專利名稱：用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的包含藥用草本提取物的組合物的制備方法及所述的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于有效治療和預(yù)防關(guān)節(jié)炎的草本提取物的組合物以及制備該組合物的方法。
更具體而言，本發(fā)明涉及基于草本提取物的藥物組合物，其包含牛膝根(Achyranthis roots)(oosle)、日本牛膝根(Atractylodes japonicaroots)(changchul)、它們的混合物以及這些發(fā)酵產(chǎn)物，通過(guò)抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生，其能治療關(guān)節(jié)炎，以及通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)和白介素的產(chǎn)生，可再生成骨細(xì)胞和具有抗炎癥的軟骨性組織和膠原蛋白的合成。本發(fā)明還涉及所述藥物組合物的制備方法。
具體而言，在關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病中，慢性多關(guān)節(jié)炎在關(guān)節(jié)囊內(nèi)層的滑膜中具有炎癥特征變化的特征，并且誘導(dǎo)全身關(guān)節(jié)的水腫和疼痛。在極端情形下，其惡化成慢性病，以至于成為身體殘疾的人。此外，關(guān)節(jié)炎病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等是進(jìn)行性的，并且產(chǎn)生如變形和acampsia之類的關(guān)節(jié)損傷(關(guān)節(jié)病)。另外，當(dāng)關(guān)節(jié)炎經(jīng)不適當(dāng)治療以及持續(xù)惡化時(shí)，其經(jīng)常導(dǎo)致嚴(yán)重的身體障礙。
誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的直接機(jī)理仍未發(fā)現(xiàn)，但為將其找到，研究工作一直在活躍地進(jìn)行。同樣，預(yù)防如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的關(guān)節(jié)炎病的治療方法未見報(bào)道。此外，一旦關(guān)節(jié)炎病侵入，對(duì)其治療方面存在許多問(wèn)題。
通常，為了治療這種關(guān)節(jié)炎，已利用各種類型的藥物來(lái)進(jìn)行化療，所述藥物含有類固醇系統(tǒng)的抗炎性藥劑如可的松以及其他腎上腺皮質(zhì)激素，非類固醇系統(tǒng)的抗炎性藥劑如阿司匹林、pyrroxicam和吲哚美辛(indomethacin)，含金藥劑如orothiomalic acid，抗類風(fēng)濕性藥劑如氯代醌和D-phenisylamine，痛風(fēng)抑制劑如秋水仙堿以及免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨喋呤(methotrexate)以及左旋咪唑(levamisol)。
然而，如果施用已知為關(guān)節(jié)炎藥物的類固醇激素用于治療，上述化療藥物基本上不能治療疾病，反而產(chǎn)生許多藥物的副作用。
此外，抗炎性藥劑等不得不同時(shí)施用，因?yàn)殛P(guān)節(jié)炎病尤其是慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎給患者帶來(lái)嚴(yán)重的疼痛。為了緩解這種疼痛并去除關(guān)節(jié)膿腫，消炎劑包括阿司匹林和btazolin等長(zhǎng)期以來(lái)一直廣泛地用作治療藥。但施用所需量的藥如阿司匹林等對(duì)關(guān)節(jié)炎進(jìn)行連續(xù)治療是困難的，因?yàn)樵撍帉?duì)人胃導(dǎo)致致命的損傷。
遺憾的是以前所示的化療藥具有一些缺點(diǎn)。具體而言，存在由于有副作用而不能長(zhǎng)時(shí)間施用、抗炎癥不足、對(duì)已激起的關(guān)節(jié)炎缺乏功效等之類的問(wèn)題。目前，吲哚美辛和布洛芬(ibuprofen)在治療關(guān)節(jié)炎過(guò)程中可有效減輕疼痛，并且僅制備出了用于給藥的各種非類固醇消炎劑。
所以，有必要解決這些問(wèn)題并開發(fā)新的藥劑用于充分緩解急性炎癥和疼痛。尤其是十分需要無(wú)副作用的藥物，這是由于為了治療關(guān)節(jié)炎如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，通常長(zhǎng)時(shí)間施用藥物，并且現(xiàn)用的大多數(shù)藥物盡管各有差異但都有一些副作用。
在上述的藥劑中，某些種類是麻煩的，因?yàn)樗鼈円造o脈內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射的形式處方。此外，如果重復(fù)這些注射，會(huì)發(fā)生過(guò)敏、休克等，還可帶來(lái)衛(wèi)生問(wèn)題。因此，需要用于治療的安全可食用的藥物。
本發(fā)明的目的之一是提供用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的草本提取物的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供利用上述方法制備的草本提取物的組合物。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供草本提取物的制備方法，其包括下列步驟(1)提取牛膝根(oosle)和日本牛膝根(changchul)以及(2)發(fā)酵草本提取物。
優(yōu)選的是本發(fā)明的制備方法包括另一步驟(3)濃縮上述發(fā)酵步驟(2)之后的草本提取物。
此時(shí)，用于提取步驟(1)的溶劑可優(yōu)選選自蒸餾水、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇以及溶劑混合物。更優(yōu)選地，溶劑是蒸餾水、乙醇或甲醇。
此外，牛膝根和日本牛膝根優(yōu)選以干草本狀態(tài)或原始草本狀態(tài)存在。牛膝根和日本牛膝根的比例優(yōu)選為0∶5～5∶0，以及更優(yōu)選為1∶10～10∶1，以及最優(yōu)選為1∶2。如果采用原始狀態(tài)的牛膝根，則比例按重量比估算并考慮其含水量。
雖然牛膝根和日本牛膝根的草本提取物在本發(fā)明中均可有效治療關(guān)節(jié)炎，但牛膝根含量及其發(fā)酵產(chǎn)物在治療效果上起著最重要的作用。具體而言，它們用于治療關(guān)節(jié)炎是通過(guò)抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生以及干擾膠原酶的活化等來(lái)預(yù)防成骨細(xì)胞的活化，并還可增強(qiáng)用于治療關(guān)節(jié)炎的成骨細(xì)胞的再生。
此外，本發(fā)明的發(fā)酵條件優(yōu)選為20～50℃下4～36小時(shí)，因?yàn)樵诘陀?0℃和高于50℃的溫度下發(fā)酵效率降低。
本發(fā)明還提供浸漬方法，其包括(1)為了減少時(shí)間，在糖化過(guò)程中慢慢升高溫度直至達(dá)到30～75℃以及(2)在以下溫度下各停頓30分鐘的期間，首先在52℃用于蛋白合成，然后在65℃用于糖化作用。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的草本提取物組合物本身，其利用上述方法制備。
本發(fā)明的草本提取物組合物由牛膝根提取物、日本牛膝根提取物和提取物的協(xié)同混合物組成。為制藥目的，本發(fā)明的草本提取物可單獨(dú)提取或一起提取，并含有利用上述方法制備的發(fā)酵產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明，取決于草本提取物組合物的所需用途，可加入一種或多種常用的成分如媒介物。通常，組合物可作為主要藥物活性成分以口服劑量形式提供，包括但不限于片劑、膠囊、囊片、糖漿、液體溶液、懸浮液或粉末、錠劑、微粉化顆粒以及滲透性給藥系統(tǒng)；或以腸胃外劑量形式提供，包括單次施用或若干次施用的形式。此外，草本提取物組合物包括可藥用成分，包括固體載體、液體載體、防腐劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑及其組合。實(shí)施例中所述的本發(fā)明組合物按藥物活性凝膠或軟提取物的形式制備。
本發(fā)明草本組合物的劑量會(huì)依賴于下列因素而發(fā)生變化，如關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性、年齡、性別、身體癥狀、施用周期、施用方法、排泄比例以及患者體重、飲食等。
所有關(guān)節(jié)炎都可在本發(fā)明的范圍內(nèi)。尤其包括挫傷性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎(anaplastia arthritis)、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、含有細(xì)菌膿的化膿性關(guān)節(jié)炎以及結(jié)核性關(guān)節(jié)炎等。
本發(fā)明草本組合物對(duì)治療自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及淀粉樣蛋白病等具有藥物效應(yīng)。
本發(fā)明的進(jìn)一步特征和優(yōu)點(diǎn)下文將表現(xiàn)出來(lái)。
圖2表示把結(jié)核細(xì)菌注射到用非發(fā)酵草本藥物(1B)處理試驗(yàn)爪樣本以及對(duì)照爪后腳爪體積隨時(shí)間過(guò)程的變化。
圖3表示在試驗(yàn)樣本和對(duì)照中具有II型膠原蛋白的關(guān)節(jié)炎小鼠隨時(shí)間過(guò)程的臨床關(guān)節(jié)炎指數(shù)體積的評(píng)估。
圖4表示在試驗(yàn)組和對(duì)照組中具有II型膠原蛋白的關(guān)節(jié)炎小鼠隨時(shí)間過(guò)程的關(guān)節(jié)炎發(fā)生率的評(píng)估。
圖5表示在試驗(yàn)組和對(duì)照組中從具有II型膠原蛋白關(guān)節(jié)炎小鼠眼球中采集的血漿中免疫球蛋白的濃度變化。
圖6表示在試驗(yàn)組和對(duì)照組中具有II型膠原蛋白關(guān)節(jié)炎小鼠的切除組織中的胞內(nèi)TGF-β的濃度，其通過(guò)ELISA進(jìn)行分析。
圖7表示在試驗(yàn)組和對(duì)照組中具有II型膠原蛋白關(guān)節(jié)炎小鼠的切除組織中的胞內(nèi)INF-γ的濃度，其通過(guò)ELISA進(jìn)行分析。
圖8表示在試驗(yàn)組和對(duì)照組中具有II型膠原蛋白關(guān)節(jié)炎小鼠的切除組織中的胞內(nèi)TGF-β的濃度，其通過(guò)RT-PCR電泳進(jìn)行分析。
圖9表示在試驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本中具有II型膠原蛋白關(guān)節(jié)炎小鼠的切除組織中的胞內(nèi)IL-4的濃度，其通過(guò)RT-PCR電泳進(jìn)行分析。


圖10表示在試驗(yàn)組和對(duì)照樣本中具有II型膠原蛋白關(guān)節(jié)炎小鼠的切除組織中的胞內(nèi)TNF-α的濃度，其通過(guò)RT-PCR電泳進(jìn)行分析。
圖11表示在用氫化可的松處理的試驗(yàn)組和對(duì)照組中小鼠巨噬細(xì)胞的TNF-α的濃度，所述巨噬細(xì)胞用LPS刺激并用實(shí)施例18中制備的草本藥物處理。
圖12表示由實(shí)施例18中制備的草本藥物抑制膠原酶活性。
牛膝根(oosle)的藥煎劑在東方國(guó)家早已用于清潔血液、利尿和調(diào)經(jīng)。其還在東方藥中按生血?jiǎng)┓诸惡褪┯谩?br> 本發(fā)明所采用的上述牛膝根是一種韓國(guó)產(chǎn)天然草本植物——日本牛膝(MIQ)以及一種中國(guó)草本植物——Blume牛膝(Achyranthesbidentata Blume)(hoeoosle)，兩者均從市場(chǎng)購(gòu)得。草本根已用于治療婦科病如產(chǎn)后期惰性子宮、由各種原因誘導(dǎo)的metremia、經(jīng)血過(guò)多(epimenorrhagia)，這些被描述在參考文獻(xiàn)中。
白術(shù)(Atractylodis Rhizoma)(changchul)是日本牛膝KOIDZ(sapzoo)的根莖，日本牛膝KOIDZ(sapzoo)是菊科中Atractyloides屬的多年生植物，并可生長(zhǎng)至約80厘米高。上述草本生長(zhǎng)在山區(qū)野外，于春季或秋季挖出，用水洗滌，剪去根的剩余物并在太陽(yáng)下干燥。
日本牛膝KOIDZ.根(changchul)含有約1.5％的香精油并可與胡蘿卜素、菊粉、樹膠和生物堿反應(yīng)。此外，其可與皂苷和香豆素(cumarine)反應(yīng)。香精油的主要成分是一種倍半萜蒼術(shù)酮(C15H20O，熔點(diǎn)38℃，含量約20％)，并且還包括purpurale、β-桉葉醇和茅蒼術(shù)醇。參照其他文獻(xiàn)，可包括蒼術(shù)醇、isovalensic酸酯、atractylakalium等。另有報(bào)道，Atractylodes Koreana Kitam根(changchul)含有少量的蒼術(shù)素(atractylodin)、乙酰蒼術(shù)素醇(acetylatractylodinol)、蒼術(shù)素醇(atractylodinol)和橄香醇(elemole)作為香精油的主要成分。在日本牛膝的這些成分中，蒼術(shù)酮是稀罕和短缺的。
參照古代東方文獻(xiàn)的說(shuō)明和附圖，Atractylodes Koreana Kitam的根更接近于牛膝的根。牛膝的根是甜、辛辣和溫性的，并對(duì)ataralgesia、生血和排尿具有效應(yīng)。此外，其在如由于腎機(jī)能失常而導(dǎo)致的小排尿(small urination)、胃腸炎、水腫、頭昏眼花、全身性疾病、排尿、出汗等發(fā)揮重要作用，以便在東方治療中處方。在另一方面，作為民間醫(yī)藥，牛膝根已用于終止腹瀉和嘔吐以及治療消化不良(cacochymia)、糖尿病、咳嗽和痛風(fēng)。因此已知如果長(zhǎng)期服用，其有助于長(zhǎng)壽。
本發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)牛膝根和日本牛膝根的草本提取物及其混合物可用于制備藥物組合物。具體而言，草本組合物經(jīng)鑒定沒(méi)有毒副作用，并有效治療關(guān)節(jié)炎，進(jìn)一步它們的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)檢查具有更好的藥物功效。所以，我們已開發(fā)出基于新草本提取物的藥物組合物，其在本發(fā)明中增強(qiáng)了治療上述疾病的功效。
本發(fā)明提供基于草本提取物的藥物組合物，其通過(guò)包括下列步驟的方法而制備(1)分別或一起用水或乙醇提取牛膝根和日本牛膝根以及(2)發(fā)酵草本提取物等。本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物幾乎沒(méi)有副作用，并對(duì)預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎具有高的功效。因此，草本組合物是用于開發(fā)藥物的優(yōu)秀草本成分，并可用于取代常規(guī)的化療劑。
本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)用于治療關(guān)節(jié)炎的草本成分衍生自天然植物，這是因?yàn)榛诓荼咎崛∥锏乃幬锝M合物相對(duì)沒(méi)有副作用。目前，大多數(shù)關(guān)節(jié)炎藥物是化療劑，并具有不盡如人意的副作用，盡管其嚴(yán)重性取決于個(gè)體。有必要克服如下的問(wèn)題阻礙藥物持久使用的副作用、抗炎癥缺乏以及抗已生成關(guān)節(jié)炎的功效低。因此，我們已證實(shí)懷牛膝根和日本牛膝根的提取物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有藥物作用。此外，經(jīng)鑒定發(fā)酵組合物對(duì)治療更有效。然后，為了完成本發(fā)明，通過(guò)利用干草本或天然原始草本，已經(jīng)建立了組合條件、提取方案以及發(fā)酵程序。
本發(fā)明涉及用于藥物目的的牛膝根和日本牛膝根的草本提取物組合物、它們的發(fā)酵產(chǎn)物及其制備方法。優(yōu)選的是在發(fā)酵過(guò)程中，可利用煮熟的米和淀粉等，發(fā)酵采用麥芽、酵母等，然后蒸發(fā)除去溶劑。具體而言，本發(fā)明涉及濃縮的草本提取物、它們用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物組合物如濃縮的酏劑或片劑、懸浮液、膠囊等，及其制備方法。
詳細(xì)而言，本發(fā)明包括牛膝根(oosle)和日本牛膝根(changchul)的濃縮的提取物，其可用含有碳原子數(shù)1～4的低級(jí)醇提取，然后除去殘留的溶劑，并進(jìn)一步可適用于發(fā)酵程序。
為了檢查預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物功效，已將牛膝根和日本牛膝根的草本提取物組合物以及它們的發(fā)酵產(chǎn)物施用給實(shí)驗(yàn)大鼠。具體而言，分別在藥物處理的組和對(duì)照組中收集小鼠細(xì)胞，并用于評(píng)價(jià)用于藥物分析的臨床指數(shù)。對(duì)涉及關(guān)節(jié)炎和炎癥的細(xì)胞因子的濃度進(jìn)行測(cè)定分析，并通過(guò)采用LPS增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。
在本發(fā)明中，將干燥狀態(tài)下的中國(guó)產(chǎn)BLUME牛膝(Achranthisbidentata BL)或天然和原始狀態(tài)下的韓國(guó)產(chǎn)土牛膝(Achyranthesjaponica(MIQ.)NAKAI)用作牛膝根，然后與日本牛膝根混合用于制備藥物草本組合物。把該草本混合物用溶劑提取，并利用麥芽、酵母等發(fā)酵。測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物，以測(cè)定預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的功效，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞組織學(xué)分析中獲得優(yōu)異結(jié)果。
牛膝根和日本牛膝根的提取物的制備可采用如下草本提取程序進(jìn)行。
將牛膝根和日本牛膝根與提取溶劑混合，并在50～120℃加熱5～24小時(shí)。將提取液冷卻在40～60℃，并過(guò)濾以獲得上清液，或直接用于下一個(gè)發(fā)酵程序。上述提取和過(guò)濾程序重復(fù)一次以上，然后收集上清液并蒸發(fā)其溶劑而濃縮。可將牛膝根和日本牛膝根分別提取，然后組合或一起提取，但共提取方案更方便操作。當(dāng)升高溫度時(shí)，提取物在120℃下的油浴中加熱，或使用蒸氣蒸餾方法。優(yōu)選的是其在80～100℃下的水浴中加熱。如果蒸餾水用作溶劑，干日本牛膝根的量的實(shí)驗(yàn)范圍是6～16倍，最適是12倍。
把牛膝根和日本牛膝根與提取溶劑混合，在正常溫度或4℃的冷卻浴中浸沒(méi)5～7天，并過(guò)濾得到上清液。上述提取和過(guò)濾程序重復(fù)一次以上，然后收集上清液并蒸發(fā)其溶劑而濃縮。
在上述兩個(gè)制備方法中，可將牛膝根和日本牛膝根變成粉末，并且作為溶劑，可利用純水或醇溶液如20～50％的乙醇、50～100％的甲醇等。但要完全除去有機(jī)溶劑以適用于下一步發(fā)酵過(guò)程。
可如下實(shí)現(xiàn)本發(fā)明下一步發(fā)酵的方法。
通過(guò)加入麥芽、酵母等可將草本提取物優(yōu)選在20～50℃下發(fā)酵4～36小時(shí)，這是由于在低于20℃和高于50℃的溫度下發(fā)酵效率降低。此時(shí)，利用上述方法制備草本提取物組合物，使用過(guò)濾液或直接發(fā)酵，然后過(guò)濾。如果草本提取物發(fā)酵前沒(méi)有過(guò)濾過(guò)程，則可比發(fā)酵前經(jīng)過(guò)濾的情形獲得高出約5％的發(fā)酵產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供針對(duì)快速發(fā)酵的浸漬方法，其從30℃緩慢升溫，并允許停頓期間，首先52℃下用于蛋白合成，然后65℃下用于糖化，分別30分鐘。結(jié)果，發(fā)酵終了溫度在2小時(shí)45分鐘內(nèi)達(dá)到75℃，以及高溫下的過(guò)濾可減少操作時(shí)間。
此外，可自然進(jìn)行發(fā)酵步驟或通過(guò)加入麥芽、酵母、葡萄、酒酶源或其他微生物進(jìn)行發(fā)酵步驟。由于本發(fā)明的草本組合物經(jīng)過(guò)發(fā)酵，因此藥物功效、味道、風(fēng)味等得到令人滿意地提高，并且尤其是上述發(fā)酵使得藥物的形式維持和保存長(zhǎng)時(shí)間。此外，發(fā)酵步驟可通過(guò)下列方法完成將煮熟的米飯與麥芽、酵母等發(fā)酵，過(guò)濾以獲得上清液，然后加入本發(fā)明的草本提取物進(jìn)行發(fā)酵。
在利用淀粉的情況下，麥芽中所含的淀粉可用其酶糖化，并改變成合適的提取物用于發(fā)酵。此時(shí)，副底物(by-substrate)用于補(bǔ)充麥芽淀粉直至達(dá)到50％的麥芽量。由于副底物價(jià)格低廉，這是經(jīng)濟(jì)的，并產(chǎn)生許多其他效應(yīng)如風(fēng)味增加、濁度降低等。此外，這提高發(fā)酵效率如發(fā)酵周期縮短、發(fā)酵產(chǎn)物提高等。作為副底物，可利用精制淀粉如玉米、大米、小麥、衍生自caprica木瓜、獼猴桃(kiwi)、梨等的木瓜蛋白酶，以及也可采用以酸或酶糖化這些淀粉的葡萄糖漿如玉米糖漿。
總而言之，發(fā)芽的小麥(koji)來(lái)源可選自小麥、用小麥粉包被的大米、綠豆、粘米、大麥等。此外，酵母來(lái)源可選自空氣、歐龍牙草、大麥桿、稻桿、桑樹、簍萵、萵苣、荷花、水胡椒葉、松樹葉等。此外，上述種子的物態(tài)可以是烘烤的、蒸煮的、輕微蒸煮的或原始的小麥，以及其使用比例可在0～12％的范圍內(nèi)。副底物可選自桑樹葉、簍萵、煎煮的汁湯、桃核粉、瓜粉等。然后，加入輔酶劑如主要細(xì)菌Rhyzopus、Usami、Oryzae等通過(guò)培養(yǎng)而提高了常規(guī)發(fā)芽小麥的糖化活性用于制備，這樣可保持天然麥芽的復(fù)合味道。
為了利于消化，本發(fā)明組合物可優(yōu)選的加工方法是將草本混合物粉末包裝到明膠膠囊(優(yōu)選硬明膠)中，膠囊大小優(yōu)選零級(jí)或雙零級(jí)。然后這些膠囊每只將含有約300～600mg的草本混合物粉末。人們已發(fā)現(xiàn)，硬明膠膠囊代表利于消化的可食用組合物的最有效、最經(jīng)濟(jì)的包裝形式。
待消化的本發(fā)明草本組合物的劑量會(huì)依賴于下列因素而發(fā)生變化，如患者的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性、年齡、身體癥狀、體重、飲食等。作為一般指南，預(yù)計(jì)體重范圍在60～90kg的患者每天將消化約1,000～5,000mg的草本組合物(對(duì)應(yīng)于每天2～12個(gè)零級(jí)或雙零級(jí)大小的硬明膠膠囊)。通常，人類患者每kg體重將消化約40mg的組合物。應(yīng)理解的是這些劑量水平僅僅是一般性指南，對(duì)于單個(gè)患者合適的劑量水平的變化相當(dāng)程度上可取決于上述因素。然而，本發(fā)明可食用組合物的一個(gè)益處是劑量不是“關(guān)鍵的”，而施用如那些上述的合成藥物劑量則是關(guān)鍵的。由于本發(fā)明可食用組合物全部存在于自然界中，并且以他們本身也是飲食的補(bǔ)充，因此，“過(guò)劑量”不是問(wèn)題。
具有特定體重和生活方式的個(gè)別患者可容易確定合適的劑量，其方法是以如上所述的一般性劑量水平開始，并按需要調(diào)整劑量以緩解關(guān)節(jié)炎。
然而，本領(lǐng)域中的那些專業(yè)技術(shù)人員將意識(shí)到在考慮本公開后可在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)做出修飾和改進(jìn)。除非另有說(shuō)明，所有量和部分以重量為基礎(chǔ)，尤其所有％符號(hào)表示重量％。
采用實(shí)施例8的同樣方法制備本發(fā)明的提取物粉，并將可藥用載體加入以便獲得微粉化的顆粒和懸浮液。接著把上述提取物組合物制成硬膠囊。
在AA(急性關(guān)節(jié)炎)的情況下，把與弗氏佐劑混合的丁酸分枝桿菌制成懸浮液(5mg/ml)，并一次注射到Wister Lewis大鼠右腳底的皮下層中，每只動(dòng)物100μl，這被視為對(duì)照組。另一方面，標(biāo)準(zhǔn)組僅用不含MB的弗氏佐劑以相同的量皮下注射。使用水取代方法，每隔3或4天對(duì)兩個(gè)腳爪的體積進(jìn)行測(cè)量，持續(xù)約28天。本發(fā)明的藥物組合物依據(jù)實(shí)體形式重量以2g/kg施用，并且各實(shí)驗(yàn)組有約6～7只動(dòng)物(Turull和Queralt，2000；Immuno.Pharmacol.，46(2000)71-77)。
在圖中所示的各組中，動(dòng)物的名稱和數(shù)目如下。
對(duì)照組6只動(dòng)物IB，4B組藥物治療的實(shí)驗(yàn)組(各自7只動(dòng)物)標(biāo)準(zhǔn)組6只動(dòng)物腳爪體積的變化定義為對(duì)照組和標(biāo)準(zhǔn)組之間以及實(shí)驗(yàn)組和標(biāo)準(zhǔn)組之間的體積差異。在實(shí)驗(yàn)組中，AA中施用藥物的抑制效應(yīng)如下列公式進(jìn)行定義(Badger等，Journal of Pharmacol ogy and ExperimentalTherapeutics，291(1999)，1380～1386)。在該實(shí)驗(yàn)中，1B表示非發(fā)酵草本提取物(實(shí)施例1)以及4B表示發(fā)酵草本提取物(實(shí)施例2)。
抑制效應(yīng)(％)＝{1-[實(shí)驗(yàn)組-標(biāo)準(zhǔn)組]/[對(duì)照組-標(biāo)準(zhǔn)組]}×100通過(guò)Student氏檢測(cè)，完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的p值以及腳爪體積的值，并進(jìn)行對(duì)比。在p值低于0.05時(shí)，其被視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異。
圖1總結(jié)了在結(jié)核桿菌(TB)注射后隨時(shí)間過(guò)程腳爪的體積變化。如圖所示，對(duì)照組顯示出在第三天的起始變化，體積增長(zhǎng)到第一天的2.6倍。這種增長(zhǎng)模式維持了16天，并在第20天觀察到再次增長(zhǎng)，其顯示是起始體積3.7倍的增長(zhǎng)。然后轉(zhuǎn)化為降低模式，并在約第31天時(shí)是初始值的2.9倍。當(dāng)施用4B時(shí)，除4B組維持或降低第三次測(cè)量體積直到實(shí)驗(yàn)完成以外，總體模式相似于對(duì)照組。具體而言，在第20天，4B組的腳爪體積降低到對(duì)照組的55％(p＜0.001)，這意味著此組與對(duì)照組相比在全過(guò)程中具有降低的模式。另一方面，標(biāo)準(zhǔn)組顯示在第3天體積最大(高于第一天1.8倍)，然后腳爪體積逐漸降低以便恢復(fù)為初始值或稍有增加。
此外，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和標(biāo)準(zhǔn)組的平均重量幾乎同樣是約270g。但AA誘導(dǎo)后約20天，4B、1B和對(duì)照組體重分別降低了25g。另一方面，標(biāo)準(zhǔn)組的重量增加了約60g，并且兩組的左腳爪體積與初始值不同。
如圖2所示，當(dāng)1B施用在對(duì)照組中時(shí)，體積首先以相似模式增長(zhǎng)，并一些時(shí)間后(約2周)增長(zhǎng)再次顯著。這種趨勢(shì)與圖1中4B注射所示的明顯不同。與對(duì)照組比較，證實(shí)1B可有效減少水腫。與對(duì)照組比較后，4B經(jīng)鑒定具有更杰出的效果。
<表1>
與對(duì)照組比較，4B、1B組中右腳爪體積和顯著性(p)的差異。

(粗字體顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性數(shù)值(p＜0.05))表1總結(jié)了施用4B和1B后右腳爪中所測(cè)定的水腫與對(duì)照組之間的差異。如圖1所示，與對(duì)照組比較，在4B注射組中水腫得到令人滿意的緩解，并在2～4周過(guò)程中顯著緩解，但在1B注射組中，顯著性相對(duì)微小，盡管其也維持某些功效。
<表2>
4B和1B注射后的浮腫抑制

(粗字體顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性數(shù)值(p＜0.05)表2顯示了上述抑制效果的轉(zhuǎn)化結(jié)果，并且最優(yōu)異的效果是施用4B。具體而言，4B注射誘導(dǎo)MB水腫減少40～45％以及1B注射帶來(lái)約25％的減少。結(jié)果，在牛膝根(oosle)和日本牛膝根(changchul)中，兩者的發(fā)酵產(chǎn)物(4B)比非發(fā)酵產(chǎn)物(1B)具有更高的治療關(guān)節(jié)炎的效果。實(shí)驗(yàn)例2臨床關(guān)節(jié)炎指數(shù)的評(píng)價(jià)46只DBA/1小鼠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室(Jackson LabUSA)，得自韓國(guó)科學(xué)和技術(shù)研究院(Korea Institute of Science andTechnology)(KIST)，并將平均重量調(diào)整到21.5g。然后使它們穩(wěn)定2周，劃分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，并用II型膠原蛋白注射到小鼠尾巴中進(jìn)行初次免疫，以便檢查II型膠原蛋白誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎。2周后，在左腳底進(jìn)行相似注射以加強(qiáng)免疫，然后使20只實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物以每kg體重按0.6g量口服給藥實(shí)施例3中制備的固體粉末(發(fā)酵草本提取物)(122.5μl/動(dòng)物)，每2天1次，共7次，持續(xù)2周。利用臨床關(guān)節(jié)炎指數(shù)，下文簡(jiǎn)稱“AI”，對(duì)實(shí)驗(yàn)組(藥物治療組，耐受組)的關(guān)節(jié)炎發(fā)生率和關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)比例進(jìn)行檢查并與對(duì)比組(CIA組)的那些指數(shù)進(jìn)行比較。為了評(píng)估草本提取物組合物用于治療關(guān)節(jié)炎的功效，將4只對(duì)照組的小鼠加強(qiáng)免疫，并于2天后處死，然后利用細(xì)胞組織學(xué)方法進(jìn)行分析。此外，得到檢查標(biāo)準(zhǔn)，并在實(shí)驗(yàn)開始的5周后，完成藥物治療，把4只實(shí)驗(yàn)組和對(duì)比組中的小鼠分別第二次處死，將它們的細(xì)胞組織切除并培育，以便通過(guò)操作ELISA、RT-PCR方法等來(lái)測(cè)定抗炎癥和關(guān)節(jié)炎的治療功效。
為了獲得免疫，CFA(完全弗氏佐劑)試劑為Chondrex公司的Arthrogen-CIA(5ml/瓶批號(hào)112700)，以及II型膠原蛋白是Sigma公司的天然牛CII，將其與CFA混合成比例1∶1，并以每只動(dòng)物100μ1注射到小鼠尾巴中。當(dāng)加強(qiáng)時(shí)，IFA(不完全弗氏佐劑)購(gòu)自Difco公司，將其與天然牛CII以1∶1的比例混合，也以每只動(dòng)物100μl注射到小鼠的左腳墊中。為了測(cè)定關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的程度，通過(guò)觀察除此左腳以外的剩余3只腳的關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)來(lái)確定臨床關(guān)節(jié)炎指數(shù)。具體而言，根據(jù)水腫程度，分配給0～4分值(分值0水腫未出現(xiàn)；1皮膚發(fā)紅，紅腫；2皮膚發(fā)紅且水腫出現(xiàn)；3關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)，象左腳墊水腫一樣的腫脹；4嚴(yán)重的炎癥，聲音粗啞，用腳站立困難)并合計(jì)。發(fā)生率以出現(xiàn)明顯水腫(AI評(píng)價(jià)大于3分)的小鼠數(shù)的％表示。
表3和表4總結(jié)了AI和發(fā)生率的評(píng)價(jià)，通過(guò)3周的臨床評(píng)估而獲得，時(shí)間自給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物施用草本提取物起計(jì)算，這些評(píng)價(jià)顯示在圖3和圖4中。然后，用本發(fā)明的草本藥物治療4周，8周后，在對(duì)照組(CIA組)中關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)增加到最大點(diǎn)的57.1％，變?yōu)榭煽康木哂?分以上的平均AI評(píng)價(jià)，然后降低。在藥物治療的組中，藥物施用6周后，發(fā)生率顯示增加，但關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)等在治療期間未觀察到。所以，預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的藥物功效得到清楚地證實(shí)。AI評(píng)價(jià)分析顯示AI值首次在5周中增加，其次在7周內(nèi)增加，并且這種模式與實(shí)驗(yàn)例1所述的完全相同。接著記錄下列進(jìn)展，在藥物治療的組中AI評(píng)價(jià)的最大點(diǎn)低于1分并且治療功效是CIA組的66.4％的顯著結(jié)果。
<表3>CIA組的臨床評(píng)價(jià)圖表


<表4> 藥物治療組的臨床評(píng)價(jià)圖表


實(shí)驗(yàn)例3關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)和切除的小鼠細(xì)胞的組織學(xué)分析在實(shí)驗(yàn)例2的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，2周后使小鼠加強(qiáng)免疫，并在施用藥物前首先把4只對(duì)照組的動(dòng)物處死。藥物注射在2周后完成后，在對(duì)比組(CIA組)和藥物治療組中分別處死4只小鼠。然后，將各組織區(qū)域切除并培育，利用ELISA和RT-PCR方法，以檢查胞內(nèi)炎癥、與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子的濃度變化、抗炎癥以及關(guān)節(jié)炎治療效果。此外，通過(guò)抗體滴定測(cè)定從眼球的血漿中所獲得的免疫球蛋白的量，并計(jì)算免疫蛋白IgG1和IgG2的總量，以分析藥物對(duì)T細(xì)胞的活性。
在實(shí)驗(yàn)小鼠中，將組織細(xì)胞從選自dLN(drainic淋巴結(jié))、mLN(mensenteric淋巴結(jié))、脾臟和PP(淋巴接結(jié))的區(qū)域中切取。然后，用RPMI 1640培養(yǎng)基/10％溶液制備細(xì)胞培養(yǎng)溶液并在3,000rpm下離心5分鐘，以5×105細(xì)胞/孔的細(xì)胞濃度接種。為了分析TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)和INF-γ(干擾素-γ)，利用儀器SPECTRA MAX 250進(jìn)行ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)方法。為了測(cè)定CIA組和耐受組中的胞內(nèi)TNF-α(腫瘤壞死因子-α)、IL-4(白介素-4)和TGF-β的濃度差異，利用Perkin Elmer 9600完成RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法，并對(duì)抗炎癥和關(guān)節(jié)炎治療進(jìn)行比較。
表5和表6描述了TGF-β和INF-γ的ELISA分析過(guò)程，GIBCOBRL的PBS試劑用作封閉溶液，該試劑的制備是將9.6g的Dulbecco磷酸鹽緩沖的鹽水與蒸餾水混合制成1L的體積，并加入10g的1％BSA(TM-USB.Lot 106268)和0.1％的乙酸鈉。此時(shí)，為了測(cè)定TGF-β，#244(目錄號(hào)MAB 1835)和#19(批號(hào)WS04)抗體購(gòu)自美國(guó)R&DSystem公司，以及#17(目錄號(hào)No.100-21)和#18(目錄號(hào)80-1835)購(gòu)自美國(guó)PEPRO Tech EC LTD和Genzyme/Techne公司，在考慮目錄手冊(cè)后將#17和#18用作標(biāo)準(zhǔn)抗體。
<表5> ELISA程序/TGF-β

<表6> ELISA程序/INF-γ

為了進(jìn)行INF-γ的ELISA分析，#352(目錄號(hào)MAB 785)、#353(目錄號(hào)MAF 485)和#344(目錄號(hào)485-MI)購(gòu)自R&D System公司，在考慮目錄手冊(cè)后將它們用作標(biāo)準(zhǔn)抗體試劑。
圖5表示血漿中免疫球蛋白的濃度變化，所述血漿得自用II型膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的小鼠的實(shí)驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本的小鼠眼球。將20μg/ml濃度的天然牛CII以50μl/孔用于包被孔，并利用購(gòu)自Pharmingen公司的檢測(cè)試劑#250、#182和#183來(lái)測(cè)定免疫球蛋白IgG1和IgG2。
在DBA/1實(shí)驗(yàn)小鼠中，IgG1為一種免疫蛋白，來(lái)源于T輔助2細(xì)胞(Th2)并參與抗炎癥反應(yīng)，與對(duì)照組比較，在藥物治療的組中其增長(zhǎng)明顯，達(dá)2倍以上。然而，指導(dǎo)Th1IgG2用于炎癥誘導(dǎo)的IgG2呈遞抗原和總免疫球蛋白IgG保持原樣。即治療組誘導(dǎo)的抗炎癥在T細(xì)胞中特異性地作用于Th2IgG2(IgG1濃度顯示115.5％的增加)。
如圖6和圖7所述，通過(guò)進(jìn)行ELISA分析，在第二次處死的從各種組織切除的小鼠細(xì)胞中，測(cè)定TGF-β和INF-γ的胞內(nèi)濃度。加強(qiáng)免疫2周后，在耐受組中mesenterici淋巴結(jié)的TGF-β增加經(jīng)鑒定比CIA組中的更為明顯(約2.5倍)，并且在藥物治療組的mLN和dLN中與炎癥相關(guān)的INF-γ值也減少到20～40％。
存在于成骨細(xì)胞內(nèi)的TGF-β無(wú)活性地積累在骨基質(zhì)中，但在骨吸附過(guò)程中被從破骨細(xì)胞釋放的酸活化。因此，其能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、膠原蛋白的合成以及破骨細(xì)胞的抑制。此外，TGF-β可視為由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的單核因子，但一般已知在骨或骨髓細(xì)胞中產(chǎn)生，并活化上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞。正好，TGF-β表現(xiàn)出抗炎癥抑制T細(xì)胞的MHC2作用(一種標(biāo)記)。
此外，在10μg的mLN、dLN、P.P和脾臟組織細(xì)胞中，采用RT-PCR方法，測(cè)定TGF-β、TNF-α和IL-4的濃度，并進(jìn)行電泳分析，從而獲得IOD值(單位ng)。利用RT-PCR方法靈敏地檢測(cè)所表達(dá)的細(xì)胞RNA，其包括下列步驟分離特定RNA，用反轉(zhuǎn)錄合成cDNA以及用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，并與對(duì)照組的結(jié)果比較，以及比較用于分析的檢測(cè)曲線。
圖8、圖9和圖10表示胞內(nèi)TGF-β、IL-4和TNF-α，它們通過(guò)PCR和電泳進(jìn)行分析。此外，表7、表8和表9描述了利用熒光檢測(cè)儀在450nm處測(cè)定的IOD值。
<表7>各種組織中胞內(nèi)TGF-β的RT-PCR結(jié)果

<表8>各種組織中胞內(nèi)IL-4的RT-PCR結(jié)果

<表9> 各種組織中胞內(nèi)TNF-α的RT-PCR結(jié)果

如上所述，在β2M的起始eDNA和PCR擴(kuò)增后計(jì)算IOD值的變化。在加強(qiáng)部位和mesenterici淋巴結(jié)中檢測(cè)TGF-β的量增加至2.5倍，這支持了上述ELISA分析的結(jié)果，并表明在脾臟和淋巴集結(jié)中TGF-β可觀地增加，以及在減少炎癥和增殖破骨細(xì)胞中發(fā)揮作用(參見表7)。
作為B細(xì)胞(骨髓細(xì)胞)刺激因子，IL-4濃度在加強(qiáng)位點(diǎn)和mesenterici淋巴結(jié)中也增加至100～200％，以及顯示IL-4可強(qiáng)烈激活B細(xì)胞，并且除骨髓細(xì)胞外，其濃度在脾臟、P.P等中沒(méi)有任何差異(參見表8)。
胞內(nèi)TNF-α是腫瘤壞死因子，并與炎癥誘導(dǎo)相關(guān)。作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，TNF-α濃度在脾臟和drainic LN中沒(méi)有變化，但在mesenterium和P.P中則顯著降低，這證實(shí)TNF-α相當(dāng)程度上影響關(guān)節(jié)炎的演變和分化。因此，與CIA誘導(dǎo)組不同，當(dāng)受到加強(qiáng)免疫以測(cè)定發(fā)生率時(shí)，藥物治療的組具有很低比例的關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)(參見圖9)。實(shí)驗(yàn)例4小鼠巨噬細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)在實(shí)施例18中制備的草本提取物組合物中，檢查11個(gè)樣本和作為比較藥物的氫化可的松以測(cè)定衍生自LPS刺激的小鼠巨噬細(xì)胞的TNF-α和膠原酶的抑制效應(yīng)。結(jié)果，TNF-α的ELISA實(shí)驗(yàn)顯示在LPS組和陰性組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，以及在發(fā)酵過(guò)程中制備的發(fā)酵的提取物沒(méi)有效果。此藥物的2種成分牛膝根(oosle)和日本牛膝根(changchul)經(jīng)確認(rèn)具有TNF-α抑制效應(yīng)，當(dāng)將由于發(fā)酵的提取物重量偏差(牛膝根9.2g23.1g，日本牛膝根12.2g22.9g)減去后，這可經(jīng)計(jì)算具有明顯的抑制效應(yīng)。這支持了如圖11所述的上文實(shí)驗(yàn)例3的結(jié)果。
利用牛膝根和日本牛膝根的提取物、10個(gè)發(fā)酵的提取物的樣本以及發(fā)酵溶液本身，進(jìn)行膠原酶抑制實(shí)驗(yàn)，并將這些測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。首先，將0.5ml含有2％偶氮染劑浸漬的膠原蛋白(Sigma公司)、CaCl21nM、Tris-HCl 50nM和II型膠原酶(125ng/0.5ml)的溶液與各個(gè)藥物在37℃下酶解反應(yīng)15小時(shí)。然后在540nm處，采用UV/vis分光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)反應(yīng)分離的偶氮染劑量并進(jìn)行比較。結(jié)果，各個(gè)草本提取物以及這些發(fā)酵產(chǎn)物顯示具有優(yōu)異的抑制膠原酶活性的效果，如圖11和圖12中所示。
<表10>
膠原酶抑制的體外實(shí)驗(yàn)

工業(yè)實(shí)用性如本發(fā)明所述，牛膝根(oosle)和日本牛膝根(changchul)的基于草本提取物的藥物組合物可部分緩解關(guān)節(jié)炎癥狀，但是它們的發(fā)酵產(chǎn)物比那些非發(fā)酵的提取物具有更優(yōu)異的治療關(guān)節(jié)炎的效果，約增加2倍。
此外，本發(fā)明的發(fā)酵草本組合物在藥物施用用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎過(guò)程中顯示很低比例的關(guān)節(jié)炎演變，以及預(yù)防關(guān)節(jié)炎確認(rèn)無(wú)疑。此外，關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)在功效上也減少到67％。結(jié)果，經(jīng)鑒定本發(fā)明的草本提取物在治療關(guān)節(jié)炎和水腫中效果突出，這是因?yàn)樗鼈兛纱_定無(wú)疑地調(diào)節(jié)與內(nèi)部水腫和關(guān)節(jié)炎相關(guān)的細(xì)胞因子的濃度。
本領(lǐng)域中的那些專業(yè)技術(shù)人員將意識(shí)到在上文描述所公開的概念和特定的實(shí)施方案可容易地用作為實(shí)施本發(fā)明的同樣目的而修飾或設(shè)計(jì)其他實(shí)施方案的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域中的那些專業(yè)技術(shù)人員還將意識(shí)到這些等同的實(shí)施方案沒(méi)有背離如附加的權(quán)利要求書中所闡述的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的草本提取物組合物的制備方法，其包括下列步驟a)提取牛膝根和日本牛膝根；以及b)發(fā)酵所述草本提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草本提取物組合物的制備方法，其包括另一步驟在發(fā)酵步驟后濃縮該提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草本提取物組合物的制備方法，其中所述a)提取步驟中的溶劑可選自蒸餾水、乙醇、甲醇、丙醇和丁醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草本提取物組合物的制備方法，其中牛膝根和日本牛膝根的比例為0∶5～5∶0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草本提取物組合物的制備方法，其中牛膝根和日本牛膝根以其干燥狀態(tài)或原始狀態(tài)使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草本提取物組合物的制備方法，其中牛膝根是土牛膝或BLUME牛膝，以及日本牛膝是日本牛膝KOIDZ或Atractylodes Koreana Kitam。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草本提取物組合物的制備方法，其中發(fā)酵步驟中采用的底物可以是一個(gè)或兩個(gè)以上選自麥芽、發(fā)芽小麥、葡萄和酒發(fā)酵酶源以及酵母；以及作為發(fā)酵的副底物，可利用直接或利用除淀粉以外的精制形式煮熟的米飯或米、玉米、淀粉、小麥、木瓜蛋白酶、獼猴桃或梨，或者一個(gè)或兩個(gè)以上選自它們的葡萄糖漿的含量可為0～50％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草本提取物組合物的制備方法，其中對(duì)于發(fā)酵步驟，將底物、副底物和輔酶劑直接加入到草本提取物中或在各個(gè)成分單獨(dú)制備后將它們混合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草本提取物組合物的制備方法，其中對(duì)于b)步驟，發(fā)酵條件是在20～75℃下進(jìn)行2～36小時(shí)。
10.一種草本提取物組合物，其是使用權(quán)利要求1～9所述的方法中的任一種方法制備的。
11.一種草本提取物組合物，其是使用權(quán)利要求1中所述的a)步驟制備的以及含有牛膝根提取物、日本牛膝根提取物或它們的混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的草本提取物組合物，其采用口服給藥形式，選自片劑、膠囊、囊片、糖漿、丸劑、液體溶液、懸浮液、粉末、錠劑、微粉化顆粒以及滲透性給藥系統(tǒng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的草本提取物組合物，其包括發(fā)酵的提取物作為主要藥物成分，以及通過(guò)利用合適的媒介物，其包括藥物上有效和可接受的載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的草本提取物組合物，其促進(jìn)身體中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的產(chǎn)生。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的草本提取物組合物，其抑制促進(jìn)身體中干擾素γ的產(chǎn)生。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的草本提取物組合物，其抑制體中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的草本提取物組合物，其促進(jìn)身體中白介素-4(IL-4)的產(chǎn)生。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的草本提取物組合物，其促進(jìn)小鼠免疫球蛋白G1的產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎的含有草本提取物的組合物以及該組合物的生產(chǎn)方法。具體而言，自牛膝根和日本牛膝根提取的藥物組合物對(duì)關(guān)節(jié)炎很有效，并且此組合物發(fā)酵的副產(chǎn)物與現(xiàn)有的人工化學(xué)物質(zhì)相比，在治療和預(yù)防關(guān)節(jié)炎中具有優(yōu)異的效果。
文檔編號(hào)A61K36/18GK1443073SQ01813031
公開日2003年9月17日 申請(qǐng)日期2001年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月19日
發(fā)明者李南起, 李宗昊, 樸武信, 姜撤勛, 孫洛源, 安泓濬 申請(qǐng)人:比奧迪克斯有限公司