專利名稱：增加絕經(jīng)后婦女和低等動物脂溶性維生素的腸道吸收的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過口服L-肉毒堿和脂溶性維生素，在絕經(jīng)后婦女或低等動物中增加脂溶性維生素腸道吸收、細胞內(nèi)濃度、膽汁分泌、肝臟儲存、和/或肝臟內(nèi)濃度的方法。
背景技術(shù)：
L-肉毒堿在組織的能量提供中起著重要的作用，它調(diào)控長鏈脂肪酸進入線粒體基質(zhì)及其后續(xù)的氧化。與其在代謝中的作用一致，L-肉毒堿已被認為可以有效地降低血清中膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸的濃度，并增加抗動脈粥樣硬化的高密度脂蛋白(HDL)膽固醇的濃度。見Pola，P.等，“肉毒堿用于治療異常脂蛋白血癥患者”，Curr Ther Res 27208-16(1980)；Lacour，B.等，“肉毒堿改善血液透析患者的脂類異?！?，Lancet 12763-4(1980)；Avogaro，P.，“L-肉毒堿對人類FFA和β-羥基-丁酸鹽的急性效應(yīng)”，Pharmacol ResCommun 13433-50(1981)；和Vacha，G.M.等，“L-肉毒堿在治療血液透析患者高甘油三酯血癥中的有效性低濃度的高密度脂蛋白甘油三酯的決定作用”，Am J Clin Nutr 38532-40(1983)。已有證據(jù)顯示，L-肉毒堿及其酯通過參與對氧化損傷的膜磷脂的再?；饔?修復(fù))，增加紅細胞膜的穩(wěn)定性和完整性。見Arduini，A.等，“丙?；?L-肉毒堿治療對糖尿病大鼠紅細胞膜磷脂脂肪酸翻轉(zhuǎn)的作用”，Mol Cell Biochem15231-7(1995)；Arduini，A.等，“肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶和?；o酶A結(jié)合蛋白另兩者參與人類紅細胞膜上磷脂脂肪酸的翻轉(zhuǎn)？”，Biochem J 325811-4(1997)；和Arduini，A.等，“在4℃儲存的加成溶液懸浮的紅細胞中添加L-肉毒堿，可以減少體外溶血并增加體內(nèi)活性”，Trandfusion 37166-74(1997)。有趣的是，L-肉毒堿及其酯的這種作用是在線粒體缺失的紅細胞中表現(xiàn)的。給老年大鼠補充L-肉毒堿已被認為可以逆轉(zhuǎn)年齡相關(guān)的線粒體功能衰退，這種作用可與L-肉毒堿的膜穩(wěn)定效應(yīng)相聯(lián)系。見Hagen，T.M.等，“喂食老年大鼠酰基-L-肉毒堿部分恢復(fù)線粒體功能和流動活性”，Proc Natl Acad Sci USA 959562-6(1998)。這一發(fā)現(xiàn)對伴隨年齡顯著增長的線粒體DNA氧化損傷有著特別的重要性，其導(dǎo)致細胞代謝和功能的損害。見Hagen，T.M.等，“老年大鼠肝細胞線粒體衰退胞膜潛在性衰退，異質(zhì)性及氧化性增強”，Proc NatlAcad Sci USA 943064-9(1997)。
在發(fā)達國家，絕經(jīng)后婦女占人口總數(shù)的15％以上。預(yù)計到2030年，絕經(jīng)后婦女比例將增長至人口總數(shù)的23％。見Hill，K.，“更年期人口統(tǒng)計學(xué)”，Maturitas 23113-127(1996)。而且，許多流行病學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)更年期雌激素缺乏影響晚年的原因特異性的發(fā)病率和死亡率。從營養(yǎng)學(xué)的觀點，更年期是機體對營養(yǎng)的吸收，消化和代謝能力衰退的時期。因此，在更年期及更年期后，機體就會出現(xiàn)明顯的特異性營養(yǎng)成份缺乏的癥狀。
已被證實，絕經(jīng)后婦女基本上更易患冠心病、年齡相關(guān)的黃斑變性、骨質(zhì)疏松癥、癌癥和阿爾茨海默病。見Hill，K.，“更年期人口統(tǒng)計學(xué)”，Maturitas 23113-127(1996)。雖然這一現(xiàn)象部分與衰老及機體功能和免疫系統(tǒng)的衰退有關(guān)，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)患某些冠脈疾病的危險性(或發(fā)病率)與絕經(jīng)后婦女特異的營養(yǎng)不足或缺乏間存在顯著的相關(guān)性?，F(xiàn)有事實強烈地提示，包括脂溶性維生素，例如維生素A、D和E的機體營養(yǎng)狀態(tài)受損是影響或?qū)е逻@些疾病發(fā)生或發(fā)展的一個重要因子。例如，絕經(jīng)后和卵巢切除術(shù)后婦女比育齡期婦女患冠心病的危險性明顯升高。補充的維生素E已被證明通過延緩血清脂蛋白的氧化及抑制血管平滑肌細胞的增生，而顯著地降低冠心病的危險性。見Chan，A.C.，“維生素E和動脈粥樣硬化”，J Nutr 1281593-6(1998)；Motoyama，T.等，“服用維生素E改善心絞痛患者受損的血管內(nèi)皮依賴的血管舒張”，J Am Coll Cardiol 321672-9(1998)；和Meydani，M.等，“長期飲食補充抗氧化劑的效應(yīng)”，Ann NY Acad Sci854352-60(1998)。并且，絕經(jīng)后婦女中普遍存在的維生素D缺乏已被證實與增高的骨質(zhì)丟失和骨質(zhì)疏松癥發(fā)病風(fēng)險有關(guān)。見WHO科學(xué)組，“二十世紀(jì)九十年代有關(guān)更年期的研究”，WHO技術(shù)報告，866系列，1996，WHO，瑞士日內(nèi)瓦。并且，研究已證實絕經(jīng)后婦女的年齡相關(guān)的黃斑變性發(fā)病率與維生素A前體(類胡羅卜素)和維生素E的攝入負相關(guān)。見Seddon，J.M.等“膳食攝入類胡羅卜素、維生素A、C和E，與老年年齡相關(guān)的黃斑變性。眼疾病病例一對照研究組”，JAMA2721413-20(1994)；West，S.等，“抗氧化劑或補充物是否在年齡相關(guān)的黃斑變性中起保護作用？”，Arch Opthalmol 112222-7(1994)；Vander Hagen，A.M.等，“游離自由基和抗氧化劑補充在年齡相關(guān)的黃斑變性中作用的綜述”，J Am Optom Assoc 64871-8(1993)；和Golberg，J.等，“年齡相關(guān)的黃斑變性的相關(guān)因子。對首次國家健康及營養(yǎng)考核調(diào)查數(shù)據(jù)的分析”，Am J Epidemiol 128700-10(1998)。此外，現(xiàn)有事實提示氧化應(yīng)激是阿爾茨海默病的重要病因，補充維生素E可以降低該病的危險性。見Sinclair，A.J.等，“阿爾茨海默病和血管性癡呆中變化的血漿抗氧化劑狀態(tài)”，Int JGeriatr Psychiatry 13840-5(1998)；Morris，M.C.等，“補充維生素E及維生素C和Alzheimer癥發(fā)病危險性”，Alzheimer Dis AssocDisord 12121-6(1998)；Subramaniam，R.等，“游離自由基抗氧化劑維生素E通過對淀粉樣的β-肽(2 5-35)毒性的作用，而不是對hydroxynonenal毒性的作用，保護腦皮層突觸膜”，Neurochem Res 231403-10(1998)。
狗的疾病相關(guān)的死因中，癌癥已被證實占47％，其次是心臟疾病(12％)、腎臟疾病(7％)。貓的排名前列的疾病包括癌癥(32％)、腎臟/尿道疾病(23％)、和心臟疾病(9％)。見1997年Morris動物基金動物健康調(diào)查。動物的這些疾病被認為與某些維生素的缺乏有關(guān)，特別是抗氧化類維生素、維生素E和維生素C，及維生素A。
因此，考慮到普遍地隨著衰老而產(chǎn)生的營養(yǎng)吸收效率的降低和腸道吸收功能的退化，必須特別地增加絕經(jīng)后婦女的脂溶性維生素的營養(yǎng)狀態(tài)。并且考慮到普遍地隨著衰老而產(chǎn)生的腸道吸收功能的退化，必須特別地增加低等動物的脂溶性維生素的營養(yǎng)狀態(tài)。
發(fā)明概述申請人發(fā)現(xiàn)L-肉毒堿增加絕經(jīng)后婦女脂溶性維生素，例如維生素A、D和E的腸道吸收。因此，L-肉毒堿增加絕經(jīng)后婦女的抗氧化保護機制，并降低一些退化性疾病的危險性，例如冠心病、年齡相關(guān)的黃斑變性、骨質(zhì)疏松癥、癌癥和Alzheimer’s癥。
本發(fā)明提供了一種增加絕經(jīng)后婦女脂溶性維生素的腸道吸收、細胞內(nèi)濃度、膽汁分泌、肝臟儲存和/或肝臟內(nèi)濃度的方法。該方法包括使有需要的絕經(jīng)后婦女口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿。
本發(fā)明也提供了一種在絕經(jīng)后婦女中減少選自以下疾病的一種或更多疾病的危險性或防止其發(fā)生的方法，所述疾病為冠心病、年齡相關(guān)的黃斑變性、骨質(zhì)疏松癥、癌癥和Alzheimer’s癥。該方法包括使絕經(jīng)后婦女口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿。
本發(fā)明提供了一種增加動物脂溶性維生素的腸道吸收的方法。該方法包括使動物口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿。
本發(fā)明也提供了一種在動物中減少選自以下疾病的一種或更多疾病的危險性或防止其發(fā)生的方法，所述疾病為冠心病、腎臟疾病、泌尿系統(tǒng)疾病和癌癥。該方法包括使動物口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿。
附圖簡述

圖1說明了8小時內(nèi)每小時的α-生育酚(αTP)膽汁分泌。對照組表示為-CN(即無肉毒堿)。含肉毒堿組表示為+CN。所有的值都表達為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。每個時間點檢測5只大鼠(即n＝5)。
圖2說明了8小時內(nèi)每小時的累積α-生育酚(αTP)膽汁分泌。對照組表示為-CN(即無肉毒堿)。含肉毒堿組表示為+CN。所有的值都表達為平均值±SD。每個時間點檢測5只大鼠(即n＝5)。星號(*)表示顯著性差異，p＜0.05。
圖3說明了8小時內(nèi)每小時的α-生育酚(αTP)淋巴吸收。對照組表示為SN。含肉毒堿組表示為CK。所有的值都表達為平均值±SD。每個時間點檢測5只大鼠(即n＝5)。星號(*)表示顯著性差異，p＜0.05。
圖4說明了8小時內(nèi)每小時的累積α-生育酚(αTP)淋巴吸收。對照組表示為SN。含肉毒堿組表示為CK。所有的值都表達為平均值±SD。每個時間點檢測5只大鼠(即n＝5)。星號(*)表示顯著性差異，p＜0.05。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種增加絕經(jīng)后婦女脂溶性維生素的腸道吸收，細胞內(nèi)濃度、膽汁分泌、肝臟儲存和肝臟內(nèi)濃度的方法。該方法包括使有需要的絕經(jīng)后婦女口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿。
與此類似，使一種低等動物，例如貓或狗口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿，也可以增加該動物脂溶性維生素的腸道吸收、細胞內(nèi)濃度、膽汁分泌、肝臟儲存和肝臟內(nèi)濃度。
適當(dāng)?shù)腖-肉毒堿包括，但并不僅限于L-肉毒堿；?；?L-肉毒堿，例如乙?；鵏-肉毒堿、丙?；?L-肉毒堿、丁酰基-L-肉毒堿、戊酰基L-肉毒堿、和異戊?；鵏-肉毒堿；其可藥用的鹽；和以上任意物質(zhì)的任意組合。適當(dāng)?shù)目伤幱玫腖-肉毒堿的鹽包括，但并不僅限于醋酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、溴化物、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、氯化物、二葡糖酸鹽、十二磺酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖磷酸鹽、甘油磷酸酯、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、碘化物、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、乳清酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、三甲基乙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、三氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、十一烷酸鹽和L-肉毒堿的酸加成鹽。優(yōu)選L-肉毒堿具有低的吸水性。優(yōu)選的L-肉毒堿鹽包括，但并不僅限于L-肉毒堿L-酒石酸鹽、L-肉毒堿酸延胡索酸鹽、L-肉毒堿己二酸鹽和L-肉毒堿檸檬酸鎂鹽。
對于絕經(jīng)后婦女，有效增加脂溶性維生素吸收的量是使脂溶性維生素腸道吸收增多的L-肉毒堿的量。典型地，在絕經(jīng)后婦女中，每天應(yīng)服用約10mg至2g的L-肉毒堿或其可藥用的鹽，優(yōu)選每日服用約250至750mg的L-肉毒堿或其可藥用的鹽。更優(yōu)選的服用量是約400至600mg的L-肉毒堿或其可藥用的鹽。通常，一個絕經(jīng)后婦女每進食1,000kcal的飲食可服用50至800mg，優(yōu)選100至400mg的L-肉毒堿或其可藥用的鹽。此處使用的術(shù)語“飲食”對于絕經(jīng)后婦女被定義為一個婦女每天消耗的食物量(卡路里)。
對于一種低等動物，例如哺乳動物，有效增加脂溶性維生素吸收的量是使脂溶性維生素腸道吸收增多的L-肉毒堿的量。低等動物的L-肉毒堿的服用量因動物的年齡或疾病狀況不同而改變。一般低等動物的L-肉毒堿或其藥用的鹽服用量為約1至100mg/kg體重，優(yōu)選量為約5至75mg/kg體重，更優(yōu)選的量為約5至25mg/kg體重。一般低等動物的L-肉毒堿或其可藥用鹽的服用量也可為約25至5,000mg/kg飲食，優(yōu)選量為約50至1,000mg/kg食物，更優(yōu)選的量為約75至500mg/kg食物。此處使用的術(shù)語“飲食”對于非人(低等)動物被定義為這種動物每天消耗的食物量(重量)。
適當(dāng)?shù)闹苄跃S生素包括，但并不僅限于維生素A、維生素D、維生素E(特指α-生育酚)；它們的前體，例如維生素E乙酸酯；含有1至約20個碳原子的酯，例如維生素A棕櫚酸酯和維生素E乙酸酯；及其任意組合。依據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，脂溶性維生素指維生素E。此處使用的術(shù)語“維生素E”包括α-，β-，δ-，和γ-生育酚及它們相應(yīng)的?；?。一個絕經(jīng)后婦女每天的特定脂溶性維生素的服用量是依據(jù)國家科學(xué)院頒布的U.S.RDA。典型地，絕經(jīng)后婦女的每日維生素E服用量約為8至800mg。其優(yōu)選的服用量約為8至400mg。
一種低等動物每天的特定脂溶性維生素的服用量是各種動物組織的推薦量。脂溶性維生素的服用量因動物的年齡，疾病狀況及維生素補給量不同而變化。一般低等動物的維生素E服用量為約30至5,000國際單位(IU)/kg，優(yōu)選量為約100至1,000IU/kg飲食。一般低等動物的維生素A服用量為約5,000至1,000,000IU/kg飲食，優(yōu)選量為約10,000至500,000IU/kg飲食。一般低等動物的維生素D服用量約250至10,000IU/kg飲食，優(yōu)選量為約500至3,000IU/kg飲食。
所指低等動物可是家養(yǎng)的寵物，例如貓或狗。優(yōu)選的是切除卵巢或中性的動物，特別指切除卵巢或中性的貓或狗。
優(yōu)選L-肉毒堿和脂溶性維生素同時服用，更優(yōu)選地對于絕經(jīng)后婦女或低等動物使用同樣的劑量單位形式。L-肉毒堿和脂溶性維生素優(yōu)選飯時或飯后服用。
同時服用雌激素，L-肉毒堿和脂溶性維生素，可以進一步增強絕經(jīng)后婦女的抗氧化系統(tǒng)。雌激素的用量可以根據(jù)雌激素替代治療中公知的方法確定。一般絕經(jīng)后婦女應(yīng)隨L-肉毒堿和脂溶性維生素服用約300至600μg的雌激素。
由于L-肉毒堿和脂溶性維生素一起服用可以增強抗氧化防御機制，L-肉毒堿和脂溶性維生素也可被用于減少絕經(jīng)后婦女患某些退化性疾病的危險性或防止其發(fā)生，例如冠心病、年齡相關(guān)的黃斑變性、骨質(zhì)疏松癥、癌癥和Alzheimer’s癥。本發(fā)明方法應(yīng)是一種長期治療，即持續(xù)數(shù)月、數(shù)年、或余生，以降低發(fā)生以上疾病的危險性。
服用L-肉毒堿也可減少低等動物患病危險性或防止某些退化性疾病的發(fā)生，例如冠心病、腎臟疾病、泌尿系統(tǒng)疾病和癌癥。本發(fā)明方法應(yīng)是一種長期治療，即持續(xù)數(shù)月、數(shù)年、或余生，以降低以上疾病的危險性。
L-肉毒堿，脂溶性維生素和任選雌激素可以制成適于絕經(jīng)后婦女的口服劑量單位形式，包括但并不僅限于膠囊、藥片和顆粒，例如粉末和藥囊。對于絕經(jīng)后婦女，口服劑量單位形式應(yīng)為液體或固體，優(yōu)選為固體形式。劑量單位形式也可進一步包括添加劑，包括但并不僅限于pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑、食用香料、味道-掩飾劑、香味劑、保濕劑、張力調(diào)節(jié)劑(tonicifier)、著色劑、表面活性劑、增塑劑、滑潤劑、配量載體、增溶劑、賦形劑、稀釋劑、崩解劑、或以上各種成份的任意組合。
L-肉毒堿和脂溶性維生素也可制成適于低等動物的口服劑量單位形式，包括但并不僅限于食物，例如動物食品、膠囊、藥片和顆粒，例如粉末和藥囊。動物可以通過食物、水、動物食品、藥片或膠囊服用L-肉毒堿和脂溶性維生素。對于低等動物，口服劑量單位形式應(yīng)為液體或固體形式?？诜┝繂挝灰部蛇M一步包括以上各種成份的任意組合。
優(yōu)選實施方案的說明以下實施例非限制性地描述了本發(fā)明。所有部分和比例除非特別說明均按重量給出。
實施例1飲食肉毒堿增加卵巢切除大鼠的α-生育酚肝臟水平和膽道分泌實施本研究，以測定飲食肉毒堿對卵巢切除大鼠的α-生育酚肝臟濃度和膽道分泌的影響材料和方法
32只10周齡的體重為214±6g的雌性Sprague-Dawley大鼠(HarlanSprague Dawley，印第安納波利斯，IN)被分別置于帶有不銹鋼網(wǎng)底的塑料籠中，籠子置于23℃恒溫的無窗室中，室內(nèi)有當(dāng)照-黑暗循環(huán)控制，330pm至330am為光照期，330am至330pm為黑暗期。大鼠經(jīng)1周適應(yīng)新環(huán)境，可以自由進食去離子水并隨意喂食Dyets公司(伯利恒，PA，USA)配制的富含鋅的AIN-93G飼料(Reeves等，J Nutr1993；1231939-1951)，該飼料含7％大豆油為脂肪源。添加碳酸鋅提供所需要的鋅。大鼠第一周末平均體重為230±12g，在禁食16小時后，氟烷麻醉下行卵巢切除術(shù)。初次血樣(0周)采集于5只隨機挑選的大鼠。
術(shù)后復(fù)原一周后，大鼠依據(jù)體重分為兩個實驗組一組大鼠喂食富含鋅的AIN-93G飼料，并添加去除α-生育酚的大豆油，產(chǎn)自新澤西里奇菲爾德Degussa公司的150ppm的SipernatTM50，即水合二氧化硅并補充150mg/kg的L-肉毒堿。對照組大鼠喂食與第一組同樣的飼料，但以150ppm的α-D-葡萄糖代替150mg/kg的L-肉毒堿。兩組大鼠的正常食物攝入量為約15g/天/只大鼠。每組隨機挑選5只大鼠于第1、3、5、8周采集血樣。
在第8周末，對兩組中平均體重約340±15g的大鼠行膽道置管術(shù)。禁食16小時后，依前人的描述(Noh等，J Nutr Biochem 1999；10110-117)行膽總管置管術(shù)。簡要地說，在氟烷麻醉下(2.01氧氣/分鐘含2.0％氟烷)行腹部正中切口后，PE-10管(Clay Adams，斯帕克斯，MD)被置入膽總管。一只聚硅酮導(dǎo)管(醫(yī)用硅化管，Dow Corning，Midland，MI)插入胃底部。注入導(dǎo)管沿膽管外置通過右肋。置管后的大鼠被分別放在獨立控制的籠中，使它們在控溫30℃的溫暖環(huán)境中復(fù)原至少20小時。術(shù)后立即通過十二指腸導(dǎo)管持續(xù)性用注射泵(935型哈佛器材，南內(nèi)蒂克，MA)以3.0ml/h的量注入葡萄糖-磷酸緩沖液(PBS)(mmol/l單位277葡萄糖，6.75磷酸氫二鈉，16.5磷酸二氫鈉，115氯化鈉，和5氯化鉀；pH6.7)。
手術(shù)復(fù)原以后，大鼠被灌輸脂肪乳液，每24mlPBS包括565μmol三油精(95％，Sigma化學(xué)公司，圣路易斯MO)，和396μmol牛磺膽酸鈉。8小時內(nèi)每小時收集膽汁至預(yù)稱重的圓錐形的離心管，離心管內(nèi)有30μg的n-丙基五倍子酸鹽并置于裝滿冰的大口杯中。大鼠在膽汁收集后，以斷脖法處死并解剖肝臟。樣品在分析前被儲存于-70℃。
脂肪用弗氏法(Folch等，J Biol Chem1957；226497-509)提取。依據(jù)Zaspel等(Anal.Biochem.1983；130146-150)描述的方法測定α-生育酚的含量。簡要的說，把150μl膽汁和一定數(shù)量的α-生育酚醋酸鹽(作為內(nèi)部參照)移入一個玻璃管。在丙酮抽提，硫酸鈉干燥及1,000xg離心后，上清液再經(jīng)PTFE注射過濾器(0.45μm，Alltech聯(lián)合公司，迪爾菲爾德，IL)過濾，氮氣干燥后，重溶于一定體積的氯仿-甲醇(1∶3，v/v)溶液中。抽提物經(jīng)配有C-18反相層析柱(Alltima C18，5μm，4.6×150mm，Alltech聯(lián)合公司，迪爾菲爾德，IL)并含System Gold軟件(Beckman器材公司，富勒敦，CA)的Beckman HPLC系統(tǒng)分離。脫氣甲醇以2ml/min用于流動相。典型的保持時間是α-生育酚4.1分鐘，α-生育酚醋酸鹽5.3分鐘。檢測波長控制在292nm(166模式紫外-檢測儀，Beckman器材)。α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍在47.6至190.5ng。
使用Excel 97(微軟公司，1997)和PC SAS(SAS研究所，1996)進行統(tǒng)計分析。斯氏t-檢驗和單向ANOVA用于對比兩組的平均值。當(dāng)P＜0.05時，認為有顯著性差異。
結(jié)果膽汁流量無差異(肉毒堿組為7.9±1.4ml/8小時，而對照組為8.9±1.8ml/8小時)。而肉毒堿組大鼠8小時內(nèi)膽汁分泌的α-生育酚(53.1±9.3nmol)比對照組(41.7±7.3nmol)明顯升高(P＜0.05)。圖1和圖2分別圖解了α-生育酚的分泌速率和累積分泌量。肉毒堿組大鼠的肝臟α-生育酚濃度(129.6±19.5nmol/g)比對照組(100.7±20.2nmol/g)明顯升高。同樣的，飲食中添加肉毒堿的大鼠，每100mg總脂類中α-生育酚的濃度明顯升高。肉毒堿組大鼠的肝臟α-生育酚/磷脂比例(4.8±0.6nmol/μmol)比對照組(3.3±0.4nmol/μmol)明顯升高(P＝0.001)。這些發(fā)現(xiàn)證實飲食肉毒堿可以改善卵巢切除大鼠肝臟α-生育酚濃度。
實施例2飲食肉毒堿增加卵巢切除大鼠淋巴吸收α-生育酚的能力實施本研究，以測定服用肉毒堿對卵巢切除大鼠腸道吸收α-生育酚的影響材料和方法32只10周齡的體重為208±8g的雌性Sprague-Dawley大鼠(HarlanSprague Dawley，印第安納波利斯，IN)按實施例1中描述的方法飼養(yǎng)和喂食。在第二周末，大鼠平均體重為240±9g，在禁食16小時后，氟烷麻醉下行卵巢切除術(shù)。初次血樣采集(0周)于6只隨機挑選的大鼠。
術(shù)后大鼠立即按實施例1中描述的分為兩個實驗組，即一組大鼠飼料中添加肉毒堿，另一組作為對照組。兩組大鼠的正常食物攝入量為約15g/天/只大鼠。
在第五周末，兩組中平均體重約340±15g的大鼠行淋巴管置管術(shù)。禁食16小時后，依前人的描述(Noh等，同上)行腸系膜淋巴管置管術(shù)。簡要的說，在氟烷麻醉下(2.0升氧氣/分，含2.0％氟烷)行腹部正中切口后，聚乙烯管(SV31管，Dural Plastics，奧本，澳大利亞)被置入腸系膜淋巴管，并以氰基丙烯酸酯膠(Krazy Glue，哥倫布OH)固定。一只聚硅酮導(dǎo)管(醫(yī)用硅化管，Dow Corning，Midland，MI)插入胃底部。注入導(dǎo)管沿淋巴管外置通過右肋。置管后的大鼠被分別放在獨立控制的籠中，使它們在控溫30℃的溫暖環(huán)境中復(fù)原至少20小時。術(shù)后立即通過十二指腸導(dǎo)管持續(xù)性用注射泵(935型哈佛器材，南內(nèi)蒂克MA)以3.0ml/h的量注入葡萄糖-磷酸緩沖液(PBS)(mmol/l單位277葡萄糖，6.75磷酸氫二鈉，16.5磷酸二氫鈉，115氯化鈉，和5氯化鉀；pH6.7)。
手術(shù)復(fù)原以后，大鼠被灌輸24mlPBS中包含1μCi[羧基-14C]-三油精(比活性112.0mCi/mmol，DuPont NEN，MA。波士頓)，565μmol三油精(95％，Sigma化學(xué)公司，圣路易斯，MO)，3.56μmolα-生育酚(all-racα-生育酚，97％，Aldrich化學(xué)公司，密爾沃基，WI)和396μmol?；悄懰徕c的脂肪乳液。8小時內(nèi)每小時收集淋巴液至預(yù)稱重的圓錐形的離心管，離心管內(nèi)有30μg的n-丙基沒食子酸鹽及4mgNa2EDTA并置于裝滿冰的燒杯中。大鼠在淋巴液收集后，以斷頸椎法處死并收集肝臟。樣品在分析前被儲存于-70℃。
用Reheja等(J Lipid Res 1973；14695-697)介紹的比色法，從脂肪提取物中(Folch等，同上)檢測組織的總磷脂。依據(jù)實施例1中Zaspel等(同上)描述的方法測定α-生育酚。依據(jù)實施例1中方法進行統(tǒng)計學(xué)分析。
結(jié)果淋巴流量無差異(肉毒堿組為22.6±4.2ml/8小時，而對照組為24.5±2.5ml/8小時)。而肉毒堿組大鼠8小時內(nèi)α-生育酚的淋巴吸收(899±200nmol/8h)比對照組(587±92nmol/8h)明顯升高(P＜0.05)。圖3和圖4分別圖解了α-生育酚的每小時吸收速率和累積吸收。肉毒堿組大鼠的14C-三油精吸收(53.5±4.0％劑量)比對照組(47.6±5.0％劑量)略升高(P＜0.05)。肉毒堿組大鼠的淋巴α-生育酚/磷脂比例(4 6.9±8.8nmol/μmol)和淋巴α-生育酚/膽固醇比例(82.7±17.1nmol/μmol)與對照組(36.3±6.2nmol/μmol和60.8±6.0nmol/μmol)均有顯著差異。這些發(fā)現(xiàn)首次證實服用肉毒堿可以增加α-生育酚的淋巴吸收。
以上涉及的所有專利、申請、論文、出版物，及檢測方法在此引入作為參考。
根據(jù)以上的詳細說明，本專利發(fā)明的許多變化形式將被本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解。這些明顯的變化都包括在所附權(quán)利要求的完整范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種增加絕經(jīng)后婦女的脂溶性維生素腸道吸收的方法，該方法包括使有需要的絕經(jīng)后婦女口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿或其可藥用的鹽。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中脂溶性維生素選自維生素A、維生素D、維生素E及其任意組合。
3.權(quán)利要求2中的方法，其中脂溶性維生素是維生素E。
4.一種增加絕經(jīng)后婦女的脂溶性維生素腸道吸收的方法，該方法包括使有需要的絕經(jīng)后婦女每天口服約10mg至2g的L-肉毒堿或其可藥用的鹽和約8至800mg的維生素E。
5.權(quán)利要求4中的方法，其中L-肉毒堿是L-肉毒堿L-酒石酸鹽、L-肉毒堿延胡索酸鹽、L-肉毒堿己二酸鹽、或L-肉毒堿檸檬酸鎂鹽。
6.權(quán)利要求4中的方法，其中每天服用約250至750mg的L-肉毒堿
7.權(quán)利要求4中的方法，其中每天服用約8至400mg的維生素E。
8.權(quán)利要求4中的方法，進一步包括服用L-肉毒堿或其可藥用的鹽和維生素E時，同時服用雌激素。
9.一種增加絕經(jīng)后婦女的脂溶性維生素膽汁分泌的方法，該方法包括使有需要的絕經(jīng)后婦女口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿或其可藥用的鹽。
10.一種增加絕經(jīng)后婦女肝臟脂溶性維生素濃度的方法，該方法包括使有需要的絕經(jīng)后婦女口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿或其可藥用的鹽。
11.一種減少絕經(jīng)后婦女患以下一種或多種疾病的危險性的方法，這些疾病選自冠心病、年齡相關(guān)的黃斑變性、骨質(zhì)疏松癥、癌癥和Alzheimer’s癥，該方法包括使絕經(jīng)后婦女口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿或其可藥用的鹽類。
12.一種增加動物的脂溶性維生素腸道吸收的方法，該方法包括使動物口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿或其可藥用的鹽類。
13.權(quán)利要求12中的方法，其中給藥量為每天每公斤體重約1至100mg的L-肉毒堿或其可藥用的鹽。
14.權(quán)利要求12中的方法，其中給藥量為每天每公斤飲食約25至5,000mg的L-肉毒堿或其可藥用的鹽。
15.權(quán)利要求12中的方法，其中給藥量為每天每公斤飲食約30至5,000IU維生素E。
16.權(quán)利要求12中的方法，其中給藥量為每天每公斤飲食約5,000至1,000,000IU維生素A。
17.權(quán)利要求12中的方法，其中給藥量為每天每公斤體重約250至10,000IU維生素D。
18.權(quán)利要求12中的方法，其中脂溶性維生素和L-肉毒堿或其可藥用的鹽類以統(tǒng)一劑量單位形式服用。
19.權(quán)利要求18中的方法，其中劑量單位形式是膠囊、藥片、粉末或藥囊。
20.權(quán)利要求12中的方法，其中動物為家養(yǎng)的寵物。
21.權(quán)利要求20中的方法，其中動物為狗或貓。
22.權(quán)利要求20中的方法，其中動物為卵巢切除術(shù)后或中性的動物。
23.一種減少動物患以下一種或多種疾病的危險性的方法，這些疾病選自心臟病、腎臟疾病、泌尿系統(tǒng)疾病、和癌癥，該方法包括使有需要的動物口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L-肉毒堿或其可藥用的鹽。
全文摘要
申請人發(fā)現(xiàn)L－肉毒堿增加絕經(jīng)后婦女的腸道脂溶性維生素，例如維生素A、D和E的吸收。因此，L－肉毒堿增強絕經(jīng)后婦女的抗氧化防御機制，并降低一些退化性疾病的危險性，例如冠心病、年齡相關(guān)的黃斑變性、骨質(zhì)疏松癥、癌癥和Alzheimer’s癥。本發(fā)明提供了一種在絕經(jīng)后婦女中增加脂溶性維生素的腸道吸收、細胞內(nèi)濃度、膽汁分泌、肝臟儲存、和/或肝臟內(nèi)濃度的方法。該方法包括使有需要的絕經(jīng)后婦女口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L－肉毒堿。本發(fā)明同時提供一種增加動物脂溶性維生素腸道吸收的方法。該方法包括使動物口服一種脂溶性維生素和增加這種脂溶性維生素吸收的有效量的L－肉毒堿。
文檔編號A61P25/28GK1429110SQ01809296
公開日2003年7月9日 申請日期2001年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月10日
發(fā)明者K·L·格羅斯, K·歐文, S·I·科 申請人:希爾氏寵物營養(yǎng)品公司, 朗扎有限公司, 堪薩斯州立大學(xué)研究基金會