專利名稱：綿羊虱Bovicola ovis變應(yīng)原的處理的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼虱變應(yīng)原的新的核苷酸序列，但是特別不意味著其僅來自咀嚼虱Bovicola ovis，所述核苷酸序列和蛋白質(zhì)變應(yīng)原在診斷、治療和預(yù)防虱侵染和相關(guān)的變應(yīng)原性疾病中的用途。
背景技術(shù)：
虱是哺乳動(dòng)物和鳥物種常見外寄生物。馴養(yǎng)動(dòng)物最重要的虱是吸虱(昆蟲綱虱目嚙毛虱科虱目)(InsectaPhthirapteraTrichodectidaeAnoplura)，它們具有能穿透宿主皮膚并且能攝取組織體液和血液的口器，和咀嚼虱(昆蟲綱虱目嚙毛虱科食毛目)(InsectaPhthirapteraTrichodectidaeMallophaga)，它們主要從皮膚表面，頭發(fā)，皮毛，絨毛或者羽毛攝取營養(yǎng)。咀嚼虱是常見的并且對(duì)于牛，綿羊，山羊和馬在經(jīng)濟(jì)學(xué)上特別重要，并且在狗，貓和鳥包括馴養(yǎng)的雞上也有發(fā)現(xiàn)。
Bovicola ovis，咀嚼虱的一個(gè)例子，是世界范圍常見的綿羊外寄生蟲。被這種寄生蟲侵染的綿羊長(zhǎng)期以來一直被認(rèn)為引起皮膚刺激隨后蹭癢而傷害到羊毛(Johnson，Boray，Plant和Blunt，1993；Lipson和Bacon-Hall，1976)。受到侵染的綿羊的羊皮會(huì)發(fā)生退色，產(chǎn)量降低和其它不期望的品質(zhì)(Kettle和Lukies，1982；Kettle和Lukies，1984；Cleland，Dobson和Meade，1989)。另外，本發(fā)明人最近的工作表明一百多年以前就認(rèn)識(shí)到的羊羔皮的嚴(yán)重缺陷褶皺也與綿羊被B.ovis侵染有關(guān)(Heath，Cooper，Cole和Bishop，1995；Heath，Cole，Bishop，Pfeffer，Cooper，和Risdon P，1995)。本發(fā)明人還證明了褶皺特征在于有變應(yīng)性反應(yīng)特征的表面血管周圍皮炎(Heath，Cole，Bishop，Pfeffer，Cooper，和Risdon P，1995)。近期研究支持了變應(yīng)性免疫應(yīng)答對(duì)綿羊褶皺產(chǎn)生中寄生蟲產(chǎn)物的作用(Bany，Pfeffer，Phegan和Heath，1995；Bany，Pfeffer和Phegan，1995；Pfeffer，Phegan和Bany，1997；Pfeffer，Bany，Phegan和Osborn，1993)。預(yù)計(jì)對(duì)寄生蟲的變應(yīng)性應(yīng)答歸因于皮膚刺激，皮膚刺激使得受侵染綿羊蹭癢并且損傷了它們的羊毛并且傷害它們的皮膚，嚴(yán)重降低了受侵染羊羔皮的價(jià)值。
如果將對(duì)羊毛的損害和預(yù)防侵染的成本都計(jì)算在內(nèi)，則綿羊受到B.ovis侵染的經(jīng)濟(jì)上的后果是相當(dāng)大的(McLeod，1995)。其中還要加上由于褶皺而降低羊羔皮品質(zhì)帶來的巨大代價(jià)。除了直接經(jīng)濟(jì)損失之外，連續(xù)應(yīng)用常規(guī)處理來控制寄生蟲侵染(合成殺蟲劑和昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)有有害作用，因?yàn)闅埩粑镞M(jìn)入環(huán)境和食物鏈并且也損及農(nóng)民的安生。
消費(fèi)者強(qiáng)烈要求在控制寄生蟲侵染中減少使用這樣的有害常規(guī)處理，而且寄生蟲對(duì)一些合成殺蟲劑產(chǎn)生耐藥性迫使改進(jìn)現(xiàn)行控制策略并且期望有新的控制方法和物質(zhì)。
本發(fā)明的一個(gè)目的是在一定程度上實(shí)現(xiàn)該愿望或者至少對(duì)公眾提供一種有用的選擇。
本申請(qǐng)人鑒定了一種寄生蟲抗原(變應(yīng)原)，其對(duì)受感染綿羊激發(fā)變應(yīng)原性反應(yīng)。在鑒定的變應(yīng)原中，純化了命名為Bol的蛋白質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行了氨基酸測(cè)序，并且獲得了編碼cDNA，并且在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。本發(fā)明廣泛涉及這些變應(yīng)原和它們?cè)谠\斷，預(yù)防和處理寄生蟲侵染和相關(guān)的變應(yīng)原性疾病中的用途。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及來自咀嚼虱的新的蛋白質(zhì)變應(yīng)原的鑒定，純化，測(cè)序和在重組體中產(chǎn)生或者合成形式，包括至少包含該蛋白質(zhì)的一個(gè)B細(xì)胞或T細(xì)胞表位的所述蛋白質(zhì)的部分。
因此，一方面，從廣義上說，本發(fā)明包括具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的基本上純的多肽，基本上具有相同活性的該多肽的片段或者變體。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了基本上如上所述的多肽，其中衍生自動(dòng)物身上的寄生虱的多肽對(duì)受到虱子侵染的動(dòng)物誘導(dǎo)了體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，或者基本上具有相同活性的其片段或者變體。
更優(yōu)選地，所述變體或片段插入了所述多肽的B細(xì)胞或者T細(xì)胞表位。
因此本發(fā)明還包括可以用來控制虱子對(duì)動(dòng)物的侵染和控制相關(guān)的變應(yīng)性疾病的本發(fā)明多肽的變體和片段。
一般來說，可以受咀嚼虱侵染的動(dòng)物包括綿羊，馬，牛，狗，貓或者鳥包括雞。
本發(fā)明還包括肽類似物，包括但不限于1.其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被其相應(yīng)的D-氨基酸置換的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道通過標(biāo)準(zhǔn)方法可以合成上述氨基酸序列(vetro-inverso aminoacid sequences)；參見例如Chorev和Goodman，1993；2.模擬肽化合物，其中肽鍵被對(duì)代謝降解更有抗性的結(jié)構(gòu)置換。參見例如Olson等，1993；和3.其中各個(gè)氨基酸被類似結(jié)構(gòu)例如偕-二氨基烷基或者烷基丙二酰基置換的化合物，其具有或者沒有修飾的末端或烷基，?；蛘甙啡〈愿淖兯鼈兊碾姾?。
使用這樣的替代結(jié)構(gòu)能夠提供明顯延長(zhǎng)的體內(nèi)半壽期，因?yàn)樗鼈冊(cè)谏項(xiàng)l件下對(duì)降解更具有抗性。
肽類似物組合合成方法和肽和肽類似物的篩選方法是本領(lǐng)域公知的(參見例如Gallop等，1994；Hogan，1997)。
對(duì)于本說明書的目的，術(shù)語″肽和肽類似物″包括多個(gè)單元組成的化合物，這些單元具有以1，2，1，3，1，4或者更大取代模式分開的氨基和羧基末端。這包括20種天然存在的或者“常見的”α-氨基酸，或者是L或者是D構(gòu)型，生物合成可獲得的或者蛋白質(zhì)中不經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的″不常見的″氨基酸，例如4-羥脯氨酸，5-羥基賴氨酸，瓜氨酸和鳥氨酸；合成衍生的α-氨基酸，例如α-甲基丙氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，Cα-和N-烷基化氨基酸，高半胱氨酸，和高絲氨酸；和很多本領(lǐng)域公知的氨基酸。
還包括具有以1，3或者更大取代模式分開的胺和羧基官能團(tuán)的化合物，例如(β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，F(xiàn)reidinger內(nèi)酰胺(Freidinger等，1982)，雙環(huán)二肽(BTD)(Freidinger等，1982；Nagai和Sato，1985)，氨基-甲基苯甲酸(Smythe和von Itzstein，1994)，和本領(lǐng)域公知的其它氨基酸。抑制素類電子等排物，羥基亞乙基電子等排物，還原的酰胺鍵電子等排物，硫代酰胺電子等排物，脲電子等排物，氨基甲酸酯電子等排物，硫醚電子等排物，乙烯基電子等排物，和本領(lǐng)域公知的其它酰胺鍵電子等排物對(duì)于本發(fā)明的目的也是有用的。
″常見的″氨基酸是選自甘氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，賴氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和組氨酸的L-氨基酸。這里用它們的常規(guī)的三字母或一字母縮寫表示氨基酸。
″不常見的″氨基酸包括但不限于選自D-氨基酸，高氨基酸，N-烷基氨基酸，去氫氨基酸，芳香族氨基酸(除了苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸)，鄰-，間-或者對(duì)-氨基苯甲酸，鳥氨酸，瓜氨酸，正亮氨酸，口-谷氨酸，氨基丁酸(Abu)，和α-α雙取代的氨基酸。
衍生所述多肽的寄生蟲屬于食毛目亞目，并且優(yōu)選選自Bovicola ovis種，一種寄生在綿羊上的咀嚼虱。
最優(yōu)選地，所述多肽包括命名為Bol來自B.Ovis的變應(yīng)原。
適宜地，本發(fā)明的變應(yīng)原多肽通過在宿主細(xì)胞或者生物體中表達(dá)編碼該多肽的DNA序列而獲得，或者可以通過化學(xué)合成。
另一方面，本發(fā)明提供編碼基本上如上所述的多肽的分離的核酸分子。
另一方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明虱變應(yīng)原多肽的分離的核酸分子。優(yōu)選地，所述分離的核酸分子a)包含SEQ ID NO.1的核苷酸序列；或者b)是(a)中分子的功能片段或變體；或者c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)中分子雜交；或者d)是(a)，(b)或(c)中定義的分子的互補(bǔ)體；或者e)是相應(yīng)于(a)-(d)中任一序列的反義序列。這種核酸分子可以包括DNA，cDNA或RNA。
優(yōu)選地，上述核酸分子的片段或變體編碼B細(xì)胞或者T細(xì)胞表位。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明DNA分子的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化有能表達(dá)本發(fā)明多肽的本發(fā)明載體的宿主。
本發(fā)明另一方面提供了結(jié)合本發(fā)明多肽的配體。最常見，所述配體是抗體或者包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體片段。最優(yōu)選地，所述配體是結(jié)合本發(fā)明多肽的單克隆抗體或多克隆抗體或者其功能片段或變體。在一些其它實(shí)施方案中，所述配體可以是噬菌體展示分子。
另一方面，本發(fā)明提供通過ELISA或者其它合適的測(cè)試檢測(cè)樣品中結(jié)合Bol的配體或者其片段存在的方法，包括從宿主獲得排泄物，分泌物，組織或血樣，并且使樣品暴露于Bol配體結(jié)合試劑或者Bol探針步驟。當(dāng)配體是一種抗體時(shí)，這樣的測(cè)試指示宿主動(dòng)物在此之前或現(xiàn)在受到寄生蟲的侵染。當(dāng)配體是IgE同種型抗體時(shí)，這樣的測(cè)試在對(duì)寄生蟲超敏反應(yīng)的診斷中是有用的。
本發(fā)明還提供了適合在對(duì)結(jié)合Bol或者其片段的配體的測(cè)試中使用的檢測(cè)試劑盒，其中所述試劑盒包括應(yīng)用于ELISA或者其它合適的測(cè)試的Bol配體結(jié)合試劑或者探針。
本發(fā)明還提供了通過真皮內(nèi)皮膚測(cè)試診斷對(duì)宿主寄生蟲超敏反應(yīng)(虱子對(duì)宿主的在此之前或現(xiàn)在的侵染)的另一種方法。在該方法中，對(duì)宿主真皮內(nèi)注射本發(fā)明的多肽或者其片段或者變體激發(fā)超敏反應(yīng)宿主皮膚內(nèi)特征性應(yīng)答，相反對(duì)不敏感宿主極少或者不激發(fā)應(yīng)答。該方法體外相關(guān)步驟包括使分離的宿主的組織或細(xì)胞接觸如上定義的本發(fā)明的多肽，并且測(cè)定對(duì)該組織或細(xì)胞的免疫介導(dǎo)的刺激作用，例如，組胺從血嗜堿細(xì)胞釋放，或者淋巴細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)化。與使用天然抗原制劑的公開方法(Pfeffer，Phegan和Bany(1997)；Bany，Pfeffer和Phegan(1995)；Bany，Pfeffe，Phegan和Heath(1995)相比，使用這里定義的本發(fā)明的多肽可提高關(guān)于外寄生蟲激發(fā)宿主的此種免疫致敏的該方法的特異性。
本發(fā)明還提供了防止或減小易感動(dòng)物Bol超敏反應(yīng)的疫苗，其中所述疫苗包括選自下面的物質(zhì)a)基本上如上所述的根據(jù)本發(fā)明的多肽；b)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子；基本上如上所述；c)轉(zhuǎn)染有和/或表達(dá)根據(jù)(a)的多肽的DNA或RNA的生物體；d)結(jié)合根據(jù)(a)的多肽的配體或探針。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有有效量選自下面的物質(zhì)的組合物a)基本上如上所述的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子；b)基本上如上所述的根據(jù)本發(fā)明的多肽；c)轉(zhuǎn)染有和/或表達(dá)根據(jù)(b)的多肽的DNA或RNA的生物體；或者d)結(jié)合根據(jù)(b)的多肽的配體或探針；和藥學(xué)或者獸醫(yī)學(xué)上合適的載體或稀釋劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了診斷外寄生蟲侵染的方法，包括步驟a)從宿主獲得排泄物，分泌物，組織或血樣，和b)通過ELISA或者其它合適的測(cè)試使樣品接觸外寄生蟲糞中存在的鑒定的抗原的配體或者探針。
本發(fā)明提供用于診斷外寄生蟲侵染的測(cè)試試劑盒。一方面，所述試劑盒包括組成ELISA或者其它合適的測(cè)試的外寄生蟲糞中存在的鑒定的抗原的配體或者探針。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，外寄生蟲可以是B.ovis，而鑒定的變應(yīng)原可以是Bol。盡管上述是優(yōu)選的實(shí)施方案，但是不應(yīng)該視為限制本發(fā)明該方面的范圍，本發(fā)明適用于寬范圍的外寄生蟲。
本發(fā)明還包括處理動(dòng)物或者預(yù)防動(dòng)物對(duì)Bol多肽表現(xiàn)出的變應(yīng)性超敏反應(yīng)的方法，包括施用有效量的基本如上所述的疫苗或組合物的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了診斷動(dòng)物體內(nèi)對(duì)Bovicola ovis或者Bol多肽的超敏反應(yīng)的方法，包括步驟a)真皮內(nèi)注射合適量帶有藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)合適的載體或稀釋劑的權(quán)利要求1-8的多肽；b)此后合適的時(shí)間檢查注射部位來檢測(cè)對(duì)本發(fā)明多肽的反應(yīng)性質(zhì)；c)在這些觀察的基礎(chǔ)上，與只注射載體或稀釋劑和其它對(duì)照溶液的那些相比，確定對(duì)本發(fā)明多肽的特異性反應(yīng)是否明顯。
雖然本發(fā)明廣義上如上定義，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員明白本發(fā)明不限與此，并且也包括下面描述給出的實(shí)施例中的實(shí)施方案。
制備藥物組合物的方法和藥物載體是本領(lǐng)域公知的，并且教科書中也有說明，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，19版，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania，USA。
可以通過任何合適的途經(jīng)施用本發(fā)明的化合物、疫苗和組合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定對(duì)于要處理的狀況的最合適的途經(jīng)和劑量?，F(xiàn)場(chǎng)醫(yī)生或獸醫(yī)有權(quán)決定劑量，并且取決于要處理的狀況的性質(zhì)和狀態(tài)，接受處理者的年齡和一般健康狀態(tài)，給藥途經(jīng)，和此前的所有處理。
載體或稀釋劑，和其它賦形劑取決于給藥途經(jīng)，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定何種特殊情況最合適的劑型。
對(duì)于本發(fā)明的目的，清楚地認(rèn)識(shí)到術(shù)語″包含″意指″包括但不限于″，而術(shù)語″包括″具有相應(yīng)的意義。
特別地，參照附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選方面，其中圖1說明銀染色12％聚丙烯酰胺凝膠的照片，說明來自Bovicola ovis虱的指定制劑中含有的蛋白質(zhì)泳帶。注意所述泳帶在D泳道大約28.5，42和83kDa；圖2說明與來自從用可溶性Bovicola ovis糞抗原免疫的小鼠衍生的雜交瘤的單克隆抗體反應(yīng)的可溶性Bovicola ovis抗原的蛋白質(zhì)印跡照片。注意主要泳帶是大約28.5kDa，少量泳帶是83kDa(30-32泳道，C和D)和大約14kDa(27和28泳道)；圖3用來將成熟Bol蛋白質(zhì)的編碼序列克隆到AY2-4載體中的策略圖示；圖4說明與Bol單克隆抗體反應(yīng)的純化的天然和重組Bol的蛋白質(zhì)印跡照片。注意與天然Bol相比，重組體的表觀分子量更高；圖5.說明Bol單克隆抗體與選擇的昆蟲和螨的可溶性抗原的交叉反應(yīng)性的測(cè)定；圖6.說明與羊羔中寄生蟲評(píng)分相比，使用Bol單克隆抗體，利用抗原捕獲ELISA檢測(cè)的羊毛樣品中Bol抗原的水平；圖7.說明對(duì)三只侵染了虱子的綿羊(L1，L2，L3)和三只沒有侵染虱子的綿羊(LF1，LF2，LF3)真皮內(nèi)注射抗原和對(duì)照溶液之后獲得的皮試結(jié)果；和圖8.說明對(duì)天然Bovicola ovis抗原和純化的Bol蛋白質(zhì)特異性的羊IgE的ELISA檢測(cè)結(jié)果。
序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO.1是完整Bol蛋白質(zhì)的編碼DNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO.2是完整Bol蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
發(fā)明詳述本申請(qǐng)人第一次證明Bovicola ovis-侵染的綿羊獲得對(duì)侵染虱子的免疫反應(yīng)。使用從整個(gè)虱子或者從虱子糞標(biāo)本分離的本發(fā)明可溶性變應(yīng)原天然制品看到這些反應(yīng)的證據(jù)。
本發(fā)明提供了基本上純的虱多肽變應(yīng)原，其具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或者與其基本上具有相同活性的其片段或變體。優(yōu)選地，所述多肽對(duì)受到虱子侵染的動(dòng)物誘導(dǎo)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，或者所述多肽是與其基本上具有相同活性的其片段或變體。
術(shù)語″基本上純的″意指基本上從天然存在所述多肽的細(xì)胞或生物體中污染蛋白或肽或者其它材料分離或者分出，并且包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)純化的多肽及通過重組技術(shù)制備的多肽和化學(xué)合成的多肽。優(yōu)選的多肽是從整個(gè)虱子或虱子糞制品純化的。
這里使用的術(shù)語″變體″指核苷酸和多肽序列，其中核苷酸或氨基酸序列表現(xiàn)出與圖中的核苷酸或氨基酸序列基本上60％或者更大的同源性，優(yōu)選與本發(fā)明的序列有75％同源性，最優(yōu)選有90-95％同源性-根據(jù)GAP或BESTFIT(核苷酸和多肽)，或者BLASTP(多肽)或者BLASTX(核苷酸)評(píng)價(jià)。通過象插入，取代或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸這樣的對(duì)天然核苷酸或氨基酸的修飾作用可以得到變體，或者它可以是天然存在的變體。術(shù)語″變體″也包括在如65℃下2×SSC定義的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下或者優(yōu)選地在如55℃下6×SCC定義的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與本發(fā)明的序列雜交的同源序列。期望獲得這樣一種變體的情況下，適當(dāng)?shù)馗淖兲烊籇NA的核苷酸序列。這種改變可以通過DNA合成或者通過天然DNA的修飾來實(shí)現(xiàn)，例如通過定點(diǎn)或者盒誘變。優(yōu)選地，在cDNA或者基因組DNA的某些部分需要序列修飾時(shí)，應(yīng)用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，使用定點(diǎn)引物誘變(site-specific primer directedmutagenesis)。
術(shù)語″配體″指可以與另一種分子例如多肽或肽，結(jié)合的任何分子，并且包括但不限于抗體，噬菌體展示分子。
術(shù)語″組織″指專有細(xì)胞的連續(xù)集合體，并且包括但不限于皮膚，皮毛，頭發(fā)，羊毛和皮革。
讀者明白基本上與本發(fā)明的多肽具有相同功能的本發(fā)明多肽模擬物也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備這樣的模擬物。
本發(fā)明的多肽可以用多種方法制備。例如，可以通過從自然來源分離，通過使用任何合適的公知的技術(shù)(如通過Merryfield(1963)，J.Amer.Cherry.Soc.Vol 852149-2156描述的分步固相合成)，或者優(yōu)選地，通過利用DNA技術(shù)來制備。
類似地，通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)可以制備所述多肽的變體。例如，通過如Adelman等DNA 2183(1983)所述的編碼天然氨基酸序列的DNA的定點(diǎn)誘變可以制備變體。
另外，在優(yōu)選的實(shí)施方案中也使用與本發(fā)明的氨基酸序列基本上相同的多肽。這里″基本上相同″指兩個(gè)序列，當(dāng)例如通過GAP或BESTFIT程序使用默認(rèn)缺口權(quán)重優(yōu)化排列時(shí)，或者根據(jù)計(jì)算機(jī)算法BLASTP測(cè)定時(shí)，共有至少60％，優(yōu)選75％，并且最優(yōu)選90-95％序列同一性。優(yōu)選地，不相同的殘基位置區(qū)別在于保守型氨基酸取代。例如，具有類似化學(xué)性質(zhì)例如電荷或極性的氨基酸的取代作用不可能影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)。例子包括谷酰胺取代天冬酰胺或者谷氨酸取代天冬氨酸。
優(yōu)選情況下，可以重組技術(shù)來制備本發(fā)明的多肽，第一步驟是獲得編碼期望產(chǎn)物的DNA。這樣的DNA構(gòu)成本發(fā)明的又一方面。本發(fā)明的DNA可以編碼本發(fā)明的天然產(chǎn)物或者本發(fā)明修飾的多肽或其活性片段或變體。
優(yōu)選地，所述DNA包括編碼本發(fā)明虱變應(yīng)原性多肽的核酸分子，并且更優(yōu)選地，所述核酸分子包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或者其功能片段或變體。
術(shù)語″分離的″意指基本上從天然存在所述核酸的細(xì)胞或生物體中污染的序列分離或者純化，并且包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)純化的核酸及通過重組技術(shù)制備，包括PCR技術(shù)制備的核酸和化學(xué)合成的核酸。優(yōu)選地，核酸分子是從Bovicola ovis咀嚼虱的基因組DNA或者mRNA衍生的。
DNA可以從任何合適的天然來源分離或者利用常規(guī)技術(shù)制備為沒有內(nèi)含子的cDNA。在允許要制備的活性片段的大小的情況下也可以合成寡核苷酸的形式制備DNA。舉例來說，可以利用Matteucci等J.Am.Chem.Soc.Vol1033185-3191(1981)的Triester方法。
如果期望，本發(fā)明的DNA也可以編碼包含本發(fā)明的多肽和載體蛋白質(zhì)的融合蛋白。在控制條件下，通常從多肽，其片段或變體裂解出該載體蛋白質(zhì)。通常使用的載體蛋白的例子是β半乳糖苷酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。
如上所指出的，也可能的是由于插入，取代或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸，所述多肽的變體與天然氨基酸序列不同。如果期望這樣一種變體，則適當(dāng)?shù)馗淖兲烊籇NA的核苷酸序列。這種改變可以通過DNA的選擇性合成或者通過天然DNA的修飾來實(shí)現(xiàn)，例如通過定點(diǎn)或者盒誘變。優(yōu)選地，在cDNA或者基因組DNA的某些部分需要序列修飾時(shí)，應(yīng)用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使用定點(diǎn)引物誘變。
最優(yōu)選地，本發(fā)明涉及來自綿羊身上Bovicola ovis，一種咀嚼虱寄生蟲的蛋白質(zhì)變應(yīng)原。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到編碼DNA中可以存在核苷酸多態(tài)性，并且蛋白質(zhì)中可以存在氨基酸多態(tài)性。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白預(yù)計(jì)其它咀嚼虱(食毛目亞目)中存在相同或者基本上相似的蛋白質(zhì)。在對(duì)來自B.Ovis的蛋白質(zhì)已經(jīng)證明的應(yīng)用中可以有利地使用這樣的蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)或者其部分的編碼DNA和氨基酸中所有這樣的序列變異都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
另一方面，本發(fā)明包括適合在制備本發(fā)明的多肽或肽中使用的可復(fù)制轉(zhuǎn)移載體。這些載體可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)構(gòu)建，或者可以選自本領(lǐng)域可獲得的克隆載體。
可以根據(jù)要使用的宿主或宿主細(xì)胞選擇克隆載體。有用的載體一般具有以下特征(a)能自我復(fù)制；(b)攜帶對(duì)于任何特定限制性內(nèi)切酶的單一靶位；和(c)期望地，攜帶可容易選擇的標(biāo)記物例如抗生素抗性的基因。
具有這些特征的兩種主要類型載體是質(zhì)粒和細(xì)菌病毒(噬菌體)。目前優(yōu)選的載體包括噬菌體λUni-ZAPTMXR和修飾的質(zhì)粒pBAD18載體，AY2-4(參見圖3和Guzman，L.，Belin，D.，Carson，M.J.和Beckwith，J.(1995)，Tight regulation，modulation，and high-level expression by vectors containing thearabinose PBAD promoter.J.Bacteriol.1774121-4130)。
通過在可復(fù)制表達(dá)載體中，將合適的調(diào)控序列與本發(fā)明的DNA分子可操作連接，可以表達(dá)本發(fā)明的DNA分子。調(diào)控序列可以包括復(fù)制起點(diǎn)，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄中止子序列。表達(dá)載體中包括的調(diào)控序列的選擇取決于要用來表達(dá)DNA的宿主或宿主細(xì)胞的類型。
一般情況下，真核細(xì)胞，酵母，昆蟲或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞是有用的宿主。質(zhì)粒載體也包括在該術(shù)語宿主中。合適的原核細(xì)胞宿主包括大腸桿菌，芽孢桿菌種和假單胞菌的各個(gè)種。通常使用的啟動(dòng)子例如(β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動(dòng)子系統(tǒng)是本領(lǐng)域公知的?？梢允褂门c選擇的宿主相容的任何可獲得的啟動(dòng)子系統(tǒng)。在酵母中使用的載體也可獲得并且是公知的。合適的例子是2微米復(fù)制質(zhì)粒起點(diǎn)。
類似地，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用的載體也是公知的。這樣的載體包括SV-40，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的DNA序列，單純皰疹病毒的公知的衍生物，和質(zhì)粒和噬菌體DNA結(jié)合衍生的載體。
此外，真核細(xì)胞表達(dá)載體是本領(lǐng)域公知的(例如P.J.Southern和P.Berg，J.Mol.Appl.Genet.1327-341(1982)；S.Subramani等，Mol.Cell.Biol.1，854-864(1981)；RJ.Kaufmann和P.A.Sharp，″Amplification and Expression ofSequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate ReducaseComplementary DNA Gene，J.Mol.Biol.159，601-621(1982)；R J.Kaufmann和P.A.Sharp，Mol.Cell.Biol.159，601-664(1982)；S.I.Scahill等，″ExpressionsAnd Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNAGene In Chinese Hamster Ovary Cells，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80，4654-4659(1983)；G.Urlaub和L.A.Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77，4216-4220，(1980)。
用于本發(fā)明的表達(dá)載體包含至少一個(gè)與要表達(dá)的DNA序列或片段操作連接的表達(dá)調(diào)控序列。為了控制和調(diào)節(jié)克隆的DNA序列的表達(dá)，在載體中插入調(diào)控序列。有用的表達(dá)調(diào)控序列的例子是lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，tac系統(tǒng)，trc系統(tǒng)，λ噬菌體的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)，酵母酸性磷酸酶的糖酵解啟動(dòng)子，例如Pho5，酵母α-交配因子的啟動(dòng)子，和從多形瘤，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和猴病毒衍生的啟動(dòng)子，例如早期和晚期SV40啟動(dòng)子，和已知控制原核和真核細(xì)胞和它們的病毒或者其組合的基因表達(dá)的其它序列。
這里使用的優(yōu)選的啟動(dòng)子是阿拉伯糖啟動(dòng)子(Guzman，L.，Belin，D.，Carson，M.J.和Beckwith，J.，1995.)，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白所有合適的啟動(dòng)子包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
在載體的構(gòu)建中，通過方便快捷的測(cè)試能區(qū)別插入外來DNA的載體和未修飾的載體也是有利的。用于這樣的測(cè)試中的報(bào)道基因系統(tǒng)包括報(bào)道基因，和產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色變化，抗生素抗性等的其它可檢測(cè)標(biāo)記。在一個(gè)優(yōu)選的載體中，使用β-半乳糖苷酶報(bào)道基因，通過在X-gal平板上表現(xiàn)出藍(lán)色表型的克隆可檢測(cè)該基因。這有利于篩選。在一個(gè)實(shí)施方案中，多角體蛋白-編碼基因可以置換β-半乳糖苷酶基因；當(dāng)用X-gal染色時(shí)，通過表現(xiàn)出白色表型的克隆可檢測(cè)該基因。這種藍(lán)-白色篩選可以用作檢測(cè)重組載體的有用標(biāo)記物。
一經(jīng)篩選，利用常規(guī)方法例如冷凍-解凍提取之后純化可以從培養(yǎng)物中分離載體。
對(duì)于表達(dá)，向宿主或宿主細(xì)胞中插入或轉(zhuǎn)化包含要表達(dá)的本發(fā)明DNA和控制信號(hào)的載體。一些有用的表達(dá)宿主細(xì)胞包括公知的原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。一些合適的原核宿主包括例如大腸桿菌，如大腸桿菌SG-936，大腸桿菌HB101，大腸桿菌W3110，大腸桿菌X1776，大腸桿菌X2282，大腸桿菌DHT，和大腸桿菌MRO1，假單胞菌，芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，和鏈霉菌。合適的真核細(xì)胞包括酵母和其它真菌，昆蟲，動(dòng)物細(xì)胞，如COS細(xì)胞和CHO細(xì)胞，組織培養(yǎng)物中的人細(xì)胞和植物細(xì)胞。
根據(jù)使用的宿主，根據(jù)適合這樣的細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。對(duì)于包含大量細(xì)胞壁的原核細(xì)胞或其它細(xì)胞，可以使用鈣處理方法(Cohen，S N ProcNat Acad Sci，USA 692110(1972))。對(duì)于沒有這樣的細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選Graeme和Van Der Eb，Virology 52546(1978)的磷酸鈣沉淀方法。利用根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)可以進(jìn)行對(duì)植物的轉(zhuǎn)化作用(Shaw等，Gene 23315(1983)，或者根據(jù)Van Solingen等，J.Bact.130946(1977)和Hsiao等，Proc Nat Acad Sci，USA 763829(1979)的方法轉(zhuǎn)化到酵母中。
使用合適的載體對(duì)所選的宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞，可以產(chǎn)生編碼的多肽，該多肽經(jīng)常是融合蛋白形式。
如上所述通過快速測(cè)試可以檢測(cè)本發(fā)明的多肽。然后根據(jù)需要回收和純化所述多肽。利用本領(lǐng)域公知的方法可以實(shí)現(xiàn)回收和純化，例如通過吸附到陰離子交換樹脂上并且從中洗脫。制備本發(fā)明多肽的該方法構(gòu)成本發(fā)明的又一方面。
轉(zhuǎn)化有本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞也構(gòu)成本發(fā)明的又一方面。
另一方面，本發(fā)明提供結(jié)合本發(fā)明多肽的配體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述配體可以是抗本發(fā)明多肽的抗體或者抗體片段。這樣的抗體可以是多克隆抗體，但是優(yōu)選單克隆抗體。
根據(jù)Koelle等；Cell6759-77，1991使用的方法可以制備多克隆抗體，該文獻(xiàn)在此引作參考。在美國專利5,514,578中概述了有用的抗體制備方法，該文獻(xiàn)在此引作參考。通過本領(lǐng)域公知的方法可以制備單克隆抗體。這些方法包括Kohler和Milstein在Nature 256495-497(1975)中描述的免疫方法，以及通過Huse等Science 2461275-1281(1989)描述的重組DNA方法。作為參考，美國專利5,514,578中詳述的所有測(cè)試方法也適合在此使用。
對(duì)于三級(jí)結(jié)構(gòu)和Bol變應(yīng)原(特別是配體結(jié)合域)和它的配體之間的空間相互作用的理解為選擇高特異性配體提供了途經(jīng)，所述配體只有通過天然受體配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的修飾作用才可以被結(jié)合。還有，這樣的知識(shí)將為使用Bol變應(yīng)原與配體的結(jié)合的新設(shè)計(jì)提供方向，并且通過例如噬菌體差別展示技術(shù)為設(shè)計(jì)和篩選具有高特異性的配體的肽模擬物提供方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述配體可以包括從天然來源包括植物，動(dòng)物和昆蟲來源衍生的結(jié)合本發(fā)明多肽的分子。產(chǎn)生Bol變應(yīng)原模擬物的昆蟲提取物是特別令人感興趣的。
因此，另一方面，本發(fā)明提供測(cè)試樣品中存在配體的方法。使用多肽作為配體結(jié)合制劑或探針的測(cè)試方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員具有的能力。對(duì)用作探針的片段的篩選使得功能上特別相關(guān)的片段分離。例如，如果使用本發(fā)明的多肽結(jié)合域的片段作為探針，可以鑒定分離相同或相似多肽結(jié)合域，并且確定編碼DNA。
還認(rèn)識(shí)到對(duì)Bovicola ovis高特異性探針的篩選為以快速而高特異性方式檢測(cè)樣品中存在Bovicola ovis提供了機(jī)會(huì)。
要篩選的材料樣品可以制備成底物溶液形式，然后暴露于配體結(jié)合制劑或探針。根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法可以檢測(cè)配體結(jié)合制劑/探針復(fù)合體的存在。這樣的方法的例子包括凝集作用，放射免疫測(cè)試，熒光或者酶學(xué)免疫測(cè)試技術(shù)。合適的篩選試驗(yàn)是ELISA測(cè)試。在本發(fā)明的該方法中優(yōu)選的是Bol結(jié)合域被用作配體結(jié)合制劑。
本發(fā)明的另一方面提供了適合在這樣的測(cè)試中使用的測(cè)試試劑盒。這樣的測(cè)試試劑盒的例子是包括本發(fā)明的配體結(jié)合制劑的ELISA測(cè)試試驗(yàn)試劑盒。
另一方面，本發(fā)明提供了測(cè)試樣品是否存在多肽或者其片段或變體或者外寄生蟲的糞中排泄的其它抗原分子的方法，所述外寄生蟲是各物種特異性的或是其相關(guān)族。這樣的方法的例子包括凝集作用，放射免疫測(cè)試，熒光或者酶學(xué)免疫測(cè)試技術(shù)。合適的篩選試驗(yàn)是ELISA測(cè)試，包括與外寄生蟲的糞中鑒定的抗原分子結(jié)合的配體。這樣的測(cè)試能方便和快速地從宿主篩選多個(gè)樣品，用來檢測(cè)外寄生蟲對(duì)宿主的侵染。
在本發(fā)明的該方法中，優(yōu)選將單克隆抗體用作檢測(cè)外寄生蟲侵染的配體。
本發(fā)明的另一方面提供了適合在這樣的測(cè)試中使用的測(cè)試試劑盒。這樣的測(cè)試試劑盒的例子是包括本發(fā)明的配體的ELISA測(cè)試試劑盒。
本發(fā)明的另一方面提供了通過真皮內(nèi)皮試診斷宿主對(duì)寄生蟲超敏反應(yīng)的方法(寄生蟲對(duì)宿主的之前或現(xiàn)在的侵染)。在該方法中，對(duì)宿主真皮內(nèi)注射本發(fā)明的多肽或者其片段或變體將誘導(dǎo)超敏反應(yīng)宿主皮膚中特征性特異反應(yīng)，相反在沒有致敏的宿主中極少或沒有反應(yīng)。超敏反應(yīng)宿主的反應(yīng)包括在注射位點(diǎn)至少一種下面的反應(yīng)風(fēng)塊，潮紅，硬結(jié)。利用變應(yīng)原制劑和負(fù)對(duì)照制劑注射和緊鄰皮膚位點(diǎn)組胺注射的真皮內(nèi)皮試是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。該方法的體外矯正也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且包括使分離的宿主組織或細(xì)胞接觸如上定義的本發(fā)明的多肽，并且測(cè)定免疫學(xué)介導(dǎo)的對(duì)組織或細(xì)胞的刺激作用，例如，組胺自血嗜堿細(xì)胞釋放或者淋巴細(xì)胞的增殖或轉(zhuǎn)化。使用如上定義的本發(fā)明的多肽，與使用天然抗原制劑的公開的方法相比，提高了Bovicola ovis對(duì)宿主的免疫致敏作用的該方法的特異性(Pfeffer，Phegan和Bany(1997；)；Bany，Pfeffer和Phegan(1995)；Bany，Pfeffer，Phegan和Heath(1995)。
使用模擬這些實(shí)施方案的蛋白質(zhì)，肽和/或特異性抗體或合成分子的診斷測(cè)試或試驗(yàn)認(rèn)為是本發(fā)明的部分，并且首先用于對(duì)動(dòng)物鑒定咀嚼虱的侵染，其次鑒定侵染的動(dòng)物體內(nèi)或體外超敏反應(yīng)。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，特異性結(jié)合或模擬受試蛋白質(zhì)和肽和抗體的受試多肽，肽和抗體或者其它分子可以用作新制劑，用以控制咀嚼虱侵染或者防止或抑制作為這樣的侵染的結(jié)果產(chǎn)生的免疫超敏反應(yīng)，因此包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。首先，可以將天然或修飾形式的蛋白質(zhì)或肽，該蛋白質(zhì)的總編碼DNA或者其部分，插入該蛋白質(zhì)全部或部分的重組體，轉(zhuǎn)染和/或表達(dá)所述蛋白質(zhì)或肽的編碼DNA或RNA的生物體，和拷貝或模擬所述蛋白質(zhì)或肽的合成分子配制成誘導(dǎo)宿主對(duì)咀嚼虱的保護(hù)性免疫的疫苗。
此外，可以使用對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽的表位特異性的抗體，或者模擬這些抗體的合成分子使宿主被動(dòng)免疫，使得部分或者完全保護(hù)宿主不受虱子的侵染。其次，可以使用天然或修飾形式的蛋白質(zhì)或肽，轉(zhuǎn)染和/或表達(dá)所述蛋白質(zhì)或肽的編碼DNA或RNA的生物體，或者模擬特異性抗體的特異性單克隆抗體或多克隆抗體或合成分子來破壞咀嚼虱或者干擾咀嚼虱的生理過程。第三，天然或修飾形式的蛋白質(zhì)或肽，該蛋白質(zhì)的總編碼DNA或者其部分，插入該蛋白質(zhì)全部或肽的重組體，轉(zhuǎn)染和/或表達(dá)所述蛋白質(zhì)或肽的編碼DNA或RNA的生物體，和模擬所述蛋白質(zhì)，肽或特異性抗體的合成分子可以配制成處理物質(zhì)來預(yù)防，減輕或逆轉(zhuǎn)宿主動(dòng)物響應(yīng)咀嚼虱侵染而產(chǎn)生的變應(yīng)性超敏反應(yīng)。本專利也包括這些應(yīng)用。
可以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽配制成疫苗，當(dāng)對(duì)動(dòng)物施用時(shí)可以誘發(fā)抗寄生蟲的保護(hù)性反應(yīng)?；蛘?，可以將本發(fā)明的多核苷酸分子插入載體或質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化到宿主中，當(dāng)對(duì)動(dòng)物施用時(shí)也可以誘發(fā)抗寄生蟲的保護(hù)性反應(yīng)。也可以對(duì)動(dòng)物全身施用抗體，抗體片段，噬菌體展示分子，或者含有或者分泌這樣的分子的轉(zhuǎn)化宿主，從而提供被動(dòng)保護(hù)。對(duì)于虱子的生存力或生殖力重要的功能可能需要Bol蛋白質(zhì)，因此本發(fā)明可以用來干擾該功能，從而防止或控制虱子的侵染?？梢詮谋景l(fā)明序列的知識(shí)設(shè)計(jì)阻斷蛋白質(zhì)的這種功能或者破壞寄生蟲中該蛋白質(zhì)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)的合成或重組分子，合成并且有利地施用于動(dòng)物。在防止導(dǎo)致超敏反應(yīng)的免疫應(yīng)答的發(fā)生或者下調(diào)該免疫應(yīng)答的方案中，通過對(duì)易感動(dòng)物施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)，肽，多核苷酸分子或轉(zhuǎn)化的宿主可以防止或降低寄生蟲侵染誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)。這樣的方案的例子可以包括施用途經(jīng)的變化，或者和各種佐劑，細(xì)胞因子或生物體一起施用。本發(fā)明還可以用來確定在宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)中重要的Bol蛋白質(zhì)的B和T細(xì)胞表位。這可以通過合成重疊肽并且測(cè)定來自超敏反應(yīng)宿主的抗體或者T細(xì)胞對(duì)各種肽的識(shí)別來實(shí)現(xiàn)。這樣確定的表位可以用于防止或控制超敏反應(yīng)。例如，在肥大細(xì)胞上沒有交聯(lián)IgE危險(xiǎn)的動(dòng)物宿主的脫敏方案中，可以使用包含本發(fā)明蛋白質(zhì)表位的肽，從而誘發(fā)過敏反應(yīng)。本發(fā)明包括本文所描述的這些應(yīng)用。
現(xiàn)在將提供詳細(xì)說明本發(fā)明的非限制性實(shí)施例。
應(yīng)該明白只是通過舉例提供對(duì)上文的說明，本發(fā)明包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的使用的材料和技術(shù)兩方面的變化。
實(shí)施方案實(shí)施例1從整個(gè)虱子和虱子糞中制備可溶性抗原從受侵染的綿羊收集活體若蟲和成蟲Bovicola ovis，并且通過抬高培養(yǎng)皿的一邊使虱子遷移到較低的一邊而從玻璃培養(yǎng)皿中與羊毛和任何其他碎屑分開。然后將虱子放在陶瓷研缽中并且通過加入液氮迅速冷凍。在保持隨液氮研磨的同時(shí)，用小槌將虱子磨成細(xì)粉。然后使粉末簡(jiǎn)短地解凍并且以10毫升/克虱子的比率加入含有1mM Pefabloc(Boehringer Mannheim)的冷磷酸鹽緩沖鹽水。將該制備物轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中并且保持在冰上并且勻化。將該制備物超離心(10,000g，20分鐘，4℃)去除顆粒物質(zhì)。含有可溶性抗原的上清夜通過無菌0.2微米過濾器過濾。對(duì)于短期貯存，上清夜保持在4℃。對(duì)于長(zhǎng)期貯存，上清夜以1∶1體積比與甘油(AnalaR，BDH)混合并且在-20℃貯存。典型地，用5％三氯乙酸沉淀之后利用BCA Protein Assay(Pierce)測(cè)定時(shí)，與甘油混合之后上清夜的蛋白質(zhì)濃度是每毫升2-3毫克。圖1給出從整個(gè)虱子制備的天然可溶性抗原的復(fù)雜性質(zhì)。
為了獲得虱子糞，根據(jù)Hopkins，1970，In vitro colonization of the sheepbiting louse，Bovicola ovis.(Annals of the Entomological Society of America.631196-1197)的方法，在控制的溫度和相對(duì)濕度條件下，在干凈的玻璃培養(yǎng)皿中將從羊毛和碎屑分離的虱子保持過夜。然后將虱子從皿中倒出，并且去除沾在平皿表面的所有的死虱，虱子的部分或其他碎屑。將與玻璃皿粘著的糞沉積物懸浮于含有1mM Pefabloc的10ml磷酸鹽緩沖鹽水中，并且轉(zhuǎn)移到保持在冰上的玻璃勻漿器并且勻化。然后如上所述將該制備物超離心并且過濾并且在4℃貯存。通過280nm處的吸光度或者通過BCA Protein Assay(Pierce)測(cè)定可溶性虱子糞抗原制備物中的蛋白質(zhì)水平。
實(shí)施例2羊IgE的分離和與親和柱的偶聯(lián)從受B.ovis侵染的綿羊收集血清，通過ELISA篩選鑒定具有與全虱可溶性抗原結(jié)合的較高IgE水平的那些血清。然后用洗滌緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖劑，500mM NaCl緩沖劑，pH7.0)將選擇的血清稀釋1-5體積，并且通過0.2微米過濾器過濾。使用通過使對(duì)羊IgE特異的單克隆抗體與HiTrapNHS-活化柱(Phamacia Biotech)偶聯(lián)而制成的免疫親和柱分離稀釋的血清中的IgE，如Shaw，R.J.，Grimmett，D.J.，Donaghy，M.J.，Gatehouse，T.K.，Shirer，C.L.和Douch，P.G.C.1996，Production and characterisation of monoclonalantibodies recognising ovine IgE.Veterinary Immunology and Immunopathology.51235-251所述。來自IgE特異性親和柱的洗脫物對(duì)沖洗緩沖液透析，并且使該制備物流經(jīng)偶聯(lián)無關(guān)單克隆抗體或者蛋白質(zhì)G的親和柱而進(jìn)一步純化。通過還原條件下SDS PAGE對(duì)得到的制備物的分析表明高純度水平(＞90％)的IgE重鏈和輕鏈典型泳帶。根據(jù)廠商說明，大約10mg的羊IgE偶聯(lián)于1ml的HiTrap NHS-活化柱(Pharmacia Biotech)。
實(shí)施例3利用羊-IgE免疫親和層析從Bovicola ovis分離天然變應(yīng)原根據(jù)實(shí)施例1制備天然可溶性B.ovis和B.ovis糞抗原制劑，除了稀釋劑是洗滌緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖劑，500mM NaCl緩沖劑，pH7.0)。稀釋的抗原制劑加載到根據(jù)實(shí)施例2制成的羊IgE免疫親和柱上。然后用沖洗緩沖劑沖洗柱子，并且用pH3.0的100mM甘氨酸洗脫天然變應(yīng)原。通過以1∶10(v/v)的比例加入1M Tris，1.5M NaCl，pH8.0將洗脫物調(diào)至中性pH。通過超濾濃縮變應(yīng)原洗脫物(MicrosepTM Centrifugal Concentrators，Pall FiltronCorporation，截留值3000kD)并且通過還原條件下的SDS-PAGE檢測(cè)。真皮內(nèi)皮試證實(shí)來自整個(gè)虱子和虱子糞抗原制劑的洗脫物含有變應(yīng)原。
實(shí)施例4單克隆抗體的制備用以1∶1與弗氏完全佐劑混合的虱子糞抗原制劑(最多1毫克總蛋白)對(duì)BALB/c小鼠皮下注射，并且兩次用弗氏完全佐劑中相同量的虱子糞抗原腹膜內(nèi)加強(qiáng)。通過與虱子糞抗原反應(yīng)性的ELISA分析來自小鼠的血清樣品鑒定表現(xiàn)出強(qiáng)抗體應(yīng)答的小鼠。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)融合來自選擇的小鼠的脾淋巴細(xì)胞和NS-1骨髓瘤細(xì)胞。在5，24孔平板上在含BALB/c胸腺細(xì)胞的條件選擇培養(yǎng)基中在1毫升培養(yǎng)物中平板培養(yǎng)得到的雜交瘤。接著，通過ELISA對(duì)孔中的培養(yǎng)基篩選識(shí)別可溶性糞抗原的小鼠IgG抗體。以每孔0.5，1和2個(gè)細(xì)胞的平均濃度在96孔培養(yǎng)平板上限制性稀釋來自陽性孔的雜交瘤。對(duì)這些雜交瘤再一次篩選識(shí)別天然可溶性虱子糞抗原的抗體。還通過ELISA篩選產(chǎn)生抗糞抗原的抗體的克隆，測(cè)定該抗體與根據(jù)實(shí)施例3描述制備的分離的天然變應(yīng)原的反應(yīng)性。通過限制性稀釋第二次克隆被鑒定為產(chǎn)生抗天然變應(yīng)原的抗體的單一雜交瘤。擴(kuò)增來自第二次克隆的雜交瘤并且深低溫保藏。對(duì)于進(jìn)一步使用所選的單克隆抗體是小鼠IgG-1同種型。對(duì)于單克隆抗體的制備，通過標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)技術(shù)擴(kuò)增克隆的雜交瘤，使長(zhǎng)滿并且收集上清夜。
該雜交瘤分泌的單克隆抗體識(shí)別在天然虱子或虱子糞抗原的蛋白質(zhì)印跡上具有28.5kDa rMW主要部分的免疫顯性分子(圖2)。這對(duì)應(yīng)于整個(gè)虱子和虱子糞抗原制劑的通過IgE親和層析獲得的推定的天然抗原的SDS PAGE上觀察到的主要泳帶之一。在大約14，42，和83 kDa rMW也觀察到次要泳帶。較高rMW部分顯示代表多個(gè)14kDa泳帶，即，2×14＝28(～28.5)，3×14＝42和6×14＝84(～83)。
由上述單克隆抗體鑒定的蛋白質(zhì)指定為Bol。
實(shí)施例5Bol變應(yīng)原的純化根據(jù)實(shí)施例4所述制備的單克隆抗體經(jīng)蛋白質(zhì)G親和層析拄純化并且以實(shí)施例2所述相似的方法偶聯(lián)于HiTrap NHS-活化柱(Pharmacia Biotech)。使用該柱子從根據(jù)實(shí)施例1所述制備的可溶性整個(gè)虱子抗原獲得洗脫物。
來自單克隆抗體親和柱的洗脫物含有高純度蛋白質(zhì)，該蛋白所具有的特征與通過SDS PAGE(圖1)和該單克隆抗體探測(cè)的蛋白質(zhì)印跡(圖2)在天然虱子抗原中觀察到的蛋白質(zhì)相吻合。另外，在蛋白質(zhì)印跡和ELISA(圖8)中來自虱子侵染的綿羊的IgE識(shí)別該純化的變應(yīng)原。真皮內(nèi)皮試證明與沒有虱子的羊羔相比受虱子侵染的羊羔體內(nèi)存在對(duì)Bol的特異性應(yīng)答(圖7)。
實(shí)施例6Bol變應(yīng)原的氨基酸測(cè)序使利用單克隆抗體親和柱純化的天然Bol進(jìn)行還原條件下的SDSPAGE，并且利用制備蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)PVDF膜電印跡(ProblottTM，Applied Biosystems)用于測(cè)序。用0.1％Ponceau S將PVDF膜染色并且鑒定28.5kDa泳帶并且將其剪下。用含有0.1％三乙胺的甲醇簡(jiǎn)短地洗滌膜條之后單獨(dú)用甲醇洗滌兩次。在氣相儀器(470AR/120A/920A/610A，AppliedBiosystems)中進(jìn)行自動(dòng)微量測(cè)序。獲得的N-末端氨基酸序列是(a)SPTELDLRLLVETARDISVILFKNLHAGYN還原條件下SDS PAGE之后從凝膠上切下Bol28.5kDa泳帶用于凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化。根據(jù)Rosenfeld，J.，Capdevielle，J.，Guillemot，J.C.和Ferrara，P.(1992)In-gel digestion of proteins for intemal sequence analysis after one-ortwo-dimensional gel electrophoresis，Analytical Biochemistry 203173-179的方案進(jìn)行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化。然后在與微內(nèi)徑HPLC(PE Biosystems，140Adelivery system and 1000S Diode array detector)相連的Phenomenex Jupiter C18柱(300angstrom，5 micron，2×250mm)上分離從凝膠洗脫的肽。在PEBiosytems Procise蛋白質(zhì)測(cè)序儀(model 492)上使用廠商提供的化學(xué)品和方法對(duì)選擇的肽測(cè)序。獲得下面的序列
(b)DISVILFK(c)NLHAGYNEVNPK(d)VFTNIK(e)IGEQVLK(f)(I)NVIFK(g)KLFDTEVPEVVK(h)DISVILFK(i)IEILLNELAPEAK(j)TLIGALDQ(L)K實(shí)施例7RNA分離和cDNA文庫構(gòu)建基本上如Frenkel M.J.，Savin K.W.，Bakker R.E.，和Ward C.W(1989)，Characterization of clones coding for muscle tropomyosin of the nematodeTrichostronglus colubriformis，Molecular and Biochemical Parasitology.37191-200所述從B.ovis分離RNA。用小槌和研缽在液氮上研磨在液氮中快速冷凍的B.ovis(100mg)。加入1毫升的6M鹽酸胍，0.2M乙酸鈉(pH5.2)加10mMβ-巰基乙醇，與B.Ovis研磨并且將粉末轉(zhuǎn)移到微量離心管。加入200微升的95％乙醇，并且將該混合物放置在干冰/乙醇上5分鐘。將混合物在4℃下離心5分鐘，然后將沉淀重新懸浮于500微升的6M鹽酸胍，0.2M乙酸鈉(pH5.2)加10mM EDTA中。重復(fù)乙醇沉淀和離心，并且將沉淀重新懸浮于250微升脲緩沖劑(7M脲，100mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1mMEDTA，0.1％(w/v)SDS，然后加入500微升水飽和的苯酚∶氯仿(1∶1)。4℃下離心10分鐘之后，將水層轉(zhuǎn)移到新試管中并且用乙醇沉淀RNA，干燥并且重新懸浮于50微升的二次蒸餾水中。
使用ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene)從B.ovis mRNA合成cDNA文庫。用T4 DNA連接酶使cDNA連接噬菌體λUni-ZAPTM XR載體臂并且用GIGAPACKII Packaging Extract包裝。
實(shí)施例8Bol的全編碼DNA的克隆和表征以Bol氨基酸序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)寡核苷酸引物(BoP14-A)與編碼氨基末端區(qū)(實(shí)施例6中的氨基酸序列(a)，(b)，(c)和(h))的Bol cDNA雜交，并且設(shè)計(jì)第二個(gè)寡核苷酸引物(BoP14-B)與編碼內(nèi)肽(實(shí)施例6中的氨基酸序列(g))的Bol cDNA雜交。設(shè)計(jì)寡核苷酸與cDNA的互補(bǔ)鏈雜交使得當(dāng)用作與衍生自B.ovis mRNA的cDNA進(jìn)行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中的引物時(shí)它們能擴(kuò)增插入的cDNA。
BoP14-A CATGCTGGATATAATGAAGT(A/T)AA(C/T)CC BoP14-BTTAACAACTTCAGGAACTTC(A/T)GT(A/G)TC(A/G)AAPCR反應(yīng)的條件是引物0.3μM，dNTPs 200μM和20ng模板，94℃30秒，45℃60秒和72℃60秒，3次循環(huán)；94℃30秒，50℃60秒和72℃60秒，30次循環(huán)，然后在72℃保持10分鐘。
PCR之后，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定大約390bp的擴(kuò)增的DNA片段。使用WizardPCR Preps DNA純化系統(tǒng)(Promega)純化該片段，然后使用RTSRadPrime DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Lifr Technologies)用[α-32P]dCTP進(jìn)行放射性標(biāo)記。使用放射性標(biāo)記的Bol cDNA探針篩選B.ovis cDNA文庫來鑒定與BolcDNA同源的DNA克隆，基本上如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis T.(1989).Molecular cloninga laboratory manual，第二版，紐約(冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社)所述。將來自該文庫的大約45000個(gè)噬菌體菌落與大腸桿菌XLl-BlueMRF′細(xì)胞在瓊脂平板上鋪板并且溫育，產(chǎn)生噬菌斑。將噬菌斑復(fù)制到Hybond-N+尼龍膜(Amersham)上并且處理以備用探針雜交。鑒定陽性雜交菌落并且在它們被克隆之前這些是純化的噬菌斑。使用與cDNA克隆位點(diǎn)周圍的DNA雜交的引物通過PCR擴(kuò)增B.ovis cDNA插入片段并且對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序。從這些序列可以辨別Bol變應(yīng)原的全編碼序列(SEQ.ID No.1)。該序列預(yù)示具有氨基末端分泌型前導(dǎo)序列的大約30kDa的蛋白質(zhì)。使用識(shí)別B.Ovis的優(yōu)先密碼子從核苷酸序列推導(dǎo)出氨基酸序列(SEQ.ID No.2)，并且在實(shí)施例6中測(cè)定N-末端和內(nèi)部序列。
實(shí)施例9重組Bol蛋白質(zhì)的表達(dá)通過PCR從B.ovis cDNA模板擴(kuò)增根據(jù)N-末端氨基酸序列(實(shí)施例6，氨基酸序列(a))推測(cè)的編碼成熟Bol蛋白質(zhì)的cDNA。從上面獲得的cDNA序列(SEQ.ID.No.1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增Bol DNA的在PCR反應(yīng)中使用的寡核苷酸引物。引物是Bol-X2 CTTGCGGCCGCCATTTTTGCAACACAGTCTGBol-X3 CGCGGATCCATATGTCCCCAACAGAACTCGAT設(shè)計(jì)引物Bol-X2使其與編碼完整純化的Bol蛋白質(zhì)(實(shí)施例6中的氨基酸序列(a))的氨基酸測(cè)序鑒定的成熟蛋白的氨基末端的BolcDNA同源。設(shè)計(jì)引物Bol-X3使其與羧基末端Bol氨基編碼DNA(SEQ.ID.No.1)同源。所述引物還包含限制性酶切位點(diǎn)以允許擴(kuò)增的DNA連接到表達(dá)載體中。使用Bol-X2和Bol-X3引物和Bol cDNA模板進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)(95℃30秒，50℃30秒，和72℃1分鐘35次循環(huán))之后，通過瓊脂糖凝膠電泳確定大約700bp的產(chǎn)物。該P(yáng)CR片段用NdeI和NotI核酸內(nèi)切酶消化并且亞克隆到AY2-4載體中，AY2-4載體是pBAD18的衍生物(Guzman，L.，Belin，D.，Carson，M.J.和Beckwith，J.(1995)，Tight regulation，modulation，and high-level expressionby vectors containing the arabinose PBAD promoter.J.Bacterial.1774121-4130.)，產(chǎn)生圖3所示的Bol表達(dá)載體。擴(kuò)增的編碼DNA與表達(dá)載體連接，導(dǎo)致完整成熟Bol編碼序列與表達(dá)載體的起始甲硫氨酸密碼子在Ndel限制性酶切位點(diǎn)處融合。Bol cDNA的羧基編碼末端在讀框內(nèi)與攜帶編碼E-標(biāo)記表位(Pharmacia)和九肽AAAHHHHHH的隨后是終止密碼子的DNA的載體DNA在Notl位點(diǎn)連接。該表達(dá)載體驅(qū)動(dòng)連接的編碼DNA從阿拉伯糖PBAD啟動(dòng)子表達(dá)，因此當(dāng)電穿孔到大腸桿菌XL2中時(shí)，對(duì)外源阿拉伯糖的反應(yīng)是在培養(yǎng)基中產(chǎn)生重組Bol(Guzman，L.，Belin，D.，Carson，M.J.和Beckwith，J.(1995)。該方法產(chǎn)生的重組Bol具有包括E-標(biāo)記表位和九肽AAAHHHHHH的羧基末端融合體。
通過向生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Luria-Bertani培養(yǎng)基，Sigma，有氨芐青霉素，Sigma，100微克/ml)加入0.2％L(+)阿拉伯糖誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌表達(dá)重組Bol。在細(xì)菌胞質(zhì)溶膠中產(chǎn)生表達(dá)的重組蛋白質(zhì)并且通過對(duì)細(xì)菌超聲處理來提取，通過離心去除不溶性物質(zhì)。然后利用羧基末端的六組氨酸標(biāo)記對(duì)固定化鎳(HiTrapTM螯合柱，Amersham Pharmacia Biotech AB)的親和性通過固定化金屬親和層析純化重組Bol(rBol)，并且用遞增濃度的咪唑介質(zhì)洗脫。一些rBol制備物經(jīng)Bol mAb親和柱(實(shí)施例5)進(jìn)一步純化。因?yàn)橹亟M蛋白質(zhì)具有羧基末端融合體部分，所以在還原條件下的SDS PAGE上，該重組蛋白具有比天然蛋白質(zhì)高的rMW(大約29.5kDa)(圖4)。
在蛋白質(zhì)印跡(圖4)和ELISA中用Bol mAb識(shí)別rBol。在初步試驗(yàn)中，與沒有虱子侵染的綿羊相比，在ELISA中來自虱子侵染的綿羊的IgE也優(yōu)先識(shí)別rBol。
實(shí)施例10Bol mAb對(duì)B.Ovis的特異性在ELISA中通過測(cè)定Bol mAb與由新西蘭的可能侵染綿羊的各種代表性昆蟲和螨制備的可溶性抗原制劑的反應(yīng)性檢測(cè)Bol mAb對(duì)B.Ovis的特異性。通過在玻璃勻漿器中在含有1mM Pefabloc(Boehringer Mannheim)的冷PBS中破碎昆蟲而從成蟲白蛉，成蟲蚊子和麗蠅蛆制備抗原。離心使抗原制劑澄清。根據(jù)實(shí)施例1所述制備B.ovis抗原。商業(yè)上可購得D.pteronyssinus抗原(變應(yīng)原提取物，Standardized Mite DP，Bayer Corporation)。適當(dāng)稀釋之后，使用抗原包被微量滴定平板中的各孔，并且使用Bol mAB作為一抗，山羊抗-小鼠IgG偶聯(lián)物作為二抗，利用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行ELISA。Bol mAb表現(xiàn)出只與從B.ovis制備的抗原的實(shí)質(zhì)的反應(yīng)性(圖5)。
實(shí)施例11B.ovis-特異性抗體在體外診斷測(cè)試中檢測(cè)虱子侵染的用途如下面實(shí)施例所述，應(yīng)用抗原捕獲ELISA檢測(cè)虱子侵染和沒有虱子侵染的羊羔的羊毛是否存在Bol。
對(duì)牧養(yǎng)的29只虱子侵染的和12只沒有虱子侵染的羊羔通過計(jì)數(shù)全身12處預(yù)測(cè)點(diǎn)處10厘米長(zhǎng)羊毛部分中觀察到的虱子的總數(shù)對(duì)虱子侵染水平進(jìn)行評(píng)分。在羊羔的肩部中央與皮膚水平割下羊毛樣品，并且放在各個(gè)紙袋中并且在室溫下貯存。將各樣品的一克羊毛放在玻璃容器中并且與20ml緩沖劑(PBS加0.5％Tween20)在室溫下混合2小時(shí)。清析上清液，并且在隨后的抗原捕獲ELISA中使用。
經(jīng)蛋白質(zhì)G親和層析柱(Pharmacia)從雜交瘤上清液純化對(duì)Bol特異性的單克隆抗體(Bol mAb)，并且使用30kDa Ultrafree-15 Centrigugal FilterDevice(Millipore)濃縮。使用NHS-LC-生物素(Pierce)根據(jù)廠商說明，將一半純化的Bol mAb生物素化。用PBS(2微克/毫升)中沒有生物素化的Bol mAb包被MaxisorpTM微量滴定板(Nunc)，在室溫下包被2小時(shí)，用沖洗緩沖液(含150mM NaCl，0.05％Tween20的10mM磷酸鹽緩沖劑，pH7.2)沖洗三次，并且用blotto(10mM磷酸鹽緩沖劑，其中含有0.5％Tween20，pH7.2)和5％脫脂牛奶粉封閉。又沖洗6次之后，室溫下雙份向平板中加入沒有稀釋的來自羊毛樣品的提取物，正對(duì)照(PBS中的來自全虱的天然可溶性抗原)和負(fù)對(duì)照(PBS加0.5％Tween20)溫育1小時(shí)。再次將平板沖洗6次并且室溫下加入生物素化Bol mAb(2微克/ml)溫育1小時(shí)。沖洗6次之后，加入鏈霉親合素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(2微克/ml)溫育1小時(shí)。使用四甲基聯(lián)苯胺底物進(jìn)行酶反應(yīng)，使用1M硫酸終止反應(yīng)并且在450nm波長(zhǎng)處讀取各孔的吸光度。
所有12只沒有侵染虱子的羊羔虱子評(píng)分為零，并且在ELISA中呈陰性(圖6)。29只侵染了虱子的羊羔的結(jié)果與該虱子評(píng)分明顯相關(guān)(r＝0.77，P＜0.001，圖6)。利用該測(cè)試來檢查綿羊群的虱子侵染，從而幫助農(nóng)夫合理利用抗虱子處理，從而對(duì)綿羊產(chǎn)品和環(huán)境都減少化學(xué)殘留。
實(shí)施例12通過使用純化的Bol抗原的真皮內(nèi)皮試體內(nèi)診斷對(duì)B.ovis的免疫超敏反應(yīng)。
使用12月齡的3只沒有虱子的羊羔和3只侵染了虱子的羊羔。通過緊貼上肩區(qū)切割下羊毛來為羊羔的真皮內(nèi)皮試做準(zhǔn)備。真皮內(nèi)注射0.1ml體積的抗原和對(duì)照溶液。注射后0.5，5，24和48小時(shí)測(cè)量皮膚反應(yīng)直徑。根據(jù)實(shí)施例5所述純化Bol。使用PBS將中和的洗脫緩沖劑中的Bol稀釋至大約6.0微克/毫升(通過280nm處的吸光度測(cè)定)。同樣用PBS稀釋的中和的洗脫緩沖劑是Bol的負(fù)對(duì)照溶液。將根據(jù)實(shí)施例1所述從全B.ovis制備的天然可溶性抗原稀釋至100微克/毫升。天然B.ovis抗原的負(fù)對(duì)照是以1∶1與甘油混合的PBS，并且同樣稀釋。使用PBS中的組胺HCl(1比250000，w/v)來檢測(cè)對(duì)組胺的反應(yīng)能力。
皮試結(jié)果表明只有侵染了虱子的綿羊才對(duì)天然B.ovis抗原和Bol存在實(shí)質(zhì)的反應(yīng)(圖7)。由于反應(yīng)(典型的IgE)抗體-介導(dǎo)的機(jī)制，30分鐘之內(nèi)發(fā)生反應(yīng)是超敏反應(yīng)的典型情況，而反應(yīng)延遲至5小時(shí)或者更長(zhǎng)時(shí)間，則表明是細(xì)胞機(jī)制。
實(shí)施例13Bol抗原在檢測(cè)對(duì)B.Ovis的免疫超敏反應(yīng)的體外測(cè)試中的用途。
作為診斷對(duì)B.ovis的超敏反應(yīng)的真皮內(nèi)皮試的替代方法，可以利用ELISA或者類似測(cè)試來檢測(cè)免疫血清中對(duì)Bol的IgE的特異性?；蛘?，可以利用類似的測(cè)試來檢測(cè)具有對(duì)Bol特異性的其它綿羊免疫球蛋白同種型，提供宿主被寄生蟲侵染的證據(jù)。
為了檢測(cè)Bol特異性IgE，用SAS(飽和硫酸銨溶液)處理來自山羊的各個(gè)血清樣品，減少競(jìng)爭(zhēng)IgG水平。以1∶1(v/v)的比例向血清樣品加入70％SAS鹽水溶液，溫育30分鐘，定期攪拌。沉淀物旋轉(zhuǎn)沉積(13000g，10分鐘)，并且以1∶8用含有0.1％Tween 20的蒸餾水稀釋上清液，得到1∶16的最終稀釋度。接著進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA程序，并且作出簡(jiǎn)要描述。用親和純化的Bol(1∶100在PBS中)室溫下將96孔微量滴定板包被5小時(shí)。用含有0.5％Tween20和5％脫脂牛奶粉的10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.2將平板封閉1小時(shí)，之后用沖洗緩沖液(150mM NaCl，0.05％Tween 20于10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.2)沖洗6次。向雙份孔中加入SAS處理過的血清，并且在室溫下保持1小時(shí)，然后在4℃保持過夜。然后用沖洗緩沖液將平板沖洗6次，并且加入稀釋緩沖劑(5mg/ml BSA，0.1％Tween 20于PBS中)中的抗-羊IgE單克隆抗體，室溫下溫育4小時(shí)。沖洗之后，加入與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊-抗小鼠IgG(Sigma A3673，1∶1000于稀釋緩沖劑中)，37℃下溫育1小時(shí)。再次沖洗平板，并且加入0.1M乙酸鹽緩沖劑pH6.5加0.1％DMSO和0.03％過氧化氫中的四甲基聯(lián)苯胺(0.1mg/ml，Sigma T8768)反應(yīng)15分鐘。使用1M硫酸終止反應(yīng)并且在自動(dòng)平板讀數(shù)器上在450nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。將使用Bol的ELISA的結(jié)果與使用天然B.Ovis抗原的類似ELISA相比較(圖8)。
與來自沒有虱子的綿羊相比，使用全虱子抗原和純化的變應(yīng)原-包被的平板的ELISA展示出高得多的來自虱子侵染的綿羊的血清IgE的反應(yīng)性(分別是P＜0.0001和0.0025，圖8)。63％(19/30)的虱子侵染的綿羊表現(xiàn)出的B.ovis-特異性IgE吸光度高于使用來自沒有虱子的羊羔的血清獲得的吸光度的平均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(圖8)。在相同條件的基礎(chǔ)上，50％(15/30)虱子侵染的羊羔的血清表現(xiàn)出比純化的Bol變應(yīng)原提高的IgE吸光度。該數(shù)據(jù)表明純化的變應(yīng)原是B.Ovis的主要變應(yīng)原。在13份血清中，檢測(cè)到提高的對(duì)兩種抗原制劑的應(yīng)答(圖8)。但是，在虱子侵染的綿羊中，觀察到對(duì)兩種抗原制劑的IgE應(yīng)答之間只有中度關(guān)聯(lián)(r＝0.49，P＞0.006)，提示當(dāng)使用純化的Bol變應(yīng)原時(shí)，天然虱抗原中存在其它變應(yīng)原和/或較小的非特異性反應(yīng)性。
討論申請(qǐng)人第一次體外證明了對(duì)虱子B.Ovis的抗原特異性的血清抗體應(yīng)答(包括IgG和IgE)和對(duì)用虱子B.Ovis抗原攻擊的應(yīng)答中從皮膚排放淋巴結(jié)獲得的淋巴細(xì)胞的特異性增殖。另外，通過真皮內(nèi)皮試證實(shí)了對(duì)虱的免疫性應(yīng)答，其中1小時(shí)之內(nèi)的應(yīng)答大大反映出反應(yīng)性抗體(IgE和其它嗜同種細(xì)胞抗體)的存在，24小時(shí)和超過24小時(shí)的持久應(yīng)答大大反映出細(xì)胞介導(dǎo)機(jī)制。通過比較相同條件下虱子侵染的羊羔的應(yīng)答和沒有虱子的羊羔的應(yīng)答確定不同免疫應(yīng)答的特異性。通過組織學(xué)檢測(cè)所確定的對(duì)虱子的免疫應(yīng)答的性質(zhì)和褶皺損傷的特征支持這樣的概念，即導(dǎo)致虱子侵染的綿羊毛皮缺陷的褶皺，外表皮炎，是對(duì)虱子的變應(yīng)性(或超敏反應(yīng))免疫應(yīng)答的結(jié)果。本發(fā)明的新的變應(yīng)原和與其結(jié)合的配體可以在診斷，預(yù)防和處理B.Ovis感染和相關(guān)變應(yīng)性疾病中使用，其結(jié)果是改善羊毛和毛皮質(zhì)量，減少合成殺蟲劑的使用并且提高農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收益。
應(yīng)該明白雖然本說明書使用了術(shù)語″包含″(或者其語法同義詞)，但是該術(shù)語不是為了限制，本發(fā)明不排除存在其它特征或成分。因此，術(shù)語″包含″等同于術(shù)語″包括″。
只是以例舉的方式描述本發(fā)明的各個(gè)方面，要明白不脫離后面權(quán)利要求書中定義的其范圍可以進(jìn)行修飾和添加。
序列表(1)一般信息(iii)序列編號(hào)2(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度xxx堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)關(guān)鍵詞(B)位置(xi)序列描述SEQ ID NO1ATCAAAACAACAATGCAAGGATTAAAATTAATTTTCGTCGCCTTTTTGGCAGTTTTCGCTGTTGGGTGTGAGGGAAATACTTTGGTCAAATCCM Q G L K L I F V A F L A V F A V G C E G N T L V K SCCAACAGAACTCGATCTTCGTCTTCTTGTTGAAACCGCTCGAGATATCTCTGTCATCTTGTTTAAAAACTTACATGCTGGATATAATGAAGTTP T E L D L R L L V E T A R D I S V I L F K N L H A G Y N E VAACCCCAAAATCGAAATACTGTTGAACGAATTGGCCCCCGAAGCTAAAGAAGGACTCCAAAAAATTATAAAAGAAATTAGAGATTTGGTCAATN P K I E I L L N E L A P E A K E G L Q K I I K E I R D L V NGAAGAAGAAACCAGAATTAATGTCATCTTCAAAACTCTTATTGGTGCTTTGGACCAACTGAAACCAATTAAGGCACCATGCGCCGACCCCGTTE E E T R I N V I F K T L I G A L D Q L K P I K A P C A D P VTCTAAAGAAGCTAAAAAATTGGCCAACGATGTTGAAAGGGAAATCGTCAAATTCATTAAATATTTAGAACAAAAATACGAAAAGGTATTTACAS K E A K K L A N D V E R E I V K F I K Y L E Q K Y E K V F TAACATCAAGAATGGAGTTACCAAAGTAATCACCAGAGCCAGGAAATTGTTTGACACTGAAGTTCCCGAAGTCGTGAAATGTTTGACCCCCAAAN I K N G V T K V I T R A R K L F D T E V P E V V K C L T P KAACAAAGAGGCCACTAAATGCATCAATACACACATCGACAAAATTCTTGGTGAAGTTGCCCAAATCGGTGCCGACATTGGACTCCTTGTAATCN K E A T K C I N T H I D K I L G E V A Q I G A D I G L L V ITCTTCTGAAGAAGCTCTTAATCCCGTTATTAAGGAAGTTGTCGCCAAAATAGGTGAACAAGTGTTGAAGGTTTTGGGTGAAGGTAGGCCCATTS S E E A L N P V I K E V V A K I G E Q V L K V L G E G R P IATCAACAAAATCTCAGACTGTGTTGCAAAAATGTAAGAAATAAAAAGAAATAAGTNAATAAATTAATTTTAATTTTTTTTTAATTTTTTTTTTI N K I S D C V A K MCTTTAATGCCAAACAAAAAAATTAAAAATTTTTAAATNAATTTTAAAAATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度275個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(ix)特征(A)關(guān)鍵詞(B)位置(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Gln Gly Leu Lys Leu Ile Phe Val Ala Phe Leu Ala Val Phe Ala Val Gly Cys Glu10 20Gly Asn Thr Leu Val Lys Ser Pro Thr Glu Leu Asp Leu Arg Leu Leu Val Glu Thr Ala30 40Arg Asp Ile Ser Val Ile Leu Phe Lys Asn Leu His Ala Gly Tyr Asn Glu Val Asn Pro50 60Lys Ile Glu Ile Leu Leu Asn Glu Leu Ala Pro Glu Ala Lys Glu Gly Leu Gln Lys Ile70 80Ile Lys Glu Ile Arg Asp Leu Val Asn Glu Glu Glu Thr Arg Ile Asn Val Ile Phe Lys90 100Thr Leu Ile Gly Ala Leu Asp Gln Leu Lys Pro Ile Lys Ala Pro Cys Ala Asp Pro Val110120Ser Lys Glu Ala Lys Lys Leu Ala Asn Asp Val Glu Arg Glu Ile Val Lys Phe Ile Lys130140Tyr Leu Glu Gln Lys Tyr Glu Lys Val Phe Thr Asn Ile Lys Asn Gly Val Thr Lys Val150160Ile Thr Arg Ala Arg Lys Leu Phe Asp Thr Glu Val Pro Glu Val Val Lys Cys Leu Thr170180Pro Lys Asn Lys Glu Ala Thr Lys Cys Ile Asn Thr His Ile Asp Lys Ile Leu Gly Glu190200Val Ala Gln Ile Gly Ala Asp Ile Gly Leu Leu Val Ile Ser Ser Glu Glu Ala Leu Asn210220Pro Val Ile Lys Glu Val Val Ala Lys Ile Gly Glu Gln Val Leu Lys Val Leu Gly Glu240260Gly Arg Pro Ile Ile Asn Lys Ile Ser Asp Cys Val Ala Lys Met .
270
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序列表<110>農(nóng)業(yè)研究有限公司(AgResearch Limited)亞歷山大，普費(fèi)弗(Pfeffer，Alexander)查爾斯，休梅克(Shoemaker，Charles)<120>綿羊虱Bovicola ovis變應(yīng)原的處理<130>30924×143<150>NZ 504096<151>1999-04-19<160>2<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>911<212>DNA<213>bovicola ovis<220><221>Unsure<222>(800)，(875)<223>未知堿基<400>1atcaaaacaa caatgcaagg attaaaatta attttcgtcg cctttttggc agttttcgct 60gttgggtgtg agggaaatac tttggtcaaa tccccaacag aactcgatct tcgtcttctt 120gttgaaaccg ctcgagatat ctctgtcatc ttgtttaaaa acttacatgc tggatataat 180gaagttaacc ccaaaatcga aatactgttg aacgaattgg cccccgaagc taaagaagga 240ctccaaaaaa ttataaaaga aattagagat ttggtcaatg aagaagaaac cagaattaat 300gtcatcttca aaactcttat tggtgctttg gaccaactga aaccaattaa ggcaccatgc 360gccgaccccg tttctaaaga agctaaaaaa ttggccaacg atgttgaaag ggaaatcgtc 420aaattcatta aatatttaga acaaaaatac gaaaaggtat ttacaaacat caagaatgga 480gttaccaaag taatcaccag agccaggaaa ttgtttgaca ctgaagttcc cgaagtcgtg 540aaatgtttga cccccaaaaa caaagaggcc actaaatgca tcaatacaca catcgacaaa 600attcttggtg aagttgccca aatcggtgcc gacattggac tccttgtaat ctcttctgaa 660gaagctctta atcccgttat taaggaagtt gtcgccaaaa taggtgaaca agtgttgaag 720gttttgggtg aaggtaggcc cattatcaac aaaatctcag actgtgttgc aaaaatgtaa 780gaaataaaaa gaaataagtn aataaattaa ttttaatttt tttttaattt tttttttctt 840taatgccaaa caaaaaaatt aaaaattttt aaatnaattt taaaaattaa aaaaaaaaaa 900aaaaaaaaaa a 911<210>2<211>255<212>PRT<213>bovicola ovis<400>2Met Gln Gly Leu Lys Leu Ile Phe Val Ala Phe Leu Ala Val Phe Ala1 5 10 15Val Gly Cys Glu Gly Asn Thr Leu Val Lys Ser Pro Thr Glu Leu Asp20 25 30Leu Arg Leu Leu Val Glu Thr Ala Arg Asp Ile Ser Val Ile Leu Phe35 40 45Lys Asn Leu His Ala Gly Tyr Asn Glu Val Asn Pro Lys Ile Glu Ile50 55 60Leu Leu Asn Glu Leu Ala Pro Glu Ala Lys Glu Gly Leu Gln Lys Ile65 70 75 80Ile Lys Glu Ile Arg Asp Leu Val Asn Glu Glu Glu Thr Arg Ile Asn85 90 95Val Ile Phe Lys Thr Leu Ile Gly Ala Leu Asp Gln Leu Lys Pro Ile100 105 110Lys Ala Pro Cys Ala Asp Pro Val Set Lys Glu Ala Lys Lys Leu Ala115 120 125Asn Asp Val Glu Arg Glu Ile Val Lys Phe Ile Lys Tyr Leu Glu Gln130 135 140Lys Tyr Glu Lys Val Phe Thr Asn Ile Lys Asn Gly Val Thr Lys Val145 150 155 160Ile Thr Arg Ala Arg Lys Leu Phe Asp Thr Glu Val Pro Glu Val Val165 170 175Lys Cys Leu Thr Pro Lys Asn Lys Glu Ala Thr Lys Cys Ile Asn Thr180 185 190His Ile Asp Lys Ile Leu Gly Glu Val Ala Gln Ile Gly Ala Asp Ile195 200 205Gly Leu Leu Val Ile Set Ser Glu Glu Ala Leu Asn Pro Val Ile Lys210 215 220Glu Val Val Ala Lys Ile Gly Glu Gln Val Leu Lys Val Leu Gly Glu225 230 235 240Gly Arg Pro Ile Ile Asn Lys Ile Set Asp Cys Val Ala Lys Met245 250 25權(quán)利要求
1.一種具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的基本上純化的多肽，或者具有基本上相同活性的其片段或變體。
2.從動(dòng)物身上寄生的虱子衍生的權(quán)利要求1要求的多肽，其對(duì)虱子侵染的動(dòng)物誘導(dǎo)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，或者具有基本上相同活性的其片段或變體。
3.權(quán)利要求1和2要求的多肽，其中所述變體或片段插入所述多肽的B細(xì)胞或T細(xì)胞表位。
4.權(quán)利要求1要求的多肽，其中所述虱子屬于食毛目亞目。
5.權(quán)利要求1要求的多肽，其中所述虱子是Bovicola ovis。
6.權(quán)利要求1要求的多肽，其中所述動(dòng)物選自綿羊，馬，牛，狗，貓或者鳥包括雞。
7.權(quán)利要求1要求的多肽，其中所述動(dòng)物是綿羊。
8.權(quán)利要求1要求的多肽，其中所述多肽是指定為Bol且來自B.Ovis的變應(yīng)原。
9.編碼權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的多肽的分離的核酸分子。
10.一種分離的核酸分子，其中所述分子a)包含SEQ ID NO.1的核苷酸序列；或者b)是(a)中分子的功能片段或變體；或者c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)中分子雜交；或者d)是(a)，(b)或(c)中定義的分子的互補(bǔ)體；或者e)是對(duì)應(yīng)于(a)-(d)中任一序列的反義序列。
11.權(quán)利要求9或10要求的分離的核酸分子，其中所述片段或變體編碼B細(xì)胞或T細(xì)胞表位。
12.包含權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的核酸分子的載體。
13.轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求12要求的載體的宿主細(xì)胞。
14.與權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的多肽結(jié)合的配體。
15.權(quán)利要求14要求的配體，其中所述配體是抗體或者包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體的片段。
16.權(quán)利要求14要求的配體，其中所述配體是單克隆抗體。
17.權(quán)利要求14要求的配體，其中所述配體是噬菌體展示分子。
18.檢測(cè)樣品是否存在結(jié)合Bol的配體或者其片段的方法，包括從宿主獲得排泄物，分泌物，組織或血樣，并且通過ELISA或者其它合適的測(cè)試使樣品接觸Bol配體結(jié)合試劑或者Bol探針步驟。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述要檢測(cè)的樣品首先制備成底物溶液形式。
20.適合在權(quán)利要求18或19中要求的測(cè)試中使用的檢測(cè)試劑盒，其中所述試劑盒包括組成ELISA或者其它合適的測(cè)試的Bol配體結(jié)合試劑或者探針。
21.在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與權(quán)利要求9-11任一項(xiàng)的核酸分子雜交的分離的探針。
22.診斷動(dòng)物對(duì)Bovicola ovis或者Bol多肽的超敏反應(yīng)的方法，包括步驟a)真皮內(nèi)注射適量的權(quán)利要求1-8要求的多肽和藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)上合適的載體或稀釋劑；b)在此之后合適的時(shí)間檢查注射部位，以檢測(cè)對(duì)本發(fā)明多肽的反應(yīng)的性質(zhì)；c)在這些觀察的基礎(chǔ)上，與只注射載體或稀釋劑和其它對(duì)照溶液的那些部位相比，確定對(duì)本發(fā)明多肽的特異性反應(yīng)是否明顯。
23.防止或減小易感動(dòng)物體內(nèi)Bol超敏反應(yīng)的疫苗，其中所述疫苗包括選自下面的物質(zhì)a)基本上如上所述的根據(jù)本發(fā)明的多肽；b)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子；基本上如上所述；c)轉(zhuǎn)染有和/或表達(dá)根據(jù)(a)的多肽的DNA或RNA的生物體；d)結(jié)合根據(jù)(a)的多肽的配體或探針。
24.治療動(dòng)物或者預(yù)防動(dòng)物對(duì)Bol多肽表現(xiàn)出變應(yīng)原性超敏反應(yīng)的方法，包括對(duì)所述動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求23要求的疫苗的步驟。
25.含有有效量的選自下面物質(zhì)的組合物g)基本上如上所述的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子；h)基本上如上所述的根據(jù)本發(fā)明的多肽；i)轉(zhuǎn)染有和/或表達(dá)根據(jù)(a)的多肽的DNA或RNA的生物體；或者j)結(jié)合根據(jù)(b)的多肽的配體或探針；和藥學(xué)或者獸醫(yī)學(xué)上合適的載體或稀釋劑。
26.權(quán)利要求25要求的組合物，其中所述組合物還含有至少一種佐劑或細(xì)胞因子。
27.治療動(dòng)物或者預(yù)防動(dòng)物對(duì)Bol多肽表現(xiàn)出變應(yīng)原性超敏反應(yīng)的方法，包括對(duì)所述動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求25或26要求的組合物的步驟。
28.權(quán)利要求24或27要求的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物或鳥。
29.權(quán)利要求24或27要求的方法，其中所述動(dòng)物是綿羊。
30.一種診斷外寄生蟲侵染的方法，包括步驟a)從宿主獲得排泄物，分泌物，組織或血樣；和b)通過ELISA或者其它合適的測(cè)試使樣品接觸鑒定的外寄生蟲糞便中存在的抗原的配體或者探針。
31.權(quán)利要求30要求的方法，其中所述外寄生蟲是B.ovis。
32.權(quán)利要求31要求的方法，其中所述鑒定的抗原是Bol。
33.通過權(quán)利要求30的方法診斷外寄生蟲侵染的檢測(cè)試劑盒，其中所述試劑盒包括構(gòu)成ELISA或者其它合適測(cè)試的外寄生蟲糞便中存在的鑒定的抗原的配體或者探針。
34.權(quán)利要求33要求的檢測(cè)試劑盒，其中所述外寄生蟲是B.ovis，并且檢測(cè)試劑盒包括構(gòu)成ELISA或者其它合適測(cè)試的Bol的配體。
35.基本上參照本發(fā)明任一實(shí)施例和/或附圖所述的基本上純化的多肽。
36.基本上參照本發(fā)明任一實(shí)施例和/或附圖所述的分離的核酸分子。
37.基本上參照本發(fā)明任一實(shí)施例和/或附圖所述的插入本發(fā)明分離的核酸分子的載體。
38.基本上參照本發(fā)明任一實(shí)施例和/或附圖所述的由插入本發(fā)明分離的核酸分子的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
39.基本上參照本發(fā)明任一實(shí)施例和/或附圖所述的與本發(fā)明的多肽結(jié)合的配體。
40.基本上參照本發(fā)明任一實(shí)施例和/或附圖所述的分析樣品是否存在與Bol或者其片段結(jié)合的配體的方法。
41.基本上參照本發(fā)明任一實(shí)施例和/或附圖所述的診斷動(dòng)物體內(nèi)對(duì)B.ovis或Bol多肽超敏反應(yīng)的方法。
42.基本上參照本發(fā)明任一實(shí)施例和/或附圖所述的疫苗。
43.基本上參照本發(fā)明任一實(shí)施例和/或附圖所述的組合物。
44.基本上參照本發(fā)明任一實(shí)施例和/或附圖所述的診斷外寄生蟲侵染的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼虱變應(yīng)原，但并不是僅來自咀嚼虱Bovicola ovis的變應(yīng)原的新的核苷酸序列，和所述核苷酸序列和蛋白質(zhì)變應(yīng)原在診斷、治療和預(yù)防虱侵染和相關(guān)的變應(yīng)原性疾病中的用途。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1430626SQ01809957
公開日2003年7月16日 申請(qǐng)日期2001年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月19日
發(fā)明者亞歷山大·T·普費(fèi)弗, 查爾斯·B·休梅克 申請(qǐng)人:奧維塔有限公司