專利名稱：有放射活性的治療性脂質(zhì)體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及偶聯(lián)物系統(tǒng)，其包含帶有離子載體的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體內(nèi)部有螯合劑，其中所述脂質(zhì)體用發(fā)射α-粒子的放射性重(heavy)核素穩(wěn)定標記。本發(fā)明進一步涉及制備所述偶聯(lián)物系統(tǒng)的方法和該系統(tǒng)的用途，以及制備該偶聯(lián)物系統(tǒng)的試劑盒。
在抗癌治療中放射性核素的生物醫(yī)學應用迄今為止集中在陽離子或陰離子核素的使用，例如，[131I]碘化物抗甲狀腺癌和89Sr用于減輕骨癌轉(zhuǎn)移瘤的疼痛，并及大多數(shù)附著于單克隆抗體上的發(fā)射β射線的放射性核素的應用(DeVita et al.，1996)。
針對癌癥的放射性核素靶向治療的應用依賴于找到將放射性核素附著于腫瘤特異性載體化合物上的方法的能力(Gaze，1996)。今天，因為在放射性核素和載體化合物之間提供化學穩(wěn)定性連接的問題，一些具有有用放射性特征的放射性核素不能用于腫瘤靶向。然而，新的載體系統(tǒng)既可以拓寬放射性同位素的使用，也可以拓寬認為對治療有用的放射性核素的儲備(Gaze，1996)。
表面附著有或沒附著受體親和基團的脂質(zhì)體，已經(jīng)被評價用于藥物給藥，并且目前臨床用于一些癌癥類型中化療藥物的給藥。最近，脂質(zhì)體研究的發(fā)展已經(jīng)走向新的藥代動力學領域，其使這些化合物作為有用的放射性核素載體用于抗癌的內(nèi)部放療(Gabizon，1995)。在脂質(zhì)體配制和生產(chǎn)上的這些最近發(fā)展導致延長了循環(huán)時間的小于100nm的小泡囊，因為途經(jīng)膜的擠壓可以較好限制脂質(zhì)體至小直徑。而且，聚乙二醇移植型脂質(zhì)體的導入降低了血漿蛋白質(zhì)的干擾，并因此降低了受網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中巨噬細胞影響的識別和清除作用(Maruyama，et al.，1997)。因此持久的血液濃度可使腫瘤攝取水平升高。通過將具有受體親和力的分子，例如單克隆抗體或葉酸，偶聯(lián)到脂質(zhì)體的表面可進一步攝取腫瘤。此外，幾項研究已顯示了使用PEG作為脂質(zhì)體和靶配體之間連接物的優(yōu)點，因為這也能改善受體的易接近性(例如Maruyama et al.，1997； Gabison et al.，1999；Lee et al.，1994)。
以前將脂質(zhì)體作為放射性同位素的載體研究(Goins et al.，1998；Turner etal，1988)。Pikul.et al(1987)報道了一項以被動摻入的212Pb-葡聚糖為基礎的研究(即在脂質(zhì)體形成過程中加入212Pb-葡聚糖，以及將一個212Pb-葡聚糖級分與代表脂質(zhì)體內(nèi)部的水相混合)。作者認為這些脂質(zhì)體不適合用于癌癥治療，而主要用其研究放射性同位素在體外細胞內(nèi)的細胞殺傷作用。沒有資料表明212Pb衰變產(chǎn)生的212Bi的命運，而且與目前認為最佳的體內(nèi)腫瘤治療體積(近100nm)相比，脂質(zhì)體達350-500nm的體積是非常大的(Forssen，1997)。而且脂質(zhì)體在膜內(nèi)不含有PEG。
Ogihar-Umeda et al.(1996)使用脂質(zhì)體作為發(fā)射γ射線的放射性核素67Ga，111In和99mTc的載體，并建議使用放射性標記的脂質(zhì)體來成像。
在理論性研究中，Kostarelos et al.(1999)提出了用有治療潛力的放射性核素131I，67Cu，188Re和211At標記的脂質(zhì)體的用途，但未指出制備放射性標記的脂質(zhì)體的化學過程。
EP 386 146 B1描述了一種包裹有用于中子俘獲腫瘤治療之化合物的脂質(zhì)體的組合物和使用方法。但是，這些脂質(zhì)體是用穩(wěn)定元素(例如硼)裝載，這些元素只有被激活后才有放射性活性，而且這些脂質(zhì)體既不包含離子載體也不包含螯合劑。
Utkhede et al.，(1994)描述裝載了90Y和與本發(fā)明中描述的螯合劑不同的螯合劑DTPA的脂質(zhì)體。而且，沒有描述母/子核素的滯留時間，此外，90Y不是如本申請描述的重核元素。
用發(fā)射α射線的放射性核素對載體進行足夠穩(wěn)定的放射標記通常需要適合每種元素化學性質(zhì)的特殊化學方法，但這些方法是未知的。用于放射標記例如Ga，In，Tc，Cu或Re的方法無法預計是否適用于放射性重核素(原子重量超過150)陽離子α射線發(fā)射者如212/213Bi，212Pb，223/224Ra，227Th或225Ac。
因此本發(fā)明的一個目的是提供一種放射性核素一脂質(zhì)體偶聯(lián)物系統(tǒng)，具有或不具有受體親和基團，其(1)包裹有螯合劑和發(fā)射α粒子射線的放射性重核素，(2)當母核素引入脂質(zhì)體時能夠保留子核素和(3)能夠通過對一組放射性核素有用的主動摻入方法制備，本發(fā)明也提供該系統(tǒng)的用途和制備該系統(tǒng)的試劑盒。這些目的已經(jīng)通過本發(fā)明實現(xiàn)了，其特征由所附的權利要求限定。
本發(fā)明涉及包含脂質(zhì)體的偶聯(lián)物系統(tǒng)，該脂質(zhì)體帶有離子載體即用于脂質(zhì)體的金屬提取試劑，以及位于該脂質(zhì)體內(nèi)部的螯合劑和放射性重核素(原子重量超過150)。用主動摻入放射性核素，即經(jīng)由離子載體的方式制備脂質(zhì)體，且按照生產(chǎn)體積一般為100nm的脂質(zhì)體的方法制備。得到的產(chǎn)品數(shù)天后仍顯示良好的化學穩(wěn)定性，而且在脂質(zhì)體內(nèi)仍保留子核素，例如從212Pb轉(zhuǎn)化而成的212Bi。可以將脂質(zhì)體制備為膜上附著有或不帶有修飾基團如聚環(huán)氧烷，例如，PEG。這里我們也描述了將這種放射標記的脂質(zhì)體連接于腫瘤搜索蛋白，例如偶聯(lián)葉酸的單克隆抗體。
現(xiàn)在參考附圖和實施例更詳細描述本發(fā)明。


圖1 PEG化的脂質(zhì)體與OVCAR3細胞的結合，所述脂質(zhì)體含有偶聯(lián)于其膜上的Fab’或者葉酸標記的Fab’抗體。
圖2葉酸與非葉酸PEG脂質(zhì)體與OVCAR3細胞的結合。
為了開發(fā)適合癌癥治療的放射標記的脂質(zhì)體，本發(fā)明者們已研究了一些脂質(zhì)體的制備和用途，以放射性核素212Bi，213Bi，213Ra，224Ra，225Ac，212Pb，和227Th為基礎，其裝載發(fā)射α粒子的放射性重核素(即原子重量超過150)。使用帶有離子載體的脂質(zhì)體(泡囊)，用放射性核素的主動摻入制備帶有優(yōu)選螯合劑的放射標記脂質(zhì)體(即脂質(zhì)體包裹放射性核素和螯合劑)，并且按照生產(chǎn)體積一般為100nm的脂質(zhì)體的方法制備。
單層泡囊用薄的脂質(zhì)膜按下列方式水化和擠壓(Olson et al.1979，MacDonald et al.1991)制備將DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)和膽固醇以2∶1摩爾比，一般分別10和5μmol溶解于圓底燒瓶內(nèi)的氯仿中。利用減壓經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。然后將干燥的脂質(zhì)膜在0.5-1ml的150mM檸檬酸，30mMDOTA(1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷1，4，7，10 N，N’，N”，N”’四乙酸)，PH4中水化。將得到的懸浮物進行5輪凍融，隨后用手動擠壓裝置(Avestin，Ottawa，Canada)反復擠壓通過100nm孔徑的聚碳酸酯過濾器5次和50nm孔徑者5次。產(chǎn)品的脂質(zhì)濃度為～30mM。在放射性核素裝載脂質(zhì)體前，將外部溶液在PD-10柱上用250mM蔗糖，20mM HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2乙磺酸)，pH7.4洗脫而交換。
脂質(zhì)體組分a)內(nèi)部水相介質(zhì)pH1-14，優(yōu)選2-9，更優(yōu)選4-5。組分水；能在所需時間間隔內(nèi)，即直到由離子載體介導的放射性金屬摻入開始，維持水相介質(zhì)所需pH值的試劑。優(yōu)選地，內(nèi)部水相介質(zhì)的組分也引起放射性金屬的復雜功能。這種影響的產(chǎn)生通過i)例如用于調(diào)節(jié)pH的試劑，例如在醋酸鹽，檸檬酸鹽和相關化合物中的氧原子的靜電供體功能；ii)此外，在內(nèi)部水相介質(zhì)中有復合試劑，例如EDTA，DTPA，DOTA，DOTMP和相關化合物。
b)離子載體例如能基本上不可逆地，從脂質(zhì)體外部相向脂質(zhì)體內(nèi)部穿過脂質(zhì)雙層轉(zhuǎn)運放射性金屬的試劑。例如以所需方式展示功能的離子載體鈣離子載體A23187，二環(huán)己基18-C6，二苯并-18-C6，2，3-二巰基-1-丙醇，Pb-離子載體。
c)脂質(zhì)雙層的組分優(yōu)選脂雙層的組分導致能形成泡囊的混合物，并且其液-固相變溫度高于生理溫度；例如，i)磷脂。例如長鏈烷基-磷脂酰膽堿，例如1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DLPC)，1，2-二肉豆蔻酰(dinlyristoyl)-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMPC)，1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)，1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)，1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC)；ii)固醇或具有相似的使脂雙層堅硬(降低流動性)特性的化合物。例如固醇類化合物膽固醇和膽固醇3-硫酸酯，和iii)(空間排列上)在體內(nèi)用以增加構建體靶向腫瘤細胞的特性和增加血液中存留時間的穩(wěn)定劑，例如聚醚，聚乙二醇。脂質(zhì)體制劑中包含PEG和/或PEG衍生物的優(yōu)點是減少所注射的脂質(zhì)體從循環(huán)系統(tǒng)中被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除。一般地在制劑中包括相當于磷脂的3-10mol％。但是獲得所需穩(wěn)定效果必需的穩(wěn)定劑的量依賴于單體(靜電特性和極性特性)和重復單位的數(shù)目，即鏈長度。例子(PEG和/或PEG衍生物)1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[聚乙二醇2000](PEG2000DMPE)，1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺N-[聚乙二醇2000](PEG2000DPPE)，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[聚乙二醇2000](PEG2000DSPE)。
d)使構建體易于修飾成具有靶向腫瘤細胞的特性的組分用半抗原的性質(zhì)，以及研究的需要決定對合適的活化脂質(zhì)的選擇。通過要去除的基團，親水間隔臂，脂質(zhì)體的材料特性，和反應物的濃度來控制反應的效率。對于要求其半抗原保持與脂質(zhì)體相連的體內(nèi)研究，通過選擇在膜間交換更慢的較長?；溨|(zhì)錨著物會獲得明顯優(yōu)勢。而且，在半抗原和脂質(zhì)錨著物間的共價鍵應該對化學裂解酶的裂解都很穩(wěn)定?；罨闹|(zhì)可用于形成如胺，酰胺，硫醚，或脂質(zhì)和修飾物之間的二硫鍵。如果制劑中包括空間排列性穩(wěn)定劑，例如PEG和/或PEG衍生物，發(fā)揮偶聯(lián)功能的基團優(yōu)選出現(xiàn)在相同或相似于該穩(wěn)定劑的化合物的末端并且具有相同于或長于穩(wěn)定劑鏈長度的有效鏈長度。例如來自PEG和/或PEG衍生物的使構建體易于修飾成具有腫瘤細胞靶向特性的泡囊組份N-[w-(2-吡啶基二硫代丙酰氨基)聚(乙二醇)2000]1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(PDP-PEG2000-DSPE)，N-{w-[4-(對-馬來酰亞氨基苯基)丁酰]氨基}聚(乙二醇)2000]1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(MpB-PEG2000-DSPE)。
用大小排阻層析法(Mauk和Gamble 1979，Tilcock et al.1991)從未偶聯(lián)放射性核素的脂質(zhì)體中分離已偶聯(lián)了放射性核素的脂質(zhì)體。由于分離在脂質(zhì)體裝載程序之后，故使用PD-10大小排阻層析柱。在PD-10柱上加載1ml或更小體積的樣品，脂質(zhì)體洗脫在最初的4.5ml中。未與脂質(zhì)體偶聯(lián)的放射性核素洗脫在相當于低分子量組分的級分中。PD-10柱也用于研究所裝載脂質(zhì)體在PBS中的穩(wěn)定性(指放射性核素的滯留時間)。
將血清中游離的放射性核素與偶聯(lián)放射性核素的脂質(zhì)體分離，通過在Sepharose CL-4B柱(Hwang和Mauk，1977)上的大小排阻層析進行。因此可以制備含有放射活性脂質(zhì)體的溶液，其中的脂質(zhì)體分散在基本上不含未結合的放射性核素的液體載體中。
在層析步驟前加入EDTA(乙二胺N，N’四乙酸)以使游離的放射性核素穩(wěn)定在容易與脂質(zhì)體偶聯(lián)級分分離的狀態(tài)。
通過對228Ac，223Ra，212Pb，212Bi，205Bi，和207Bi的γ-波譜分析確立偶聯(lián)放射性核素的脂質(zhì)體的放射性核素裝載量，和潛伏期。將228Ac和205/207Bi分別用作有潛在治療性用途的放射性核素225Ac，212Bi和213Bi的示蹤劑。
本發(fā)明者們意義重大的且意想不到的發(fā)現(xiàn)是，212Bi在摻入此類型脂質(zhì)體中的212Pb衰變后沒有明顯的易位。212Pb作為212Bi分子連接型發(fā)生者應用的現(xiàn)狀表明明顯的釋放(≥30％)通常由螯合劑產(chǎn)生(McClure和Feinendegen，1998；Mirzadeh et al.，1993)。但是，用高濃度螯合劑，例如在脂質(zhì)體內(nèi)部，俘獲212Pb，可以避免子產(chǎn)物的釋放，提供可被用來在核轉(zhuǎn)變后俘獲子核素的偶聯(lián)物系統(tǒng)。這是首次報道幾乎能定量地保留212Bi子核素的212Pb偶聯(lián)物系統(tǒng)。因此，本發(fā)明涉及帶有包括位于脂質(zhì)體內(nèi)部的放射性核素和螯合劑的離子載體的脂質(zhì)體(偶聯(lián)物系統(tǒng))，并且其中此偶聯(lián)物系統(tǒng)能夠或不能保留子核素。
本發(fā)明螯合劑可選自1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)，1，4，7，10四氮雜環(huán)三癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四乙酸(TRITA)，1，4，7，10四氮雜環(huán)四癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四乙酸(TETA)，1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四(亞甲基)膦酸(DOTMP)，1，4，7，10四氮雜環(huán)三癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四(亞甲基)膦酸，1，4，7，10四氮雜環(huán)四癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四(亞甲基)膦酸，二亞乙基三胺N，N’，N”五乙酸和它們的異構體衍生物，穴狀化合物[2，2，2]，穴狀化合物[3，2，2]，穴狀化合物[2，2，1]和它們的單-和雙-苯并衍生物。包含電子富集(供體)基團(羥基，羧基，酯，胺，酰胺)的橋聯(lián)(bridged)杯狀(calix)[4]芳烴。1，10-二氮-4，7，13，16-四氧雜環(huán)十八烷-1，10N，N’二乙酸，和1，10-二氮-4，7，13，16-四氧雜環(huán)十八烷-1，10N，N’二丙二酸酯。
另一個重要且驚人的發(fā)現(xiàn)是，按照本發(fā)明的脂質(zhì)體可以有效地摻入并保留212Ra。這是首次描述了帶有鐳-223的潛在用于靶向腫瘤的偶聯(lián)物系統(tǒng)。此外，我們發(fā)現(xiàn)鉍和錒也可被摻入并很強地保留在目前描述的這類脂質(zhì)體當中，說明也可制備以212Bi，213Bi和225Ac為基礎的偶聯(lián)物系統(tǒng)。
按照本發(fā)明的偶聯(lián)物系統(tǒng)可被制成在脂質(zhì)體膜中帶有或不帶有表面修飾基團，例如PEG(PEG植入的/PEG化的脂質(zhì)體)。在膜中含有PEG的優(yōu)點是它提供一些PEG-反應基團，其允許蛋白質(zhì)例如抗體，抗體片段或構建體或葉酸，或其他受體親和性(受體結合性)蛋白質(zhì)/分子的偶聯(lián)。
本申請進一步涉及一種在脂質(zhì)體膜上附著有受體結合蛋白的新型脂質(zhì)體。這里我們描述放射性標記的PEG植入性脂質(zhì)體，其結合于葉酸標記的抗體。葉酸和葉酸衍生物靶向能表達葉酸結合蛋白(FBP)的腫瘤的用途已經(jīng)吸引了研究者們的注意，F(xiàn)BP是一種參與細胞經(jīng)胞吞作用攝取氧化型葉酸的糖基-磷脂酰-肌醇-連接的細胞膜蛋白(Kranz et al.，1996；Reddy et al.，1998；Shinoda et al.，1998；Trippet et al.，1999)。由于人類腫瘤細胞的一些類型已經(jīng)表現(xiàn)出過表達FBP，所以此受體可能是給予結合葉酸的治療性放射性同位素的可能靶點。因此，通過使用結合葉酸的抗體，對癌癥有目標的放射性核素治療是可以達到的。而且，如果葉酸標記抗體的抗原結合位點是直接抗不同于FBP的腫瘤相關抗原，則獲得二元結合力(即對抗體-抗原和FBP受體都有親和力)。據(jù)我們所知，這是首次描述葉酸標記的抗體的偶聯(lián)。
為增強放射性治療，可以將結合于本發(fā)明脂質(zhì)體的葉酸標記抗體進一步用放射性核素或不同放射性核素的混合物標記。
本發(fā)明表明，葉酸標記的抗體與脂質(zhì)體偶聯(lián)的這種新式結合可被用于使放射性核素靶向表達葉酸受體的細胞。這對α粒子發(fā)射者尤其有用，其是高水平能量線性轉(zhuǎn)移(高-LET)射線發(fā)射者，對哺乳類細胞有很強的細胞毒性(Hall，1994；Larsen et al.，1998；Ritter et al.，1977)。但是，與其他類型射線相比，α射線源可向特別小的區(qū)域發(fā)射射線。因此，如果將α射線源直接指向靶組織，那么會減少對正常組織的照射。
通過將抗體與雌激素或睪酮結合，也可將按照本發(fā)明的偶聯(lián)物系統(tǒng)用于靶向那些表達例如雌激素受體或睪酮受體的細胞。
按照本發(fā)明使用的標記抗體優(yōu)選是IgG或IgM類，和/或其片段和/或其構建體(例如小體(minibody))。而且，這些抗體和/或其片段和/或其構建體是鼠源的，嵌合的或完全人源化的，多克隆的或單克隆的。
本發(fā)明也涉及按照本發(fā)明的偶聯(lián)物系統(tǒng)的用途，用來制備適合經(jīng)靜脈內(nèi)和/或局部，和/或腫瘤內(nèi)途徑注射或輸注至包括人類等哺乳動物的藥用溶液?？梢詫⑺幱萌芤号c一種放射性免疫偶聯(lián)物或幾種放射性免疫偶聯(lián)物和/或其他類型的放射性藥物治療，化療，外部射線治療或外科治療聯(lián)合使用以治療惡性腫瘤。
本發(fā)明也涉及使用按照本發(fā)明的偶聯(lián)物系統(tǒng)治療惡性腫瘤的方法，這些惡性腫瘤例如腦癌，肺癌，子宮頸癌，卵巢癌，或乳腺癌，或白血病，淋巴瘤或惡性黑素瘤。
本發(fā)明也涉及用于制備按照本發(fā)明的偶聯(lián)物系統(tǒng)的試劑盒，其包括含有脂質(zhì)體溶液的第一小瓶和含有放射性核素溶液的第二小瓶，可將它們混合以易于放射性標記。此外，可與包含具有受體親和性的蛋白質(zhì)和/或分子的第三小瓶混合以獲得受體親和性偶聯(lián)物系統(tǒng)。
試劑與設備γ波譜分析用與多通道分析儀(EG&G ORTEC.Oak Ridge，TN，USA)相連的鍺測試劑(Canberra，Meriden，CT，USA)進行。Beckmann LS 6500(Beckmann，F(xiàn)ullerton，CA，USA)用于液閃計數(shù)。DSPC和膽固醇購自NorthernLipids(Vancouver，Canada)。Sephadex G-25 PD-10柱(Amersham PharmaciaBiotech AB，Uppsala，Sweden)用于放射性標記的脂質(zhì)體的純化。大環(huán)螯合劑DOTA用作脂質(zhì)體內(nèi)螯合劑且購自Macrocyclics(Richardson，TX，USA)。本研究中使用了Ultrex grade HNO3(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ，USA)和6MHCl(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA，USA)和購自Fluka(經(jīng)Sigma-Aldrich As，Norway)的雙(2-乙基己基)磷酸(HDEHP)。
用精氨酸(游離堿)將所有用于介導脂質(zhì)體陽離子裝載的離子載體調(diào)節(jié)至所需pH值。使用的所有水從Milli-Q水純化系統(tǒng)(Millipore，Bedford.MA.USA)獲得。離子交換樹脂由Bio-Rad(Hercules，CA，USA)供給。
通過用下列物質(zhì)依次洗滌將樹脂預處理用水，然后用6M HCl，隨后用丙酮，最后用水洗滌。裝柱前將樹脂貯存在水中。
使用的DMSO與4濾網(wǎng)一起貯存。
本工作中使用的232Th(NO3)4已經(jīng)貯存20多年。樣品由Nuclear ChemistryGroup，Department of Chemistry University of Oslo，Oslo，Norway提供。
3H-葉酸購自Amersham Pharmacia Biotech(Buckinghamshire，UK)。
所有其它化學試劑購自Sigma-Aldrich，Norway。
表1表示脂質(zhì)體實驗中使用的放射性核素的一些物理特性。
表1核素 t1/2γ-射線(S) ％概率*
*對每種核素僅列出最豐富的γ-射線。
數(shù)據(jù)來自Nuclear Data Sheets，Academic Press INC。
最佳方案將按照描述的步驟制備的脂質(zhì)體裝載鐳-223或鉛-212。此后，使抗體與脂質(zhì)體反應以得到在脂質(zhì)體表面的抗體分子。約100μm大小的脂質(zhì)體適合于全身給藥，但進行腔內(nèi)給藥時可使用的一般大小為200-1000μm，例如，顱內(nèi)腦腫瘤的治療，或腹膜內(nèi)卵巢癌的治療。(更大的脂質(zhì)體會減慢從注射該制劑的體腔中清除的速率，從而在腫瘤區(qū)維持高濃度。)實施例實施例1脂質(zhì)體中212Pb/212Bi的裝載方法如Hassfjell和Hoff(1994)描述的，通過從228Th源發(fā)射220Rn產(chǎn)生212Pb/212Bi。228Th源如Hassfjell和Hoff(1994)所述。將未加載體的212Pb/212Bi用0.1M HNO3從收集容器中析出，并將溶液裝載至2×20mm的AG 50W-X4陽離子交換樹脂柱。然后將212Pb/212Bi用2M HCl洗脫并將溶液蒸發(fā)干燥。再將212Pb/212Bi溶解于200μl 10mM PH5醋酸溶液中。212Pb通過測定其238.6keVγ-射線(表1)來定量。212Bi通過在放射平衡時測定其子核208Tl的583.1keVγ-射線來定量。
結果保溫時間達3天時發(fā)現(xiàn)，增加的活性的不到0.2％與脂質(zhì)體結合。
相當于30-60mM脂質(zhì)濃度的脂質(zhì)體與離子載體A23187(10-13nM)的膜(film)充分混合。然后加入大約1MBq的212Pb/212Bi并將混合物在75℃保溫30分鐘，隨后從PD-10柱上洗脫。然后使含有所加泡囊的95％以上的級分從第二個PD-10柱上洗脫。結合212Pb/212Bi的脂質(zhì)體的潛伏期通過在37℃人血清或PBS中保溫泡囊來研究。隨后對活性分布進行24小時的追蹤。
結果212Pb的裝載效率34.8％(n＝3)。
用γ波譜分析測定滯留(retention)，保溫時間達24小時的情況下，99％以上的212Pb與脂質(zhì)體結合。
實施例2脂質(zhì)體結合的212Pb衰變形成的212Bi的滯留方法如上述用212Pb裝載脂質(zhì)體。通過將反應混合物在用10mM EDTA的PBS預平衡的PD-10柱上用10mM EDTA的PBS洗脫，將脂質(zhì)體結合的放射活性分離。
3小時后，為了確保212Pb和212Bi之間暫時平衡的建立，將溶液的等份試樣裝載于10mM EDTA的PBS預平衡的PD-10柱上，以使脂質(zhì)體結合的放射性核素與游離的放射性核素分離。隨后對活性分布進行24小時的追蹤。
測定未進行分離步驟的另一等份標記性脂質(zhì)體(與層析步驟獲得的有相同的幾何學)以用作標準。進行此步驟以建立在放射平衡時212Bi/212Pb的活性比率。
結果通過對比層析分離獲得脂質(zhì)體與平衡混合物的212Bi/212Pbi比率，估計脂質(zhì)體結合的212Pb衰變后有95％以上的212Bi滯留在脂質(zhì)體內(nèi)。
此外，在兩種層析獲得的級分中對比212Bi活性的測定值。212Bi總活性的99％以上洗脫在相應于脂質(zhì)體的級分中。
實施例3研究Pb和Bi在脂質(zhì)體中可能的再裝載方法脂質(zhì)體相當于30-60mM脂質(zhì)，內(nèi)含150mM檸檬酸，30mM DOTA，用含有10mM EDTA的PBS作外部溶液，將這種脂質(zhì)體加入離子載體A23187膜(film)(玻璃瓶內(nèi)表面20-26nmol)中。然后加入212Pb和212Bi的PBS，37℃保溫。溶液的等份試樣通過PD-10柱洗脫，經(jīng)層析獲得的相當于脂質(zhì)體-洗脫物的級分用內(nèi)在Ge-測試劑(Ge-detector)測定。
結果在24小時期間，未檢測到212Pb和212Bi的裝載(＜1％)。
實施例4脂質(zhì)體中223Ra的裝載如所描述的在以227Ac為基礎的發(fā)生劑(generator)上產(chǎn)生223Ra(Larsenand Henriksen，1999)。簡言之，將227Ac和其子核素227Th保留在使用無機酸洗脫223Ra很容易的一種提取層析樹脂柱中。為向脂質(zhì)體中摻入鐳，將發(fā)生劑的洗脫溶液蒸發(fā)干燥，然后將223Ra溶解于5mM檸檬酸，pH7.4中。
相當于30-60mM脂質(zhì)濃度的脂質(zhì)體被充分地與離子載體A23187(玻璃瓶內(nèi)表面10-13nmol)的膜混合。然后加入大約50KBq的223Ra并將混合物在75℃保溫20分鐘。然后將反應混合物加入100μl的10mM EDTA中，并在PD-10柱上洗脫以分離與脂質(zhì)泡囊結合的放射性活性。
結合223Ra的脂質(zhì)體的保留通過將泡囊在37℃人血清(Sigma)或含5mM EDTA的人血清中以0.3mg總脂質(zhì)/ml血清的脂質(zhì)體濃度保溫來研究。結果列于表2中，表明223Ra非常穩(wěn)定地保留在脂質(zhì)體中。
表2保溫時間(天) 占脂質(zhì)體級分中總223Ra的％1 94.6±13 94±2.54 94.7±0.5平均標準差，n＝4實施例5判斷是否再裝載在223Ra保留實驗中有作用方法將用150mM檸檬酸，30mM DOTA水化脂質(zhì)膜形成的相當于30-60mM脂質(zhì)的脂質(zhì)體，和外部溶液PBS或血清加入離子載體A23187膜(玻璃瓶內(nèi)表面10-13nmol)中。然后加入于5mM EDTA pH7.4中的223Ra，于37℃保溫。將該溶液的等份試樣裝載至PD-10柱洗脫，層析所得相當于脂質(zhì)體的級分用內(nèi)在Ge-測試劑測定。
實施例6脂質(zhì)體中207Bi的裝載方法通過在(p.xn)天然鉛靶上反應產(chǎn)生203-207Bi并用鉛選擇性提取層析樹脂純化(Henriksen and Hoff，1998)。
本研究使用同位素Bi-混合物，其主要由205Bi和207Bi組成，此后稱作207Bi。將50μl溶于10-4M HCl中的207Bi溶液加入相當于30-60mM脂質(zhì)并已經(jīng)提前與離子載體A23187膜(玻璃瓶內(nèi)表面10-13nmol)混合的脂質(zhì)體中，并于75℃保溫30分鐘。然后將反應混合物加入100μl的10mM EDTA中，并在PD-10柱上洗脫以分離結合于脂質(zhì)泡囊的放射性活性。
結果發(fā)現(xiàn)總207Bi的32％與脂質(zhì)體結合。
實施例7脂質(zhì)體中228Ac的裝載方法通過聯(lián)合使用溶劑提取和離子交換從232Th(NO3)4制劑分離228Ac。將232Th(NO3)4(起初帶4H2O)溶解于20ml 0.1M HNO3并且加入500ml分離漏斗上，與5×100ml的2M HDEHP的庚烷溶液接觸。然后用庚烷洗滌水相三次，如所描述(Cabell，1959)隨后裝載于3×40mm的AG50W-X 12陽離子交換樹脂柱以分離228Ac。212Pb，212Bi，224Ra，和228Ra被洗脫從柱上至3M HNO3中，將溶液靜置＞20h。然后將溶液蒸發(fā)干燥，隨后用1ml 1M HNO3從容器中析出放射性核素。將此溶液裝載至3×40mm的AG50W-X12柱。212Pb，212Bi，224Ra，和228Ra再次被洗脫于3M HNO3中，228Ac被洗脫于6M HNO3中，將洗脫物蒸發(fā)干燥。然后用200μl 5mM HNO3將228Ac從容器中析出。如上所述將大約6kBq的228Ac加入含有離子載體A23187的脂質(zhì)體中，并于75℃保溫60分鐘。然后將反應混合物加入100μl的10mM EDTA中，并在PD-10柱上洗脫以分離結合于脂質(zhì)泡囊的放射性活性。將相當于裝載的泡囊的95％以上的級分匯合，然后在第二個PD-10柱上洗脫。228Ac在脂質(zhì)體中的滯留時間通過將放射性標記的泡囊在37℃人血清或PBS中保溫來確定。隨后對活性分布進行24小時的追蹤。
結果在裝載實驗中于，裝載步驟后，90-95％所加入的228Ac(針對標記和純化中的衰變進行了校正)與脂質(zhì)體結合。在滯留實驗中發(fā)現(xiàn)保溫時間達24小時的情況下，98％以上的228Ac結合于脂質(zhì)體。
實施例890Y的裝載方法在本實施例中90Y被用作示蹤劑來研究放射性標記的脂質(zhì)體的行為。在本研究中用液閃計數(shù)測定90Y和90Sr。
如Dietz and Horwitz(1992)所述，用鍶選擇性提取層析樹脂從90Sr分離90Y。這里，將0.1M HNO3中的90Sr(Amersham，Buckinghamshire，England)蒸發(fā)干燥并向殘余物中加入3M HNO3。將溶液裝到3×20mm的Sr-樹脂柱上(EiChroM，Darien，IL，USA)并將柱用5ml 3M HNO3洗滌。
此方法選擇性洗脫90Y，而Sr充分保留在柱上，使得90Sr/90Y混合物中90Sr的含量降低約103倍(Dietz and Horwitz1992)。此后，用0.05M HNO3從柱上將90Sr洗脫并將此溶液放置一周以允許90Y產(chǎn)生。然后，在第二個Sr-樹脂柱上分離放射性核素之前將溶液蒸發(fā)干燥并向殘余物中加入3MHNO3。將含有90Y的洗脫物蒸發(fā)干燥，用200μl 5M HNO3將放射性核素從容器中析出將此溶液加入含離子載體A23187(如前所述)的脂質(zhì)體中，75℃保溫60分鐘。然后將反應混合物加入50μl 10mM EDTA中，并在PD-10柱上洗脫以分離結合于脂質(zhì)泡囊的放射性活性。將相當于泡囊的95％以上的級分在第二個PD-10柱上洗脫。結合90Y的脂質(zhì)體的滯留通過將泡囊在37℃人血清或PBS中保溫來觀察。隨后對活性分布進行4天的追蹤。
結果裝載1小時并在凝膠排阻柱上純化后，加入的90Y95％以上與脂質(zhì)體結合。
在脂質(zhì)體滯留的研究中獲得下列結果5小時和1天后，99％以上是與脂質(zhì)體結合的。4天后測得與脂質(zhì)體結合的部分為98±1％。
如這些實驗中所示，脂質(zhì)體可被發(fā)射α-粒子和/或β-粒子的放射性核素標記并在生理溫度下很好地保留了這些核素。
實施例9釔-90/鐳-223 PEG化的脂質(zhì)體-葉酸-Fab’的制備用F(ab’)2Rφ骨髓瘤(IgG1亞類)的14mg/ml PBS溶液(Michalsen，Norwegian Institute of Public Health.Oslo，Norway)進行本實驗。
葉酸與抗體的偶聯(lián)首先將葉酸·2H2O溶解于二甲基亞砜(Fluka，含水量低于0.05％)中。然后將溶液裝套管于活化的4濾網(wǎng)(Fluka)上并在氬氣中黑暗貯存6-10小時。加入氚標記的葉酸(3H-葉酸)，其為3H-葉酸鉀水溶液(就檸檬酸而言為1％)。用于偶聯(lián)蛋白質(zhì)的3H-葉酸的比活性為7-7.5GBq/mol。
為偶聯(lián)骨髓瘤抗體F(ab’)2，向葉酸溶液加入10mol當量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺并于室溫保溫30分鐘將3H-葉酸激活。此后，將30-40倍摩爾過量的活化的葉酸加入14mg/ml蛋白質(zhì)的PBS中，允許反應30-60分鐘。通過加入0.2ml 0.3M甘氨酸的pH8.5的PBS/硼酸鹽結束反應。用在PBS中預平衡的PD-10柱將葉酸-F(ab’)2偶聯(lián)物(葉酸-F(ab’)2)與未反應物分離。為形成葉酸-Fab’，將葉酸-F(ab’)2在1mM二硫蘇糖醇(DTT)中室溫下保溫2小時，隨后在NAP-5大小排阻柱上洗脫。含有葉酸-Fab’的級分通過向溶液中吹氬氣后立即使溶液與脂質(zhì)體溶液混合而脫氧。
葉酸偶聯(lián)的程度通過用液閃計數(shù)儀(Beckmann LS6500)測定純化蛋白質(zhì)的3H含量并結合280nm處分光光度計讀數(shù)判定。
為定量與脂質(zhì)體結合的葉酸-Fab’，在與DTT反應之前加入痕量碘化F(ab’)2(蛋白質(zhì)按照標準步驟由IodoGen碘化)。
標記的抗體與脂質(zhì)體的偶聯(lián)DSPE-PEG2000-MPB(Northern Lipids，VA，Canada)，鈉鹽包含在5mol％總磷脂中。以對非-PEG化的脂質(zhì)體描述的相同方式，另外構成脂質(zhì)體并且也準備進行離子載體介導的陽離子裝載步驟。
在允許反應混合物于裝載步驟完畢達到室溫后，將脂質(zhì)體懸浮物脫氧化，加入葉酸-Fab’以獲得0.3-0.5mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)Bartlett磷分析(Bartlett，1958)判定脂質(zhì)濃度為1-3mM。允許葉酸-Fab’和脂質(zhì)體在室溫下反應2小時。然后將反應混合物裝載至已用PBS平衡的PD-10柱。將結合于葉酸-Fab’的PEG-脂質(zhì)體在用于葉酸-受體結合測定之前于4℃貯存12-15小時。
脂質(zhì)體結合的放射活性使用Nal孔(well)型測試劑測定，并校正雙標記樣品于不同通道內(nèi)的溢出值(spillover)。將單一核素和核素混合物的樣品用作參考。
根據(jù)對放射活性的測量，將蛋白質(zhì)濃度轉(zhuǎn)換成每脂質(zhì)體的Fab’數(shù)目，假定脂質(zhì)體大小為100nm，有8·104磷脂/泡囊(Kirpotin et al，1997)，并且骨髓瘤抗體Fab’的分子量等于52000。
細胞結合的放射性活性在加入Insta-Gel plus(Packard)后使用Nal-測試劑(比Y-90高出3倍濃度)和液閃計數(shù)儀測定(表3)。表3在有或無葉酸鹽時與抗體偶聯(lián)的90Y-脂質(zhì)體與OVCAR細胞的結合加入的脂質(zhì)體/細胞 ％結合葉酸陰性 ％結合葉酸陽性脂質(zhì)體的細胞脂質(zhì)體的細胞
脂質(zhì)體上3H-葉酸的檢測將在20mM HEPES/300mM蔗糖中的PEG脂質(zhì)體(2.5mM脂質(zhì)濃度)與偶聯(lián)3H-葉酸鹽的Fab’(于PBS中0.5mg/ml，葉酸/Fab’比率為2±0.2)反應。室溫下2小時后，將偶聯(lián)葉酸-Fab’的脂質(zhì)體在Sepharose CL-4B柱上洗脫分離。脂質(zhì)體上3H-葉酸-Fab’的量用層析獲得部分的液閃計數(shù)定量，經(jīng)測定葉酸-Fab’/脂質(zhì)體比率大約為110。
縮寫DSPC二硬脂酰磷脂酰膽堿DOTA1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷1，4，7，10 N，N’，N”，N”’四乙酸DSPE-PEG2000-MPBN-(4-(對-馬來酰亞氨基苯基)丁酰)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Northern Lipids，VA，Canada)HEPESN-2-羥乙基哌嗪-N’-2乙烷磺酸PBS磷酸鹽緩沖液EDTA乙二胺N，N’四乙酸HDEHP二(2-乙基己基)磷酸PEG聚乙二醇DTT二硫蘇糖醇參考文獻Bartlett G R.柱層析中的磷分析.生物化學雜志.234(3)，466-468(1958).Cabell M J.錒-227的純化，鑒定和中子俘獲截面，加拿大化學雜志.37，1094-1101，(1959).DeVita Jr V T，Hellman S，Rosenberg S A.癌.腫瘤學原理與實踐.第5版Lippincot-Raven，費城，紐約，美國(1997).Dietz M L和Horwitz E P.改進藥用Y-90制備的化學.應用放射同位素43，1093-1101(1992).Forssen E A.用于實體瘤靶DaunoXome的體內(nèi)設計和發(fā)展.藥物運載進展綜述24，133-150(1997).Gabizon R，Horowitz A T，Goren D，Tzemach D，Mandelbaum-Shavit F，Quasen M M，和Zalipsky S.具有與聚(乙二醇)-移植的脂質(zhì)體末端連接的葉酸靶葉酸受體體外研究.生物共軛化學(Bioconjugate Chem.)10，289-298(1999).Gabison A.脂質(zhì)體循環(huán)時間和腫瘤靶對癌癥化學療法的暗示.藥物運載進展綜述16，285-294(1995).Gaze M N.靶放射線療法在臨床實踐中的目前狀況.物理學在醫(yī)學與生物學中的應用(Phys.Med.Bol.)41，1895-1903(1996).Goins B.Phillips W T，和Klipper R.在同一動物中锝-99m標記的PEG-脂質(zhì)體的重復注射研究.脂質(zhì)體研究雜志8(2)，265-281(1998).Hall E.放射線學者的放射性生物學.Fourth Edn.JB Lippincott公司，費城，美國(1994).Hassfjell S P和Hoff P.用于產(chǎn)生Pb-212和Bi-212發(fā)生器.應用放射同位素45，1021-1025(1994).Henriksen G和Hoff P.利用鉛-選擇性提取層析樹脂分離回旋加速器產(chǎn)生的Bi-205，Bi-206和Pb-203.應用放射同位素49，357-359(1998).Hwang K J和Mauk M R.脂小泡體內(nèi)的命運γ-射線穿透角的相關研究.美國國家科學院院刊，74，4991-4995(1977).Kirpotin D，Park J W，Hong K.Zalipsky S，Wen-Lu L，Carter P，Benz C C和Papahadjopoulos D.Sterically穩(wěn)定抗-HER2的免疫脂質(zhì)體體外人乳癌細胞靶向和設計，生物化學，36，66-75，(1997).Kostarelos K，Emfietzoglou D和Stamatelou M.癌癥放射性療法的脂質(zhì)體介導的放射性核向腫瘤模型的運載定量分析.脂質(zhì)體研究雜志9(3)，407-424(1999).Kranz，D M，Roy，E J和Patrick，T A.葉酸抗效應細胞抗體的共軛物，美國專利號5，547，668(Aug.20，1996).Larsen R H，Akabani G，Welsh P和Zalutsky M R.砹-211-標記的嵌合單克隆抗體在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤和黑素瘤細胞體外細胞毒性和微劑量學.放射研究149，155-162(1998).Larsen R H，Henriksen G.挪威專利申請?zhí)朠990001(1999).Lee R J和Low P S.通過葉酸受體介導的細胞內(nèi)吞作用將脂質(zhì)體釋放到培養(yǎng)的KB細胞中.生物化學雜志269.3198-3204(1994).MacDonald R C，MacDonald R I，Menco BPhM.，Takeshita K，Subbarao N K和Hu Lan-rong.用于制備大量單層脂質(zhì)體的小體積擠壓式裝置.生物化學與生物物理學學報1061，297-303(1991).Maruyama K，Takizawa T，Takahashi N，Tagawa T，Nagaike K和IwatsuruM，在PEG末端PEG-免疫脂質(zhì)體-偶聯(lián)抗體的靶效率.藥物運載進展綜述24，235-242(1997).Mauk M R和Gamble R C.含高水平截留型放射性陽離子的脂小體的制備.分析生物化學94，302-307(1979).McClure J J和Feinendegen，L E.用于藥物治療的α-輻射體第二次Bi-年會議錄，多倫多，加拿大，June 4-5，(1998).Report from Department ofEnergy，Germantown，Md.，USAMirzadeh S，Kumar K，Ganzow，O A.通過212Pb(DOTA)2-b-衰變形成的212Bi-DOTA的化學命運.放射化學雜志60，1-10(1993).Ogihara-Umeda I，Sasaki T，Kojima S，Nishigori H.用于腫瘤影像的最佳放射性標記的脂質(zhì)體.核醫(yī)學雜志37(2)，326-332(1996).Olson F，Hunt C A，Szoka F，Vail W J和Papahadjopoulos D.通過聚碳酸酯膜擠出制備限定大小分布的脂質(zhì)體.生物化學與生物物理學學報557，9-23(1979).Pikul II S S，Parks N J，Schneider P D.胞內(nèi)輻射釋放的脂質(zhì)體體外殺死黑素瘤.外科學文獻122，1417-1420(1987).Reddy，J A和Low，P S.葉酸-介導的癌癥治療性靶和影像介質(zhì).治療藥物載體系統(tǒng)的鑒定性評論15(6)587-627(1998)Ritter M A，Cleaver J E和Tobias C A.高-LET輻射誘導大比例的非-再結合的DNA-斷裂.自然266，653-655(1977).Shinoda，T，Takagi，A，Maeda，A，Kagatani，S，Kono，Y和Hashida，M.非腫瘤-和合腫瘤鼠中葉酸-BSA的體內(nèi)命運.藥學科學雜志87(12)1521-1526，1998.Tilcock C P，Ahkong Q F和Parr M.制備脂質(zhì)體釓-DTPA-離子載體-介導的釓的主動截留的改進方法.實驗放射學26，242-247(1991).Trippett，T M和Bertino，J R.調(diào)控葉酸和還原型葉酸轉(zhuǎn)運的靶蛋白治療性策略.化學治療術雜志113-10(1999).Turner A F，Presant C A，Proffitt R T，Wiliams L E，Winsor D W和Wemer JL.111-標記的脂質(zhì)體放射量測定和腫瘤的描述.放射學166(3)，761-765(1988).Utkhede D，Yeh V，Szucs M和Tilcock C.脂小泡對釔-90的攝入.脂質(zhì)體研究雜志4(2).1049-1061(1994).
權利要求
1.偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于它包括帶有離子載體的脂質(zhì)體，且所述脂質(zhì)體內(nèi)部有螯合劑，所述脂質(zhì)體還包裹發(fā)射α粒子的放射性重核素，并且當母核素衰變后能夠或不能穩(wěn)定地保留子核素。
2.按照權利要求1的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于脂質(zhì)體內(nèi)部的螯合劑的濃度適于保留子核素。
3.按照權利要求1-2任一項的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于螯合劑選自1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)，1，4，7，10四氮雜環(huán)三癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四乙酸(TRITA)，1，4，7，10四氮雜環(huán)四癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四乙酸(TETA)，1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10N，N’，N”，N”’-四(亞甲基)膦酸(DOTMP)，1，4，7，10四氮雜環(huán)三癸烷-1，4，7，10N，N’，N”，N”’-四(亞甲基)膦酸，1，4，7，10四氮雜環(huán)四癸烷-1，4，7，10N，N’，N”，N”’-四(亞甲基)膦酸，二亞基三胺N，N’，N”五乙酸和它們的異構體衍生物，穴狀化合物[2，2，2]，穴狀化合物[3，2，2]，穴狀化合物[2，2，1]和它們的單-和雙-苯并衍生物，含電子富集(供體)基團(羥基，羧基，酯，胺，酰胺)的橋聯(lián)的杯[4]芳烴，1，10-二氮-4，7，13，16-四氧雜環(huán)十八烷-1，10N，N’二乙酸，和1，10-二氮-4，7，13，16-四氧雜環(huán)十八烷-1，10N，N’二丙二酸酯。
4.按照權利要求1-3任一項的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于所述脂質(zhì)體在膜中含有活化的基團，其允許蛋白質(zhì)或其他受體親合性分子與這些活化基團偶聯(lián)。
5.按照權利要求1-4任一項的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于所述活化的基團是聚乙二醇(PEG；即，脂質(zhì)體是植入了PEG的脂質(zhì)體/PEG化的脂質(zhì)體)，其允許蛋白質(zhì)或其他受體親合性分子與PEG鏈偶聯(lián)。
6.按照權利要求1-5任一項的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于所述脂質(zhì)體與受體結合蛋白，如單克隆或多克隆抗體或抗體片段或構建體，葉酸或其他受體親合性分子偶聯(lián)。
7.按照權利要求6的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于所述脂質(zhì)體與IgM或IgG類抗體，或這些類抗體的片段或構建體，或其他受體親合性分子偶聯(lián)。
8.按照權利要求6的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于所述脂質(zhì)體與IgM或IgG類抗體，或這些類抗體的片段或構建體偶聯(lián)，其中所述抗體，片段或構建體用葉酸和放射性核素或不同放射性核素的混合物標記。
9.按照權利要求1-8任一項的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于與所述脂質(zhì)體偶聯(lián)的抗體，抗體片段或構建體是鼠源的，嵌合的或人源的，單克隆的或多克隆的。
10.按照權利要求9的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于所述抗體或抗體片段或構建體用葉酸標記，其中的抗原結合位點直接針對葉酸結合蛋白(FBP)。
11.按照權利要求9的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于將抗體或抗體片段或構建體用葉酸標記，其中的抗原結合位點是直接針對不同于FBP的抗原。
12.按照權利要求1-11任一項的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于放射性核素是重α發(fā)射者例如211At，212Bi，213Bi，212Pb，225Ac，223Ra，224Ra，227Th。
13.按照權利要求1-12任一項的偶聯(lián)物系統(tǒng)，其特征在于子核素和母核素分別是212Bi和212Pb。
14.制備放射性標記的偶聯(lián)物系統(tǒng)的方法，其特征在于帶有離子載體和合適濃度螯合劑的脂質(zhì)體是被用重α粒子發(fā)射者穩(wěn)定地放射性標記的，這是通過將含有發(fā)射重α粒子放射線的放射性核素或放射性核素混合物與含有所述脂質(zhì)體的溶液混合并在比生理溫度高的溫度下保溫以使放射性核素向脂質(zhì)體內(nèi)轉(zhuǎn)運，從而所述脂質(zhì)體在母核素衰變后能或不能穩(wěn)定地保留子核素。
15.按照權利要求14的方法，其特征在于螯合劑選自1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)，1，4，7，10四氮雜環(huán)三癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四乙酸(TRITA)，1，4，7，10四氮雜環(huán)四癸烷-1，4，7，10N，N’，N”，N”’-四乙酸(TETA)，1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四(亞甲基)膦酸(DOTMP)，1，4，7，10四氮雜環(huán)三癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四(亞甲基)膦酸，1，4，7，10四氮雜環(huán)四癸烷-1，4，7，10 N，N’，N”，N”’-四(亞甲基)膦酸，二亞乙基三胺N，N’，N”五乙酸和它們的異構體衍生物，穴狀化合物[2，2，2]，穴狀化合物[3，2，2]，穴狀化合物[2，2，1]和它們的單-和雙-苯并衍生物，含電子富集(供體)基團(羥基，羧基，酯，胺，酰胺)的橋聯(lián)的杯[4]芳烴，1，10-二氮-4，7，13，16-四氧雜環(huán)十八烷-1，10N，N’二乙酸，和1，10-二氮-4，7，13，16-四氧雜環(huán)十八烷-1，10N，N’二丙二酸酯。
16.按照權利要求14-15任一項的方法，其特征在于所述脂質(zhì)體在膜中含有活化的基團，其允許蛋白質(zhì)或其他受體親合性分子的偶聯(lián)。
17.按照權利要求14-16任一項的方法，其特征在于所述活化的基團是聚乙二醇(PEG；即，脂質(zhì)體是植入了PEG的脂質(zhì)體/PEG化的脂質(zhì)體)，其允許蛋白質(zhì)或其他受體親合性分子與PEG鏈偶聯(lián)。
18.按照權利要求14-17任一項的方法，其特征在于將脂質(zhì)體與受體結合蛋白，如單克隆或多克隆抗體或抗體片段或構建體，葉酸或其他受體親合性分子偶聯(lián)。
19.按照權利要求18的方法，其特征在于將脂質(zhì)體與IgM或IgG類抗體，或這些類抗體的片段或構建體，或其他受體親合性分子偶聯(lián)。
20.按照權利要求18的方法，其特征在于將脂質(zhì)體與IgM或IgG類抗體，或這些類抗體的片段或構建體偶聯(lián)，其中用葉酸和放射性核素標記抗體的標準方法將抗體用葉酸和放射性核素或不同放射性核素混合物標記。
21.按照權利要求14-20任一項的方法，其特征在于與脂質(zhì)體偶聯(lián)的抗體，抗體片段或構建體是鼠源的，嵌合體的或人源的，單克隆的或多克隆的。
22.按照權利要求21的方法，其特征在于將抗體或抗體片段或構建體用葉酸標記，其中的抗原結合位點是直接針對FBP。
23.按照權利要求21的方法，其特征在于抗體或抗體片段或構建體，其中的抗原結合位點是直接針對不同于FBP的抗原。
24.按照權利要求14-22任一項的方法，其特征在于放射性核素是重α發(fā)射者例如211At，212Bi，213Bi，212Pb，225Ac，223Ra，224Ra，227Th。
25.按照權利要求14-24任一項的方法，其特征在于子核素和母核素分別是212Bi和212Pb。
26.按照權利要求1-13任一項的偶聯(lián)物系統(tǒng)的用途，用來制備適合注射或輸注至包括人在內(nèi)的哺乳動物中的藥用溶液。
27.按照權利要求26的用途，用來制備適合注射或輸注至包括人在內(nèi)的哺乳動物中的藥用溶液，其通過靜脈內(nèi)，和/或局部，和/或腫瘤內(nèi)途徑給藥。
28.按照權利要求26的用途，其結合放射免疫偶聯(lián)物或幾種放射免疫偶聯(lián)物和/或其他形式的放射性藥物治療，化療，外部照射治療或外科治療以治療惡性腫瘤。
29.用權利要求1-13任一項描述的偶聯(lián)物系統(tǒng)靶向細胞的方法，其中所述細胞表達例如但不局限于以下的受體葉酸結合蛋白，雌激素受體，睪酮受體，和各種單克隆抗體的抗原，所述方法通過向人類主體注射以實現(xiàn)將潛在治療性放射運送至表達這些受體的惡性細胞(組織)。
30.使用權利要求1-13任一項的偶聯(lián)物系統(tǒng)的方法，其通過向人類主體注射而實現(xiàn)將潛在的治療性放射運送至表達這些受體的惡性細胞(組織)，其中的惡性組織是腦癌，肺癌，宮頸癌，卵巢癌，或乳腺癌，或白血病，淋巴瘤或惡性黑素瘤。
31.用于制備權利要求1-13任一項的偶聯(lián)物系統(tǒng)的試劑盒，其特征在于包括含有脂質(zhì)體溶液的小瓶和含有放射性核素溶液的小瓶，它們混合后可以利于放射性標記。
32.用于制備權利要求1-13任一項的偶聯(lián)物系統(tǒng)的試劑盒，其特征在于包括含有脂質(zhì)體溶液的第一小瓶和含有放射性核素溶液的第二小瓶和含有具有受體親合力的分子的第三小瓶，它們混合后可以利于放射性標記并且是被受體親合性分子標記。
全文摘要
本發(fā)明涉及偶聯(lián)物系統(tǒng)，其包含帶有離子載體的脂質(zhì)體，在該脂質(zhì)體內(nèi)部有螯合劑溶液和發(fā)射α－粒子的放射性核素。本發(fā)明進一步描述了制備這種類型放射性脂質(zhì)體的方法，以及該系統(tǒng)的用途和制備該系統(tǒng)的試劑盒。
文檔編號A61K9/127GK1404402SQ01805372
公開日2003年3月19日 申請日期2001年2月21日 優(yōu)先權日2000年2月21日
發(fā)明者羅伊·H·拉森, 杰芒德·亨里克斯 申請人:抗癌治療發(fā)明公司