專利名稱：用于治療多發(fā)性硬化的新干擾素的制作方法
背景技術(shù)：
干擾素是在涉及諸如細(xì)胞增殖和免疫應(yīng)答的多種生物學(xué)過程中起重要作用的胞間信號蛋白。


圖1顯示人干擾素-β-2的核苷酸序列，包括5′和3′序列。
圖2顯示人干擾素-β-2的氨基酸序列。顯示了IFN-β2的可譯框的翻譯。信號序列以斜體字顯示，而兩個潛在N-糖基化位點和能夠形成二硫鍵的半胱氨酸以下劃線和粗體字顯示。
圖3顯示I型干擾素的三維結(jié)構(gòu)。所有三種IFN共享共同的人I型IFN的5-螺旋束基序特征。此外，IFN-β1b和IFN-β2在它們的潛在N-糖基化位點和被提議的二硫鍵的位置方面彼此類似。獨(dú)特的C-末端氨基酸序列僅在IFN-β2中存在。
圖4是比較人干擾素-β-2與其它干擾素類型的蛋白質(zhì)序列對比。
圖5是IFN-β2與人I型和II型干擾素的系統(tǒng)發(fā)生比較。根據(jù)半胱氨酸保守模式、潛在N-糖基化位點和系統(tǒng)發(fā)生分析，與其它任何干擾素相比，IFN-β2與IFN-β更加密切相關(guān)。
圖6顯示用于人干擾素-β-2的I型IFN依賴性ISRE-螢光素酶報道基因分析。
圖7顯示IFN-β2與含有抗IFN-β2多克隆抗體的人I型干擾素受體結(jié)合的抑制作用的結(jié)果。
圖8(A和B)顯示干擾素對細(xì)胞增殖的影響。
圖9說明IFN-β2對人細(xì)胞的抗增殖活性。
圖10顯示干擾素對人細(xì)胞的抗病毒活性。
圖11顯示IFN-α2和IFN-β2之間的與I型干擾素受體結(jié)合的競爭。
圖12是人IFN-β2的5′基因組核苷酸序列。
圖13是編碼人IFN-β2的5′區(qū)的核苷酸序列。
圖14是人IFN-β2的5′多肽序列。
圖15顯示應(yīng)答IFN-β2的人胎兒星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗增殖。(A)為無刺激的胎兒腦培養(yǎng)物1，(B)為EGF刺激的胎兒腦培養(yǎng)物1；(C)為無刺激的胎兒腦培養(yǎng)物2，(D)為EGF刺激的胎兒腦培養(yǎng)物2。

發(fā)明內(nèi)容
已鑒定編碼干擾素-β-2(“IFN-β2”)的新的核酸、多肽序列及它們的核酸調(diào)節(jié)劑，IFN-β2是一類發(fā)揮無數(shù)生物作用，包括例如抗腫瘤作用、抗病毒作用和免疫調(diào)節(jié)作用的胞間信號多肽。例如，參見Cirelli和Tyring，Clin.Immunother.3，27-87，1995。本發(fā)明的干擾素多肽、其片段及其衍生物具有一種或多種以下生物活性，包括但不限于IFN-β2生物活性和IFN-β2-特異性免疫原活性。
“IFN-β2生物活性”意指例如功能性作用，如改變細(xì)胞膜、抗癌基因調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性、抗病毒活性、細(xì)胞生長抑制或抗生長活性、抗增殖、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性、免疫調(diào)節(jié)活性、靶細(xì)胞分化的誘導(dǎo)或抑制、巨噬細(xì)胞激活、癌基因減量調(diào)節(jié)等；免疫作用，如減少抗體形成、增加細(xì)胞膜組分(主要組織相容性復(fù)合物、Fc受體、β2-微球蛋白)、調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、增加細(xì)胞因子(如白介素)產(chǎn)生、增加細(xì)胞毒性T細(xì)胞作用、增加巨噬細(xì)胞作用和增加天然殺傷；干擾素受體結(jié)合活性，如與干擾素I型受體，特別是它的IFNAR2c鏈結(jié)合，和由這種受體結(jié)合刺激的細(xì)胞作用；激活和/或締合胞內(nèi)信號分子，如Jak1、Tyk2、Stat1、Stat2、IRS-1、IRS-2、CrkL、CrkII、Vav等和其它下游效應(yīng)物(如MAPK)。例如，參見Platanias和Fish，Exp.Hematology，271583-1592，1999。
短語“抗增殖活性”意指本發(fā)明的IFN-β2抑制細(xì)胞生長或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這在以下實施例中說明。還參見圖8、9和15。例如，IFN-β2抑制腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。例如，這種活性用于治療多發(fā)性硬化，因為星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖可能導(dǎo)致作為疾病特征的神經(jīng)元炎癥。IFN-β2通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞生長而減少炎癥和改善疾病。因此，本發(fā)明涉及多發(fā)性硬化的治療方法，所述方法包括給予有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和/或減少炎癥的量的IFN-β2。
“IFN-β2-特異性免疫原活性”意指，例如，IFN-β2多肽引起對IFN-β2具有選擇性或優(yōu)先性的免疫應(yīng)答，例如對哺乳動物IFN-β2具有選擇性的免疫應(yīng)答。因此，由選自哺乳動物IFN-β2氨基酸序列，例如圖2中的IFN-β2刺激抗體、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞等是特異性免疫原活性。這些應(yīng)答可以常規(guī)測定。
IFN-β2是具有可從天然來源獲得的氨基酸序列并具有一種或多種上述生物活性的全長哺乳動物多肽。它可以具有圖2所示的序列，具有起始于起始密碼子并終止于終止密碼子的可譯框。它包括天然存在的正常序列、天然存在的突變序列和天然存在的多形序列，包括單核苷酸多形(SNP)等。例如，天然來源包括活細(xì)胞，例如得自組織或整個生物、培養(yǎng)的細(xì)胞系(包括原代和無限增殖化細(xì)胞系)、活檢組織等。
本發(fā)明還涉及哺乳動物IFN-β2的片段。所述片段優(yōu)選是“生物活性的”?！吧锘钚缘摹币庵付嚯钠尉哂性诨钕到y(tǒng)中或活系統(tǒng)成分的活性。生物活性包括已提及的活性，如IFN-β2-生物活性和IFN-β2-特異性免疫原活性。可以根據(jù)任何期望的方法制備片段，所述方法包括化學(xué)合成、基因工程、切割產(chǎn)物等。IFN-β2的生物活性片段包括在蛋白質(zhì)的羧基-或氨基末端除去或修飾氨基酸序列的多肽。
優(yōu)選排除圖12和13中的核酸及其片段。優(yōu)選排除圖14中的多肽及其片段。但不排除含有或包含(contain或comprise)這些序列的多肽，如全長IFN-β2，具有兩個或更多個這些所述片段的多肽或具有一個所述片段和其他氨基酸序列的多肽，這些多肽來自IFN-β2或其它來源。
本發(fā)明還涉及具有圖2所示的推導(dǎo)的氨基酸序列1-208的IFN-β2。它的計算分子量為大約23000道爾頓而預(yù)期的等電點為8.1。它是一種由SDS-PAGE測得的分子量為大約26000道爾頓的酸穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。在大腸桿菌產(chǎn)生的未糖基化的形式具有大約20500道爾頓的分子量。參見以下實施例。
如圖2所示，它具有預(yù)期的氨基酸1-21位的信號序列、氨基酸74-77位和83-86位的兩個潛在N-糖基化位點和32位、142位和154位的半胱氨酸殘基。預(yù)期在半胱氨酸殘基32位和142位之間形成二硫鍵。它包括在氨基酸7-24位的螺旋A、55-69位的螺旋B、83-95位的螺旋C、118-134位的螺旋D和143-158位的螺旋E。
成熟IFN-β2指圖2所示的缺乏氨基酸-1至-21且長度為187個氨基酸的IFN-β2。與其它已知的干擾素類型相比，它還具有位于C-末端的獨(dú)特18個氨基酸延伸。這些延伸可以用作IFN-β2的核苷酸和氨基酸水平的標(biāo)記，并可以融合到異源多肽上。
例如，具有圖2所示氨基酸序列的本發(fā)明的IFN-β2多肽可以通過任何適宜的方法分析，以鑒定此多肽中的其它結(jié)構(gòu)和/或功能域，包括跨膜區(qū)、疏水區(qū)。例如，IFN-β2多肽可以由以下文獻(xiàn)公開的方法分析如Kyte和Doolittle，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué))，157105，1982；EMBL Protein Predict(EMBL蛋白質(zhì)預(yù)測)；Rost和Sander，Proteins(蛋白質(zhì))，1955-72，1994。
本發(fā)明的IFN-β2的其它同系物可以根據(jù)多種方法從哺乳動物和非哺乳動物來源獲得。例如，與寡核苷酸(如用于擴(kuò)增編碼區(qū)的引物-5′-ATG ATT ATC AAG CAC TTC TTT GGA-3′和5′-CTA CCT CGGGCT TCT AAA CTC TGT-3′)雜交。用于在大腸桿菌中表達(dá)的引物-5′-GGA ATT CCT ACT ACC TCG GGC TTC TAA-3′和5′-GCG CGCGCA TAT GCT AGA TTT GAA ACT GAT TAT-3′。全長已知序列的引物，包括5′和3′未翻譯的基因組序列-5′-TTT AGG TGA CAC TATAGA AT-3′和5′-TAA AAT GGA TAG AAT ATA TAA-3′-可以用于選擇同系物，如在Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，Chapter 11(11章)，1989中所述。這些同系物可以與IFN-β2具有不同量的核苷酸和氨基酸序列同一性和相似性。哺乳動物生物包括，例如嚙齒動物、小鼠、大鼠、倉鼠、猴、猿、豬、母牛、馬、狗、貓等。非哺乳動物生物包括，例如脊椎動物、無脊椎動物、斑馬魚、小雞、果蠅、秀麗隱桿線蟲(C.elegans)、非洲蟾蜍(Xenopus)、酵母如裂變酵母(S.pombe)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、線蟲、原核生物、植物、擬南芥(Arabidopsis)、甲殼動物、鹵蟲屬(Artemia)、病毒等。為了選擇用于雜交的寡核苷酸，可以使用有效的方法。例如，可以通過比較本發(fā)明的IFN-β2和其它IFN-β2類型并選擇僅在前者中出現(xiàn)的氨基酸序列(即非保守的或?qū)FN-β2“特異性的”)來鑒定IFN-β2-特異性區(qū)。例如參見圖4，該圖顯示不同干擾素類型之間的保守區(qū)和非保守區(qū)?？梢赃x擇非保守氨基酸序列(如KSLSP)并可以根據(jù)這些序列設(shè)計簡并探針。還參見Venkataraman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，963658-3663，1999?？梢猿Ｒ?guī)地，如通過使用BLAST計算機(jī)程序組檢索基因/蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫來發(fā)現(xiàn)其它特異性(即非保守)和/或保守氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及IFN-β2-特異性氨基酸序列，例如在圖2和4的特定序列中發(fā)現(xiàn)但在其它干擾素類型中沒有發(fā)現(xiàn)的確定的氨基酸序列。優(yōu)選的多肽為至少大約8個鄰接的氨基酸，如大約9、10、12、15、20、21、22、25、30、40、50個氨基酸等。例如，這些多肽可以包含KHFFGTV、IIFQQRQV、KSLSP、FRANI、AEKLSGT、CLFFVFS和QGRPLNDMKQELTTEFRSPR和它們的片段。IFN-β2-特異性氨基酸序列或基序可以生產(chǎn)肽，所述肽作為抗原產(chǎn)生對其特異性的免疫應(yīng)答。通過這種免疫獲得的抗體可以用作用于診斷或研究目的的哺乳動物IFN-β2蛋白質(zhì)的特異性探針，包括作為表達(dá)標(biāo)記。
如上述，本發(fā)明的多肽可以包含多種IFN-β2的氨基酸序列(如全長序列，即圖1所示的具有起始和終止密碼子)、成熟氨基酸序列(即其中以前體形式產(chǎn)生IFN-β2多肽，并被加工成成熟多肽，或其片段)。有用的片段包括，例如包含或基本組成為任意上述域的片段和特異性或保守氨基酸序列，如圖2和4所示的氨基酸序列可以選擇具有特定生物活性的本發(fā)明的IFN-β2多肽片段，所述活性如抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗生長等。這些活性的測定可如已知那樣進(jìn)行。參見下述。還可以如EP496162所述鑒定和制備這些肽。
本發(fā)明的多肽還可以與圖2所述的氨基酸序列具有100％或更小的氨基酸序列同一性。為以下討論的目的，序列同一性意指在比較序列的對應(yīng)位置發(fā)現(xiàn)與在圖1和2所述序列中發(fā)現(xiàn)的相同的核苷酸或氨基酸。與圖1和2所述氨基酸序列具有小于100％序列同一性的多肽可以含有來自天然存在序列的多種置換，包括同源和非同源氨基酸置換。參見以下關(guān)于同源氨基酸置換的實施例。相同和同源殘基的總和除以與IFN-β2多肽比較的序列中殘基的總數(shù)等于百分序列相似性。為計算序列同一性和相似性的目的，可以對比較序列進(jìn)行比對(align)，并根據(jù)任何期望的方法、算法、計算機(jī)程序等，例如FASTA、BLASTA進(jìn)行計算。
與圖2的氨基酸序列具有小于100％的氨基酸序列同一性的多肽可以具有大約99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、88％、85％、80％、75％、70％或低至大約53％的序列同一性。
本發(fā)明還涉及IFN-β2的多肽突變體蛋白，即任何具有在氨基酸序列方面不同于可從天然來源獲得的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽(哺乳動物IFN-β2的片段在氨基酸序列方面與天然存在的IFN-β2的沒有不同，雖然在氨基酸數(shù)目方面不同)。因此，IFN-β2多肽突變體蛋白包含氨基酸置換、插入和缺失，包括非天然存在的氨基酸。
還可以在基因數(shù)據(jù)庫如Genbank、EMBL中進(jìn)行同源性檢索的基礎(chǔ)上制備本發(fā)明的IFN-β2氨基酸序列的突變體蛋白?？梢允褂枚喾N方法，包括在BLAST計算機(jī)程序組中所述的算法、Smith-Waterman算法等進(jìn)行序列同源性檢索?？梢酝ㄟ^在多肽的相同和/或同源的域內(nèi)鑒定和比對氨基酸，然后在此比對的基礎(chǔ)上修飾氨基酸而將突變體蛋白引入序列。例如，本發(fā)明的IFN-β2與圖4中所示的多種已知干擾素共享序列同一性。保守氨基酸殘基上的這些多肽之間的比對可以鑒定預(yù)期其修飾減少、降低或消除IFN-β2生物活性，如受體結(jié)合活性等的殘基。例如，當(dāng)比對揭示兩個或更多域之間的相同保守氨基酸時，可以預(yù)期這些氨基酸的消除或置換不利地影響其生物活性。
還可以通過用一種同源氨基酸代替另一種來進(jìn)行氨基酸置換?？梢栽趥?cè)鏈的大小和極化程度的基礎(chǔ)上確定同源氨基酸，包括小非極性半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸；小極性絲氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺；大極性谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸；中等極性酪氨酸、組氨酸、色氨酸；大非極性苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸。同源酸還可以分組如下不帶電的極性R基團(tuán)甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；酸性氨基酸(帶負(fù)電)天冬氨酸和谷氨酸；堿性氨基酸(帶正電)賴氨酸、精氨酸、組氨酸。同源氨基酸還包括Dayhoff在Atlas of Protein Sequence and Structure5，1978中和Argos在EMBOJ.，8，779-785，1989中所述的氨基酸。
可以制備對活性無影響，或與野生型相比降低或增加IFN-β2活性的突變體蛋白?？梢耘c其它IFN-β2，如成纖維細(xì)胞干擾素(β-1)和α-干擾素類似地進(jìn)行突變。例如，IFN-β2折疊成干擾素的典型的特征性五螺旋束在氨基酸7-24位的螺旋A、55-69位的螺旋B、83-95位的螺旋C、118-134位的螺旋D和143-158位的螺旋E。這些螺旋通過無規(guī)卷曲或環(huán)形區(qū)域栓在一起。參見圖3。螺旋結(jié)構(gòu)的突變可以與IFN-β1(成纖維細(xì)胞)類似地完成，如在Runkel等人，Biochemistry(生物化學(xué))，392538-2551，2000中所述。例如，A螺旋的部分、AB環(huán)和E螺旋在受體結(jié)合中涉及。還參見Piehler和Schreiber，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)，294223-237，1999。
本發(fā)明的IFN-β2，如成纖維細(xì)胞干擾素，具有三個位于氨基酸32位、142位和154位的半胱氨酸殘基。32位和142位的半胱氨酸殘基的位置與已知形成成纖維細(xì)胞干擾素內(nèi)的二硫鍵的半胱氨酸殘基相似。與成纖維細(xì)胞干擾素相似，154位的氨基酸可以缺失或被中性氨基酸置換，所述中性氨基酸如甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸。優(yōu)選絲氨酸和蘇氨酸，因為它們與半胱氨酸具有化學(xué)相似性。除去未成對的半胱氨酸可以防止不正確的分子內(nèi)和分子間二硫鍵的形成。例如，參見美國專利4,588,585。突變還可以根據(jù)美國專利4,914,033、5,545,723和5,580,723進(jìn)行。例如，參見Fish等人，J.Interferon Res.(干擾素研究雜志)，12257-66，1992；Fish等人，J.Interferon Res.(干擾素研究雜志)，997-114，1989；DiMarco等人，J.Interferon Res.(干擾素研究雜志)，13139，1993；Mitsui等人，Pharmacol.Therap.(藥理學(xué)治療)，5893-132，1993；Wang等人，J.Immunol，152705-715，1994。
本發(fā)明涉及編碼這種突變體蛋白多肽的突變體蛋白核酸。因此，本發(fā)明涉及圖1的核苷酸序列，其中所述核酸編碼多肽且一個或多個氨基酸位置被置換或缺失，或者同時被置換和缺失，且由該核酸編碼的多肽具有生物活性，如在重組表達(dá)時增強(qiáng)從細(xì)菌細(xì)胞的回收，或增強(qiáng)生物活性。多肽突變體蛋白及其對應(yīng)的核苷酸編碼序列可能具有圖2所述的氨基酸序列，除了其中一個或多個位置被同源氨基酸置換，如其中存在1、5、10、15或20個置換。可以根據(jù)上述、下述和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定修飾如何影響所述的活性。
已知多種測定IFN-β2活性的方法。例如，有用的測定包括抗病毒分析，如CPE(如美國專利5,545,723和4,914,033；以下實施例)；受體結(jié)合(如美國專利5,545,723和以下實施例；STAT激活(如以下實施例)；IFN-β2效應(yīng)基因的激活(如干擾素刺激的效應(yīng)元件(ISRE)可操縱地連接到報道基因，如螢光素酶，如以下實施例所示)；I型受體的磷酸化作用(以下實施例)；抗增殖(美國專利4,914,033，評價IFN-β2抑制細(xì)胞系復(fù)制的能力；以下實施例)；免疫調(diào)節(jié)(美國專利4,914,033，antibody-dependent cellular cytotoxicity(抗體依賴性細(xì)胞毒性)；Noronha等人，J.Neuroimmunol.(神經(jīng)免疫)，46145-154，1993，inhibition of T-lymphocytes and their production of IFN-gamma(T淋巴細(xì)胞的抑制作用及它們的IFN-γ的生產(chǎn))；experimental allergicencephalomyelitis(實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎)(“EAE”)(如Louboutin等人，Acta Neurol.Scand.，8897-99，1993；Rott等人，Eur.J.Immunol.，231745-1751，1993；以下實施例)。
本發(fā)明的哺乳動物IFN-β2、其片段或取代的多肽還可以包含多種修飾，其中這種修飾包括脂質(zhì)修飾、甲基化、磷酸化、糖基化、共價修飾(如氨基酸R基的共價修飾)、氨基酸置換、氨基酸缺失或氨基酸添加。多肽的修飾可以根據(jù)多種方法進(jìn)行，包括重組、合成、化學(xué)等。
本發(fā)明的多肽(如全長、其片段、其突變)可以多種方式使用，如用于測定、作為如下所述抗體的免疫原、作為生物活性試劑(如具有一種或多種與本發(fā)明的IFN-β2相關(guān)的活性)。
編碼本發(fā)明的IFN-β2的多肽、其衍生物或其片段可以與一個或多個結(jié)構(gòu)域、功能域、可檢測域、抗原域和/或期望的有用多肽，以自然界不存在，即不天然存在的排列組合。包含這些特征的多肽是嵌合或融合多肽。這種嵌合多肽可以根據(jù)多種方法制備，這些方法包括化學(xué)、合成、半合成和/或重組方法。編碼嵌合多肽的嵌合核酸可以在可譯框中包含多個域或連續(xù)(如具有多重N-末端域以穩(wěn)定或增強(qiáng)活性)或中斷的期望的多肽，如包含內(nèi)含子、剪接位點、增強(qiáng)子等等。嵌合核酸可以根據(jù)多種方法生產(chǎn)。例如參見美國專利5,439,819。域或期望的多肽可以具有任何期望的性質(zhì)，包括生物功能如信號、生長促進(jìn)、細(xì)胞靶向(如信號序列、靶向序列，如靶向作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或核)等，結(jié)構(gòu)功能如疏水、親水、跨膜等，受體-配體功能和/或可檢測的功能如與酶、熒光多肽、綠色熒光蛋白組合(Chalfie等人，Science(科學(xué))，263802，1994；Cheng等人，Nature Biotechnology(自然生物技術(shù))，14606，1996；Levy等人，Nature Biotechnology(自然生物技術(shù))，14610，1996)等。域還可以是免疫球蛋白，如增強(qiáng)穩(wěn)定性等，如免疫球蛋白重鏈、輕鏈和/或Fc區(qū)或附加表位序列。
此外，多肽或其部分在引入宿主細(xì)胞時可以用作選擇性標(biāo)記。例如，編碼本發(fā)明的氨基酸序列的核酸可以符合讀框融合成期望的編碼序列并用作純化、選擇或標(biāo)記目的的標(biāo)記物。融合區(qū)可以編碼切割位點以促進(jìn)表達(dá)、分離、純化等。
本發(fā)明的IFN-β2多肽或其片段還可以與其它細(xì)胞因子如干擾素組合，以制備嵌合或雜合IFN-β2。這種雜合IFN-β2可以是在任何種類的干擾素之間，所述干擾素包括α、ω、γ、ε、滋養(yǎng)層、胎兒等?？梢灾苽渑c產(chǎn)生它們的雜合體相比具有降低或限制活性，如限制細(xì)胞生長調(diào)節(jié)活性、抗病毒活性或免疫調(diào)節(jié)活性的雜合體(和上述的突變體蛋白)。例如，參見美國專利4,758,428，用于在成纖維細(xì)胞干擾素和α-干擾素之間雜合，如使用成纖維細(xì)胞干擾素的大約氨基酸47-187、74-187、1-73等。
根據(jù)本發(fā)明，可以在表達(dá)系統(tǒng)，如體內(nèi)、體外、無細(xì)胞、重組、細(xì)胞融合的表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。由這些系統(tǒng)賦予的多肽修飾包括糖基化、氨基酸置換(如通過使用不同的密碼子)、多肽加工如消化、切割、內(nèi)肽酶或外肽酶活性、化學(xué)部分包括脂質(zhì)或磷酸酯的連接等。
可以根據(jù)常規(guī)方法，如應(yīng)用于其它干擾素和其它重組蛋白的方法，從天然來源、轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(培養(yǎng)基或細(xì)胞)中回收本發(fā)明的多肽，這些方法包括去污劑萃取(如非離子去污劑、Triton X-100、CHAPS、辛基葡糖苷、Igepal CA-630)、相萃取、正丁醇萃取、硫酸銨或乙醇沉淀、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)、疏水相互作用層析、羥磷灰石層析、凝集素層析、凝膠電泳、親合層析、SDS PAGE、可控孔度玻璃層析(CPG)、抗體親合層析、凝膠過濾、藍(lán)色瓊脂糖、苯基瓊脂糖層析、CPG和鋅-螯合物層析(如Heine和Billiau，Methods in Enzymology(酶學(xué)方法)，78(A部分)448-456，1981)，Cibacron Blue F3GA-Agarose andHPLC(汽巴弄藍(lán)F3GA-瓊脂糖和HPLC)(Kenny等人，Methods inEnzymology(酶學(xué)方法)，78(A部分)435-447，1981)。還參見Innis和McCormick，Methods in Enzymology(酶學(xué)方法)，119397-403，1986；Dembinski和Sulkowski，Preparative Biochemistry(制備生物化學(xué))，16175-186，1986；Friesen等人，Methods in Enzymology(酶學(xué)方法)，78(A部分)4330-435，1981)；Pestka等人，Annu.Rev.Biochem.，56727-77，1987。如果需要，可以使用蛋白質(zhì)再折疊步驟完成成熟蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還涉及核酸，如編碼本發(fā)明的IFN-β2多肽及其片段的DNA和RNA。IFN-β2核酸或及片段是具有可從天然來源獲得的核苷酸序列的核酸。因此，它包括天然存在的核酸、正常的核酸、天然存在的突變型和天然存在的多形等位基因(如SNP)等。例如，天然來源包括從組織或整個生物獲得的活細(xì)胞、腫瘤、培養(yǎng)的細(xì)胞系，包括原代和無限增殖化的細(xì)胞系。
本發(fā)明的核酸序列可以包含圖1所示的完全編碼序列、其簡并序列及其片段。本發(fā)明的核酸還可以包含與任何上述或下述的核苷酸序列100％互補(bǔ)如反義的核苷酸序列。
本發(fā)明的核酸，即核苷酸或多核苷酸的聚合物可以由各種不同的來源獲得。它可以得自DNA或RNA，如從組織、細(xì)胞或整個生物分離的多腺苷酸化mRNA。核酸可以直接得自DNA或RNA，或來自cDNA文庫。核酸可以得自特定發(fā)育期的細(xì)胞或組織(如來自胚胎或成體心肌細(xì)胞(cardiac cell)或組織)，具有期望的基因型、表型等。
如以上關(guān)于IFN-β2多肽所述，包含編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列的核酸可以僅包括編碼序列；可以包括編碼序列和其他編碼序列(如編碼先導(dǎo)肽、分泌肽、靶肽、酶肽、熒光肽或其它診斷肽的序列)；可以包括編碼序列和非編碼序列，如在5′或3′端或分散在編碼序列中的未翻譯的序列，如內(nèi)含子。包含不中斷地編碼多肽的核苷酸序列的核酸意指該核苷酸序列包含IFN-β2氨基酸編碼序列，不含中斷或間插在編碼序列中的非編碼序列，如不存在內(nèi)含子。這種核苷酸序列還可以描述為鄰接的。編碼人、小鼠或其它哺乳動物干擾素等的基因組DNA可以常規(guī)地獲得。
本發(fā)明的核酸還可以包含可操縱地連接到上述核酸上的表達(dá)調(diào)控序列。術(shù)語“表達(dá)調(diào)控序列”意指調(diào)節(jié)一種多肽表達(dá)的核酸序列，該多肽由與該核酸序列可操縱地連接其上的核酸編碼?？梢栽趍RNA或多肽水平調(diào)節(jié)表達(dá)。因此，表達(dá)調(diào)控序列包括mRNA相關(guān)元件和蛋白質(zhì)相關(guān)元件。這些元件包括啟動子、增強(qiáng)子(病毒的或細(xì)胞的)、核糖體結(jié)合序列、轉(zhuǎn)錄終止子等。當(dāng)表達(dá)調(diào)控序列以這種方式定位以進(jìn)行或完成編碼序列的表達(dá)時，表達(dá)調(diào)控序列可操縱地連接于核苷酸編碼序列。例如，當(dāng)啟動子可操縱地連接5′至編碼序列時，啟動子驅(qū)動編碼序列的表達(dá)。表達(dá)調(diào)控序列可以與正?；蚴钱愒吹幕騼?nèi)源的。
可以在核酸雜交的基礎(chǔ)上選擇本發(fā)明的核酸。兩種單鏈核酸制劑雜交在一起的能力衡量它們的核苷酸序列的互補(bǔ)性，例如核苷酸如A-T、G-C等之間的堿基配對。因此本發(fā)明還涉及核酸和它們的互補(bǔ)鏈，它們與包含圖1所述的核苷酸序列的核酸雜交。與后一序列雜交的核苷酸序列具有互補(bǔ)核酸鏈，或在聚合酶(即適宜的核酸合成酶)存在下用作一條鏈的模板。本發(fā)明包括核酸的兩條鏈，如有義鏈和反義鏈。
可以選擇雜交條件以選擇具有期望量的與圖1所述的核苷酸序列互補(bǔ)性的核苷酸的核酸。能夠與這種序列雜交的核酸優(yōu)選在序列之間具有大約85％，更優(yōu)選90％、92％，甚至更優(yōu)選95％、97％或100％的互補(bǔ)性。本發(fā)明特別涉及在低或高嚴(yán)格條件下與圖1所述的核苷酸序列雜交的核酸序列。
可以多種方式選擇與IFN-β2序列雜交的核酸。例如，印跡(即包含核酸的基質(zhì))、芯片陣列和其它包含有用核酸的基質(zhì)，可以在30℃下在預(yù)雜交溶液(6×SSC，0.5％SDS，100μg/ml變性的鮭精子DNA，5×Denhardt溶液和50％甲酰胺)中溫育過夜，然后根據(jù)已知的方法在42℃下在雜交溶液(如6×SSC，0.5％SDS，100μg/ml變性的鮭精子DNA和50％甲酰胺)中與可檢測的寡核苷酸探針(見下述)雜交過夜?？梢栽谠试S少于5％bp錯配的高嚴(yán)格條件下洗滌印跡(如在65℃下在0.1×SSC和0.1％SDS中洗滌兩次，持續(xù)30分鐘)，即選擇具有95％或更大序列同一性的序列。高嚴(yán)格條件的其它非限制性實例包括在65℃下在包含30mM NaCl和0.5％SDS的緩沖水溶液中的最后洗滌。高嚴(yán)格條件的另一實例是在50℃下在7％SDS、0.5M NaPO4、pH7、1mM EDTA中雜交過夜，然后在42℃下用1％SDS溶液洗滌一次或多次。
高嚴(yán)格洗滌可以允許少于5％錯配，而寬松的或低嚴(yán)格洗滌條件(如在37℃下在0.2×SSC和0.5％SDS中洗滌30分鐘)可以允許多至20％錯配。低嚴(yán)格條件的另一個非限制性實例包括在42℃下在包含30mM NaCl和0.5％SDS的緩沖液中的最后洗滌。還可以如在Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，1989，第9章中所述完成洗滌和雜交。
雜交還可以基于在探針和它的靶之間形成的雜合體的解鏈溫度(Tm)，如在Sambrook等人中所述。一般地，短寡核苷酸(包含18個核苷酸或更少)從其靶序列中解鏈的溫度Tm由以下等式得到Tm＝(A和T的數(shù)目)×2℃+(C和G的數(shù)目)×4℃。對于更長的分子，Tm＝81.5+16.6log10[Na+]+0.41(％GC)-600/N，其中[Na+]是鈉離子的摩爾濃度，％GC是探針中GC堿基對的百分比，而N是長度。雜交可以在低于此溫度幾度下進(jìn)行以確保探針和靶可以雜交。通過更進(jìn)一步降低溫度可以允許錯配。
可以選擇嚴(yán)格條件以分離序列和它們的互補(bǔ)鏈，它們在探針(如IFN-β2的寡核苷酸)和靶核酸之間具有至少大約95％、97％、98％、99％的核苷酸互補(bǔ)性。
根據(jù)本發(fā)明，核酸或多肽在圖1或2所示的核苷酸或氨基酸序列中可以包含一個或多個差別。核苷酸和/或氨基酸序列的改變或修飾可以通過任何可獲得的方法，包括定向或無規(guī)誘變而完成。
編碼本發(fā)明的哺乳動物IFN-β2，如人IFN-β2的核酸可以包含在天然存在的基因如天然存在的多形、正常或突變型等位基因(核苷酸或氨基酸)中存在的核苷酸，在天然哺乳動物如人、猴、豬、小鼠、大鼠或兔的種群中發(fā)現(xiàn)的突變。術(shù)語“天然存在的”意指該核酸可從天然來源如動物組織和細(xì)胞、體液、組織培養(yǎng)細(xì)胞、法醫(yī)樣品中獲得。天然存在的突變可以包括核苷酸序列的缺失(如截短的氨基或羧基末端)、置換、倒位或添加。這些基因可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過核酸雜交而被檢測和分離。編碼本發(fā)明的哺乳動物IFN-β2的核苷酸序列可以包含在天然存在的基因中發(fā)現(xiàn)的密碼子、轉(zhuǎn)錄物或cDNA，例如圖1所示，或者它可以包含編碼相同氨基酸序列的簡并密碼子。例如，可以期望改變序列中的密碼子以使序列在期望的宿主內(nèi)的表達(dá)最優(yōu)化。
本發(fā)明的核酸可以包含例如DNA、RNA、合成核酸、肽核酸、修飾的核苷酸或混合物。DNA可以是雙鏈或單鏈。包含核苷酸的核酸可以通過多種已知的連接，如酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等連接，這取決于期望的目的，如耐核酸酶，例如耐RNA酶H，改善體內(nèi)穩(wěn)定性等。例如參見美國專利5,378,825。
可以對核酸進(jìn)行多種修飾，如連接可檢測的標(biāo)記(抗生物素蛋白、生物素、放射性元素)、連接改善雜交、檢測或穩(wěn)定性的部分。根據(jù)期望的方法，核酸還可以連接到固體載體上，如硝酸纖維素、磁性或順磁性微球體(如在美國專利5,411,863、美國專利5,543,289中所述；例如包含鐵磁體、超磁體、順磁體、超順磁體、氧化鐵和多糖)、尼龍、瓊脂糖、重氮化纖維素、膠乳固體微球體、聚丙烯酰胺等。例如，參見美國專利5,470,967、5,476,925、5,478,893。
本發(fā)明的另一方面涉及寡核苷酸或核酸探針。這些寡核苷酸或核酸探針可以用于例如檢測、定量或分離試驗樣品中哺乳動物IFN-β2核酸，或者用于鑒定IFN-β2同系物。在一個優(yōu)選的實施方案中，核酸可以用作寡核苷酸探針，如用于PCR、示差顯示、基因芯片(如Affymetrix GeneChips(Affymetrix基因芯片)；美國專利5,143,854、美國專利5,424,186、美國專利5,874,219、PCT WO 92/10092、PCT WO90/15070)，和其它可用的方法。檢測可以預(yù)期用于多種不同的目的，包括研究、診斷和法醫(yī)學(xué)。對于診斷目的，可能期望鑒定樣品中核酸序列的存在或量，其中樣品從組織、細(xì)胞、體液等中獲得。在一個優(yōu)選的方法中，本發(fā)明涉及一種檢測核酸的方法，所述方法在有效地實現(xiàn)靶和寡核苷酸之間的雜交的條件下使試驗樣品中的靶核酸與寡核苷酸接觸，和檢測雜交。本發(fā)明的寡核苷酸還可以用于合成核酸擴(kuò)增如PCR(如Saiki等人，Science(科學(xué))，24153，1988；美國專利4,683,202；PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(PCR方案方法和應(yīng)用指南)，Innis等人，eds.，Academic Press(學(xué)院出版社)，New York，1990)；示差顯示(例如參見Liang等人，Nucl.AcidsRes.(核酸研究)，213269-3275，1993；美國專利5,599,672；WO97/18454)；線性PCR；或其它擴(kuò)增方法。
可以結(jié)合其它基因，如在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長、癌、細(xì)胞凋亡或任何上述或下述基因的寡核苷酸等進(jìn)行檢測。寡核苷酸還可以用于測試突變，如使用在美國專利5,683,877；美國專利5,656,430；Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，898779-8783，1992中所述的錯配DNA修復(fù)技術(shù)。
本發(fā)明的寡核苷酸可以包含任何圖1的連續(xù)的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈，或任意的這些序列或上述的其互補(bǔ)鏈。本發(fā)明的這些寡核苷酸(核酸)可以是任何期望的大小，如大約10-200個核苷酸、12-100、12-50、12-25、14-16，至少大約15，至少大約20，至少大約25，至少大約30個核苷酸等。寡核苷酸可以具有非天然存在的核苷酸，如肌苷、AZT、3TC等。寡核苷酸可以與圖1的序列具有100％同一性或互補(bǔ)性，或者它可以具有錯配或核苷酸置換，如1、2、3、4或5個置換。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸可以包含試劑盒，其中該試劑盒包括期望的緩沖液(如磷酸鹽、Tris等)、檢測組合物等等。寡核苷酸可以被本領(lǐng)域中已知的放射性或非放射性標(biāo)記標(biāo)記或未被標(biāo)記。
本發(fā)明的另一方面是哺乳動物IFN-β2的獨(dú)特核苷酸序列。IFN-β2的獨(dú)特序列意指在IFN-β2中存在的確定的核苷酸順序，例如它在圖1的核苷酸序列中存在，但在其它核酸中很少或不常存在，尤其是不存在于動物核酸，優(yōu)選哺乳動物，如人、大鼠、小鼠等。獨(dú)特核苷酸序列包括編碼圖1所示的氨基酸KHFFGTV、IIFQQRQV、KSLSP、FRANI、AEKLSGT、CLFFVFS和QGRPLNDMKQELTTEFRSPR及其片段的序列或者它們的互補(bǔ)鏈。這些序列可以在本文所述的或引用作為參考的任何方法中用作探針。包括有義和反義核苷酸序列。本發(fā)明的獨(dú)特核酸可以常規(guī)地檢測。包含這些獨(dú)特序列的核酸可以用作雜交探針，用于在包含核酸混合物的樣品中，如在RNA印跡上鑒定人或小鼠IFN-β2的存在。雜交可以在高嚴(yán)格條件(參見上述)下進(jìn)行以選擇與探針具有至少95％同一性(即互補(bǔ)性)的核酸(和它們的可以包含編碼序列的互補(bǔ)鏈)，但也可以使用較低的嚴(yán)格條件。獨(dú)特的IFN-β2核苷酸序列還可以在其5′或3′端符合讀框融合成本專利通篇所述的多種核苷酸序列，包括用于IFN-β2其它部分、酶、GFP等的編碼序列、表達(dá)調(diào)控序列等。
如已討論的，可以在不同條件下，根據(jù)期望的選擇性完成雜交，例如Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，1989中所述。例如，為了特異性地檢測本發(fā)明的IFN-β2，可以在以下條件下將寡核苷酸與靶核酸雜交其中，僅寡核苷酸與它雜交，例如其中寡核苷酸與靶100％互補(bǔ)。如果期望選擇具有小于100％的核苷酸互補(bǔ)性，例如至少大約為99％、97％、95％、90％、86.4％、85％、70％、67％的核苷酸互補(bǔ)性的靶核酸，則可以使用不同的條件。
還可以由本發(fā)明的核酸制備反義核酸，優(yōu)選圖1的序列的反義核酸。反義核酸可以多種方式使用，如用于調(diào)控或調(diào)節(jié)(regulate或modulate)IFN-β2的表達(dá)，如抑制它，用于檢測它的表達(dá)，或者用于原位雜交。這些寡核苷酸可以與美國專利5,576,208類似地使用。為了調(diào)控或調(diào)節(jié)IFN-β2的表達(dá)，反義寡核苷酸可以可操縱地連接到表達(dá)調(diào)控序列。
為了抑制IFN-β2，可以將寡核苷酸設(shè)計成沿cDNA的對應(yīng)的有義位置。例如參見J.Milligan等人，Current Concepts in Antisense DrugDesign(目前反義藥物設(shè)計的概念)，J.Med.Chem.(藥物化學(xué)雜志)，36(14)1923-1937，1993；Helene和Toulme，Biochim.Biophys.Acta，104999-125，1990；Cohen，J.S.，Ed.，Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression(寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑)，CRC PressBoca Raton，F(xiàn)la.，1987；Crooke，S.，Basic Principles of Antisense Therapeutics(反義治療的基本原理)，Springer-Verlag Berlin，Heidelberg，New York，Jul.1998。這些寡核苷酸可以是耐核酸酶的，例如使用在美國專利6,040,296或上述參考資料中所公開的多種化學(xué)連接。可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中使用大約35bp的總長度和陽離子脂質(zhì)體以促進(jìn)細(xì)胞攝入，但對于體內(nèi)使用，優(yōu)選給予較短的寡核苷酸，如25個核苷酸。
可以根據(jù)任何期望的方法將本發(fā)明的核酸標(biāo)記。就某些常用的示蹤劑而言，可以使用放射性示蹤劑如32P、35S、125I、3H或14C標(biāo)記核酸。放射性標(biāo)記的進(jìn)行可以根據(jù)任何方法，如使用放射標(biāo)記的核苷酸、多核苷酸激酶(進(jìn)行或不進(jìn)行磷酸酶脫磷酸)或連接酶(取決于欲標(biāo)記的末端)在3′或5′端進(jìn)行末端標(biāo)記。還可以使用非放射性標(biāo)記，組合本發(fā)明的核酸和具有免疫性質(zhì)(抗原、半抗原)、對某些反應(yīng)物(配體)的特殊親合力、使可檢測的酶反應(yīng)能夠完成的性質(zhì)(酶或輔酶、酶底物或其它在酶反應(yīng)中涉及的物質(zhì))或特征性物理性質(zhì)如熒光或者發(fā)射或吸收期望波長的光等的殘基。
可以采用多種技術(shù)，包括RNA印跡、PCR、原位雜交、示差顯示、核酸陣列(如“基因芯片”)、斑點印跡等，使用本發(fā)明的核酸，包括寡核苷酸、反義核酸等，檢測整個器官、組織、細(xì)胞等中IFN-β2的表達(dá)。這些核酸可以特別地用于檢測擾亂的表達(dá)，如IFN-β2的細(xì)胞特異性和/或亞細(xì)胞改變?？梢詥为?dú)或結(jié)合其它基因產(chǎn)物，特別是在細(xì)胞因子生產(chǎn)中涉及的其它基因產(chǎn)物來測定IFN-β2的水平。
可以根據(jù)期望的目的，在多種不同的系統(tǒng)中體外和體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的核酸。例如，可以將核酸插入表達(dá)載體、導(dǎo)入期望的宿主，并在有效地實現(xiàn)該核酸編碼的多肽表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。有效條件包括任何適于實現(xiàn)由宿主細(xì)胞生產(chǎn)多肽的培養(yǎng)條件，包括有效的溫度、pH、培養(yǎng)基、培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基添加劑(如擴(kuò)增或誘導(dǎo)表達(dá)的添加劑如丁酸鹽，或者如果該編碼核酸與dhff基因相鄰則為甲氨蝶呤)、放線菌酮、細(xì)胞密度、培養(yǎng)皿等?？梢酝ㄟ^任何有效的方法將核酸導(dǎo)入細(xì)胞，這些方法包括例如裸DNA、磷酸鈣沉淀、電穿孔、注射、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體融合、與增強(qiáng)其細(xì)胞攝入的試劑締合、病毒轉(zhuǎn)染。已導(dǎo)入本發(fā)明的核酸的細(xì)胞是轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。核酸可以是染色體外的或整合到宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)。它可以是穩(wěn)定或瞬時的。選擇與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)載體。宿主細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞，如COS、CV1、BHK、CHO、HeLa、LTK、NIH 3T3、293、PAE、人、人成纖維細(xì)胞、人原發(fā)腫瘤細(xì)胞、睪丸、神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)元、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等；昆蟲細(xì)胞，如Sf9(S.frugipeda)和果蠅、細(xì)菌如大腸桿菌、鏈球菌、桿菌、酵母如酵母屬(Sacharomyces)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(例如哺乳動物，如小鼠或人)、神經(jīng)元干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和T細(xì)胞。
類似地選擇和宿主相容的表達(dá)調(diào)控序列用于期望目的，如高拷貝數(shù)、高量、誘導(dǎo)、擴(kuò)增、受控的表達(dá)。其它可以使用的序列包括諸如來自SV40、CMV、RSV的增強(qiáng)子、可誘導(dǎo)的啟動子、細(xì)胞類型特異性元件或允許選擇性或特異性細(xì)胞表達(dá)的序列?？梢杂糜隍?qū)動其表達(dá)的啟動子包括例如細(xì)菌宿主的內(nèi)源性啟動子、其它細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因的啟動子、MMTV、SV40、trp、lac、tac或T7啟動子；或者酵母的α-因子、醇氧化酶或PGH啟動子。RNA啟動子可以用于產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物，如T7或SP6。例如參見Melton等人，Nucleic AcidsRes.(核酸研究)，12(18)7035-7056，1984；Dunn和Studier，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)，166477-435，1984；美國專利5,891,636；Studier等人，Gene Expression Technology(基因表達(dá)技術(shù))，Methods inEnzymology(酶學(xué)方法)，8560-89，1987。
本發(fā)明的核酸或多肽可以用作核酸或蛋白質(zhì)電泳、層析等中的大小標(biāo)記?？梢酝ㄟ^掃描序列的限制位點、計算其大小和進(jìn)行相應(yīng)的限制酶切消化而測定確定的限制片段。
本發(fā)明的IFN-B2多肽和核酸可以是“分離的”。術(shù)語“分離的”意指它處于在其原始環(huán)境中或自然界未發(fā)現(xiàn)的形式，如更為濃縮、更為純化、從組分中分離、在其中表達(dá)異源IFN-β2基因的細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物中存在。當(dāng)IFN-β2作為異源核酸在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中表達(dá)時，在核酸表達(dá)的條件下將本發(fā)明的核酸導(dǎo)入上述的細(xì)胞中。術(shù)語“異源的”意指已“手工”將核酸導(dǎo)入細(xì)胞系。以上討論了細(xì)胞系內(nèi)核酸的導(dǎo)入。表達(dá)IFN-β2核酸的轉(zhuǎn)染的(或轉(zhuǎn)化的)細(xì)胞可以如實施例所述溶解，并在所述方法中用作溶胞產(chǎn)物(即“分離的”)或者可以使用完整的細(xì)胞系。
一般地，術(shù)語“有效條件”意指諸如實現(xiàn)期望效果的環(huán)境。這種環(huán)境包括例如緩沖劑、氧化劑、還原劑、pH、輔因子、溫度、離子濃度、細(xì)胞正被使用時的適宜年齡和/或儲藏的細(xì)胞(例如在細(xì)胞周期的特定部分或在特定基因正在表達(dá)的特定時期)、培養(yǎng)條件(包括底物、氧、二氧化碳等)。
本發(fā)明還涉及一種調(diào)節(jié)、優(yōu)選抑制編碼本發(fā)明的IFN-β2的核酸的表達(dá)的方法，所述方法包括使表達(dá)本發(fā)明的IFN-β2的細(xì)胞與一定量的試劑，如IFN-β2的反義寡核苷酸或反義RNA接觸，這些試劑有效的序列特異性地抑制所述核酸的表達(dá)。
可以使用反義核酸如反義寡核苷酸或RNA常規(guī)地實現(xiàn)核酸的序列特異性抑制作用。例如，反義寡核苷酸，如磷酸二酯或硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸可以設(shè)計于IFN-β2 RNA的特定區(qū)域，如翻譯起始位點，然后可以抑制它們表達(dá)的量給予表達(dá)這些基因的細(xì)胞。一般地，反義核酸是與給定核酸的有義或編碼鏈互補(bǔ)的核酸，因此它們也與所述核酸的mRNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)丙因此能與其特異性雜交。優(yōu)選的反義寡核苷酸包含靶基因的5′區(qū)，特別是包含起始密碼子的區(qū)域。
為了增強(qiáng)穩(wěn)定性，可以將給予的核酸修飾，如使其耐細(xì)胞酶、氧化、還原、核酸酶等，或增強(qiáng)它的細(xì)胞攝入。可以使用任何適宜的修飾，包括例如硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、與吖啶嵌入試劑和/或疏水尾連接的磷酸二酯寡核苷酸、補(bǔ)骨脂素衍生物、2′-核糖修飾、戊糖衍生物、氮堿衍生物等等。例如參見用于反義寡核苷酸修飾的美國專利5,576,208、5,744,362、6,040,296和6,046,319等，這些修飾可以用于本發(fā)明。一般地，本發(fā)明的反義核酸可以包含天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸的單體和它們的組合，以增強(qiáng)細(xì)胞攝入和/或穩(wěn)定性。
給予的反義可以是裸核酸、和其它試劑或任何適宜的給藥工具，或被所述試劑或給藥工具復(fù)合或包封，所述試劑促進(jìn)其攝入細(xì)胞、注入細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的IFN-β2，如人IFN-β2的方法，用于治療任何期望IFN-β2生物活性的病癥、障礙、疾病等。這些方法包括給予需要治療的宿主有效量的本發(fā)明的IFN-β2，用于一種或多種以下目的抗癌基因調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性、抗病毒活性、細(xì)胞生長抑制或抗生長活性、抗增殖(如有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的IFN-β2的量)、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性、免疫調(diào)節(jié)活性、誘導(dǎo)或抑制靶細(xì)胞分化、巨噬細(xì)胞激活、減量調(diào)節(jié)癌基因等；免疫作用，如減少抗體形成、增加細(xì)胞膜組分(主要組織相容性復(fù)合物、Fc受體、β2-微球蛋白)、調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、增加細(xì)胞因子(如細(xì)胞間介素)產(chǎn)生、增加細(xì)胞毒性T細(xì)胞作用、增加巨噬細(xì)胞作用和增加天然殺傷。IFN-β2可以給藥用于治療癌、自體免疫疾病和病毒感染。例如，參見Cirelli和Tyring，Clin Immunbother.(臨床免疫干擾).327-87，1995，關(guān)于可用本發(fā)明的IFN-β2治療的各種疾?。痪唧w參見α-和β-干擾素的用途。
IFN-β2可以作為多肽給藥，或者它可以作為核酸給藥，如在基因治療中給藥。當(dāng)作為核酸給藥時，它可以任何有效實現(xiàn)表達(dá)的形式提供，如作為裸DNA、作為載體(如病毒載體，如腺病毒)、與脂質(zhì)體或其它載體試劑復(fù)合、微泡等。參見以上關(guān)于核酸給藥，它們在宿主中的表達(dá)等等的更多信息。
可以根據(jù)本發(fā)明治療任何癌，如宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變和宮頸癌(例如參見DePalo等人，Int.J.Tissue React.，6523-527，1984，關(guān)于劑量、給藥途徑、方案等)、黑素瘤和轉(zhuǎn)移性黑素瘤(例如參見Beiteke等人，Hautarzt，44365-371，1994，關(guān)于劑量、給藥途徑、方案等)、毛細(xì)胞白血病、卡波西肉瘤、基細(xì)胞癌、扁平細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、良性腫瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(關(guān)于其它癌，還參見Dorr，Drugs，45(2)177-211，1993)。
還可以根據(jù)本發(fā)明治療自體免疫疾病，如多發(fā)性硬化(例如參見Yong等人，Neurology(神經(jīng)學(xué))，51682-689，1998，關(guān)于劑量、給藥途徑、方案等)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。多發(fā)性硬化(“MS”)是一種自體免疫疾病，其病理學(xué)特征在于導(dǎo)致脫髓鞘、軸突破壞和隨后的神經(jīng)膠質(zhì)增生的血管周和室周炎癥。慢性MS損傷的特點是由局部星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大和增生導(dǎo)致形成的脫髓鞘神經(jīng)膠質(zhì)增生斑。這些星形膠質(zhì)細(xì)胞斑干擾正常軸突傳導(dǎo)并產(chǎn)生再髓鞘化的物理屏障。因此，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的因子具有有益的治療意義，特別是在疾病的后期。因此，IFN-β2抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力對于治療MS特別有用。
還可以根據(jù)本發(fā)明治療病毒性疾病和感染，如人乳頭狀瘤病毒(如Puligheddu等人，Eur.J.Gynaecol.Oncol.(歐洲婦科腫瘤學(xué)雜志)，9161-162，1988；Costa等人，Cervix(子宮頸)，6203-212，1988，關(guān)于劑量、給藥途徑、方案等)、尖銳濕疣(Schonfeld等人，Lancet，11038-1042，1984，關(guān)于劑量、給藥途徑、方案等)、乙、丙、丁型肝炎、HIV等。
術(shù)語“給藥”意指將IFN-β2或其它活性試劑轉(zhuǎn)運(yùn)到靶，如腫瘤、免疫系統(tǒng)、腦損傷(如腦炎癥部位，如在多發(fā)性硬化或其它腦炎癥中觀察到的部位)等?？梢圆捎脤崿F(xiàn)上述效果的有效途徑對任何靶進(jìn)行IFN-β2給藥(如體內(nèi)、體外或原位)，包括培養(yǎng)物中的細(xì)胞和具有欲治療的損傷、病癥或疾病的宿主，例如可以通過直接注射到靶部位或接近靶部位而將IFN-β2配方給藥。還可以進(jìn)行局部、腸、腸胃外、靜脈內(nèi)、肌肉、皮下、口、鼻、大腦內(nèi)、心室內(nèi)給藥等，這取決于欲治療的靶部位的位置。IFN-β2還可以作為被細(xì)胞攝入的核酸給藥。核酸給藥的方法包括上述的給藥和其它常規(guī)給藥技術(shù)。
將有效量的IFN-β2給予靶。有效量是用于實現(xiàn)期望效果，優(yōu)選是有益或治療效果的量，如有效抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的量。這種量可以常規(guī)確定，如通過進(jìn)行劑量反應(yīng)試驗，其中將不同的劑量給予靶細(xì)胞以確定實現(xiàn)期望目的，如產(chǎn)生抗病毒效果、產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)效果的有效量?？梢愿鶕?jù)多種因素選擇用量，包括IFN-β2給藥的環(huán)境(如患有多發(fā)生性硬化的患者、動物模型、組織培養(yǎng)細(xì)胞等)、欲治療的細(xì)胞的部位、欲治療的患者或動物的年齡、健康、性別和體重等。有用的量包括，例如1.6MIU(根據(jù)國際參考標(biāo)準(zhǔn)的百萬國際單位)和8MIU交替日皮下給藥。術(shù)語“治療”意指任何導(dǎo)致癥狀、疾病、障礙等改善的效果。
有效量的IFN-β2可以與其它有效的試劑，如用于治療癌、病毒、MS、肝炎和任何可以用IFN-β2治療的病癥的試劑一起給藥。這些試劑可以是細(xì)胞毒性試劑、抗病毒劑、化學(xué)治療試劑等。
本發(fā)明還涉及特異性識別本發(fā)明的IFN-β2的抗體。對IFN-β2具有特異性的抗體意指該抗體識別IFN-β2內(nèi)或包括IFN-β2的確定的氨基酸序列，如圖2的序列。因此，一般而言，特異性抗體與圖2中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列，即表位的結(jié)合比其與其他表位結(jié)合的親合力更大，例如所述親和力通過免疫印跡測定或其它常規(guī)免疫測定來檢測和/或測定。因此，對人IFN-β2的表位具有特異性的抗體用于檢測樣品中該表位的存在，這些樣品如包含人IFN-β2基因產(chǎn)物的組織樣品，從而將其與其中不存在該表位的樣品區(qū)分開。有用的抗體是對獨(dú)特的IFN-β2的C-末端而言的，如QGRPLNDMKQELTTEFRSPR或其片段。這些抗體的有用性如在Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz生物技術(shù)公司)，Research Product Catalog中所述，可以根據(jù)其進(jìn)行配方。
抗體，如多克隆、單克隆、重組、嵌合、人源化抗體可以根據(jù)任何期望的方法制備。還參見篩選重組免疫球蛋白文庫(如Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，863833-3837，1989；Huse等人，Science(科學(xué))，2561275-1281，1989)；體外刺激淋巴細(xì)胞群；Winter和Milstein，Nature(自然)，349293-299，1991。例如，為了生產(chǎn)單克隆抗體，可以將圖2的多肽，皮下和/或腹膜內(nèi)，與佐劑一起或不與佐劑一起，以足以引起免疫應(yīng)答的量給予小鼠、山羊或兔?？贵w還可以是單鏈或Fab片段。這些抗體可以是IgM、IgG、亞型、IgG2a、IgG1等。還可以通過裸DNA給藥產(chǎn)生抗體和免疫應(yīng)答。例如，參見美國專利5,703,055、5,589,466、5,580,859。
用于誘導(dǎo)抗體的干擾素或其片段不需要具有生物活性；但是它們必須單獨(dú)或與載體組合而具有免疫原活性。用于誘導(dǎo)IFN-β2-特異性抗體的肽可以具有由至少5個氨基酸，優(yōu)選至少10個氨基酸組成的氨基酸序列。短的一段氨基酸序列，如5個氨基酸可以與其它蛋白質(zhì)如鑰孔血藍(lán)蛋白的氨基酸或其它有用的載體和用于抗體生產(chǎn)的嵌合分子融合。用于制備抗體的IFN-β2的區(qū)域可以憑經(jīng)驗選擇，或者可以分析由cDNA推導(dǎo)的IFN-β2的氨基酸序列以確定高免疫原性區(qū)域。Ausubel，F(xiàn).M.等人(1989，Current Protocols in Molecular Biology(目前分子生物學(xué)的方案)，第2卷，John Wiley & Sons)描述了選擇適宜表位的分析。
特定的IFN-β2抗體用于診斷前病理學(xué)癥狀和以IFN-β2的量或分布的差別為特征的慢性或急性疾病。IFN-β2的診斷試驗包括使用抗體和標(biāo)記檢測人(或小鼠等，如果使用小鼠等的話)的體液、組織或這種組織的提取物中的IFN-β2的方法?？贵w可以被中和或用于測定IFN-β2活性，如作為中和干擾素活性的對照。
本發(fā)明的多肽和抗體可以在修飾和不修飾的情況下使用。通常，通過將多肽和抗體與提供可檢測信號的物質(zhì)共價或非共價連接在一起而將它們標(biāo)記。大量的標(biāo)記和綴合技術(shù)是已知的，并廣泛報道在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中。適宜的標(biāo)記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光劑、化學(xué)發(fā)光試劑、磁性顆粒等等。教導(dǎo)這些標(biāo)記的專利包括美國專利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。
結(jié)合IFN-β2的抗體和其它配體可以多種方式使用，包括作為治療、診斷和商業(yè)研究工具，如在蛋白質(zhì)印跡、ELISA、免疫沉淀、RIA等中，用于定量測定動物、組織、細(xì)胞等中的干擾素多肽水平，用于鑒定細(xì)胞位置和/或其分布，用于純化其或包含其部分的多肽，用于調(diào)節(jié)其功能。本發(fā)明涉及這些分析、和進(jìn)行分析的組合物試劑盒等。使用這些和其它方法，可以將本發(fā)明的抗體用于檢測多種樣品包括組織、細(xì)胞、體液、血、尿、腦脊液中的IFN-β2多肽或其片段。
此外，與本發(fā)明的IFN-β2多肽結(jié)合的配體或其衍生物也可以使用例如合成肽文庫或類似方法制備(如Pitrung等人，美國專利5,143,854；Geysen等人，J.Immunol.Methods(免疫方法雜志)，102259-274，1987；Scott等人，Science(科學(xué))，249386，1990；Blackwell等人，Science(科學(xué))，2501104，1990；Tuerk等人，1990，Science(科學(xué))，249505)。
本發(fā)明還涉及根據(jù)期望的方法制備的IFN-β2多肽，例如在美國專利5,434,050中公開的。標(biāo)記的多肽可以用于例如結(jié)合分析，如鑒定結(jié)合或連接到IFN-β2上的物質(zhì)，從而在體外、體內(nèi)或在原位系統(tǒng)中示蹤IFN-β2在細(xì)胞中的運(yùn)動等。
核酸、多肽、抗體、IFN-β2等可以是分離的?！胺蛛x的”意指物質(zhì)處于在其原始環(huán)境中或自然界未發(fā)現(xiàn)的形式，如更為濃縮、更為純化、從組分中分離等。例如，分離的核酸包括具有從活動物中發(fā)現(xiàn)的染色體DNA分離的IFN-β2序列的核酸，例如作為完全基因、轉(zhuǎn)錄物或cDNA。此核酸可以是載體的部分或插入到染色體(通過特異性基因靶向或在除了其正常位置之外的位置進(jìn)行無規(guī)整合)，且其仍是分離的原因在于它不處于在其天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的形式。本發(fā)明的核酸或多肽還可以是基本上純化的?；旧霞兓囊庵负怂峄蚨嚯氖欠蛛x的，且基本上不含其它核酸或多肽，即核酸或多肽是主要和活性組分。
本發(fā)明還涉及一種轉(zhuǎn)基因動物，例如非人哺乳動物，如小鼠，所述動物包含IFN-β2。轉(zhuǎn)基因動物可以根據(jù)已知方法制造，例如這些方法包括將重組基因前核注射到1-細(xì)胞胚胎的前核中、將人工酵母染色體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞中、基因靶向法、胚胎干細(xì)胞方法。例如，參見美國專利4,736,866、4,873,191、4,873,316、5,082,779、5,304,489、5,174,986、5,175,384、5,175,385、5,221,778；Gordon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，777380-7384，1980；Palmiter等人，Cell(細(xì)胞)，41343-345，1985；Palmiter等人，Annu.Rev.Genet.，20465-499，1986；Askew等人，Mol.Cell.Biol.(分子細(xì)胞生物學(xué))，134115-4124，1993；Games等人，Nature(自然)，373523-527，1995；Valancius和Smithies，Mol.Cell.Biol.(分子細(xì)胞生物學(xué))，111402-1408，1991；Stacey等人，Mol.Cell.Biol.(分子細(xì)胞生物學(xué))，141009-1016，1994；Hasty等人，Nature(自然)，350243-246，1995；Rubinstein等人，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，212613-2617，1993?？梢詫⒈景l(fā)明的核酸引入任何非人哺乳動物，包括小鼠(Hogan等人，Manipulating theMouse Embryo(操控小鼠胚胎)A Laboratory Manual(實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港實驗室)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，紐約，1986)、豬(Hammer等人，Nature(自然)，315343-345，1985)、羊(Hammer等人，Nature(自然)，315343-345，1985)、牛、大鼠或靈長類。還參見例如Church，Trends in Biotech.(生物技術(shù)趨勢)，513-19，1987；Clark等人，Trends in Biotech.(生物技術(shù)趨勢)，520-24，1987)；和DePamphilis等人，BioTechniques(生物技術(shù))，6662-680，1988)。此外，定制的轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠生產(chǎn)是可商購的。這些轉(zhuǎn)基因動物是有用的動物模型，用于測試IFN-β2功能，作為蛇的食物，作為檢測菌株來源的基因標(biāo)記(即其中已插入IFN-β2或其片段)等。這些轉(zhuǎn)基因動物還可以包含其它轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因動物可以根據(jù)任何適宜的方法制備和使用。
本發(fā)明還涉及一種哺乳動物細(xì)胞，其中編碼IFN-β2的基因的表達(dá)已被剔除(knock out)或破壞。這種基因破壞可以通過一種有效的方法實現(xiàn)，如包括反義，或通過向其中插入有效抑制基因表達(dá)的核苷酸序列而實現(xiàn)。在此意義上術(shù)語“基因”意指IFN-β2編碼序列，它存在于染色體上，且包括它的啟動子序列和其它調(diào)節(jié)區(qū)。
本發(fā)明特別涉及包含一種或多種細(xì)胞的哺乳動物，其中基因的表達(dá)被功能性失活或破壞。功能性失活或破壞指部分或完全降低至少一部分由哺乳動物的單細(xì)胞、選擇的細(xì)胞或所有細(xì)胞的內(nèi)源IFN-β2基因編碼的多肽的表達(dá)。術(shù)語“剔除”是基因功能性失活的同義語。
在一個實施方案中，使用基因靶向策略促進(jìn)將期望的核苷酸序列導(dǎo)入IFN-β2基因?；虬邢虿呗詢?yōu)選使用雙交互重組和正選擇標(biāo)記以幫助將核苷酸序列插入靶核酸內(nèi)。靶核酸優(yōu)選是基因，更優(yōu)選在其特定染色體基因座上的基因。以如下方式將期望的核苷酸序列插入基因基因被功能性破壞，即它的表達(dá)被部分或完全降低。
在本發(fā)明的一方面，使用靶向載體以將選擇性標(biāo)記插入IFN-β2基因的預(yù)定位置。選擇此位置以在插入選擇性標(biāo)記后立即實現(xiàn)基因的功能性破壞。為此目的，一個優(yōu)選的實施方案是包含以下的重組核酸分子(1)在哺乳動物IFN-β2基因的第一預(yù)定位置有效地實現(xiàn)同源性重組的5′核苷酸序列，該序列可操縱地連接到(2)賦予其存在的細(xì)胞第一選擇特征的第一選擇性核苷酸序列的5′端，和(3)在哺乳動物IFN-β2基因的第二預(yù)定位置，如IFN-β2基因有效地實現(xiàn)同源性重組的3′核苷酸序列，其可操縱地連接到第一選擇性核苷酸序列的3′端。重組核酸分子有效地實現(xiàn)在哺乳動物染色體的預(yù)定位置的同源性重組。靶向載體的片段也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如包含元件(1)和(2)，或包含元件(2)和(3)的重組核酸分子等。
術(shù)語重組指已被手工修飾的核酸分子，如包含來自不同來源的核酸片段或來自己改造的一種來源的核酸分子。因此，核酸分子是重組的，因為它包含來自哺乳動物IFN-β2基因的核苷酸序列和選擇性標(biāo)記基因。當(dāng)分子包含來自相同基因的序列，但以自然界不存在的方式排列，即非天然存在的排列時，其也是重組的。
同源性重組指這樣的方法，其中具有類似基因信息的核酸分子并排地排列并交換核苷酸鏈。因此有效地在靶核酸的預(yù)定位置實現(xiàn)同源性重組的重組核酸的核苷酸序列指促進(jìn)重組核酸分子之間在靶基因，如小鼠IFN-β2基因的預(yù)定位置的核苷酸鏈交換的核苷酸序列。有效的核苷酸序列一般包括與期望的靶核酸分子(如欲被修飾的基因座)互補(bǔ)，促進(jìn)核苷酸堿基配對的核苷酸序列?？梢允褂萌魏魏塑账嵝蛄?，只要它促進(jìn)在靶核酸分子的特定和選定位置進(jìn)行同源性重組。一般地，靶向效率指數(shù)依賴于靶向載體和靶基因座之間的同源性的范圍和長度。在諸如以下的文獻(xiàn)中描述了對同源性重組有效的序列的選擇和使用Deng和Capecchi，Mol.Cell.Biol.(分子細(xì)胞生物學(xué))，123365-3371，1992；Bollag等人，Annu.Rev.Genet.，23199-225，1989；Waldman和Liskay，Mol.Cell.Biol.(分子細(xì)胞生物學(xué))，85350-5357，1988。
本發(fā)明的一方面是抑制或功能性破壞IFN-β2基因的表達(dá)。短語“基因的破壞”、“基因破壞”、“抑制表達(dá)”、“基因抑制”、“基因的功能性失活”或“功能性基因失活”指以降低或阻止該基因的表達(dá)和/或它在細(xì)胞中的產(chǎn)生的方式進(jìn)行的基因修飾?；虍a(chǎn)物的表達(dá)可以完全或僅部分被抑制，如降低70％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。功能性破壞的基因，如功能性破壞的IFN-β2基因包括表達(dá)短于野生型基因的整個編碼序列的截短的多肽的修飾基因。這種基因如圖1所示。還可以通過影響基因的mRNA結(jié)構(gòu)以創(chuàng)造不可翻譯的信息，如移碼、降低穩(wěn)定性等，從而功能性破壞基因。
根據(jù)本發(fā)明，將IFN-β2基因修飾以使其有效地破壞相應(yīng)的基因產(chǎn)物的表達(dá)。因此，例如功能性破壞的重組IFN-β2基因不表達(dá)功能性IFN-β2多肽或以小于IFN-β2的野生型水平的水平表達(dá)功能性IFN-β2多肽，例如表達(dá)水平降低70％、80％、85％、90％、95％、99％或更多?！胺枪δ苄浴被颉肮δ苄允Щ睢盜FN-β2多肽意指例如IFN-β2缺乏一種或多種其生物活性。該基因的修飾可以在任何有效的位置，如增強(qiáng)子、啟動子、調(diào)節(jié)區(qū)、非編碼序列、編碼序列、內(nèi)含子、外顯子等，以降低或阻止該基因在細(xì)胞中的表達(dá)。插入IFN-β2基因，如鼠IFN-β2基因的某一區(qū)域可以通過同源性重組完成。將包含基因同源性區(qū)域和編碼選擇性標(biāo)記基因的核苷酸序列的重組核酸分子插入到IFN-β2的啟動子和/或編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)，從而功能性破壞基因的表達(dá)。當(dāng)然后將這種剔除的構(gòu)建物(knockout construct)插入細(xì)胞時，可以將此構(gòu)建物整合入基因組DNA。因此，該細(xì)胞的子代將只表達(dá)該基因的僅有的一個功能性拷貝；其它拷貝將不再表達(dá)基因產(chǎn)物，或?qū)⒌退奖磉_(dá)其，因為此基因的內(nèi)源性核苷酸序列被插入的核苷酸序列破壞。如果需要的話，可以在另一個類似的步驟中激活該功能基因。
對同源性重組有效的核苷酸序列可以可操縱地連接到核苷酸序列，優(yōu)選選擇性標(biāo)記核苷酸序列或基因上，所述序列將插入期望的靶核酸中。
重組核酸優(yōu)選插入含染色體DNA的細(xì)胞中，所述DNA包含欲被剔除的內(nèi)源性基因。在細(xì)胞中，重組核酸分子可以通過同源性重組和細(xì)胞的DNA整合，整合的位置為阻止或中斷欲被剔除的基因的轉(zhuǎn)錄的位置。這種插入通常通過同源性重組而發(fā)生(即與內(nèi)源性DNA序列同源或互補(bǔ)的靶向載體的區(qū)域在細(xì)胞中插入靶向載體時彼此雜交；然后這些區(qū)域重組以使部分靶向載體導(dǎo)入內(nèi)DNA的相應(yīng)位置。
如所討論的，可以將一個或多個核苷酸序列插入基因中以抑制它的表達(dá)。期望確定此基因中插入的核苷酸序列的存在。這可以多種方式實現(xiàn)，包括通過核酸雜交、抗體結(jié)合到由插入的核酸編碼的表位，或通過選擇插入序列的表型。因此，這種插入的核苷酸序列可以稱為第一選擇性核苷酸序列。第一選擇性核苷酸序列優(yōu)選賦予其存在的細(xì)胞第一選擇特征。短語“選擇特征”意指例如在細(xì)胞中表達(dá)且可以優(yōu)先于另一個或其它特征被選擇的特征。選擇性核苷酸序列，也稱為選擇性標(biāo)記基因，可以是任何在其被導(dǎo)入哺乳動物基因組DNA后可被檢測和/或分析的核酸分子。選擇特征可以是正特征，即細(xì)胞表達(dá)或獲得的，且其存在使這種細(xì)胞的選擇成為可能的特征。正選擇特征可以使細(xì)胞或生物的存活，如抗生素耐藥性、耐烏本苷(一種耐烏本苷鈉/鉀ATP酶蛋白的基因)成為可能。正選擇特征的實例和相應(yīng)的選擇試劑包括Neo和G418或卡那霉素；Hyg和潮霉素、hisD和組氨醇；Gpt和黃嘌呤；Ble和博萊霉素；Hprt和次黃嘌呤。例如參見美國專利5,464,764和Capecchi，Science(科學(xué))，2441288-1292，1989。還可以使用識別可選擇基因的產(chǎn)物的結(jié)合配體鑒定靶序列中選擇性基因的存在，例如可以使用抗體鑒定由該選擇性基因編碼的多肽產(chǎn)物，可以使用適宜的配體鑒定由該選擇性基因編碼的受體多肽，或通過分析由該選擇性基因編碼的酶的表達(dá)而鑒定靶序列中選擇性基因的存在。優(yōu)選地，該選擇性基因編碼不天然存在于哺乳動物的多肽。
該選擇性標(biāo)記基因可以可操縱地連接到它本身的啟動子或來自任何具有活性或可在其插入的細(xì)胞中被容易地激活的其它來源的另一種啟動子。但是，選擇性標(biāo)記基因不需要連接其本身的啟動子，而使用其插入的基因的啟動子可以將其轉(zhuǎn)錄。選擇性標(biāo)記基因可以包含一種或多種用于驅(qū)動和/或幫助其表達(dá)的序列，包括例如核糖體識別序列、增強(qiáng)子序列、賦予多肽或RNA穩(wěn)定性的序列和/或連接在3′端以終止基因轉(zhuǎn)錄的序列。
正選擇性標(biāo)記促進(jìn)重組體的選擇，所述重組體中正選擇性標(biāo)記已通過同源性重組整合到靶核酸中。本發(fā)明的基因靶向載體還可以進(jìn)一步包含由第二選擇性基因編碼的第二選擇特征以進(jìn)一步幫助正確選擇靶向重組體。負(fù)選擇標(biāo)記不允許選擇其中只發(fā)生非同源性重組的細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，第二選擇性標(biāo)記基因賦予其已導(dǎo)入的細(xì)胞負(fù)選擇特征。這些負(fù)選擇特征可以安排在靶向載體上以使它可被用于區(qū)分無規(guī)整合事件和同源性重組。術(shù)語負(fù)選擇意指這樣的選擇特征當(dāng)細(xì)胞獲得這種選擇特征時，導(dǎo)致細(xì)胞存活能力的喪失(即它對細(xì)胞而言是致死的)。核苷類似物，更昔洛韋(gancyclovir)，對表達(dá)HSV tk(單純皰疹病毒胸苷激酶)的細(xì)胞具有優(yōu)先毒性，它可以用作負(fù)選擇試劑，因為它選擇不具有整合的HSV tk選擇性標(biāo)記的細(xì)胞。FIAU(1，2-脫氧-2-氟-α-d-阿拉伯呋喃糖基-5-碘尿嘧啶)也可以用作選擇試劑，用以選擇缺乏HSV tk的細(xì)胞。其它負(fù)選擇性標(biāo)記可以類似地使用。負(fù)選擇特征的實例是相應(yīng)的胸苷激酶(HSV tk)和阿昔洛韋、更昔洛韋或FIAU；Hprt和6-硫鳥嘌呤或6-硫黃嘌呤；白喉毒素；蓖麻毒蛋白毒素；胞嘧啶脫氨基酶和5-氟胞嘧啶。
負(fù)選擇性標(biāo)記一般排列在基因靶向載體5′或3′至重組基因同源區(qū)，從而使同源區(qū)的雙交換置換重組將正選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)移到靶核酸的預(yù)定位置，但不轉(zhuǎn)移負(fù)選擇性標(biāo)記。例如，tk盒可以位于鼠基因的3′端，從3′終止密碼子數(shù)大約150個堿基對。還可以在靶向載體中使用多于一個負(fù)選擇性標(biāo)記。例如兩種負(fù)選擇載體在靶向載體的5′和3′端的定位進(jìn)一步增強(qiáng)不選擇具有無規(guī)整合載體的靶細(xì)胞。無規(guī)整合有時導(dǎo)致載體的重排，造成無規(guī)整合之前的全部或部分負(fù)選擇性標(biāo)記的切除。當(dāng)這種情況發(fā)生時，負(fù)選擇不能用于消除已通過無規(guī)整合而不是同源性重組導(dǎo)入靶向載體的細(xì)胞。多于一種負(fù)選擇性標(biāo)記的使用基本上增大了無規(guī)整合導(dǎo)致插入至少一種負(fù)選擇性標(biāo)記的可能性。為此目的，負(fù)選擇性標(biāo)記可以相同或不同。
正-負(fù)選擇方案的使用減少了具有不正確整合的靶向構(gòu)建物序列的細(xì)胞的背景。正-負(fù)選擇一般包括使用兩種活性選擇性標(biāo)記(1)可以在無規(guī)整合或同源靶向之后穩(wěn)定表達(dá)的正選擇性標(biāo)記(如neo)，和(2)僅可以在無規(guī)整合之后穩(wěn)定表達(dá)的負(fù)選擇性標(biāo)記(如tk)。通過組合正和負(fù)選擇，可以有效地獲得具有正確靶向同源性重組事件的宿主細(xì)胞。正-負(fù)選擇方案描述于例如美國專利5,464,764、WO 94/06908。但是應(yīng)認(rèn)識到，對于實施本發(fā)明，如生產(chǎn)其中IFN-β2基因被功能性失活或破壞的轉(zhuǎn)基因動物來說，不需要一種或多種負(fù)選擇性標(biāo)記。
本發(fā)明的重組核酸分子還可以包含整個載體或其部分。載體是，例如可以在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，如包含復(fù)制區(qū)的核酸分子。載體可以用于進(jìn)行操控，以在期望的宿主中增殖和/或獲得大量重組分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)期望的目的選擇載體，例如為了在細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞中增殖重組分子。例如以下舉例提供的載體。細(xì)菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、Phagescript、φX174、pBKPhagemid、pNH8A、pNH16a、pNH18Z、pNH46A(Stratagene)；Bluescript KS+II(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核生物的PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、PBPV、PMSG、pSVL(Pharmacia)。但是，可以使用任何其它載體，例如質(zhì)粒、病毒或它們的部分，只要它們在期望的宿主中可復(fù)制和可存活。載體還可以包含能夠在其基因組要被修飾的宿主中復(fù)制的序列。這種載體的使用可以延長重組能夠發(fā)生的相互作用時間，增大靶向效率。在Molecular Biology(分子生物學(xué))，Ausubel，F(xiàn).M.等人編，Unit9.16，圖9.16.1(pNTK)中描述了可以根據(jù)本發(fā)明使用的基因靶向載體的實例。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，可以通過在IFN-β2基因中插入外源或異源序列，中斷其功能，從而破壞或剔除IFN-β2基因的功能。例如，可以將外源或異源序列插入IFN-β2基因的第一起始密碼子之前的區(qū)域?？梢酝ㄟ^同源性重組將編碼選擇性特征的核苷酸序列插入IFN-β2基因，從而使其可操縱地連接于IFN-β2基因的內(nèi)源啟動子。在將選擇性標(biāo)記基因整合入IFN-β2基因的期望的預(yù)定位置后，立即由內(nèi)源IFN-β2基因啟動子驅(qū)動選擇性特征的表達(dá)，從而允許對其整合入的細(xì)胞進(jìn)行檢測。
還可以將選擇性標(biāo)記基因整合到IFN-β2基因的第一起始密碼子的3′下游位置?？梢允笽FN-β2基因在讀框外或讀框內(nèi)整合IFN-β2多肽以制備融合多肽，其中融合多肽的活性小于正常產(chǎn)物的活性。通過僅檢測表達(dá)這些特征的細(xì)胞便可以選擇在期望的位置含有整合的序列的細(xì)胞。進(jìn)行這種選擇的一種方便的方法是利用抗生素耐藥性。以下實施例中，利用新霉素耐藥性作為選擇性特征。通常，在毒性濃度的新霉素存在下的細(xì)胞生長將死亡。通過同源性重組而獲得新霉素耐藥性拯救細(xì)胞免受致死影響，從而促進(jìn)它們的選擇。
通過整合事件將IFN-β2基因剔除或功能性中斷。在IFN-β2編碼序列之前插入選擇性基因有效地將它與啟動子序列分離，使其不能表達(dá)。如果選擇性基因含有轉(zhuǎn)錄終止子，則使用IFN-β2啟動子的基因轉(zhuǎn)錄將在其后立即終止，且很少導(dǎo)致IFN-β2編碼序列的轉(zhuǎn)錄。還可以通過無置換的缺失，如基因的部分的定向缺失而將IFN-β2基因剔除。缺失的區(qū)域可以是該基因的調(diào)節(jié)區(qū)的編碼區(qū)。
可以在任何期望的位置修飾IFN-β2基因。可以修飾其從而產(chǎn)生具有完整IFN-β2多肽的一種或多種活性的截短的IFN-β2多肽。
如果期望，可以將插入從重組基因中除去。在實施例中，新霉素盒置換小鼠IFN-β2基因的外顯子，從而將其功能性失活。隨后可以從IFN-β2基因中除去該新霉素盒，如使用重組酶系統(tǒng)。Cre-lox位點特異性重組系統(tǒng)對于從重組基因中除去序列而言特別有用。為了使用Cre-lox系統(tǒng)，將重組酶識別位點和選擇性基因一起整合入染色體，以方便其后將其除去。關(guān)于重組酶切割系統(tǒng)的指導(dǎo)，例如參見美國專利5,626,159、5,527,695和5,434,066。還參見Orban，P.C.等人，“Tissue-and Site-Specific DNA Recombination in Transgenic Mice(轉(zhuǎn)基因動物中的組織和位點特異性DNA重組)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896861-6865，1992；O′Gorman，S.等人，“Recombinase-Mediated Gene Activation and Site-Specific Integration in MammalianCells(重組酶介導(dǎo)的哺乳動物細(xì)胞的基因激活和位點特異性整合)”，Science(科學(xué))，2511351-1355，1991；Sauer，B.等人，“Cre-stimulatedrecombination at loxP-Containing DNA Sequences placed into themammalian genome(在置于哺乳動物基因組內(nèi)的含loxP的DNA序列中進(jìn)行Cre刺激的重組)”，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，17(1)147-161，1989。
關(guān)于核酸的其它方面，參見分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教科書。例如，參見Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology(分子生物學(xué)中的基本方法)，Elsevir Sciences Publishing，Inc.，New York，1986；Hames等人，Nucleic acid Hybridization(核酸雜交)，IL Press，1985；Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，CSH Press，1989；Howe，Gene Cloning and Manipulation(基因克隆和操控)，CambridgeUniversity Press，1995。
實施例IFN-β2的表達(dá)和純化。通過SDS-PAGE比較純化的IFN-β2和IFN-β1b。IFN-β2的表觀分子量為26kDa，所述分子量由SDS-PAGE測定，而IFN-β1b的表觀分子量為大約20.5kDa。方法設(shè)計PCR引物(5′-GGA ATT CCT ACT ACC TCG GGC TTCTAA-3′和5′-GCG CGC GCA TAT GCT AGA TTT GAA ACT GATTAT-3′)以擴(kuò)增來自人基因組DNA制劑的去掉信號序列的IFN-β2的編碼區(qū)，用于隨后連接到IPTG可誘導(dǎo)的pet5a表達(dá)載體(Promega公司)。在誘導(dǎo)之后，從大腸桿菌包含體分離IFN-β2并使用Zwittergent3-14(Russell-Harde等人，J.interferon Cytokine Res.(干擾素細(xì)胞因子研究雜志)，15，31-37，1995)將其溶解。使用離子交換層析，然后使用大小排阻層析，進(jìn)行從溶解的包含體純化IFN-β2。從SDS-PAGE凝膠洗脫26kDa條帶，對應(yīng)于IFN-β2，并通過N-末端蛋白測序進(jìn)行分析。最初的10個氨基酸對應(yīng)于預(yù)期的IFN-β2的氨基酸。而且，進(jìn)行溴化氰消化，得到幾個片段，將所述片段測序，發(fā)現(xiàn)它們具有預(yù)期的蛋白質(zhì)序列，表明已成功地表達(dá)和純化完整蛋白。
IFN-β2激活干擾素依賴性ISRE-螢光素酶報道基因.用含有ISRE-螢光素酶構(gòu)建物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染T98G細(xì)胞，并分離表達(dá)該構(gòu)建物的穩(wěn)定克隆。將3×104個細(xì)胞放置過夜，并加入指定濃度的純化的IFN-β2。4小時后，如在試劑盒方案(Promega Cat.#E1501)中所述，使用螢光素酶測定試劑盒測定細(xì)胞的螢光素酶活性。IFN-β2特異性地激活干擾素依賴性ISRE報道基因。參見圖6。采用這種測定，IFN-β2表現(xiàn)出與IFN-β1b類似的性質(zhì)。
用抗IFN-β2小鼠多克隆抗體抑制IFN-β2與人I型干擾素受體結(jié)合。合成對應(yīng)于IFN-β2獨(dú)特的C末端區(qū)的肽(KLSKQGRPLNDMKQELTTEFR)，將其偶聯(lián)于KLH并用于免疫Swiss-Webster小鼠，兩個月內(nèi)總共進(jìn)行四次免疫。免疫后，收集血清，證明它含有特異性結(jié)合IFN-β2的抗體。而且，抗IFN-β2血清阻斷由IFN-β2導(dǎo)致的IFN依賴性ISRE-螢光素酶報道基因的誘導(dǎo)。采用這種測定，IFN-β2表現(xiàn)出與IFN-β1b類似的功能性質(zhì)。方法將3×104個細(xì)胞放置過夜，并在抗IFN-β2血清或正常小鼠血清的存在下，于4小時內(nèi)加入20ng IFN-β2，然后使用螢光素酶測定試劑盒和Promega公司的標(biāo)準(zhǔn)方案測定誘導(dǎo)的螢光素酶的存在。參見圖7。
IFN-β1b和IFN-β2對人HT1080細(xì)胞增殖的影響。IFN-β1b和IFN-β2對HT1080細(xì)胞和HT1080IFNAR2c細(xì)胞均有抗增殖作用。這由Alamar Blue測定組(圖8A和B)和目視檢查證明?？乖鲋匙饔门c受體數(shù)目增加有關(guān)，這由HT1080IFNAR2c細(xì)胞的作用增加證明，與HT1080細(xì)胞相比，HT1080IFNAR2c細(xì)胞具有5倍的IFN結(jié)合位點數(shù)目。采用這種測定，IFN-β2表現(xiàn)出類似于IFN-β1b的功能性質(zhì)。方法HT1080IFNAR2c細(xì)胞為過度表達(dá)IFNAR2c的HT1080細(xì)胞。這些細(xì)胞與親本HT1080細(xì)胞相比具有5倍的IFN結(jié)合位點。將2-5×104細(xì)胞/ml放置過夜，未接受刺激或接受1μg/ml、500ng/ml、200ng/ml或50ng/ml IFN-β2的刺激。但是，HT1080接受1μg/ml、500ng/ml或200ng/ml IFN-β2刺激，而HT1080IFNAR2c細(xì)胞接受500ng/ml、200ng/ml或50ng/ml IFN-β2的刺激。采用標(biāo)準(zhǔn)方案，使用Alamar Blue(美國專利5,501,959)測定細(xì)胞增殖，并在代表范圍內(nèi)的每個時間點拍照。每天更換含干擾素的培養(yǎng)基。所有的處理均進(jìn)行三份。參見圖8。
由短期3[H]胸苷結(jié)合測定的IFN-β2對人HT1080細(xì)胞的抗增殖活性。在加入IFN-β2(反萃取柱)或緩沖對照(填充柱)后48小時測定3[H]胸苷結(jié)合。3[H]胸苷結(jié)合表示為結(jié)合的CPM/106細(xì)胞。數(shù)據(jù)(圖9)代表n＝3的平均值，而平行樣品之間的變分小于15％。IFN-β2顯著降低胸苷結(jié)合，如降低大約86％。采用這種測定，IFN-β2表現(xiàn)出與IFN-β1b類似的功能性質(zhì)。方法在24孔細(xì)胞培養(yǎng)平板中接種(2×104細(xì)胞/孔)細(xì)胞，溫育過夜，然后用IFN-β2(1μg/ml)刺激24小時。然后在含有3[H]胸苷([甲基-3H]胸苷，比活性＝40-60Ci/mmol，Amersham Life Science)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并在在24小時后收集細(xì)胞。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞，然后用10％三氯乙酸(TCA)和100％乙醇洗滌。在測定放射性結(jié)合之前，將細(xì)胞溶解于1M氫氧化鉀并與Ecolume閃爍流體混合。
由IFN-β2激活I(lǐng)型IFN受體。IFN-β2誘導(dǎo)人I型IFN受體的IFNAR2c受體鏈的酪氨酸磷酸化。不刺激(unstim.)細(xì)胞或用人IFN-α2、IFN-β1b或IFN-β2刺激細(xì)胞(1000-2000相對單位/106細(xì)胞，15分鐘)。在存在而不是不存在干擾素下觀測到磷酸化作用。采用這種測定，IFN-β2表現(xiàn)出與IFN-β1b類似的功能性質(zhì)。方法將表達(dá)IFNAR2c的Daudi細(xì)胞(5×107細(xì)胞)溶解于溶胞緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.5，含有1％Nonidet-40(v/v)(NP-40)，150mM氯化鈉，1mM EDTA，2.5％甘油(v/v)，1.0mM氟化鈉，1.0mM原釩酸鈉，1.0mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.5μg/ml亮抑酶肽(leupeptin)和5.0μg/ml胰蛋白酶抑制劑)，4℃下持續(xù)30分鐘，并離心除去不溶物質(zhì)。為了進(jìn)行免疫沉淀，將IFNAR2c抗血清(+)或陰性對照抗血清(-)加到各樣品中，溫育過夜，與蛋白-G瓊脂糖(Boehringer-Mannheim)混合，并通過SDS-PAGE(10％Novex凝膠)分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移入聚偏二氟乙烯濾器(Pro-Blot)，并在4℃下在封閉緩沖液(20mMTris-HCl，pH7.5，含有0.1％Tween20(v/v)、150mM氯化鈉、1mMEDTA、1.0mM氟化鈉、1.0mM原礬酸鈉、1.0mM PMSF、0.5μg/ml亮抑酶肽和5.0μg/ml胰蛋白酶抑制劑)中溫育過夜，與抗磷酸酪氨酸抗體(ab PY99，Santa Cruz Biotechnology，Inc.Santa Cruz，CA)一起溫育并在封閉緩沖液中洗滌。洗滌后，將膜與偶聯(lián)于辣根過氧化物酶(HRP)的特異性第二抗體(1∶1000稀釋)一起溫育1小時，在封閉緩沖液中洗滌3次，并使用化學(xué)發(fā)光檢測法顯色(Pierce)。
通過用IFN-β2刺激進(jìn)行Daudi細(xì)胞中的STAT1和STAT2激活。用IFN-β1b或IFN-β2(1000-2000相對單位/106細(xì)胞)刺激Daudi細(xì)胞15分鐘，將其溶解于溶胞緩沖液中并免疫沉淀STAT1和STAT2。免疫沉淀之后，使用磷酸酪氨酸特異性抗體檢測兩種IFN類型的STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化作用。采用這種測定，IFN-β2表現(xiàn)出與IFN-β1b類似的功能性質(zhì)。方法將Daudi細(xì)胞(1×107細(xì)胞)溶解于溶胞緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.5，含有1％Nonidet-40(v/v)(NP-40)、150mM氯化鈉、1mMEDTA、2.5％甘油(v/v)、1.0mM氟化鈉、1.0mM原礬酸鈉、1.0mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.5μg/ml亮抑酶肽和5.0μg/ml胰蛋白酶抑制劑)，4℃下持續(xù)30分鐘，并離心除去不溶物質(zhì)。為了進(jìn)行免疫沉淀，將STAT1和2抗體(分別為Stat1 p91和Stat 2(C-20)，Santa CruzBiotechnology，Inc.Santa Cruz，CA)加入各樣品中，溫育過夜，與蛋白質(zhì)-G瓊脂糖(Boehringer-Mannheim)混合，并通過SDS-PAGE(10％Novex凝膠)分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移入聚偏二氟乙烯濾器(Pro-Blot)，并在4℃下在封閉緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.5，含有0.1％Tween20(v/v)、150mM氯化鈉、1mM EDTA、1.0mM氟化鈉、1.0mM原礬酸鈉、1.0mM PMSF、0.5μg/ml亮抑酶肽和5.0μg/ml胰蛋白酶抑制劑)中溫育過夜，與抗磷酸酪氨酸抗體(PY99，Santa CruzBiotechnology，Inc.Santa Cruz，CA)一起溫育并在封閉緩沖液中洗滌。洗滌后，將膜與偶聯(lián)于辣根過氧化物酶(HRP)的特異性第二抗體(1∶1000稀釋)一起溫育1小時，在封閉緩沖液中洗滌3次，并使用化學(xué)發(fā)光檢測法顯色(Pierce)。
IFN-β2和IFN-β1b的抗病毒活性。用IFN-β1b或IFN-β2刺激人WISH細(xì)胞，然后用皰疹性口炎病毒(VSV)感染。用氧化還原染料Alamar Blue測定病毒性細(xì)胞病變作用(CPE)。與IFN-β1b對應(yīng)的抗病毒活性單元沿X軸繪制。測定IFN-β2的特異性抗病毒為每mg4.0-8.0×106國際單位(“IU”)。參見圖10。采用這種測定，IFN-β2表現(xiàn)出與IFN-β1b類似的功能性質(zhì)。方法將WISH細(xì)胞(30000細(xì)胞/孔)置于96孔Falcon微滴板上并使其吸附過夜。用IFN-β1b(1000IU，在第一孔中；比活性＝2.5×107IU/ml)或IFN-β2(1μg，在第一孔中)刺激細(xì)胞，通過平板稀釋1∶1，進(jìn)行6小時，然后在18小時內(nèi)加入VSV(7×103空斑形成單位/孔，(PFU))。溫育后，除去培養(yǎng)基，將100μl Alamar Blue(BiosourceInternational)(生產(chǎn)商提供的貯備液在培養(yǎng)基中1∶10稀釋)加入各孔中。在37℃下溫育30-60分鐘后，通過測定600nm處的吸光度來測定CPE。
IFN-β2與IFN-α2競爭與HT1080細(xì)胞上的I型IFN受體結(jié)合。將1×106HT1080細(xì)胞與15ng/ml32P-標(biāo)記的IFN-α2(PestkaBiomedical#51100)在全細(xì)胞培養(yǎng)基(10％FBS，DMEM)中一起溫育。溫育后，用細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，將其溶解于1％SDS中，與閃爍流體混合并計數(shù)。15μg/ml IFN-β2競爭大于90％的結(jié)合于HT1080細(xì)胞的標(biāo)記的IFN-β2。測定進(jìn)行三份，標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％。參見圖11。
IFN-β2競爭性結(jié)合Daudi細(xì)胞上的I型IFN受體。用磷酸化形式的IFN-α2進(jìn)行競爭性配體結(jié)合測定。將配體磷酸化(比活性為60-62μCi/μg)，如在Croze，E.，等人，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，27133165-33168，1996中所述。分析結(jié)合數(shù)據(jù)，如在Scatchard，G.，Ann.N.Y Acad.Sci.，51，660-672，1965中所述。在100倍過量的未標(biāo)記的IFN存在下測定非特異性結(jié)合。通過溫育增加量的未標(biāo)記的IFN-α2、IFN-β1b或IFN-β2和恒定量的磷酸化的IFN-α2測定不同IFN的競爭性結(jié)合。采用這種測定，IFN-β2表現(xiàn)出與IFN-β1b類似的功能性質(zhì)。
I型IFN受體的IFN-β特異性組配。IFN-β1b以不同于IFN-α2的方式與I型IFN受體相互作用。采用這種測定，IFN-β2表現(xiàn)出與IFN-β1b類似的功能性質(zhì)。方法在37℃下在CO2恒溫箱中用濃度為200IU/106細(xì)胞的IFN刺激細(xì)胞(1×108)15分鐘。處理后，在4℃下通過離心(3000×g，3分鐘)快速收集細(xì)胞，并立即溶解于冰冷的溶胞緩沖液(100mM Tris，pH8.0，含有150mM NaCl、10％甘油(v/v)、1％NP-40(v/v)、1mM原礬酸鹽、1mM焦磷酸鈉、1mM氟化鈉、1mM EDTA、1mM苯甲基磺酰氟、5μg/ml亮抑酶肽和5μg/ml胰蛋白酶抑制劑)。4℃下將溶胞產(chǎn)物離心(16000×g，30分鐘)，并收集上清液。使用如在Croze，E.，等人，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，271，33165-33168，1996中所述的抗IFNAR1抗體或IFNAR2.2兔多克隆抗血清(10μl抗血清/108細(xì)胞)免疫沉淀細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，然后使用Novex8％ Tris-甘氨酸凝膠進(jìn)行SDS-PAGE分析。電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移入聚偏二氟乙烯(PVDF)濾器(Pro-Blot)，在室溫下用以下物質(zhì)封閉過夜20mM Tris，pH8.0，含有150mM NaCl、1mM原礬酸鹽、1mM焦磷酸鈉、1mM氟化鈉、1mM PMSF和0.1％Tween20。然后在室溫下將濾器與針對抗IFNAR1的抗體(40H2，0.1μg/ml，如在Croze，E.，等人，J Biol.Chem.(分子生物學(xué))，271，33165-33168，1996中所述)或針對IFNAR2的抗體(10μl抗血清/10ml封閉緩沖液)一起溫育2-3小時，隨后用封閉緩沖液洗滌10分鐘。然后在室溫下將洗滌的濾器與相應(yīng)的辣根過氧化物酶(HRP)綴合的第二抗體一起溫育2-3小時，洗滌并用化學(xué)發(fā)光法顯色(增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，Pierce)。
不同種類的干擾素優(yōu)先誘導(dǎo)基因。干擾素誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞中的基因的重疊(overlapping)、不種組(distinct set)。用人IFN-α2(1000IU/106細(xì)胞)、IFN-β1b(1000IU/106細(xì)胞)、IFN-γ(1000IU/106細(xì)胞)或IFN-β2(1000IU/106細(xì)胞)刺激Daudi或HT1080細(xì)胞17小時，并收集和處理全部細(xì)胞粒狀沉淀用于TaqMan分析，如在TaqManGold RT-PCR Protocol Manual(TaqMan黃金RT-PCR方案手冊)，AppliedBiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng))，Perkin-Elmer Corporation P/N402876Rev.A1997中所述。為了進(jìn)行基因表達(dá)的核糖核酸酶保護(hù)測定，如在Sandhya，R.等人，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，271，22878-22884，1996中所述，刺激并收集細(xì)胞。將由IFN-β1b優(yōu)先誘導(dǎo)的基因歸一化為ISG6-16，由IFN-α和IFN-β等同誘導(dǎo)的基因的表達(dá)。采用這種測定，IFN-β2表現(xiàn)出與IFN-β1b類似的功能性質(zhì)。
應(yīng)答IFN-β2的人胎兒星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗增殖。星形膠質(zhì)細(xì)胞引起MS損傷的產(chǎn)生，而在這里我們證明IFN-β2在體外抑制人胎兒星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。這種觀測結(jié)果提示IFN-β2可以用作星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的生長調(diào)節(jié)劑，從而防止MS中反應(yīng)性膠質(zhì)損傷的形成。采用這種測定，IFN-β2表現(xiàn)出與IFN-β1b類似的功能性質(zhì)。方法(A)星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的制備由2個不同的17-22周妊娠的胎兒腦制備來自人胎兒腦的富含星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)物。從Advanced Bioscience Resource Inc.，在合法治療性流產(chǎn)之后獲得組織。除去腦脊膜之后，將腦解剖并通過溫和移液而分離成單細(xì)胞懸浮液，然后使它們過篩。在含有青霉素、鏈霉素和兩性霉素B的抗生素混合劑的存在下將細(xì)胞再懸浮在含10％FCS的Iscove培養(yǎng)基中，并在一周內(nèi)每天通過示差吸附技術(shù)除去小膠質(zhì)細(xì)胞。然后使星形膠質(zhì)細(xì)胞生長至少8-10周，并每周進(jìn)料(feed)兩次。污染的小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞不能存在活在這些長期培養(yǎng)條件中。在此段時期結(jié)束時，用GFAP、O4和巢蛋白(nestin)抗體將培養(yǎng)物染色，證實含大于95％的純星形膠質(zhì)細(xì)胞。將培養(yǎng)物在液N2中冷凍，然后將它們用于增殖測定。(B)增殖測定星形膠質(zhì)細(xì)胞起始于冷凍的貯備液，并在用于增殖測定之前在上述培養(yǎng)基中生長至少兩個傳代。以2×104細(xì)胞/ml將細(xì)胞與或不與10ng/ml EGF(R & D System)一起置于96孔平板中。在低血清培養(yǎng)基(2％FCS)中進(jìn)行測定。用指定稀釋的IFN-β2(1mg/ml貯備液)或緩沖對照處理培養(yǎng)物。溫育4天后，將培養(yǎng)物與3H-胸苷一起溫育過夜，并在收集前將平板冷凍。
IFN-β2在多發(fā)性硬化的嚙齒動物模型中的活性。實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)廣泛用作多發(fā)性硬化的動物模型(Swanborg，G.，Clin.Immunol.Immunopathol.(臨床免疫學(xué)和免疫病理學(xué))，77，4-13，1995；Martin，R.和McFarland，H.，Sprircgeroge Semin.Immurzopathol.，18，1-24，1996)。IFN-β1b在這些相關(guān)的MS模型中顯示體內(nèi)功效。采用這些模型，IFN-β2表現(xiàn)出與IFN-β31b類似的功能性質(zhì)。方法(A)SJL小鼠中的被動轉(zhuǎn)移實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎動物和材料8周齡雌性SJL小鼠(Jackson Laboratories)；RPMI1640，含L-谷氨酰胺和25mM HERPES、1X，0.1微米過濾(LifeTechnologies，Cat#22400-089)；FBS，確定的(Hyclone，熱失活，Cat#SH30070.01)；MEM非必需氨基酸溶液，10mM，100X(LifeTechnologies，Cat#11140-050)；2-巰基乙醇，1000X，5.5×10-2M，在D-PBS中(Life Technologies，Cat#21985-023)；青霉素/鏈霉素，10000U/μg/ml(Bio-Whiftaker，Cat#17-602E)；Hank′s Balanced SaltSolution(Hank’s平衡鹽溶液)，1X，0.1微米過濾(Life Technologies；Cat#24020-117)；實驗皮下(分開在尾基部和上背面)注射0.1ml在完全弗氏佐劑(“CFA”)中的150μg蛋白脂質(zhì)蛋白(“PLP”)和200μg結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)H37Ra(研磨)對8周齡雌性SJL小鼠進(jìn)行免疫。11天后，切除小鼠的軸突(axial)淋巴結(jié)、肱淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞，并在以下培養(yǎng)基(向450ml RPMI 1640(含L-谷氨酰胺和HEPES)中加入50ml FBS、0.455ml 2-巰基乙醇、5.0ml Pen/Strep和5.0ml非必需氨基酸)以6×106細(xì)胞/ml進(jìn)行培養(yǎng)。將PLP加入細(xì)胞以獲得最終50μg/ml的濃度。將細(xì)胞在37℃下在7％CO2中溫育72小時。收集細(xì)胞，并用HBSS洗滌兩次。通過臺盼藍(lán)排阻評價淋巴結(jié)細(xì)胞的存活能力。將淋巴結(jié)細(xì)胞的濃度調(diào)節(jié)到4×107細(xì)胞/ml的濃度。給年幼8周齡的雌性SJL小鼠腹膜內(nèi)注射2×107淋巴結(jié)細(xì)胞/小鼠(劑量體積＝0.5ml)。將小鼠稱重并每日打分。如果需要，給予IFN-β2和IFN-β1b治療。臨床評價(EAE打分/癥狀)0/正常；1/跛行尾；2/難以直立；3/一只或兩只后肢不完全麻痹；4/一只或兩只后肢完全麻痹；5/不動、瀕死或死亡。(B)Lewis大鼠中的急性實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎動物和材料雌性Lewis大鼠(Charles River)，在8周齡時免疫；脊髓均漿制劑(來自雄性Hartley豚鼠，Simonsen Labs，Gilroy)用CO2將500-700克的豚鼠處死。使用鋒利的骨剪刀切開椎骨取出脊髓，用鹽水洗滌、吸干一次，并在-80℃下貯藏直到使用。然后將脊髓稱重，并用1g/ml鹽水均化；抗原乳液將豚鼠脊髓均漿與含1mg/ml結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis)(用研缽和杵研磨)的CFA(Difco，底特律，密歇根州)1∶1混合。將0.05ml注射入每只后肢的腳掌，每只大鼠總共注射0.1ml。
實驗在第1天用一次推注對大鼠進(jìn)行免疫。每天將大鼠稱重并打分。如果需要，給予IFN-β2和IFN-β1b治療。臨床評價(EAE打分/癥狀)0/正常；1/跛行尾；2/一只或兩只后肢不完全麻痹；3/一只后肢完全麻痹或兩只后肢可以移動但不能有助于身體的運(yùn)動；4/兩只后肢完全麻痹；5/后肢完全麻痹和一只或兩只前肢虛弱或瀕死，或死亡。
前面的描述最大范圍地使用本發(fā)明。因此，前述優(yōu)選的具體實施方案應(yīng)理解為只是一種例示，而不是以任何方式限制說明書的其它部分。以上和圖中所引用的所有申請、專利和出版物均引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種用于治療哺乳動物的多發(fā)性硬化的藥物組合物，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和治療有效量的圖2的人IFN-β2多肽、其生物活性片段或其生物活性衍生物。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中需要其的哺乳動物是人。
3.一種將用于哺乳動物的多發(fā)性硬化的藥物組合物給予需要其的哺乳動物的方法，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和治療有效量的圖2的人IFN-β2多肽、其生物活性片段或其生物活性衍生物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中需要其的哺乳動物是人。
5.一種用于治療哺乳動物的多發(fā)性硬化的藥物組合物，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和治療有效量的人IFN-β2多肽、其生物活性片段或其生物活性衍生物。
6.一種將用于哺乳動物的多發(fā)性硬化的藥物組合物給予需要其的哺乳動物的方法，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和治療有效量的人IFN-β2多肽、其生物活性片段或其生物活性衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的核酸和多肽序列，它們編碼干擾素－β－2(“IFN－β2”)。一種包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和治療有效量的人IFN－β2多肽，其生物活性片段或其生物活性衍生物的組合物用于治療人的多發(fā)性硬化。
文檔編號A61P25/28GK1436086SQ01811184
公開日2003年8月13日 申請日期2001年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月16日
發(fā)明者愛德華·M·克羅茲, 達(dá)里亞爾·福爾茲, T·查爾斯·瓦格納 申請人:舍林股份公司