專利名稱：作為防污染化妝品試劑的鞣花酸的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明實(shí)質(zhì)上涉及鞣花酸，它的鹽，它的金屬絡(luò)合物，衍生自羥基的它的單醚或聚醚，單?；蚨圊；苌锖退奶妓狨セ虬被姿狨パ苌镒鳛榉牢廴净瘖y品試劑的一種新應(yīng)用。
城市污染由各種類型的化學(xué)產(chǎn)品，異生素和顆粒構(gòu)成。
三種主要種類的污染物對(duì)皮膚和毛發(fā)產(chǎn)生有害的作用氣體，重金屬和顆粒，這些顆粒是其上吸附了大量有機(jī)化合物的燃燒殘?jiān)?br> 最先并且直接暴露于環(huán)境有毒試劑的是最外面的組織。皮膚被直接并且經(jīng)常暴露于前氧化環(huán)境中。氧化劑的環(huán)境來(lái)源包括氧氣，太陽(yáng)的紫外線照射以及，在被污染的空氣中，臭氧，氧化氮和氧化硫。由民用和工業(yè)燃燒的一級(jí)和二級(jí)產(chǎn)物如單環(huán)的和多環(huán)的芳烴代表的大氣污染物也是氧化應(yīng)力的主要來(lái)源。皮膚對(duì)氧化應(yīng)力的作用特別敏感，并且最外層作為抗氧化損傷屏障。在大多數(shù)環(huán)境中，與角蛋白物質(zhì)反應(yīng)后，氧化劑多半被中和，但形成的反應(yīng)產(chǎn)物可能對(duì)細(xì)胞和組織產(chǎn)生化學(xué)浸蝕。
作為皮膚屏障的角質(zhì)層是空氣和皮膚組織的接觸部位。脂質(zhì)/蛋白質(zhì)兩相結(jié)構(gòu)是這種皮膚屏障功能的決定性因素。這些元素可與氧化劑反應(yīng)，并被損傷，這將促進(jìn)脫皮現(xiàn)象。臭氧誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)可以兩種方式損傷皮膚1)角質(zhì)層的脂質(zhì)的氧化和降解可損傷角質(zhì)層的屏障功能。外脂和蛋白結(jié)構(gòu)的分布似乎是很多皮膚病的觸發(fā)因素(牛皮癬，遺傳過(guò)敏性皮炎和刺激性皮炎)。
2)在皮膚上層中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的增加的形成能觸發(fā)皮膚毗鄰層中化學(xué)浸蝕。臭氧(O3)與不飽和脂質(zhì)的反應(yīng)涉及對(duì)雙鍵的加成反應(yīng)。這個(gè)過(guò)程將脂鏈的裂解、醛氫過(guò)氧化物和過(guò)氧化氫的形成引入第二階段。這是一種被自由基介導(dǎo)的特殊的機(jī)制，其不同于通常描述的脂過(guò)氧化作用機(jī)制。被臭氧誘導(dǎo)的二級(jí)或三級(jí)脂氧化產(chǎn)物，其比具有更長(zhǎng)生存期的臭氧更惰性，可以增長(zhǎng)臭氧的作用。由于它們相對(duì)的穩(wěn)定性，脂質(zhì)氧化和過(guò)氧化產(chǎn)物即膽甾醇氧化物和醛具有在不直接暴露于O3的較遠(yuǎn)的部位損傷細(xì)胞的潛能。
在角質(zhì)表層上的有效的氧化侵蝕可促使下層發(fā)炎的過(guò)程，導(dǎo)致吞噬細(xì)胞的反射增進(jìn)，其通過(guò)產(chǎn)生氧化劑，將放大最初的氧化過(guò)程。
在城市污染中，伴隨的暴露于O3和紫外線，可導(dǎo)致協(xié)同的氧化應(yīng)力。
同樣地，認(rèn)為在臭氧和燃燒衍生的有機(jī)化合物之間存在協(xié)同作用。
重金屬組成另一類污染物。
作為基本的養(yǎng)分，以微量的形式存在的金屬離子是身體必需的。例如，涉及多肽的幾種功能如酶促，結(jié)構(gòu)和免疫功能需要金屬輔因子。
然而，其它金屬離子，特別是重金屬離子，當(dāng)它們處于非生理濃度時(shí)，可能損傷這些功能。因此，過(guò)度曝射在金屬的環(huán)境可導(dǎo)致毒性效應(yīng)。
在工業(yè)化國(guó)家進(jìn)行的生態(tài)學(xué)研究顯示存在于大氣中的金屬量正在增加。伴隨著被污染食物的攝食和暴露于大氣金屬，這導(dǎo)致人體組織中重金屬含量的增加。
重金屬蓄積的作用可能是極端危險(xiǎn)的，并且它們的毒性部分歸因于損傷蛋白質(zhì)的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致降低它們的催化活性。被損傷的蛋白質(zhì)可能變得具有抗原性，并引起免疫反應(yīng)。
而且，來(lái)自于空氣中存在的污染物顆粒的金屬如鋅，銅，鈷，鎂，汞或鎳的蓄積引起兒童的記憶障礙。
導(dǎo)致金屬毒性效應(yīng)的另一個(gè)機(jī)制是在非生理濃度下，重金屬對(duì)天然生理輔因子的競(jìng)爭(zhēng)性取代。因此，控制大氣中污染物重金屬對(duì)于預(yù)防與暴露于金屬有關(guān)的疾病是必需的。
由于重金屬對(duì)環(huán)境的污染增加和在生態(tài)系中它們普遍存在，皮膚、毛發(fā)和可及粘膜提供最大的接觸面積，從而促進(jìn)金屬的蓄積和隨后吸收入人體。
存在于工業(yè)制造產(chǎn)品，化學(xué)制品，珠寶，衣服，藥品，色料和清潔產(chǎn)品中的某些金屬和金屬化合物在皮膚組織中的初級(jí)刺激反應(yīng)，變態(tài)反應(yīng)和致癌性反應(yīng)中被涉及。
環(huán)境中作為主要罪魁禍?zhǔn)椎慕饘偈倾~，鈷，鋅，鎂，汞，鎳和鉛。
由金屬引發(fā)的皮炎引起的皮疹是困擾暴露于大量的某些金屬離子環(huán)境中的人們的一個(gè)難題。暴露于鎳環(huán)境大部分是由于在珠寶制品、表帶和衣物紐扣中頻繁使用這種金屬。由于皮炎的發(fā)展對(duì)鎳過(guò)敏是在某些職業(yè)中存在的工業(yè)危害。金屬沉積在毛發(fā)上是一種不可避免的現(xiàn)象。
毛發(fā)是金屬的強(qiáng)大吸收體。毛發(fā)對(duì)金屬的結(jié)合是如此牢固，使得一旦這些被結(jié)合的金屬被纖維的陰離子部位捕獲，它們難以被取出來(lái)。毛發(fā)結(jié)合金屬的程度通常取決于幾種因素，如纖維的大小，它的孔隙率和暴露時(shí)間。金屬如銅，鉛和鐵可干擾化學(xué)處理如毛發(fā)的染色和長(zhǎng)效卷發(fā)。
對(duì)于這些重金屬粒子，毛發(fā)也是一個(gè)優(yōu)選的結(jié)合部位。這是由于角蛋白纖維包含結(jié)合陽(yáng)離子重金屬并蓄積它們的陰離子部位。某些化妝品包含金屬如鎂，銅或鐵。由角蛋白纖維吸收的這些金屬可能干擾化學(xué)處理如染色，漂白或長(zhǎng)效卷發(fā)效果。如美國(guó)專利US-5 635 167所描述，這些相互作用可能在染色或沉淀過(guò)程中導(dǎo)致出現(xiàn)問題。
已證實(shí)某些重金屬能滲透入皮膚并蓄積(A.B.G.Landsdown.CriticalReviews in Toxicology，1995，25397-462)。在高濃度下，它們可誘導(dǎo)膜脂質(zhì)上的氧化機(jī)制，直接的細(xì)胞毒性，容易導(dǎo)致細(xì)胞壞死和細(xì)胞親核物質(zhì)的烷基化，這些可能引起過(guò)敏現(xiàn)象或致癌作用。
另一大類污染物由顆粒形式的燃燒殘?jiān)M成，在這些顆粒上吸附了大量有機(jī)化合物，特別是多環(huán)芳烴(PAHs)。這些被吸附到由城市空氣攜帶的顆粒和灰塵的表面上的多環(huán)芳烴可滲透到皮膚組織，并且在那里被生物轉(zhuǎn)化。它們?cè)诟闻K中的新陳代謝，其在參考文獻(xiàn)中被詳細(xì)描述，導(dǎo)致單羥基的代謝物(解毒途徑)，環(huán)氧化物和二醇環(huán)氧化物(toxifying途徑)的形成。在皮膚中可觀察到相似的現(xiàn)象。已知這些化合物對(duì)皮膚具有致癌和致免疫作用。
在美容和治療的處理過(guò)程中已預(yù)見一些方案，其通過(guò)用具有含硫基團(tuán)的化合物來(lái)保護(hù)組織，所述化合物具有重金屬螯合劑的性質(zhì)，例如歐洲專利0 557 042 A1中的金屬硫蛋白和歐洲專利申請(qǐng)0 914 815 A1中的具有含硫基團(tuán)的氨基酸化合物。
英國(guó)專利申請(qǐng)2 333 705提及組合物中乙二胺二琥珀酸對(duì)于治療重金屬誘導(dǎo)的皮膚刺激的應(yīng)用。
而且，文獻(xiàn)EP-A-0 496 173描述了含鞣花酸的五倍子提取物結(jié)合鞣酸和水解鞣質(zhì)，來(lái)防止自由基的有害作用。所述文獻(xiàn)也預(yù)見了一種作為防曬劑以免受紫外線B照射的化妝品應(yīng)用，紫外線B導(dǎo)致皮膚的老化。
很多現(xiàn)有專利基本上覆蓋了鞣花酸由于它的除色素，防紫外線，抗癌和抗炎性能而產(chǎn)生的應(yīng)用。
因此提出的問題是使皮膚免受在城市污染中遇到的、單獨(dú)或聯(lián)合作用的氣體、重金屬和有機(jī)化合物和它們的有害作用，所述有機(jī)化合物是燃燒殘?jiān)?br> 目前已非常令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，鞣花酸，它的鹽，它的金屬絡(luò)合物，衍生自羥基的它的單醚或聚醚衍生物，它的單?；蚨圊；苌镆约八奶妓狨セ虬被姿狨パ苌镌诰植渴┯弥械膽?yīng)用，使得保護(hù)角質(zhì)蛋白物質(zhì)，皮膚和覆蓋物免受氣體，重金屬和作為燃燒殘?jiān)挠袡C(jī)化合物的有害作用成為可能。
本申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)鞣花酸使得保存和保護(hù)角質(zhì)蛋白物質(zhì)，皮膚和覆蓋物免受污染的有害作用成為可能。
鞣花酸顯示出作為一種分子的主要的價(jià)值，即對(duì)抗污染對(duì)皮膚的有害作用是有效的。它具有一個(gè)在低濃度下行使抗各種污染物的作用的優(yōu)點(diǎn)。
鞣花酸，也稱為2，3，7，8-四羥基-(1)苯并吡喃(5，4，3-cde)(1)苯并吡喃-5，10-二酮，是一種眾所周知的屬于多酚基團(tuán)的分子，并存在于植物界。可參考Merck Index 20th版(1996)，No.3588。
文獻(xiàn)FR-A-1 478 523公開了一種純化鞣花酸的方法，還公開了用這種方法獲得的純化的鞣花酸。
鞣花酸具有下列化學(xué)式 其包含四個(gè)稠環(huán)。
鞣花酸是可在市場(chǎng)上買到的，尤其可購(gòu)自法國(guó)Sigma公司。
本發(fā)明的一個(gè)主題是鞣花酸，它的鹽，它的金屬絡(luò)合物，衍生自羥基的它的單醚或聚醚衍生物，它的單酰基或多?；苌镆约八奶妓狨セ虬被姿狨パ苌镒鳛榉牢廴净瘖y品試劑，在局部施用中的一種應(yīng)用。
表述“防污染化妝品試劑”表示一種保護(hù)皮膚和角質(zhì)物質(zhì)的試劑，以便防止、削弱和/或抑制有毒氣體如臭氧、金屬和作為燃燒殘?jiān)挠袡C(jī)化合物的有害作用。
將鞣花酸和它的衍生物用作化妝品試劑來(lái)捕集有害氣體和/或用作重金屬螯合化妝品試劑和/或用作化妝品試劑來(lái)防止尤其是由多環(huán)芳烴引起的接觸性過(guò)敏反應(yīng)。
本發(fā)明的一個(gè)主題還是鞣花酸和它的衍生物在制備或?yàn)榱酥苽溆糜诰植渴┯玫姆牢廴净瘖y品組合物的應(yīng)用。
在本發(fā)明的上下文中，鞣花酸鹽，特別包含金屬鹽，尤其是它的堿金屬或堿土金屬如鈉和鈣鹽，銨鹽如甲基谷氨酰胺，二乙醇胺，三乙醇胺，膽堿和雙-三乙胺鹽，氨基酸鹽，尤其是堿性氨基酸如精氨酸，賴氨酸和鳥氨酸的鹽，金屬絡(luò)合物，特別包含具有鋅和銅的金屬絡(luò)合物，單?；蚨圊；苌?，特別包含飽和的或不飽和的含2-22個(gè)碳原子的酰基。優(yōu)選這些?；鶎?duì)應(yīng)于乙酸，棕櫚酸，油酸，亞麻酸，花生四烯酸，硬脂酸，巴西烯酸，芥酸，山崳酸，和(所有Z)-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸。上述提及的單醚或多醚衍生物是，特別是，含1-4個(gè)碳原子的烷氧基衍生物，或鞣花酸的一個(gè)或多個(gè)羥基與糖或糖鏈的縮合衍生物。特別是3-甲氧基鞣花酸或其與糖如葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖的單醚或多醚衍生物。
上述提及的醚或?；苌锟捎媚切┍绢I(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的多酚的醚化或?；椒ǐ@得。某些也可通過(guò)從植物中提取來(lái)獲得。
相對(duì)于組合物的總重量，在本發(fā)明中使用的化妝品組合物將有利地包含0.001％-10％和優(yōu)選0.01％-5％重量的鞣花酸，它的鹽，它的金屬絡(luò)合物，衍生自羥基的它的單醚或多醚，單?；蚨圊；苌锖退奶妓狨セ虬被姿狨パ苌?。
這個(gè)組合物還包含至少一種其它的防污染化合物。
所述化合物可尤其選自花色素和/或它的衍生物，包含一個(gè)硫醚官能團(tuán)的化合物，亞砜或砜，麥角硫因(ergothionine)和/或它的衍生物，重金屬螯合劑如N，N’-聯(lián)芐基亞乙基-二胺-N，N’-二乙酸衍生物，抗氧化劑，和雨久花科植物的細(xì)胞提取物。
在本發(fā)明中使用的化妝品組合物還可包含化妝品可接受的介質(zhì)，其更特別地由水和/或任選的化妝品可接受的有機(jī)溶劑組成。
它們可選自親水有機(jī)溶劑，兩親溶劑和親油有機(jī)溶劑或它們的混合物。
在親水有機(jī)溶劑中，可提及的是，例如線性或支化的、含1-8個(gè)碳原子的低級(jí)單醇，如乙醇，丙醇，丁醇，異丙醇和異丁醇，含6-80個(gè)環(huán)氧乙烷的聚乙二醇，多元醇如丙二醇，異戊二醇，丁二醇，甘油，山梨醇，單烷基或二烷基異山梨醇，其中的烷基包含1-5個(gè)碳原子，如二甲基異山梨醇，乙二醇醚，如二甘醇一甲基醚或一乙基醚，和丙二醇醚，例如二丙二醇甲醚。
可提及的兩親有機(jī)溶劑包括多元醇如丙二醇(PPG)衍生物，如聚丙二醇的酯和脂肪酸的酯，PPG的衍生物和脂肪族醇的衍生物，例如PPG-23油基醚和PPG-36油酸鹽。
可提及的親油有機(jī)溶劑有例如包括脂肪族酯如己二酸二異丙酯，己二酸二辛酯和苯甲酸烷基酯。
優(yōu)選有機(jī)溶劑選自單官能團(tuán)或多官能團(tuán)醇，任選氧乙烯化的聚乙二醇，聚丙二醇酯，山梨醇和它的衍生物，二烷基異山梨醇，乙二醇醚和聚丙二醇醚，和脂肪族酯。
有機(jī)溶劑可為組合物總重量的5％-98％。
為使在本發(fā)明中使用的組合物更適于使用，更柔軟以便應(yīng)用，更有營(yíng)養(yǎng)和更軟化，在這些組合物的介質(zhì)中加入脂肪相是可能的。
相對(duì)于組合物的總重量，優(yōu)選脂肪相為0-50％。
該脂肪相可包含一種或多種油，優(yōu)選選自以下物質(zhì)-揮發(fā)的或不揮發(fā)的，線性、支化的或環(huán)狀的，有機(jī)修飾的或非有機(jī)修飾的，水溶或脂溶的硅氧烷；-礦物油如液態(tài)石蠟和液態(tài)礦脂；-動(dòng)物來(lái)源的油如全氫化角鯊烯；-植物來(lái)源的油如甜杏仁油，鱷梨油，蓖麻油，橄欖油，霍霍巴油，
芝麻油，花生油，澳洲堅(jiān)果油，葡萄子油，菜子油或椰子油；-合成油如purcellin oil和異鏈烷烴；-氟代油和全氟代油；-脂肪酸酯如purcellin oil。
所述油相還可包含作為脂族物質(zhì)的一種或多種脂肪族醇，脂肪酸或蠟(石蠟，聚乙烯蠟，巴西棕櫚蠟或蜂蠟)。
按照已知的方式，在本發(fā)明中使用的組合物還可包含在化妝品中普遍使用的輔助劑，如標(biāo)準(zhǔn)含水或親油膠凝劑和/或增稠劑，親水或親油活性劑，防腐劑，抗氧化劑，日用香料，乳化劑，保濕劑，著色劑，脫色劑，溶角蛋白劑，維生素，潤(rùn)膚劑，螯合劑，表面活性劑，聚合物，酸化或堿化劑，增量劑，自由基清除劑，神經(jīng)酰胺，防曬劑，尤其是防紫外線劑，昆蟲拒斥劑，減肥劑，染料，殺菌劑和去頭屑劑。
這些各種輔助劑的用量是那些在本領(lǐng)域中常規(guī)使用的用量。
不必說(shuō)，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員會(huì)注意選擇按照本發(fā)明加入組合物中的任選的化合物，使得本發(fā)明組合物的內(nèi)在優(yōu)點(diǎn)性能不被、或基本上不被預(yù)期的附加物不利地影響。
按照本發(fā)明使用的組合物可以通常用于局部施用的任何形式存在，尤其是以含水、含水-醇或含油溶液，水包油或油包水或多重乳狀液，含水或含油凝膠，液態(tài)、糊狀或固態(tài)無(wú)水產(chǎn)品或使用內(nèi)孢囊將油分散在含水相中的分散液形式存在，所述這些內(nèi)孢囊可以是聚合物納米顆粒如納米球和納米膠囊，或最好是離子和/或非離子型的類脂囊。
在本發(fā)明中使用的組合物可以是程度不同的流體，并且可具有白色或有色膏，軟膏，乳劑，乳液，漿液，膏狀，摩絲或固體的外觀。
它們可任選以氣溶膠形式施用于皮膚上。
它們也可以固體形式施用，例如以棒狀形式施用。
它們也可用作護(hù)理產(chǎn)品和/或化妝品。
按照本發(fā)明的組合物可具有3-8，優(yōu)選5-7的pH值。
本發(fā)明的另一個(gè)主題是保護(hù)人體免受污染影響的化妝處理方法，其是將化妝有效量的鞣花酸，它的鹽，它的金屬絡(luò)合物，衍生自羥基的它的單醚或聚醚，它的單?；蚨圊；苌镆约八奶妓狨セ虬被姿狨パ苌锸┯糜谄つw。
按照本發(fā)明的另一種保護(hù)人體免受污染影響的化妝處理方法是如上述說(shuō)明對(duì)皮膚施用本發(fā)明的化妝品組合物。
下列實(shí)施例實(shí)質(zhì)上是意圖舉例說(shuō)明本發(fā)明的，而非限制本發(fā)明。
在存在細(xì)胞內(nèi)氫過(guò)氧化物和過(guò)氧化物酶的條件下，DCFH被氧化成熒光2，7-二氯熒光黃(DCF)。
然后用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)洗滌用鞣花酸預(yù)處理24小時(shí)的細(xì)胞，并與在培養(yǎng)基中配制的濃度為320μM的DCFH-DA溶液(500μl/孔)接觸30分鐘。暴露于臭氧中用PBS緩沖液再次洗滌細(xì)胞，然后與在PBS中配制的濃度為200μM的鞣花酸溶液接觸。隨后在濕潤(rùn)氣氛、37℃培養(yǎng)箱中，將它們暴露于臭氧(10ppm)中。臭氧誘導(dǎo)的類脂氫過(guò)氧化物的測(cè)量暴露于臭氧中不同的時(shí)間0，5，10和20分鐘之后，測(cè)量由于氫過(guò)氧化物的產(chǎn)生引起的熒光DCF的形成(485nm激發(fā)屏蔽和530nm發(fā)射屏蔽)。結(jié)果在缺失和存在200μM鞣花酸的條件下，臭氧對(duì)培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞的毒性作為暴露時(shí)間的函數(shù)。
每次，將未保護(hù)的對(duì)照組的熒光值設(shè)為100％。然后將存在鞣花酸的條件下得到的數(shù)值表示為相對(duì)于這個(gè)對(duì)照數(shù)值的百分?jǐn)?shù)。鞣花酸明顯地降低臭氧誘導(dǎo)的應(yīng)力。暴露5分鐘這個(gè)保護(hù)作用處于最大限度(誘導(dǎo)的應(yīng)力下降71.8％)。暴露20分鐘后保護(hù)作用仍然明顯(誘導(dǎo)的應(yīng)力下降47.7％)。
在體外，從生物模型開始，使用培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)-在我們的試驗(yàn)條件下，一種大氣污染物的典型試劑如臭氧，導(dǎo)致出現(xiàn)足夠的應(yīng)力；-鞣花酸對(duì)由這種污染物誘導(dǎo)的作用發(fā)揮高度明顯的保護(hù)作用。2.對(duì)重金屬的細(xì)胞毒性的保護(hù)原理
重金屬如鎘，鎳，鉛，汞等對(duì)各種器官包括皮膚的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用。通過(guò)中性紅結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞生存力的技術(shù)使得證明鞣花酸對(duì)鎘的毒性的細(xì)胞保護(hù)作用成為可能。細(xì)胞的培養(yǎng)和培養(yǎng)條件對(duì)獲自整形外科的人角質(zhì)細(xì)胞的單層培養(yǎng)進(jìn)行研究。在100μl培養(yǎng)基中，以25000細(xì)胞/cm2的標(biāo)準(zhǔn)，將細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)皿的D-3上。在37℃的富含5％CO2的濕潤(rùn)氣氛中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞的處理最初，用增加濃度(0，10，25，50，75，100，150和200μM)的氯化鎘(CdCl2)處理細(xì)胞24小時(shí)，以便確定它的細(xì)胞毒性。在第二階段，在存在鞣花酸(200和100μM的濃度，相當(dāng)于對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的鞣花酸的最大劑量和最大劑量的一半)的條件下，用相同濃度的CdCl2處理細(xì)胞24小時(shí)。細(xì)胞生存力的測(cè)定在處理的結(jié)尾，通過(guò)中性紅結(jié)合試驗(yàn)(POS 55/006)和在550nm處讀數(shù)確定細(xì)胞生存力(參考文獻(xiàn)Borenfreund，E and Puerner，J.A.(1984)ASimple quantitative procedure using monolayer cultures for cytotoxicity assays.Tissue Culture Methods；97-9)。
用PBS緩沖液漂洗細(xì)胞以去除處理溶液，然后在中性紅溶液(100μl)中于37℃培養(yǎng)三小時(shí)，該中性紅溶液在培養(yǎng)基中配制成0.5mg/ml的濃度。然后PBS緩沖液漂洗細(xì)胞，隨后在甲醛/鈣溶液中固定一分鐘。然后用乙醇/乙酸溶液(100μl/孔)萃取中性紅。通過(guò)在分光廣度計(jì)上讀數(shù)550nm處的光密度，確定萃取的數(shù)量。
然后計(jì)算誘導(dǎo)細(xì)胞生存力下降50％(IC-50)的CdCl2的濃度。結(jié)果缺失或存在兩個(gè)濃度100和200μM鞣花酸的條件下，氯化鎘對(duì)培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性(n＝4)。
IC-50為39μM的單獨(dú)氯化鎘顯示足夠的毒性。在存在鞣花酸的條件下，氯化鎘的細(xì)胞毒性大大的降低(其相應(yīng)于IC-50增加)-在100μM鞣花酸條件下，細(xì)胞毒性降低約2.5倍；-在200μM鞣花酸條件下，細(xì)胞毒性降低約4.3倍；在體外從生物模型開始，使用培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)-在我們的試驗(yàn)條件下，一種大氣污染物(重金屬)的典型試劑如氯化鎘，產(chǎn)生高的毒性；-鞣花酸對(duì)這種污染物的毒性發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。3.對(duì)由多環(huán)芳烴(PAHs)的皮膚代謝誘導(dǎo)的親核體的烷基化的保護(hù)原理吸附到由城市大氣傳送的顆粒和灰塵表面上的多環(huán)芳烴(PAHs)可滲透到皮膚組織，并在那里被生物轉(zhuǎn)化。在肝臟中它們的代謝，其在文獻(xiàn)中被詳細(xì)描述，導(dǎo)致單羥基代謝物(解毒途徑)、環(huán)氧化物和二醇環(huán)氧化物(toxifying途徑)的形成。在皮膚中遵循相同的途徑。環(huán)氧化物和二醇環(huán)氧化物的toxifying途徑產(chǎn)生親核體(蛋白質(zhì)和DNA)的烷基化，其通過(guò)研究放射標(biāo)記(14C-苯并-[a]芘)的PAH的新陳代謝來(lái)測(cè)量對(duì)這些大分子的共價(jià)結(jié)合而被證實(shí)是可能的。連續(xù)或重復(fù)暴露于污染物之后，在蛋白質(zhì)被烷基化的情況下，它的潛在毒性可引起接觸性超敏反應(yīng)。
研究的原理是通過(guò)測(cè)量共價(jià)結(jié)合于蛋白質(zhì)的放射性，證實(shí)鞣花酸對(duì)由于放射標(biāo)記的B[a]P的皮膚新陳代謝產(chǎn)生的烷基化的活性種的保護(hù)作用。研究和培養(yǎng)的細(xì)胞類型
對(duì)獲自整形外科的人角質(zhì)細(xì)胞的單層培養(yǎng)進(jìn)行研究。以53000細(xì)胞/cm2的標(biāo)準(zhǔn)，將細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)皿的D-3上。在37℃，富含5％CO2的濕潤(rùn)氣氛中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞的處理將細(xì)胞與共培育的14C-B[a]P(20μM)和購(gòu)自法國(guó)Sigma的鞣花酸(100μM)接觸24小時(shí)。接觸之后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，在相同的緩沖液(0.5ml)中刮除，然后在液氮中冷凍，并保存于-80℃直至分析。共價(jià)結(jié)合細(xì)胞蛋白質(zhì)的測(cè)量按照Hoellinger等的方案，采用在96孔微量培養(yǎng)板中進(jìn)行過(guò)濾的方法(H.Hoellinger，M.Sonnier，J.Gray，T.A.Connors，J.Pichon和N.H.Nam.In vitro covalent binding of cismethrin，bioresmethrin and their commonalcohol to hepatic proteins.Toxicol.Appl.Pharmacol.，1985，77，11-18)，測(cè)量細(xì)胞蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合。
用10％高氯酸(50μl)在微量培養(yǎng)板孔中沉淀細(xì)胞蛋白質(zhì)的等分部分(200μl)。然后將培養(yǎng)板移至一個(gè)真空下的過(guò)濾系統(tǒng)，其中通過(guò)空吸吸出孔的內(nèi)容物，并且蛋白質(zhì)保留在濾膜上，用溶劑乙酸乙酯(3×200μl)，丙酮(200μl)，乙醇(200μl)和PBS緩沖液(200μl)洗滌。這一系列洗滌的目的是從蛋白質(zhì)中去除未共價(jià)結(jié)合的任何放射活性物質(zhì)。分別回收微量培養(yǎng)板過(guò)濾器，并在37℃下，于1N氫氧化鈉(400μl)中消化保留在它們表面的蛋白質(zhì)24小時(shí)。隨后取樣分析蛋白質(zhì)，并計(jì)算溶液的放射活性。
結(jié)果表示為每毫克蛋白質(zhì)結(jié)合B[a]P的毫微摩爾數(shù)(nmol)。結(jié)果在缺失和存在100μM濃度的鞣花酸的條件下，苯并(a)芘對(duì)培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞的共價(jià)結(jié)合(n＝4)。
B(a)P共價(jià)結(jié)合不含鞣花酸含鞣花酸在每mg蛋白質(zhì)的nmol B(a)P中在每mg蛋白質(zhì)的nmol B(a)P中平均值±SEM 平均值±SEM0.28±0.07μM0.09±0.02μM單獨(dú)的苯并(a)芘在20μM的濃度下顯示具有共價(jià)結(jié)合至角質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)的相當(dāng)大的反應(yīng)性，為每毫克蛋白質(zhì)結(jié)合0.28nmol的B(a)P。在存在鞣花酸的條件下，B(a)P的反應(yīng)性大大降低(反應(yīng)性減少約3.1倍)。
使用來(lái)自人上皮的細(xì)胞(角質(zhì)細(xì)胞/皮膚)，從體外生物模型開始，我們發(fā)現(xiàn)-在我們的試驗(yàn)條件下，一種大氣污染物的典型試劑(PAH)如苯并(a)芘產(chǎn)生與它的代謝能力有關(guān)的潛在的毒性，以產(chǎn)生烷基化的物種；-鞣花酸發(fā)揮對(duì)由這種污染物誘導(dǎo)的這種形式的毒性的保護(hù)作用。配方實(shí)施例實(shí)施例1按照通常的制備技術(shù)，混合下列組分以制備一種乳液。
局部施用的組合物鞣花酸的鈉鹽 5g用50mol環(huán)氧乙烷氧乙烯化的聚乙3g二醇單甘油二硬脂酸酯(monodiglyceryl 3gstearate)液態(tài)礦脂24g鯨蠟醇 5g水 適量100g實(shí)施例2同樣地，使用下列化合物，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備乳液鞣花酸的二乙醇胺鹽1g棕櫚酸辛酯 10g異硬脂酸甘油酯4gPurcellin oil23g維生素E 1g甘油 3g水適量 100g實(shí)施例3同樣地，使用下列化合物，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備乳液。3-甲氧基鞣花酸 0.01g棕櫚酸辛酯 10g異硬脂酸甘油酯4g液態(tài)礦脂 20g山梨醇2g維生素E 1g甘油 3g水適量 100g實(shí)施例4同樣地，使用下列化合物，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備乳液?jiǎn)我阴；坊ㄋ? 0.5g棕櫚酸辛酯 10g異硬脂酸甘油酯4g液態(tài)礦脂 24g維生素E 1g甘油 3g水適量 100g實(shí)施例5從下面組分開始，配制下列組合物鞣花酸的鈣鹽1.5g霍霍巴油 13g甲基異丙基對(duì)-苯甲酸基苯甲酸酯 0.05g山梨酸鉀0.3g環(huán)戊二烯并二甲基硅氧烷 10g十八烷醇 1g硬脂酸4g聚乙二醇硬脂酸酯 3g維生素E 1g甘油 3g水適量 100g實(shí)施例6從下面組分開始，配制下列組合物絡(luò)合鋅的鞣花酸1g霍霍巴油 13g甲基異丙基對(duì)-苯甲酸基苯甲酸酯 0.05g山梨酸鉀0.3g環(huán)戊二烯并二甲基硅氧烷 10g十八烷醇 1gN，N’-雙(3-羥芐基)乙二胺-N，N’-二乙 0.01g酸硬脂酸4g聚乙二醇硬脂酸酯 3g維生素E 1g甘油 3g水適量 100g實(shí)施例7從下面組分開始，配制下列組合物鞣花酸的膽堿鹽 0.5g霍霍巴油 13g甲基異丙基對(duì)-苯甲酸基苯甲酸酯 0.05g山梨酸鉀 0.3g環(huán)戊二烯并二甲基硅氧烷10g十八烷醇 1g硬脂酸 4g水風(fēng)信子的細(xì)胞提取物0.05g聚乙二醇硬脂酸酯 3g維生素E1g甘油 3g水 適量100g通過(guò)這個(gè)方法獲得水風(fēng)信子(Eichhornia crassipes)的細(xì)胞提取物用水洗滌12水風(fēng)信子莖(12 water hyacinth stems)，然后粗排水。在切碎機(jī)(切碎處理機(jī))中處理后，獲得了700g的磨料。加入700ml的H2O，然后加入300ml的MilliQ H2O。在切碎處理機(jī)中進(jìn)一步處理5分鐘，在8000×G，Whatmann GFD下離心20分鐘，然后GFF過(guò)濾并凍干如此獲得5.43g的凍干產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.鞣花酸，它的鹽，它的金屬絡(luò)合物，衍生自羥基的它的單醚或聚醚、單?；蚨圊；苌?、和它的碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物，作為防污染化妝品試劑在局部施用中的應(yīng)用。
2.鞣花酸，它的鹽，它的金屬絡(luò)合物，衍生自羥基的它的單醚或聚醚、單?；蚨圊；苌铩⒑退奶妓狨セ虬被姿狨パ苌?，作為用于捕集有毒氣體的化妝品試劑和/或作為重金屬螯合化妝品試劑和/或作為用于防止由多環(huán)芳烴引起的接觸性超敏反應(yīng)的化妝品試劑在局部施用中的應(yīng)用。
3.鞣花酸，它的鹽，它的金屬絡(luò)合物，衍生自羥基的它的單醚或聚醚，單?；蚨圊；苌?，和它的碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物在制備或用于制備適于局部施用的防污染化妝品組合物時(shí)的應(yīng)用。
4.如同權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)中所要求的應(yīng)用，其特征在于，所述鞣花酸鹽包含金屬鹽，特別是堿金屬或堿土金屬如鈉和鈣鹽，胺鹽如甲基谷氨酰胺，二乙醇胺，三乙醇胺，膽堿和雙-三乙胺鹽，氨基酸鹽，尤其是堿性氨基酸如精氨酸，賴氨酸和鳥氨酸的鹽，具有鋅和銅的金屬絡(luò)合物，單酰基或多?；苌锇柡偷幕虿伙柡偷暮?-22個(gè)碳原子的?；?。優(yōu)選這些?；鶎?duì)應(yīng)于乙酸，棕櫚酸，油酸，亞麻酸，花生四烯酸，硬脂酸，巴西烯酸，芥酸，山崳酸，和(所有Z)-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸。上述提及的單醚或多醚衍生物是含1-4個(gè)碳原子的烷氧基衍生物，或鞣花酸的一個(gè)或多個(gè)羥基與糖或糖鏈的縮合衍生物，特別是3-甲氧基鞣花酸或其與糖如葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖的單醚或多醚衍生物。
5.如同權(quán)利要求3或4中所要求的應(yīng)用，其特征在于，相對(duì)于組合物的總重量，所述防污染化妝品組合物包含0.001％-10％，并優(yōu)選0.01％-5％重量的鞣花酸，它的鹽，它的金屬絡(luò)合物，衍生自羥基的它的單醚或聚醚，單?；蚨圊；苌?，和它的碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物。
6.如同權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所要求的應(yīng)用，其特征在于，所述組合物還包含至少一種其它的防污染化合物。
7.如同權(quán)利要求6中所要求的應(yīng)用，其特征在于，所述化合物選自花色素和或它的衍生物，包含硫醚官能團(tuán)的化合物，亞砜或砜，麥角硫因和/或它的衍生物，重金屬螯合劑如N，N’-聯(lián)芐基亞乙基二胺-N，N’-二乙酸衍生物，抗氧化劑，和雨久花科植物的細(xì)胞提取物。
8.如同權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所要求的應(yīng)用，其特征在于，所述組合物還包含一種化妝品可接受的介質(zhì)，其由水和/或任選的化妝品可接受的有機(jī)溶劑組成。
9.權(quán)利要求8中所要求的應(yīng)用，其特征在于，所述有機(jī)溶劑選自親水有機(jī)溶劑，兩親溶劑和親油有機(jī)溶劑，或它們的混合物。
10.如同權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)中所要求的應(yīng)用，其特征在于，所述有機(jī)溶劑優(yōu)選選自單官能或多官能醇，任選氧乙烯化的聚乙二醇，聚丙二醇酯，山梨醇和它的衍生物，二烷基異山梨醇，乙二醇醚，聚丙二醇醚和脂肪族酯。
11.如同權(quán)利要求8或10中所要求的應(yīng)用，其特征在于，所述有機(jī)溶劑為所述組合物的總重量的5％-98％。
12.如同權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)中所要求的應(yīng)用，其特征在于，所述組合物還包含至少一種脂肪相。
13.如同權(quán)利要求12中所要求的應(yīng)用，其特征在于，相對(duì)于所述組合物的總重量，所述油相為0-50％。
14.如同權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)中所要求的應(yīng)用，其特征在于，所述組合物還包含至少一種添加劑，其選自標(biāo)準(zhǔn)含水的或親油膠凝劑和/或增稠劑，親水或親油活性劑，防腐劑，抗氧化劑，日用香料，乳化劑，保濕劑，著色劑，脫色劑，溶角蛋白劑，維生素，潤(rùn)膚劑，螯合劑，表面活性劑，聚合物，酸化或堿化劑，增量劑，自由基清除劑，神經(jīng)酰胺，防曬劑，尤其是防紫外線劑，昆蟲拒斥劑，減肥劑，染料，殺菌劑和去頭屑劑。
15.如同權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)中所要求的應(yīng)用，其特征在于，所述組合物以含水、含水-醇或含油溶液，水包油或油包水或多重乳液，含水或含油凝膠，液態(tài)、糊狀或固態(tài)無(wú)水產(chǎn)品或使用內(nèi)孢囊將油分散在含水相中的分散液形式存在。
16.如同權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)中所要求的應(yīng)用，其特征在于，所述組合物具有白色或有色膏，軟膏，乳劑，乳液，漿液，膏狀，摩絲或固體的外觀。
17.一種保護(hù)人體免受污染影響的化妝品處理方法，其特征在于，它是將化妝用的有效量的鞣花酸，它的鹽，它的金屬絡(luò)合物，衍生自羥基的它的單醚或聚醚衍生物，它的單?；蚨圊；苌镆约八奶妓狨セ虬被姿狨パ苌锸┯糜谄つw上。
18.一種保護(hù)人體免受污染影響的化妝品處理方法，其特征在于，它是將權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)中限定的組合物施用于皮膚上。
全文摘要
本發(fā)明涉及鞣花酸作為化妝品防污染劑在局部施用中的應(yīng)用，和一種保護(hù)生物體免受污染影響的化妝品處理方法。
文檔編號(hào)A61K8/00GK1429097SQ0180963
公開日2003年7月9日 申請(qǐng)日期2001年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月18日
發(fā)明者達(dá)尼埃爾·迪什, 若澤·科托維奧, 菲利普·卡特魯 申請(qǐng)人:歐萊雅