專利名稱：具有神經(jīng)保護(hù)作用的7－羥基表雄酮的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類用于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于死亡的7-羥基類固醇化合物的用途，因此它可用于治療和預(yù)防如阿爾茲海默氏病、帕金森氏病、非癡呆性認(rèn)知損傷(Cognitive Impairment No Dementia)(CIND)、中風(fēng)、腦外傷、脊髓損傷和周圍神經(jīng)損傷等疾病或其后遺癥。而且它也可用于增強(qiáng)認(rèn)知功能。
在體內(nèi)，脫氫表雄酮的7α-羥基化代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生于1959年在尿中被發(fā)現(xiàn)，并被鑒定為7α-羥基DHEA[J J Schneider，M L Lewbart，RecentProgr.Horm.Res.15(1959)201-230；L Starka et al，Clin.Chim.Acta.7(1961)309-316]]。此后報(bào)道了來自人的許多器官，包括成人肝和胎肝、睪丸、副睪、皮膚、乳腺組織、前列腺、脂肪基質(zhì)細(xì)胞和扁桃腺等組織制品中3β-羥類固醇底物(包括DHEA和表雄酮-EPIA)的廣泛7α-羥基化。在大鼠肝和大量的小鼠組織和器官中，DHEA在7位的羥基化也得到驗(yàn)證。所有這些研究中，7α-羥基-DHEA是迄今為止所產(chǎn)生的最主要的代謝物。事實(shí)上，Doostzadeh等[Steroids 63(1998)608-614]已報(bào)道通過小鼠肝微粒體生成7α-DHEA的速度比7β-DHEA快15倍。
而且表明EPIA，DHEA和孕烯醇酮在大鼠腦中也可快速廣泛地轉(zhuǎn)化為它們相應(yīng)的7α-羥基代謝物[J M Guiraud et al，Steroids 34(1979)241-248；M Warner et al，Endocrinology 124(1989)2699-2706；Y Akwaet al，Biochem.J.288(1992)959-964]]。
WO97/37664公開了包括7α-羥基取代類固醇在內(nèi)的一類特定化合物在治療神經(jīng)、免疫或內(nèi)分泌失調(diào)方面的用途。在WO97/37664中建議可用這些化合物進(jìn)行治療的疾病包括阿爾茲海默氏病。但由于該病的作用機(jī)制是假設(shè)腦中缺少7α-羥基取代的類固醇而引起的，因此WO97/37664中所建議的治療更改為用7α-羥基取代的類固醇來替代缺少的化合物。因此，WO97/37664描述的程序是治療已有的疾病，而不是預(yù)防疾病或通過阻止神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷來防止疾病的惡化。所以WO97/37664并沒有描述一種神經(jīng)保護(hù)作用。也沒有建議這些化合物可用于防止由意外或創(chuàng)傷事件如中風(fēng)而引起的損傷。
目前我們很驚訝地發(fā)現(xiàn)7-羥基表雄酮，無論α、β或混合物，均可用于防止由中風(fēng)、腦外傷、蛛網(wǎng)膜下出血或心臟分流手術(shù)導(dǎo)致的大腦缺血等事件所引起的急性和慢性神經(jīng)損傷。
對于長時(shí)間組織缺氧或缺血，可能會或不會造成低血糖，但都會產(chǎn)生不同程度的神經(jīng)損傷。
典型地，在心臟病發(fā)作時(shí)會發(fā)生缺血情況，但此時(shí)造成的損傷基本上局限在心臟組織，而且已經(jīng)研發(fā)了可靠的治療方法。對于本發(fā)明，我們考慮的是腦部更長時(shí)間的缺血，如中風(fēng)病人或頭損傷病人的缺血。缺血的嚴(yán)重程度取決于中風(fēng)或損傷的程度，但一致的是它們都產(chǎn)生腦部損傷，這是本發(fā)明強(qiáng)調(diào)的情況。
本領(lǐng)域中已知的各種神經(jīng)保護(hù)制劑都嘗試用來減緩腦損傷問題，但就目前而言，所有已知的制劑都有不利的副作用。例如，MK801(dizocilpinemaleate)是一種非常簡單的分子，可以對缺血病人提供一定程度的神經(jīng)保護(hù)作用。但MK801也具有一定的“神經(jīng)恐慌效應(yīng)”(Martindale)，以及不利的運(yùn)動作用。神經(jīng)保護(hù)作用在《腦研究》755(1997)36-46(Pringle，A.K.，等)中有詳細(xì)介紹，其作為參考結(jié)合在此處。這些作者在早期文章中也介紹了海蝸牛毒素的神經(jīng)保護(hù)作用，但盡管該化合物具有神經(jīng)保護(hù)作用，在體內(nèi)卻觀察到其不利的副作用。
因此本發(fā)明在于7-羥基表雄酮(7-羥基-EPIA)用于生產(chǎn)保護(hù)急性或慢性神經(jīng)損傷的藥劑的用途。
該化合物可用分子式(I)表示 7α和7β互為異構(gòu)體，分別是 本發(fā)明也包含這些化合物的前體及在體內(nèi)代謝產(chǎn)生這些化合物的物質(zhì)的用途。
α和β異構(gòu)體可單獨(dú)或混合使用。如果混合使用，可以以任意比例使用。但由于7β異構(gòu)體具有更高的活性，因此是優(yōu)選存在的。
眾所周知，本發(fā)明中的化合物從母體類固醇開始，可通過各種方法進(jìn)行制備。例如，可通過上述所列參考文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行制備，這樣可得到7β和相應(yīng)的7α化合物的混合物，然后可通過已知的技術(shù)分離該混合物。
作為實(shí)施例，在用傳統(tǒng)方法保護(hù)DHEA的3β-羥基和17-酮基后，可通過烯丙基的氧化作用來得到7α和/或7β-羥基EPIA。然后產(chǎn)物用可溶性金屬化合物催化劑(如氫化鈉)進(jìn)行還原，并對3β-羥基和17-酮基去保護(hù)。如果需要，然后可用傳統(tǒng)方法，如柱層析，分離7α-羥基和7β羥基差向異構(gòu)體，而且可通過結(jié)晶純化7α-和7β-羥基EPIA。
作為選擇，7α-和7β-羥基-EPIA可通過以下列出的反應(yīng)路線進(jìn)行制備 在該反應(yīng)路線中，DHEA(II)乙?；玫较鄳?yīng)的式(III)的乙酸酯，然后其與乙二醇反應(yīng)，得到式(IV)的縮酮。然后縮酮(IV)如實(shí)施例3所述進(jìn)行氧化，得到相應(yīng)的7-酮基化合物(V)，然后該化合物進(jìn)行脫乙酰化，得到式(VI)的化合物。該化合物還原得到式(VII)的7-羥基-17-縮酮基-EPIA，然后它用酸處理來除去縮酮基而得到7-羥基-EPIA，最后通過層析法分離成7β-和7α-異構(gòu)體，得到7α-羥基-EPIA(IX)和7β-羥基-EPIA(X)。
本發(fā)明中的化合物可用于治療可能有缺血危險(xiǎn)，特別是中風(fēng)或頭損傷危險(xiǎn)的病人，或治療可能會發(fā)展為神經(jīng)退化性疾病的病人，如阿爾茲海默氏病或CIND，可能由慢性閾下腦缺血或減少神經(jīng)元能量產(chǎn)生而促使發(fā)病，這種情況常在老化的大腦中觀察到。在這種情況下，預(yù)防藥是很有用的。而且應(yīng)注意到，即使在缺血情況發(fā)生后，使用本發(fā)明中的化合物也是有用的，但推薦盡早用藥，以盡可能避免神經(jīng)元的惡化。在有些情況下，特別是在病人仍處于缺血危險(xiǎn)中時(shí)，可以使用重復(fù)的劑量。
為了盡早得到期望的效果，用藥的合適方式一般是注射。因此，靜脈注射是特別優(yōu)選的，但在有些情況下，優(yōu)選的用藥方式是直接將化合物注射到腦脊髓液中。
本發(fā)明中化合物的劑量可根據(jù)很多因素進(jìn)行改變，包括年齡、體重和病人病況、及用藥方式、頻率和途徑。但一般推薦的劑量是從0.01到50mg/kg體重，更優(yōu)選的是從0.05到20mg/kg體重的劑量?？梢砸淮蔚膭┝炕蚍珠_的劑量進(jìn)行用藥。
本發(fā)明通過下面無限制的實(shí)施例進(jìn)一步描述，其中實(shí)施例1到20描述的是本發(fā)明中化合物的制備，實(shí)施例21和22描述的是它們的活性。在實(shí)施例1到20中，羅馬數(shù)字代表上述反應(yīng)路線中的分子式。
如前所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性缺氧操作(Pringle等，1996；1997)。簡要來說，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有5μg/ml熒光排斥染料碘化丙錠(PI)的無血清培養(yǎng)基(SFM-75％MEM，補(bǔ)加1mM谷氨酰胺和4.5mg/ml葡萄糖的25％HBSS)中。成象前培養(yǎng)物在SFM中平衡60分鐘。然后用裝有一套若丹明濾光片的Leica倒置顯微鏡檢測PI熒光。該步驟中任何可檢測到PI熒光的培養(yǎng)物在以后的實(shí)驗(yàn)中舍棄。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到已用95％N2/5％CO2飽和的SFM(+PI)中來誘導(dǎo)缺氧。然后將培養(yǎng)皿(無蓋)封口成密閉室，其中的空氣已在密閉前通過以10L/min的速度連續(xù)鼓氣10分鐘用95％N2/5％CO2飽和了。然后在培養(yǎng)箱中放170分鐘(因此缺氧總時(shí)間為180分鐘)。在缺氧階段的最后時(shí)刻，將培養(yǎng)物放回到含PI的含氧量正常的SFM中，再將其放回培養(yǎng)箱中維持24小時(shí)。
按前述方法(Pringle等.，1996；1997)用Apple IIsi計(jì)算機(jī)運(yùn)行NIHImage 1.60或Macintosh G4/400計(jì)算機(jī)運(yùn)行OpenLab 2.1(Improvision)對神經(jīng)元損傷進(jìn)行評估。圖像用單色相機(jī)拍攝，并保存在光盤中以備脫機(jī)分析。在加入藥品之前拍攝光透射圖像，而在24小時(shí)缺氧后的恢復(fù)期結(jié)束時(shí)拍攝PI熒光圖像。CA1細(xì)胞層的范圍可從透射圖像中確定。而CA1中的PI熒光區(qū)域可用NIH Image或Openlab中的密度分割功能進(jìn)行計(jì)算。神經(jīng)元損傷以PI熒光高于背景的CA1的百分比來表示。
類固醇化合物是通過制造最初的溶在乙醇中的1mg/ml溶液并進(jìn)一步在SFM中稀釋制得的。在缺氧之前、缺氧之中及缺氧之后的恢復(fù)期將化合物加入到培養(yǎng)物中45分鐘。對照實(shí)驗(yàn)由只用載質(zhì)處理的培養(yǎng)物構(gòu)成。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1進(jìn)行最初的實(shí)驗(yàn)是用來確定7αOH-EPIA和7βOH-EPIA在100nM的高濃度下是否具有神經(jīng)保護(hù)作用。缺氧在25.5±6.4％的CA1中產(chǎn)生損傷。如下面的表1所示，在缺氧之前、之中及之后，7αOH-EPIA和7βOH-EPIA均可顯著降低這種損傷。
表1
實(shí)驗(yàn)2已確定70H-EPIA的α和β異構(gòu)體均具有神經(jīng)保護(hù)作用，我們推測這種作用具有濃度依賴性。對照組缺氧對31.9±4.7％的CA1造成神經(jīng)損傷。7αOH-EPIA在100nM具有顯著的保護(hù)作用。在10nM可觀察到輕微的神經(jīng)損傷，但并不是統(tǒng)計(jì)意義上顯著降低量，并且在1nM沒有作用。相反，7βOH-EPIA在10nM和100nM均具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，但在濃度降低到1nM時(shí)活性喪失(見表2)。
表2
實(shí)施例8大鼠全腦缺血實(shí)驗(yàn)(4血管閉塞法)通過4血管閉塞法(4VO)在雄性Wistar大鼠(250-280g)中誘導(dǎo)腦缺血。兩個(gè)椎動脈在戊巴比妥麻醉(60mg/kg腹腔注射)下通過電烙術(shù)進(jìn)行閉塞。然后允許動物在自由進(jìn)水但無食物的情況下恢復(fù)24小時(shí)。第二天頸動脈在30％氧/70％一氧化二氮麻醉下暴露在2％氟烷中，并用微脈管鉗閉塞10分鐘。隨后，松開二只鉗子，并檢查二個(gè)動脈以進(jìn)行立刻的再灌注。在手術(shù)時(shí)和隨后的3小時(shí)中，通過用連有溫度計(jì)的恒溫控制的電熱毯來維持其正常體溫(37.5±0.5℃)。對于對照組，假手術(shù)動物的兩個(gè)椎動脈在戊巴比妥麻醉下被電烙，兩個(gè)普通的頸動脈在30％氧/70％一氧化二氮麻醉下暴露于氟烷但第二天不被夾緊。傷口用利多卡因膠處理，然后進(jìn)行縫合。動物在環(huán)境溫度30℃的情況下保持在加熱燈下直至恢復(fù)意識。
共研究了7組動物1.(n＝8)類固醇化合物，7β-OH EPIA(0.1mg/kg，通過尾靜脈注射，共注射3次分別在誘導(dǎo)缺血前15分鐘、缺血中及再灌注后5分鐘)；2.(n＝8)類固醇，7β-OH EPIA(0.3mg/kg，如1所述靜脈注射3次)；3.(n＝8)類固醇，7β-OH EPIA(1mg/kg，如1所述靜脈注射3次)；4.(n＝8)NBQX(二鈉鹽，因?yàn)橛懈嗟目扇芩?作為參照物和陽性對照(TOCRIS，德國，30mg/kg，如1所述腹膜注射3次)；5.(n＝8)標(biāo)準(zhǔn)載質(zhì)(0.9％NaCl，含100μl乙醇)，如1所述靜脈注射3次)；6.(n＝8)單獨(dú)缺血；7.(n＝8)假手術(shù)對照組。
NBQX是2，3-二羥基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并(F)喹喔啉，并已知具有神經(jīng)保護(hù)作用[Gill，R.，Nordholm，L.，Lodge D.TheneuroprotectiVe action of 2，3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)quinoxaline(NBQX)in a rat focal ischaemia model.BrainRes.580，35-43，1992]。
7β-OH EPIA是本發(fā)明的化合物7β-羥基表雄酮。
將上述物質(zhì)溶解在100μl乙醇中，最后用0.9％NaCl稀釋。
缺血后經(jīng)過7天的生存期，所有動物用4％多聚甲醛穿心灌注固定。然后小心地除去腦并在相同的固定液中后固定2小時(shí)。腦在30％蔗糖中超低溫保護(hù)后，放到異戊烷中快速冷凍并保存在-80℃。將含有海馬結(jié)構(gòu)的20微米低溫恒溫器部件用甲苯胺藍(lán)或Neuro Trace熒光進(jìn)行Nissl染色。數(shù)據(jù)分析Nissl染色后，通過存活神經(jīng)元的數(shù)量可評價(jià)缺血后海馬CA1區(qū)域神經(jīng)損傷的嚴(yán)重程度。計(jì)算每組CA1區(qū)域中每400μm長度上形態(tài)學(xué)完整的神經(jīng)元的平均數(shù)。用裝有20倍物鏡的光學(xué)顯微鏡對每只動物的3-5個(gè)連續(xù)切片進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并對每個(gè)切片的400μm CA1區(qū)域進(jìn)行6次計(jì)數(shù)。通過成對的Student’s t-測試對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均值±SEM來表示。結(jié)果和討論結(jié)果如附

圖1至3所示。
形態(tài)學(xué)完整的海馬CA1神經(jīng)元在Nissl染色(甲苯胺藍(lán)或NeuroTrace，如圖2)后根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)來體現(xiàn)清晰的神經(jīng)元核周體形狀，帶有陽性標(biāo)記的核仁的大核，在具有Nissl染色的核周圍的小細(xì)胞質(zhì)區(qū)，表明具有完整的含核糖體的粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，因此具有完整的蛋白合成系統(tǒng)。
全腦缺血10分鐘(輕度缺血)及7天的生存期導(dǎo)致海馬CA1區(qū)域錐體細(xì)胞的選擇性神經(jīng)變性(圖1A-1C)。在假手術(shù)動物的CA1中，錐體細(xì)胞平均數(shù)目為121.5±4.3(設(shè)為100％)。因此，在全腦缺血10分鐘后，60％CA1神經(jīng)元死亡(圖1B)。缺血并如實(shí)驗(yàn)所述用載質(zhì)(NaCl+100μl乙醇)進(jìn)行靜脈注射的動物組神經(jīng)元數(shù)目與單獨(dú)缺血動物組進(jìn)行比較(圖1A，1B)。NBQX(30mg/kg，如實(shí)驗(yàn)所述靜脈注射三次)與缺血組比較，CA1錐體細(xì)胞中表現(xiàn)出顯著的(p＝0.03)神經(jīng)保護(hù)作用。與單獨(dú)缺血組比較，NBQX表現(xiàn)出47.5％的神經(jīng)保護(hù)作用，而與假手術(shù)組動物相比較，保護(hù)作用為68.5％。NBQX引起的神經(jīng)保護(hù)作用與Gill等，1992和Gill 1994的結(jié)果是一致的，表明我們實(shí)驗(yàn)中所用的全腦缺血模式是有效的。7β-OH EPIA在全腦缺血10分鐘和7天生存期后，對海馬CA1錐體細(xì)胞具有濃度依賴性的神經(jīng)保護(hù)作用(圖1A)。T-測試分析表明，7β-OH EPIA在濃度為0.1mg/kg(p＝0.01)和0.3mg/kg(p＝0.0008)時(shí)具有非常顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。與假手術(shù)組相比較，7β-OH EPIA對CA1錐體細(xì)胞分別表現(xiàn)出74.8％(0.1mg/kg)和83.9％(0.3mg/kg)的神經(jīng)保護(hù)作用(圖1C)。但7β-OH EPIA在濃度為1.0mg/kg時(shí)僅表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)的趨勢，但作用不顯著。
在缺血之前、之中和之后用7β-OH EPIA進(jìn)行靜脈注射的所有實(shí)驗(yàn)中，我們從未觀察到動物的任何行為異常。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)用于保護(hù)急性或慢性神經(jīng)損傷的藥劑的7-羥基表雄酮的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中的7-羥基表雄酮是7α-羥基表雄酮。
3.權(quán)利要求1的用途，其中的7-羥基表雄酮是7β-羥基表雄酮。
4.權(quán)利要求1的用途，其中的7-羥基表雄酮是7α-羥基表雄酮和7β-羥基表雄酮的混合物。
5.前述任何一個(gè)權(quán)利要求的用途，其中的神經(jīng)損傷是由中風(fēng)或腦外傷引起的。
6.前述任何一個(gè)權(quán)利要求的用途，其中的神經(jīng)損傷是由阿爾茲海默氏病、帕金森氏病、非癡呆性認(rèn)知損傷、脊髓損傷或周圍神經(jīng)損傷引起的。
全文摘要
7－羥基表雄酮可用于保護(hù)急性或慢性神經(jīng)損傷。
文檔編號A61K31/5685GK1440290SQ01812109
公開日2003年9月3日 申請日期2001年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月29日
發(fā)明者阿什利·克爾·普林格爾, 拉爾斯·埃里克·森德斯特羅姆, 恩斯特·武爾費(fèi)特 申請人:亨特-弗萊明有限公司