專利名稱：具有副作用降低的特性的新型重組腺病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于基因治療的重組腺病毒載體，和生產(chǎn)該載體的方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種新型重組腺病毒載體，其通過(guò)抑制插入腺病毒基因組中的外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)，能減輕體內(nèi)施用該載體后的炎癥，還涉及一種生產(chǎn)該載體的方法，用于生產(chǎn)該重組腺病毒載體的一種細(xì)胞系，或應(yīng)用該重組腺病毒載體的一種基因治療方法。
背景技術(shù)：
腺病毒載體是適用于動(dòng)物細(xì)胞的極好的基因轉(zhuǎn)移載體，因?yàn)樗鼈兙哂休^高的基因轉(zhuǎn)移效率，使基因轉(zhuǎn)移到未分裂細(xì)胞的能力，易于制備高效價(jià)的病毒原液，等等，其臨床用途已嘗試作為基因治療的載體。當(dāng)前廣泛應(yīng)用的腺病毒載體是復(fù)制缺陷型載體，其中腺病毒復(fù)制和所有腺病毒蛋白質(zhì)表達(dá)必需的E1基因缺失，該載體被稱為第一代腺病毒載體(有些還缺失E3基因)。
眾所周知，由于第一代腺病毒載體缺乏E1基因，所以在不表達(dá)E1基因的正常細(xì)胞(如人類細(xì)胞)中沒(méi)有任何腺病毒蛋白質(zhì)表達(dá)。然而，最近的研究證明，當(dāng)利用第一代腺病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)移一種基因時(shí)，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)是暫時(shí)的，并且在基因轉(zhuǎn)移部位發(fā)生炎癥反應(yīng)(Yang Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914407-4411(1994)，Wilmott R.W.等人，Hum.Gene Ther.，7301-318(1996))。
提出了下列假說(shuō)，作為其原因的一種解釋。在第一代腺病毒載體感染的細(xì)胞中，腺病毒早期基因(如E2A基因)由細(xì)胞產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子低水平表達(dá)，從而激活腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(MLP)。之后，主要晚期蛋白質(zhì)表達(dá)，針對(duì)它們的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)開(kāi)始產(chǎn)生，CTL清除轉(zhuǎn)移有外源基因的細(xì)胞。因此，這一理論是，通過(guò)腺病毒早期蛋白質(zhì)的表達(dá)，腺病毒晚期蛋白質(zhì)的表達(dá)是炎癥反應(yīng)和缺乏轉(zhuǎn)基因持續(xù)表達(dá)的一個(gè)原因(Engelhardt J.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 916196-6200(1994)，Yang Y.等人，Nature Gnent.7362-368(1994))。
根據(jù)這一假說(shuō)，構(gòu)建了多種改進(jìn)的腺病毒載體，其中除E1基因之外，腺病毒復(fù)制必需的基因缺失，然后提供由來(lái)自產(chǎn)病毒細(xì)胞的基因編碼的蛋白質(zhì)，該病毒變得能夠復(fù)制。例如，曾經(jīng)報(bào)道E2A基因缺失的一種腺病毒載體(Zhou H.等人，J.Virol.，707030-7038(1996)，Gorziglia M.I.等人，J.Virol.，704173-4178(1996))，和E4基因(如E2A基因一樣，它是一種早期基因)缺失的一種腺病毒載體(Krouglicak V.等人，Hum.Gene Ther.，61575-1586(1995)，Wang Q.等人，GeneTher.，2775-783(1995)，Yeh P.等人，J.Virol.，70559-565(1996))，等等。然而，對(duì)于E2A基因缺失的腺病毒載體，觀察到延長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間和減少炎癥反應(yīng)的極小影響(Morral N.等人，Hum.Gene Theer.，81275-1286(1997)，Lusky M.等人，J.Virol.，722022-2032(1998)，O’neal W.K.等人，Hum.Gene Ther.，91587-1598(1998))。此外，曾經(jīng)報(bào)道在E4基因缺失的腺病毒中觀察到適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，但還不令人滿意(Gao G-P.等人，J.Virol.，708934-8943(1996)，Wang Q.等人，GeneTher.，4393-400(1997)，Dedieu J-F.等人，J.Virol.，714626-4637(1997))。
因此，提出一種依賴輔助病毒的腺病毒載體(HD載體)作為進(jìn)一步改進(jìn)的載體，其中除了末端反向重復(fù)序列(ITR)和包裝信號(hào)外所有腺病毒基因都缺失，其復(fù)制依賴于輔助病毒(Kochanek S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 935731-5746(1996)，Parks R.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9313565-13570(1996))。這種HD載體也被稱為gutted載體或gutless載體。據(jù)報(bào)道這種HD載體顯示改良載體的作用，如轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間延長(zhǎng)，炎癥反應(yīng)減少(Morsy M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 957866-7871(1998)，Schiedner G.等人，Nature Gnet.18180-183(1998)，Morral N.等人，Hum.Gene Ther.92709-2716(1998))。
然而，當(dāng)這種HD載體在臨床上用作藥物時(shí)，存在載體產(chǎn)率低的重要問(wèn)題。原因如下第一，在HD載體的產(chǎn)生過(guò)程中，HD載體依賴于輔助腺病毒作為來(lái)源供應(yīng)復(fù)制所需的所有蛋白質(zhì)。根據(jù)使HD載體能夠復(fù)制而始終保持恒定比例輔助病毒的生產(chǎn)原則，報(bào)道的每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的HD載體的產(chǎn)量明顯低于第一代腺病毒載體(Morsy M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 957866-7871(1998)，Schiedner G.等人，Nature Gnent.18180-183(1998))。而且，由于希望的HD載體總是污染用于生產(chǎn)的輔助病毒，必須根據(jù)病毒比重的微小差異，通過(guò)超速離心分離病毒，除去輔助病毒。有時(shí)通過(guò)超速離心純化第一代腺病毒載體，但是其目的在于從腺病毒顆粒中除去污染蛋白質(zhì)。另一方面，在HD載體的純化過(guò)程中，不僅必須如上所述除去污染蛋白質(zhì)，而且必須分離輔助病毒，因此一輪離心純化的產(chǎn)量少于第一代腺病毒載體。如果輔助病毒沒(méi)有完全除去，病毒安全性本身就是一個(gè)問(wèn)題。而且，盡管第一代腺病毒載體也能通過(guò)可比超速離心法處理更大量病毒的柱層析法純化(Huyghe B.D.等人，Hum.Gene Ther.61403-1416(1995))，但是由于HD載體必須除去輔助病毒，現(xiàn)有技術(shù)水平不能應(yīng)用柱層析法。由于上述原因，在培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生和隨后的純化步驟中，HD載體的產(chǎn)率明顯低于第一代腺病毒載體。因此，認(rèn)為生產(chǎn)足夠臨床應(yīng)用的HD載體極其困難，并且不切實(shí)際。
此外，病毒來(lái)源的啟動(dòng)子，如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子和勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子，已經(jīng)廣泛用于基因治療的載體，包括腺病毒載體，因?yàn)樗鼈兊膯?dòng)子活性是高水平的。然而據(jù)報(bào)道，為了由這些啟動(dòng)子體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)希望的基因，需要腺病毒E4基因編碼的蛋白質(zhì)(Armentano D.等人，J.Virol.，712408-2416(1997)，Brough D.E.等人，J.Virol.719206-9213(1997))?；诔志脝?dòng)子活性的觀點(diǎn)，插入來(lái)自病毒的高活性啟動(dòng)子的腺病毒載體必須采用結(jié)構(gòu)類似于第一代腺病毒載體的載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種能夠不依賴于輔助病毒復(fù)制的新型腺病毒載體，該載體具有在體內(nèi)幾乎不表達(dá)腺病毒蛋白質(zhì)，因此不誘發(fā)炎癥反應(yīng)，并且能夠持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)基因的特性。另外，本發(fā)明的一個(gè)目的在于在基因治療中提供這種腺病毒載體。
關(guān)于在向個(gè)體動(dòng)物施用E1基因缺失的第一代腺病毒載體時(shí)發(fā)生炎癥反應(yīng)的原因，本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)進(jìn)行了廣泛和深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)谝淮俨《据d體感染不產(chǎn)生E1蛋白的細(xì)胞時(shí)，表達(dá)腺病毒蛋白質(zhì)的機(jī)制不同于傳統(tǒng)假說(shuō)。于是發(fā)明的發(fā)明者解釋，觸發(fā)腺病毒蛋白質(zhì)表達(dá)的不是通常認(rèn)為的早期基因的表達(dá)，而是插入腺病毒載體中的外源啟動(dòng)子。特別闡明了一種新的機(jī)制外源啟動(dòng)子的特定成分(增強(qiáng)子等)作用于該啟動(dòng)子附近的腺病毒啟動(dòng)子，于是腺病毒基因得到表達(dá)。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)表達(dá)的主要腺病毒基因不是由公認(rèn)的主要晚期啟動(dòng)子(MLP)調(diào)節(jié)并且編碼六鄰體等的主要晚期基因，而是含有獨(dú)立啟動(dòng)子的蛋白IX基因。
蛋白IX不是腺病毒復(fù)制所必需的蛋白質(zhì)，而是形成完整腺病毒顆粒所需的。因此，第一代腺病毒載體中僅蛋白IX基因缺失就不能產(chǎn)生發(fā)明者希望獲得的正常的腺病毒載體。因此，發(fā)明者進(jìn)一步進(jìn)行了廣泛和深入的研究，發(fā)現(xiàn)這一問(wèn)題能用兩種不同的方法解決。一種方法是將腺病毒載體的蛋白IX基因由正常位置重新定位到不受外源啟動(dòng)子作用的位置(稱為蛋白IX重新定位的腺病毒載體)。另一種方法是從腺病毒載體中缺失蛋白IX基因，構(gòu)建產(chǎn)生蛋白IX的新細(xì)胞系，由該細(xì)胞系產(chǎn)生蛋白IX基因缺失的腺病毒載體(蛋白IX缺失的腺病毒載體)。
此外，發(fā)明者的研究還證明，盡管由于外源啟動(dòng)子的作用誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因主要是蛋白IX基因，但是蛋白IVa2基因和L1基因也可能誘導(dǎo)表達(dá)。因此，蛋白IVa2基因和L1基因的啟動(dòng)子已經(jīng)修飾而不受外源啟動(dòng)子作用的腺病毒載體，能夠單獨(dú)使用或與蛋白IX基因的修飾聯(lián)合使用，作為不表達(dá)腺病毒蛋白質(zhì)并且?guī)缀醪徽T發(fā)炎癥的載體。
本發(fā)明根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)完成。
因此，本發(fā)明涉及1.一種重組腺病毒載體，其體內(nèi)施用過(guò)程中的炎癥減輕，該載體具有下列特征(1)-(4)(1)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(2)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；(3)具有下列特征(A)和/或(B)(A)由外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因組的基因從正常位置重新定位到不受外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的位置，或者該基因缺失；和(B)由外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因組基因啟動(dòng)子的核苷酸序列被置換，以致不受外源啟動(dòng)子的作用；和(4)形成與腺病毒野生株具有相同特性的正常病毒顆粒，2.一種根據(jù)上述1的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組的啟動(dòng)子是MLP和/或IVa2基因啟動(dòng)子，3.一種根據(jù)上述1或2的重組腺病毒載體，其具有下列特征(5)-(8)(5)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(6)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；(7)腺病毒基因組的蛋白IX基因從正常位置重新定位到不受外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的位置；和(8)含有含量類似于腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒，4.一種根據(jù)上述1-3中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失位點(diǎn)插入含外源啟動(dòng)子的外源基因，5.一種根據(jù)上述1-4中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因之外的至少一種基因全部或部分缺失，6.一種根據(jù)上述3-5中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因和蛋白IX基因之外的至少一種基因全部或部分缺失，7.一種根據(jù)上述1-6中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E3基因全部或部分缺失，8.一種根據(jù)上述1-7中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E2A基因全部或部分缺失，9.一種根據(jù)上述1-8中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的至少一個(gè)ORF，10.一種根據(jù)上述9的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的ORF3，11.一種根據(jù)上述10的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E4基因ORF3之外的全部或部分ORF缺失，12.一種根據(jù)上述3-11中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于距外源啟動(dòng)子18kb或更遠(yuǎn)的位置，13.一種根據(jù)上述12的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因組的L3基因與E2A基因之間，14.一種根據(jù)上述3-11中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于距外源啟動(dòng)子24kb或更遠(yuǎn)的位置，15.一種根據(jù)上述14的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因組的E3基因缺失位點(diǎn)，16.一種根據(jù)上述3-11中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于距外源啟動(dòng)子30kb或更遠(yuǎn)的位置，17.一種根據(jù)上述16的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因組的E4基因上游區(qū)與3’端ITR之間，18.一種根據(jù)上述1-17中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子含有來(lái)自哺乳動(dòng)物和/或動(dòng)物病毒的元件，19.一種根據(jù)上述18的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子含有CMV增強(qiáng)子，20.一種根據(jù)上述19的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種CMV啟動(dòng)子，
21.一種根據(jù)上述19的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種CAG啟動(dòng)子，22.一種根據(jù)上述18的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種RSV啟動(dòng)子或一種SRα啟動(dòng)子，23.一種根據(jù)上述18的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是一種人類腺病毒載體，24.一種根據(jù)上述23的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是2型腺病毒或5型腺病毒，25.一種根據(jù)上述1或2的重組腺病毒載體，其具有下列特征(9)-(11)(9)腺病毒基因組的E1A和E1B基因和蛋白IX基因缺失；(10)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；和(11)含有含量類似于腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒，26.一種根據(jù)上述25的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E3基因全部或部分缺失，27.一種根據(jù)上述25或26的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失位點(diǎn)或E3基因缺失位點(diǎn)插入含外源啟動(dòng)子的外源基因，28.一種根據(jù)上述25-27中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因、E3基因和蛋白IX基因之外的至少一種基因全部或部分缺失，29.一種根據(jù)上述25-28中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E2A基因全部或部分缺失，30.一種根據(jù)上述25-29中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的至少一個(gè)ORF，31.一種根據(jù)上述30的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的ORF3，32.一種根據(jù)上述31的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E4基因ORF3之外的全部或部分ORF缺失，33.一種根據(jù)上述25-32中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子含有來(lái)自哺乳動(dòng)物和/或動(dòng)物病毒的元件，34.一種根據(jù)上述33的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子含有CMV增強(qiáng)子，35.一種根據(jù)上述34的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種CMV啟動(dòng)子，36.一種根據(jù)上述34的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種CAG啟動(dòng)子，37.一種根據(jù)上述33的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種RSV啟動(dòng)子或一種SRα啟動(dòng)子，38.一種根據(jù)上述25-37中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是一種人類腺病毒載體，39.一種根據(jù)上述38的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是2型腺病毒或5型腺病毒，40.一種來(lái)源于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，其具有下列特征(12)-(13)(12)表達(dá)腺病毒的E1基因和蛋白IX基因；和(13)能使根據(jù)上述25-39中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體繁殖，41.一種根據(jù)上述40的細(xì)胞，其中腺病毒的蛋白IX基因的表達(dá)由外源啟動(dòng)子而不是該基因的原始啟動(dòng)子調(diào)節(jié)，42.一種根據(jù)上述40或41的細(xì)胞，其進(jìn)一步表達(dá)除腺病毒的E1基因和蛋白IX基因之外的至少一種腺病毒基因，43.一種根據(jù)上述42的細(xì)胞，其表達(dá)腺病毒的E1基因、蛋白IX基因和E2A基因，44.一種生產(chǎn)根據(jù)上述25-39中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體的方法，其中應(yīng)用根據(jù)上述40-43中任意一項(xiàng)的細(xì)胞，45.一種重組腺病毒載體，其體內(nèi)施用過(guò)程中的炎癥減輕，該載體具有下列特征(14)和(15)(14)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；和
(15)腺病毒基因組中插入一種不誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的外源啟動(dòng)子，46.一種根據(jù)上述45的重組腺病毒載體，其具有下列特征(16)-(18)(16)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(17)腺病毒基因組的蛋白IX基因在原始位置處保留；和(18)腺病毒基因組中插入一種不誘導(dǎo)蛋白IX基因表達(dá)的外源啟動(dòng)子，47.一種根據(jù)上述45或46的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A基因和E1B基因缺失位點(diǎn)插入含外源啟動(dòng)子的外源基因，48.一種根據(jù)上述45-47中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子不含CMV增強(qiáng)子，49.一種根據(jù)上述45-48中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中含外源啟動(dòng)子的外源基因以朝左的方向插入，50.一種根據(jù)上述45-49中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子是一種EF1α啟動(dòng)子，51.一種重組腺病毒載體，其體內(nèi)施用過(guò)程中的炎癥減輕，該載體具有下列特征(19)-(21)(19)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(20)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；和(21)在外源啟動(dòng)子與腺病毒基因之間插入具有抑制外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的特性的堿基序列，52.一種根據(jù)上述51的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A基因和E1B基因缺失位點(diǎn)插入含外源啟動(dòng)子的外源基因，53.一種根據(jù)上述51或52的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子含有CMV增強(qiáng)子，54.一種藥用組合物，它在體內(nèi)施用過(guò)程中可減輕或不誘發(fā)炎癥，含有一種選自上述1-39和45-53的重組腺病毒載體作為活性成分，55.一種減輕體內(nèi)施用過(guò)程中的炎癥的方法，其中對(duì)哺乳動(dòng)物施用一種選自上述1-39和45-53的重組腺病毒載體，56.一種減輕體內(nèi)施用過(guò)程中的炎癥的基因治療方法，其中對(duì)哺乳動(dòng)物施用一種選自上述1-39和45-53的重組腺病毒載體，57.一種選自上述1-39和45-53的重組腺病毒載體的用途，用于生產(chǎn)在體內(nèi)施用過(guò)程中可減輕或不誘發(fā)炎癥的藥用組合物，58.一種選自上述1-39和45-53的重組腺病毒載體的用途，用于生產(chǎn)在基因治療中使用的藥用組合物，它在體內(nèi)施用過(guò)程中可減輕或不誘發(fā)炎癥。
圖2顯示通過(guò)尾靜脈注射腺病毒載體Ax1CAHGH或ΔE2A-CAHGH的C57BL/6小鼠(每組5只小鼠)血清GPT水平日變化的平均值。圖中，●是注射1×109PFU腺病毒載體組，○是注射3×108PFU組，▲是注射1×108PFU組。
該實(shí)驗(yàn)以每組5只小鼠進(jìn)行。在Ax1CAHGH 1×109PFU施用組和ΔE2A-CAHGH 3×108PFU施用組中，有一只小鼠的血清hGH水平明顯低于(1/10或更低，數(shù)據(jù)未顯示)其它4只小鼠。因此，對(duì)于這兩組，在計(jì)算平均值時(shí)忽略該小鼠的值，顯示每組4只小鼠的平均GPT值。
圖3顯示通過(guò)尾靜脈注射不同結(jié)構(gòu)的腺病毒載體或紫外線滅活的腺病毒顆粒的C57BL/6小鼠(每組5只小鼠)血清GPT水平日變化的平均值。圖中，●是注射1×109PFU載體組，○是注射3×108PFU組，▲是注射1×108PFU組，Δ是注射3×107PFU組。鹽水代表注射生理鹽水組，紫外線滅活代表注射紫外線滅活的腺病毒顆粒組。
圖4是一張照片，顯示Northern印跡分析的結(jié)果。A549細(xì)胞或HepG2細(xì)胞用以下所示的每種腺病毒載體以moi＝100感染，24小時(shí)后由細(xì)胞制備RNA。各5μg RNA電泳后，通過(guò)Northern印跡分析檢測(cè)(A)L3 RNA，(B)IVa2 RNA，和(C)pIX RNA。凝膠上的符號(hào)代表Mock假感染，lwlAxlwl，CAwtAxCAwt，HGHAx1CAHGH，ΔE2AΔE2A-CAHGH。凝膠右側(cè)的箭頭和數(shù)字顯示希望的條帶的位置和大小。
右側(cè)標(biāo)為Ad5的三個(gè)道是陽(yáng)性對(duì)照。HepG2細(xì)胞用來(lái)自5型腺病毒野生株(Ad5-dlXSaito I.等人，J.Virol.54711-719(1985))、只缺失E3基因的病毒以moi＝10感染，24小時(shí)后制備RNA，并對(duì)圖中所示的RNA進(jìn)行電泳。
圖5是一張照片，顯示蛋白IX(pIX)基因的Northern印跡分析結(jié)果。A549細(xì)胞用AxCAwt或AdCMVlacZ以圖中所示的moi感染，24小時(shí)后由細(xì)胞制備RNA。對(duì)各5μg RNA進(jìn)行電泳，然后通過(guò)Northern印跡分析檢測(cè)pIX RNA。圖中縮寫(xiě)代表Mock假感染，CAGAxCAwt，CMVAdCMVlacZ。
右側(cè)標(biāo)為Ad5的三個(gè)道是陽(yáng)性對(duì)照。A549細(xì)胞用Ad5-dlX(見(jiàn)圖4)以moi＝10感染，24小時(shí)后制備RNA，對(duì)圖中所示的RNA進(jìn)行電泳。
圖6是一張照片，顯示pIX基因的Northern印跡分析結(jié)果。A549細(xì)胞用圖中所示的每種腺病毒載體以moi＝30或100感染，24小時(shí)后由細(xì)胞制備RNA。對(duì)各5μg RNA進(jìn)行Northern印跡分析以檢測(cè)pIXRNA。
圖7顯示注射含有不同啟動(dòng)子的腺病毒載體的C57BL/6小鼠(每組5只小鼠)血清GPT水平日變化的平均值。圖中，●是注射1×109PFU載體組，○是注射3×108PFU組，▲是注射1×108PFU組。
圖8是一張照片，顯示應(yīng)用抗pIX-融合蛋白(GST-pIX)抗血清的Western印跡分析的結(jié)果。用Ad5-dIX(見(jiàn)圖4)以moi＝10感染A549細(xì)胞，大約1天后收獲細(xì)胞，溶解于SDS樣品緩沖液中。細(xì)胞裂解液或純化的病毒顆粒(7.5×107PFU)在還原條件下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，隨后用抗-pIX抗血清#1(抗-pIX)或免疫前血清(免疫前)進(jìn)行Western印跡分析以檢測(cè)pIX。圖中縮寫(xiě)代表Mock未感染的細(xì)胞，Ad5Ad5-dIX感染的細(xì)胞，病毒體純化的病毒顆粒。圖右側(cè)的數(shù)值是分子量標(biāo)記物的分子量。用預(yù)染色的分子量標(biāo)記物(GIBCO BRL，目錄號(hào)10748-010)作為分子量標(biāo)記物，并根據(jù)未染色的分子量標(biāo)記物(New England Biolabs，目錄號(hào)P7702S)的遷移率修正分子量。括號(hào)中的數(shù)值是未用未染色分子量標(biāo)記物修正的值。
圖9是一張照片，顯示pIX的Western印跡分析的結(jié)果。用AxCAwt(moi＝100)、Awlwl(moi＝100)或Ad5-dIX(moi＝10)感染A549細(xì)胞，大約1天后收獲細(xì)胞，溶解于SDS樣品緩沖液中。待SDS-PAGE后，進(jìn)行Western印跡分析以檢測(cè)pIX。圖中縮寫(xiě)代表Ad5Ad5-dIX感染的細(xì)胞，CAwtAxCAwt感染的細(xì)胞，lwlAwlwl感染的細(xì)胞，Mock未感染的細(xì)胞。圖右側(cè)的數(shù)值是分子量(見(jiàn)圖8)。


圖10是顯示蛋白IX重新定位的腺病毒載體、pIX缺失的腺病毒載體等的結(jié)構(gòu)的示意圖。圖中，lacZ代表大腸桿菌lacZ基因的表達(dá)單元，pIX代表蛋白IX基因，psi代表包裝信號(hào)，CAG代表CAG啟動(dòng)子，hGH代表人類生長(zhǎng)激素cDNA，pA代表poly(A)序列。箭頭表示每種基因的轉(zhuǎn)錄方向。
圖11是顯示構(gòu)建粘粒載體pAxΔpIXcw和pAxΔpIXCAHGH的方法的示意圖。圖中，空框表示5型人類腺病毒基因組，細(xì)線部分表示大腸桿菌來(lái)源的DNA序列。限制酶上的數(shù)值表示5型人類腺病毒中每種限制酶識(shí)別位點(diǎn)處的核苷酸數(shù)。APR代表氨芐青霉素抗性基因，ori代表大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)，COS代表λ噬菌體的COS位點(diǎn)。
圖12是一張照片，顯示表達(dá)pIX的細(xì)胞系的蛋白IX基因的Northern印跡分析結(jié)果。將表達(dá)pIX的細(xì)胞系的4個(gè)克隆(#2，#5，#6，#10)傳代培養(yǎng)至第30代，每5代由細(xì)胞系制備RNA，并進(jìn)行Northern印跡分析。圖中，P1、P5、P10、P15、P20、P25和P30表示傳代數(shù)。左側(cè)三個(gè)道是陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。Mock代表由不含病毒的293細(xì)胞制備的RNA，8hr和24hr代表用Axlwl以moi＝10感染293細(xì)胞8小時(shí)(8hr)和24小時(shí)(24hr)后制備的RNA。
圖13是一張照片，顯示表達(dá)pIX的細(xì)胞系的pIX的Western印跡分析結(jié)果。將表達(dá)pIX的細(xì)胞系的4個(gè)克隆(#2，#5，#6，#10)傳代培養(yǎng)至第25代，溶解于SDS樣品緩沖液中。在SDS-PAGE后，進(jìn)行Western印跡分析檢測(cè)pIX。右側(cè)三個(gè)道是陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。詳見(jiàn)圖12。用未染色的分子量標(biāo)記物(New England Biolabs，目錄號(hào)P7702S)作為分子量標(biāo)記物。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳模式以下將更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明，第一次揭示了在體內(nèi)施用重組腺病毒載體后發(fā)生的炎癥是由外源啟動(dòng)子引起的。特別是第一次闡明，原來(lái)不應(yīng)表達(dá)的腺病毒基因組的基因由于外源啟動(dòng)子的作用而表達(dá)，來(lái)源于腺病毒的表達(dá)蛋白質(zhì)引起炎癥。
因此，為了減輕體內(nèi)施用腺病毒載體后的炎癥，顯然應(yīng)當(dāng)在適當(dāng)時(shí)修飾重組腺病毒載體的基因組結(jié)構(gòu)，以使腺病毒基因的表達(dá)不受外源啟動(dòng)子作用的影響。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能利用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)對(duì)重組腺病毒載體的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，以使腺病毒基因的表達(dá)不受外源啟動(dòng)子作用的影響。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的重組腺病毒載體包括重組腺病毒載體的基因組結(jié)構(gòu)已經(jīng)修飾，使得腺病毒基因的表達(dá)不受外源啟動(dòng)子影響的任何載體。
本發(fā)明的重組腺病毒載體的優(yōu)選實(shí)施方案包括具有下列特征(1)-(4)的載體(1)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(2)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；(3)具有下列特征(A)和/或(B)(A)由外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因組的基因從正常位置重新定位到不受外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的位置，或者該基因缺失；和
(B)由外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因組基因啟動(dòng)子的核苷酸序列被置換，以致不受外源啟動(dòng)子的作用；和(4)形成與腺病毒野生株具有相同特性的正常病毒顆粒。
在此使用時(shí)，用于構(gòu)建本發(fā)明的重組腺病毒載體的腺病毒是一種利用動(dòng)物作為天然宿主的病毒，特別是，優(yōu)選使用利用人作為宿主的人類腺病毒，更優(yōu)選地使用C亞組的人類腺病毒，如2型或5型人類腺病毒。在本說(shuō)明書(shū)中，為了顯示一種基因在腺病毒基因組中的位置，可以使用圖距單位(下文稱為m.u.；1m.u.＝約360個(gè)堿基對(duì))，其值基于5型腺病毒。該腺病毒基因組的結(jié)構(gòu)已知，例如，2型人類腺病毒基因組的完整核苷酸序列已經(jīng)在GenBank中登記(保藏號(hào)J01949)，5型人類腺病毒基因的完整核苷酸序列已經(jīng)在GenBank中登記(保藏號(hào)M73260)。
在上述(1)中，腺病毒的E1A和E1B基因缺失是指這兩種基因的全部或部分堿基不存在，如果缺失導(dǎo)致不產(chǎn)生功能性E1A蛋白和E1B蛋白，則不具體限制缺失范圍。此外，盡管蛋白IX基因存在于與E1B基因部分完全重疊的位置，但E1B基因的缺失通常不包括蛋白IX基因的缺失。E1A和E1B基因缺失的例子包括5型腺病毒的1.3-9.3m.u.的缺失(E1A基因的全部和E1B基因的大部分缺失；Trapnell B.C.，Advanced Drug Delivery Reviews，12185-199(1993)，Elsevier SciencePublishing B.V.)。根據(jù)基礎(chǔ)教材如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，T.Maniatis等人編寫(xiě)，第二版(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地實(shí)現(xiàn)這種缺失。
根據(jù)本發(fā)明，E1A和E1B基因可以簡(jiǎn)單地通稱為E1基因或E1區(qū)。
在上述(2)中，外源啟動(dòng)子是腺病毒原始啟動(dòng)子之外的啟動(dòng)子，外源基因是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列，包括啟動(dòng)子、編碼蛋白質(zhì)的基因、poly(A)序列等。當(dāng)進(jìn)行基因治療時(shí)，外源基因是指表達(dá)用于治療所述疾病的蛋白質(zhì)的基因。例如，通過(guò)向市售的不同表達(dá)載體中插入編碼希望的蛋白質(zhì)的基因，能容易地構(gòu)建外源基因。向腺病毒基因組中插入構(gòu)建的外源基因也可根據(jù)參考文獻(xiàn)所述的周知的方法進(jìn)行(GrahamF.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 918802-8806(1994)，Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)等)。外源基因優(yōu)選地插入上述E1基因缺失位點(diǎn)中。
在上述(3)中，由外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因組的基因是指腺病毒基因組的一種基因，其轉(zhuǎn)錄通過(guò)外源啟動(dòng)子中特定組分的作用發(fā)生。具體包括蛋白IX基因、蛋白IVa2基因和L1基因等。
在上述(3)之(A)中，由外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因組的基因可以從正常位置重新定位到不受外源啟動(dòng)子作用的位置，或者該基因可以缺失，以防止該基因在體內(nèi)施用后表達(dá)。具體例子包括蛋白IX基因。因此，能夠達(dá)到減輕體內(nèi)施用后炎癥的本發(fā)明的目的。當(dāng)基因如上缺失時(shí)，必須預(yù)先向細(xì)胞中導(dǎo)入已經(jīng)缺失的基因，并且應(yīng)當(dāng)在允許重組腺病毒載體復(fù)制形成正常病毒顆粒的細(xì)胞中表達(dá)該基因。
盡管下文更詳細(xì)地描述了基因重新定位或缺失的具體例子，構(gòu)建基本上不同的重新定位或缺失的重組腺病毒載體，通過(guò)如實(shí)施例5所述研究在體內(nèi)施用后是否發(fā)生炎癥，或者通過(guò)如實(shí)施例6所述的Northern印跡分析等，評(píng)價(jià)哪種重新定位或缺失能夠滿足本發(fā)明的目的。
上述(3)之(B)的基因的具體例子包括主要晚期啟動(dòng)子(MLP)和/或IVa2基因啟動(dòng)子。通過(guò)置換腺病毒基因組啟動(dòng)子中的堿基，使其不受外源啟動(dòng)子的影響，以至不影響其原始功能，能夠防止體內(nèi)施用后在該腺病毒基因組啟動(dòng)子控制下的基因表達(dá)。因此，能夠達(dá)到減輕體內(nèi)施用腺病毒載體后的炎癥的本發(fā)明的目的。參照下列實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員在適當(dāng)時(shí)能夠進(jìn)行特定堿基置換。因此，可以構(gòu)建具有不同堿基置換的重組腺病毒載體，通過(guò)如實(shí)施例5所述研究在體內(nèi)施用后是否發(fā)生炎癥，或者通過(guò)如實(shí)施例6所述的Northern印跡分析，評(píng)價(jià)哪種堿基置換能夠滿足本發(fā)明的目的。
如以上(3)之(A)和(B)所述的腺病毒基因重新定位、缺失和置換的具體方法可由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行，根據(jù)基本教材，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，T.Maniatis等人編寫(xiě)，第二版(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，或用于重組腺病毒構(gòu)建的已知技術(shù)(Graham F.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 918802-8806(1994)，Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)等)，等等。
在上述(4)中，與腺病毒野生株具有相同特性是指在病毒顆粒的組成比，如病毒顆粒的蛋白質(zhì)和物理化學(xué)性質(zhì)，以及細(xì)胞感染性的保持等方面，具有與野生株幾乎相同的特性。
在上述本發(fā)明的重組腺病毒載體中，上述E1A和E1B基因之外的腺病毒基因組的至少一種基因可能進(jìn)一步全部或部分缺失。具體而言，E3基因、E2A基因和/或E4基因可能全部或部分缺失。在此使用時(shí)，當(dāng)E4基因缺失時(shí)，優(yōu)選地缺失但保留E4基因的至少一個(gè)ORF。特別是，優(yōu)選地至少保留ORF3。下文將詳細(xì)說(shuō)明這些缺失。
本發(fā)明的重組腺病毒載體的優(yōu)選實(shí)施方案包括具有下列特征(5)-(8)的載體(5)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(6)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；(7)腺病毒基因組的蛋白IX基因從正常位置重新定位到不受外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的位置；和(8)含有含量類似于腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒。
下面將以具有這些特征的重組腺病毒載體為例，詳細(xì)解釋這些特征。
上述(6)的外源基因優(yōu)選地插入E1基因缺失位點(diǎn)。更優(yōu)選地，外源基因插入病毒基因組的1.3-11.2m.u.已經(jīng)缺失的位點(diǎn)，和E1基因和蛋白IX基因全部缺失(由于重新定位)的位點(diǎn)。
上述(7)的腺病毒蛋白IX(下文稱為pIX)是構(gòu)成腺病毒病毒體殼體的九個(gè)六鄰體的一種次要成分，與病毒體的熱穩(wěn)定性和能夠包裝的病毒基因組的大小有關(guān)。蛋白IX不是腺病毒復(fù)制必需的成分，但鎖定pIX的病毒體傾向于熱不穩(wěn)定(Colby W.W.等人，J.Virol.39977-980(1981))，只能包裝大小約為野生株90％的基因組DNA(Ghosh-Choudhury G.等人，EMBO J.61733-1739(1987))。因此，形成正常的病毒顆粒需要pIX。
在上述(7)中，腺病毒基因組的蛋白pIX基因從正常位點(diǎn)重新定位到不受外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的位置是指，在蛋白IX基因最初存在于野生型腺病毒基因組中的位點(diǎn)，即5型人類腺病毒基因組中9.7-11.2m.u.的位點(diǎn)(Maat J.等人，Gene 1027-38(1980))，不存在蛋白IX基因，蛋白IX基因存在于腺病毒基因組的其它任何位點(diǎn)。此外，蛋白IX基因不受外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)是指蛋白IX基因的轉(zhuǎn)錄不由外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)。在下文中，蛋白IX基因重新定位于其中的腺病毒載體可以稱為“蛋白IX基因重新定位的腺病毒載體”。
在上述(7)中，不具體限制蛋白IX基因重新定位的位點(diǎn)，只要蛋白IX基因不受外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)，并且在載體復(fù)制循環(huán)中蛋白IX的表達(dá)不被明顯抑制。然而，優(yōu)選地蛋白IX基因重新定位于距外源啟動(dòng)子幾十個(gè)kb的位置，和容易進(jìn)行外源基因克隆的位置。此位置的一個(gè)優(yōu)選例子是，距外源啟動(dòng)子約18kb或更遠(yuǎn)的位置，具體例子包括腺病毒基因組L3基因與E2A基因之間的位置(日本未審查專利文本(Kokai)號(hào)-308585)。另一個(gè)優(yōu)選例子是，距外源啟動(dòng)子約24kb或更遠(yuǎn)的位置，具體例子包括腺病毒基因組E3基因的缺失位點(diǎn)。此外，另一個(gè)優(yōu)選例子是，距外源啟動(dòng)子約30kb或更遠(yuǎn)的位點(diǎn)置，具體例子包括腺病毒基因組的E4基因上游區(qū)與3’端ITR(末端反向重復(fù)序列)之間的位置(Saito I.等人，J.Virol.54711-719(1985))。從蛋白IX基因的正常位置缺失和上述位置的重新定位通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)和周知的上述重組腺病毒構(gòu)建技術(shù)容易進(jìn)行。構(gòu)建的蛋白IX重新定位的腺病毒載體是否滿足本發(fā)明的目的能如下評(píng)價(jià)如實(shí)施例5所述研究在體內(nèi)施用后是否發(fā)生炎癥，如實(shí)施例6所述的Northern印跡分析，等等。
在上述(8)中，含有含量類似于腺病毒野生株的蛋白IX的病毒顆粒是指一種腺病毒顆粒，它含有與野生型腺病毒顆粒所含蛋白IX幾乎相同比例的蛋白IX。此外，正常病毒顆粒是指保持細(xì)胞感染力的腺病毒顆粒，其熱穩(wěn)定性和能夠包裝的基因組DNA的大小與野生型腺病毒幾乎相同。
在上述蛋白IX重新定位的腺病毒載體中，E1A和E1B基因能夠缺失，蛋白IX基因能夠重新定位，而且腺病毒基因組的其它基因也能全部或部分缺失。具體而言，E3基因、E2A基因和/或E4基因可能全部或部分缺失。在此使用時(shí)，不具體限制“全部或部分”的長(zhǎng)度，只要缺失不引起功能性蛋白質(zhì)產(chǎn)生。腺病毒基因組(如上述E3基因、E2A基因和E4基因)的核苷酸序列在參考文獻(xiàn)中已有描述(《腺病毒》，Ginsberg H.S.編寫(xiě)，1984，Plenum Press，紐約)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地進(jìn)行從腺病毒載體中缺失這些基因的方法。
通過(guò)在上述基因中缺失E3基因的全部或一部分，能夠插入更長(zhǎng)的外源基因。當(dāng)E3基因全部或部分缺失時(shí)，不需要在重組腺病毒載體復(fù)制的細(xì)胞中表達(dá)E3基因。另一方面，當(dāng)E2A和E4基因全部或部分缺失時(shí)，為了形成正常的病毒顆粒，必須導(dǎo)入先前缺失的基因，并使其在重組腺病毒載體復(fù)制的細(xì)胞中表達(dá)。
當(dāng)E4基因缺失時(shí)，優(yōu)選地保留E4基因的至少一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。特別是，優(yōu)選地保留E4基因的ORF3。在5型和2型腺病毒中，由于轉(zhuǎn)錄后的RNA剪切不同，E4基因編碼七種不同的多肽，ORF3是這些多肽之一。在腺病毒的多個(gè)循環(huán)中，ORF3具有促進(jìn)病毒基因表達(dá)和DNA復(fù)制的功能。另一方面，為使以下所述的一些CMV啟動(dòng)子的外源啟動(dòng)子在體內(nèi)長(zhǎng)期保留其啟動(dòng)子活性，E4基因的ORF3是必要的(Lusky M.等人，J.Virol.738308-8319(1999)，Yeew N.S.等人，Hum.Gene Ther.101833-1843(1999))?；谏鲜鲈颍瑑?yōu)選地保留ORF3。
不具體限制產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白IX重新定位的腺病毒載體的細(xì)胞系，只要它們表達(dá)E1基因，并且適于產(chǎn)生腺病毒載體，如來(lái)源于人胚胎腎細(xì)胞的293細(xì)胞(ATCC CRL-1573)。然而，如果在整合到細(xì)胞系染色體中的腺病毒DNA與載體基因組之間存在同源DNA序列，通過(guò)重源重組可能產(chǎn)生不希望的腺病毒。因此，為了產(chǎn)生這種腺病毒載體，優(yōu)選地使用只含E1基因最小部分的細(xì)胞系，使得載體基因組與細(xì)胞系染色體之間盡可能不存在重疊DNA序列。一個(gè)實(shí)例是來(lái)源于人胚胎視網(wǎng)膜(HER)的PER細(xì)胞系(Fallaux F.J.等人，Hum.Gene Ther.91909-1917(1998))。除了E1基因之外，必要時(shí)也可使用表達(dá)其它腺病毒基因(如E2A基因)的細(xì)胞系。表達(dá)其它腺病毒基因的細(xì)胞系可以如下構(gòu)建例如，向合適的表達(dá)載體中插入腺病毒基因，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法用這樣構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染表達(dá)E1基因的細(xì)胞。
本發(fā)明的重組腺病毒載體的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是一種腺病毒載體，其基因組缺失E1基因和蛋白IX基因，病毒顆粒中含有正常含量的蛋白IX。因此，包括具有下列特征(9)-(11)的重組腺病毒載體(9)腺病毒基因組的E1A和E1B基因和蛋白IX基因缺失；(10)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；和(11)含有含量類似于腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒。
這種載體在下文中可稱為“蛋白IX缺失的腺病毒載體”。
在上述(9)中，不具體限制蛋白IX基因缺失的范圍，只要缺失不引起蛋白IX的部分肽或來(lái)源于蛋白IX基因的肽表達(dá)。優(yōu)選地至少蛋白IX基因的全部編碼區(qū)缺失。此外，更優(yōu)選地病毒基因組的1.3-11.2m.u.缺失，并且E1基因和蛋白IX基因全部缺失。這些缺失能用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
為了產(chǎn)生蛋白IX缺失的腺病毒載體，需要表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系，該細(xì)胞系在下文說(shuō)明。
上述(10)中的外源基因優(yōu)選地插入E1基因缺失位點(diǎn)。更優(yōu)選地，外源基因插入病毒基因組1.3-11.3m.u.已經(jīng)缺失的位點(diǎn)，即E1基因和蛋白IX基因全部缺失的位點(diǎn)。如同上述蛋白IX重新定位的腺病毒載體，在蛋白IX缺失的腺病毒載體中，腺病毒E3基因也能全部或部分缺失，也能向E3基因缺失位點(diǎn)插入外源基因。
在上述(11)中，含有含量類似于腺病毒野生株的蛋白IX的病毒顆粒是指一種腺病毒顆粒，它含有與野生型腺病毒顆粒所含蛋白IX幾乎相同比例的蛋白IX。正常病毒顆粒是指保持細(xì)胞感染力的腺病毒顆粒，它們?cè)跓岱€(wěn)定性和能夠包裝的基因組DNA的大小方面具有與野生型腺病毒幾乎相同的特性。通過(guò)用蛋白IX缺失的腺病毒感染表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系，并使其復(fù)制，能夠產(chǎn)生這種病毒顆粒。
對(duì)于本發(fā)明的蛋白IX缺失的腺病毒載體，E1A和E1B基因以及蛋白IX基因能夠缺失，而且腺病毒基因組其它基因也能全部或部分缺失。特定缺失與上述蛋白IX重新定位的腺病毒載體相同，E3基因、E2A基因和/或E4基因能夠全部或部分缺失。在此使用時(shí)，不具體限制進(jìn)行缺失的“全部或部分”的長(zhǎng)度，只要缺失不引起功能性蛋白質(zhì)產(chǎn)生。腺病毒基因組(如上述E3基因、E2A基因和E4基因)的核苷酸序列在參考文獻(xiàn)中已有描述(《腺病毒》，Ginsberg H.S.編寫(xiě)，1984，Plenum Press，紐約)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地進(jìn)行從腺病毒載體中缺失這些基因的方法。
通過(guò)在上述基因中缺失E3基因的全部或一部分，能夠插入更長(zhǎng)的外源基因。當(dāng)E3基因缺失時(shí)，不需要在重組腺病毒載體復(fù)制的細(xì)胞中表達(dá)E3基因。另一方面，當(dāng)E2A基因和E4基因全部或部分缺失時(shí)，必須導(dǎo)入先前缺失的基因，并使其在重組腺病毒載體復(fù)制的細(xì)胞中表達(dá)。
當(dāng)E4基因缺失時(shí)，優(yōu)選地保留E4基因的至少一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。特別是，優(yōu)選地保留E4基因的ORF3。至于保留ORF3的優(yōu)點(diǎn)，參見(jiàn)蛋白IX重新定位的腺病毒載體部分。
對(duì)于以本發(fā)明的蛋白IX重新定位的腺病毒載體和蛋白IX缺失的腺病毒載體為代表的本發(fā)明的重組腺病毒載體，為了表達(dá)希望的外源基因，如治療基因，載體中必須含有外源啟動(dòng)子。對(duì)于外源啟動(dòng)子，只要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用，并且能夠以希望的量表達(dá)希望的基因，能夠不加限制地使用任何啟動(dòng)子，如動(dòng)物病毒來(lái)源的啟動(dòng)子、哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的啟動(dòng)子或這兩種啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子等。作為外源啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例，由于在許多情況下希望高水平地表達(dá)治療基因，優(yōu)選地使用所謂的高表達(dá)啟動(dòng)子，如CMV啟動(dòng)子(Foecking M.K.等人，Gene 45101-105(1986))和CAG啟動(dòng)子(Niwa H.等人，Gene 108193-200(1991))等。CMV啟動(dòng)子包含巨細(xì)胞病毒(CMV)直接早期(IE)基因的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，CAG啟動(dòng)子包含CMV的IE增強(qiáng)子、雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、兔β-珠蛋白的剪接受體和poly(A)序列。因此，CMV啟動(dòng)子和CAG啟動(dòng)子都含有CMV的IE基因的增強(qiáng)子(Boshart M.等人，Cell 41521-530(1985))。在此使用時(shí)，CMV的IE基因的增強(qiáng)子簡(jiǎn)稱為“CMV增強(qiáng)子”。
在以下實(shí)施例中說(shuō)明時(shí)，當(dāng)使用CMV啟動(dòng)子和CAG啟動(dòng)子(它們均含有CMV增強(qiáng)子)之一時(shí)，注意到蛋白IX基因表達(dá)的誘導(dǎo)。另一方面，當(dāng)使用EF-1α啟動(dòng)子(它不含CMV增強(qiáng)子)時(shí)，未發(fā)現(xiàn)蛋白IX基因表達(dá)的誘導(dǎo)。因此，應(yīng)當(dāng)理解，CMV啟動(dòng)子和CAG啟動(dòng)子共有的CMV增強(qiáng)子是引起腺病毒基因(如蛋白IX)表達(dá)誘導(dǎo)的因素。因此，認(rèn)為CMV增強(qiáng)子作用于啟動(dòng)子，如蛋白IX基因，結(jié)果是蛋白IX等表達(dá)。
根據(jù)啟動(dòng)子活性強(qiáng)度，現(xiàn)在進(jìn)行臨床研究的幾乎所有腺病毒載體都采用含有CMV啟動(dòng)子或CMV增強(qiáng)子的雜合啟動(dòng)子。因此，在臨床應(yīng)用中，可以十分有效地使用本發(fā)明的重組腺病毒載體，它們能減輕體內(nèi)施用后的炎癥。
除了上述含有CMV增強(qiáng)子的啟動(dòng)子之外，也能使用類似地來(lái)源于病毒的啟動(dòng)子，如SV40啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子(TakebeY.等人，Mol.Cell Biol.8466-472(1988))。
不具體限制插入本發(fā)明的腺病毒載體中的外源基因，可以使用編碼如細(xì)胞因子、酶、受體、病毒結(jié)構(gòu)蛋白等蛋白質(zhì)的基因，編碼反義RNA和核酶的基因等。
上述本發(fā)明的蛋白IX缺失的腺病毒載體甚至在表達(dá)E1基因但不表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系(如人胚胎腎細(xì)胞來(lái)源的293細(xì)胞)中也能夠復(fù)制。但是，由于不表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系產(chǎn)生的蛋白IX缺失的腺病毒載體在病毒顆粒中不含希望含量的蛋白IX，所以不可能獲得具有本發(fā)明目的特性的腺病毒載體。因此，為了產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白IX缺失的腺病毒載體，需要至少表達(dá)E1基因和蛋白IX的特殊細(xì)胞系。也就是說(shuō)，為了使本發(fā)明的蛋白IX缺失的腺病毒載體能夠復(fù)制，使用具有下列特征(12)和(13)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(12)表達(dá)腺病毒的E1基因和蛋白IX基因；和(13)能使蛋白IX缺失的腺病毒載體繁殖。
作為構(gòu)建表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系的一種方法，可以用含有蛋白IX基因的表達(dá)載體進(jìn)一步轉(zhuǎn)化表達(dá)E1基因的細(xì)胞系，如人胚胎腎細(xì)胞來(lái)源的293細(xì)胞(ATCC CRL-1573)，或者可以用含有E1基因的表達(dá)載體和含有蛋白IX基因的表達(dá)載體連續(xù)或同時(shí)轉(zhuǎn)化不表達(dá)E1基因的細(xì)胞。然而，由于用含有E1A、E1B和蛋白IX基因全部1.3-11.2m.u.的DNA片段轉(zhuǎn)化細(xì)胞不產(chǎn)生表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系，必須用在蛋白IX基因上游添加適當(dāng)啟動(dòng)子的DNA片段轉(zhuǎn)化。因?yàn)閾?jù)報(bào)道，盡管插入了含有全長(zhǎng)蛋白IX基因的5型人類腺病毒位點(diǎn)1-4344處的核苷酸(LouisN.，Virology 233423-429(1997))，但293細(xì)胞表達(dá)極少的蛋白IX(Krougliak V.等人，Hum.Gene Ther.61575-1586(1995))，而且，盡管插入了含有全長(zhǎng)蛋白IX基因的E1基因，但其它細(xì)胞系表達(dá)極少的蛋白IX(Fallaux F.J.等人，Hum.Gene Ther.91909-1917(1998))?？梢哉J(rèn)為，這些細(xì)胞不表達(dá)蛋白IX的原因是，當(dāng)E1B基因通過(guò)蛋白IX啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄時(shí)，蛋白IX基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制(Vales L.D.，Genes Dev.349-59(1989))。
關(guān)于表達(dá)本發(fā)明的蛋白IX的細(xì)胞系，不具體限制用于表達(dá)蛋白IX的啟動(dòng)子，可以是外源啟動(dòng)子或蛋白IX基因的原始啟動(dòng)子。當(dāng)使用外源啟動(dòng)子時(shí)，可以是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，只要目的細(xì)胞系能夠建立并保存，而且該細(xì)胞系中繁殖產(chǎn)生的蛋白IX缺失的腺病毒載體形成含有正常含量的蛋白IX的病毒顆粒。組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括CAG啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、EF-1α啟動(dòng)子、SRα啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(MLP)等。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子、小鼠乳腺癌病毒(MMTV)啟動(dòng)子等。此外，也能使用由四環(huán)素或蛻皮激素誘導(dǎo)組成型啟動(dòng)子表達(dá)的系統(tǒng).包括這種啟動(dòng)子的表達(dá)載體和表達(dá)誘導(dǎo)系統(tǒng)可以購(gòu)得，或者可從公開(kāi)機(jī)構(gòu)獲得。商品能購(gòu)自Invitrogen Inc.，Clontech Inc.等。
表達(dá)上述蛋白IX的細(xì)胞系能夠如下構(gòu)建通過(guò)PCR方法克隆蛋白IX基因的編碼區(qū)，將其插入市售表達(dá)載體(例如pcDNA3.1(+)，Invitrogen Inc.)，然后導(dǎo)入人胚胎腎細(xì)胞來(lái)源的293細(xì)胞，使細(xì)胞表達(dá)蛋白IX。詳見(jiàn)以下實(shí)施例。
此外，當(dāng)腺病毒E1基因和蛋白IX基因之外的腺病毒基因進(jìn)一步缺失的蛋白IX缺失的腺病毒載體將要復(fù)制時(shí)，有時(shí)可能需要進(jìn)一步表達(dá)這種缺失基因的細(xì)胞系。例如，當(dāng)腺病毒載體的E1基因、蛋白IX基因和E2A基因缺失時(shí)，使用表達(dá)這三種基因的細(xì)胞系。E2A基因能轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，使之以類似于上述蛋白IX基因所述的方式表達(dá)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員周知用上述細(xì)胞系構(gòu)建重組腺病毒載體的方法，例如可以用COS-TPC法(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA931320-1324(1996))進(jìn)行構(gòu)建。
因此，本發(fā)明的重組腺病毒載體的一個(gè)代表性實(shí)施方案是具有上述特征(1)-(4)的重組腺病毒載體，作為優(yōu)選實(shí)施方案，說(shuō)明了蛋白IX重新定位的腺病毒載體和蛋白IX缺失的腺病毒載體。上述之外的實(shí)施方案包括外源啟動(dòng)子已被修飾而不誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的重組腺病毒載體，或采用不誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的外源啟動(dòng)子的重組腺病毒載體。因此，本發(fā)明的重組腺病毒載體的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是具有下列特征(14)和(15)的重組腺病毒載體(14)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；和(15)腺病毒基因組中插入一種不誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的外源啟動(dòng)子。
在此使用時(shí)，“不誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的外源啟動(dòng)子”可以是至少不誘導(dǎo)蛋白IX基因表達(dá)的任何啟動(dòng)子。當(dāng)使用這種外源啟動(dòng)子時(shí)，蛋白IX基因不需要上述重新定位和/或缺失，只需要位于腺病毒基因組的原始位置。通過(guò)構(gòu)建插入含外源啟動(dòng)子的外源基因的重組腺病毒載體，并如實(shí)施例5所述研究在體內(nèi)施用后是否發(fā)生炎癥，或如實(shí)施例6所述進(jìn)行Northern印跡分析，能夠評(píng)估哪種外源啟動(dòng)子不誘導(dǎo)蛋白IX的表達(dá)。這種外源啟動(dòng)子至少不含CMV增強(qiáng)子，特別是EF-1α啟動(dòng)子(Kim D.W.等人，Gene 91217-223(1990))。關(guān)于EF-1α啟動(dòng)子不誘導(dǎo)蛋白IX表達(dá)并且不誘發(fā)炎癥的事實(shí)，見(jiàn)以下的實(shí)施例8和9。
而且，含有不誘導(dǎo)蛋白IX表達(dá)的外源啟動(dòng)子(如EF-1α啟動(dòng)子)的表達(dá)單元優(yōu)選地以朝左的方向插入(E1基因轉(zhuǎn)錄的相反方向)。因?yàn)楫?dāng)表達(dá)單元以朝右的方向插入時(shí)，由外源啟動(dòng)子開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄在正常位置不會(huì)終止，轉(zhuǎn)錄恐怕會(huì)延伸到蛋白IX基因。
此外，本發(fā)明的重組腺病毒載體的另一個(gè)實(shí)施方案是具有下列特征(19)-(21)的重組腺病毒載體(19)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(20)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；和(21)在外源啟動(dòng)子與腺病毒基因之間插入具有抑制外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的特性的堿基序列。
在此使用時(shí)，“具有抑制外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的特性的堿基序列”是指一種DNA序列，它具有抑制外源啟動(dòng)子中含有的增強(qiáng)子激活腺病毒基因組的啟動(dòng)子的活性。一個(gè)例子是以“scs”和“gypsy”為代表的隔離體(insulator)，它們最初是在果蠅(Drosophila)中發(fā)現(xiàn)的。隔離體是一種DNA序列，當(dāng)它位于增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間時(shí)，能阻止增強(qiáng)子激活啟動(dòng)子(Chung J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94575-580(1997)，Bell A.C.等人，Curr.Opin.Genet.Dev.9191-198(1999))。
因此，在插入到E1基因缺失位點(diǎn)的外源基因(含有增強(qiáng)子/啟動(dòng)子)的右側(cè)(MLP側(cè))插入一個(gè)隔離體的腺病毒載體不表達(dá)包括蛋白IX在內(nèi)的腺病毒蛋白質(zhì)，或者不誘發(fā)炎癥，甚至在腺病毒基因組的原始位置處存在蛋白IX基因時(shí)仍然如此。
隔離體的具體實(shí)施方案除了上述“scs”和“gypsy”外，還包括位于雞β-珠蛋白基因座5’HS4位點(diǎn)的約1.2kb的DNA片段(Chung J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94575-580(1997))和人T細(xì)胞受體α/δ基因座的BEAD-1(Bell A.C.等人，Curr.Opin.Genet.Dev.9191-198(1999))等。不具體限制插入本發(fā)明的腺病毒載體的隔離體，也不限制所用DNA片段的來(lái)源和大小等，只要隔離體具有不使外源增強(qiáng)子/啟動(dòng)子誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的功能。關(guān)于插入隔離體的腺病毒載體，曾經(jīng)報(bào)道了一種插入上述β-珠蛋白隔離體和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的腺病毒載體(Steinwaerder D.S.等人，Gene Ther.7556-567(2000))、插入牛生長(zhǎng)激素轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)中的隔離體和組織特異性啟動(dòng)子的腺病毒載體(Vassux G.等人，Gene Ther.61192-1197(1999))等。然而，它們均非用于抑制外源增強(qiáng)子/啟動(dòng)子引起的腺病毒基因表達(dá)，其目的在于抑制腺病毒增強(qiáng)子對(duì)外源啟動(dòng)子的激活。因此，對(duì)于兩篇報(bào)道中的腺病毒載體，沒(méi)有證據(jù)表明外源增強(qiáng)子/啟動(dòng)子引起的腺病毒基因表達(dá)受到抑制，因而這些報(bào)道本質(zhì)上不同于本發(fā)明，本發(fā)明是為了抑制腺病毒基因表達(dá)和炎癥的誘導(dǎo)，插入隔離體。
下面解釋了本發(fā)明的腺病毒載體的發(fā)明歷史。說(shuō)明了本發(fā)明的本質(zhì)的歷史，或第一代腺病毒載體引起的炎癥起因于外源啟動(dòng)子對(duì)腺病毒基因表達(dá)的誘導(dǎo)這一發(fā)現(xiàn)。
在此使用時(shí)，第一代腺病毒載體是指腺病毒E1基因缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒載體。第一代腺病毒載體只能在表達(dá)E1基因的細(xì)胞系(如293細(xì)胞)中復(fù)制。第一代腺病毒載體可能有或者可能沒(méi)有E3基因的缺失。
為了證明“第一代腺病毒載體引起的炎癥是由E2A基因(是一種腺病毒早期基因)的表達(dá)引發(fā)的”這一傳統(tǒng)假說(shuō)——也在“現(xiàn)有技術(shù)”部分作了解釋，發(fā)明者也構(gòu)建了一種E2A基因缺失的腺病毒載體。由于發(fā)明者構(gòu)建E2A缺失的腺病毒載體的方法已經(jīng)在日本未審查專利文本(kokai)號(hào)8-308585中公開(kāi)，此處只解釋構(gòu)建方法的概述。首先，我們構(gòu)建了第一代腺病毒載體(圖1，Ax2LD3LCAHGH)，其中在兩個(gè)位點(diǎn)(腺病毒L3基因和E2A基因之間(61.5m.u.)和E3基因缺失位點(diǎn)(78.0m.u.))之間插入一個(gè)loxP位點(diǎn)，該位點(diǎn)是P1噬菌體重組酶Cre的識(shí)別序列(Abremski K.等人，J.Biol.Chem.2591509-1514(1984)，HoessR.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811026-1029(1984))。通過(guò)用Ax2LD3LCAHGH和表達(dá)重組酶Cre的第一代腺病毒載體(圖1，AxCANCre)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，產(chǎn)生了一種E2A缺失的腺病毒載體(圖1，ΔE2A-CAHGH)，其中側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的E2A基因和L4基因被剪切。然后，通過(guò)氯化銫密度梯度超速離心，根據(jù)病毒顆粒的比重分離每種病毒，純化E2A缺失的腺病毒載體，純度為97-98％。向這種E2A缺失的腺病毒載體ΔE2A-CAHGH中插入表達(dá)單元，使得人生長(zhǎng)激素(hGH)能在上述CAG啟動(dòng)子控制下作為報(bào)道基因表達(dá)。而且還構(gòu)建了含有相同表達(dá)單元的第一代腺病毒載體(圖1，Ax1CAHGH)作為E2A缺失的腺病毒載體的對(duì)照載體。
然后證實(shí)這樣構(gòu)建的E2A缺失的腺病毒載體缺失E2A基因。ΔE2A-CAHGH或Ax1CAHGH感染的A549細(xì)胞(人肺癌來(lái)源的細(xì)胞系)中E2A基因編碼的DBP(單鏈DNA結(jié)合蛋白)的表達(dá)水平通過(guò)熒光抗體法比較，由于DBP的表達(dá)在ΔE2A-CAHGH感染的細(xì)胞中明顯降低，證實(shí)了E2A基因的缺失。此外，L3基因(屬于晚期基因)編碼的六鄰體(是病毒顆粒的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白)的表達(dá)水平類似地也用熒光抗體法比較，發(fā)現(xiàn)六鄰體的表達(dá)在ΔE2A-CAHGH感染的細(xì)胞中明顯降低。結(jié)果表明，傳統(tǒng)假說(shuō)“痕量表達(dá)的E2A基因激活腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(MLP)，從而主要晚期蛋白得到表達(dá)”在這點(diǎn)上是正確的。
因此，研究了注射E2A缺失的腺病毒載體的動(dòng)物的體內(nèi)炎癥反應(yīng)是否降低。對(duì)小鼠靜脈內(nèi)注射ΔE2A-CAHGH或Ax1CAHGH，測(cè)定肝臟釋放的酶GPT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)的血清水平作為炎癥指標(biāo)。首先，為了證實(shí)每種腺病毒載體的感染效率，測(cè)定腺病毒載體施用3天后的血清hGH水平。因?yàn)閮蓚€(gè)腺病毒載體施用組的血清hGH水平?jīng)]有顯著性差異，證實(shí)了兩種腺病毒載體對(duì)動(dòng)物的感染效率沒(méi)有差異。因此，用血清GPT水平作為指標(biāo)評(píng)價(jià)E2A缺失的腺病毒載體，發(fā)現(xiàn)與施用Ax1CAHGH的小鼠一樣，施用ΔE2A-CAHGH的小鼠血清GPT水平升高。而且某些小鼠在施用腺病毒載體后，以固定間隔制備肝切片進(jìn)行組織分析。施用Ax1CAHGH的小鼠在施用5天或更多天以后，觀察到炎癥反應(yīng)，如白細(xì)胞浸潤(rùn)肝臟，包括T細(xì)胞，和肝細(xì)胞的凋亡，在施用ΔE2A-CAHGH的小鼠中也觀察到類似的炎癥反應(yīng)。因此，施用這兩種腺病毒載體的小鼠在組織病理學(xué)上也沒(méi)有差異。
上述結(jié)果表明，E2A基因的缺失對(duì)減輕炎癥沒(méi)有作用。因此，關(guān)于E2A缺失的腺病毒載體與第一代腺病毒載體在誘發(fā)炎癥上沒(méi)有差異的原因，考慮以下4種可能性1)除E2A基因之外的腺病毒基因(如E4基因)由細(xì)胞產(chǎn)生的因子直接激活，表達(dá)的腺病毒蛋白質(zhì)自身誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，或者誘導(dǎo)另一種腺病毒蛋白質(zhì)表達(dá)，該蛋白質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，從而引起炎癥；2)用作報(bào)道基因的hGH蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，從而引起炎癥；3)插入載體中的外源啟動(dòng)子(CAG啟動(dòng)子)作為表達(dá)腺病毒蛋白質(zhì)的腺病毒啟動(dòng)子的增強(qiáng)子，該腺病毒蛋白質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，從而引起炎癥；和4)不是在載體感染的細(xì)胞中從頭合成的蛋白質(zhì)，而是構(gòu)成可侵入細(xì)胞的腺病毒顆粒的蛋白質(zhì)本身誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，從而引起炎癥。此外，腺病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞本身也是一種刺激，誘發(fā)炎性細(xì)胞因子等的產(chǎn)生，從而引起炎癥。
因此，為了闡明上述1)-4)中哪一個(gè)是E2A基因缺失的腺病毒載體不能減輕炎癥誘發(fā)的可能的原因，用下列4種腺病毒載體研究了炎癥的起因(a)表達(dá)hGH的第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH陽(yáng)性對(duì)照)(b)只插入CAG啟動(dòng)子、不含hGH cDNA的第一代腺病毒載體(圖1，AxCAwt也插入poly(A)序列)(c)未插入外源基因(如啟動(dòng)子)的第一代腺病毒載體(圖1，Axlwl)(d)紫外線滅活的腺病毒顆粒(Ax1CAHGH已滅活)。
對(duì)小鼠靜脈內(nèi)注射這4種載體，測(cè)定血清GPT水平。制備紫外線滅活的腺病毒顆粒的定義和方法細(xì)節(jié)在現(xiàn)有公開(kāi)文本中已有描述(Brinstiel M.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896094-6098(1992)，Birnstiel M.L.等人，Virology 205254-261(1994))，其定義簡(jiǎn)述如下。紫外線滅活的腺病毒顆粒是指這樣的腺病毒顆粒它們保留細(xì)胞感染力并且能侵入細(xì)胞，但是甚至在滅活前腺病毒能夠復(fù)制的細(xì)胞中也不能復(fù)制，被滅活為插入的外源基因不能表達(dá)的狀態(tài)。
總結(jié)結(jié)果，用紫外線滅活的腺病毒顆粒處理的小鼠和用未插入外源基因的Axlwl處理的小鼠，血清GPT水平根本未升高。另一方面，用只插入CAG啟動(dòng)子的AxCAwt處理的小鼠，血清GPT水平升高到類似于表達(dá)hGH的Ax1CAHGH處理小鼠的程度。由于在AxCAwt處理的小鼠中也發(fā)生炎癥，否定了2)的hGH蛋白是起因的可能性。此外，由于用紫外線滅活的腺病毒顆粒處理的小鼠不發(fā)生炎癥，否定了4)的腺病毒顆粒是起因的可能性。此外，由于Axlwl處理的小鼠不發(fā)生炎癥，否定了1)的原因單獨(dú)引起炎癥的可能性。因此，由于AxCAwt處理的小鼠發(fā)生程度上類似于Ax1CAHGH處理的小鼠的炎癥，但Axlwl處理的小鼠不發(fā)生炎癥，而AxCAwt與Axlwl結(jié)構(gòu)的唯一不同是存在或不存在CAG啟動(dòng)子，因此揭示了第一代腺病毒載體引起炎癥的原因是由3)中插入載體中的CAG啟動(dòng)子引起的。
因此，鑒定了由CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因，即與炎癥有關(guān)的腺病毒基因。用一種E2A缺失的腺病毒載體(ΔE2A-CAHGH)或上述(a)-(c)中的三種第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH、AxCAwt、Axlwl)以較高的moi(感染復(fù)數(shù))感染A549細(xì)胞(人肺癌來(lái)源的細(xì)胞系)或HepG2細(xì)胞(人肝癌來(lái)源的細(xì)胞系)，24小時(shí)后通過(guò)Northern印跡分析表達(dá)的腺病毒基因。研究其表達(dá)的腺病毒基因有下列8種基因早期基因E2A基因、E4基因；在主要晚期啟動(dòng)子(MLP)控制下的主要晚期基因L1、L2、L3、L5；晚早期基因蛋白IX、IVa2。希望的腺病毒，即由CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)并且與炎癥有關(guān)的腺病毒基因的定義是一種基因，如果向載體中插入CAG啟動(dòng)子，該基因在E2A缺失的腺病毒載體(ΔE2A-CAHGH)感染的細(xì)胞中表達(dá)，程度類似于第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH和AxCAwt)感染的細(xì)胞，但是在未插入CAG啟動(dòng)子的第一代腺病毒載體(Axlwl)感染的細(xì)胞中其表達(dá)極少誘導(dǎo)。
首先，在研究E2A基因的表達(dá)后，證實(shí)了本發(fā)明使用的E2A缺失的腺病毒載體中E2A基因完全缺失，因?yàn)樵讦2A-CAHGH感染的細(xì)胞中E2A基因極少表達(dá)，無(wú)論在其它3種第一代腺病毒載體感染的細(xì)胞中是否存在CAG啟動(dòng)子，基因表達(dá)程度幾乎相同。同時(shí)，還揭示了CAG啟動(dòng)子不誘導(dǎo)E2A基因的表達(dá)。另一種早期基因——E4基因，在4種腺病毒載體感染的所有細(xì)胞中幾乎程度相同地表達(dá)，從而也揭示了CAG啟動(dòng)子也不誘導(dǎo)E4基因的表達(dá)。
然后，研究了MLP控制的主要晚期基因的表達(dá)。對(duì)于HepG2細(xì)胞，在主要晚期基因中，3種基因(L2、L3和L5)的表達(dá)只在ΔE2A-CAHGH感染的細(xì)胞中降低，而對(duì)于A549細(xì)胞，ΔE2A-CAHGH感染的細(xì)胞和Axlwl感染的細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低。因此，不僅是在上述蛋白質(zhì)水平上，而且在基因水平上，傳統(tǒng)假說(shuō)“E2A基因誘導(dǎo)主要晚期基因的表達(dá)”都得到證實(shí)，但是證明了CAG啟動(dòng)子不誘導(dǎo)這些主要晚期基因的表達(dá)。此外，L1基因的表達(dá)隨所用細(xì)胞系的不同而不同。對(duì)于HepG2細(xì)胞，L1基因的表達(dá)只在ΔE2A-CAHGH感染的細(xì)胞中增強(qiáng)，未觀察到CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)。另一方面，對(duì)于A549細(xì)胞，L1基因的表達(dá)只在Axlwl感染的細(xì)胞中降低，觀察到CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)。
最后，研究了各自具有獨(dú)特啟動(dòng)子的兩種晚早期基因——IVa2基因和蛋白IX基因的表達(dá)。IVa2基因的表達(dá)模式隨對(duì)于L1基因所用的細(xì)胞系的不同而不同。因此，對(duì)于HepG2細(xì)胞，所有4種腺病毒載體感染的細(xì)胞都以幾乎相同的水平表達(dá)IVa2基因，而未注意到CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)。相反，對(duì)于A549細(xì)胞，IVa2基因的表達(dá)只在Axlwl感染的細(xì)胞中降低，注意到CAG啟動(dòng)子對(duì)表達(dá)的誘導(dǎo)。
另一方面，兩種細(xì)胞系的蛋白IX基因表達(dá)獲得相同的結(jié)果，在ΔE2A-CAHGH-、Ax1CAHGH-和AxCAwt-感染的細(xì)胞中，蛋白IX基因幾乎程度相同地表達(dá)，但在Axlwl感染的細(xì)胞中表達(dá)極低。因此，對(duì)于蛋白IX基因，明顯觀察到CAG啟動(dòng)子對(duì)表達(dá)的誘導(dǎo)。
根據(jù)上述結(jié)果，證明了明顯由CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因主要是蛋白IX基因。這強(qiáng)烈表明，蛋白IX基因的表達(dá)是體內(nèi)施用第一代腺病毒載體時(shí)發(fā)生炎癥的一個(gè)原因。
此外，根據(jù)上述結(jié)果，也證明了在某些細(xì)胞中，蛋白IVa2基因和L1基因的表達(dá)由CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)。由于蛋白IVa2基因含有獨(dú)立的啟動(dòng)子，預(yù)計(jì)它由CAG啟動(dòng)子直接激活。然而，L1基因是主要晚期基因之一，受與其它晚期基因(如L3基因和L5基因)共有的MLP調(diào)節(jié)，不能認(rèn)為CAG啟動(dòng)子只誘導(dǎo)L1基因的表達(dá)。然而，由于眾所周知L2-L5基因只在感染晚期表達(dá)，而周知L1基因也在感染早期表達(dá)(Shaw A.R.等人，Cell 22905-916(1980))，L1基因的表達(dá)只由CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)的原因可能是基于早期與晚期基因表達(dá)機(jī)制的不同。而且，由于據(jù)報(bào)道蛋白IX和蛋白IVa2都有激活MLP的作用(Lutz P.等人，J.Virol.715102-5109(1997)，Tribouley C.等人，J.Virol.684450-4457(1994))，可能是通過(guò)蛋白IX或蛋白IVa2間接激活MLP，而不是CAG啟動(dòng)子直接激活MLP。與蛋白IX基因表達(dá)的誘導(dǎo)相比，CAG啟動(dòng)子引起的蛋白IVa2基因和L1基因表達(dá)的程度較弱，但可能是通過(guò)與蛋白IX加合作用誘發(fā)炎癥。
然后，研究了CAG啟動(dòng)子的哪種成分誘導(dǎo)包括蛋白IX基因在內(nèi)的腺病毒基因表達(dá)。CAG啟動(dòng)子包含CMV的IE增強(qiáng)子、雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、兔β-珠蛋白的剪接受體和poly(A)序列。在本發(fā)明使用的腺病毒載體中，CAG啟動(dòng)子以朝左的方向(與E1轉(zhuǎn)錄相反的方向)插入E1基因的缺失位點(diǎn)中(1.3-9.2m.u.)，CAG啟動(dòng)子的插入方向與向右轉(zhuǎn)錄的蛋白IX基因(9.7-11.2m.u.)的方向相反。因此認(rèn)為誘導(dǎo)蛋白IX基因表達(dá)的可能不是β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，而是CMV的IE增強(qiáng)子。于是，利用插入含IE增強(qiáng)子部分(與CAG啟動(dòng)子的唯一共同成分)的CMV啟動(dòng)子的腺病毒載體(AdCMVlacZ)，研究了蛋白IX基因的表達(dá)。結(jié)果對(duì)于AdCMVlacZ感染的A549細(xì)胞，蛋白IX基因的表達(dá)水平幾乎類似于只插入CAG啟動(dòng)子的AxCAwt感染的細(xì)胞。因此，證實(shí)了CMV IE增強(qiáng)子(CMV增強(qiáng)子)誘導(dǎo)包括蛋白IX基因在內(nèi)的腺病毒基因的表達(dá)。
為了進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)果，利用插入EF-1α啟動(dòng)子(不含CMV增強(qiáng)子)的腺病毒載體(AxEFlacZ-L)研究了蛋白IX的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在AxEFlacZ-L感染的細(xì)胞中蛋白IX基因根本不表達(dá)。另外用插入CAG啟動(dòng)子和lacZ基因的腺病毒載體(AxCAlacZ-L)作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)測(cè)定接受靜脈內(nèi)施用腺病毒載體的小鼠的血清GPT水平比較AdCMVlacZ和AxEFlacZ-L引起的炎癥程度。結(jié)果證實(shí)，AdCMVlacZ處理的小鼠的血清GPT水平升高到等于或高于AxCAlacZ-L處理的小鼠的水平，而AxEFlacZ-L處理的小鼠的血清GPT水平升高極小。因此，不含CMV增強(qiáng)子的EF-1α啟動(dòng)子不能誘導(dǎo)蛋白IX的表達(dá)，表明在不誘導(dǎo)蛋白IX表達(dá)的腺病毒載體中不發(fā)生炎癥。
綜合以上一系列結(jié)果，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了傳統(tǒng)上不知的一個(gè)極其重要的新機(jī)制第一代腺病毒載體引起的炎癥是由于CMV增強(qiáng)子對(duì)腺病毒基因表達(dá)的誘導(dǎo)。
含有CMV增強(qiáng)子的啟動(dòng)子，如CMV啟動(dòng)子，由于高啟動(dòng)子活性，已經(jīng)用于當(dāng)前進(jìn)行臨床研究的多種腺病毒載體。例子包括采用CMV啟動(dòng)子本身的載體腫瘤抑制基因、表達(dá)p53的腺病毒載體(Clayman G.L.等人，J.Clin.Oncol.162221-2232(1998)，Swisher S.G.等人，J.Natl.Cancer Inst.91763-771(1999))、表達(dá)白介素-2的腺病毒載體(Stewart A.K.等人，Gene Ther.6350-363(1999))、表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF121的腺病毒載體(Rosengart T.K.等人，Circulation100468-474(1999))；采用含CMV IE增強(qiáng)子的雜合啟動(dòng)子的腺病毒載體的例子包括表達(dá)囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)的腺病毒載體(Knowles M.R.等人，N.Eng.J.Med.333823-831(1995)，Zuckerman J.B.等人，Hum.Gene Ther.102973-2985(1999))。
因此，發(fā)明者關(guān)于外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)引發(fā)炎癥的發(fā)現(xiàn)不是一種只限于含CAG啟動(dòng)子的重組腺病毒載體的現(xiàn)象，而是適用于當(dāng)前正在進(jìn)行臨床研究的其它許多腺病毒載體的廣泛現(xiàn)象。因此，根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，預(yù)計(jì)修飾后不能誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的腺病毒載體可減輕施用后的炎癥，從而持久表達(dá)治療基因，有極高的使用價(jià)值。
此外，本發(fā)明關(guān)于外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的發(fā)現(xiàn)可能不僅適用于含有CMV IE增強(qiáng)子的腺病毒載體而且適用于含有其它病毒啟動(dòng)子的腺病毒載體。這類啟動(dòng)子的例子包括RSV啟動(dòng)子、含有SV40早期基因增強(qiáng)子的啟動(dòng)子或SRα啟動(dòng)子等。
下面以蛋白IX重新定位的腺病毒載體和蛋白IX缺失的腺病毒載體為例，具體描述了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。
首先描述了構(gòu)建蛋白IX重新定位的腺病毒載體的方法。蛋白IX基因的核苷酸序列和位置在參考文獻(xiàn)中有描述(Maat J.等人，Gene 1027-38(1980))。不具體限制制備重新定位的蛋白IX基因的方法，可利用限制酶消化從含有蛋白IX基因的質(zhì)粒或粘粒上酶切(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996))，但是為了便于隨后的構(gòu)建，優(yōu)選地用PCR方法擴(kuò)增。將要擴(kuò)增的蛋白IX基因的范圍優(yōu)選地不僅含有蛋白IX基因的編碼序列而且含有5’-非翻譯區(qū)和3’-非翻譯區(qū)。5’-非翻譯區(qū)優(yōu)選地含有蛋白IX基因的啟動(dòng)子區(qū)，一個(gè)例子含有5型腺病毒位點(diǎn)3525和其后的序列，更優(yōu)選地位點(diǎn)3213和其后的序列。不具體限制3’-非翻譯區(qū)的范圍，只要它含有直到蛋白IX基因終止密碼子的堿基序列，可以在緊接終止密碼子之后添加另一種基因的poly(A)序列，或者可以采用蛋白IX基因的原始poly(A)序列。后者的一個(gè)例子是，優(yōu)選地含有聚腺苷酸化信號(hào)和含poly(A)實(shí)際添加位點(diǎn)的可達(dá)位點(diǎn)4070的堿基序列，更優(yōu)選地含有可達(dá)位點(diǎn)4076的堿基序列。不具體限制PCR引物的核苷酸序列，只要該序列能夠擴(kuò)增上述范圍內(nèi)的蛋白IX基因，但是為了便于在擴(kuò)增后向質(zhì)粒中克隆含有蛋白IX基因的DNA片段，優(yōu)選地含有適當(dāng)限制酶的識(shí)別序列。
含有PCR擴(kuò)增的蛋白IX基因的DNA片段可以直接插入腺病毒基因組的希望的位點(diǎn)，但是為了證實(shí)在PCR反應(yīng)中核苷酸序列不含突變，首先將擴(kuò)增的片段克隆到合適的質(zhì)粒等中，然后優(yōu)選地證實(shí)該核苷酸序列可以使用。不具體限制克隆擴(kuò)增片段的質(zhì)粒，例子包括pUC19等。
如上所述，重新定位蛋白IX基因的位點(diǎn)包括L3基因與E2A基因之間的位點(diǎn)，E3基因的缺失位點(diǎn)等，但是作為一個(gè)更優(yōu)選的例子，以下描述了一種在E4基因上游區(qū)與3’端ITR之間重新定位的方法。構(gòu)建蛋白IX基因重新定位于上述位點(diǎn)的腺病毒載體的一種方法是，用含有腺病毒基因組的質(zhì)?；蛘沉］d體轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞系，如293細(xì)胞，基因組結(jié)構(gòu)中蛋白IX基因從原始位置(9.7-11.2m.u.)缺失，插入E4基因上游區(qū)與3’端ITR之間，一步獲得希望的重組腺病毒載體。然而，另一種方法使用兩步法也是可能的，該方法首先構(gòu)建一種重組腺病毒，其中蛋白IX保留于原始位置，也在E4基因上游區(qū)與3’端ITR之間插入蛋白IX基因，然后刪除原始位點(diǎn)的蛋白IX基因，構(gòu)建蛋白IX基因重新定位的腺病毒載體。盡管后一種方法中包括多個(gè)步驟，但它肯定能獲得目的重組腺病毒載體，因此是一種優(yōu)選方法，這種構(gòu)建方法包括兩步，在下文詳述。以下描述的構(gòu)建重組腺病毒載體的方法是，用含有腺病毒基因組大部分和限制酶消化末端蛋白質(zhì)-腺病毒DNA復(fù)合物(DNA-TPC)獲得的DNA的粘粒載體轉(zhuǎn)化293細(xì)胞等，然后通過(guò)粘粒載體與腺病毒DNA-TPC之間的同源重組獲得目的重組腺病毒載體，其原理和步驟已在現(xiàn)有參考文獻(xiàn)(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996))和專利(日本未審查專利文本(Kokai)號(hào)7-298877)中公開(kāi)。
粘粒載體pAx4w是這樣一種載體，它含有5型腺病毒基因組的2.6-98.0m.u.(E3基因缺失)和2型腺病毒基因組的98.0-100m.u.，在E4基因啟動(dòng)子上游區(qū)與3’端ITR之間(99.3m.u.)含有一個(gè)限制酶SwaI位點(diǎn)作為克隆位點(diǎn)(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)，在該參考文獻(xiàn)中pAx4w描述為pAdex4w)。向pAx4w的SwaI位點(diǎn)插入通過(guò)上述PCR方法制備的蛋白IX基因，獲得粘粒載體pAx4pIX。另一方面，重組腺病毒載體Adex4SRlacZL是一種復(fù)制缺陷型腺病毒載體，它來(lái)源于5型腺病毒(E1A、E1B、E3基因缺失)，在與pAx4w相同的99.3m.u.位置處插入大腸桿菌lacZ基因的表達(dá)單元。用限制酶AseI和EcoRI消化，在基因組右半段消化幾次，由Adex4SRlacZL制備腺病毒基因組DNA，用從該DNA獲得的DNA-TPC和粘粒載體pAx4pIX轉(zhuǎn)化293細(xì)胞，然后產(chǎn)生重組腺病毒載體pAx4pIX，其中Adex4SRlacZL的大腸桿菌lacZ基因的表達(dá)單元已經(jīng)替換為蛋白IX基因。pAx4pIX是一種重組腺病毒載體，它在兩個(gè)位點(diǎn)處含有蛋白IX基因蛋白IX基因的原始位點(diǎn)和E4基因上游區(qū)與3’端ITR之間。
然后說(shuō)明了在蛋白IX基因原始位點(diǎn)處缺失的核苷酸序列的范圍。蛋白IX基因向右轉(zhuǎn)錄，而蛋白IX基因的3’-非翻譯區(qū)與向左轉(zhuǎn)錄的IVa2基因和E2B基因的3’-非翻譯區(qū)部分重疊，因此蛋白IX基因的缺失范圍必須是不影響IVa2基因和E2B基因功能的范圍。以5型腺病毒為例，認(rèn)為IVa2基因和E2B基因的聚腺苷酸化位點(diǎn)是位點(diǎn)4060處的基礎(chǔ)，缺失范圍必須在其左側(cè)更遠(yuǎn)。不限制缺失范圍，只要滿足這一條件并且蛋白IX不表達(dá)，一個(gè)例子是從5型腺病毒的PvuII位點(diǎn)(Ad5452-457)到AlwNI位點(diǎn)(Ad54048-4056)的缺失。含有缺失這段堿基的腺病毒基因組的載體能由粘粒載體pAxcw(日本未審查專利文本(Kokai)號(hào)8-308585，第15頁(yè)，pAdexlcw與pAxcw相同)構(gòu)建。pAxcw是一種粘粒載體，它含有5型腺病毒基因組的大部分，其中E1基因缺失(Δ454-3328)，以pAxcw作為原材料通過(guò)幾步構(gòu)建，能獲得粘粒載體pAxΔpIXcw，它含有從PvuII位點(diǎn)到AlwNI位點(diǎn)缺失的腺病毒基因組。pAxΔpIXcw是這樣一種載體，其中E1A、E1B和蛋白IX基因缺失(Δ454-4053)，缺失位點(diǎn)中插入一個(gè)用于外源基因的克隆位點(diǎn)(ClaI和SwaI位點(diǎn))。
用限制酶EcoT22I(在基因組左側(cè)含有多個(gè)識(shí)別位點(diǎn))消化由上述腺病毒Ax4pIX制備的基因組DNA，獲得DNA-TPC，用該DNA-TPC和上述粘粒載體pAxΔpIXcw轉(zhuǎn)化293細(xì)胞，能夠獲得蛋白IX基因重新定位的目的重組腺病毒載體pAxRpIXcw。該AxRpIXcw中沒(méi)有插入外源基因如啟動(dòng)子，插入任一種外源基因的蛋白IX重新定位的腺病毒載體能夠如下獲得使EcoT22I消化AxRpIXcw的基因組DNA獲得的DNA-TPC與在粘粒載體pAxΔpIXcw的SwaI位點(diǎn)或ClaI位點(diǎn)插入外源基因的粘粒載體同源重組。此外，插入任何外源基因的蛋白IX重新定位的腺病毒載體也能如下獲得使EcoT22I消化Ax4pIX的基因組DNA獲得的DNA-TPC與在粘粒載體pAxΔpIXcw的SwaI位點(diǎn)或ClaI位點(diǎn)插入外源基因的粘粒載體同源重組。
如上所述，以5型腺病毒為例，說(shuō)明了一種構(gòu)建蛋白IX重新定位的腺病毒載體的方法。重新定位的蛋白IX基因不需要采用來(lái)自相同血清型腺病毒的基因，能采用另一種血清型的蛋白IX基因，只要該蛋白質(zhì)在腺病毒復(fù)制循環(huán)中充分起作用。例如，2型蛋白IX基因重新定位于5型基本骨架的一種載體，或者相反，5型蛋白IX基因重新定位于2型基本骨架的一種載體。
然后說(shuō)明了一種構(gòu)建蛋白IX缺失的腺病毒載體的方法。為了構(gòu)建這種載體，需要表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系，因此說(shuō)明了一種構(gòu)建表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系的方法。不具體限制向細(xì)胞中導(dǎo)入的蛋白IX基因的范圍，只要它含有蛋白IX的編碼區(qū)。含有蛋白IX編碼區(qū)的DNA片段可通過(guò)限制酶消化從含有該基因的質(zhì)粒等上切下，或者可以通過(guò)PCR方法制備。不具體限制用于表達(dá)蛋白IX的啟動(dòng)子，可以使用在動(dòng)物細(xì)胞中組成型作用的啟動(dòng)子，或者可以使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。此外，也可以使用蛋白IX基因的原始啟動(dòng)子。通過(guò)用含有蛋白IX基因表達(dá)單元的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化任何細(xì)胞，能夠獲得表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系。然而，用于構(gòu)建該細(xì)胞系的細(xì)胞優(yōu)選地是表達(dá)腺病毒E1基因的細(xì)胞，該細(xì)胞能夠高效產(chǎn)生E1基因缺失的第一代腺病毒載體。這種細(xì)胞的例子包括293細(xì)胞。而且，為了防止載體基因組與細(xì)胞基因組的同源重組產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒(RCA)，優(yōu)選地使用只導(dǎo)入E1基因所需最小區(qū)域的細(xì)胞系構(gòu)建表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系。此外，首先由不表達(dá)E1基因的細(xì)胞構(gòu)建表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系，然后用E1基因轉(zhuǎn)化該細(xì)胞系，也能獲得希望的細(xì)胞系。不具體限制細(xì)胞轉(zhuǎn)化和目的細(xì)胞系選擇的方法，可以使用能為蛋白IX缺失的腺病毒載體提供足量蛋白IX的任何細(xì)胞系。
其次，更加具體地說(shuō)明了一種構(gòu)建蛋白IX缺失的腺病毒載體的方法。如對(duì)于蛋白IX重新定位的腺病毒載體所述，蛋白IX基因的缺失范圍可以是不影響IVa2基因和E2B基因功能并且不能使蛋白IX表達(dá)的任何范圍，其例子包括上述PvuII位點(diǎn)(Ad5452-457)到AlwNI位點(diǎn)(Ad54048-4056)的缺失。上述粘粒載體pAxΔpIXcw是一種對(duì)應(yīng)于此范圍腺病毒基因組缺失的載體。用限制酶如EcoT22I消化第一代腺病毒載體(如AxCAwt或Axlwl)的基因組DNA獲得DNA-TPC，用pAxΔpIXcw和這種DNA-TPC轉(zhuǎn)化上述表達(dá)蛋白IX的細(xì)胞系，能夠獲得蛋白IX缺失的目的腺病毒載體。這樣構(gòu)建的蛋白IX缺失的腺病毒載體AxΔpIXcw中未插入外源基因如啟動(dòng)子。然而，類似于蛋白IX重新定位的腺病毒載體，插入外源基因的蛋白IX缺失的腺病毒載體能夠如下獲得使在粘粒載體pAxΔpIXcw的SwaI位點(diǎn)或ClaI位點(diǎn)插入外源基因的粘粒載體與用EcoT22I等消化AxΔpIXcw的基因組DNA獲得的DNA-TPC重源重組。此外，插入外源基因的蛋白IX缺失的腺病毒載體也能如下獲得用EcoT22I消化第一代腺病毒載體(如AxCAwt和Axlwl)的基因組DNA獲得的DNA-TPC與在粘粒載體pAxΔpIXcw的SwaI位點(diǎn)或ClaI位點(diǎn)插入外源基因的粘粒載體同源重組。
如上所述，以5型腺病毒為例，說(shuō)明了一種構(gòu)建蛋白IX重新定位的腺病毒載體和蛋白IX缺失的腺病毒載體的方法。然而，本發(fā)明不限于5型腺病毒，適用于含有其它血清型的腺病毒骨架的任何腺病毒載體，包括2型腺病毒。
然后說(shuō)明了一種含有本發(fā)明的重組腺病毒載體作為活性成分的藥用組合物，和炎癥減輕的一種基因治療方法。如上所述獲得的本發(fā)明的重組腺病毒載體是一種十分安全的載體，當(dāng)對(duì)人施用時(shí)能夠減輕炎癥，并且能夠作為藥用組合物的活性成分用于多種疾病的基因治療。當(dāng)本發(fā)明的重組腺病毒載體作為藥用組合物時(shí)，根據(jù)所治療的疾病、靶器官等，能夠恰當(dāng)?shù)剡x用體內(nèi)或離體方法。在此使用時(shí)，體內(nèi)方法是將用于基因治療的藥用組合物直接導(dǎo)入患者體內(nèi)的方法，而離體方法是從患者中取出某些細(xì)胞，將上述藥用組合物離體導(dǎo)入該細(xì)胞中，然后將細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)的方法。
對(duì)于本發(fā)明的重組腺病毒載體，不具體限制體內(nèi)施用途徑，可以對(duì)患者器官(如肝臟、肺、腎、腦等)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈、皮下、經(jīng)皮膚或肌內(nèi)施用。也不具體限制用于體內(nèi)施用的劑型，例如，當(dāng)采用注射時(shí)，能夠用標(biāo)準(zhǔn)方法準(zhǔn)備注射。因此，在將本發(fā)明的重組腺病毒載體無(wú)菌溶解于合適的溶劑(緩沖液，如PBS、生理鹽水、無(wú)菌水等)中后，可以填充到無(wú)菌容器中備用。需要時(shí)可以向這種藥物制劑中添加常用的載體。
當(dāng)在離體方法中使用本發(fā)明的腺病毒載體時(shí)，不具體限制使用的細(xì)胞，可以使用用于預(yù)期用途的任何細(xì)胞，如白細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞，來(lái)自患者的不同腫瘤細(xì)胞，等等。
本發(fā)明的藥用組合物用于患者的劑量可以根據(jù)所治療的疾病、患者的年齡和體重等適當(dāng)確定。通常每次施用約106-1014(PFU)，優(yōu)選地約108-1012(PFU)本發(fā)明的重組腺病毒載體，或者連續(xù)幾天，或者約一個(gè)月一次。
如上所述，當(dāng)前正進(jìn)行臨床研究的腺病毒載體，已知有腫瘤抑制基因p53表達(dá)載體、白介素2表達(dá)載體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)121表達(dá)載體、囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)表達(dá)載體等。本發(fā)明的重組腺病毒載體能夠代替常規(guī)腺病毒載體，作為能夠減輕使用常規(guī)腺病毒載體引起的炎癥的載體。
例如，使用腫瘤抑制基因p53表達(dá)載體的臨床研究方案等在參考文獻(xiàn)中已有描述(Roth J.A.等人，Hum.Gene Ther.71013-1030(1996))，因而按照該方案能夠進(jìn)行本發(fā)明的基因治療。
本發(fā)明的重組腺病毒載體不僅可以用作人類基因治療藥物，而且可以用作向動(dòng)物轉(zhuǎn)移基因的載體。該方法可以按照上述人類基因治療方法進(jìn)行，如體內(nèi)和離體方法。
也可參考許多已知的公開(kāi)文本和以下所述的實(shí)施例。本發(fā)明的腺病毒載體的特征在于是一種能夠減輕炎癥的載體，具有甚至在用于動(dòng)物時(shí)仍優(yōu)于常規(guī)腺病毒載體的主要優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵谠S多用途中，如制備疾病動(dòng)物模型，人類疾病的治療模型，基因的功能分析等，不需要考慮載體的副作用，如炎癥。
下面將參照實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明決不限于這些實(shí)施例，可以進(jìn)行本發(fā)明領(lǐng)域常用的改變。除非另外說(shuō)明，這些實(shí)施例中處理噬菌體、質(zhì)粒、DNA、多種酶、大腸桿菌、培養(yǎng)的細(xì)胞等的方法根據(jù)“《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，T.Maniatis等人編寫(xiě)，第二版(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室”所述的方法進(jìn)行。
本發(fā)明實(shí)施例中使用的粘粒載體pAxCAwt(Kanegae Y.等人，Nucleic Acids Res.233816-3821(1995))和pAxcw(日本未審查專利文本(Kokai)號(hào)8-30858858，第15頁(yè)，pAdexlcw與pAxcw相同)是含有5型腺病毒基因組中除腺病毒E1和E3基因之外的大部分的載體。此外，pAxCAwt在E1基因缺失位點(diǎn)還導(dǎo)入一個(gè)CAG啟動(dòng)子(Niwa H.等人，Gene 108193-200(1991)，日本專利號(hào)2824434)，在該啟動(dòng)子與poly(A)序列之間有一個(gè)克隆位點(diǎn)。pAxcw只在E1基因缺失位點(diǎn)插入一個(gè)ClaI位點(diǎn)和一個(gè)SwaI位點(diǎn)。用這些粘粒載體和腺病毒DNA-末端蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)化293細(xì)胞(ATCC CRL-1573)和通過(guò)同源重組(COS-TPC法)構(gòu)建重組腺病毒載體的方法根據(jù)現(xiàn)有參考文獻(xiàn)(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996))和專利(日本未審查專利文本(Kokai)號(hào)7-298877)進(jìn)行。此外，除非另外說(shuō)明，通過(guò)超速離心純化腺病毒載體的方法(Kanegae Y.等人，Jpn.J.Med.Sci.Biol.47157-166(1994))和應(yīng)用293細(xì)胞通過(guò)有限稀釋測(cè)定病毒效價(jià)的方法(日本未審查專利文本(Kokai)號(hào)7-298877)也根據(jù)現(xiàn)有的方法進(jìn)行。
實(shí)施例1表達(dá)人生長(zhǎng)激素的腺病毒載體的構(gòu)建(1)人生長(zhǎng)激素cDNA的克隆為了通過(guò)PCR方法克隆人生長(zhǎng)激素cDNA，進(jìn)行下列方法。
由商品人垂體腺瘤來(lái)源的cDNA文庫(kù)(CLONTECH)制備噬菌體DNA，用作PCR的模板DNA。設(shè)計(jì)PCR引物，在兩端添加限制酶識(shí)別位點(diǎn)，5’端引物含有起始密碼子和一個(gè)NheI識(shí)別位點(diǎn)，3’端引物含有終止密碼子和一個(gè)SphI識(shí)別位點(diǎn)。每條引物的序列如下所示
5′-端引物5-TGGCTAGCTCACCTAGCGGCAATGGCT-3′NheIMet(SEQ ID NO1)3′-端引物5-CAGGCATGCCACCCGGGCAGCTAGAA-3′SphI 終止(SEQ ID NO2)用來(lái)源于上述cDNA文庫(kù)的DNA作為模板，在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中使用聚合酶pfu(Takara Shuzo)，獲得含有hGH cDNA的約700bp的擴(kuò)增片段。用Klenow酶使擴(kuò)增片段成為平端，插入pUC19的HincII位點(diǎn)，獲得質(zhì)粒pUCHGH(3.4kb)。通過(guò)對(duì)pUCHGH的cDNA部分測(cè)序證實(shí)該序列與參考文獻(xiàn)中所述的序列相同(Chen E.Y.等人，Genomics 4479-497(1989))。
(2)表達(dá)人生長(zhǎng)激素的重組腺病毒載體的構(gòu)建用NheI和BglI消化pUCHGH，使其成為平端，獲得含有hGHcDNA編碼區(qū)的約0.7kb DNA片段。將該cDNA片段插入粘粒載體pAxCAwt的啟動(dòng)子與poly(A)序列之間的SwaI位點(diǎn)，獲得粘粒pAx1CAHGH。
為了證實(shí)hGH的表達(dá)單元已經(jīng)精確整合到粘粒pAx1CAHGH中，由pAx1CAHGH構(gòu)建含有hGH的表達(dá)單元的質(zhì)粒，使得在COS7細(xì)胞(猴腎來(lái)源的細(xì)胞系)中瞬時(shí)表達(dá)hGH蛋白。用NruI消化后使pAx1CAHGH自身連接，獲得已經(jīng)去除腺病毒DNA大部分的表達(dá)hGH的質(zhì)粒Px1CAHGH(含有左端的約0.4kb)。然后通過(guò)DEAE-葡聚糖法用Px1CAHGH轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，兩天后用ELISA法(PicoiaTMHGH板Sumitomo Pharmaceuticals)測(cè)定條件培養(yǎng)基中hGH的濃度。在未導(dǎo)入質(zhì)粒的COS7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中，hGH濃度低于檢測(cè)限度，但在Px1CAHGH轉(zhuǎn)化的COS7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中檢測(cè)到1ng/ml或更高的hGH。此結(jié)果證實(shí)hGH的表達(dá)單元已經(jīng)精確整合到粘粒pAx1CAHGH中。
最后，通過(guò)上述COS/TPC法，用粘粒pAx1CAHGH和腺病毒DNA-末端蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)化293細(xì)胞，獲得表達(dá)hGH的重組腺病毒Ax1CAHGH(圖1，E1基因和E3基因缺失)。
實(shí)施例2表達(dá)hGH的E2A基因缺失的腺病毒載體的構(gòu)建(1)用于構(gòu)建E2A缺失的腺病毒載體的重組腺病毒載體的構(gòu)建粘粒載體pAx2LD3LCAwt(日本未審查專利文本(Kokai)號(hào)8-308585第19頁(yè)中的pAdex2LD3LCAwt，與pAx2LD3LCAwt相同)是上述粘粒載體pAxCAwt的衍生物。pAx2LD3LCAwt是在腺病毒L3基因與E2A基因之間(61.5圖距單位)和E3基因缺失位點(diǎn)(78.0圖距單位)插入loxP位點(diǎn)的一種粘粒，loxP插入位點(diǎn)之外的核苷酸序列與pAxCAwt相同。
用NheI和BglI消化實(shí)施例1中構(gòu)建的質(zhì)粒pUCHGH，使其成為平端，獲得含有hGH cDNA編碼區(qū)的約0.7kb DNA片段。該DNA片段插入粘粒載體pAx2LD3LCAwt的啟動(dòng)子與poly(A)序列之間的SwaI位點(diǎn)，獲得粘粒pAx2LD3LCAHGH。
腺病毒載體Adex2LD3LCANLacZ(圖1，日本未審查專利文本(Kokai)號(hào)8-308585，第21頁(yè))是一種重組腺病毒，其中在與粘粒載體pAx2LD3LCAwt相同的位置插入兩個(gè)loxP位點(diǎn)，它表達(dá)大腸桿菌β-半乳糖苷酶。
為了構(gòu)建Adex2LD3LCANLacZ的插入基因由lacZ替換為hGH的重組腺病毒，根據(jù)現(xiàn)有方法(日本未審查專利文本(Kokai)號(hào)7-298877)進(jìn)行下列方法。首先，由Adex2LD3LCANLacZ制備腺病毒DNA-末端蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后用EcoT221消化。用這種DNA-末端蛋白質(zhì)復(fù)合物和粘粒pAx2LD3LCAHGH轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得含有hGH表達(dá)單元和兩個(gè)loxP位點(diǎn)的重組腺病毒Ax2LD3LCAHGH(圖1)。該Ax2LD3LCAHGH與實(shí)施例1構(gòu)建的腺病毒載體Ax1CAHGH在結(jié)構(gòu)上除表達(dá)單元之外均相同。
(2)E2A缺失的腺病毒載體的構(gòu)建為了構(gòu)建通過(guò)重組酶Cre的作用從腺病毒載體Ax2LD3LCAHGH中刪除側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的E2A基因和L4基因的重組腺病毒(E2A缺失的腺病毒載體)，進(jìn)行下列方法。
首先，利用超速離心法(同上文)純化腺病毒載體Ax2LD3LCAHGH和表達(dá)重組酶Cre的腺病毒載體AxCANCre(圖1，Kanegae Y.等人，Nucleic Acids Res.233816-3821(1995))，利用293細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法(同上文)測(cè)定每種病毒的效價(jià)。
然后向膠原蛋白包被的225cm2培養(yǎng)瓶中幾乎鋪滿的293細(xì)胞中加入含有3.0×107PFU/ml Ax2LD3LCAHGH(moi＝2)和1.5×107PFU/mlAxCANCre(moi＝1)的4ml培養(yǎng)基(含有5％FCS的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基DMEM)，在37℃下感染兩種病毒1小時(shí)。感染后，加入21ml含有5％FCS的DMEM培養(yǎng)基，在5％CO2存在下37℃培養(yǎng)。兩天后，用細(xì)胞刮棒刮取附著于瓶底的細(xì)胞，將含有條件培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液置于50ml離心管中，在4℃下以2500轉(zhuǎn)/分(1130×g)離心5分鐘，棄去上清液后，細(xì)胞級(jí)分在-80℃下凍存。
(3)E2A缺失的腺病毒載體的純化盡管在用上述Ax2LD3LCAHGH和AxCANCre共感染的293細(xì)胞中產(chǎn)生表達(dá)hGH的E2A缺失的目的腺病毒載體(ΔE2A-CAHGH28.1kb)，但還存在Ax2LD3LCAHGH(34.4kb)和AxCANCre(34.7kb)，因而這三種病毒存在于一種混合物中(括號(hào)中的數(shù)字表示每種病毒的基因組大小)。因此，為了根據(jù)病毒比重的差異分離ΔE2A-CAHGH，進(jìn)行以下氯化銫(CsCl)密度梯度超速離心，純化E2A缺失的腺病毒載體。用于純化的CsCl溶液均在50mM Hepes緩沖液(pH7.4)中制備，離心和超速離心在4℃下進(jìn)行。
1)融化凍存于-80℃的含ΔE2A-CAHGH的293細(xì)胞級(jí)分，懸浮于25ml 50mM Hepes緩沖液(pH7.4)中，細(xì)胞來(lái)自8個(gè)225cm2搖瓶。然后將細(xì)胞懸液置于200ml超聲杯中，用密閉型超聲儀(Cosmo Bio生產(chǎn)，UCD-200T型)超聲處理(200W，3分鐘(30秒×6次)，4℃)。將細(xì)胞勻漿轉(zhuǎn)移到30ml離心管中，以10000轉(zhuǎn)/分(11850×g)離心10分鐘。對(duì)離心后的上清液進(jìn)行三步超速離心。
2)為了濃縮細(xì)胞勻漿中的腺病毒，8ml比重為1.43的CsCl溶液置于用于Beckman轉(zhuǎn)頭SW28的超速離心管中，使上述1)制備的約25ml上清液在其上分層，以23000轉(zhuǎn)/分(95400×g)超速離心約1.5小時(shí)。離心后，回收水相與CsCl相界面周圍的含腺病毒的帶(每管約2.5ml)，加入與回收的病毒溶液等量的飽和CsCl溶液。
3)在用于Beckman轉(zhuǎn)頭SW41的超速離心管中，下列溶液從底部連續(xù)分層。上述2)中制備的病毒溶液(約5ml)/比重為1.32的CsCl溶液(4.5ml)/比重為1.25的CsCl溶液(2.5ml)。以35000轉(zhuǎn)/分(210000×g)超速離心3小時(shí)。通過(guò)超速離心，蛋白質(zhì)在比重為1.25和1.32的CsCl溶液界面周圍形成一條寬帶，病毒在比重為1.32的CsCl溶液中部周圍形成一條銳帶，回收病毒帶(每管約1.5ml)，加入與回收的病毒溶液等量的比重為1.36的CsCl溶液。
4)向用于SW41的超速離心管中加入3)中制備的約2ml病毒溶液和10ml比重為1.34的CsCl溶液，充分混合，以30000轉(zhuǎn)/分(154000×g)超速離心約19小時(shí)。通過(guò)超速離心，根據(jù)每種病毒的比重，病毒帶均被分離。由于Ax2LD3LCAHGH(34.4kb)和AxCANCre(34.7kb)有幾乎相同的基因組大小，其比重幾乎相等，超速離心后的病毒帶重疊，而ΔE2A-CAHGH(28.1kb)比重小于這些病毒，通過(guò)超速離心在管的上部形成一條帶。用注射器針頭在超速離心管側(cè)面穿一個(gè)洞，回收ΔE2A-CAHGH帶。
5)最后，為了從病毒溶液中除去CsCl，使回收的病毒溶液對(duì)含有10％甘油的PBS(-)透析，獲得最終純化的ΔE2A-CAHGH產(chǎn)物。透析后的病毒等分后凍存于-80℃。
(4)E2A缺失的腺病毒載體的感染效價(jià)和純度的測(cè)定1)感染效價(jià)的測(cè)定由于E2A缺失的腺病毒載體在293細(xì)胞中不能復(fù)制，所以不能象第一代腺病毒載體(E1基因缺失)那樣，利用在293細(xì)胞中的復(fù)制作為指標(biāo)，用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定其效價(jià)。于是，以報(bào)道基因產(chǎn)物hGH的量作為指標(biāo)，比較效價(jià)已知的表達(dá)hGH的第一代腺病毒載體Ax1CAHGH與ΔE2A-CAHGH的hGH產(chǎn)量，測(cè)定ΔE2A-CAHGH的相對(duì)效價(jià)(感染效價(jià))。
將要檢測(cè)的腺病毒載體用含有2％FCS的DMEM培養(yǎng)基連續(xù)稀釋，然后將50μl加入在96孔微孔板中培養(yǎng)的A549細(xì)胞(人肺癌來(lái)源的細(xì)胞系)中，37℃感染1小時(shí)。然后除去病毒溶液，細(xì)胞用培養(yǎng)基洗滌一次，加入100μl含2％FCS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。培養(yǎng)完成后，利用ELISA法(PicoiaTMHGH板Sumitomo Pharmaceuticals)測(cè)定條件培養(yǎng)基中的hGH量。
首先，用第一代腺病毒載體Ax1CAHGH進(jìn)行預(yù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)病毒感染期間在moi＝0.01-1的范圍內(nèi)，添加的病毒量與hGH產(chǎn)量相關(guān)，證實(shí)hGH的產(chǎn)量反映添加的病毒量。
因此，用效價(jià)已知的Ax1CAHGH(B批，效價(jià)3.0×1010PFU/ml)作為對(duì)照病毒，測(cè)定ΔE2A-CAHGH(第3批)的感染效價(jià)。感染中每種病毒的稀釋比為30000、90000和270000倍，比較兩天后hGH的產(chǎn)量。在任一稀釋比，Ax1CAHGH(B批)的hGH產(chǎn)量都高于ΔE2A-CAHGH(第3批)，平均約1.1倍。因此，ΔE2A-CAHGH(第3批)的效價(jià)計(jì)算為3.0×1010PFU/ml×1/1.1＝2.7×1010PFU/ml(等價(jià))。
根據(jù)該值計(jì)算ΔE2A-CAHGH(第3批)的總產(chǎn)量，來(lái)自48個(gè)225cm2搖瓶的293細(xì)胞產(chǎn)生4.7×1010PFU(等價(jià))的病毒。而且，根據(jù)純化病毒的260nm吸光度測(cè)定，ΔE2A-CAHGH的顆粒與噬斑形成單位(PFU)之比為63。
對(duì)另一批ΔE2A-CAHGH進(jìn)行類似的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)來(lái)自20個(gè)225cm2搖瓶的293細(xì)胞的ΔE2A-CAHGH(第2批)總產(chǎn)量為1.9×1010PFU(等價(jià))病毒，顆粒與噬斑形成單位(PFU)之比為47。
2)純度的測(cè)定盡管E2A缺失的腺病毒載體通過(guò)超速離心純化，但仍有純化不能除去的第一代腺病毒載體(Ax2LD3LCAHGH和AxCANCre)的輕微污染。由于污染的第一代腺病毒載體能在293細(xì)胞中復(fù)制，利用293細(xì)胞通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(有限稀釋法)測(cè)定的效價(jià)反映了污染的第一代腺病毒載體的量。因此，為了測(cè)定ΔE2A-CAHGH(第3批)的純度，利用293細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法測(cè)定效價(jià)。ΔE2A-CAHGH(第3批)的效價(jià)是7.8×108PFU/ml，Ax1CAHGH(B批)的效價(jià)為4.4×1010PFU/ml，比例為1.8％。由于根據(jù)1)的結(jié)果，Ax1CAHGH(B批)的感染效價(jià)是ΔE2A-CAHGH(第3批)的1.1倍，修正該值，ΔE2A-CAHGH(第3批)的純度計(jì)算為(1-0.018×1.1)×100＝98％。
通過(guò)類似的測(cè)定，另一批(第2批)ΔE2A-CAHGH的純度為97％。
(5)E2A缺失的腺病毒載體的腺病毒蛋白表達(dá)降低的證實(shí)對(duì)于用E2A缺失的腺病毒載體感染的細(xì)胞，用熒光抗體法測(cè)定E2A基因編碼的DBP(單鏈DNA結(jié)合蛋白)和六鄰體(腺病毒顆粒的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白)的表達(dá)是否降低。
向膠原蛋白包被的8孔培養(yǎng)片(Becton Dickinson，#40630)中培養(yǎng)的鋪滿的A549細(xì)胞中，加入100μl含ΔE2A-CAHGH或Ax1CAHGH的病毒溶液，這兩種載體用含5％FCS的DMEM培養(yǎng)基稀釋為moi＝100或10，在37℃下感染1小時(shí)。感染后，棄去病毒溶液，加入0.3ml含5％FCS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)兩天。兩天后，棄去條件培養(yǎng)基，用PBS(-)洗滌細(xì)胞，加入0.4ml 2％低聚甲醛/PBS(-)，細(xì)胞在室溫下固定10分鐘，用PBS(-)洗滌兩次。另外，用1mg/ml皂苷進(jìn)行膜通透性處理(室溫，30分鐘)，之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DBP或六鄰體檢測(cè)。
為了檢測(cè)DBP，在用10％正常山羊血清封閉載玻片后，兔抗-DBP肽(RPPTMEDVSSPSPSPPPPRAPPKKR；對(duì)應(yīng)于DBP位點(diǎn)22-46的氨基酸殘基)抗體和FITC-標(biāo)記的山羊抗-兔抗體(JACKSON，#111-096-003)連續(xù)反應(yīng)，用DAPI(4’，6-二氨基-2-苯基-吲哚)溶液進(jìn)行核染色，在落射光熒光顯微鏡(Olympus BX-50)下檢查。
為了檢測(cè)六鄰體，在用10％正常山羊血清封閉載玻片后，山羊抗-六鄰體抗體(CHEMICON，AB-1056)和FITC-標(biāo)記的兔抗-山羊抗體(Vector Laboratories，F(xiàn)I-5000)連續(xù)反應(yīng)，用DAPI進(jìn)行核染色，在落射光熒光顯微鏡下檢查。
在ΔE2A-CAHGH感染的細(xì)胞中，DBP和六鄰體的表達(dá)水平明顯降低，用ΔE2A-CAHGH以moi＝100感染的細(xì)胞中DBP陽(yáng)性和六鄰體陽(yáng)性細(xì)胞之比與用Ax1CAHGH以moi＝10感染的細(xì)胞幾乎相同。因此，如開(kāi)始時(shí)預(yù)期的那樣，證實(shí)ΔE2A-CAHGH中腺病毒基因的表達(dá)降低。
實(shí)施例3E2A缺失的腺病毒載體的炎癥誘發(fā)作用的研究為了確定腺病毒E2A基因的缺失是否導(dǎo)致炎癥誘發(fā)作用降低，對(duì)小鼠注射表達(dá)hGH的E2A缺失的腺病毒載體(ΔE2A-CAHGH)或表達(dá)hGH的第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH)，以血清GPT水平(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)為指標(biāo)，比較兩種腺病毒載體誘發(fā)炎癥的作用。方法與結(jié)果如下所示。
(1)方法使用的小鼠是C57BL/6小鼠(7周齡，雌性)。使用的腺病毒載體是ΔE2A-CAHGH(第3批)或Ax1CAHGH(C批)。腺病毒載體的劑量為1×109PFU、3×108PFU或1×108PFU(每組5只動(dòng)物)，鹽水稀釋的腺病毒載體以每只小鼠0.2ml的量通過(guò)尾靜脈施用。腺病毒載體施用3天前和3、5、7、10、14、21、28、35、42、49、56、63天后，用肝素化的血球壓積管從乙醚麻醉的動(dòng)物的眼窩靜脈部分采血。血液以10000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘分離血清，貯存于-20℃直到使用。用轉(zhuǎn)氨酶CII-試驗(yàn)Wako(Wako Pure Chemicals)通過(guò)POP-TOOS法測(cè)定血清GPT水平。
(2)結(jié)果對(duì)C57BL/6小鼠施用腺病毒載體后以固定間隔測(cè)定的血清GPT水平的平均值示于圖2中。為了證實(shí)每個(gè)處理組中載體的施用效率，也在腺病毒載體施用3天后和5天后測(cè)定血清hGH水平。在用相同劑量的腺病毒載體處理的組中，Ax1CAHGH處理組與ΔE2A-CAHGH處理組的血清hGH水平?jīng)]有顯著差異，證實(shí)這兩種載體以相同的效率施用。
然后測(cè)定了血清GPT水平。對(duì)于ΔE2A-CAHGH處理的小鼠，血清GPT水平隨腺病毒載體劑量升高而升高，與用第一代腺病毒載體處理的小鼠沒(méi)有差異。此結(jié)果表明，腺病毒E2A基因的缺失不會(huì)導(dǎo)致減輕炎癥誘發(fā)作用。
實(shí)施例4紫外線滅活的腺病毒顆粒的制備為了闡明對(duì)小鼠施用腺病毒載體時(shí)發(fā)生的炎癥是否由腺病毒載體本身引起，用下列方法制備紫外線滅活的腺病毒顆粒。
向通過(guò)實(shí)施例2-(2)所述方法純化的1.8ml表達(dá)hGH的腺病毒載體Ax1CAHGH(3.0×1010PFU/ml，1.4×1012顆粒/ml)中加入18μl33mg/ml 8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP)(8-MOP的終濃度為330μg/ml)，然后按0.6ml等分到三個(gè)直徑35mm的組織培養(yǎng)皿(Sumitomo Bakelite，目錄號(hào)MS-10350)中。將培養(yǎng)皿置于冰上，置于配備有波長(zhǎng)365nm的紫外燈(8瓦，5只燈)的紫外交聯(lián)儀(1800型StratalinkerTM紫外交聯(lián)儀，STRATAGENE)的紫外燈下5cm，使蓋保持關(guān)閉。紫外線照射1小時(shí)(紫外線強(qiáng)度約為1.8kW)，每10分鐘改變一次培養(yǎng)皿的位置。紫外線照射后，從培養(yǎng)皿中回收病毒溶液，為了除去8-MOP，對(duì)含10％甘油的PBS(-)透析過(guò)夜。最后，回收顆粒濃度為1.1×1012顆粒/ml的約1.7ml病毒溶液，貯存于-80℃。
通過(guò)上述處理滅活腺病毒載體用兩種測(cè)定hGH產(chǎn)量和測(cè)定效價(jià)的方法證實(shí)。hGH產(chǎn)量的測(cè)定用以上實(shí)施例2-(4)所述的方法進(jìn)行，不同之處在于在腺病毒載體感染1天后測(cè)定hGH的濃度。在紫外線滅活前用1×105顆粒/ml的腺病毒載體Ax1CAHGH感染的細(xì)胞的hGH產(chǎn)量約為0.2ng/ml，用1×1010顆粒/ml感染的細(xì)胞的產(chǎn)量約為28μg/ml。另一方面，對(duì)于上述滅活的腺病毒載體，在用1×1010顆粒/ml感染時(shí)，hGH的產(chǎn)量為0.4ng/ml。因而根據(jù)計(jì)算hGH的產(chǎn)量，證實(shí)滅活使腺病毒載體的感染力下降為1/105。效價(jià)測(cè)定也通過(guò)使用293細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。滅活前病毒的效價(jià)約為3×1010PFU/ml，而滅活后的效價(jià)低于2×103PFU/ml，因而病毒的效價(jià)下降為1/107或更低。
上述結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的接受紫外線照射處理的病毒(紫外線照射的腺病毒顆粒)被完全滅活。
實(shí)施例5關(guān)于第一代腺病毒載體施用后炎癥起因的研究實(shí)施例3顯示，甚至在對(duì)小鼠施用E2A缺失的腺病毒載體時(shí)，處理小鼠的血清GPT水平與用第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH)處理的小鼠相比仍不降低。對(duì)于此結(jié)果的解釋，考慮以下四種可能性1)E2A基因的表達(dá)與炎癥無(wú)關(guān)，2)作為報(bào)道分子的hGH蛋白是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的抗原，從而引起炎癥，3)由外源啟動(dòng)子(CAG啟動(dòng)子)誘導(dǎo)表達(dá)的病毒基因產(chǎn)物作為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的抗原，4)不是在感染動(dòng)物中從頭合成的病毒蛋白，而是在病毒感染過(guò)程中進(jìn)入細(xì)胞的病毒顆粒組成型蛋白，作為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的抗原。
于是，對(duì)小鼠施用不同結(jié)構(gòu)的腺病毒，通過(guò)測(cè)定血清GPT水平作為指標(biāo)，研究第一代腺病毒載體施用后炎癥的起因。所用的腺病毒載體、實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下所示。
(1)腺病毒載體使用的腺病毒載體如下所示。均為第一代腺病毒載體。
-表達(dá)hGH的腺病毒載體Ax1CAHGH-只插入CAG啟動(dòng)子而不含hGH cDNA的腺病毒載體AxCAwt(圖1也插入poly(A)序列)(Kanegae Y.等人，Nucleic AcidsRes.233816-3821(1995))-無(wú)外源基因(如啟動(dòng)子)插入的腺病毒載體(只插入限制酶SwaI位點(diǎn))Axlwl(圖1Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)，在該參考文獻(xiàn)中描述為Adexlw)-通過(guò)紫外線照射Ax1CAHGH滅活的病毒紫外線滅活的顆粒(見(jiàn)實(shí)施例4)
該方法與實(shí)施例3所示基本相同。以下只描述了不同之處。
載體的劑量為1×109PFU、3×108PFU、1×109PFU或3×107PFU(每組5只動(dòng)物)。由于不能根據(jù)PFU確定紫外線滅活的腺病毒顆粒的劑量，它們以顆粒數(shù)相同的量施用。
施用前3天及施用后第3、5、7、10(或11)、14、21、28天采血。
(3)結(jié)果實(shí)驗(yàn)分開(kāi)進(jìn)行兩輪。第一輪，比較Ax1CAHGH和AxCAwt(圖3，上面的柱圖)。第二輪，比較Ax1CAHGH、Axlwl和紫外線滅活的腺病毒顆粒(圖3，下面的柱圖)。在這兩輪中，只施用用于稀釋載體的鹽水的組作為陰性對(duì)照。在圖3中，鹽水處理組的數(shù)據(jù)只來(lái)自第一輪，但在第二輪獲得類似的結(jié)果。
在CAG啟動(dòng)子控制下表達(dá)hGH的腺病毒載體(Ax1CAHGH)處理組，和只含CAG啟動(dòng)子的腺病毒載體(AxCAwt)處理組，它們?cè)谘錑PT水平升高程度上有極小的差異。因此證明，報(bào)道基因hGH的表達(dá)與炎癥無(wú)關(guān)。另一方面，未插入外源基因的腺病毒載體(Axlwl)處理組，和紫外線照射的腺病毒顆粒處理組，血清GPT水平不升高。由于AxCAwt與Axlwl的結(jié)構(gòu)差異只是存在或不存在CAG啟動(dòng)子和poly(A)序列，說(shuō)明血清GPT水平升高的原因，即炎癥的原因，是CAG啟動(dòng)子。
實(shí)施例6由CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因的鑒定對(duì)于第一代腺病毒載體，為了鑒定由CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)從而引發(fā)炎癥的腺病毒基因，用以下所示的不同腺病毒載體感染第一代腺病毒載體在其中不能復(fù)制的細(xì)胞系(A549細(xì)胞或HepG2細(xì)胞)，并通過(guò)Northern印跡法分析表達(dá)的腺病毒基因。用于該研究的腺病毒載體是含CAG啟動(dòng)子的第一代腺病毒載體(Ax1CAHGH、AxCAwt)，不含外源啟動(dòng)子的第一代腺病毒載體(Axlwl)，和含CAG啟動(dòng)子的E2A缺失的腺病毒載體(ΔE2A-CAHGH)。在此使用時(shí)，目的腺病毒基因，即CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)其表達(dá)的基因，是在三種載體(Ax1CAHGH、AxCAwt、ΔE2A-CAHGH)感染的細(xì)胞中相同程度地表達(dá)，但在Axlwl感染的細(xì)胞中極少表達(dá)的腺病毒基因。方法與結(jié)果如下所示。
(1)方法在25cm2培養(yǎng)瓶中幾乎鋪滿的(約5×106個(gè)細(xì)胞)A549細(xì)胞(人肺癌來(lái)源的細(xì)胞系)或HepG2細(xì)胞(人肝癌來(lái)源的細(xì)胞系)用以含5％FCS的DMEM培養(yǎng)基稀釋的各0.3ml腺病毒載體感染1小時(shí)(moi＝100)。感染后，棄去病毒溶液，加入5ml含5％FCS的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后，棄去條件培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS(-)洗滌兩次，然后用ISOGEN(Nippongene)洗滌，按照使用說(shuō)明由每種病毒感染的細(xì)胞制備RNA。
用于Northern印跡分析的探針如下獲得以粘粒載體pAxcw(同上文)為模板，利用BcaBESTTM標(biāo)記試劑盒(Takara Shuzo)以[α-32P]dCTP標(biāo)記PCR擴(kuò)增的DNA。用于PCR的引物序列如下所示(括號(hào)中的數(shù)值表示5型腺病毒的堿基數(shù)和序列數(shù))L15′-引物 5′-ACTGCGGCTAATGGTGACTGAGACA-3′(12,818-12,842/序列 3)3′-引物 5′-CGGCCGCGCGATGCAAGTAGTCCAT-3′(13,440-13,416/序列 4)L25′-引物 5′-AGCGGCGCGGAAGAGAACTCCAACG-3′(15,098-15,122/序列 5)3′-引物 5′-ATGCCCAGGGCCTTGTAAACGTAGG-3′(15,834-15,810/序列 6)L35′-引物 5′-GGGCTCCAGTGAGCAGGAACTGAAA-3′(21,735-21,759/序列 7)
3′-引物5′-CTGCGCACTGTGGCTGCGGAAGTAG-3′(22,305-22,281/序列 8)L55′-引物5′-GACCCCTCACAGTGTCAGAAGGAAA-3′(31,484-31,508/序列 9)3′-引物5′-GCCAAACAGCCTTTAACAGCCAAAA-3′(32,378-32,354/序列 10)pIX5′-引物 5′-ATGAGCACCAACTCGTTTGATG-3′(3,609-3,630/序列 11)3′-引物5′-TGTTTTAAACCGCATTGGGAGGGGA-3′(4,035-4,011/序列 12)Iva25′-引物 5′-AAGAACTTGGAGACGCCCTTGTGA-3′(4,554-4,577/序列 13)3′-引物5′-TGTGGGACCGCCTGGAACTGCTTG-3′(5,181-5,158/序列 14)E45′-引物5′-GGCAGTGGTCTCCTCAGCGA-3′(33,301-33,320/序列 15)3′-引物5′-TGAGGAAGTGTATGCACGTG-3′(33,800-33,781/序列 16)E2A5′-引物 5′-TGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTA-3′(22,769-22,798/序列 17)3′-引物5′-GTATGCGGACGCAAGAGGAAGAGGAAGAGC-3′(23,584-23,555/序列 18)
各5μg RNA進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳后，用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法在尼龍濾紙(Hybond-N+，Amersham)上印跡，然后進(jìn)行紫外線交聯(lián)。用0.02％亞甲基藍(lán)溶液使濾紙染色，證實(shí)28S和18S RNA的位置，加入50ml緩沖液A(0.5M Na2HPO4(pH7.2)7％SDS/1mM EDTA)，在65℃下預(yù)雜交2小時(shí)。然后向?yàn)V紙?zhí)砑雍?2.5ng32P-標(biāo)記探針的50ml緩沖液A，在65℃下雜交過(guò)夜。此外，還加入200ml緩沖液B(40mMNa2HPO4(pH7.2)/1％SDS)，在65℃下洗滌濾紙兩次后，進(jìn)行放射自顯影。
(3)結(jié)果Northern印跡結(jié)果示于圖4A-C中，結(jié)果概述示于表1中。對(duì)于A549細(xì)胞，由腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(MLP)控制的主要晚期基因(如含六鄰體的L3基因)在Axlwl感染的細(xì)胞中的表達(dá)比在AxCAwt感染的細(xì)胞中明顯降低，在ΔE2A-CAHGH感染的細(xì)胞中類似地降低(圖4A)。此外，對(duì)于HepG2細(xì)胞，L3基因的表達(dá)只在ΔE2A-CAHGH感染的細(xì)胞中降低。盡管數(shù)據(jù)未顯示，但其它主要晚期基因(如L2基因和L5基因)的結(jié)果類似于L3基因，對(duì)于這些晚期基因，沒(méi)有注意到CAG啟動(dòng)子對(duì)表達(dá)的誘導(dǎo)。
盡管在ΔE2A-CAHGH感染的細(xì)胞中，E2A基因的表達(dá)自然降低，但是在Axlwl感染的細(xì)胞和AxCAwt感染的細(xì)胞中，E2A基因的表達(dá)沒(méi)有差異，在這兩種病毒感染的細(xì)胞中E2A基因以相似的水平表達(dá)。E4基因的表達(dá)在所有載體感染的細(xì)胞中都沒(méi)有差異，E4基因在所有病毒感染的細(xì)胞中均以相似的水平表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。因此證明，E2A基因的表達(dá)和E4基因的表達(dá)都不是由CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)的。
對(duì)于HepG2細(xì)胞，IVa2基因(是一種不受MLP控制的晚早期基因)的表達(dá)在Axlwl感染的細(xì)胞中和在AxCAwt感染的細(xì)胞中沒(méi)有差異，在兩種細(xì)胞中均程度相似地表達(dá)。另一方面，對(duì)于A549細(xì)胞，IVa2基因的表達(dá)只在Axlwl感染的細(xì)胞中降低(圖4B)。
L1基因(受MLP控制的晚期基因之一)的表達(dá)也類似于IVa2基因，在HepG2細(xì)胞和A549細(xì)胞中結(jié)果不同(見(jiàn)表1)。
另一方面，蛋白IX基因(下文稱為pIX基因，如IVa2基因一樣，是一種不受MLP控制的晚早期基因)的表達(dá)在A549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中得到類似的結(jié)果。因此，pIX基因的表達(dá)在ΔE2A-CAHGH感染的細(xì)胞中不降低，只是在Axlwl感染的細(xì)胞中，表達(dá)明顯降低(圖4C)。
根據(jù)上述結(jié)果，在A549細(xì)胞中和HepG2細(xì)胞中顯示與血清GPT水平改變類似的表達(dá)模式，即在AxCAwt-、Ax1CAHGH-和ΔE2A-CAHGH-感染的細(xì)胞中的表達(dá)幾乎相同，而只在Axlwl感染的細(xì)胞中表達(dá)降低的基因，是pIX基因。這表明，由CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)并引發(fā)炎癥的基因是pIX基因。
表1 Northern印跡結(jié)果

實(shí)施例7CMV啟動(dòng)子誘導(dǎo)pIX基因表達(dá)的證實(shí)研究了pIX基因的表達(dá)是否由CMV啟動(dòng)子以類似于CAG啟動(dòng)子的方式誘導(dǎo)。用重組腺病毒AdCMVlacZ(Osada S.等人，Kidney Int.551234-1240(1999))作為一種插入CMV啟動(dòng)子的重組腺病毒，其中在5型腺病毒的E1基因缺失位點(diǎn)以朝右的方向插入一個(gè)CMV啟動(dòng)子和大腸桿菌lacZ基因。用實(shí)施例6所示的AxCAwt作為插入一個(gè)CAG啟動(dòng)子的對(duì)照病毒。
以類似于實(shí)施例6所述的方法用AdCMVlacZ或AxCAwt感染A549細(xì)胞，24小時(shí)后回收RNA。然而，對(duì)于AdCMVlacZ，感染的moi為6或2，對(duì)于AxCAwt，moi為300或100。Northern印跡分析用實(shí)施例6所示的pIX探針進(jìn)行。
結(jié)果示于圖5中。在用AdCMVlacZ以moi＝6感染的細(xì)胞中，pIX基因以等于或高于用AxCAwt以moi＝100感染的細(xì)胞的水平表達(dá)。由于兩種病毒感染時(shí)的moi不同，啟動(dòng)子的插入方向不同，啟動(dòng)子距pIX基因的距離不同，所以CAG啟動(dòng)子和CMV啟動(dòng)子誘導(dǎo)pIX基因表達(dá)的強(qiáng)度無(wú)法比較。然而，在插入CMV啟動(dòng)子的AdCMVlacZ感染的細(xì)胞中，pIX基因以較低的moi表達(dá)，因此揭示，pIX基因的表達(dá)也能由CMV啟動(dòng)子誘導(dǎo)。
實(shí)施例8關(guān)于SRα啟動(dòng)子和EF-1α啟動(dòng)子是否誘導(dǎo)pIX基因表達(dá)的研究研究了不含CMV啟動(dòng)子的外源啟動(dòng)子是否誘導(dǎo)pIX基因的表達(dá)。用于該研究的啟動(dòng)子是SRα啟動(dòng)子(Takebe Y.等人，Mol.Cell Biol.8466-472(1988))和EF-1α啟動(dòng)子(Kim D.W.等人，Gene 91217-223(1990))，和以朝左的方向插入每種啟動(dòng)子和大腸桿菌lacZ基因的腺病毒載體(AxSRlacZ-L和AxEFlacZ-L)。用只插入CAG啟動(dòng)子的腺病毒載體AxCAwt(見(jiàn)實(shí)施例5)和以朝左的方向插入CAG啟動(dòng)子和大腸桿菌lacZ基因的腺病毒載體(AxCAlacZ-L)作為陽(yáng)性對(duì)照。Saito等人(日本未審查專利文本(Kokai)號(hào)7-298877)公開(kāi)了構(gòu)建AxSRlacZ-L、AxEFlacZ-L和AxCAlacZ-L的方法，其中 Adex1SRlacZ-L與AxSRlacZ-L，Adex1EFlacZ-L與AxEFlacZ-L，Adex1CAlacZ-L與AxCAlacZ-L分別相同。用未插入外源啟動(dòng)子的腺病毒載體Axlwl(見(jiàn)實(shí)施例5)作為陰性對(duì)照。此外，再次研究了實(shí)施例7使用的含CMV啟動(dòng)子的腺病毒載體(AdCMVlacZ)。
用上述六種腺病毒載體(AxSRlacZ-L、AxEFlacZ-L、AxCAlacZ-L、AdCMVlacZ、AxCAwt、Axlwl)以moi＝30或100感染A549細(xì)胞，24小時(shí)后回收RNA，用pIX探針進(jìn)行Northern印跡分析(方法詳見(jiàn)實(shí)施例6)。
結(jié)果示于圖6中。在用含CMV啟動(dòng)子的腺病毒載體(AdCMVlacZ)感染的細(xì)胞中，pIX基因確實(shí)表達(dá)，其表達(dá)量等于或高于用含CAG啟動(dòng)子的腺病毒載體(AxCAlacZ-L和AxCAwt)感染的細(xì)胞，用作陽(yáng)性對(duì)照。
另一方面，在含EF-1α啟動(dòng)子的腺病毒載體(AxEFlacZ-L)感染的細(xì)胞中，根本未觀察到pIX基因的表達(dá)。在含SRα啟動(dòng)子的腺病毒載體(AxSRlacZ-L)感染的細(xì)胞中，觀察到pIX基因的表達(dá)。
上述結(jié)果證明，外源啟動(dòng)子引起的pIX基因的表達(dá)與啟動(dòng)子的特異性有關(guān)，存在根本不誘導(dǎo)pIX基因表達(dá)的外源啟動(dòng)子，如EF-1α啟動(dòng)子。此外也證明，誘導(dǎo)pIX基因表達(dá)的主要是CMV IE增強(qiáng)子，因?yàn)镃AG啟動(dòng)子與CMV啟動(dòng)子的共同部分只是CMV IE增強(qiáng)子。
實(shí)施例9關(guān)于含不同啟動(dòng)子的腺病毒載體誘發(fā)炎癥能力的研究為了證明外源啟動(dòng)子對(duì)pIX基因表達(dá)的誘導(dǎo)與對(duì)動(dòng)物施用腺病毒載體時(shí)發(fā)生的炎癥有關(guān)，對(duì)C57BL/6小鼠施用了實(shí)施例8使用的腺病毒載體中的4種載體(AxEFlacZ-L、AxCAlacZ-L、AdCMVlacZ和Axlwl)，并以血清GPT水平作為指標(biāo)比較了炎癥的程度。
腺病毒以1×109PFU(除了AdCMVlacZ之外)、3×108PFU和1×108PFU通過(guò)尾靜脈施用(每組5只動(dòng)物)，施用3天前和3、5、7、10、14、21、28、35天后采血，測(cè)定GPT水平。每種方法的細(xì)節(jié)按照實(shí)施例3所述的方法進(jìn)行。
結(jié)果顯示于圖7中。在含CMV啟動(dòng)子的AdCMVlacZ處理的小鼠中，血清GPT水平升高超過(guò)含CAG啟動(dòng)子的AxCAlacZ-L處理的小鼠，炎癥程度與實(shí)施例8所示的pIX基因表達(dá)量相關(guān)。另一方面，在含EF-1α啟動(dòng)子的AxEFlacZ-L處理的小鼠中，血清GPT水平幾乎沒(méi)有升高，與不含外源啟動(dòng)子的Axlwl處理的小鼠水平相同。
上述結(jié)果證明，pIX基因的表達(dá)與體內(nèi)施用后的炎癥直接相關(guān)，即不能誘導(dǎo)pIX基因表達(dá)的含有一種啟動(dòng)子的腺病毒載體也不能誘發(fā)炎癥，外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)pIX基因表達(dá)是炎癥的原因。
實(shí)施例10抗-pIX抗體的制備和蛋白IX的檢測(cè)(1)蛋白IX(pIX)基因的克隆為了通過(guò)PCR方法克隆5型人類腺病毒(Ad5)pIX基因的編碼區(qū)，進(jìn)行下列方法。用上述粘粒載體pAxCw作為模板，用具有下列序列的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。設(shè)計(jì)5’-引物使之包含Ad5位點(diǎn)3585-3605的核苷酸序列和一個(gè)EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)3’-引物使之包含Ad5位點(diǎn)4034-4015的堿基序列和一個(gè)XhoI識(shí)別位點(diǎn)。
5′-端引物5′-TAGAATTCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCC-3′(SEQ ID NO19)EcoRI3′-端引物5′-TACTCGAGGTTTTAAACCGCATTGGGAG-3′(SEQ ID No.20)XhoI 終止用Pfx DNA聚合酶(GIBCO BRL)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增含有pIX基因編碼區(qū)的470bp DNA片段。市售質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)(Invitrogen)在CMV啟動(dòng)子下游含有一個(gè)多克隆位點(diǎn)。用EcoRI和XhoI共消化PCR擴(kuò)增的470bp DNA片段，然后插入pcDNA3.1(+)多克隆位點(diǎn)的EcoRI位點(diǎn)與XhoI位點(diǎn)之間，獲得一種表達(dá)pIX的質(zhì)粒pCMV-IX(5.9kb)。通過(guò)對(duì)該pCMV-IX的含pIX基因編碼區(qū)的部分測(cè)序，證實(shí)其序列與現(xiàn)有序列(GenBank保藏號(hào)M73260)相同。
(2)pIX-融合蛋白的制備制備pIX與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白，作為用來(lái)獲得抗-pIX抗體的抗原。
1)pIX-融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用EcoRI和XhoI共消化質(zhì)粒pCMV-IX，獲得含有pIX基因的470kb DNA片段。構(gòu)建用來(lái)在大腸桿菌中表達(dá)GST-融合蛋白的市售質(zhì)粒載體pGEX-5X-1(Amersham Pharmacia Biotech)在GST的C端含有一個(gè)多克隆位點(diǎn)。于是，將由pCMV-IX獲得的470bp DNA片段插入pGEX-5X-1多克隆位點(diǎn)的EcoRI位點(diǎn)與XhoI位點(diǎn)之間，獲得表達(dá)GST-pIX的質(zhì)粒pGST-IX(5.4kb)。
2)pIX-融合蛋白的制備用質(zhì)粒pGST-IX轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。由于轉(zhuǎn)化子表達(dá)的GST-pIX是可溶的，所以按照用于包涵體蛋白質(zhì)的純化方法純化GST-pIX。首先，在40ml LB培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，之后加入800ml LB培養(yǎng)基，再培養(yǎng)1小時(shí)。加入IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖苷)(終濃度為0.2mM)培養(yǎng)6小時(shí)后，收集細(xì)胞。細(xì)胞用PBS洗滌，懸浮于20ml含有溶菌酶(1mg/ml)的裂解緩沖液(50mM Tris-HCl(pH8.0)/1mM EDTA/100mM NaCl)中，室溫溫育20分鐘，然后加入1ml含10％去氧膽酸鈉的裂解緩沖液裂解細(xì)胞。然后向裂解液中加入100μl 1M MgCl2溶液、100μl 1M MnCl2溶液和20μl DNase I溶液(70U/μl)，在37℃下溫育15分鐘，之后離心(11850×g)15分鐘。離心后，棄去上清液，沉淀用20ml含0.5％Triton X-100/10mM EDTA的裂解緩沖液洗滌兩次，然后將沉淀懸浮于1ml PBS中。溶液中加入等量的6M尿素，室溫溫育1小時(shí)，之后離心(11850×g)15分鐘。離心后，棄去上清液，沉淀懸浮于2ml PBS中。溶液中加入6ml 8M鹽酸胍(終濃度為6M)，離心(11850×g)15分鐘后，回收上清液。用該上清液作為純化的GST-pIX，制備抗-pIX抗體。
(3)抗-pIX抗體的制備用含有6M鹽酸胍的純化GST-pIX免疫兔(日本白兔)。
免疫和采血參見(jiàn)Asahi Techno Glass Corporation。用0.2-0.4mg抗原(GST-pIX)免疫兩只兔子，每?jī)芍?次。第四次免疫一周后，部分采血，用ELISA法證實(shí)抗GST-pIX抗體的效價(jià)充分提高，第五次免疫一周后，采集全血獲得抗血清(#1和#2)。
然后通過(guò)Western印跡分析證實(shí)，該抗血清可與pIX反應(yīng)。用下列兩種樣品作為含有pIX的陽(yáng)性對(duì)照。一種是用來(lái)源于5型腺病毒野生株(Ad5-DixSaito I.等人，J.Virol.54711-719(1985))的病毒以moi＝10感染A549細(xì)胞約一天后回收的細(xì)胞，其中只有E3基因缺失，另一種是純化的腺病毒顆粒。用未用腺病毒感染的A549細(xì)胞作為陰性對(duì)照。
每種樣品都在還原條件下進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后印跡到硝酸纖維素膜(Hybond ECL，AmershamPharmacia Biotech)上。該膜用5％脫脂奶封閉，加入1000倍稀釋的抗血清或免疫前血清，在4℃下溫育過(guò)夜。洗滌該膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的F(ab’)2片段猴抗-兔Ig抗體(Amersham PharmaciaBiotech，目錄號(hào)NA9340)，室溫溫育1小時(shí)。另外，在洗滌該膜后，加入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑(ECL Plus檢測(cè)試劑，Amersham PharmaciaBiotech)，使該膜暴露于X-射線膠片。
在兩種抗血清中，例如，抗血清#1的結(jié)果顯示于圖8中。當(dāng)使用免疫后的抗血清時(shí)，在加樣Ad5-dIX感染的細(xì)胞和純化病毒顆粒的道中清楚地檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于pIX的分子量的約14kDa帶，而在加樣未用病毒感染的A549細(xì)胞的道中未檢測(cè)到這條帶。另外，當(dāng)使用免疫前血清時(shí)，在任何道中根本未檢測(cè)到這條14kDa帶。#2抗血清獲得類似的結(jié)果，數(shù)據(jù)未顯示。上述結(jié)果證實(shí)，用這些抗血清檢測(cè)到的14kDa帶來(lái)源于pIX。因此，在下列實(shí)驗(yàn)中用這些抗血清作為抗-pIX抗體。
(4)由CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的pIX的檢測(cè)在實(shí)施例6-8中，通過(guò)Northern印跡分析證明CAG啟動(dòng)子誘導(dǎo)pIX RNA的表達(dá)。因此，通過(guò)Western印跡分析研究了pIX的表達(dá)是否不僅能在RNA水平上誘導(dǎo)，而且能在蛋白質(zhì)水平上誘導(dǎo)。
用只插入CAG啟動(dòng)子的腺病毒載體AxCAwt(見(jiàn)實(shí)施例5)或無(wú)外源啟動(dòng)子插入的腺病毒載體Axlwl(見(jiàn)實(shí)施例5)以moi＝100感染A549細(xì)胞，一天后收集細(xì)胞。用Ad5-dIX以moi＝10感染并在一天后回收的A549細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。在類似于上述(3)所述的方法中，進(jìn)行Western印跡分析以用抗-pIX抗體(#1)檢測(cè)pIX。如圖9所示，在AxCAwt感染的細(xì)胞以及Ad5-dIX感染的細(xì)胞中檢測(cè)到14kDa的pIX。另一方面，在Axlwl感染的細(xì)胞中根本未觀察到這條14kDa帶。這證實(shí)，CAG啟動(dòng)子也在蛋白質(zhì)水平上誘導(dǎo)pIX的表達(dá)。
實(shí)施例11pIX重新定位的腺病毒載體的構(gòu)建pIX重新定位的腺病毒載體通過(guò)下列步驟(1)-(3)構(gòu)建(1)在E4基因上游區(qū)與3’端ITR之間插入pIX基因的重組腺病毒載體(Ax4pIX)的構(gòu)建為了克隆包含5型人類腺病毒(Ad5)全長(zhǎng)pIX基因的區(qū)域，進(jìn)行下列方法。用含有5型腺病毒基因組除E1基因和E3基因外的大部分的粘粒載體pAxcw(同上文)作為模板，用下列引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。向每條引物中添加限制酶識(shí)別位點(diǎn)。5′-端引物5′-CCTGAATTCGTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTA-3′EcoRIRsaI(SEQ ID NO21)(Ad53513-3536)
3′-端引物5′-CCTGGATCCGTACATTAATTGCTTGATCCAAATCCAAACAG-3′BamHI RsaIAseI(SEQ ID No.22)(Ad54076-4054)用EcoRI和BamHI共消化含有PCR擴(kuò)增的pIX基因的約0.6kbDNA片段，然后插入市售質(zhì)粒pUC19多克隆位點(diǎn)的EcoRI位點(diǎn)與BamHI位點(diǎn)之間，獲得質(zhì)粒pUCfpIX(3.3kb)。通過(guò)對(duì)該pUCfpIX含pIX基因的插入部分測(cè)序，證實(shí)其序列與現(xiàn)有序列(GenBank保藏號(hào)M73260)相同。
然后，為了構(gòu)建在E4基因上游區(qū)與3’端ITR之間插入pIX基因的粘粒載體，進(jìn)行下列方法。粘粒載體pAx4w是一種含有5型腺病毒基因組的2.6-98.0m.u.(E3基因缺失)和2型腺病毒基因組的98.0-100m.u.的載體，在E4基因啟動(dòng)子上游區(qū)與3’端ITR之間(99.3m.u.)含有一個(gè)克隆位點(diǎn)，限制酶SwaI位點(diǎn)(Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)，在該參考文獻(xiàn)中pAx4w稱為pAdex4w)。用RsaI消化質(zhì)粒pUCfpIX，獲得含有pIX基因的約0.6kbDNA片段。將該0.6kb DNA片段插入粘粒載體pAx4w的SwaI位點(diǎn)，獲得粘粒pAx4pIXL和pAx4pIXR。在pAx4pIXL中pIX基因以朝左的方向插入，在pAx4pIXR中pIX基因以朝右的方向插入。
最后，為了構(gòu)建在E4基因上游區(qū)與3’端ITR之間插入pIX基因的重組腺病毒，進(jìn)行下列方法。重組腺病毒載體Adex4SRlaczL(見(jiàn)Miyake S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 931320-1324(1996)和圖10)是一種復(fù)制缺陷型腺病毒載體，它來(lái)源于5型腺病毒(E1A基因和E3基因缺失)，在99.3m.u.位點(diǎn)以朝左的方向插入大腸桿菌lacZ基因的表達(dá)單元。由Adex4SRlaczL制備腺病毒DNA-末端蛋白復(fù)合物(DNA-TPC)，然后用限制酶AseI和EcoRI共消化該DNA-TPC。由于在Adex4SRlaczL的基因組DNA中，在含有l(wèi)acZ基因表達(dá)單元的右半段基因組中含有幾個(gè)AseI和EcoRI位點(diǎn)，用這兩種酶消化Adex4SRlaczL的DNA-TPC產(chǎn)生基因組右半段已經(jīng)被消化的DNA-TPC。用這種限制酶消化的DNA-TPC和粘粒pAx4pIXL或pAx4pIXR轉(zhuǎn)化293細(xì)胞。通過(guò)用限制酶BspEI和PmlI消化產(chǎn)生的重組腺病毒的基因組DNA，鑒定目的病毒克隆，并獲得重組腺病毒pAx4pIXL或pAx4pIXR(圖10)，其中Adex4SRlaczL的大腸桿菌lacZ基因的表達(dá)單元被替換為pIX基因。pAx4pIXL和pAx4pIXR是在兩個(gè)位點(diǎn)(pIX基因的原始位點(diǎn)(9.7-11.2m.u.)和E4基因上游區(qū)與3’端ITR之間)處含有pIX基因的重組腺病毒。pAx4pIXL與pAx4pIXR的結(jié)構(gòu)差異只是E4基因與ITR之間的pIX基因插入方向，pAx4pIXL是pIX基因以朝左的方向插入的重組腺病毒，而pAx4pIXR是pIX基因以朝右的方向插入的重組腺病毒。
(2)含有E1A、E1B和pIX基因缺失的腺病毒載體基因組的粘粒載體(pAxΔpIXcw)的構(gòu)建為了構(gòu)建含有5型腺病毒基因組左端17％(含pIX基因)的質(zhì)粒，進(jìn)行下列方法。上述粘粒載體pAx4w(圖11)是一種含有5型腺病毒基因組除E1基因(Δ454-3328)和E3基因(Δ28592-30470)之外的大部分的載體。用HindIII和EcoRV消化pAxcw，用Klenow酶使其成為平端，之后自身連接，獲得質(zhì)粒pAx17cw(6.5kb圖11)。pAx17cw是含有5型腺病毒左端除E1基因之外的大約17％(1-453，3329-6241)的一種質(zhì)粒。
為了由pAx17cw構(gòu)建pIX基因缺失的質(zhì)粒，制備下列三條DNA片段(a)-(c)(a)用SwaI和XhoI消化pAx17cw獲得的，不含pIX基因的約4.0kb DNA片段，(b)用AlwNI和XhoI消化pAx17cw獲得的，對(duì)應(yīng)于5型腺病毒基因組位點(diǎn)4054-5788的約1.7kb DNA片段，(c)設(shè)計(jì)含有SwaI消化的片段-ClaI識(shí)別位點(diǎn)-SalI識(shí)別位點(diǎn)-NruI識(shí)別位點(diǎn)-AlwNI消化的片段的雙鏈DNA片段，其通過(guò)磷酸化含有下列序列的合成DNA的5’端，然后使其退火獲得(SwaI)ClaISalINruI(A1wNI)5′-AAATCGATT GTCGAC TCGCGA CAGACT-3′ (SEQ ID NO23)3′-TTTAGCTAA CAGCTG AGCGCT GTC-5′(SEQ ID NO24)連接上述三條片段(a)、(b)和(c)，獲得質(zhì)粒pAx17ΔpIXcw(5.8kb；圖11)，其中E1A、E1B和pIX基因缺失(Δ454-4053)。
然后，為了構(gòu)建粘粒載體pAx4w的BamHI位點(diǎn)與BstZ17I位點(diǎn)之間的序列已被替換為質(zhì)粒pAx17ΔpIXcw的BamHI位點(diǎn)與BstZ17I位點(diǎn)之間的序列的粘粒載體，制備下列三條DNA片段(d)-(f)(d)用BamHI和BstZ17I消化pAx17ΔpIXcw獲得的，含有一個(gè)SwaI識(shí)別位點(diǎn)的約2.2kb DNA片段，(e)用BamHI和Csp45I消化pAxcw獲得的，不含腺病毒基因組DNA的約10kb DNA片段，(f)用Csp45I和BstZ17I消化pAxcw獲得的，含有腺病毒基因組DNA的約30kb DNA片段。
連接上述三條片段(d)、(e)和(f)，獲得粘粒載體pAxΔpIXcw(41.8kb；圖11)，其含有E1A、E1B和pIX基因缺失的腺病毒基因組。
最后，為了構(gòu)建在粘粒載體pAΔpIXcw的E1A、E1B和pIX基因缺失位點(diǎn)插入人生長(zhǎng)激素(hGH)表達(dá)單元的粘粒載體，進(jìn)行下列方法用限制酶PmeI消化含有hGH表達(dá)單元(其中hGH DNA連接于CAG啟動(dòng)子下游)的粘粒pAx1CAHGH(實(shí)施例1)，獲得含有hGH表達(dá)單元的約3.0kb DNA片段。將該DNA片段插入粘粒載體pAΔpIXcw的SwaI位點(diǎn)，獲得粘粒pAΔpIXCAHGH(44.8kb圖11)。
(3)蛋白IX重新定位的腺病毒載體的構(gòu)建為了通過(guò)(1)所述的重組腺病毒Ax4pIXL或Ax4pIXR與(2)所述的粘粒載體pAxΔpIXCAHGH之間的同源重組構(gòu)建蛋白IX重新定位的腺病毒載體，進(jìn)行下列方法。由Ax4pIXL和Ax4pIXR制備腺病毒DNA-TPC，然后用限制酶EcoT22I消化每種DNA-TPC。由于在Ax4pIXL和Ax4pIXR基因組DNA的左半段含有幾個(gè)EcoT22I位點(diǎn)，EcoT22I消化產(chǎn)生基因組左半段已被消化的DNA-TPC。用EcoT22I消化的Ax4pIXR和粘粒pAxΔpIXCAHGH轉(zhuǎn)化293細(xì)胞。通過(guò)用限制酶(XhoI、NruI、BspEI等)消化產(chǎn)生的重組腺病毒的基因組DNA，鑒定目的病毒克隆。結(jié)果能夠獲得pIX重新定位的腺病毒載體(AxRpIXRCAHGH，圖10)，其中在pIX基因的原始位點(diǎn)(9.7-11.2m.u.)不含pIX基因，pIX基因重新定位到E4基因上游區(qū)與3’端ITR之間。類似地，用EcoT22I消化的Ax4pIXL和粘粒pAxΔpIXCAHGH的DNA-TPC轉(zhuǎn)化293細(xì)胞，也能獲得pIX重新定位的腺病毒載體(AxRpIXLCAHGH，圖10)。AxRpIXRCAHGH與AxRpIXLCAHGH的結(jié)構(gòu)差異只是pIX基因的插入方向，AxRpIXRCAHGH是pIX基因以朝右的方向插入的重組腺病毒，而AxRpIXLCAHGH是pIX基因以朝左的方向插入的重組腺病毒。
實(shí)施例12表達(dá)pIX的細(xì)胞系的構(gòu)建為了用于生產(chǎn)pIX缺失的腺病毒載體，轉(zhuǎn)化293細(xì)胞，構(gòu)建表達(dá)pIX的細(xì)胞系。
使用實(shí)施例10-(1)中構(gòu)建的表達(dá)pIX的質(zhì)粒pCMV-IX，用lipofection法(FuGENETM6轉(zhuǎn)染試劑Roche Diagnostics Corp.)轉(zhuǎn)化293細(xì)胞。由于pCMV-IX中已經(jīng)插入新霉素抗性基因，轉(zhuǎn)化3天后將培養(yǎng)基替換為含有600μg/ml硫酸G418(遺傳霉素GIBCO BRL)的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再培養(yǎng)13天后，克隆這些細(xì)胞。對(duì)G418抗性細(xì)胞系中的任意10個(gè)克隆，通過(guò)Northern印跡分析檢測(cè)pIX基因的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)，pIX基因在4個(gè)克隆中表達(dá)(#2、#5、#6、#10)。于是，為了檢測(cè)這4個(gè)克隆中pIX基因表達(dá)的穩(wěn)定性，將這4個(gè)克隆傳代培養(yǎng)到第30代，期間每5代制備一次RNA，通過(guò)Northern印跡分析證實(shí)pIX基因的表達(dá)(圖12)。結(jié)果證實(shí)，所有4個(gè)克隆，至少到第30代，pIX基因仍能穩(wěn)定表達(dá)，但是不同克隆的pIX基因的表達(dá)量不同。
此外，利用第25代的細(xì)胞，在蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了pIX的表達(dá)，也用實(shí)施例10-(3)所述的Western印跡分析證實(shí)。在該實(shí)驗(yàn)和圖12的實(shí)驗(yàn)中，用未插入外源啟動(dòng)子的腺病毒載體Axlwl感染的293細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。甚至在用Axlwl感染不表達(dá)腺病毒E1A或E1B基因的細(xì)胞(如A549細(xì)胞)時(shí)，pIX在RNA水平(圖4，圖6)或蛋白質(zhì)水平(圖9)上幾乎不表達(dá)。然而，當(dāng)用Axlwl感染表達(dá)E1A和E1B基因的293細(xì)胞時(shí)，它們相當(dāng)于E1基因缺失的第一代腺病毒載體的普通復(fù)制循環(huán)，表達(dá)足量的pIX。如圖13所示，在蛋白質(zhì)水平上證實(shí)所有4個(gè)克隆都表達(dá)pIX，但是表達(dá)量略低于Axlwl感染的293細(xì)胞的pIX表達(dá)量。
上述結(jié)果清楚地表明，獲得了表達(dá)pIX的細(xì)胞系的4個(gè)克隆(#2、#5、#6、#10)，它們組成并且穩(wěn)定地表達(dá)pIX。
實(shí)施例13pIX缺失的腺病毒載體的構(gòu)建為了通過(guò)實(shí)施例5所用的腺病毒載體AxCAwt與pIX缺失的粘粒載體pAxΔpIXCAHGH之間的同源重組構(gòu)建pIX缺失的腺病毒載體，進(jìn)行下列方法由AxCAwt制備腺病毒DNA-TPC，然后用EcoT22I消化。用這種DNA-TPC和粘粒載體pAxΔpIXCAHGH轉(zhuǎn)化293細(xì)胞或?qū)嵤├?2所述的表達(dá)pIX的細(xì)胞系。通過(guò)用限制酶(ClaI、NruI、SalI等)消化產(chǎn)生的重組腺病毒的基因組DNA，鑒定目的病毒克隆，并能獲得pIX缺失的腺病毒載體AxΔpIXCAHGH(圖10)。AxΔpIXCAHGH是一種來(lái)源于5型腺病毒的重組腺病毒，其中E1A、E1B和pIX基因缺失(Δ454-4053)，E3基因也缺失(Δ28592-30470)。
當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)化表達(dá)pIX的細(xì)胞系獲得pIX缺失的腺病毒載體時(shí)，表達(dá)pIX的細(xì)胞系用于病毒的大規(guī)模傳代和制備。另一方面，當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)化293細(xì)胞獲得pIX缺失的腺病毒載體時(shí)，表達(dá)pIX的細(xì)胞系用于病毒的大規(guī)模制備。
然后純化pIX缺失的腺病毒載體，制備病毒顆粒，利用抗-pIX抗體通過(guò)Western印跡分析證實(shí)病毒顆粒中存在正常含量的pIX蛋白。
實(shí)施例14關(guān)于施用pIX重新定位的腺病毒載體和pIX缺失的腺病毒載體是否引發(fā)炎癥的研究為了證實(shí)pIX重新定位的腺病毒載體和pIX缺失的腺病毒載體的炎癥減輕，如實(shí)施例3和5所述，通過(guò)測(cè)定血清GPT水平作為炎癥的指標(biāo)，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。測(cè)試的腺病毒載體如下—表達(dá)hGH的pIX重新定位的腺病毒載體AxRpIXRCAHGH、AxRpIXLCAHGH(實(shí)施例11)—表達(dá)hGH的pIX缺失的腺病毒載體AxΔpIXRCAHGH(實(shí)施例13)—表達(dá)hGH的第一代腺病毒載體Ax1CAHGH(實(shí)施例13)—無(wú)外源基因插入的第一代腺病毒載體Axlwl(實(shí)施例5)包括小鼠株和腺病毒載體劑量的實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)實(shí)施例3所述的方法進(jìn)行。
結(jié)果如實(shí)施例3和5所述，施用Ax1CAHGH的小鼠，血清GPT水平顯著升高。然而，施用AxRpIXRCAHGH、AxRpIXLCAHGH和AxΔpIXCAHGH的小鼠，如同施用Axlwl的小鼠一樣，血清GPT水平根本不升高。上述結(jié)果表明，甚至在體內(nèi)施用時(shí)，pIX重新定位的腺病毒載體和pIX缺失的腺病毒載體幾乎不引發(fā)炎癥。
工業(yè)用途本發(fā)明能提供高度安全的用于基因治療的腺病毒載體，使病毒蛋白的表達(dá)受到抑制，炎癥減輕。
權(quán)利要求
1.一種重組腺病毒載體，其體內(nèi)施用過(guò)程中的炎癥減輕，該載體具有下列特征(1)-(4)(1)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(2)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；(3)具有下列特征(A)和/或(B)(A)由外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因組的基因從正常位置重新定位到不受外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的位置，或者該基因缺失；和(B)由外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的腺病毒基因組基因啟動(dòng)子的核苷酸序列被置換，以致不受外源啟動(dòng)子的作用；和(4)形成與腺病毒野生株具有相同特性的正常病毒顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組的啟動(dòng)子是MLP和/或IVa2基因啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的重組腺病毒載體，其具有下列特征(5)-(8)(5)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(6)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；(7)腺病毒基因組的蛋白IX基因從正常位置重新定位到不受外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的位置；和(8)含有含量類似于腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失位點(diǎn)插入含外源啟動(dòng)子的外源基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因之外的至少一種基因全部或部分缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因和蛋白IX基因之外的至少一種基因全部或部分缺失。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E3基因全部或部分缺失。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E2A基因全部或部分缺失。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的至少一個(gè)ORF。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的ORF3。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E4基因ORF3之外的全部或部分ORF缺失。
12.根據(jù)權(quán)利要求3-11中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于距外源啟動(dòng)子18kb或更遠(yuǎn)的位置。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因組L3基因與E2A基因之間。
14.根據(jù)權(quán)利要求3-11中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于距外源啟動(dòng)子24kb或更遠(yuǎn)的位置。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因組的E3基因缺失位點(diǎn)。
16.根據(jù)權(quán)利要求3-11中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于距外源啟動(dòng)子30kb或更遠(yuǎn)的位置。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的重組腺病毒載體，其中蛋白IX基因重新定位于腺病毒基因組的E4基因上游區(qū)與3’端ITR之間。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子含有來(lái)自哺乳動(dòng)物和/或動(dòng)物病毒的元件。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子含有CMV增強(qiáng)子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種CMV啟動(dòng)子。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種CAG啟動(dòng)子。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種RSV啟動(dòng)子或SRα啟動(dòng)子。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是一種人類腺病毒載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是2型腺病毒或5型腺病毒。
25.根據(jù)權(quán)利要求1或2的重組腺病毒載體，其具有下列特征(9)-(11)(9)腺病毒基因組的E1A和E1B基因和蛋白IX基因缺失；(10)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；和(11)含有含量類似于腺病毒野生株的蛋白IX，形成正常的病毒顆粒。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E3基因全部或部分缺失。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失位點(diǎn)或E3基因缺失位點(diǎn)插入含外源啟動(dòng)子的外源基因。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-27中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E1A和E1B基因、E3基因和蛋白IX基因之外的至少一種基因全部或部分缺失。
29.根據(jù)權(quán)利要求25-28中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組E2A基因全部或部分缺失。
30.根據(jù)權(quán)利要求25-29中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的至少一個(gè)ORF。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的重組腺病毒載體，該載體保留腺病毒基因組E4基因的ORF3。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的重組腺病毒載體，其中腺病毒基因組除E4基因ORF3之外的全部或部分ORF缺失。
33.根據(jù)權(quán)利要求25-32中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子含有來(lái)自哺乳動(dòng)物和/或動(dòng)物病毒的元件。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子含有CMV增強(qiáng)子。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種CMV啟動(dòng)子。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種CAG啟動(dòng)子。
37.根據(jù)權(quán)利要求33的重組腺病毒載體，其中該外源啟動(dòng)子是一種RSV啟動(dòng)子或SRα啟動(dòng)子。
38.根據(jù)權(quán)利要求25-37中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是一種人類腺病毒載體。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的重組腺病毒載體，其中該腺病毒是2型腺病毒或5型腺病毒。
40.一種來(lái)源于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，其具有下列特征(12)和(13)(12)表達(dá)腺病毒的E1基因和蛋白IX基因；(13)能使根據(jù)權(quán)利要求25-39中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體繁殖。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的細(xì)胞，其中腺病毒的蛋白IX基因的表達(dá)受該基因原始啟動(dòng)子之外的外源啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。
42.根據(jù)權(quán)利要求40或41的細(xì)胞，其進(jìn)一步表達(dá)除腺病毒的E1基因和蛋白IX基因之外的至少一種腺病毒基因。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的細(xì)胞，其表達(dá)腺病毒的E1基因、蛋白IX基因和E2A基因。
44.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求25-39中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體的方法，其中使用根據(jù)權(quán)利要求40-43中任意一項(xiàng)的細(xì)胞。
45.一種重組腺病毒載體，其體內(nèi)施用過(guò)程中的炎癥減輕，該載體具有下列特征(14)和(15)(14)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；和(15)腺病毒基因組中插入一種不能誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的外源啟動(dòng)子。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的重組腺病毒載體，其具有下列特征(16)-(18)(16)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(17)腺病毒基因組的蛋白IX基因在原始位置處保留；和(18)腺病毒基因組中插入一種不誘導(dǎo)蛋白IX基因表達(dá)的外源啟動(dòng)子。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或46的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A基因和E1B基因缺失位點(diǎn)插入含外源啟動(dòng)子的外源基因。
48.根據(jù)權(quán)利要求45-47中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子不含CMV啟動(dòng)子。
49.根據(jù)權(quán)利要求45-48中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中以朝左的方向插入含外源啟動(dòng)子的外源基因。
50.根據(jù)權(quán)利要求45-49中任意一項(xiàng)的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子是一種EF1α啟動(dòng)子。
51.一種重組腺病毒載體，其體內(nèi)施用過(guò)程中的炎癥減輕，該載體具有下列特征(19)-(21)(19)腺病毒基因組的E1A和E1B基因缺失；(20)腺病毒基因組中插入含外源啟動(dòng)子的外源基因；和(21)在外源啟動(dòng)子與腺病毒基因之間插入具有抑制外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)的特性的堿基序列。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的重組腺病毒載體，其中在腺病毒基因組的E1A基因和E1B基因缺失位點(diǎn)插入含外源啟動(dòng)子的外源基因。
53.根據(jù)權(quán)利要求51或52的重組腺病毒載體，其中外源啟動(dòng)子含有CMV增強(qiáng)子。
54.一種藥用組合物，它在體內(nèi)施用過(guò)程中可減輕或不誘發(fā)炎癥，含有一種選自權(quán)利要求1-39和45-53的重組腺病毒載體作為活性成分。
55.一種減輕體內(nèi)施用過(guò)程中的炎癥的方法，其中對(duì)哺乳動(dòng)物施用一種選自權(quán)利要求1-39和45-53的重組腺病毒載體。
56.一種減輕體內(nèi)施用過(guò)程中的炎癥的基因治療方法，其中對(duì)哺乳動(dòng)物施用一種選自權(quán)利要求1-39和45-53的重組腺病毒載體。
57.選自權(quán)利要求1-39和45-53的重組腺病毒載體的用途，用于生產(chǎn)在體內(nèi)施用過(guò)程中可減輕或不誘發(fā)炎癥的藥用組合物。
58.選自權(quán)利要求1-39和45-53的重組腺病毒載體的用途，用于生產(chǎn)在基因治療中使用的藥用組合物，它在體內(nèi)施用過(guò)程中可減輕或不誘發(fā)炎癥。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新型腺病毒載體，其通過(guò)抑制插入腺病毒基因組中的外源啟動(dòng)子誘導(dǎo)腺病毒基因表達(dá)，能減輕體內(nèi)施用該載體期間的炎癥，還涉及一種生產(chǎn)該載體的方法，用于生產(chǎn)該重組腺病毒載體的一種細(xì)胞系，或應(yīng)用該重組腺病毒載體的一種基因治療方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1439055SQ01811685
公開(kāi)日2003年8月27日 申請(qǐng)日期2001年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月26日
發(fā)明者中井通雄, 小宮和雄, 村田真志, 東藤直樹(shù), 齊藤泉 申請(qǐng)人:住友制藥株式會(huì)社