專利名稱：重組胞內病原體疫苗和使用方法
關于政府權利本發(fā)明在美國政府支持下完成，由衛(wèi)生與人類服務部(theDepartment of Health and Human Services)提供的資助號為AI31338。美國政府在本發(fā)明中享有一定的權利。
在主要流行病學關注的病原體中，已經(jīng)證實胞內細菌是治療性或預防性措施特別難對付的病原體。包括分枝桿菌屬(Mycobacterium)和軍團菌屬(Legionella)在內的胞內細菌在受感染宿主生物的細胞內而不是在細胞外完成其全部或部分生活史。在全世界范圍內，胞內細菌每年導致數(shù)百萬人死亡，而患病者更不計其數(shù)。結核病是由一種病原體導致死亡的主要病因，全球每年有1000萬新病例出現(xiàn)，并且導致290萬人死亡。另外，胞內細菌引起數(shù)百萬麻風病病例。其它由胞內病原體傳播、衰弱型疾病包括皮膚和內臟利什曼病、美洲錐蟲病(恰加斯病(Chagas disease))、李斯特菌病、弓形體病、組織胞漿菌病、沙眼、鸚鵡熱、Q熱和軍團菌病。其時，幾乎不能對接觸這些生物中的許多生物的易感個體進行預防，以防止衰弱型感染。由于不能有效地保護群體免患這類胞內病原體感染，從而導致由這類病原體引起的人和動物病死率，結核病是現(xiàn)在人類面對的最重要疾病中的一種。
本領域技術人員會認識到，下文對結核分枝桿菌(M.tuberculosis)的示例性討論是說明本發(fā)明的內容，而決不是指本發(fā)明范圍限于結核分枝桿菌治療。同樣，本文中的內容不以任何方式限于結核性感染的治療。相反，本發(fā)明通過利用表達并同樣重要地釋放所述致病生物免疫學上重要的蛋白的重組減毒病原體或重組無毒力生物，可以用來有利地提供安全有效的針對任何病原體的疫苗和免疫治療藥。
據(jù)目前認為，大約世界人口的三分之一受到結核分枝桿菌感染，每年導致數(shù)百萬肺結核病例。更準確地講，主要由結核分枝桿菌引起的人類肺結核是發(fā)展中國家死亡的主要病因。能夠在巨噬細胞和單核細胞內存活的結核分枝桿菌可以產(chǎn)生慢性胞內感染。結核分枝桿菌通過將其自身隱藏在主要負責檢查外源因子并隨后激活免疫系統(tǒng)的細胞內而在規(guī)避宿主生物的正常防御方面是相當成功的。此外，許多用來治療結核病的第一線化療藥對與胞外生物相比的胞內生物的活性相對低。迄今為止，這些相同致病特征阻礙了開發(fā)針對結核性感染完全有效的免疫治療藥或疫苗。
雖然這種疾病在拉丁美洲、非洲和亞洲的發(fā)展中國家是特別嚴重的健康問題，但是這種疾病在第一世界也逐漸變得更加普遍。在美國，特殊人群、尤其是城區(qū)窮人、免疫受損個體和來自疾病高發(fā)區(qū)的移民的危險性增大。近幾年來，主要由于AIDS流行，結核病發(fā)病率在發(fā)達國家通常以廣譜抗藥結核分枝桿菌形式增加。
最近，在美國50個州中的36個州已經(jīng)報道結核病對一種或多種藥物有抗性。在紐約市，所有已測病例中的三分之一對一種或多種主要藥物有抗性。雖然非抗性結核病可以用抗生素的一個較長療程來治愈，但是對于抗藥性菌株的前景卻不容樂觀。感染抗兩種或兩種以上主要抗生素的菌株的患者的致死率約為50％。因此，非常需要針對這類結核分枝桿菌變種安全有效的疫苗。
結核分枝桿菌的初次感染幾乎總是通過吸入氣霧化顆粒而發(fā)生，因為所述病原體在濕痰或干痰中可以保持活力達數(shù)周或數(shù)月。雖然感染的主要部位位于肺部，但是所述生物也可以引起幾乎任何器官(包括但不限于骨、脾、腎、腦脊膜和皮膚)的感染。根據(jù)具體菌株的毒力和宿主的抵抗力，所述感染和對所述組織的相應損害可以是局部或廣泛的。就人類而言，初次感染在大多數(shù)接觸所述細菌的毒性菌株的個體中受到控制。初次攻擊后產(chǎn)生的獲得性免疫減少細菌增殖，從而使得病變痊愈并且使受治療者基本上無癥狀。
當結核分枝桿菌在受感染者中未得到控制時，它通常導致肺組織的廣泛降解。在易感個體中，損害通常在肺部形成，因為所述結核桿菌在塵細胞或肺巨噬細胞內繁殖。正是由于所述生物繁殖，它們可以通過淋巴系統(tǒng)擴散到遠處的淋巴結，并且通過血流擴散到肺尖、骨髓、腎和大腦周圍的腦脊膜。主要因為細胞介導的超敏反應，所產(chǎn)生的特征性肉芽腫病變或結核結節(jié)與所述感染的嚴重程度成正比。這些病變包括接近單核細胞的上皮樣細胞、淋巴細胞和成纖維細胞。在大多數(shù)情況下，病變或結核結節(jié)最終會壞死并經(jīng)歷干酪性壞死(受感染組織轉變?yōu)槿彳浉衫覙游镔|)。
盡管結核分枝桿菌是一種重要病原體，但是分枝桿菌屬的其它種在包括人在內的動物中也引起疾病，顯然包括在本發(fā)明的范圍內。例如，牛分枝桿菌(M.bovis)與結核分枝桿菌密切相關，并且在諸如牛、豬、綿羊、馬、狗和貓的馴養(yǎng)動物中引起結核性感染。此外，牛分枝桿菌可以通過腸道、通常由于攝入未消毒鮮奶而感染人。局部腸感染最終擴散到呼吸道，隨后不久就出現(xiàn)典型的結核病癥狀。分枝桿菌屬另一重要的致病載體是引起數(shù)百萬古老疾病病例一麻風的麻風分枝桿菌(M.leprae)。在動物和人類中引起疾病的該屬的其它種包括堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、鳥胞內分枝桿菌(M.aviumintracellulare)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)、海分枝桿菌(M.marinum)、龜分枝桿菌(M.chelonei)和瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)。所述致病分枝桿菌種常常在其相應的DNA序列和相應的蛋白質序列方面表現(xiàn)出高度的同源性，并且有些種例如結核分枝桿菌和牛分枝桿菌高度相關。
為了顯而易見的現(xiàn)實和道義原因，在承受這種痛苦的病人身上測定實驗組合物功效的初步工作是不可行的。因此，在任何藥物或疫苗的早期研發(fā)階段，由于安全和成本原因，標準的方法是采用合適的動物模型。免疫原性表位通常在不同宿主物種中是有活性的，說明所進行的實驗室動物模型能夠取得成功。因而，在一種物種例如嚙齒動物或豚鼠中的免疫原性決定簇一般在不同物種例如在人類中有免疫反應性。只有在合適動物模型進行足夠開發(fā)后，才能在人類中進行臨床試驗，以進一步證明疫苗在人類中的安全和功效。
就結核分枝桿菌引起肺泡或肺部感染而言，豚鼠模型在許多方面非常類似于所述疾病的人體病理學。因此，本領域技術人員熟知可將這種疾病的豚鼠模型外推至人和其它動物。如同人類一樣，豚鼠對低劑量的氣霧化人類病原體結核分枝桿菌易感結核性感染。與其中初次感染通常受到控制的人類不同，當接觸氣霧化病原體后，豚鼠持續(xù)發(fā)生播散性疾病，因而有利于后續(xù)分析。此外，豚鼠和人均表現(xiàn)出特征為在皮膚試驗部位發(fā)生致密單核細胞硬結或發(fā)硬區(qū)的皮膚遲發(fā)型超敏反應。最后，人和豚鼠的特征性結核結節(jié)病變表現(xiàn)出相似的形態(tài)學，包括朗格漢斯巨大細胞的存在。由于豚鼠比人對所述疾病的初次感染和進程更加敏感，所以在實驗中利用這種動物模型所產(chǎn)生的任何保護強有力地表明可以在人或其它敏感性低的哺乳動物中產(chǎn)生相同保護性免疫。因此，僅僅為了解釋而不是限制，本發(fā)明主要在豚鼠作為哺乳動物宿主的示例中加以說明。本領域技術人員將會認識到，可以用其它哺乳動物宿主(包括人和馴養(yǎng)動物)實施本發(fā)明。
任何感染致病生物、尤其是胞內生物的動物或人都難以有效刺激宿主免疫系統(tǒng)。盡管許多感染性病原體可以通過體液應答和相應產(chǎn)生的保護性抗體而得到有效控制，但是這些機制主要僅針對位于機體胞外液中的病原體有效。具體來說，調理抗體與胞外外來病原體結合，從而使得它們對吞噬作用易感，隨后將其在細胞內殺傷。然而對于其它病原體情況不是這樣。例如，先前的研究已經(jīng)表明，體液免疫應答針對胞內細菌例如結核分枝桿菌的感染似乎不能起有效的保護作用。然而，本發(fā)明可以對所述靶病原體產(chǎn)生有益的體液應答，因此，本發(fā)明的有效性不限于刺激免疫應答的任何特定組分。
更準確地講，抗體介導的防御似乎不阻止胞內病原體的初次感染，并且一旦將所述細菌隔絕在宿主細胞內就不起作用。由于水溶性蛋白一抗體可以穿過胞外液和血液，但是難以遷移跨過細胞的脂膜。此外，產(chǎn)生抗細菌表面結構的調理抗體可能實際上有助于胞內病原體進入宿主細胞。因此，任何針對胞內病原體例如分枝桿菌屬的有效預防性措施應該包括導致抗原特異性淋巴細胞快速增殖的攻擊性細胞介導的免疫應答組分，所述組分激活妥協(xié)的吞噬細胞或細胞毒性消除它們。然而，正如下文詳細討論，誘導細胞介導的免疫應答不等于誘導了保護性免疫。雖然細胞介導的免疫可能是保護性免疫的前提條件，但是依照本發(fā)明內容生產(chǎn)疫苗需要基于動物的攻擊研究。
這種細胞介導的免疫應答一般包括兩個步驟。第一步，通過特定分子(主要組織相容性分子或MHC分子)完成感染細胞的信號發(fā)送，將病原體的多個部分傳遞至細胞表面。這些MHC分子與在受感染細胞內已經(jīng)降解的細菌蛋白的小片段結合，并將其呈遞在細胞表面。它們呈遞至T細胞刺激宿主免疫系統(tǒng)，以消除受感染宿主細胞或誘導宿主細胞根除在其中居留的任何細菌。
在卡爾默蒂(Calmette)和蓋蘭(Guérin)使用體外連續(xù)傳代技術成功地弱化了牛分枝桿菌的毒力菌株之后，從1921年開始人們試圖利用接種疫苗根除結核病。在法國里爾巴斯德研究所(the Institut Pasteur inLille，F(xiàn)rance)開發(fā)所得的活疫苗被稱為卡介苗(the Bacille Calmette andGuérin)或BCG疫苗。八十多年以來，這種疫苗仍是結核病目前所使用的唯一預防性療法。事實上，今天所使用的所有BCG疫苗都來源于巴斯德研究所的卡爾默蒂和蓋蘭研制的牛分枝桿菌的原始菌株。
世界衛(wèi)生組織(the World Health Organization)認為BCG疫苗是全球、尤其是在發(fā)展中國家結核病降低的根本因素。理論上，BCG疫苗賦予針對免疫學上與結核分枝桿菌相關的減毒分枝桿菌細胞介導的免疫。所產(chǎn)生的免疫應答應該預防原發(fā)性結核病。因此，如果原發(fā)性結核病得到預防，則潛伏性感染就不可能發(fā)生，從而避免疾病復發(fā)。
然而，臨床對照試驗顯示在疫苗功效方面有顯著變化。報道的有效率在0-80％之間變動。在英國學齡兒童中進行的疫苗試驗報道，接種疫苗后10年保護率超過78％。然而，在南印度的相似試驗中，BCG在接種后前5年內不能保護培養(yǎng)物證實的原發(fā)性結核病。BCG在預防結核病方面的功效的最近總的分析(meta-analysis)估計，總體預防性功效大約為50％。(Colditz，G.A.T.F.Brewer，C.S.Berkey，M.E.Wilson，E.Burdick，H.V.Fineberg和F.Mosteller.1994.JAMA 271698-702.)
在報道的效率方面的這種顯著的差異對于健康官員和醫(yī)師而言仍是一個令人不安的問題，所以健康官員和醫(yī)師必須確定何時怎樣使用BCG疫苗。已經(jīng)暗示眾多因素可能引起這些所觀測到的功效差異，包括生產(chǎn)技術、接種途徑和其中已使用疫苗的人口特征和環(huán)境方面的差異。最近的研究工作表明，偶然接觸環(huán)境分枝桿菌可以產(chǎn)生“天然疫苗”，該疫苗防止疫苗受體建立對天然BCG蛋白的有效應答。
為了使BCG免疫原性變異減至最小，疫苗生產(chǎn)商以凍干(冷凍-干燥)狀態(tài)保持原始疫苗菌株的原種。從其衍生的每種生產(chǎn)菌株進而在產(chǎn)地之后加上公司名或細菌菌株名，例如BCG-London、BCG-Copenhagen、BCG-Connaught或BCG-Tice(Organon，Inc.全球銷售)。美國致力于使生產(chǎn)技術標準化，聯(lián)邦食品與藥物管理局(the FederalFood and Drug Administration)(FDA)生物教育研究中心(Center forBiologic Education and Research)(CBER)管理疫苗生產(chǎn)。FDA CBER機構規(guī)定，接種疫苗所用的每種凍干BCG菌株必須能夠在豚鼠和人體內誘導特異性結核菌素皮膚試驗反應。遺撼的是，已經(jīng)顯示誘導的結核菌素敏感性與保護性免疫無關。
目前，BCG疫苗作為凍干培養(yǎng)物提供，臨用前再與無菌稀釋劑水合。在實施BCG疫苗接種的國家，包括發(fā)展中國家和發(fā)達國家，BCG疫苗在出生時、嬰兒期或兒童早期給予?？赡芤呀佑|高劑量的感染性分枝桿菌的疫區(qū)成年游客可以預防性接受BCG，條件是他們皮膚試驗無反應性。對所述疫苗有不利反應極其罕見，一般限于在注射部位附近的皮膚潰瘍和淋巴結炎。然而，盡管有這些罕見的不利反應，但是從1930年起，全球已經(jīng)給予的30億劑以上的BCG疫苗具有空前的安全史。
自從研制出BCG以來，現(xiàn)在已經(jīng)過去了八十多年，但仍沒有可接受的疫苗代用品。最近，本發(fā)明人在由胞內病原體分泌的胞外蛋白的分離、鑒定和重組表達方面取得顯著的進步。例如，本發(fā)明人的于1992年4月28日授予的美國專利第5,108,745號和幾個待審的美國專利申請?zhí)峁┊a(chǎn)生針對嗜肺軍團菌(L.pneumophila)和結核分枝桿菌以及其它胞內病原體的保護性免疫的疫苗和方法。這些現(xiàn)有技術疫苗主要基于來源于由所述致病細菌胞外釋放體外肉湯培養(yǎng)物并且由受感染宿主細胞體內的細菌釋放到胞外的蛋白質性化合物的胞外產(chǎn)物。正如本文中所提供的，這些疫苗選擇性地基于針對哺乳動物宿主體內靶病原體刺激強免疫應答的胞外產(chǎn)物或其類似物的鑒定。
從所選結核分枝桿菌胞外產(chǎn)物制備的疫苗目前最好作為人類預防性療法使用。使用重組蛋白以及天然表達的蛋白質的蛋白質混合劑和單種蛋白制劑正在研究之中。這些正在研究的一個目的是通過優(yōu)化免疫原(蛋白質)呈遞使基礎免疫應答最大化。迄今為止，已經(jīng)制備100種以上的不同制劑，包括38種不同的蛋白組合，26種不同的佐劑，10種不同的蛋白濃度和若干種不同的給藥方案。也將候選疫苗蛋白與包括牛血清白蛋白、軍團菌主要分泌性蛋白質和破傷風類毒素在內的非結核分枝桿菌蛋白偶聯(lián)。該一覽表不包括本發(fā)明人用來將胞內病原體的胞外蛋呈遞至宿主動物的方法；而是用來說明與疫苗優(yōu)化相關的極端復雜性和固有變異性。然而，盡管有這些和其它活性，胞外蛋白、佐劑、載體蛋白、濃度或給藥頻率的組合沒有導致在豚鼠體內誘導與BCG相當或優(yōu)于BCG的保護性免疫應答。
最近，特別的關注集中于使用轉化BCG菌株生產(chǎn)表達各種細胞相關抗原的疫苗。例如，C.K.Stover等已經(jīng)報道使用表達布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)的膜相關脂蛋白OspA的重組BCG(rBCG)生產(chǎn)的萊姆病(Lyme Disease)疫苗。同樣，同一作者也生產(chǎn)出表達肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的肺炎球菌表面蛋白(PsPA)的rBCG疫苗。(Stover，C.K.，G.P.Bansal，S.Langerman和M.S.Hanson.1994.rBCG疫苗誘發(fā)的保護性免疫(Protective Immunity Elicited byrBCG Vaccines)。載于Brown F.(編著)Recombinant Vectors in VaccineDevelopment.Dev Biol Stand.Dasel，Karger，第82卷，163-170.)授予B.R.Bloom等的美國專利號(USPN)5,504,005(“005專利”)和USPN 5,854,055(“055專利”)公開了表達來自多種微生物的各種各樣的細胞相關融合蛋白的理論rBCG載體。在這些專利中介紹的理論載體針對與胞外非融合蛋白抗原不同的細胞相關融合蛋白，和/或假設所述rBCG表達得自遠緣相關物種的融合蛋白。此外，在這些模型中表達的重組細胞相關融合蛋白在整合到宿主基因組并且在熱激啟動子控制下的DNA上編碼。因此，所表達的抗原是融合蛋白，并且表達限制水平大約等于或低于所述載體的天然蛋白。
此外，‘005專利和‘055專利都沒有公開在最竭力模仿人類疾病的動物系統(tǒng)中的動物模型安全試驗、免疫應答發(fā)生或保護性免疫。另外，在‘005和‘055中只公開了表達結核分枝桿菌融合蛋白的理論rBCG載體，實際疫苗還不可能。已公開結核分枝桿菌的那些疫苗模型涉及細胞相關熱激融合蛋白，而沒有涉及胞外非融合蛋白。
美國專利號5,830,475(“475專利”)也公開了用來表達融合蛋白的理論分枝桿菌疫苗。編碼這些融合蛋白的DNA位于在分枝桿菌熱激蛋白啟動子和應激蛋白啟動子控制下的染色體外質粒上。所公開的疫苗用來在非人類動物模型中誘發(fā)免疫應答，以生產(chǎn)其抗體，但沒有顯示可預防哺乳動物的胞內病原體性疾病。此外，‘475專利沒有公開使用蛋白質特異性啟動子表達胞外非融合蛋白的重組接種疫苗病原體(vaccinating agent)。
本發(fā)明人非限制性地提出，胞內病原體的主要胞外非融合蛋白可能是重要的免疫保護性分子。首先，胞外非融合蛋白，由于它們被病原體釋放到宿主細胞的胞內環(huán)境，可用來加工并呈遞至免疫系統(tǒng)，作為片段與所述宿主細胞表面的MHC分子結合。這些肽-MHC復合物使免疫系統(tǒng)監(jiān)視宿主細胞內存在的其它隱藏侵入物，使得所述免疫系統(tǒng)建立針對所述侵入物的合適抗微生物攻擊。其次，當所述復合物在相關胞內病原體侵入的宿主細胞上呈現(xiàn)時，用胞外蛋白有效免疫能夠誘導在將來某一時間識別相同肽-MHC復合物的免疫細胞群體。因此，所述免疫細胞能夠靶向受感染宿主細胞，并且用細胞因子將其激活，從而能夠使其限制胞內病原體生長，或將其裂解，從而使所述病原體在其繁殖的胞內環(huán)境不能生存。第三，在所述胞外蛋白中，所述主要蛋白，即最大量產(chǎn)生的那些胞外蛋白，將最主要作為免疫保護性分子，由于它們一般提供最豐富呈現(xiàn)所述免疫系統(tǒng)的肽-MHC復合物所致。
因此，仍需要表達與所述接種疫苗病原體密切相關的胞內病原體的主要胞外非融合蛋白的重組胞內病原體疫苗。此外，需要借助于具有非熱激基因啟動子或非應激蛋白基因啟動子的染色體外DNA能夠過量表達重組胞外非融合蛋白的重組胞內病原體疫苗。
具體地說，仍迫切需要生產(chǎn)提供免患疾病的受體保護優(yōu)于BCG疫苗受體提供的保護的胞內病原體疫苗。此外，迫切需要提供在發(fā)達國家和發(fā)展中國家均具有成本效益的免疫治療性和預防性治療結核病和其它胞內病原體。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供用以治療和預防由胞內病原體引起的疾病的治療性和預防性疫苗。
本發(fā)明的另一個目的是提供預防胞內病原體性疾病的疫苗，所述疫苗使用已經(jīng)轉化的胞內病原體來表達相同胞內病原體、另一種胞內病原體或它們兩者的主要重組免疫原性抗原。
本發(fā)明的再一個目的是提供治療和預防分枝桿菌疾病的疫苗，所述疫苗使用重組BCG表達致病分枝桿菌的胞外蛋白。
本發(fā)明的另一個目的是提供治療和/或預防結核病的疫苗，所述疫苗使用重組BCG菌株表達并分泌結核分枝桿菌的一種或多種主要胞外蛋白。
本發(fā)明詳細介紹了由已經(jīng)轉化的重組減毒胞內病原體(接種疫苗病原體)組成的疫苗和免疫治療藥，所述接種疫苗病原體表達另一種或相同胞內病原體的胞外蛋白(重組免疫原性抗原)。在一個實施方案中，本發(fā)明疫苗利用卡介苗或BCG的重組菌株來制備。在該實施方案中，所述重組BCG表達包括但不限于結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌和牛分枝桿菌(僅舉幾個例子)的致病分枝桿菌的主要胞外蛋白。
由所述重組BCG表達的主要胞外蛋白包括但不限于分枝桿菌的12kDa、14kDa、16kDa、23kDa、23.5kDa、30kDa、32A kDa、32BkDa、45kDa、58kDa、71kDa、80kDa和110kDa和它們的相應類似物、同系物和亞基，包括重組非融合蛋白、融合蛋白和它們的衍生物。對本領域技術人員顯而易見的是，用來鑒定分枝桿菌屬和其它胞內病原體的主要胞外蛋白的分子量僅是指近似值。重組技術領域和分子生物學領域的技術人員將會認識到，正如其以截短形式表達這些蛋白是可行的一樣，使這些蛋白與另外的氨基酸、多肽和蛋白一起共表達(共翻譯)也是可行的。所產(chǎn)生的修飾蛋白，無論是稱為天然蛋白、非融合蛋白、融合蛋白、雜種蛋白還是稱為嵌合蛋白，都被認為在本發(fā)明的范圍內。對于本發(fā)明而言，融合蛋白定義為包括但不限于來自已經(jīng)克隆在一起的不同基因的兩種或兩種以上的編碼序列、翻譯后形成一種多肽序列的產(chǎn)物。
本發(fā)明也介紹了過量表達來自至少一種其它胞內病原體的非融合蛋白的重組減毒胞內病原體接種疫苗病原體。這通過利用表達至少一種重組免疫原性抗原基因的染色體外核酸并且該基因置于非熱激基因啟動子或非應激蛋白基因啟動子、最好是蛋白質特異性啟動子序列的控制下來完成。因此，當編碼重組免疫原性抗原的基因穩(wěn)定地整合到所述接種疫苗病原體的基因組DNA，提供具有以比可能的更大量表達的非融合、重組免疫原性抗原的疫苗。因而，提供比現(xiàn)有亞單位疫苗或減毒胞內病原體疫苗具有令人驚奇優(yōu)越特異性和效價的胞內病原體疫苗。
此外，本發(fā)明介紹了使用本發(fā)明疫苗治療和預防由胞內病原體引起的哺乳動物疾病的方法?？梢杂米鳒p毒接種疫苗病原體和/或重組免疫原性抗原源的許多胞內病原體的部分一覽表包括但不限于牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、鳥分枝桿菌(M.avium)、分枝桿菌(Mycobacterium sp.)、嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)、長灘軍團菌(L.longbeachae)、博茲曼氏軍團菌(L.bozemanii)、軍團菌(Legionella sp.)、立氏立克次氏體(Rickettsiarickettsii)、斑疹傷寒立克次氏體(Rickettsia typhi)、立克次氏體(Rickettsia sp.)、恰菲埃里希氏體(Ehrlichia chaffeensis)、嗜噬胞埃里希氏體geno組(Ehrlichia phagocytophila geno group)、埃里希氏體(Ehrlichia sp.)、伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)、利什曼原蟲(Leishmania sp.)、鼠弓形體(Toxpolasma gondii)、克氏錐蟲(Trypanosomacruzi)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、衣原體(Chlamydia sp.)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、李斯特氏菌(Listeria sp.)和組織胞漿菌(Histoplasma sp.)。在本發(fā)明的一個實施方案中，采用皮內接種，給予哺乳動物表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白的重組BCG。然而，不用說本發(fā)明疫苗可以采用產(chǎn)生合適免疫應答的任何方法給予，所述方法包括但不限于皮下、肌內、鼻腔、腹膜內、口服或吸入。在接種后適當時間，所述哺乳動物用感染性結核分枝桿菌氣霧劑攻擊。接受本發(fā)明疫苗的哺乳動物與接受單獨的BCG、接受單獨的主要胞外蛋白或其任何組合的哺乳動物相比明顯不患病。
參考下文優(yōu)選示例性實施方案的詳細描述并結合附圖簡述，本發(fā)明的其它目的和特征和優(yōu)勢對于本領域技術人員而言是顯而易見的。
圖2圖示設計用以比較豚鼠皮膚試驗結果的標以2a和2b的兩組實驗結果，所述豚鼠用表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白的重組BCG疫苗、用單獨的BCG、用單獨的重組30kDa蛋白或用假疫苗接種。
圖3圖示免疫后用結核分枝桿菌攻擊后標以3a和3b的豚鼠體重變化。
圖4a圖示免疫后用結核分枝桿菌攻擊后從豚鼠肺回收的感染性結核分枝桿菌的菌落形成單位(CFU)。
圖4b圖示免疫后用結核分枝桿菌攻擊后從豚鼠脾回收的感染性結核分枝桿菌的菌落形成單位(CFU)。
圖5圖示豚鼠對假疫苗、單獨的BCG和與結核分枝桿菌的重組30kDa一起給予的BCG的皮膚試驗反應。
發(fā)明詳述本發(fā)明總的來講涉及用于治療和預防由胞內病原體引起的人和動物感染的疫苗和免疫治療藥。具體地說，本發(fā)明涉及使胞內病原體抗原呈遞最優(yōu)化，使得能夠免疫治療藥和/或疫苗受體產(chǎn)生針對重要治療蛋白和預防蛋白的最大免疫應答。本發(fā)明人通過多年的研究和實驗已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，使用來源于胞內病原體的胞外蛋白成功地治療和預防胞內病原體感染是蛋白呈遞至所述宿主的功能。
抗原呈遞包括一組決定受體如何加工并對抗原應答的變量。這些變量可以包括但不限于佐劑、疫苗組分濃度、載體分子、半抗原、給藥頻率和給藥途徑。本發(fā)明人已經(jīng)證明，不同組合的相同抗原將會導致在遺傳上相似的宿主體內統(tǒng)計學顯著性應答變異。例如，采用相同蛋白和佐劑濃度組合結核分枝桿菌30kDa胞外蛋白的兩種疫苗制劑。一組豚鼠給予僅含有所述30kDa蛋白和佐劑的疫苗；第二組豚鼠給予如第一組一樣的疫苗，只是將IL-12加入到第二種疫苗中。當比較兩組的平均免疫應答時，接受所述疫苗加上IL-12的豚鼠證明統(tǒng)計學顯著性優(yōu)異免疫應答。
本發(fā)明介紹兩種技術的聯(lián)合，已知一種超過80年，另一種是二十世紀九十年代的產(chǎn)物?？傊?，它們代表將胞內病原體的胞外蛋白呈遞至受體并且誘導針對其顯著強的保護性免疫應答的一種全新令人驚奇的有效方法。本發(fā)明人使用結核分枝桿菌為示例性胞內病原體的胞外蛋白嘗試100多種不同的抗原呈遞方法。然而，盡管本發(fā)明人已獲得了許多成功，但是沒有誘導優(yōu)于用單獨的BCG疫苗觀察到的免疫應答。
簡而言之，并且僅計劃作為一般性實例，本發(fā)明包括胞內病原體的疫苗，所述疫苗使用表達并分必相同物種、另一物種或兩者的重組免疫原性抗原(“免疫原”)的減毒或無毒力重組胞內病原體(“接種疫苗病原體”)；所述接種疫苗病原體和免疫原統(tǒng)稱為本發(fā)明的“疫苗”。所述疫苗采用一種或多種途徑給予，包括但不限于皮下、肌內、鼻腔、腹膜內、皮內、口服或吸入。本發(fā)明的接種疫苗病原體在原位(狀態(tài))表達并分泌所述免疫原的受體內存活。
不希望受這種理論的束縛，本發(fā)明人已經(jīng)提出，諸如軍團菌的機會病原體的免疫原性抗原可以比更傳統(tǒng)的動物病原體例如分枝桿菌的相似免疫原性抗原更容易地誘發(fā)保護性免疫應答。選擇壓力可以提供與其天然宿主共同進化的病原體例如分枝桿菌以偶然或機會病原體缺乏的免疫規(guī)避機制。因此，必須研制誘發(fā)針對致病分枝桿菌屬的保護性免疫應答比需要誘發(fā)針對人類不是第一宿主的病原體的保護性免疫顯著更強的接種疫苗病原體和免疫原。
本發(fā)明人先前已經(jīng)證明，當使用完全或不完全弗氏佐劑以純化形式或以混合劑給予時，得自機會胞內病原體軍團菌的胞外蛋白給動物提供有效的免疫保護。(參見USPN 5,108,745，該文獻通過引用結合到本文中)。然而，試圖在相似條件下使用結核分枝桿菌胞外蛋白獲得相似的保護性免疫應答尚未成功。因此，本發(fā)明人提出，胞外非融合蛋白的過量表達可能是抗原呈遞和發(fā)生保護性免疫應答的一個重要方面。然而，不用說盡管非融合免疫原性胞外蛋白的過量表達可能是誘發(fā)保護性免疫的一個重要因素，但不能認為這是本發(fā)明疫苗提供的唯一免疫刺激因素。
本發(fā)明理想適合于制備針對各種各樣胞內病原體的高效免疫保護性疫苗，所述胞內病原體包括但不限于過量表達結核分枝桿菌、牛分枝桿菌或麻風分枝桿菌的主要胞外非融合蛋白的BCG菌株。本發(fā)明的每種疫苗都可以表達至少一種對給定胞內病原體特異性的各種分子量的免疫原。例如，本發(fā)明先前已經(jīng)鑒定包括但不限于以下蛋白的結核分枝桿菌免疫原主要胞外蛋白12kDa、14kDa、16kDa、23kDa、23.5kDa、30kDa、32A kDa、32B kDa、45kDa、58kDa、71kDa、80kDa、110kDa和它們的相應類似物、同系物和亞基，包括重組非融合蛋白、融合蛋白和它們的衍生物。(參見待審的美國專利申請順序號08/156,358、09/157,689、09/175,598、09/226,539和09/322,116，所述專利申請的全部內容通過引用結合到本文中)。對本領域技術人員顯而易見的是，用來鑒定分枝桿菌屬和其它胞內病原體的主要胞外蛋白的分子量僅是指近似值。重組技術領域和分子生物學領域的技術人員將會認識到，正如其可以截短形式表達這些蛋白是可行的一樣，使這些蛋白與另外的氨基酸、多肽和蛋白一起共表達(共翻譯)也是可行的。所產(chǎn)生的修飾蛋白，無論是稱為天然蛋白、非融合蛋白、融合蛋白、雜種蛋白還是稱為嵌合蛋白，都被認為在本發(fā)明的范圍內。對于本發(fā)明而言，融合蛋白定義為包括但不限于來自已經(jīng)克隆在一起的不同基因的兩種或兩種以上的編碼序列、翻譯后形成一種多肽序列的產(chǎn)物。
當編碼重組非融合蛋白的基因位于一種或多種質粒(染色體外DNA)上并且在其控制下而不是整合到宿主基因組中，一般增強包括胞外蛋白的抗原表達。此外，對特定蛋白特異性的啟動子序列驅動的蛋白表達提供增強的表達和改進的蛋白折疊和非融合蛋白抗原的加工。因此，本發(fā)明提供非熱激基因啟動子或非應激蛋白基因啟動子、最好是蛋白質特異性啟動子序列控制的染色體外DNA上編碼的重組胞外非融合蛋白。
本發(fā)明提供除表達密切相關和/或其它胞內病原體的重組胞外非融合蛋白外，還表達其自身內源胞外蛋白的重組減毒胞內病原體接種疫苗病原體例如rBCG。然而，通過80年的研究已經(jīng)證明，單獨的BCG內源胞外蛋白沒有給所有受體提供完全的保護作用。此外，正如會在下文更加詳細地加以解釋一樣，本發(fā)明人也證明，僅與傳統(tǒng)的BCG一起共同注射結核分枝桿菌胞外蛋白不產(chǎn)生優(yōu)于單獨的BCG的疫苗。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述疫苗包括僅表達一種免疫原、例如結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白的重組BCG接種疫苗病原體。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述重組BCG可以表達兩種或兩種以上的免疫原，例如結核分枝桿菌的23.5kDa和30kDa主要胞外蛋白。這后一實施方案作為預防哺乳動物疾病的疫苗可能特別有效。本發(fā)明人已提出的非限制性理論是，重組BCG同時過量表達的結核分枝桿菌的23.5kDa和30kDa主要胞外蛋白可以協(xié)同發(fā)揮作用，以提高針對本發(fā)明胞內病原體的哺乳動物保護性免疫應答。這種理論部分基于這樣的觀測野生型BCG和重組BCG都是不天然表達其自身23.5kDa主要胞外蛋白的牛分枝桿菌缺失突變體。
為了簡便起見，并且由于下文非常復雜的描述但不是用于限制本發(fā)明，作為本發(fā)明的一個示例性實施方案，使用重組BCG作為接種疫苗病原體和結核分枝桿菌胞外非融合蛋白、準確地說是30kDa主要胞外非融合蛋白更加具體地描述本發(fā)明。不用說任何重組減毒胞內病原體可以表達任何重組免疫原性抗原，本發(fā)明的疫苗不限于BCG作為所述接種疫苗病原體以及結核分枝桿菌的主要胞外非融合蛋白作為所述免疫原。
為了測定接種疫苗病原體菌株變異的作用，用兩種不同的BCG菌株制備本發(fā)明的各種實施方案BCG Tice和BCG Connaught。野生型牛分枝桿菌BCG Tice購自Organon，野生型牛分枝桿菌BCGConnaught得自Connaught Laboratories，Toronto，加拿大。所述菌株在7H9培養(yǎng)基pH6.7(Difco)中于37℃以5％CO2-95％空氣大氣壓作為非振蕩培養(yǎng)物保持。培養(yǎng)物每周一次或二次在超聲處理水浴中超聲處理5分鐘，以減少細菌菌落團塊。
表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白的重組BCG TICE(rBCG30 Tice)如下制備。一種大腸桿菌/分枝桿菌穿梭質粒pSMT3的重組構建體質粒pMTB30如本發(fā)明人在以下文獻中先前介紹的方法制備Harth，G.，B.-Y.Lee和M.A.Horwitz.1997，在快速生長的非致病分枝桿菌中高水平異源表達并分泌的4種主要結核分枝桿菌胞外蛋白被認為是先導疫苗候選物和藥物靶(High-level heterologousexpression and secretion in rapidly growing nonpathogenic mycobacteriaof four majorMycobacteriumtuberculosisextracellular proteinsconsidered to be leading vaccine candidates and drug targets).Infect.Immun.652321-2328，所述文獻的全部內容通過引用結合到本文中。
簡而言之，采用重組DNA技術領域的技術人員已知的方法，通過將一個含有所述30kDa非融合蛋白基因加上多種側翼DNA序列的大基因組DNA限制性片段插入到質粒pMTB30的多克隆位點，對質粒pMTB30進行工程改造，使其用其自身啟動子(或任何非熱激和非應激蛋白基因啟動子)表達結核分枝桿菌Erdman 30kDa主要胞外非融合蛋白。首先將所述質粒導入大腸桿菌DH5α中，以獲得大量的重組質粒。讓不能表達結核分枝桿菌30kDa非融合蛋白的重組大腸桿菌菌株在250μg/ml潮霉素存在下生長，測定質粒中所插入DNA序列的完整性。采用6.25kV/cm、25μF和1000mΩ作為產(chǎn)生最大數(shù)目陽性轉化體的條件，通過電穿孔，將所述質粒導入恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)中。本發(fā)明人通過在50μg/ml潮霉素存在下生長證實所述重組質粒的存在，并且采用重組DNA技術領域的技術人員已知的方法，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和用多價高特異性兔抗30kDa非融合蛋白免疫球蛋白的免疫印跡法，證實重組30kDa非融合蛋白的組成型表達和輸出。另外，本發(fā)明人證實重組結核分枝桿菌30kDa非融合蛋白的正確表達和加工，通過N端氨基酸測序不能將其與其天然對應物區(qū)分開來。
隨后采用6.25kV/cm、25μF和200mΩ作為最佳電穿孔條件，將重組pSMT3質粒pMTB30導入牛分枝桿菌BCG Tice中。讓轉化體在補充2％葡萄糖的7H9培養(yǎng)基中在環(huán)境搖瓶機上于37℃培養(yǎng)4小時，隨后接種到含有20μg/ml潮霉素的7H11瓊脂上。隨著將所述轉化體傳代至新的生長培養(yǎng)基中，所以將潮霉素濃度逐漸增加至50μg/ml。重組BCG Tice培養(yǎng)物在相同條件下作為野生型保持，只是所述7H9培養(yǎng)基含有50μg/ml潮霉素。
通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和用多價高特異性兔抗30kDa非融合蛋白免疫球蛋白的免疫印跡法，證實重組結核分枝桿菌30kDa非融合蛋白的表達和輸出。通常，10個轉化體中有1個轉化體比其它轉化體表達并有效輸出更大量的重組非融合蛋白；選擇2個這樣的轉化體，制備這些轉化體的大的原種，將其在含有10％甘油的7H9培養(yǎng)基中于-70℃冷凍。用這些轉化體在豚鼠中進行疫苗功效研究。

圖1a顯示SDS-PAGE凝膠和免疫印跡上重組BCG Tice表達的結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白。在考馬斯藍染色的凝膠和免疫印跡上，所述重組菌株比所述野生型菌株表達的結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白多得多。
接下來，采用前述pMTB30質粒，與上述重組BCG Tice(rBCGTice)相似的制備方法，制備表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白的重組牛分枝桿菌BCG Connaught菌株(rBCG30 Conn)。將其在與所述重組BCG Tice菌株相同的條件下，在含有濃度50μg/ml潮霉素的培養(yǎng)基中保持。圖1b顯示SDS-PAGE凝膠和免疫印跡上重組BCG Connaught表達的結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白。在考馬斯藍染色的凝膠和免疫印跡上，所述重組菌株比所述野生型菌株表達的結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白多得多。
用生物化學方法評價重組BCG菌株的質粒穩(wěn)定性。所述生物化學分析證明在潮霉素存在下，重組BCG菌株的肉湯培養(yǎng)物在3個月生長期內仍保持穩(wěn)定水平的重組非融合蛋白表達。在無潮霉素時，相同培養(yǎng)物僅顯示略微減少的非融合蛋白表達(以每個細胞為準)，表明所述重組質粒穩(wěn)定地保持，并且僅在無選擇壓力生長的細菌中非常緩慢地丟失(圖1a和圖1b，泳道3)。
不用說采用上述方法結合重組DNA技術領域的技術人員已知的方法，可以制備表達結核分枝桿菌32(A)kDa主要胞外非融合蛋白、16kDa主要胞外非融合蛋白、23.5kDa主要胞外非融合蛋白和其它結核分枝桿菌主要胞外非融合蛋白的重組BCG菌株。此外，可以用相似的方法制備表達包括但不限于以下蛋白的麻風分枝桿菌主要胞外非融合蛋白的重組BCG菌株結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白的麻風分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白同系物(a.k.a.抗原85B)、結核分枝桿菌32(A)kDa主要胞外非融合蛋白的麻風分枝桿菌32(A)kDa主要胞外非融合蛋白同系物(a.k.a.抗原85A)和其它麻風分枝桿菌主要胞外非融合蛋白。另外，也可以用相似的方法制備表達以下蛋白的重組牛分枝桿菌BCG結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白的牛分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白同系物(a.k.a.抗原85B)、結核分枝桿菌32(A)kDa主要胞外蛋白的牛分枝桿菌32(A)kDa主要胞外非融合蛋白同系物(a.k.a.抗原85A)和其它牛分枝桿菌主要胞外蛋白。
在成功的疫苗生產(chǎn)后，采用動物模型測試本發(fā)明疫苗的安全和功效。所述研究利用豚鼠是因為豚鼠模型在臨床、免疫學和病理學上與人類結核病尤其相關。與小鼠和大鼠不一樣，但與人類一樣，豚鼠a)對低劑量的氣霧劑化結核分枝桿菌敏感；b)對結核菌素表現(xiàn)出強皮膚DTH；和c)出現(xiàn)朗格漢斯巨大細胞和肺病變的干酪性壞死。然而，僅約10％感染結核分枝桿菌的免疫應答病人在其有生之年發(fā)生活動性疾病(一半是接觸后早期，一半是潛伏期后)，而受感染豚鼠總是發(fā)生早期活動性疾病。雖然豚鼠與人類在這一方面不同，但是它們在感染結核分枝桿菌后發(fā)生活動性疾病的一致性在疫苗功效試驗中是有利的。
依照本發(fā)明的內容制備的免疫接種物可從對數(shù)生長的野生型或重組BCG培養(yǎng)物(“細菌”)中取出的等份樣品制備。每等份的細菌通過以3,500×g離心15分鐘沉淀，然后用1×磷酸緩沖鹽溶液(1×PBS，50mM磷酸鈉pH7，150mM氯化鈉)洗滌。然后將所述免疫接種物重懸浮于1×PBS中，至終濃度1×104菌落形成單位/ml，并且每100μl含有1,000個活細菌。
無特定病原體的250-300g遠交雄性Hartley品系豚鼠(得自Charles River Breeding Laboratories)，以9只為一組，用以下疫苗中的一種進行皮內免疫1)BCG Connaught[103菌落形成單位(CFU)]，僅1次(時間，第0周)；2)rBCG30 Connaught(103CFU)，僅1次(時間，第0周)；3)純化重組結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白(r30)100μg的100μl Syntex佐劑制劑(SAF)，3次，間隔3周(時間，第0周、第3周和第6周)；SAF由Pluronic L121、角鯊烷和吐溫80組成，在第一次免疫中，加入丙氨酰胞壁酰二肽；和4)僅SAF(100μl)(假免疫)，3次，間隔3周(時間，第0周、第3周和第6周)。3只動物為一組的另外一組用單獨的SAF(100μl)進行假免疫，用作皮膚試驗對照。在攻擊實驗中，這些假免疫動物和3-6個其它假免疫動物用作未感染對照。
在僅1次免疫(BCG組和rBCG30組)或初次免疫(r30組和假免疫的皮膚試驗組)后9周，剃掉豚鼠背上的毛，然后皮內注射10μg純化重組結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白(r30)的100μl磷酸緩沖鹽溶液。24小時后，測量紅斑和硬結的直徑。(對于皮膚試驗，使用不同組的在攻擊研究中使用的動物中的假免疫動物。在攻擊研究中使用的假免疫動物不進行皮膚試驗，以消除皮膚試驗本身對結果影響的可能性)。
在初次或僅1次免疫后9周并且恰好在皮膚試驗之后，動物用從10ml含有1×105菌落形成單位(CFU)的結核分枝桿菌的單細胞懸浮液制備的氣霧劑攻擊。結核分枝桿菌Erdman菌株(ATCC 35801)通過遠交豚鼠傳代來保持毒力，在7H11瓊脂上培養(yǎng)，經(jīng)歷溫和超聲處理，以獲得單細胞懸浮液，用于動物攻擊實驗之前于-70℃冷凍。所述攻擊氣霧劑劑量給予每只動物肺約40個活桿菌。采用感染的空氣傳播途徑是因為這是肺結核感染的天然途徑。使用大劑量，以便在100％對照動物中在相對短的時間(10周)內誘發(fā)可測量的臨床疾病。此后，將豚鼠在裝有層流生物危害安全限內區(qū)的不銹鋼籠單個關養(yǎng)，讓其自由得到標準實驗室飼料和水。每周觀測動物的疾病狀況并稱重，連續(xù)進行10周，然后將其安樂死。取出每只動物的右肺和脾，并培養(yǎng)計數(shù)結核分枝桿菌的CFU。
在兩個實驗的每個實驗中，假免疫動物和用野生型BCG免疫的動物在用重組30kDa結核分枝桿菌主要胞外非融合蛋白(r30)測試時都幾乎沒有或沒有表現(xiàn)出紅斑和硬結。相反，用r30或rBCG30免疫的動物都表現(xiàn)出明顯的紅斑和硬結，顯著高于假免疫動物或野生型BCG免疫的動物(表1和圖2)。
在兩個實驗的每個實驗中，未感染的對照增重通常在攻擊后，與用rBCG30或野生型BCG免疫的動物一樣(圖3)。事實上，在這三組動物中在增重方面沒有顯著性差異。相反，假免疫動物和程度較低的r30免疫的動物在實驗過程中都表現(xiàn)出增重減少(表2和圖3)。因此，用結核分枝桿菌攻擊后，BCG和rBCG30保護的動物全部沒有體重減輕，體重減輕是結核病在患有這種慢性感染性疾病的病人的主要體征以及結核病在患有這種慢性感染性疾病的豚鼠模型的標志。
在兩個實驗的每個實驗中，在第10周觀察期結束時，將豚鼠安樂死，無菌取出每只動物的右肺和脾，并測定結核分枝桿菌的CFU。假免疫動物肺和脾中的細菌負荷最高(表3和圖4a和圖4b)。用r30免疫的動物比假免疫動物肺和脾中的細菌少；BCG-免疫的動物比r30-免疫動物中的細菌少；值得注意的是，rBCG30-免疫的動物比BCG-免疫動物中的細菌少。運用雙向階乘方差分析方法的統(tǒng)計學檢驗，比較平均值，表明實驗1中的4個“處理”組(假的、r30、BCG和rBCG30)的平均值與實驗2中的4個“處理”組的平均值沒有顯著性差異，因此，適宜將這兩個實驗的數(shù)據(jù)綜合。綜合數(shù)據(jù)示于表4和圖3。最感興趣且最重要的是，rBCG30-免疫動物比BCG-免疫動物的肺中的細菌低0.5log，而比脾中的細菌低1log。進行統(tǒng)計學分析，運用方差分析方法比較平均值，用Tukey-Fisher最小顯著差別(LSD)標準評價統(tǒng)計學顯著性，在肺和脾兩者的4個組中的每個組的平均值與其它組的每個組的平均值顯著不同(表4)。rBCG30免疫的動物和BCG免疫的動物之間在肺中的差異是顯著的，p＝0.02；在脾中的差異也是顯著的，p＝0.001。rBCG30免疫動物的肺CFU、總體檢查、肺的差異是平行的，比BCG免疫動物的肺破壞小(20±4％相對于35±5％平均值±SE)。
因此，在肺結核高度敏感的豚鼠模型中，給予表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白的重組BCG，誘導針對用結核分枝桿菌氣霧劑攻擊的高水平保護。相反，如下文實施例所述，給予相同分枝桿菌胞外非融合蛋白(結核分枝桿菌重組30kDa主要胞外非融合蛋白)的佐劑與BCG聯(lián)合不誘導針對用結核分枝桿菌氣霧劑攻擊的高水平保護；給予表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白的重組恥垢分枝桿菌也不誘導高水平保護；給予含結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白的微球(其大小基本與BCG相同并且同BCG一樣在60-90天內緩慢釋放所述蛋白)也不誘導高水平保護；給予在脂質體中包囊的結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白也不誘導高水平保護。
本發(fā)明的一個非常令人驚奇的方面是rBCG30菌株誘導的保護優(yōu)于野生型BCG，即使所述野生型表達并分泌內源高度同源的30kDa主要胞外蛋白。(參見圖1)。未對得自亞株BCG Connaught的30kDa蛋白編碼基因測序。然而，從這些亞株的克隆基因序列推導的BCG的兩個其它亞株的30kDa蛋白序列，與結核分枝桿菌蛋白的不同僅為1個氨基酸(BCG Paris 1173 P2)或5個氨基酸(包括2個另外的氨基酸)(BCG Tokyo)。(參見Harth，G.，B.-Y.Lee，J.Wang，D.L.Clemens和M.A.Horwitz.第3041-3042頁，1996，對結核分枝桿菌30千道爾頓主要胞外蛋白的遺傳學、生物化學和免疫細胞化學的新認識(Novelinsights into the genetics，biochemistry，and immunocytochemistry of the30-kilodalton major extracellular protein ofMycobacteriumtuberculosis.)Infect.Immun.643038-3047，所述文獻的全部內容通過引用結合到本文中)。因此，所述重組菌株的保護增強未必是由于所述重組蛋白和內源蛋白之間的少數(shù)氨基酸差異產(chǎn)生的。更可能的是，它是由于所述重組非融合蛋白與所述內源蛋白相比的表達增強產(chǎn)生的。如果是這樣的話，則利用高拷貝數(shù)質粒所獲得的大量表達可能是所述重組疫苗成功的重要因素。
表1結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白的皮膚遲發(fā)型超敏反應
表2用含毒性結核分枝桿菌Erdman菌株的氣霧劑攻擊后的凈增重
表3在被含有結核分枝桿菌Erdman菌株的氣霧劑攻擊的動物肺和脾的結核分枝桿菌菌落形成單位(CFU)綜合實驗1和實驗2
表4統(tǒng)計學分析(ANOVA)總結肺和脾CFU綜合實驗1和實驗2肺假免疫與r30 p＝0.03r30與BCG p＝0.0001BCG與rBCG30 p＝0.02脾假免疫與r30 p＝0.05r30與BCG p＝0.0001BCG與rBCG30 p＝0.001表5在被含有結核分枝桿菌Erdman菌株的氣霧劑攻擊的動物肺和脾的結核分枝桿菌菌落形成單位(CFU)用BCG或用BCG加上重組結核分枝桿菌30kDa蛋白的佐劑免疫的動物或假免疫的動物
表6在被含有結核分枝桿菌Erdman菌株的氣霧劑攻擊的動物肺和脾的結核分枝桿菌菌落形成單位(CFU)用表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白(恥垢分枝桿菌r30)的活重組恥垢分枝桿菌免疫的動物
表7在被含有結核分枝桿菌Erdman菌株的氣霧劑攻擊的動物肺和脾的結核分枝桿菌菌落形成單位(CFU)用大小基本與BCG相同并且同BCG一樣緩慢釋放結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白(r30)的微球免疫的動物用含有結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白(r30)的脂質體免疫的動物
下述實施例用以說明本發(fā)明新的方面。每個實施例說明采用與本發(fā)明疫苗密切相關但不相同的技術傳遞本發(fā)明免疫原的方式。準確地說，實施例1證明當給予本發(fā)明的免疫原，但BCG不在體內表達時，則達不到高水平的保護性免疫。
實施例2證明采用與BCG密切相關、但不能在哺乳動物宿主體內復制的分枝桿菌，本發(fā)明免疫原的體內表達不能誘導針對用結核分枝桿菌攻擊的顯著水平保護。實施例3和實施例4證明通過合成疫苗微載體緩慢釋放本發(fā)明的免疫原，也不能誘導針對用結核分枝桿菌攻擊的顯著水平的保護。
因此，下述實施例用以強調本發(fā)明的胞內病原體疫苗代表感染性疾病免疫學領域的完全出乎意料的顯著進步。
實施例實施例1用BCG加上重組結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白(r30)免疫豚鼠不能誘導針對用結核分枝桿菌攻擊的高水平保護我們以前用BCG加上r30的高效佐劑(SAF，Syntex佐劑制劑)免疫豚鼠。皮內給予r30蛋白(每次免疫100μg)3次。這誘導對r30的強皮膚遲發(fā)型過敏(C-DTH)反應(圖5)。事實上，C-DTH反應相當于表達r30的重組BCG誘導的反應。盡管如此，用BCG和r30兩者免疫不誘導針對用結核分枝桿菌攻擊的高水平保護(表5)。用BCG和r30兩者免疫的動物肺和脾的CFU水平不比用單獨的BCG免疫的動物低。這個結果正好與上述結果相反，在上述結果中用表達r30的重組BCG免疫的動物當用結核分枝桿菌攻擊時表現(xiàn)出高水平保護。
實施例2用以不能與天然形式區(qū)別的形式表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白(r30)的活重組恥垢分枝桿菌免疫豚鼠不能誘導針對用結核分枝桿菌攻擊的高水平保護在一個與我們用BCG免疫動物的實驗相同的實驗中，我們用以不可與天然形式區(qū)別的形式表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白(r30)的活重組恥垢分枝桿菌免疫豚鼠。恥垢分枝桿菌表達并分泌結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白(r30)等于或高于重組BCG菌株表達并分泌結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白(r30)的水平。此外，重組恥垢分枝桿菌的劑量(109細菌)是非常高的，高于重組BCG的劑量(103細菌)100萬倍，超過補償動物宿主體內繁殖差的恥垢分枝桿菌。為了進一步補償，皮內給予重組恥垢分枝桿菌3次，而僅皮內給予重組BCG 1次。用表達r30蛋白的重組恥垢分枝桿菌免疫誘導對r30的強皮膚遲發(fā)型過敏(C-DTH)反應。事實上，C-DTH反應相當于或高于表達r30的重組BCG誘導的反應。然而，表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白的活重組恥垢分枝桿菌不誘導針對用結核分枝桿菌攻擊的高水平保護(表6)。用表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白的活重組恥垢分枝桿菌免疫的動物肺和脾中的CFU水平并沒有比用單獨的BCG免疫的動物低。這個結果正好與上述結果相反，在上述結果中用表達r30的重組BCG免疫的動物當用結核分枝桿菌攻擊時表現(xiàn)出高水平保護。
實施例3用大小基本與BCG相同并且同BCG一樣在60-90天內緩慢釋放結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白(r30)的微球免疫豚鼠不能誘導針對用結核分枝桿菌攻擊的高水平保護在一個與我們用rBCG30和BCG免疫動物的實驗相同的實驗中，我們用大小基本與BCG相同并且同BCG一樣在60-90天內緩慢釋放結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白(r30)的微球免疫豚鼠。一組動物用含有10mg r30的微球免疫1次。另一組動物用含有3.3mg r30的微球免疫3次。計算這一用量大大超過重組BCG菌株表達的r30蛋白的量。用微球方案免疫誘導對r30的強皮膚遲發(fā)型過敏(C-DTH)反應。事實上，C-DTH反應相當于表達r30的重組BCG誘導的反應。盡管如此，用大小基本與BCG相同并且同BCG一樣緩慢釋放結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白的微球免疫不誘導針對用結核分枝桿菌攻擊的高水平保護(表7)。用微球免疫的動物肺和脾中的CFU水平并沒有比用單獨的BCG免疫的動物低。這個結果正好與上述結果相反，在上述結果中用表達r30的重組BCG免疫的動物當用結核分枝桿菌攻擊時表現(xiàn)出高水平保護。
實施例4用會有結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白的脂質體免疫豚鼠不能誘導針對用結核分枝桿菌攻擊的高水平保護在與實施例3相同的實驗中，我們用含有結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白的脂質體免疫豚鼠。所述動物用含有50μg r30的脂質體免疫3次。這誘導對r30中等強度的皮膚遲發(fā)型過敏(C-DTH)反應。所述C-DTH反應高于BCG和對照脂質體誘導的反應，但是低于表達r30的重組BCG誘導的反應。盡管如此，用含有結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白的脂質體免疫不誘導針對用結核分枝桿菌攻擊的高水平保護(表7)。用含有結核分枝桿菌30kDa主要胞外蛋白的脂質體免疫的動物肺和脾中的CFU水平并沒有比用單獨的BCG免疫的動物低。這個結果正好與上述結果相反，在上述結果中用表達r30的重組BCG免疫的動物當用結核分枝桿菌攻擊時表現(xiàn)出高水平保護。
本發(fā)明的疫苗代表一種治療性和預防性治療胞內病原體的全新方法。通過一系列精心設計的實驗和有創(chuàng)見的分析，本發(fā)明人充分證明，按照本發(fā)明的內容，保護性免疫僅當將準確選定的胞內病原體或密切相關種進行轉化，以表達相同或不同的胞內病原體的重組胞外蛋白時才得以實現(xiàn)。
本發(fā)明也可以用來提供同時針對多種胞內病原體的預防性和治療性益處。例如，可以設計重組減毒胞內接種疫苗病原體如牛分枝桿菌使其表達同時針對結核分枝桿菌和軍團菌的免疫保護性免疫原。因此，可以達到高效率地傳遞疫苗。表達結核分枝桿菌主要胞外蛋白的重組BCG的非限制性實施例不僅用作本發(fā)明的通用實施方案，而且代表對醫(yī)學和全人類的顯著進步。
因此，顯然盡管已經(jīng)說明并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但在不偏離本發(fā)明的真正精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和變化。
權利要求
1.用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，所述疫苗包含表達至少一種胞內病原體的至少一種重組免疫原性抗原的重組減毒胞內病原體。
2.權利要求1的用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，其中所述至少一種胞內病原體是除所述重組減毒胞內病原體以外的物種。
3.權利要求1的用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，其中所述重組減毒胞內病原體選自牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、鳥分枝桿菌(M.avium)、分枝桿菌(Mycobacteriumsp.)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、長灘軍團菌(L.longbeachae)、博茲曼氏軍團菌(L.bozemanii)、軍團菌(Legionella sp.)、立氏立克次氏體(Rickettsia rickettsii)、斑疹傷寒立克次氏體(Rickettsiatyphi)、立克次氏體(Rickettsia sp.)、恰菲埃里希氏體(Ehrlichiachaffeensis)、嗜噬胞埃里希氏體geno組(Ehrlichia pagocytophila genogroup)、埃里希氏體(Ehrlichia sp.)、伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)、利什曼原蟲(Leishmania sp.)、鼠弓形體(Toxpolasma gondii)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、衣原體(Chlamydia sp.)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、李斯特氏菌(Listeria sp.)和組織胞漿菌(Histoplasma sp.)。
4.權利要求3的用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，其中所述重組減毒胞內病原體是牛分枝桿菌。
5.權利要求1的用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，其中所述至少一種其它胞內病原體選自牛分枝桿菌、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌、分枝桿菌、嗜肺軍團菌、長灘軍團菌、博茲曼氏軍團菌、軍團菌、立氏立克次氏體、斑疹傷寒立克次氏體、立克次氏體、恰菲埃里希氏體、嗜噬胞埃里希氏體geno組、埃里希氏體、伯氏考克斯氏體、利什曼原蟲、鼠弓形體、克氏錐蟲、肺炎衣原體、衣原體、單核細胞增生李斯特氏菌、李斯特氏菌和組織胞漿菌。
6.權利要求5的用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，其中所述至少一種其它胞內病原體是結核分枝桿菌。
7.權利要求1的用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，其中所述重組免疫原性抗原是主要胞外蛋白。
8.權利要求7的用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，其中所述主要胞外蛋白選自牛分枝桿菌、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌和分枝桿菌。
9.權利要求8的胞內病原體的主要胞外蛋白，所述主要胞外蛋白選自12kDa、14kDa、16kDa、23kDa、23.5kDa、30kDa、32AkDa、32B kDa、45kDa、58kDa、71kDa、80kDa和110kDa主要胞外蛋白和它們的相應類似物、同系物和亞基。
10.用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，所述疫苗包含表達至少一種其它密切相關胞內病原體的至少一種重組免疫原性抗原的重組減毒胞內病原體。
11.權利要求10的用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，其中所述至少一種重組免疫原性抗原包括至少一種其它胞內病原體的至少一種主要胞外蛋白。
12.權利要求11的用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，所述至少一種其它胞內病原體是一種密切相關胞內病原體。
13.用于預防哺乳動物疾病的胞內病原體疫苗，所述疫苗包含表達另一種密切相關胞內病原體的至少一種重組免疫原性抗原和第三種胞內病原體的至少一種重組免疫原性抗原的重組減毒胞內病原體。
14.一種預防哺乳動物胞內病原體性疾病的方法，所述方法包括給予哺乳動物宿主表達胞內病原體的重組免疫原性抗原的重組減毒胞內病原體。
15.權利要求14的預防哺乳動物胞內病原體性疾病的方法，其中所述重組減毒胞內病原體是BCG。
16.權利要求14的預防哺乳動物胞內病原體性疾病的方法，其中所述胞內病原體是結核分枝桿菌。
17.權利要求14的預防哺乳動物胞內病原體性疾病的方法，其中所述重組免疫原性抗原是主要胞外蛋白。
18.一種預防哺乳動物胞內病原體性疾病的方法，所述方法包括給予哺乳動物宿主表達一種其它胞內病原體的重組免疫原性抗原的重組減毒胞內病原體。
19.權利要求18的預防哺乳動物胞內病原體性疾病的方法，其中所述重組免疫原性抗原是主要胞外蛋白抗原。
20.權利要求18的預防哺乳動物胞內病原體性疾病的方法，其中所述其它胞內病原體是密切相關的胞內病原體。
21.一種預防哺乳動物胞內病原體性疾病的方法，所述方法包括給予哺乳動物宿主表達一種密切的胞內病原體的主要胞外免疫原性抗原和另一種胞內病原體的重組免疫原性抗原的重組減毒胞內病原體。
22.用于預防哺乳動物至少一種胞內病原體性感染的活減毒重組胞內病原體疫苗，所述疫苗包含表達至少一種病原體的至少一種重組免疫原性抗原的減毒重組胞內病原體，所述至少一種重組免疫原性抗原在摻入到質粒中并且在選自非熱激基因啟動子和非應激蛋白基因啟動子的基因啟動子控制下的DNA上編碼。
23.權利要求22的用于預防哺乳動物至少一種胞內病原體性感染的活減毒重組胞內病原體疫苗，其中所述重組減毒胞內病原體選自牛分枝桿菌、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌、分枝桿菌、嗜肺軍團菌、長灘軍團菌、博茲曼氏軍團菌、軍團菌、立氏立克次氏體、斑疹傷寒立克次氏體、立克次氏體、恰菲埃里希氏體、嗜噬胞埃里希氏體geno組、埃里希氏體、伯氏考克斯氏體、利什曼原蟲、鼠弓形體、克氏錐蟲、肺炎衣原體、衣原體、單核細胞增生李斯特氏菌、李斯特氏菌和組織胞漿菌。
24.權利要求23的用于預防哺乳動物至少一種胞內病原體性感染的活減毒重組胞內病原體疫苗，其中所述重組減毒胞內病原體是牛分枝桿菌。
25.權利要求22的用于預防哺乳動物至少一種胞內病原體性感染的活減毒重組胞內病原體疫苗，其中所述至少一種胞內病原體選自牛分枝桿菌、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌、分枝桿菌、嗜肺軍團菌、長灘軍團菌、博茲曼氏軍團菌、軍團菌、立氏立克次氏體、斑疹傷寒立克次氏體、立克次氏體、恰菲埃里希氏體、嗜噬胞埃里希氏體geno組、埃里希氏體、伯氏考克斯氏體、利什曼原蟲、鼠弓形體、克氏錐蟲、肺炎衣原體、衣原體、單核細胞增生李斯特氏菌、李斯特氏菌和組織胞漿菌。
26.權利要求25的用于預防哺乳動物至少一種胞內病原體性感染的活減毒重組胞內病原體疫苗，其中所述至少一種胞內病原體是結核分枝桿菌。
27.權利要求22的用于預防哺乳動物至少一種胞內病原體性感染的活減毒重組胞內病原體疫苗，其中所述至少一種重組免疫原性抗原是主要胞外蛋白。
28.權利要求27的主要胞外蛋白，所述主要胞外蛋白還包含選自牛分枝桿菌、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌和分枝桿菌的胞內病原體的主要胞外蛋白。
29.權利要求28的胞內病原體的主要胞外蛋白，所述主要胞外蛋白選自12kDa、14kDa、16kDa、23kDa、23.5kDa、30kDa、32AkDa、32B kDa、45kDa、58kDa、71kDa、80kDa和110kDa主要胞外蛋白和相應類似物、同系物和亞基。
30.用于預防哺乳動物至少一種胞內病原體性感染的活減毒重組分枝桿菌疫苗，所述疫苗包含表達至少一種病原體的至少一種重組免疫原性抗原的減毒重組分枝桿菌，所述至少一種重組免疫原性抗原在摻入到質粒中并且在選自非熱激基因啟動子和非應激蛋白基因啟動子的基因啟動子控制下的DNA上編碼。
31.權利要求30的用于預防哺乳動物至少一種胞內病原體性感染的活減毒重組分枝桿菌疫苗，其中所述基因啟動子是所述重組免疫原性抗原特異性啟動子。
32.權利要求30的用于預防哺乳動物至少一種胞內病原體性感染的活減毒重組分枝桿菌疫苗，其中所述至少一種重組免疫原性抗原是非融合蛋白。
33.一種用于預防哺乳動物感染結核分枝桿菌的活減毒重組分枝桿菌疫苗，所述疫苗包含同時表達結核分枝桿菌的重組23.5kDa主要胞外蛋白和重組30kDa主要胞外蛋白的重組BCG。
全文摘要
本發(fā)明提供預防哺乳動物胞內病原體性疾病的疫苗和免疫治療藥，所述疫苗及免疫治療藥由已經(jīng)轉化表達相同或其它胞內病原體的重組免疫原性抗原的重組減毒胞內病原體構成。示例性的疫苗和免疫治療藥包括表達分枝桿菌和/或其它胞內病原體的主要胞外非融合蛋白的減毒重組分枝桿菌。已表明這些示例性的疫苗在哺乳動物體內產(chǎn)生令人驚奇的有效保護性免疫應答，超過了任何先前已知的抗分枝桿菌疫苗的保護性免疫應答。更準確地講，提供表達結核分枝桿菌30kDa主要胞外非融合蛋白的重組BCG。另外，提供預防和治療由胞內病原體引起的疾病的方法。所述胞內病原體性疾病的預防和治療方法利用所述令人驚奇的有效疫苗和免疫治療藥。
文檔編號A61K39/116GK1437479SQ01811004
公開日2003年8月20日 申請日期2001年4月16日 優(yōu)先權日2000年4月17日
發(fā)明者M·A·霍爾維茨, G·哈斯 申請人:加州大學評議會