neilson，E.G.等，1993，J.Bio.Chem.2688402-5；GenBank Accession No.M24766(Killen，P.D.et al.，1994))通過PCR擴增編碼卡斯達丁的序列，使用正向引物5′-CGG GAT CCT GTCAGC ATC GGC TAC CTC-3′(SEQ ID NO7)和反向引物5′-CCC AAGCTT CAG GTT CTT CAT GCA CAC-3′(SEQ ID NO8)。得到的cDNA片段用BamHI和HindIII消化并且連接到預先消化的pET22b(+)(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中。圖12給出了該構建體。該構建體位于帶有pelB前導序列的符合讀框的卡斯達丁下游和可讀框中，使位于胞質并且使可溶蛋白表達。另一個載體序列加給蛋白質編碼氨基酸MDIGINSD(SEQ ID NO13)。該序列的3′端符合讀框地連接多組氨酸標記序列。另一個載體序列位于cDNA的3′端和組氨酸標記編碼的氨基酸KLAAALE(SEQ ID NO14)之間。對陽性克隆雙鏈測序。
首先將編碼卡斯達丁的質粒構建體轉化到大腸桿菌HMS174(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中，然后轉化到BL21(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中進行表達。使用過夜細菌培養(yǎng)物接種500ml LB培養(yǎng)基。該培養(yǎng)物生長大約4小時直到細胞密度達到OD600值為0.6。然后通過加入IPTG至終濃度為0.5mM誘導蛋白質表達。誘導2小時之后，以5000×g離心收集細胞并且再次懸浮于6M胍、0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液中溶菌。對再懸浮的細胞進行短時間聲波處理，并且以12000×g離心30分鐘。以每分鐘2毫升的速度使上清液級分通過5ml Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen，Hilden，德國)4-6次。用15ml含有8M脲、0.1MNaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)的10mM或25mM或50mM咪唑的溶液洗滌，去除沒有特異性結合的蛋白質。用兩種濃度且含有8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)的咪唑溶液(125mM和250mM)從柱中洗脫出卡斯達丁蛋白質。洗脫出的蛋白質用4℃的PBS透析兩次。在透析過程中總蛋白質中的一部分沉淀下來。收集透析的蛋白質并且以大約3500×g離心分離為沉淀和上清液級分。通過BCA(Pierce Chemical Co.，Rocldbrd，Illinois，USA)和定量SDS-PAGE分析測定各級分中的蛋白質濃度。SDS-PAGE表明有大約26-32kDa單體泳帶，最可能是27kDa，其中3kDa來自多連接體和組氨酸標記序列。合并含有卡斯達丁的洗脫液并且用PBS透析用于下面的分析。通過SDS-PAGE和蛋白質印跡分析卡斯達丁蛋白質，并且通過多組氨酸標記抗體進行檢測。也用卡斯達丁抗體檢測細菌表達的重組卡斯達丁蛋白質。
大腸桿菌表達的蛋白質優(yōu)先作為可溶性蛋白質分離出。沉淀中總的蛋白質級分是大約40％，回收的剩余60％是可溶性蛋白質。蛋白質的總產率是大約15毫克/升。
實施例15293胚胎腎細胞中卡斯達丁的表達使用pcDNA3.1真核載體在293胚胎腎細胞中也生產出作為分泌的可溶性蛋白質的人卡斯達丁，并且使用親和層析分離(沒有任何純化或檢測標記)。
使用包含α2(IV)NC1的pDS質粒(Neilson，E.G.等，1993，J；Biol.Chem.2688402-5)以這樣的方式PCR擴增卡斯達丁，使得前導信號序列符合讀框地加到pcDNA3.1真核表達載體(In Vitlogen，San Diego，California，USA)中。前導序列從全長α2(IV)鏈5′端克隆5′到NC1結構域使蛋白質分泌到培養(yǎng)基中。用側翼引物對包含卡斯達丁的重組載體測序。進一步純化無差錯cDNA克隆并且用于體外翻譯研究來證實蛋白質表達。應用氯化鈣方法(Kingston，R.E.，1996，”Calcium Phosphate Transfection，”pp.9.1.4-9.1.7，inCurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.，等，編著，Wiley和Sons，Inc.，紐約，紐約，USA)使用包含卡斯達丁的質粒和對照質粒轉染293細胞。通過遺傳霉素抗生素處理(Life Technologies/GibcoBRL，Gaithersburg，Maryland，USA)篩選轉染的克隆。在抗生素存在下細胞生長3星期直到不再有細胞凋亡。然后在T-225燒瓶中擴增克隆并且生長到匯合。然后收集上清液并且使用amicon濃縮器(Amicon，Inc.，Beverly，Massachusetts，USA)濃縮。通過SDS-PAGE，免疫印跡分析和ELISA對濃縮的上清液分析卡斯達丁表達。使用卡斯達丁特異性抗體對含有卡斯達丁的上清液進行親和層析(Gunwar，S.等，1991，J.Biol.Chem.26615318-24)。鑒定主峰含有大約24kDa的純單體，其與卡斯達丁抗體(抗-α2NC1抗體，1∶200稀釋度)發(fā)生免疫反應。
實施例16卡斯達丁抑制內皮細胞增殖牛主動脈內皮(C-PAE)細胞在含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM中生長至匯合并且保持接觸抑制48小時。37℃下利用胰蛋白酶作用(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)5分鐘收獲細胞。向包被有10μg/ml纖連蛋白的24-孔平板的每一個孔中加入含有12500個細胞和0.5％ FCS的DMEM懸浮液。在37℃、5％CO2和95％濕度下將細胞溫育24小時。去除培養(yǎng)基并且用含有0.5％FCS(沒有刺激)或者10％FCS(刺激和處理的細胞)的DMEM代替。786-0、PC-3和HEK293細胞作為對照并且也生長至匯合，受胰蛋白酶作用并且以同樣的方法制成平板。用0.025～40μg/ml濃度范圍的卡斯達丁或內靜素處理細胞，重復三次。在胸苷摻入實驗中，在處理時所有的細胞接受1mCurie的3H-胸苷。24小時之后，去除培養(yǎng)基并且用PBS洗滌孔三次。用1N NaOH抽提細胞的放射性并且加給含有4ml ScintiVerse II(Fisher Scientific，Pittsburgh，Pennsylvania，USA)溶液的閃爍瓶。使用閃爍計數器測定胸苷插入。
圖13A和13B給出結果，圖13A是說明不同量的卡斯達丁對C-PAE細胞增殖的作用的直方圖。y-軸是每分鐘胸苷摻入量。x-軸上”0.5％”是0.5％FCS(沒有刺激)對照，”10％”是10％FCS(刺激)對照。遞增濃度的卡斯達丁處理能穩(wěn)定減少胸苷摻入。圖13B是說明遞增量的卡斯達丁對非內皮細胞786-O(斑點條框)、PC-3(斜杠條框)和HEK293(白色條框)中胸苷摻入作用的直方圖。y-軸是每分鐘胸苷摻入量，x-軸表示，對于三個細胞系中的每一個，0.5％FCS(沒有刺激)、10％FCS(刺激)對照都用遞增濃度的卡斯達丁。所有的組代表三次重復的樣品，并且條框代表每分鐘的平均量±平均值的標準誤差。
也進行亞甲基藍染色。向各孔中加入3100個細胞并且如上所述處理，然后應用Oliver等(Oliver，M.H.等，1989，J Cell.Science 92513-8)的方法計數。所有的孔用100ml的1X PBS洗滌一次并且通過加入100ml的10％福爾馬林中性緩沖鹽水溶液(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，Missouri，USA)在室溫下將細胞固定30分鐘。去除福爾馬林之后，室溫下用1％亞甲基藍溶液(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)對細胞染色30分鐘。去除染色溶液之后，用100ml的0.01M硼酸鹽緩沖液(pH8.5)將孔洗滌5次。室溫下用100ml的0.1N HCl/乙醇(1∶1混合物)從細胞萃取亞甲基藍1小時。在微量滴定板(BioRad，Hercules，California，USA)上使用655nm波長吸光度測定亞甲基藍染色量。
圖13C和13D給出結果。圖13C是說明遞增量的卡斯達丁對C-PAE細胞攝取染料的作用的直方圖。y-軸是OD655的吸光度?！?.1％”代表0.1％FCS處理(沒有刺激)對照，”10％”是10％FCS處理(刺激的)對照。剩下的條框代表使用遞增濃度的卡斯達丁處理。在C-PAE細胞中，染料攝取降至未刺激細胞中可見到的卡斯達丁處理水平0.625-1.25μg/ml。圖13D是說明不同濃度的卡斯達丁對非內皮細胞HEK293(白色條框)和PC-3(斜杠條框)的作用的直方圖。y-軸是OD655的吸光度。”0.1％”代表0.1％FCS處理(沒有刺激)對照，“10％”是10％FCS處理(刺激的)對照。條框代表655nm處相對吸光度單位的平均值±每個處理濃度8個孔的標準誤差。
用大約0.5μg/ml的ED50值檢測10％血清刺激內皮細胞的劑量-依賴性抑制作用(圖13A和13C)。在最大40mg/ml卡斯達丁劑量下，對腎癌細胞(786-O)、前列腺癌細胞(PC-3)或者人胚胎腎細胞或者(HEK293)的增殖沒有發(fā)現明顯作用(圖13B和13D)。這種內皮細胞特異性表明卡斯達丁可能是特別有效的抗血管生成物質。
實施例17卡斯達丁抑制內皮細胞遷移在血管生成過程中，內皮細胞不僅增殖而且遷移。因此，評價了卡斯達丁對內皮細胞遷移的作用。應用Boyden室測試(Neuro-Probe，Inc.，Cabin John，Maryland，USA)，利用人臍帶內皮細胞(HUVECs)測試卡斯達丁和內靜素對FBS-誘導的趨化性的抑制作用。HUVECs細胞在含有10％FBS和5ng/mlDiIC18(3)活體熒光染料(MolecularProbes，Inc.，Eugene，Oregon，USA)的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。受胰蛋白酶作用之后，在含有0.5％FBS的M199中洗滌并稀釋細胞，在有或沒有卡斯達丁(0.01或1.00mg/ml)時在上室孔中接種60000個細胞。將含有2％FBS的M199培養(yǎng)基放置于下室中作為chemotactant。用8微米孔徑的聚碳酸酯過濾器(Poretics Corp.，Livermore，California，USA)將含有細胞的隔室和chemotactant分開。在37℃、5％CO2和95％濕度下溫育4.5小時。棄去沒有遷移的細胞并且用PBS沖洗上面的細胞之后，用塑料片刮過濾器，固定在4％甲醛PBS溶液中，并且置于載玻片上。利用高強度熒光場，通過數字SenSysTM相機記錄幾個獨立的同質圖象，所述數字相機用成像處理軟件PMIS(Roper Scientific/Photometrics，Tucson，Arizona，USA)操作。使用OPTIMAS6.0軟件(Media Cybernetics，Rochester，NY)計數細胞(Klemke，R.L.等，1994，J.Cell.Biol.127859-66)。
圖14給出結果，圖14是條形圖，說明對于沒有VEGF(沒有VEGF或者血清)，和有VEGF(1％FCS和10ng/ml VEGF)細胞的處理，和對于0.01卡斯達丁(1％FCS和10ng/ml VEGF和0.01μg/ml卡斯達丁)和1.0μg/ml卡斯達丁(1％FCS和10ng/ml VEGF和1μg/mi卡斯達丁)的處理每個條框區(qū)(y-軸)遷移的內皮細胞的數目。
卡斯達丁抑制HUVECs的遷移，10ng/ml時觀察到明顯作用。卡斯達丁抑制內皮細胞的增殖和遷移的能力提示其在血管生成過程中以一步以上的步驟工作。或者，卡斯達丁可以作為既能影響增殖又能影響遷移的刺激的內皮細胞的程序性細胞死亡信號而起作用。對于另一種抗生血管分子制管張素報道過程序性細胞死亡誘導作用(O′Reilly，M.S.等，1994，Cell 79315-28；Lucas，R.等，1998，Blood 924730-41)。
實施例18卡斯達丁抑制內皮管形成作為卡斯達丁抗生血管能力的第一個試驗，評價其在Matrigel中的內皮細胞破壞管形成的能力，其中所述Matrigel是從肉瘤腫瘤衍生的小鼠基膜蛋白質的固體凝膠。當在Matrigel上培養(yǎng)小鼠主動脈內皮細胞時，它們很快地排列并且形成空管樣結構(Grant，D.S.等，1994，Pathol.Res.Pract.190854-63)。
將Matrigel(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)(320微升)加到24-孔平板的每一個孔中并且使聚合(Grant，D.S.等，1994，上文)。25,000個小鼠主動脈內皮細胞(MAE)在沒有抗生素的EGM-2培養(yǎng)基(Clonetics Corporation，San Diego，California，USA)中的懸浮液注入Matrigel包被的每一個孔中。用遞增濃度的卡斯達丁、BSA、無菌PBS或者α5-NC1結構域處理細胞。所有的測試都重復進行三次。細胞在37℃下溫育24-48小時并且使用CK2 Olympus顯微鏡(3.3目鏡，10X物鏡)觀察。然后使用400 DK套裝TMAX膠片(Kodak)對細胞照像。用diff-quik定影劑(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)對細胞染色并且再次照像(Grant，D.S.等，1994，Pathol.Res.Pract.190854-63)。觀察10個場，計數管數并且取平均值。
圖15給出結果，就是說明BSA(□)、卡斯達丁(■)和α5NC1(○)不同處理下作為對照(PBS-處理孔)管形成百分比(y-軸)的管形成量的圖。垂直線代表平均值的標準誤差。結果表明卡斯達丁相對對照物來說大大減少內皮管形成。
293細胞中產生的卡斯達丁以依賴于劑量的方式選擇性抑制內皮管形成，加入1mg的卡斯達丁可見到幾乎完全抑制管形成(圖15)。不管是對照蛋白質，還是牛血清白蛋白(BSA)，還是IV型膠原α5鏈NC1結構域，對內皮管形成都沒有作用，證明該項實驗中卡斯達丁抑制作用對卡斯達丁是特異性的，并且不是由于加入的蛋白質含量。這些結果表明卡斯達丁是一種抗生血管物質。
實施例19卡斯達丁對ERK激活的作用為了進一步理解卡斯達丁抗增殖和抗遷移活性中涉及的分子機理，評價了卡斯達丁對20％胎牛血清和內皮促細胞分裂劑誘導的ERK(胞外信號-調節(jié)激酶)激活的作用。在補充有20％FBS、1％青霉素/鏈霉素、100μg/ml肝素和50μg/ml內皮促細胞分裂劑(Biomedical Technologies，Inc.，Cambridge，Massachusetts，USA)的McCoy′s培養(yǎng)基中將HUVEC細胞培養(yǎng)過夜。第二天，洗滌細胞并且在低血清培養(yǎng)基(補充有1％青霉素/鏈霉素、100μg/ml肝素和5％FBS的McCoy′s培養(yǎng)基)中培養(yǎng)4小時。4小時之后，用有或沒有20μg/ml卡斯達丁的新鮮低血清培養(yǎng)基置換培養(yǎng)基。1小時之后，將血清濃度調節(jié)到20％并且加入促內皮細胞分裂劑至最終濃度是50μg/ml。在0、5、10、25和40分鐘，細胞用PBS洗滌并且用被動溶胞混合物(Promega，Madison，Wisconsin，USA)加亮抑酶肽、PMSF、NaF、Na3VO4、β-甘油磷酸酯和焦磷酸鈉溶胞。對溶胞產物定量測定蛋白質濃度并且在12％SDS-PAGE凝膠上分離。使用磷酸ERK的抗體(New England Biolabs，Beverly，Massachusetts，USA)對血清處理的和血清+卡斯達丁處理的HUVECs進行磷酸-ERK蛋白質印跡。生長因子刺激5分鐘之內證實HUVECs中的ERK磷酸化作用。20μg/ml的卡斯達丁處理不影響ERK的早期激活。在較后的時間點發(fā)現ERK磷酸化作用降低，是與幾種促細胞分裂劑觀察到的響應相吻合的曲線(Gupta，K.等，1999，Exp.Cell.Res.247495-504；Pedram，A.等，1998，J.Biol.Chem.27326722-26728)。這些觀察表明卡斯達丁不主要通過抑制由VEGF或bFGF受體激活地近中心作用而工作。
實施例20卡斯達丁誘導內皮細胞程序性死亡膜聯蛋白V-FITC標記.為了確定程序性細胞死亡作為卡斯達丁作用的潛在模式，使用膜聯蛋白V-FITC標記外部磷脂酰絲氨酸(PS)來評價程序性細胞死亡細胞。向6-孔組織平板的每一個孔加入0.5×106的C-PAE細胞、PC-3、786-O和HEK293細胞，在補加有10％FBS的DMEM(BioWhittaker，Walkersville，Maryland，USA)中培養(yǎng)過夜。向各孔中加入新鮮培養(yǎng)基和40ng/ml TNF-α(正對照)或者15μg/ml卡斯達丁。對照孔接受等體積的PBS。處理24小時之后，收集含有分離的細胞的培養(yǎng)基并且將粘著細胞胰蛋白酶作用，并且與分離的細胞混合，以3000×g離心。然后沖洗細胞，根據廠商說明用FITC-標記的膜聯蛋白V(Clontech，Palo Alto，California，USA)進行標記來測定磷脂?；?絲氨酸外表化作用(早期程序性細胞死亡指征)。使用FACStar Plus流式細胞儀(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)計數膜聯蛋白-FITC標記的細胞。對于每一次處理，計數15000個細胞并且排列貯存。然后使用標準Cell Quest軟件(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)分析該數據。
發(fā)現卡斯達丁特異性誘導內皮細胞程序性死亡，而對PC-3、786-O或HEK 293細胞系沒有觀察到顯著作用。
FLIP蛋白質水平.和上文對于ERK測試一樣處理HUVEC細胞，并且在0、1、3、6和24時收集。使用FLIP的抗體(Sata，M.等，1998，J.Biol Chem.27333103-33106)定量測定血清處理的HUVEC細胞和血清+卡斯達丁處理的HUVEC細胞中FLIP蛋白質水平并且使用粘著斑蛋白水平對蛋白質負載規(guī)格化，并且以0小時時間點的百分比作圖。
圖16給出結果，圖16是作為t＝0(y-軸)時存在的蛋白質百分比的粘著斑蛋白水平隨著時間(x-軸)的函數的FLIP蛋白質水平的圖。用卡斯達丁處理之后1小時FLIP蛋白質水平有所降低，持續(xù)至血清刺激后24小時，表明卡斯達丁的程序性細胞死亡作用可能由Fas激活的程序性細胞死亡抑制劑FLIP介導的。因為內皮細胞組成型表達Fas和FasL(Sata，M.等，上文)，可能的是FLIP降低觸發(fā)caspase激活并且傳送終端程序性細胞死亡信號。
實施例21卡斯達丁體內抑制腫瘤生長從培養(yǎng)物收集人前列腺癌細胞(PC-3細胞)對7至9周齡雄性SCID小鼠皮下注射二百萬細胞的無菌PBS懸浮液。腫瘤生長大約4星期之后，將小鼠分為四只一組。對實驗組每天I.P.注射總體積0.1毫升PBS的10mg/kg劑量的卡斯達丁。對照組每天接受等體積的PBS。處理開始時(第0天)，對照小鼠腫瘤范圍是88mm3至135mm3體積，卡斯達丁處理小鼠腫瘤范圍是108mm3至149mm3體積。每組包括5只小鼠。在指定天數計算的腫瘤體積除以處理第0天的體積，得到分數腫瘤體積(V/V0)。圖17A給出了結果，圖17A是說明對處理天數(x-軸)作圖的分數腫瘤體積(y-軸)±標準誤差的圖。卡斯達丁-處理的(■)的腫瘤相對對照組(□)大小只有少量增加。
在第二個PC-3實驗中，從培養(yǎng)物收集PC-3細胞并且皮下注射給6至7周齡雄性無胸腺裸鼠，將動物分為4只小鼠的組之后讓腫瘤皮下生長大約2星期。對實驗組(4只小鼠)每天I.P.注射總體積0.2毫升PBS中3mg/kg劑量的卡斯達丁或者相同PBS體積中8mg/kg劑量的內靜素。對照組(4只小鼠)每天接受等體積的PBS。用游標卡尺測量腫瘤的長和寬，并且利用標準公式計算腫瘤體積寬2×長×0.52。腫瘤體積范圍是26mm3至73mm3，并且在指定天數計算的腫瘤體積除以處理第0天的體積，得到分數腫瘤體積(V/V0)，如上所述。圖17B給出了結果，圖17B是說明對處理天數(x-軸)作圖的分數腫瘤體積(y-軸)±標準誤差的圖。相對于對照組(□)，卡斯達丁-處理的(■)的腫瘤大小只有少量增加，并且這些結果順利地與用內靜素(○)實現的那些相比較。
對于腎細胞癌細胞模型，7至9周齡雄性無胸腺裸鼠皮下注射2百萬786-O細胞。讓腫瘤生長至大約100mm3或者大約700mm3。每組包括6只小鼠。每天以10mg/kg濃度I.P.注射無菌PBS中的卡斯達丁。對照組接受等體積的PBS。結果見圖17C(100mm3腫瘤)和15D(700mm3腫瘤)。在兩個組中，卡斯達丁-處理(■)腫瘤實際上相對于對照組(□)收縮。
與安慰劑處理的小鼠相比，大腸桿菌中產生的卡斯達丁分別抑制小(100mm3，圖17C)和大(700mm3，圖17D)腎細胞癌(786-O)腫瘤的生長4-倍和3-倍。對于結合嚴重免疫缺陷(SCID)小鼠的確診的人前列腺(PC-3)腫瘤，10mg/kg的卡斯達丁占僅注射賦形劑小鼠的55％分數腫瘤體積(比其小1.8-倍)。在無胸腺(nu/nu)小鼠中，處理的腫瘤比安慰劑處理的小鼠的小2.4倍。腫瘤大小的減小與CD-31-正脈管系統中的降低相吻合(參見下文實施例29)。在無胸腺小鼠中，使用低劑量的卡斯達丁和內靜素，3mg/kg的卡斯達丁和8mg/kg的內靜素一樣具有相同的抑制作用，5mg/kg劑量的內靜素不能抑制腫瘤生長。在所有的體內研究中，小鼠表現健康，沒有消瘦現象，并且在處理期間沒有一只小鼠死亡。
實施例22卡斯達丁處理小鼠的CD31免疫組織化學體內腫瘤的減小提示對這些腫瘤中血管形成的抑制作用。在異種移植腫瘤研究最后殺死小鼠并且將腫瘤切除。為了測定腫瘤血管，對石蠟包埋的腫瘤切片進行CD31抗體堿性磷酸酶-偶聯的免疫組織化學反應。將切除的腫瘤切成幾個大約3-4mm厚的片，然后固定在4％多聚甲醛中24小時。在脫水和石蠟包埋之前使組織接觸PBS24小時。在石蠟中包埋之后，切下3mm組織切片并且固定。將切片去石蠟，37℃下用300mg/ml蛋白酶XXIV(SIGMA Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)再水合和預處理5分鐘。用100％乙醇終止消化并且在空氣中風干切片，用10％兔血清再水合和封閉。然后將玻片在4℃下與大鼠抗小鼠CD-31單克隆抗體(PharMingen，San Diego，California，USA)的1∶50稀釋液一起溫育過夜，接著37℃下連續(xù)兩次在兔抗大鼠免疫球蛋白(DAKO)和大鼠APAAP(DAKO)的1∶50稀釋液中各溫育30分鐘。用新洋紅進行顏色反應，并且用蘇木紫對切片對比染色。
發(fā)現卡斯達丁處理的腫瘤中腫瘤的減小與CD31正脈管系統減少相吻合。
實施例23塔牡斯達丁和塔牡斯達丁突變體在大腸桿菌中的重組生產圖18A和18B分別給出了IV型膠原NC1結構域的α3鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO9)和氨基酸序列(SEQ ID NO10)。從α3 NC1(IV)/pDS載體(Neilson，E.G.等，1993，J.Bio.Chem.2688402-5；GenBank Accession No.M92993(Quinones，S.等，1994)，M81379.(Turner，N.等，1994)，和X80031(Leionin，A.K.，和Mariyama，M.等，1998))通過PCR擴增編碼塔牡斯達丁的序列，使用正向引物5′-CGG GAT CCA GGT TTG AAA GGA AAA CGT-3′(SEQ IDNO11)和反向引物5′-CCC AAG CTT TCA GTG TCT TTT CTT CAT3′(SEQ ID NO12)。得到的cDNA片段用BamHI和HindIII消化并且連接到預先消化的pET22b(+)(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中。圖19給出了該構建體。該連接位于帶有pelB前導序列的符合讀框的塔牡斯達丁下游和可讀框中，以位于胞質并且使可溶蛋白表達。另一個載體序列加給蛋白質編碼氨基酸MDIGINSD(SEQ IDNO13)。該序列的3′端符合讀框地連接多組氨酸標記序列。另一個載體序列位于cDNA的3′端和組氨酸標記編碼的氨基酸KLAAALE(SEQ ID NO14)之間。對陽性克隆雙鏈測序。首先將編碼塔牡斯達丁的質粒構建體轉化到大腸桿菌HMS174(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中，然后轉化到BL21(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中進行表達。使用過夜細菌培養(yǎng)物接種500ml LB培養(yǎng)基(FisherScientific，Pittsburgh，Pennsylvania，USA)。該培養(yǎng)物生長大約4小時直到細胞密度達到OD600為0.6。然后通過加入IPTG至終濃度為1mM誘導蛋白質表達。誘導2小時之后，以5000×g離心收集細胞并且再次懸浮于含有6M胍、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)的溶液中溶菌。對再懸浮的細胞進行短時間聲波處理，并且以12000×g離心30分鐘。以每分鐘2毫升的速度使上清液級分通過5mlNi-NTA瓊脂糖柱(Qiagen，Hilden，德國)4-6次。用含有8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)和10mM或25mM咪唑的溶液洗滌，去除沒有特異性結合的蛋白質。用遞增濃度并含有8M脲、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)的咪唑(50mM、125mM和250mM)從柱中洗脫出塔牡斯達丁蛋白質。洗脫出的蛋白質用4℃的PBS透析兩次。在透析過程中總蛋白質中的一部分沉淀下來。收集透析的蛋白質并且以大約3500×g離心分離為不溶的(沉淀)和可溶的(上清液)級分。
大腸桿菌表達的塔牡斯達丁優(yōu)先作為可溶性蛋白質分離出，并且SDS-PAGE分析表明有31kDa單體泳帶。另外的3kDa來自多連接體和組氨酸標記序列。在下面的實驗中使用含有該泳帶的洗脫的級分。通過BCA測定(Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，USA)和定量SDS-PAGE分析，使用掃描測光密度術測定各級分的蛋白質濃度。在還原條件下，觀察到的大約60kDa的帶代表確定為31kDa單帶的非還原條件下塔牡斯達丁的二聚體。蛋白質的總產率大約是每升5毫克。
大腸桿菌中產生重組截短的缺少53個N末端氨基酸的塔牡斯達丁(塔牡斯達丁-N53)，并且根據先前對于另一種突變體的描述(Kallun，R.等，1996，J Biol.Chem.2719062-8)進行純化。該突變體如圖20所示，它是一個組成圖，說明α3(IV)NC1單體中截短的氨基酸的位置。實心圓圈相應于從塔牡斯達丁缺失N-末端53個氨基酸殘基，產生′塔牡斯達丁-N53′(Kalluri，R.等，1996，J Biol.Chem.2719062-8)。短線標出的二硫鍵和它們在α1(IV)NC1和α2(IV)NC1中一樣排列(Siebold，B.等，1988，Eur.J.Biochem.176617-24)。為清楚起見，只標出兩個可能的二硫鍵構型中的一個。
按前述方法，制備抗人α3(IV)NC1的兔抗體(Kalluri，R.等，1997，J.Clin.Invest.992470-8)。單克隆大鼠抗小鼠CD31(血小板內皮細胞粘著分子，PECAM-1)抗體購自PharMingen(San Diego，California，USA)。FITC偶聯的山羊抗大鼠IgG抗體、FITC偶聯的山羊抗兔IgG抗體和辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔IgG抗體均購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Missouri，USA)。
通過SDS-PAGE和如上所述對于塔牡斯達丁表達的免疫印跡分析(Kalluri，R.等，1996，J.Biol.Chem.2719062-8)分析上面獲得的濃上清液。使用12％解析凝膠和不連續(xù)緩沖系統進行一維SDS-PAGE。將分離的蛋白質移至硝基纖維素膜并且在室溫下用2％BSA封閉30分鐘。封閉剩余的結合位點之后，用洗滌緩沖液充分洗滌膜并且以在含有1％BSA的PBS中1∶1000的稀釋度與一抗溫育。在搖床上室溫下溫育過夜。然后用洗滌緩沖液充分洗滌印跡并且與辣根過氧化物酶偶聯的二抗在室溫下在搖床上溫育3小時。然后充分洗滌印跡并且加入底物(含有0.01％氯化鈷和鎳銨的0.05M磷酸緩沖液中的二氨基聯苯胺)并且在室溫下溫育10分鐘。然后倒出底物溶液，并且加入含有過氧化氫的底物緩沖液。
出現帶之后，用蒸餾水終止反應，并且干燥印跡?？吹?1kDa的單一帶。
實施例24293胚胎腎細胞中塔牡斯達丁的表達使用pcDNA3.1真核載體在293胚胎腎細胞中也生產出作為分泌的可溶性蛋白質的人塔牡斯達丁。使用親和層析分離(沒有任何純化或檢測標記)該重組蛋白質，然后通過SDS-PAGE和免疫印跡分析在主峰中檢測出純單體形式。
使用包含α3(IV)NC1的pDS質粒(Neilson，E.G.等，1993，J；Biol.Chem.2688402-5)以這樣的方式PCR擴增塔牡斯達丁，使得前導信號序列符合讀框地加到pcDNA 3.1真核表達載體(In Vitlogen，San Diego，California，USA)中。前導序列從全長α3(IV)鏈5′端克隆5′到NC1結構域使蛋白質分泌到培養(yǎng)基中。用側翼引物對包含塔牡斯達丁的重組載體雙鏈測序。進一步純化無差錯cDNA克隆并且用于體外翻譯研究來證實蛋白質表達。應用氯化鈣方法(Sambrook，J.et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA，pps.16.32-16.40)使用包含塔牡斯達丁的質粒和對照質粒轉染293細胞。通過遺傳霉素抗生素處理(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)篩選轉染的克隆。在抗生素存在下細胞生長3星期直到不再有細胞凋亡。然后在T-225燒瓶中擴增克隆并且生長到匯合。然后收集上清液并且使用amicon濃縮器(Amicon，Inc.，Beverly，Massachusetts，USA)濃縮。通過SDS-PAGE、免疫印跡分析和ELISA對濃縮的上清液分析塔牡斯達丁表達。通過ELISA檢測上清液中的強結合。
使含有塔牡斯達丁的上清液進行親和層析，并且用抗-塔牡斯達丁和抗-6-組氨酸標記抗體(Gunwar，S.等，1991，J.Biol.Chem.26615318-24)進行免疫檢測。鑒定主峰含有大約31kDa單體，其與塔牡斯達丁抗體發(fā)生免疫反應。
實施例25塔牡斯達丁抑制內皮細胞增殖通過使用大腸桿菌生產的可溶性蛋白質進行3H-胸苷摻入實驗來測定塔牡斯達丁對C-PAE細胞的抗-增殖作用。
細胞系和培養(yǎng)。從美國典型培養(yǎng)物收集保藏中心獲得786-O(腎清細胞癌細胞系)、PC-3(人前列腺癌細胞系)、C-PAE(牛肺動脈內皮細胞系)、HPE(人初期前列腺內皮細胞)、HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)、MAE(小鼠主動脈內皮細胞系)。786-O和C-PAE細胞系在含有10％胎牛血清(FCS)、100單位/毫升的青霉素、100mg/ml的鏈霉素和10％胎牛血清(FCS)的DMEM(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)中保持，HPE細胞在補充有牛腦垂體提取物和重組人EGF(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)的角質細胞-SFM中保持，而HUVEC和MAE細胞在EGM-2(Clonetics Corporation，San Diego，California，USA)中保持。
增殖測試。C-PAE細胞在含有10％FCS的DMEM中生長至匯合并且保持接觸抑制48小時。使用第二代和第四代之間的C-PAE細胞。在該實驗中786-O和PC-3細胞用作非內皮對照物。37℃下利用胰蛋白酶作用(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)5分鐘收獲細胞。向包被有10μg/ml纖連蛋白的24-孔平板的每一個孔中加入含有12500個細胞和0.1％FCS的DMEM的懸浮液。在37℃、5％CO2和95％濕度下將細胞溫育24小時。去除培養(yǎng)基并且用含有20％FCS的DMEM代替。沒有刺激的對照細胞與0.1％FCS溫育。用0.01～10mg/ml濃度范圍的各種濃度的塔牡斯達丁處理細胞。在開始處理之后，所有的孔接受1mCurie的3H-胸苷。24小時之后，去除培養(yǎng)基并且用PBS洗滌孔三次。用1N NaOH抽提細胞并且加到含有4ml ScintiVerse II(Fisher Scientific，Pittsburgh，Pennsylvania，USA)溶液的閃爍瓶。使用閃爍計數器測定胸苷插入。
在亞甲基藍染色方法中，向96孔平板中的各孔中加入7000個細胞并且如上所述處理。然后應用Oliver等(Oliver，M.H.等，1989，J Cell.Science 92513-8)的方法對細胞計數。處理48小時之后，所有的孔用100微升的PBS洗滌一次并且通過加入10％福爾馬林中性緩沖鹽水溶液(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)將細胞固定。用含有1％亞甲基藍溶液(Sigma)的0.01M硼酸鹽緩沖液(pH8.5)對細胞染色。用0.01M硼酸鹽緩沖液將孔洗滌，并且用0.1NHCl/乙醇從細胞萃取亞甲基藍，在微量滴定板(BioRad，Hercules，California，USA)上使用655nm波長測定吸光度。使用終濃度是5微克/毫升的多粘菌素B(Sigma)來滅活內毒素(Liu，S.等，1997，Clin.Biochem.30455-63)。
圖21A、21B和21C給出結果，它們說明當用不同量的塔牡斯達丁(x-軸)處理時，C-PAE細胞(圖21A)、PC-3細胞(圖21B)和786-O細胞(圖21C)的3H-胸苷摻入(y-軸)的直方圖。所有的組代表三次重復的樣品。塔牡斯達丁以劑量依賴方式顯著抑制20％FCS刺激的3H-胸苷摻入，ED50大約是0.01mg/ml(圖21A)。而且，即使在至多20mg/ml的塔牡斯達丁劑量下，對前列腺癌細胞(PC-3)或者腎癌細胞(786-O)沒有發(fā)現顯著的抗增殖作用(圖21B和21C)。3H-胸苷摻入平均值在塔牡斯達丁處理的(0.1-10mg/ml)和對照物中之間的差異是顯著的(P＜0.05)。當使用塔牡斯達丁處理PC-3細胞或者786-O細胞時，沒有發(fā)現抑制作用(圖21B，21C)。每一條框代表平均值±三個孔的SE。該項實驗重復三次。星號標記的條框是統計學意義的，t-試驗測得P＜0.05。
實施例26競爭增殖測試如上所述用C-PAE細胞制成96-孔板用于內皮細胞增殖測試。終濃度是0.1μg/ml的塔牡斯達丁與不同濃度(0、0.008、0.08、0.8、1.6和2.4μg/ml)的人αVβ3蛋白質(CHEMICON International，Temecula，California，USA)在室溫下溫育30分鐘。然后將該混合物加到孔中，并且溫育48小時。然后利用上文內皮細胞增殖測試所述的亞甲基藍染色方法進行增殖測試。
結果如圖22所示，圖22是說明x-軸上與遞增量的αVβ3結合的0.1μg/ml的塔牡斯達丁對C-PAE細胞攝入染料的影響的直方圖。y-軸是OD655吸光度?！?.1％FCS”代表0.1％FCS處理的(沒有刺激)對照物，“20％FCS”是20％FCS處理的(刺激的)對照物。其余條框代表單獨αVβ3的對照，和使用塔牡斯達丁加遞增濃度的αVβ3的處理。每一條框代表三個孔的平均值±平均標準誤差。該項實驗重復三次。星號標記指示t-試驗測得P＜0.05。
如上所述，塔牡斯達丁一般以劑量依賴方式抑制細胞增殖。但是加入αVβ3整聯蛋白時，塔牡斯達丁的抗增殖作用以劑量依賴方式與αVβ3蛋白的遞增濃度呈反比，表明αVβ3整聯蛋白有效地“飽和了”抑制內皮細胞增殖的塔牡斯達丁。2.4μg/ml的αVβ3(3倍摩爾過量)顯著逆轉塔牡斯達丁誘導的抗增殖作用達43.1％。單獨用αVβ3處理沒有抑制內皮細胞增殖。
實施例27塔牡斯達丁誘導內皮細胞程序性死亡膜聯蛋白V-FITC測試。在程序性細胞死亡早期，發(fā)現膜磷脂PS從質膜內表面易位到外部(van Engeland，M.等，1998，Cytometry311-9；zhang，G.等，1997，Biotechniques 23525-531；Koopman，G.等1994，Blood 841415-1420)。通過使用本質對PS有高結合親和性的膜聯蛋白V的FITC偶聯物進行染色可以檢測外部化PS(vanEngeland，上文)。因此可以使用膜聯蛋白V-FITC標記來評價用塔牡斯達丁處理時內皮細胞的程序性細胞死亡細胞。
將C-PAE細胞(0.5×106/孔)接種到補加裝有10％FBS的DMEM的6孔平板上。第二天，加入含有10％FCS的新鮮培養(yǎng)基和80ng/ml的TNFα(正對照)或者0.02-20μg/ml的塔牡斯達丁。對照細胞接受等體積的PBS。處理18小時之后，收集含有漂浮細胞的培養(yǎng)基，并且用胰蛋白酶處理粘著細胞，與漂浮細胞一起以3000×g離心。然后用PBS沖洗細胞，再次懸浮于結合緩沖液(10mM HEPES/NaOH，pH7.4，140mM NaCl，2.5mMCaCl2)。加入膜聯蛋白V-FITC(Clontech，Palo Alto，California，USA)至最終濃度150ng/ml，將細胞避光下溫育10分鐘。再次用PBS洗滌細胞并且再次懸浮于結合緩沖液。使用FAC Star Plus流式細胞儀(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)計數膜聯蛋白-FITC標記的細胞。對于每一次處理，計數15000個細胞并且排列貯存。然后使用Cell Quest軟件(Becton-Dickinson，Waltham，Massachusetts，USA)分析該數據。
18小時之后20μg/ml的塔牡斯達丁表現出膜聯蛋白熒光峰的顯著位移。對于20μg/ml的塔牡斯達丁和正對照TNF-α(80ng/ml)來說，熒光強度位移是相似的。2μg/ml的塔牡斯達丁也表現出膜聯蛋白熒光強度中等位移，但是濃度低于0.2μg/ml證明沒有任何膜聯蛋白V確定性。當使用非內皮細胞(PC-3)時沒有發(fā)現峰強度位移。
根據相對比顯微鏡的監(jiān)測，塔牡斯達丁也改變了C-PAE細胞的細胞形態(tài)。在纖連蛋白包被的平板上，在10％FCS存在時用20μg/ml的塔牡斯達丁處理細胞24小時之后，可以觀察到程序性細胞死亡、膜泡、胞質收縮和染色質縮合的典型的形態(tài)特征。在對照孔中，細胞表現出完整的形態(tài)學。
Caspase-3測試。Caspase-3(CPP32)是程序性細胞死亡早期激活的胞內蛋白酶，通過降解結構蛋白和DNA修復蛋白而引發(fā)細胞破碎(Casciola-Rosen，L.等，1996，J Exp.Med.1831957-1964；Salvesen，G.S.等，1997，Cell 91443-446)?？梢酝ㄟ^檢測從標記的底物(DEVD-pNA)裂解的發(fā)色團(對硝基苯胺)來用分光光度法測定Caspase-3的蛋白酶活性。
C-PAE細胞或者PC-3細胞(0.5×106/孔)接入10％FCS的DMEM中，并在預先包被有纖連蛋白(10μg/ml)的6孔平板培養(yǎng)溫育過夜。第二天，用含有2％FCS的DMEM置換培養(yǎng)基后，在37℃下溫育過夜。然后用含有2％FCS和TNFα(80ng/ml，正對照)或者塔牡斯達丁(10μg/ml)的DMEM溶液中的bFGF(3ng/ml)刺激細胞，溫育24小時。對照物接受PBS緩沖液。24小時之后，收集上清液細胞并且用胰蛋白酶處理粘著細胞，與上清液細胞合并。計數細胞并且以4×107細胞/毫升的濃度再次懸浮于細胞溶解緩沖液(Clontech，PaloAlto，California，USA)中。接下來的方案根據廠商說明(Clontech，PaloAlto，California，USA)。使用Caspase-3的一種特異性抑制劑DEVD-fmk(Asp-Glu-Val-Asp-氟甲基酮)來證實測試的特異性。在微量滴定平板讀數器(Bio-Rad，Hercules，California，USA)上在405nm下測定吸光度。對于每種細胞類型測定重復三次。
圖23A和23B給出了結果，圖23A和23B是一對直方圖，說明不同各種處理下(x-軸)，C-PAE細胞(圖23A)和PC-3細胞(圖23B)的Caspase-3活性對OD405吸光度(y-軸)的函數。每個條框柱代表三個孔的平均值+/-標準誤差。
用20μg/ml的塔牡斯達丁處理的C-PAE細胞表現出Caspase-3活性提高1.6倍，而正對照TNF-α與對照物相比表現出可比較的(1.7倍)提高。Caspase-3的具體的指示劑DEVD-fmk將蛋白酶活性降低至基線，表明測定的活性的提高對于Caspase-3是特異性的。在非內皮PC-3細胞中，對照和塔牡斯達丁處理的細胞之間的Caspase-3活性沒有差異。
實施例28細胞粘著測試在整聯蛋白亞基α1至α6、β1和αVβ3整聯蛋白封閉抗體存在下，觀察了HUVECs對塔牡斯達丁包被平板的附著。對Senger等的方法(Senger，D.R.等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USS 9413612-13617)稍作改進后進行該項測試。用人塔牡斯達丁、小鼠層粘連蛋白-1或者人IV型膠原(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)以10μg/ml的濃度對96-孔板包被后在37℃下過夜。然后使用玻連蛋白(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)以0.5μg/ml的濃度包被平板。用含有100mg/ml的BSA的PBS(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA)將剩余的蛋白質結合位點封閉2小時。使HUVEC細胞在EGM-2培養(yǎng)基中生長至亞匯合(70-80％)，溫和地用胰蛋白酶處理并且再次懸浮于無血清培養(yǎng)基(1.5×105細胞/ml)。細胞與10μg/ml的小鼠IgG1(對照)(Life Technologies/Gibco BRL，Gaithersberg，Maryland，USA)或者抗體(抗人β1整聯蛋白的小鼠單克隆抗體(克隆P4C10)(LifeTechnologies/Gibco BRL，Gaithersberg，Maryland，USA)、人整聯蛋白α1至α6的單克隆抗體(CHEMICON International，Temecula，California，USA)和αVβ3整聯蛋白(克隆LM609)(CHEMICONInternafional))混合，然后并且室溫溫和攪動下溫育15分鐘。然后將100微升細胞懸浮液加給每個孔，并且在37℃下溫育45分鐘。通過洗滌去除沒有附著的細胞，用亞甲基藍染色之后計數附著細胞數目。根據上述方法，在其它實驗中使用C-PAE細胞。
圖24A至24D和圖25給出了結果，圖24A、24B、24C和24D是一組四個直方圖，說明在整聯蛋白亞基α1至α6、β1或者αVβ3整聯蛋白阻斷抗體存在下HUVEC細胞對用塔牡斯達丁(圖24A)、IV型膠原對照物(圖24B)、玻連蛋白(圖24C)或者層粘連蛋白-1(圖24D)包被的平板的結合。圖25是說明C-PAE細胞與塔牡斯達丁-包被平板結合的直方圖。在每個表的上方列出了平板包被物，每個表的x-軸是用于溫育的抗體。BSA-包被的平板用作負對照。
與IgG-包被的對照平板相比，α6、β1或者αVβ3的抗體顯著封閉與塔牡斯達丁包被平板附著的HUVEC細胞。當一起使用β1和αVβ3的抗體時細胞附著被進一步抑制。與對照IgG處理相比，αVβ3抗體抑制細胞附著80％，而α6或β1抗體封閉54％。盡管α5表現出較小的抑制作用(20％)，亞基α1至α4的抗體則不阻斷細胞附著。當一起使用αVβ3抗體和β1抗體時，細胞結合被阻斷91％。
在塔牡斯達丁包被的平板上使用C-PAE細胞代替HUVEC細胞也發(fā)現可比較的抑制作用。用IV型膠原包被平板，玻連蛋白和層粘連蛋白-1也作為對照物。α1β1和α2β1整聯蛋白結合膠原(Elices，M.J.等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci USA 869906-9910 Ignatius，M.J.等，1990，J.Cell.Biol.111709-720)。與對照組IgG溫育的細胞相比，α1(20％)、α2(27％)和β1(53％)的抗體部分抑制細胞結合到IV型膠原包被平板上。αVβ3整聯蛋白是玻連蛋白的受體(Hynes，R.O.等，1992，Cell 6911-25)。αVβ3的抗體抑制61％細胞結合到玻連蛋白包被平板上。α5β1和α6β1整聯蛋白結合層粘連蛋白(Wayner，E.A.等，1988，J.Cell.Biol.1071881-1891；Sonnenberg，A.等，1988，Nature 336487-489)。α5或α6的抗體分別阻斷50％和89％的內皮細胞結合到層粘連蛋白-1包被平板上。與IgG處理對照物相比較，β1或αVβ3的抗體顯著抑制細胞附著到塔牡斯達丁包被板上(圖25)。當一起使用β1和αVβ3的抗體時，細胞附著被進一步抑制。
實施例29塔牡斯達丁抑制內皮管形成將Matrigel(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)(320微升)加到24-孔平板的每一個孔中并且使聚合(Grant，D.S.等，1994，上文)。25000個MAE細胞在沒有抗生素的EGM-2培養(yǎng)基(Clonetics Corporation，San Diego，California，USA)中的懸浮液注入到Matrigel(Grant，D.S.等，1994，Pathol.Res.Pract.190854-63)包被的每一個孔中。用遞增濃度的塔牡斯達丁、BSA、無菌PBS或者7S結構域處理細胞。對照細胞與無菌PBS溫育。所有的測試都重復進行三次。細胞在37℃下溫育24-48小時并且使用CK2 Olympus顯微鏡(3.3目鏡，10X物鏡)觀察。然后使用400 DK套裝TMAX膠片(Kodak)對細胞照像。用diff-quik定影劑(SigmaChemical Company，St.Louis，Missouri，USA)對細胞染色并且再次照像(Grant，D.S.等，1994，Pathol.Res.Pract.190854-63)。觀察數個場，由兩名不知道實驗方案的研究人員計數管數并且取平均值。
圖26給出結果。當在小鼠基質膜蛋白固體凝膠Matrigel上培養(yǎng)小鼠主動脈內皮細胞時，它們快速排列并且形成空管樣結構(Haralabopoulos，G.C.等，1994，Lab.Invest.71575-82)。293細胞產生的塔牡斯達丁與BSA對照物(圖26)相比較，以劑量依賴方式顯著抑制MAE細胞中內皮管形成。用1mg/ml的蛋白質處理之后，管形成百分比是BSA98.0±4.0和塔牡斯達丁14.0±4.0。使用大腸桿菌產生的塔牡斯達丁也獲得了相似結果。IV型膠原的7S結構域(N末端非膠原結構域)對內皮管形成沒有作用。濃度在800-1000ng/ml之間的塔牡斯達丁獲得最大抑制。塔牡斯達丁處理(●，0.1-10mg/ml)和對照物(BSA(□)，7S結構域(○))的平均百分比值之間的差異是顯著的(P＜0.05)。每一點代表三個孔的平均值±SE。該項實驗重復三次。星號標記的數據點是顯著的，t-試驗測得P＜0.05。在7S結構域處理中發(fā)現形成完好的管。用0.8mg/ml的塔牡斯達丁處理的MAE細胞表現出減少的管形成。
為了評價體內塔牡斯達丁對新毛細管形成的作用，進行Matrigel栓測試(Passaniti，A.等，1992，Lab.Invest.67519-29)。獲得5至6周齡雄性C57/BL6小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine，USA)。Matrigel(Collaborative Biomedical Products，Bedford，Massachusetts，USA)在4℃下解凍過夜。然后與20U/ml的肝素(PierceChemical Co.，Rockford，Illinois，USA)、150ng/ml的bFGF(R&DSystems，Minneapolis，Minnesota，USA)和1mg/ml的塔牡斯達丁混合，然后注射給C57/BL6小鼠。對照組不接受生血管抑制劑。使用21規(guī)格針頭皮下注射這種matrigel混合物。14天之后，殺死小鼠并且取出matrigel栓。將matrigel栓固定在4％多聚甲醛(PBS溶液)中，在室溫下固定4小時，然后轉換到PBS中24小時。將所述栓包埋在石蠟中、切片，并且H&E染色。用光學顯微鏡檢查切片并且從10個高強度場計數血管數并且取平均值。對所有的切片編號并且由不知道研究方案的病理學家觀察。
在有或沒有大腸桿菌產生的塔牡斯達丁下，當在bFGF和肝素存在下放置Matrigel時，用1mg/ml的塔牡斯達丁處理發(fā)現血管數減少67％。每個高強度場的血管數是塔牡斯達丁2.25±1.32，對照物7.50±2.17。每一個條框代表每組5-6只小鼠的平均值±SE。與用PBS處理的對照物相比，塔牡斯達丁(1mg/ml)體內顯著抑制新血管化作用。塔牡斯達丁處理動物和對照動物的平均百分比值之間的差異是顯著的(P＜0.05)。塔牡斯達丁處理是顯著的，t-試驗測得P＜0.05。
實施例30塔牡斯達丁和塔牡斯達丁突變體體內抑制腫瘤生長收集大約5百萬PC-3細胞并且皮下注射給7至9周齡雄性無胸腺裸鼠。用游標卡尺測量腫瘤，并且利用標準公式寬2×長×0.52計算腫瘤體積。讓腫瘤生長至大約100mm3，然后將動物分為5或6只小鼠的組。對各實驗組，每日腹膜內注射無菌PBS中的塔牡斯達丁或者小鼠內靜素(20mg/kg/天)，注射10天。對照組接受賦形劑注射(BSA或PBS)。在10天中每2或3天計算腫瘤體積。結果見圖27A，圖27A是說明分別用PBS對照(□)、20mg/kg塔牡斯達丁(●)和20mg/kg內靜素(○)處理時，腫瘤體積(mm3)(y-軸)對處理天數(x-軸)的圖。大腸桿菌產生的塔牡斯達丁顯著抑制PC-3人前列腺腫瘤的生長(圖27A)。20mg/Kg的塔牡斯達丁與20mg/kg的內靜素類似，抑制腫瘤生長(圖27A)。在第10天觀察到對腫瘤生長的顯著抑制作用(對照202.8±50.0mm3，塔牡斯達丁82.9±25.2mm3，內靜素68.9±16.7mm3)。與對照物相比，每天腹膜內注射塔牡斯達丁或內靜素抑制人前列腺癌細胞(PC-3)腫瘤的生長。當腫瘤體積小于100mm3時開始該項實驗。
也研究了塔牡斯達丁對小鼠已經確診的另一種原發(fā)腫瘤的作用。對7至9周齡雄性無胸腺裸鼠背部皮下注射二百萬786-O細胞。讓腫瘤生長至大約600-700mm3，并且將動物分為6只一組。每天腹膜內注射塔牡斯達丁(6mg/kg)無菌PBS溶液，注射10天。對照小鼠接受BSA注射。結果見圖27B，圖27B是說明PBS對照(□)和6mg/kg塔牡斯達丁(●)處理時]腫瘤體積(mm3)(y-軸)對處理天數(x-軸)的圖。與BSA相比較，6mg/kg的大腸桿菌產生的塔牡斯達丁抑制786-O人腎細胞癌腫瘤的生長(圖27B)。在第10天觀察到對腫瘤生長的顯著抑制作用(對照1096±179.7mm3，塔牡斯達丁619±120.7mm3)。與對照物相比，每天腹膜內注射塔牡斯達丁抑制人腎細胞癌(786-O)腫瘤的生長。當腫瘤體積是600-700mm3時開始該項實驗。每一個點代表每組5-6只小鼠的平均值±SE。星號標記的數據點是顯著的，t-試驗測得P＜0.05。
IV型膠原的α3鏈的NC1結構域的一部分(α3(IV)NC1)是古德帕斯徹綜合癥德病原表位(Butkowski，R.J.等，1987，J.Biol.Chem.2627874-7；Saus，J.等，1988，J.Biol.Chem.26313374-80；Kalluri，R.等，1991，J Biol.Chem.26624018-24)。古德帕斯徹綜合癥是一種特征在于肺出血和/或快速發(fā)病的腎小球性腎炎的自身免疫疾病(Wilson，C.& F.Dixon，1986，The Kidney，W.B.Sanders Co.，Philadelphia，Pennsylvania，USA，pps.800-89；Hudson，B.G.等，1993，J.Biol.Chem.26816033-6)。這些癥狀是由通過抗α3(IV)NC1自身抗體的結合而破壞血管小球和肺泡基膜引起的(Wilson，1986，上文；Hudson，1993，上文)。幾個研究組試圖作圖或預測古德帕斯徹綜合癥自身抗原在α3(IV)上的位置(Kalluri，R.等，1995，J.Am.Soc.Nephrol.61178-85；Kalluri，R.等，1996，J.Biol.Chem.2719062-8；Levy，J.B.等，1997，J.Am.Soc.Nephrol.81698-1705；Kefalides，N.A.等，1993，Kidney Int.4394-100；Quinones，S.等，1992，JBiol.Chem.26719780-4(erratum in J.Biol.Chem.26917358)；Netzer，K.O.等，1999，J.Biol.Chem.27411267-74)，據報道，N-末端、C-末端和中間部分的殘基是表位位置。最近，N端頭40個氨基酸中鑒定了最有可能的與疾病相關的病原表位(Hellmark，T.等，1999，Kidney Int.55936-44)，并且進一步證實是N-末端40個氨基酸。設計了相應于古德帕斯徹綜合癥病原自身表位的缺失N-末端53個氨基酸的截短的塔牡斯達丁(塔牡斯達丁N53)。在下面的實驗中使用該突變體蛋白質。
對7至9周齡雄性無胸腺裸鼠背部皮下注射二百萬786-O腎細胞癌細胞。讓腫瘤生長至大約100-150mm3大小。將小鼠分為5只一組，并且每天腹膜內注射20mg/kg的大腸桿菌表達的缺失53個N末端氨基酸的截短的塔牡斯達丁(Kalluri，R.等，1996，J Biol.Chem.2719062-8)，注射10天。對照小鼠接受PBS注射。結果見圖28，圖28是說明對照小鼠(□)和用塔牡斯達丁突變體N53處理的小鼠(●)腫瘤體積的增加(y-軸)對處理天數(x-軸)的圖。與對照物相比較，從第4天至第10天，6mg/kg的大腸桿菌產生的塔牡斯達丁-N53抑制786-O人腎癌腫瘤的生長(第10天；塔牡斯達丁-N53 110.0±29.0mm3，對照345.0±24.0mm3)(圖28)。每一個點代表每組5-6只小鼠的平均值±SE。星號標記的數據點是顯著的，t-試驗測得P＜0.05。
實施例31對α3(IV)NC1和CD31的免疫組織化學染色處理從7周齡雄性C57/BL6小鼠獲得的腎組織和皮組織用于免疫熒光顯微鏡檢查評估。組織樣品在液氮中冷凍，并且使用4mm厚的切片。通過如前所述的間接免疫熒光技術處理組織(Kalluri，R.等，1996，J；Biol.Chem.2719062-8)。用一抗、多克隆CD31抗體(1∶100稀釋度)或者多克隆α3(IV)NC1抗體(1∶50稀釋度)，接著用二抗、FITC-偶聯的大鼠IgG抗體或者FITC-偶聯的人IgG抗體對冷凍的切片染色。Olympus熒光顯微鏡(Tokyo，Japan)下檢查免疫熒光。通過用無關的預先免疫血清替換一抗進行負對照。
在小鼠腎中，在GBM和血管基膜中發(fā)現α3(IV)NC1的表達。在血管小球內皮和血管內皮中發(fā)現CD31、PECAM-1的表達。在小鼠皮膚中，表皮基膜和血管基膜中不存在α3(IV)NC1。皮膚血管內皮中發(fā)現CD31的表達。在小鼠腎中的腎小球和小管的內皮中發(fā)現CD31表達。在血管小球基膜和血管小球外血管基膜中發(fā)現α3(IV)NC1表達。在小鼠皮膚的真皮血管的內皮中發(fā)現CD31的表達。在表皮基膜中不存在α3(IV)NC1表達，并且在皮膚小管的基膜中幾乎沒有發(fā)現α3(IV)NC1表達。這些結果是塔牡斯達丁有限分布的一個例子。
實施例32塔牡斯達丁N-53引起內皮細胞中程序性死亡檢查了C-PAE細胞中塔牡斯達丁N-53的前程序性細胞死亡活性。通過MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基tetrasolium溴化物)分析(Sugiyama，H.等，1998，KidneyInt.541188-1196)評價細胞生存力。該項分析是以活細胞裂解活性線粒體中tetrasolium環(huán)的能力為基礎對細胞存活的定量比色法分析。C-PAE細胞(7000個細胞/孔)在96孔板上在含有10％FCS的DMEM中培養(yǎng)。第二天，對孔中加入TNF-α(正對照，80ng/ml)或者不同濃度的塔牡斯達丁或者塔牡斯達丁N-53，并且溫育24小時。然后以10微升/孔的比例向孔中加入MTT溶液(5mg/ml；CHEMICON International，Temecula，California，USA)，并且在37℃下溫育4小時。
加入酸-異丙醇并且充分混合。在微量滴定平板讀數器(Bio-Rad，Hercules，California，USA)上在590nm處測定吸光度。
圖29給出結果，圖29是說明遞增濃度的塔牡斯達丁和NumstatinN-53(x-軸)條件下細胞存活力(作為OD590的函數，y-軸)的圖。每一個點代表三個孔的平均值+/-三個孔的平均標準誤差。信號指示t-試驗測得P＜0.05。
塔牡斯達丁N-53以劑量依賴方式降低細胞存活力。與對照物相比，5μg/ml的塔牡斯達丁N-53降低細胞存活力49.4％，該效果可以與用作正對照的80ng/ml TNF-α相比較。在其它實驗中，與5μg/ml塔牡斯達丁N-53下49.4％相比，全長塔牡斯達丁在5μg/ml下只將細胞存活力降低22.5％并且在10μg/ml下降低60％。出人意料地，即使與全長塔牡斯達丁相比，5μg/ml或1μg/ml的塔牡斯達丁N-53誘導更多的內皮細胞程序性死亡實施例33抗生血管蛋白的突變體和片段根據Mariyama等假單胞菌彈性蛋白酶消化方法(1992，J.Biol.Chem.2671253-8)也制備了安瑞斯丁和卡斯達丁的突變體和片段。通過凝膠過濾HPLC分離消化物和通過SDS-PAGE分析得到的片段，然后用如上所述的方法進行內皮管分析評價。這些片段包括安瑞斯丁的12kDa片段、安瑞斯丁的8kDa片段和卡斯達丁的10kDa片段。另外，通過PCR克隆產生了兩個塔牡斯達丁片段(′333′和′334′)。
如圖30所示，如上所述進行內皮管分析，兩個安瑞斯丁片段(12kDa(■)和8kDa(□))和卡斯達丁片段(19kDa(▲))抑制內皮管形成，其程度甚至大于安瑞斯丁(●)或卡斯達丁(○)。圖31表明塔牡斯達丁片段”333”(●)和”334”(○)與塔牡斯達丁(▲)相似，BSA(■)和α6鏈(□)作為對照。
實施例34塔牡斯達丁對內皮細胞和WM-164細胞增殖的影響如上文實施例25中所述，通過3H-胸苷摻入或者亞甲基藍染色進行內皮細胞增殖。C-PAE細胞(傳代2-4代)生長至匯合并且保持接觸抑制48小時。786-O、PC-3和WM-164細胞用作非內皮對照物，并且如上文實施例25中所述培養(yǎng)。HPE(人初期前列腺上皮細胞)在補充有牛腦垂體和重組人EGF(Life Technologies/GibcoBRL，Gaithersburg，Maryland，USA)的角質細胞-SFM中培養(yǎng)。黑色素細胞系WM-164從Wistar Institute(Philadelphia，Pennsylvania，USA)MeenhardHerlyn博士處獲得，并且根據Herlyn等(1990，Adv.CancerRes.54213-234)所述，在78％MCDB-153培養(yǎng)基、10％L-15培養(yǎng)基、10％胰蛋白朊磷酸液體培養(yǎng)基、2％FBS和50單位/毫升胰島素中培養(yǎng)。
C-PAE、PC-3和786-O細胞中3H-胸苷摻入的結果如圖21A-C所示，并且在上文實施例25中有所描述。HPE、C-PAE和WM-164細胞的亞甲基藍染色如圖32A、32B和32C所示，它們是一組三個直方圖，說明遞增濃度的塔牡斯達丁(x-軸)對HPE(圖32A)、CPAE(圖32B)和WM-164(圖32C)細胞的增殖(y-軸)的作用。結果表明塔牡斯達丁以劑量依賴方式抑制FCS刺激的C-PAE細胞的增殖(圖21A)。塔牡斯達丁-處理的(0.1-10μg/ml)和對照細胞中3H-胸苷摻入平均值之間的差異是顯著的(P＜0.05)。塔牡斯達丁對PC3(圖21B)、786-O(圖21C)、HPE(圖32A)和WM-164細胞(圖32C)沒有抑制作用。當加入多粘菌素B(5μg/ml)激活內毒素時，塔牡斯達丁的抑制作用不改變(圖32B)。
令人感興趣的是，全長塔牡斯達丁對WM164細胞的增殖沒有作用，盡管有人報道過(Han等，1997，J.Biol.Chem.27220395-20401)α3(IV)NC1結構域的氨基酸185-203抑制這些細胞。這表明當作為全長折疊塔牡斯達丁的一部分存在時，185-203區(qū)域沒有抗腫瘤細胞活性。
實施例35塔牡斯達丁突變體Tum-1、Tum-2、Tum-3和Tum-4的重組制備已經證明α3(IV)NC1結構域體外結合并且抑制黑素瘤以及其它上皮腫瘤細胞系的增殖(Han等，1997，J.biol.Chem.27220395-20401)。Han等將黑素瘤細胞的結合位點定位為α3(IV)NC1結構域的氨基酸185-203。在該位點產生的單克隆抗體和多克隆抗體能夠阻斷黑素瘤細胞附著并且抑制增殖(Han等，上文)。Han等也發(fā)現位于氨基酸189-191中的具體序列”SNS”對于黑素瘤細胞附著和增殖的抑制是必需的(Han等，上文)。在這些研究中，對其它細胞類型沒有測試185-203α3(IV)NC1合成肽，包括內皮細胞。另外，Han等沒有使用分離的人α3(IV)NC1結構域。
根據上文實施例23中和(Kalluri，R.等，1996 J.Biol Chem.2719062-8)中所述制備并純化四種重組缺失突變體。Tum-1也稱為塔牡斯達丁N53，由SEQ IDNO10的C-末端191個氨基酸組成，并且缺失N-末端53個氨基酸。上面實施例23中也描述了Tum-1。塔牡斯達丁333由塔牡斯達丁(SEQ ID NO10)的N-末端氨基酸2至125組成。Tum-3由C-末端112個氨基酸組成。Tum-4是C-末端64個氨基酸，包括氨基酸185-203(Han等，上文)。如上文實施例23所述，使用pET22b或pET28a(+)表達體系(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)在大腸桿菌中表達這些缺失突變體。這些突變體在上面的表1中詳細說明。
實施例36塔牡斯達丁突變體對內皮細胞和WM-164細胞的增殖和程序性死亡的影響如上實施例25和34所述，通過亞甲基藍染色評價內皮細胞(C-PAE細胞)和WM-164黑素瘤細胞的增殖。圖33A和33B給出了結果，圖33A和33B是一對說明遞增濃度的塔牡斯達丁、Tum-1、Tum-2、Tum-3和Tum-4(x-軸)對C-PAE細胞(圖33A)和WM-164細胞(圖33B)的相對數目(y-軸)的影響的圖。圖33A說明塔牡斯達丁、Tum-1和Tum-2以劑量依賴方式抑制C-PAE細胞增殖。圖33B說明黑素瘤細胞系WM-164不受Tum-1或Tum-2的影響。但是Tum-4在該細胞系中不具有抗增殖活性。如下面表2所示，15μg/ml的塔牡斯達丁抑制C-PAE細胞增殖78.5％。Tum-1和Tum-2分別抑制C-PAE細胞65.6％和73.3％。相反，Tum-3和Tum-4不抑制C-PAE細胞。只有Tum-4抑制WM-164黑素瘤細胞。50μg/ml的Tum-4抑制這些細胞46.1％，但是不抑制C-PAE細胞。表2.重組塔牡斯達丁和塔牡斯達丁的缺失突變體

如下文實施例X所述，使用pET22b或pET28a(+)表達體系(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)在大腸桿菌中表達這些重組塔牡斯達丁和缺失突變體。每孔7000個細胞制成96孔板，并且在存在或者不存在15μg/ml(對于C-PAE細胞)或者50μg/ml(對于WM-164細胞)重組蛋白質下，用20％FCS(C-PAE細胞)或3％FCS(WM-164細胞)刺激。通過如上所述的亞甲基藍染色測定相對細胞數目。數據代表三個孔的平均值±平均值的標準誤差。N.D.＝沒有測定。*＝與沒有蛋白質(“沒有”)相比較P＜0.05。
應用MTT實驗來評價塔牡斯達丁、Tum-1、Tum-2、Tum-3和Tum-4處理之后C-PAE內皮細胞和WM-164黑素瘤細胞的存活力。圖34A和34B給出了結果，圖34A和34B是一對說明遞增濃度的塔牡斯達丁、Tum-1、Tum-2、Tum-3和Tum-4(x-軸)對C-PAE細胞(圖34A)和WM-164細胞(圖34B)細胞生存能力的影響(y-軸)的圖。每個點代表三個孔的平均值+/-平均值的標準誤差。圖34A說明Tum-1以劑量依賴方式降低細胞存活力。在1μg/ml和5μg/ml的劑量下，Tum-1比塔牡斯達丁在降低細胞存活力方面明顯更有效。Tum-4是唯一的降低WM-164黑素瘤細胞(圖34B)的存活力的缺失突變體。
如上文實施例27所述，通過測定Caspase-3活性評價程序性細胞死亡。圖35給出這些結果。圖35是說明用5μg/ml Tum-1、Tum-2、Tum-3或Tum-4、或80 ng/ml TNF-α或PBS緩沖液(對照)處理的C-PAE細胞(x-軸)后，在以OD405吸光度值為量度(y-axis)的Caspase-3活性的直方圖。Tum-1和Tum-2提高了C-PAE細胞中Caspase-3的活性，而Tum-3和Tum-4則不能。
實施例37塔牡斯達丁突變體與內皮細胞上αVβ3整聯蛋白的結合為了測定C-PAE細胞與包被有塔牡斯達丁缺失突變體的平板的結合，如上所述(參見例如實施例28)進行細胞附著測試。如先前所述制備Tum-4兔抗體(Kalluri等，1997，J Clin.Invest.992470-2478)。與辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗-兔IgG抗體購自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，Missouri，USA)。結果如36A、36B和36C所示，它們是一組三個直方圖，說明在對照物IgG、αVβ3、αVβ5和BSA存在下，C-PAE細胞與包被有Tum-1(圖36A)、Tum-2(圖36B)和Tum-4(圖36C)的平板的結合百分率(y-軸)。也用Tum-4抗體(1∶200稀釋度)處理Tum-1包被的平板(圖36A)來封閉先前報道的(Shahan等，1999，Cancer Res.594584-4590)αVβ3結合位點和αVβ5結合位點。
αVβ3抗體分別抑制C-PAE細胞對Turn-1、Tum-2或Tum-4的附著55.9％、69.8％和62.6％。αVβ5抗體不抑制C-PAE細胞與包被有Tum-1、Tum-2或Tum-4的平板的結合。即使當加入Tum-4抗體(其結合氨基酸209-244)時，αVβ3抗體仍然抑制C-PAE細胞與Tum-1的附著(圖36A)。
如圖37所示，塔牡斯達丁、Tum-1、Tum-2和Tum-4也結合WM-164細胞，圖37是說明與包被有PBS、塔牡斯達丁、Turn-1、Tum-2、Tum-4或BSA(x-軸)的平板粘著的WM-164細胞以OD655吸光度(y-軸)表示的亞甲基藍染色水平的直方圖。塔牡斯達丁和所有三種缺失突變體增強WM-164黑素瘤細胞對平板的附著。
實施例38塔牡斯達丁缺失突變體的活性的逆轉為了測定Tum-4抗體是否使Tum-1對內皮細胞增殖的抑制作用無效，如上文實施例26所述進行競爭增殖測試。Tum-1與Tum-4抗體預先溫育，目的在于至少部分地封閉αVβ3整聯蛋白結合位點。然后在內皮細胞增殖試驗中使用它。
結果如圖38A和38B所示，它們是說明預先與Tum-4抗體(1∶100，1∶200，1∶500稀釋度)(x-軸)溫育的用1.5μg/mlTum-1(圖38A)或Tum-2(圖38B)處理的C-PAE細胞(y-軸)的增殖的直方圖。每一條框代表三個孔的平均值±平均值的標準誤差。實驗重復三次。星號表明t-試驗測得P＜0.05。
即使當預先與Tum-4抗體或者對照兔IgG溫育，Tum-1的抗增殖作用也不改變(圖38A)。類似地，與Tum-4抗體或者對照兔IgG預先溫育也不影響Tum-2的抗增殖作用(圖38B)。
然后對整聯蛋白αVβ3研究其逆轉塔牡斯達丁和Tum-2的抗增殖作用的能力。塔牡斯達丁和Tum-2與αVβ3蛋白質溫育30分鐘，然后加給在96-孔平板中培養(yǎng)并與生長培養(yǎng)基溫育過夜的C-PAE細胞。溫育48小時之后，通過亞甲基藍染色測定細胞數目。如圖22所示并且如實施例26所述，遞增劑量的αVβ3可溶性蛋白質以劑量依賴方式逆轉塔牡斯達丁的抗增殖作用，并且在2.4μg/ml(相對于塔牡斯達丁3倍摩爾過量)下，αVβ3明顯恢復塔牡斯達丁的抗增殖作用(43.1％)。單獨用αVβ3蛋白質處理不抑制內皮細胞增殖。如圖38C所示，遞增劑量的αVβ3可溶性蛋白質以劑量依賴方式逆轉Tum-2的抗增殖作用，并且使用2μg/mlαVβ3蛋白質，可使Tum-2的抗增殖作用明顯恢復74.1％。
然后對αVβ3測試其取消Tum-4對黑素瘤細胞的抗增殖作用的能力。塔牡斯達丁和Tum-4在室溫下與αVβ3整聯蛋白預先溫育30分鐘，然后加給96-孔平板中生長的WM-164細胞。溫育48小時之后，通過亞甲基藍染色測定細胞數目的增加。結果見圖38D和38E。塔牡斯達丁對WM-164細胞沒有作用。遞增劑量的αVβ3可溶性蛋白質以劑量依賴方式逆轉Tum-4的抗增殖作用，并且使用2μg/mlαVβ3蛋白質，可使Tum-4誘導的抗增殖作用明顯恢復76.7％。單獨使用αVβ3蛋白質處理不抑制黑素瘤細胞增殖。
將塔牡斯達丁的增殖作用與內靜素和αVβ3抗體相比較。對C-PAE細胞加給等摩爾量的塔牡斯達丁和αVβ3整聯蛋白抗體。圖39給出結果，圖39是說明x-軸上塔牡斯達丁，內靜素，αVβ3抗體和IgG(對照)的濃度對y-軸上相對細胞數目的影響的圖。每個點代表三個孔平均值+/-標準誤差。每項實驗重復三次。星號代表t-實驗測定P＜0.05。遞增量的抗-αVβ3抗體不抑制內皮細胞增殖，而塔牡斯達丁和內靜素則表現出對內皮細胞增殖的劑量依賴性抑制作用。
實施例39卡斯達丁的缺失突變體如上實施例23和35所述構建卡斯達丁的缺失突變體。Can-1由全長卡斯達丁(SEQ ID NO6)的N-末端114氨基酸組成，Can-2由C-末端113個氨基酸組成。將這兩個突變體分別克隆到pET22b和pET28a中，并且穿梭到BL21細胞(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)中表達蛋白質。蛋白質容易從表達克隆中產生，并且用Ni-TA柱子純化，使用插入到載體中的多組氨酸標記。用遞增濃度的咪唑從柱子上將蛋白質洗脫，然后用PBS透析。透析過程中析出的所有的蛋白質是不溶性的，仍然留在溶液中的稱為可溶性級分。濃縮可溶性級分，無菌過濾，并且在-20℃下儲存。不溶性蛋白質重新懸浮于PBS并且在-20℃下儲存。
在增殖測試中，卡斯達丁、Can-1和Can-2可溶蛋白(0.1-20.0μg/ml)加給增殖的C-PAE細胞的生長培養(yǎng)基，用含有10％FBS，5ng/ml bFGF和3ng/mlVEGF的DMEM刺激。結果在圖40中給出，圖40是說明遞增濃度的卡斯達丁(◆)、Can-1(■)和Can-2(▲)(x-軸)對C-PAE細胞相對細胞數(y-軸)的影響的圖。每一種蛋白質的每一濃度試驗重復四次。牛血清白蛋白(BSA)用作對照處理。多粘菌素B用來控制內毒素干擾，并且發(fā)現有或沒有向培養(yǎng)基加入多粘菌素B進行的測試之間沒有差異。使細胞增殖48小時，然后固定、染色，并且用Bio-Rad平板讀數器(Bio-Rad，Hercules，California，USA)讀出密度?？ㄋ惯_丁和Can-1都引起細胞數目百分比的劑量依賴性減少，在5μg/ml和更高濃度下兩者都將細胞數減少80％。Can-2表現出在高于10μg/ml濃度下細胞數目百分比稍微降低，并且在最高濃度下(20μg/ml)，Can-2抑制增殖33％。
使用ApoAlert試劑盒(CLONTECH，Palo Alto，California，USA)通過膜聯蛋白V-FITC測試測定程序性細胞死亡。使用碘化丙錠對通過程序性細胞死亡之外的途經死亡的細胞核染色。卡斯達丁、Can-1和Can-2在高于1μg/ml的濃度下都誘導內皮細胞的程序性細胞死亡。在小于1μg/ml的濃度下，Can-1在誘導程序性細胞死亡方面最有效。
通過體內Matrigel栓測試測定抗生血管活性，其中對C57/BL6小鼠兩腹側皮下注射含有2μg/ml或20μg/ml不溶性蛋白質、50ng/mlVEGF和20U/ml肝素的0.5ml的Matrigel。栓在小鼠體內停留14天，然后殺死小鼠并且切除栓并且固定。將栓包埋、切片并且H&E染色。對樣品進行盲測并且定量測定血管。兩個濃度的蛋白質之間沒有發(fā)現血管數目的差別，對所有6個數值取平均值并且作圖。
圖41給出結果，圖41是說明使用PBS(對照)、卡斯達丁、Can-1和Can-2治療時的每一栓的血管平均數(y-軸)的直方圖。用卡斯達丁或Can-1處理的栓與用PBS或Can-2處理的栓相比表現出少得多的血管。
實施例40塔牡斯達丁的合成片段的活性塔牡斯達丁的肽片段塔牡斯達丁的氨基酸54-132區(qū)指定為Tum-5。合成了肽T1、T2、T3、T4、T5和T6。T2、T3、T4、T5和T6部分重疊，并且位于Tum-5中。下面的圖42和表3中給出這些肽在塔牡斯達丁中的位置。表3.塔牡斯達丁缺失突變體

抗增殖活性檢查肽T2、T3、T4、T5和T6對內皮細胞(C-PAE細胞)的抗增殖活性。圖43A給出結果，圖43A是說明10μg/ml肽T2、T3、T4、T5或T6(x-軸)處理對內皮細胞的增殖(y-軸)的抑制作用的直方圖。對照物是沒有刺激的細胞和用20％FCS刺激的細胞。發(fā)現肽T3顯著抑制內皮細胞的增殖(p＜0.05)，并且抑制作用是劑量依賴性的，如圖43B所示，圖43B是說明用0.1、1.0或10μg/ml肽T3處理C-PAE細胞的增殖的抑制作用(y-軸)的直方圖。對整聯蛋白αVβ3研究其逆轉肽T3的抗增殖作用的能力。T3肽與0、0.001、0.01、0.1、0.5或1.0mlαVβ3整聯蛋白(CHEMICON International，Temecula，California，USA)在室溫下溫育30分鐘，然后以20μg/ml的終濃度加給已經在96孔板的生長培養(yǎng)基中生長的C-PAE細胞。附加溫育48小時之后，通過亞甲基藍染色測定細胞數。圖43C給出了結果，圖43C是說明用與各種濃度的αVβ3整聯蛋白(x-軸)預先溫育的T3肽處理時C-PAE細胞的生長(y-軸)的直方圖。與αVβ3整聯蛋白預先溫育明顯降低肽T3的抗增殖作用。αVβ3整聯蛋白本身不抑制增殖(對照)。
程序性細胞死亡活性如上文實施例32和36所述利用MTT實驗測試肽T2、T3、T4、T5和T6(10μg/ml濃度)對C-PAE細胞存活力的影響。圖43D給出結果，圖4D是說明OD595(y-軸)測定的用合成肽(x-軸)處理的細胞的存活力的直方圖。發(fā)現肽T3相對從Tum-5衍生的其它肽來說顯著降低細胞的存活力。使用TNF-α(100ng/ml)作為誘導內皮細胞程序性死亡的正對照。
細胞附著活性。如上所述使用內皮細胞進行細胞附著性測試。HUVEC或C-PAE細胞與單克隆人整聯蛋白抗體、對照小鼠IgG(10μg/ml)、或者合成肽在預先包被的96-孔平板上培養(yǎng)，然后利用亞甲基藍染色在OD655下測定附著平板的細胞數。圖44A說明在BSA(對照)、沒有抗體(對照)、小鼠IgG(對照)和αVβ3整聯蛋白抗體存在下，HUVEC細胞結合Tum-5肽(10μg/ml)包被的平板的情況。αVβ3整聯蛋白抗體顯著抑制細胞附著。對照小鼠IgG不抑制細胞附著。圖44B是說明C-PAE細胞與用10μg/ml重組Tum-5肽包被的96-孔平板的附著情況的直方圖。與RGD肽溫育不抑制C-PAE細胞與這些平板的附著，說明這些內皮細胞與Tum-5的結合是RGD依賴性的。CNGRC用作對照。
然后測定合成肽T2、T3、T4、T5和T6對C-PAE細胞與Tum-5包被平板的附著的影響。圖44C中給出結果，圖44C是說明C-PAE細胞(y-軸)與包被Tum-5的96-孔平板并用2.5μg/ml的肽T2、T3、T4、T5或T6處理(x-軸)和Tum-4包被的平板并用用T3處理相合的直方圖。PBS處理作為對照。T3肽顯著抑制細胞對Tum-5包被的平板的附著，說明T3負責內皮細胞與Tum-5的相互作用，而其它合成肽沒有表現出該作用，而T3沒有抑制內皮細胞對Tum-4肽包被的平板的附著。圖44D是一個直方圖，說明不同濃度的T3肽(x-軸)對C-PAE細胞(y-軸)結合Tum-5-包被的平板的影響。PBS處理作為對照。發(fā)現T3肽以劑量依賴方式抑制內皮細胞對Tum-5包被平板的附著。
如圖44E所示，對于T3肽，只有αVβ3整聯蛋白抑制內皮細胞對肽-包被的平板的附著，表明αVβ3整聯蛋白介導內皮細胞與肽T3的相互作用。圖44F說明與β3整聯蛋白抗體預溫育抑制C-PAE細胞與T3肽包被的平板的附著。但是αV或者β1整聯蛋白抗體不抑制細胞與T3包被平板的附著。圖44G說明與T3肽溫育不抑制C-PAE細胞與玻連蛋白(2.5μg/ml)包被的平板的結合，這表明T3結合在不與αVβ3整聯蛋白上玻連蛋白結合的結構域。細胞與T6肽的溫育也不抑制附著。
實施例41塔牡斯達丁的缺失突變體的活性將塔牡斯達丁的缺失片段克隆到細菌表達載體中并表達，利用鎳層析純化，然后分析體外抗生血管活性和相關的活性。特殊努力地保證從蛋白質制劑中去除污染內毒素。制備全長塔牡斯達丁、塔牡斯達丁-N53和兩種其他的缺失突變體(Tum-2C和Tum-KE)并且試驗。對這些缺失突變體測定內皮細胞增殖、細胞周期進程、程序性細胞死亡和內皮管形成。也分析活性塔牡斯達丁片段對非內皮細胞的影響來證明這些分子的內皮細胞特異性。下面表4中總結了這些活性。表4.另外的塔牡斯達丁缺失突變體的活性


“構成”欄中的1-12指全長塔牡斯達丁中位于氨基酸位點35、68、80、86、123、126、145、179、191、197、237、240的12個半胱氨酸殘基。
二硫鍵存在于半胱氨酸1和6、半胱氨酸2和5、半胱氨酸3和4、半胱氨酸7和12、半胱氨酸8和11、以及半胱氨酸9和10。
G1細胞周期停止測試Apo膜聯蛋白V-FITC測試管內皮管形成測試EUBioWhitaker試劑測定的內毒素水平。
在這些實驗中發(fā)現塔牡斯達丁-N53最有活性。在體外，塔牡斯達丁-N53誘導內皮細胞程序性死亡，并且在10％胎牛血清(FBS)的存在下抑制內皮細胞細胞周期進程。兩種活性的IC50是大約5μg/ml，而在超過20μg/ml的濃度下，在這些相同的測試中，內靜素沒有表現出活性。
在細胞附著測試中也使用了塔牡斯達丁-N53。當在96孔平板上包被時，塔牡斯達丁-N53(10μg/ml)支持人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)粘著。當與HUVECs預溫育時，αVβ3整聯蛋白抗體和β1整聯蛋白抗體抑制該粘著，如圖45所示，而α6抗體則不這樣。塔牡斯達丁-N53因此可以通過αVβ3整聯蛋白和β1整聯蛋白實現其抗生血管作用。這與用全長塔牡斯達丁見到的結果相吻合，如上文實施例28所述。
塔牡斯達丁-N53在對于新血管形成的Matrigel栓測試中也抑制血管生成。塔牡斯達丁-N53在PC3前列腺異種移植模型和MDA-MB435乳腺癌常位模型中也表現出實質性的抗腫瘤活性。每天施用兩次塔牡斯達丁-N53(每千克5mg/kg或20mg/kg)。后兩項測試的結果在圖46和47中給出。圖46說明了用賦形劑(對照，○)、每日每千克5毫克的塔牡斯達丁-N53(□)或者每日每千克20毫克的塔牡斯達丁-N53(◇)處理的腫瘤經15天(x-軸)PC3前列腺腫瘤以mm3表示的平均腫瘤體積(y-軸)。圖47說明了用賦形劑(對照，○)、每日每千克20毫克的塔牡斯達丁-N53(□)或者每日每千克5毫克的塔牡斯達丁-N53(◇)處理的腫瘤經22天(x-軸)MDA-MB435乳腺癌腫瘤以mm3表示的平均腫瘤體積(y-軸)。因為每日每千克5毫克和20毫克的劑量表現出可比較的抗腫瘤活性，使用低劑量時仍然可以實現顯著的抗腫瘤活性。
最近有人作圖將第二古德帕斯徹綜合癥德表位GPB定位于塔牡斯達丁-N53內的區(qū)域(在全長塔牡斯達丁的氨基酸140-153中)。
因此去除該區(qū)來制備另外的缺失突變體。突變體塔牡斯達丁-45-132(全長塔牡斯達丁的氨基酸45至132)表現出高水平表達，并且以低于塔牡斯達丁-N53的劑量抑制細胞周期進程。如圖48所示，圖48是直方圖，說明當用PBS(對照)、緩沖液(對照)、20μg/ml塔牡斯達丁-N53、10μg/ml塔牡斯達丁-45-132和5μg/ml塔牡斯達丁-45-132(x-軸)處理時S-期的C-PAE細胞百分比(y-軸)。塔牡斯達丁-45-132也支持HUVEC細胞附著，并且受αVβ3抗體和β1抗體的抑制。如圖49所示，圖49是直方圖，說明在PBS(對照)、αVβ3整聯蛋白抗體、β1整聯蛋白抗體、α6整聯蛋白抗體和BSA(對照)存在下HUVEC細胞(y-軸)與塔牡斯達丁-45-132包被(20μg/ml)的平板的附著(x-軸)。因此塔牡斯達丁的抗生血管活性同樣在氨基酸45-132的區(qū)域內。這些片段的其它缺失突變體也可以根據這些方法制備，例如，缺失其中(全長塔牡斯達丁)的第6個半胱氨酸的片段。
實施例42.塔牡斯達丁-45-132和Tum-5-126-C-A的表達和純化塔牡斯達丁-45-132由全長塔牡斯達丁的氨基酸45-132組成，使用表達質粒在大腸桿菌中表達為帶有C-末端6-組氨酸標記的融合蛋白。重折疊和SDS-PAGE分析之后，大腸桿菌表達的蛋白質主要分離為12kDa可溶性蛋白質。通過多組氨酸標記抗體免疫方法可以檢測塔牡斯達丁-45-132。在Tum-5上加上另外9個氨基酸(全長塔牡斯達丁殘基45-54)來提高蛋白質表達率和溶解性。在其它實驗中只使用具有低水平(小于50EU/mg)內毒素的可溶性蛋白質。
如上所述也在畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達重組塔牡斯達丁-45-132。使用載體pPICZαA亞克隆塔牡斯達丁-45-132使得該蛋白質與C末端6-組氨酸標記融合。
通過在全長塔牡斯達丁的殘基126處將半胱氨酸定點誘變?yōu)楸彼醽碇苽銽um-5-125-C-A(SEQ ID NO34)，以提高塔牡斯達丁-45-132的分泌。其在大腸桿菌中表達并且利用蛋白質印跡使用多組氨酸標記抗體在相同分子量大小處檢測出。
古德帕斯徹綜合癥是一種特征在于肺出血和/或快速發(fā)病的腎小球性腎炎的自身免疫疾病，它是由與α3(IV)NC1的自身抗體相關的免疫損傷破壞血管小球和肺泡基膜引起的。最近在N末端部分鑒定出了最可能的與疾病相關的病原表位(Kalluri，R.等，1996，JBiol.Chem.2719062-8；Hellmark，T.等，1999，Kidney Int.55938-44)，并且進一步證實是在N末端40個氨基酸內(Hellmark，T.等，1999，J.Biol.Chem 27425862-8；Netzer，K.O.等，1999，J.Biol.Chem.27411267-74)。N-末端塔牡斯達丁-45-132由塔牡斯達丁的殘基45-132組成，其位于古德帕斯徹綜合癥自身表位之外。為了進一步證明古德帕斯徹綜合癥自身抗體不檢測塔牡斯達丁-45-132，將來自古德帕斯徹綜合癥患者的抗血清用于蛋白質印跡。這種抗血清檢測293細胞表達的具有高靈敏性的全長塔牡斯達丁，但是不能檢測大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132和畢赤酵母表達的Tum-5-126-C-A。這表明塔牡斯達丁-45-132和Tum-5-126-C-A不包含古德帕斯徹綜合癥自身表位，并且排除了當施用時這些重組蛋白質會誘導這種自身免疫疾病可能性。
實施例43.塔牡斯達丁-45-132和Tum-5-126-C-A的活性對塔牡斯達丁-45-132檢查了其對內皮細胞增殖、細胞周期(GI/S)停止和細胞存活力的影響。
通過BrdU摻入實驗檢查塔牡斯達丁-45-132對C-PAE細胞的抗增殖作用。該項測試使用溴代脫氧尿苷(BrdU)代替[3H]胸苷作為胸苷類似物。BrdU摻入到活躍增殖的細胞的新合成DNA鏈中。然后免疫化學檢測摻入到細胞中的BrdU。使用BrdU增殖實驗試劑盒(CalbioChem，San Diego，California，USA)根據廠商說明(有一些改動)進行該項測試，C-PAE細胞接種到含有10％FCS的DMEM中的96-孔平板上。第二天，用有或沒有大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132或者293細胞中表達的全長塔牡斯達丁的含有2％FCS的DMEM置換培養(yǎng)基。然后將平板溫育46小時，用10nM BrdU對細胞脈沖處理2小時。然后將細胞和DNA固定到孔中，與抗-BrdU的一抗和二抗反應，然后用試劑盒提供的比色反應顯色。然后在平板讀數器(Molecular Dynamics，Sunnyvale，California，USA上在OD450處讀取平板數據。
與上文實施例4類似，評價了塔牡斯達丁-45-132和Tum-5-126-C-A對細胞周期的作用。簡要地說，接觸抑制48小時后的C-PAE細胞生長停止。然后收獲細胞，每孔105個細胞，并且在用含有纖連蛋白的5％FCS和重組塔牡斯達丁-45-132或者Tum-5-126-C-A包被的12-孔板上平板培養(yǎng)。21小時之后，收集細胞并且固定在70％冰冷乙醇中。室溫下在含有2％FCS和0.1％Tween-20的PBS中將固定的細胞再水合化30分鐘，離心并且再懸浮于0.5ml的相同的緩沖液中。在37℃下使用RNA酶(5μg/ml)消化1小時，接著用碘化丙錠染色(5μg/ml)。然后使用EPICS XL-MCL流式細胞儀(Beckman-CoulterInstruments，Fullerton，California，USA)計數細胞。
如上所述，通過MTT實驗測定細胞存活力。
如圖50-52所示，塔牡斯達丁-45-132特異性抑制內皮細胞的增殖(圖50A和50B)、誘導細胞周期停止(圖51)，并且降低細胞存活力(圖52A、52B、52C和52D)。
圖50A是說明用0、0.125、0.250、0.500、1.0或2.0μM濃度(x-軸)的大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132(黑色條框)、或者293細胞表達的全長塔牡斯達丁(白色條框)處理的C-PAE細胞的BrdUOD450測試下(y-軸)測定的細胞增殖的直方圖。圖50B是說明用0、0.1、1.0、5.0和10.0μg/ml濃度(x-軸)的畢赤酵母表達的塔牡斯達丁-45-132處理的C-PAE細胞的亞甲基藍染色OD655測定的細胞增殖(y-軸)的直方圖。沒有刺激的C-PAE細胞作為對照物。塔牡斯達丁-45-132以劑量依賴方式抑制用20％FCS刺激過的C-PAE細胞，并且ED50是5μg/ml。對照(0μg/ml)和用塔牡斯達丁-45-132(5和10μg/ml)處理之間的差異是顯著的(t-試驗測得P＜0.05)。當使用對照人黑素瘤細胞(WM-164細胞)時，沒有發(fā)現塔牡斯達丁-45-132的抗增殖作用。
圖51是說明增殖的內皮細胞的G1期停止的直方圖。在生長停止、接觸抑制的細胞中，5.8％的細胞在0小時時處于S期。當用5％FCS處理細胞21小時時，S期細胞的百分比增加3.7倍，達到21.5％。使用塔牡斯達丁-45-132處理將S期細胞百分比降低至6.0％。該作用是劑量依賴性的，S期細胞百分比在1μg/ml塔牡斯達丁-45-132時是19.3％，在10μg/ml塔牡斯達丁-45-132時是11.3％。在另一個實施方案中，G0/G1期細胞百分比在5％FCS處理對照組中最低，用塔牡斯達丁-45-132處理則升高。這些結果表明用塔牡斯達丁-45-132處理引起增殖的內皮細胞細胞周期停止。用Tum-5-126-C-A處理表現出的結果與用塔牡斯達丁-45-132處理相同。
圖52A、52B、52C和52D是一組四個直方圖，說明塔牡斯達丁-45-132和Tum-5-126-C-A對細胞存活能力的影響。圖52A說明MTT實驗中對用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-軸)塔牡斯達丁-45-132(黑色條框)和烷基化并且還原的塔牡斯達丁-45-132(白色條框)處理的C-PAE細胞在OD562(y-軸)下測定的細胞生存能力。塔牡斯達丁-45-132以劑量依賴方式顯著降低細胞存活力，ED50是12μg/ml。還原并且烷基化的塔牡斯達丁-45-132在降低C-PAE細胞的細胞存活力方面表現出與沒有處理的塔牡斯達丁-45-132相似的作用。因此塔牡斯達丁-45-132抗生血管作用不取決于其從半胱氨酸殘基之間的二硫鍵衍生的構象。
Tum-5-126-C-A在細胞存活力方面表現出的作用與塔牡斯達丁-45-132的類似，如圖52B所示。圖52B說明MTT實驗中對用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-軸)Tum-5-126-C-A處理的C-PAE細胞在OD562(y-軸)下測定的細胞生存能力。
塔牡斯達丁-45-132和Tum-5-126-C-A對C-PAE細胞的細胞存活力的作用在對照PC-3和DU-145細胞中沒有見到，如圖52C和52D所示。圖52C說明MTT實驗中對用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-軸)塔牡斯達丁-45-132處理的PC-3細胞在OD562(y-軸)下測定的細胞生存能力。圖52D說明MTT實驗中對用0、3、6、12、25和50μg/ml(x-軸)塔牡斯達丁-45-132處理的DU-145細胞在OD562(y-軸)下測定的細胞生存能力。因此塔牡斯達丁-45-132的活性對內皮細胞是特異性的。
實施例44.塔牡斯達丁-45-132對內皮細胞的作用發(fā)現塔牡斯達丁-45-132誘導內皮細胞程序性死亡并且抑制內皮管形成，如下面的測試所證明的。
如膜聯蛋白V-FITC測試所證實的，發(fā)現塔牡斯達丁-45-132誘導內皮細胞程序性死亡。如上所述通過用塔牡斯達丁-45-132處理C-PAE細胞18小時進行該項測試。對照細胞接受PBS。5μg/ml塔牡斯達丁-45-132與對照物TNF-α相比誘導熒光強度峰的顯著位移。
也如上所述測定了Caspase-3活性。DEVD-fmk，一種特異性caspase-3抑制劑，被用作內部對照物來說明塔牡斯達丁-45-132的特異性。TNF-α(80ng/ml)用作正對照。實驗重復三次。
圖53給出了結果，圖53是說明(x-軸)對照、對照+DEVD-fmk、TNFα、TNF-α+DEVD-fmk、塔牡斯達丁-45-132(1μg/ml和10μg/ml)和塔牡斯達丁-45-132(10μg/ml)+DEVD-fmk的caspase-3活性(OD405下測定的，y-軸)的直方圖。通過用10μg/ml大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132處理C-PAE細胞，發(fā)現caspase-3活性提高4.5倍。正對照TNF-α也產生4.5倍的提高。caspase-3的特異性抑制劑DEVD-fink能降低該蛋白酶活性基礎水平，表明測得的活性的提高對于caspase-3是特異性的。用塔牡斯達丁-45-132處理PC-3細胞沒有發(fā)現該提高的活性。
如Matrigel測試證實的，也發(fā)現塔牡斯達丁-45-132抑制內皮管形成。如上文實施例所述進行Matrigel測試。簡要地說，使HWECS在與或者沒有與5μg/ml大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132溫育的Matrigel包被平板上形成管。BSA處理的細胞和酵母表達的人內靜素(5和20μg/ml)用作對照物。相對對照物來說，塔牡斯達丁-45-132以劑量依賴方式顯著抑制內皮管形成。處理之后平均支化管形成百分比對于BSA處理是22.7±3.1，對于塔牡斯達丁-45-132處理是2.1±2.0，而5μg/ml和20μg/ml內靜素分別產生19.4±3.0和7.5±6.0平均值。與對照物相比較，5μg/ml的塔牡斯達丁-45-132顯著降低內皮管形成。人內靜素甚至在20μg/ml下也表現出比5μg/ml塔牡斯達丁-45-132小的抑制作用。
實施例45.塔牡斯達丁-45-132的結合活性進行細胞附著測試，其證明塔牡斯達丁-45-132結合內皮細胞上的αVβ3和β1整聯蛋白，并且該結合不依賴RGD肽序列。
如上所述進行細胞附著測試。簡要地說，用10μg/ml塔牡斯達丁-45-132或者0.5-2.5μg/ml玻連蛋白(Collaborative BiomedicalProducts，Bedford，Massachusetts，USA)將96-孔平板包被過夜。用BSA封閉平板，并且HUVEC或者C-PAE細胞與10μg/ml的抗體或者合成肽(合成肽CDCRGDCFC(SEQ ID NO35)或者合成對照肽CNGRC(SEQ ID NO36)溫育15分鐘。將細胞加給平板并且在37℃下溫育45分鐘。然后洗滌平板，并且通過亞甲基藍染色測定附著細胞數目。
αVβ3和β1整聯蛋白的抗體顯著抑制用大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132包被的平板上HUVEC細胞的附著。相對用作對照物的小鼠IgG來說，αVβ3整聯蛋白抗體和β1整聯蛋白抗體分別抑制細胞附著47.1％和47.5％。C-PAE細胞表現出可比較的抑制作用。
合成肽CDCRGDCFC在5μg/ml下抑制內皮細胞附著到玻連蛋白包被的平板上。對照肽CNGRC沒有表現出這樣的抑制作用。但是，當細胞與1.0和10.0μg/ml CDCRGDCFC肽溫育時，C-PAE細胞對大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132包被的平板的附著沒有被抑制，表明塔牡斯達丁-45-132結合在內皮細胞上αVβ3整聯蛋白受體上不同的位點，一個不同于先前描述的(Arap，W.等，1998，Science 279377-80)RGD結合位點的位點。CNGRC對照肽也不抑制細胞對塔牡斯達丁-45-132包被平板的附著。
可溶性αVβ3整聯蛋白逆轉塔牡斯達丁-45-132的抗增殖作用。這可通過上文實施例26中描述的競爭增殖測試證明。玻連蛋白包被的平板與αVβ3可溶性蛋白質溫育，然后進行細胞附著測試?？扇苄驭罺β3蛋白質在1μg/ml和2μg/ml下顯著抑制C-PAE細胞附著到包被的平板上。然后大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132與αVβ3整聯蛋白溫育30分鐘，然后和20％FCS一起加給C-PAE細胞。48小時之后，通過亞甲基藍染色測定細胞增殖。遞增濃度的αVβ3可溶性蛋白質以劑量依賴方式逆轉塔牡斯達丁-45-132的抗增殖作用。在1μg/ml下，αVβ3蛋白質顯著逆轉塔牡斯達丁-45-132誘導的抗增殖作用65.9％。用αVβ3蛋白質本身處理，沒有塔牡斯達丁-45-132，則不抑制內皮細胞增殖，進一步表明與內皮細胞表面上αVβ3整聯蛋白結合介導塔牡斯達丁-45-132抗生血管活性。
為了進一步證明塔牡斯達丁-45-132與內皮細胞的表面結合，將生物素化的塔牡斯達丁-45-132用于細胞表面標記。使用Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，USA)將重組大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132生物素化。塔牡斯達丁-45-132，在含有10％DMSO和5％D-甘露糖醇的緩沖液中，在4℃下與12M過量的Sulfo-NHS-LC-Biotin溫育過夜。在溫育過程中從溶液中沉淀出生物素化的塔牡斯達丁-45-132。沉淀物用蒸餾水洗滌兩次，重新懸浮于DMSO，然后以1∶1與蒸餾水混合，得到大約4mg/ml的終濃度。4℃下貯存生物素化的塔牡斯達丁-45-132。
對于細胞表面標記，使用受輕微胰蛋白酶作用的EDTA從燒瓶中去除亞匯合的HUVEC細胞，然后用含有2％BSA的DMEM洗滌兩次。然后將細胞再次懸浮于DMEM/BSA，并且在4℃下和生物素標記的塔牡斯達丁-45-132或者沒有塔牡斯達丁-45-132的條件下進行的模擬生物素反應的產物一起溫育1小時。然后用DMEM/BSA將細胞洗滌兩次，然后在4℃下與鏈霉抗生物素-FITC(“Neutravidin-FITC”，Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，USA)溫育30分鐘。然后在Nikon Eclipse E600熒光顯微鏡下觀察樣品并且用流式細胞儀分析。
在懸浮液中，在HWEC細胞的表面檢測到與塔牡斯達丁-45-132間接結合的FITC，附著之后熒光以較小的點狀圖案廣泛分布在細胞表面上。當細胞與代替生物素化塔牡斯達丁-45-132的自由生物素溫育時，在細胞表面上沒有檢測到明顯熒光。FITC陽性即塔牡斯達丁-45-132結合的細胞數，隨著遞增濃度的生物素化塔牡斯達丁-45-132以劑量依賴方式增加，表明塔牡斯達丁-45-132結合在內皮細胞的表面。
實施例46.塔牡斯達丁-45-132對血管生成和腫瘤生長的影響為了評價體內塔牡斯達丁-45-132對新毛細管形成的作用，進行了Matrigel栓測試。處理6天之后，相對于PBS處理的對照物來說，用5μg/ml大腸桿菌表達的塔牡斯達丁-45-132處理時，生成的新血管數目減少91％。也對缺失全長塔牡斯達丁的N-末端53個氨基酸的Tum-1進行了測試，并且減少新血管化作用95％。血管的平均數(超過3-4Matrigel栓)，對于Tum-1處理的栓是0.47±0.16，對于塔牡斯達丁-45-132處理的栓是0.80±0.16，并且對于PBS處理的對照物是8.81±0.35。
也對塔牡斯達丁-45-132測試了其抑制腫瘤生長的能力。對5-6周齡并且大約25g的雄性無胸腺裸鼠NCRNU小鼠的背部皮下組織植入大約2×106PC-3(前列腺癌)細胞。用游標卡尺測量腫瘤并且用標準公式(寬2×寬×0.52)計算腫瘤體積。讓腫瘤生長至大約50mm3，然后將動物配對分成6只小鼠的組。在配對的這一天(第一天)給予初始劑量的蛋白質或賦形劑(PBS，對照)。每天以1～20mg/kg范圍的劑量腹膜內注射含有塔牡斯達丁-45-132、Tum-5-126-C-A或者人內靜素的b.i.d.無菌PBS，注射20天。對照動物接受PBS賦形劑注射。在一個處理中，使用手術包埋的Alzet小泵實施塔牡斯達丁-45-132的連續(xù)皮下送藥。每周兩次對小鼠稱重，并且從第一天開始測量腫瘤。計算估計的平均腫瘤體積，在第21天對小鼠稱重，殺死小鼠，切除它們的腫瘤，然后用光學顯微鏡和CD31免疫染色檢查。從1中減去處理過的平均腫瘤重量除以對照組的平均腫瘤重量，并且以百分比表示，得到它對每一個組的腫瘤生長的抑制作用。
圖54給出了結果，圖54是線形圖，說明在用賦形劑(對照，□)、1mg/kg的塔牡斯達丁-45-132(◆)、1mg/kgTum-5-126-C-A(●)、20mg/kg內靜素(○)和微量泵控制的塔牡斯達丁-45-132(1mg/kg，△)處理第0、5、10、15和20天(x-軸)時以V/Vo(平均腫瘤體積/最初腫瘤體積)表示的分數腫瘤體積(y-軸)。根據體重變化判斷，蛋白質處理沒有觀察到毒性。塔牡斯達丁-45-132和Tum-5-126-C-A都顯著抑制PC-3細胞的生長。與注射賦形劑的對照組相比，1mg/kg的人塔牡斯達丁-45-132具有74.1％(p＝0.02)的腫瘤生長抑制作用，而Tum-5-126-C-A具有92.0％(p＝0.001)的腫瘤生長抑制作用。通過Alzet小型泵連續(xù)送遞塔牡斯達丁-45-132(1mg/kg，經24小時)也證明70.1％(p＝0.03)的顯著的腫瘤生長抑制作用。與注射賦形劑的對照組相比，以20mg/kg的劑量(b.i.d.，大丸劑注射)送遞內靜素沒有發(fā)現顯著的腫瘤生長抑制作用。
應用CD31免疫染色來測定PC-3腫瘤異種移植冷凍組織切片中腫瘤內的微血管密度(MVD)，應用標準鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶檢測系統(Vectastain ABC Elite Kit，Vector Labs，Burlingame，California，USA)，使用大鼠抗-小鼠VD31單克隆抗體(PharMingen，San Diego，California，USA)。使用1％H2O2/甲醇將內源過氧化物酶活性封閉30分鐘，然后通過與蛋白酶K在室溫下溫育30分鐘對玻片進行抗原檢索。以1∶20在含有0.1％TWEEN-20的PBS中稀釋小鼠CD31的抗體，并且在用5％正常山羊血清/PBS+0.1％TWEEN-20封閉切片之后溫育2小時。正常大鼠IgG用作負對照。使用VectastainABC Elite試劑盒進行免疫過氧化物酶染色。用甲基綠對切片計數染色。通過以較低放大率掃描腫瘤來評價MVD，然后在腫瘤周圍鑒定含有最大數目離散的微血管的三個區(qū)域，然后在40×場上計數各微血管。處理組之間比較平均微血管密度并且利用t試驗進行分析。
與注射賦形劑的對照組相比，塔牡斯達丁-45-132腹膜內注射顯著抑制PC-3異種移植中微血管密度。每個低強度(40×)場CD31-陽性血管數目是，對于塔牡斯達丁-45-132處理是6.33±0.54，對于對照組是9.44±1.05(p＝0.047)。用Tum-5-126-C-A處理的組或者微量泵控制的塔牡斯達丁-45-132表現出平均血管密度相似的降低。
所有的參考文獻、專利文獻和專利申請在這里全文引作參考。本發(fā)明參照優(yōu)選的實施方案進行了具體說明和描述，本領域技術人員明白不脫離后面附加的權利要求書的精神和范圍可以進行形式和詳細方面的各種變化。
權利要求
1.安瑞斯丁(Arresten)、卡斯達丁(Canstatin)或者塔牡斯達丁(Tumstatin)、或者其片段、突變體、同系物、類似物或等位變體在制備用于治療涉及抑制組織中血管生成的疾病的藥物中的用途，其中所述血管生成由一種或多種內皮細胞整聯蛋白或者一種或多種內皮細胞整聯蛋白亞基介導。
2.根據權利要求1的用途，其中所述疾病是腫瘤生長。
3.安瑞斯丁、卡斯達丁或者塔牡斯達丁、或者其片段、突變體、同系物、類似物或等位變體在制備通過促進或誘導組織中內皮細胞編程性細胞死亡來治療疾病的藥物中的用途，其中所述內皮細胞編程性細胞死亡由一種或多種內皮細胞整聯蛋白或者一種或多種內皮細胞整聯蛋白亞基介導。
4.根據權利要求1或2的用途，其中通過抑制下面的一項或幾項來抑制血管生成內皮細胞增殖、內皮細胞遷移或者內皮細胞管生成。
5.根據權利要求1-4任一項的用途，其中所述一種或多種整聯蛋白選自α1β1、α2β1、α3β1和αVβ3，并且所述一種或多種整聯蛋白亞基選自α1、α2、α3、αV、β1和β3。
6.下面的物質在制備用于抑制組織中血管生成或細胞增殖的藥物中的用途(a)特異性結合整聯蛋白α1亞基的抗體或肽；(b)特異性結合整聯蛋白α2亞基的抗體或肽；(c)特異性結合整聯蛋白α3亞基的抗體或肽；(d)特異性結合整聯蛋白α5亞基的抗體或肽；(e)特異性結合整聯蛋白α6亞基的抗體或肽；(f)特異性結合整聯蛋白αV亞基的抗體或肽；(g)特異性結合整聯蛋白β1亞基的抗體或肽；或者(h)特異性結合整聯蛋白β3亞基的抗體或肽。
7.根據權利要求6的用途，其中所述藥物用于治療特征在于血管生成或細胞增殖的疾病。
8.下述物質在制備用于促進或誘導組織中血管生成或細胞增殖的藥物中的用途(a)整聯蛋白α1亞基；(b)整聯蛋白α2亞基；(c)整聯蛋白α3亞基；(d)整聯蛋白α5亞基；(e)整聯蛋白α6亞基；(f)整聯蛋白αV亞基；(g)整聯蛋白β1亞基；或者(h)整聯蛋白β3亞基。
9.根據權利要求8的用途，其中所述一種或多種整聯蛋白亞基是可溶的。
10.根據權利要求8或權利要求9的用途，其中所述一種或多種整聯蛋白亞基是單體、二聚體、三聚體、四聚體、多聚體。
11.受體介導的血管生成的抑制劑在制備用于治療脊椎動物增殖性疾病的藥物中的用途，其中所述疾病特征在于安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的受體介導的血管生成，并且其中所述被抑制的受體是安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁受體。
12.根據權利要求11的用途，其中所述安瑞斯丁受體選自α1β1、α2β1、α3β1和αVβ3整聯蛋白。
13.根據權利要求11的用途，其中所述卡斯達丁受體選自α1β1或α2β1。
14.根據權利要求11的用途，其中所述塔牡斯達丁受體選自α5β1、α6β1和αVβ3整聯蛋白。
15.根據權利要求11的用途，其中所述藥物用于抑制腫瘤生長。
16.根據權利要求11的用途，其中所述藥物用于已確診腫瘤的消退。
17.根據權利要求11-16任一項的用途，其中抑制安瑞斯丁受體介導的血管生成、卡斯達丁受體介導的血管生成、或者塔牡斯達丁受體介導的血管生成的分子被用來制備藥物。
18.根據權利要求17的用途，其中與安瑞斯丁受體、卡斯達丁受體或塔牡斯達丁受體特異性結合的抗體、抗體片段或肽被用來制備藥物。
19.根據權利要求18的用途，其中所述抗體是多克隆或單克隆抗體。
20.在促進組織中血管生成的藥物存在下結合安瑞斯丁、卡斯達丁或塔牡斯達丁的一種或多種可溶性受體的用途。
21.根據權利要求20的用途，包括所述組織接觸一種降低組織中FLIP水平的分子。
22.具有選自下面特征的一項或兩項的α3(IV)NC1結構域的非古德帕斯徹片段(a)結合αVβ3整聯蛋白的能力；(b)抑制內皮細胞增殖的能力；和(c)引起內皮細胞編程性細胞死亡的能力。
23.具有選自下面特征的一項或多項的α3(IV)NC1結構域的非古德帕斯徹片段(a)結合αVβ3整聯蛋白的能力；(b)結合內皮細胞的能力；(c)抑制腫瘤細胞增殖的能力；和(d)不抑制內皮細胞增殖的能力。
24.根據權利要求22或23的片段，其中所述結合αVβ3整聯蛋白的能力是不依賴于RGD的。
25.根據權利要求24的片段，進一步包括不抑制腫瘤細胞增殖的能力。
26.權利要求22-25任一項的片段在制備用于治療涉及血管生成的疾病的藥物中的用途。
27.權利要求22-25任一項的片段在制備用于治療涉及腫瘤生長的疾病的藥物中的用途。
28.含有權利要求22-25任一項的片段的藥物組合物。
29.根據權利要求22或23的片段，其中所述片段具有SEQIDNO10的氨基酸殘基54至氨基酸124的氨基酸序列。
30.根據權利要求24的片段，具有SEQIDNO10的氨基酸殘基185至氨基酸203的氨基酸序列。
31.根據權利要求22或23的片段，其中所述片段包括氨基酸序列PGL KGK RGD SGS PAT WTT RGF VFT RHS QTT AIP SCP EGTVPL YSG FSF LFV QGN QRA HGQ DLG TLG SCL QRF TTM PFLFCN VND VCN FAS RND YSY WLS TPA LMP MNM API TGR ALEPYI SRC TVC EGP AIA(SEQIDNO23)。
32.根據權利要求22或23的片段，其中所述片段包括氨基酸序列G FSF LFV QGN QRA HGQ DLG TLG SCL QRF TTM PFL FCN VNDVCN FAS RND YSY WLS TPA LMP MNM API TGR ALE PYI SRCTVC EGP AIA(SEQIDNO33)。
33.根據權利要求22或23的片段，其中所述片段包括氨基酸序列LQRFTTMPFLFCNVNDVCNF(SEQIDNO29)。
34.權利要求29-33任一項的片段用于藥物的用途。
35.權利要求29-33任一項的片段在制備用于治療涉及血管生成的疾病的藥物中的用途。
36.權利要求29-33任一項的片段在制備用于治療涉及腫瘤生長的疾病的藥物中的用途。
37.含有權利要求29-33任一項的片段的藥物組合物。
38.根據權利要求29-33任一項的片段，其中一個或多個半胱氨酸殘基被堿性還原。
39.根據權利要求29-33任一項的片段，其中一個或多個半胱氨酸殘基被誘變?yōu)槠渌被帷?br> 40.根據權利要求39的片段，其中一個或多個半胱氨酸殘基被誘變?yōu)楸彼帷?br> 41.根據權利要求22或23或40的片段，其中所述片段包括氨基酸序列G FSF LFV QGN QRA HGQ DLG TLG SCL QRF TTM PFL FCN VNDVCN FAS RND YSY WLS TPA LMP MNM API TGR ALE PYI SRCTVA EGP AIA(SEQIDNO34)。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有抗生血管功能的蛋白質及其片段，和使用這些蛋白質和片段抑制或促進血管生成的用途。
文檔編號A61P35/00GK1420926SQ01805050
公開日2003年5月28日 申請日期2001年1月8日 優(yōu)先權日2000年1月7日
發(fā)明者拉格胡拉姆·卡路里 申請人:貝絲以色列迪克尼斯醫(yī)療中心